Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Пантелеев, Михаил Александрович

• Пантелеев, Михаил Александрович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пантелеев, Михаил Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Современные представления о системе свертывания крови.

1.1.1 Структура и функционирование системы гемостаза человека.

1.1.2 Тромбоцитарное звено гемостаза.

1.1.3 Плазменное звено гемостаза.

1.1.4 Роль сосудистой стенки в гемостазе.

1.2 Экспериментальные модели свертывания крови.

1.3 Математические модели свертывания крови.

1.3.1 Качественные и феноменологические модели.

1.3.2 Количественные и механизменные модели.

1.3.3 Учет диффузии и кровотока в моделях свертывания.

1.4 Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ.

2.1 Подходы, использованные для описания ферментативных реакций.

2.1.1 Общая структура модели.

2.1.2 Кинетика многосубстратных реакций с избытком фермента над субстратом.

2.1.3 Математическое описание взаимодействия факторов свертывания с мембранами тромбоцитов.

2.1.4 Вывод граничных условий для факторов, взаимодействующих с поверхностью.

2.2 Численный метод и его программная реализация.

2.3 Расчет коэффициентов корреляции и контроля.

2.5 Экспериментальные методы и материалы исследования.

2.5.1 Материалы.

2.5.2 Эксперименты по связыванию факторов свертывания с фосфолипидными везикулами.

2.5.3 Эксперименты по активации фактора X.

ГЛАВА 3. ПОСТРОЕНИЕ МОДЕЛИ.

3.1 Построение моделей отдельных реакций системы свертывания.

3.1.1 Ингибирование внешней теназы ингибитором пути тканевого фактора.

3.1.2 Активация фактора X внутренней теназой.

3.2 Построение математической модели системы свертывания крови.

3.2.1 Допущения и условия применимости гомогенной модели.

3.2.2 Допущения и условия применимости пространственной модели.

3.2.3 Построение модели и сравнение с экспериментом.■.

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ВНУТРЕННЕЙ ТЕНАЗЫ.

4.1 Связывание факторов VIII, VIIIa, IXa и X с фосфолипидными везикулами.

4.2 Роль комплекса VIIIa-X в активации фактора X внутренней теназой.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛИ.

5.1 Сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям в системе свертывания.

5.2 Анализ пороговых свойств системы свертывания.

5.3 Анализ механизма терапевтического действия препарата NovoSeven.

5.4 Сравнительный анализ вкладов внутреннего и внешнего пути свертывания в пространственную динамику формирования фибринового сгустка.

5.5 Исследование эффекта тромбомодулина на остановку роста фибринового сгустка.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Математическое моделирование свертывания крови в гомогенных и реакционно-диффузных in vitro системах»

Свертывание крови является одним из элементов системы гемостаза, функция которой заключается в предотвращении потери крови при повреждении сосудистой системы. Нарушение целостности стенки сосуда приводит к активации свертывания, сложнейшего процесса, в который вовлечено свыше пятидесяти белков, а также клетки крови и сосудистой стенки. Этот процесс приводит к локальному переходу крови из жидкого в гелеобразное состояние в районе повреждения и остановке кровотечения благодаря сформированному сгустку. Любой сдвиг в деликатном балансе свертывания крайне опасен для организма, угрожая либо повышенной кровоточивостью, либо тромбозом, что делает изучение свертывания одной из приоритетных задач биохимии, биофизики и медицины.

Исследования, проводившиеся на протяжении последних десятилетий, привели к качественному изменению представлений о свертывании крови. В настоящий момент можно довольно уверенно утверждать, что устройство этой системы сравнительно хорошо известно: в последний раз новые белки в свертывании были открыты в конце 80-х годов XX века, а последние реакции обнаружены в начале 90-х. Несмотря на напряженную работу тысяч лабораторий во всем мире, за последние десять лет новых участников в каскаде свертывания ф обнаружено не было. Однако, знание устройства системы не означает понимания ее функционирования и далеко не всегда помогает определить правильный способ скорректировать то или иное нарушение. Именно поэтому все больше и больше работ в последние годы посвящается изучению разнообразных экспериментальных in vitro, in vivo и ex vivo моделей свертывания с целью понять, как оно функционирует и как можно на него воздействовать.

В силу сложности этой системы, обусловленной огромным количеством белковых и клеточных участников, наличием диффузии и потока крови, математические модели являются крайне перспективным методом исследования функционирования гсмостаза. Однако, существующие на настоящий момент математические модели большей частью не сравнивались с экспериментом и не включают многих существенных реакций. Далее, многие принципы устройства опубликованных моделей сильно устарели и сейчас нуждаются в уточнении, или даже были признаны неправильными.

Целью настоящей работы было построение новой количественной модели свертывания крови, способной успешно описать экспериментальные данные, и ее применение для изучения регуляции системы свертывания. В качестве объекта моделирования были выбраны две экспериментальные модели гемостаза. Первой моделью был тест генерации тромбина, в котором свертывание в плазме или в цельной крови активируется тканевым фактором (ТФ) и регистрируется изменение активности тромбина со временем. Второй моделируемой системой была разработанная в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН методика по исследованию пространственного формирования фибринового сгустка в тонком, неперемешиваемом слое рекальцифицированной плазмы при активации свертывания монослоем клеток, экспрессирующих ТФ. Первая модель была выбрана из-за того, что она является одним из самых эффективных и популярных методов, применяющихся как для фундаментальных исследований свертывания, так и для клинической диагностики. Чувствительность этой модели к различным изменениям в системе свертывания может быть исследована с помощью метода коэффициентов контроля в варианте, адаптированном для нестационарных систем. Вторая же экспериментальная постановка наиболее воспроизводимо и точно отображает пространственные аспекты свертывания, столь существенные in vivo, позволяя изучать роли как различных реакций, так и диффузии различных факторов в формирование сгустка.

В качестве наиболее актуального приложения модели было исследовано влияние на свертывание рекомбинантного активированного фактора VII и тромбомодулина. Первое из этих веществ успешно используется в терапии гемофилий и других геморрагических заболеваний свертывания (коммерческое название NovoSeven®, Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), в то время как растворимый тромбомодулин (Solulin) сейчас предлагается использовать для лечения тромбозов. Однако, механизм действия обоих препаратов не вполне ясен, и прояснение его способно внести вклад в стратегию терапии, использующей эти препараты.

Цель работы: Разработка количественной математической модели свертывания крови для решения биохимических и клинических задач.

Задачи исследования:

1. Построить количественную математическую модель каскада свертывания крови и сравнить ее с существующими экспериментальными данными по динамике свертывания.

2. Провести сравнительное исследование чувствительности генерации тромбина к изменениям констант реакций и концентраций факторов свертывания крови.

3. Проанализировать роль внешнего и внутреннего пути свертывания в пространственной динамике роста фибринового сгустка.

4. Использовать предложенную математическую модель для анализа механизмов действия препаратов рекомбинантного фактора Vila (NovoSeven) и рекомбинантного растворимого тромбомодулина (Solulin).

Научная новизна. Предложен механизм действия ингибитора пути тканевого фактора, позволяющий объяснить ранее необъясненные наблюдения. Экспериментально показано, что фактор Villa связывает фактор X и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой. Построена новая оригинальная математическая модель свертывания крови, отвечающая современным биохимическим представлениям и успешно описывающая большой набор экспериментальных данных из литературы. В этой модели учтены такие важные реакции, как активация факторов X и IX активированным фактором VII в присутствии активированных тромбоцитов, тромбоцит-зависимая активация фактора XI тромбином, секреция тромбоцитов, регуляция комплекса внешней теназы и активированного фактора X ингибитором пути тканевого фактора, и многие другие, которые отсутствуют в ранее опубликованных моделях свертывания. С помощью модели проведен анализ чувствительности и информативности теста генерации тромбина. Показан неизвестный ранее различный механизм работы внутреннего и внешнего путей в фазе распространения свертывания: установлено, что активированный фактор X производится внутренней теназой, тогда как фактор IX активируется по внешнему пути и распространяется в пространстве путем диффузии. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментально. Обнаружено, что вклад ТФ-зависимого и ТФ-независимого действия препарата NovoSeven в нормализацию свертывания в плазме больных гемофилией зависит от условий эксперимента, однако физиологическое формирование сгустка определяется преимущественно ТФ-независимым механизмом.

Научно-практическое значение. Полученные результаты по кинетике и регуляции реакций, катализируемых внутренней и внешней теназами могут иметь значение для клинических и биохимических исследований свертывания. Построенная модель может быть использована в качестве инструмента для планирования и анализа экспериментов по биохимии свертывания крови, а также для исследования механизмов действия препаратов, воздействующих на свертывание. Результатом исследования модели является вклад в понимание регуляции системы свертывания и механизмов . действия препаратов, направленных на коррекцию гемостаза, что может как иметь значение для экспериментальных исследований свертывания, так и дать базу для терапевтической стратегии при использовании этих препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Показано экспериментально, что фактор Villa связывает фактор X на фосфолипидных мембранах и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой.

2. Построена оригинальная математическая модель свертывания крови, активированного по внешнему пути, количественно описывающая процесс свертывания как в гомогенной, так и в пространственной экспериментальных постановках.

3. Доказано, что пространственный рост сгустка определяется выработкой активированного фактора X внутренней теназой, однако активированный фактор IX производится преимущественно по внешнему пути.

4. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментом.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Пантелеев, Михаил Александрович

Выводы

1. Предложен механизм регуляции внешнего пути свертывания крови ингибитором пути тканевого фактора, объясняющий ранее необъясненные экспериментальные данные.

2. Показано экспериментально, что фактор Villa связывает фактор X на фосфолипидных мембранах и регулирует его доставку к ферменту в реакции, катализируемой внутренней теназой.

3. Построена оригинальная математическая модель свертывания крови, активированного по внешнему пути, количественно описывающая процесс свертывания как в гомогенной, так и в пространственной экспериментальных постановках.

4. Проанализирована чувствительность и независимость параметров теста генерации тромбина и показано существование только двух полностью независимых типов параметров.

5. Оценен вклад ТФ-зависимого и ТФ-независимого механизмов действия препарата NovoSeven в нормализацию генерации тромбина в плазме больных гемофилией и показано, что при физиологических условиях главным является вклад ТФ-независимого механизма. Представлено теоретическое обоснование терапевтической эффективности гипердоз препарата NovoSeven.

6. Доказано, что пространственный рост сгустка определяется выработкой активированного фактора X внутренней теназой, однако активированный фактор IX производится преимущественно по внешнему пути.

7. Предсказан эффект локализации фибринового сгустка в присутствии тромбомодулина, подтвержденный экспериментом.

Благодарности

Эта работа была бы невозможна без помощи и поддержки со стороны моих коллег, которым я хотел бы выразить свою глубокую и искреннюю признательность. Я хочу поблагодарить коллектив лаборатории физической биохимии системы крови, в особенности группы свертывания: Андрея Александровича Бутылина, Веронику Игоревну Зарницину, Василия Ивановича Сарбаша, Елену Ивановну Синауридзе, Александру Валерьевну Похилко; сотрудников гемофилического центра ГНЦ РАМН: Елену Геннадьевну Лопатину и руководителя гемофилического центра Ольгу Павловну Плющ; сотрудников лаборатории Дж. Холланда, Американский Красный Крест: Евгения Львовича Саенко, Наталью Михайловну Ананьеву, Николаса Греко, Джеймса Куртца и Андрея Сарафанова. Я хотел бы особо поблагодарить Михаила Ованесова, Дмитрия Киреева и Людмилу Ивановну Ульянову за работу по экспериментальной проверке предсказаний математической модели, а также Екатерину Лобанову, Николая Пешкова, Алексея Токарева и Алексея Шибеко, которые использовали построенную модель в своих исследованиях, за выявленные при этом недочеты. Для меня большое удовольствие поблагодарить моего научного руководителя, Фазоила Иноятовича Атауллаханова, за его постоянное внимание, помощь и поддержку, а также за создание замечательной атмосферы для работы в его лаборатории.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пантелеев, Михаил Александрович, 2005 год

1. Шмидт Р, Тевс Г. Физиология человека (том 2). Москва: Мир, 1996.

2. Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Saltzman EW. Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice. Philadelphia: Lippincott Company, 1994.

3. Butenas S, Branda RF, van't Veer C, Cawthern KM, Mann KG. Platelets and phospholipids in tissue factor-initiated thrombin generation. Thromb Haemost 2001; 86: 660-667.

4. Mann KG, Brummel K, Butenas S. What is all that thrombin for? J Thromb Haemost 2003;1: 1504-1514.

5. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc) 2002; 67: 3-12.

6. Балуда ВП, Балуда MB, Деянов ИИ, Тлепшуков ИЛ. Физиология системы гемостаза. Москва: 1995.

7. Heemskerk JW, Bevers ЕМ, Lindhout Т. Platelet activation and blood coagulation. Thromb Haemost 2002; 88: 186-193.

8. Kalafatis M, Swords NA, Rand MD, Mann KG. Membrane-dependent reactions in blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Biochim Biophys Acta 1994; 1227: 113-129.

9. Smith RD, Owen WG. Platelet responses to compound interactions with thrombin. Biochemistry 1999; 38: 8936-8947.

10. Bajzar L. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and an antifibrinolytic pathway. Arterioscler Thromb Vase Biol 2000; 20: 2511-2518.

11. Solum NO. Procoagulant expression in platelets and defects leading to clinical disorders. Arterioscler Thromb Vase Biol 1999; 19: 2841-2846.

12. Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim Biophys Acta 1998; 1376: 433-453.

13. Gilbert GE, Sims PJ, Wiedmer T, Furie B, Furie ВС, Shattil SJ. Platelet-derived microparticles express high affinity receptors for factor VIII. J Biol Chem 1991; 266: 17261-17268.

14. Bouchard BA, Tracy PB. Platelet regulation of thrombin generation in cardiovascular disease. Ital Heart J 2001; 2: 819-823.

15. Monroe DM, Hoffman M, Oliver JA, Roberts HR. Platelet activity of high-dose factor Vila is independent of tissue factor. Br J Haematol 1997; 99: 542-547. Hedner U. Recombinant factor Vila (NovoSeven) as a hemostatic agent. Dis Mori 2003; 49: 39-48.

16. Brummel K, Paradis SG, Butenas S, Mann KG. Thrombin functions during tissue factor-induced blood coagulation. Blood 2002; 100: 148-152.

17. Butenas S, Mann KG. Kinetics of human factor VII activation. Biochemistry 1996; 35: 1904-1910.

18. Nesheim ME, Tracy RP, Mann KG. "Clotspeed," a mathematical simulation of the functional properties of prothrombinase. J Biol Chem 1984; 259: 1447-1453.3134,35,36,37,38,3940,4144

19. Fay PJ. Activation of factor VIII and mechanisms of cofactor action. Blood Rev 2004; 18: 1-15.

20. Moyer MP, Tracy RP, Tracy PB, van't Veer C, Sparks CE, Mann KG. Plasma lipoproteins support prothrombinase and other procoagulant enzymatic complexes. Arterioscler Thromb Vase Biol 1998; 18: 458-465.

21. Tracy PB, Eide LL, Mann KG. Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations. J Biol Chem 1985; 260: 2119-2124. Andrews DA, Low PS. Role of red blood cells in thrombosis. Curr Opin Hematol 1999; 6: 76-82.

22. Gailani D, Broze GJ, Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation. Science 1991; 253: 909-912.

23. Gailani D, Ho D, Sun MF, Cheng Q, Walsh PN. Model for a factor IX activation complex on blood platelets: dimeric conformation of factor XIa is essential. Blood 2001; 97: 31173122.

24. Solymoss S, Tucker MM, Tracy PB. Kinetics of inactivation of membrane-bound factor Va by activated protein C. Protein S modulates factor Xa protection. J Biol Chem 1988; 263: 14884-14890.

25. Heeb MJ, Mesters RM, Tans G, Rosing J, Griffin JH. Binding of protein S to factor Va associated with inhibition of prothrombinase that is independent of activated protein C. J Biol Chem 1993; 268: 2872-2877.4548,49.50,51,52,53,54,55,56