Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Баландина, Анна Николаевна

• Баландина, Анна Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Баландина, Анна Николаевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о гемостазе человека.

1.2. Плазменное свертывание крови.

1.2.1. Состав и структура системы свертывания.

1.2.2. Активация свертывания.

1.2.3. Петли положительной обратной связи и образование комплексов.

1.2.4. Формирование фибринового сгустка.

1.2.5. Ингибиторы свертывания.

1.3. Нарушения плазменного звена системы свертывания.

1.3.1. Дефициты факторов свертывания.

1.4. Экспериментальные модели свертывания крови.

1.4.1. Модели свертывания in vivo и ex vivo.

1.4.2. Пространственно-однородные модели.

1.4.3. Пространственно-распределенные модели.

1.5. Математические модели свертывания крови.

1.5.1. Качественные и феноменологические модели.

1.5.2. Количественные и механизменные модели.

1.6. Пороговые свойства и роль обратных связей в in vitro моделях свертывания крови.

1.7. Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Доноры крови.

2.3. Подготовка плазмы крови.

2.3.1. Получение плазмы крови.

2.3.2. Работа с замороженной плазмой.

2.3.3. Стабилизация рН плазмы.

2.3.4. Ингибирование контактной активации.

2.3.5. Восполнение дефицитной плазмы факторами V, VII и VIII.

2.3.6. Рекальцификация плазмы.

2.4. Стандартные тесты: АЧТВ и определение уровня фактора VIII.

2.5. Приготовление пленок с фибробластами.

2.5.1. Культура фибробластов.

2.5.2. Подсчет плотности клеток.

2.5.3. Посадка клеток на пленку.

2.6. Приготовление пленок с иммобилизованным тканевым фактором.

2.7. Иммобилизация тромбопластина на полистироловую поверхность.

2.8. Определение плотности тканевого фактора.

2.9. Экспериментальные системы.

2.9.1. Пространственно-однородные эксперименты.

2.9.2. Рост сгустка в пространстве.

2.9.2.1. Конструкция кюветы.

2.9.2.2. Схема и принцип работы установки.

2.10. Программный комплекс получения и обработки экспериментальных изображений.

2.10.1. Получение изобраэ/сений.

2.11.2. Обработка экспериментальных кадров.

2.11. Математическая модель свертывания.

2.11.1. Уравнения и параметры модели.

2.11.2. Пространственно-однородная модель.

2.11.3. Трехмерная пространственно-распределенная модель.

2.11.3.1. Равномерное распределение тканевого фактора.

2.11.3.2. Моделирование фибробластов.

2.11.3.3. Исключение обратных связей из модели.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Порог по активации свертывания в пространственно-однородной системе. .62 3.1.1. Свертывание в плазме здоровых доноров.

3.2. Исследование роли положительных обратных связей при активации свертывания в пространственно-однородной системе.

3.2.1. Изучение пороговых свойств системы свертывания в модели in silico.

3.2.2. Свертывание в плазме, дефицитной по фактору V.

3.2.3. Свертывание в плазме, дефицитной по фактору VIII.

3.3. Порог по активации свертывания в пространственно-распределенной системе.

3.3.1. Активация свертывания поверхностью с равномерно иммобилизованным тканевым фактором.

3.3.2. Активация свертывания фибробластами.

3.4. Исследование роли положительных обратных связей при активации свертывания в пространственно-распределенной системе.

3.4.1. Исследование роли обратных связей в свертывании в математической модели.

3.4.2. Планирование эксперимента для верификации модели.

3.4.3. Экспериментальная проверка роли положительных обратных связей активации факторов V и VII.

3.5. Динамика роста сгустка в плазме больных гемофилией А после восполнения фактором VIII.

3.5.1. Рост сгустка у больных гемофилией А с различными фенотипами.

3.5.2. Динамика изменения роста сгустка при введении пациентам фактора VIII.

3.5.3. Корреляция скорости роста сгустка с параметрами А ЧТВ, уровнем фактора VIII в крови и клинической картиной у пациентов.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Регуляция свертывания в пространственно-однородной системе.

4.2. Регуляция свертывания в пространственно неоднородной системе.

4.3. Свертывание крови у пациентов с гемофилией.

4.4. Новые представления о работе системы свертывания крови.

4.5. Пространственная динамика свертывания как новый метод диагностики и оценки терапии.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пороговые свойства системы свертывания крови in vitro при активации тканевым фактором»

Система гемостаза обеспечивает целостность кровеносной системы в организме человека. Выделяются три составляющих: тромбоцитарный гемостаз, плазменный гемостаз и сосудистый гемостаз. Все три составляющие необходимы для эффективного предотвращения кровопотери: агрегировавшие в месте повреждения тромбоциты обеспечивают прочность сгустка, образованная в результате работы плазменной системы свертывания фибриновая полимерная сеть скрепляет клетки и предотвращает просачивание жидкости, вазоконстрикция сосудов перераспределяет ток крови, уменьшая его в месте повреждения. Важной особенностью протекания реакций свертывания является пространственная гетерогенность этого процесса - свертывание запускается от места повреждения, а реакции проходят в объеме крови на фосфолипидных мембранах.

На данный момент хорошо изучены все компоненты системы свертывания с точки зрения биохимии - известны константы реакции, условия протекания реакций и др. Однако, так как система состоит более чем из 30 элементов, связанных между собой множеством реакций, сложно предсказать ее работу в целом и влияние на нее отдельных параметров. В медицинском аспекте это проявляется в том, что до сих пор неясно, почему, например, дефицит одного белка системы приводит к сильнейшей кровоточивости, а другого - остается незамеченным организмом. Более половины смертей в мире имеют в качестве непосредственной причины нарушения свертывания крови тромбозы или кровотечения [1-4]. Поэтому изучение работы этой системы является важной биофизической и медицинской задачей.

Система свертывания должна обладать пороговыми свойствами, чтобы избежать случайного возникновения тромбов и запускаться только в случае наличия повреждения. Под порогом по активации свертывания здесь и далее понимается минимальное ненулевое количество активатора свертывания, вызывающего образование фибринового сгустка. Существуют указания на такое свойство в системе свертывания крови [5-7]. Однако до сих пор не были проведены эксперименты, в которых зарегистрировали пороговые значения активатора свертывания. Во всех проведенных ранее исследованиях в образце цельной крови или плазмы без добавления активатора свертывания происходило формирование сгустка.

Пороговое поведение системы свертывания связывают с наличием в ней положительных обратных связей. Положительная обратная связь позволяет ускорить образование продукта реакции за счет того, что он влияет на собственное производство. В системе свертывания основным таким регулятором является тромбин - последний фермент каскада реакций, превращающий растворимый белок фибриноген в 7 нерастворимый полимеризующийся фибрин. Тромбин вступает в реакции, приводящие к еще большей наработке самого тромбина в системе. В математических моделях, описывающих работу систем типа системы свертывания, активно изучается функция таких обратных связей [8-15]. Было показано, что они позволяют ускорить на порядки работу системы и обеспечить выборочную чувствительность системы к запускающему сигналу — свертывание начинается только при получении сигнала, выше определенного уровня. Однако, из клинических примеров хорошо известно, что отсутствие того или иного фактора системы свертывания, участвующего в своей положительной обратной связи, по-разному влияет на здоровье человека. Так, при тяжелой форме гемофилии А больные нуждаются в постоянном восполнении недостающего элемента системы свертывания [16-18], а при гемофилии С заболевание проявляет себя только при серьезных травмах [19], редко встречающийся дефицит фактора V иногда ассоциирован с тромбоэмболиями [20,21], а дефицит фактора VII парадоксальным образом может сопровождаться тяжелыми тромбозами [22]. При этом степень кровоточивости не всегда коррелирует с уровнем дефицитного фактора, так что пациенты с одинаковым исходным уровнем фактора нуждаются в индивидуальном подборе терапии.

В данной работе изучались пороговые свойства системы свертывания человека и исследована роль положительных обратных связей с использованием экспериментов in vitro и математического моделирования. Целью работы являлось изучение пороговых свойств системы свертывания крови и роли положительных обратных связей активации факторов V, VII, VIII в активации свертывания и формировании фибринового сгустка в системе in vitro. Отличительной особенностью работы является исследование пороговых свойств в системах in vitro с различной пространственной организацией: активация свертывания в объеме (однородная система), на поверхности и от единичных клеток (пространственно-распределенные системы). Пространственно-распределенная система свертывания in vitro имитирует рост сгустка от стенки сосуда. В такой системе реакции свертывания запускаются на поверхности с тканевым фактором и распространяются вглубь тонкого неперемешиваемого слоя плазмы. Поверхность с клетками, вызывающими свертывание крови, позволяет выяснить роль единичных клеток в формировании фибринового сгустка. Математическая модель системы свертывания позволила обнаружить вероятные элементы регуляции в системе и спроектировать эксперименты, проверяющие теоретические представления. Клинически наиболее актуальной частью работы было исследование влияния замещающей терапии факторами свертывания VIII при гемофилии А.

Цель работы: Изучить пороговые свойства свертывания крови и роль положительных обратных связей в формировании фибринового сгустка в системе in vitro.

Задачи исследования:

1. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от тромбоцитов плазмы крови в пространственно-однородной системе.

2. Исследовать пороговые свойства при активации свертывания свободной от тромбоцитов плазмы крови в пространственно-распределенной системе при активации поверхностью с равномерно иммобилизованным тканевым фактором.

3. Сравнить формирование фибринового сгустка при активации свертывания от равномерно иммобилизованного на поверхности тканевого фактора и от клеток, экспрессирующих тканевый фактор.

4. Выявить роль положительных обратных связей в процессе активации и формирования фибринового сгустка.

5. Изучить динамику формирования сгустка у пациентов с гемофилией А при введении им фактора VIII.

Научная новизна. Показано существование порога в свободной от тромбоцитов плазме крови по концентрации тканевого фактора (в пространственно-однородной системе) и плотности тканевого активатора на поверхности (в пространственно-распределенной системе). В работе впервые экспериментально измерена величина порога по активации свертывания. Показано, что положительная обратная связь активации фактора V тромбином позволяет системе свертывания осуществить быстрый переход из неактивного состояния к образованию плотного фибринового сгустка при небольших изменениях концентрации и плотности тканевого фактора. При переходе от пространственно-однородной постановки к пространственно-распределенной меняется вклад отдельных реакций в процесс свертывания плазмы крови. Впервые измерена зависимость параметров роста сгустка в пространстве от плотности и распределения тканевого фактора. Показано, что рост сгустка зависит от локальной плотности активатора, а не от его количества. При этом даже единичный фибробласт - клетка с большой плотностью тканевого фактора на мембране - способен эффективно активировать свертывание крови. Впервые экспериментально показана значимость положительной обратной связи активации VII фактора фактором Ха. В экспериментах с плазмой больных гемофилией А показано, что при введении пациентам фактора VIII изменяются параметры роста сгустка в пространственно-распределенной системе. Динамика этих изменений, по-видимому, коррелирует с клиническим проявлением заболевания.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные о регуляции работы системы свертывания могут впоследствии быть применены в области лечения и создания новых препаратов для пациентов с дефицитами факторов свертывания. В работе показано, что метод, созданный на основе пространственно-распределенной модели, может быть использован для оценки и подбора терапии при восполнении недостающих компонентов системы свертывания. Это позволяет поддерживать систему свертывания пациентов вблизи нормальных показателей свертывания на протяжении всего времени между двумя инъекциями препарата.

Положения, выносимые на защиту:

1. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором, равномерно распределенным по объему и по поверхности.

2. Тканевый фактор, сосредоточенный на пятнах, вызывает свертывание, а то же его количество, распределенное равномерно по поверхности — не вызывает свертывания.

3. Порог при активации свертывания в пространственно-однородной системе регулируется положительной обратной связью активации фУ тромбином, а порог по активации и чувствительность к распределению активатора в пространственно-распределенной системе регулируются положительными обратными связями активации фУ тромбином и фУП фактором Ха.

4. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Баландина, Анна Николаевна

Выводы

1. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором равномерно распределенным по объему.

2. Порог при активации свертывания в гомогенной системе регулируется положительной обратной связью активации фактора V тромбином.

3. Система свертывания крови обладает порогом при активации тканевым фактором равномерно распределенным по поверхности.

4. Система свертывания чувствительна к локальной плотности тканевого фактора, но не к его общему количеству в системе.

5. Порог по активации и чувствительность к распределению активатора в пространственно-распределенной системе регулируются положительными обратными связями активации фактора V тромбином и фактора VII фактором Ха.

6. Скорость роста сгустка в пространстве коррелирует с клиническим течением гемофилии А.

Благодарности

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность людям, без которых эта работа была бы невозможна:

Сотрудникам лаборатории физической биохимии:

Алексею Михайловичу Шибеко за помощь в разработке и реализацию математической модели свертывания.

Висилию Ивановичу Сарбашу и Сергею Сергеевичу Карамзину за создание установки по исследованию пространственного роста сгустка.

Игорю Игоревичу Шмыреву и Ольге Александровне Фадеевой за создание поверхностей с иммобилизованным тканевым фактором.

Елене Ивановне Синауридзе, Андрею Александровичу Бутылину, Борису Ефимовичу Мовшеву и многим другим сотрудникам лаборатории за советы, помощь и поддержку.

Сотрудникам отделения реконструктивно-восстановительной ортопедии для больных гемофилией:

Константину Геннадиевичу Копылову и Марии Алексеевне Кумсковой за активное участие, поддержку и постоянный интерес к работе.

Сотрудникам станции переливания крови за предоставленную возможность работать с кровью доноров.

Людмиле Ивановне Ульяновой за ее многолетний самоотверженный труд по культивированию клеток.

Особая благодарность моему научному руководителю

Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову, за его помощь, поддержку и внимание, а также за создание замечательной атмосферы для работы в его лаборатории и Михаилу Александровичу Пантелееву, чей вклад в эту работу неоценим.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Баландина, Анна Николаевна, 2010 год

1. Российский статистический ежегодник. Москва: Федеральная служба государственной статистики, 2009.

2. Dempfle СЕ, Knoebl PN. Blood coagulation and inflammation in critical illness the importance of the protein С pathway. Bremen u.a.: UNI-MED Verl, 2008.

3. Баркаган ЗС, Момот АП, Тараненко ИА, Шойхет ЯН. Основы пролонгированной профилактики и терапии тромбоэмболии. Москва: "Ньюдиамед", 2003.

4. Котельников MB. Ведение больных с венозными тромбоэмболиями. Москва: Боргес, 2006.

5. Kastrup CJ, Runyon МК, Shen F, Ismagilov RF. Modular chemical mechanism predicts spatiotemporal dynamics of initiation in the complex network of hemostasis. Proc Natl AcadSci USA 2006; 103: 15747-15752.

6. Pokhilko AV. Intrinsic coagulation pathway: an activation threshold. Thromb Res 2000; 99: 285-293.

7. Khanin MA, Semenov VV. A mathematical model of the kinetics of blood coagulation. J Theor Biol 1989; 136: 127-134.

8. Семенов BB, Ханин MA. Нелинейные эффекты в кинетике свертывания крови. Биофизика 1990; 35: 139-141.

9. Образцов ИФ, Ханин MB, Горбатюк ИА. Математическая модель кинетики активации факторов VII и X системы гемокоагуляции. ДоклАкад Наук 1992; 326: 558-561.

10. Образцов ИФ, Попов АФ, Ханин MB. Кинетика активации внутреннего пути гемокоагуляции: пороговый эффект .ДоклАкад Наук 1996; 349: 560-562.

11. Образцов ИФ, Попов АФ, Ханин MB. Пороговые эффекты в кинетике активации контактной системы гемокоагуляции. ДоклАкад Наук 1999; 367: 130-132.

12. Beltrami Е, Jesty J. Mathematical analysis of activation thresholds in enzyme-catalyzed positive feedbacks: application to the feedbacks of blood coagulation. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 8744-8748.

13. Beltrami E, Jesty J. The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation. Math Biosci 2001; 172: 1-13.15