Применение спектроскопии спиновых и флуоресцентных зондов для изучения параметров микроокружения в растворах и биомембранах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.17, кандидат физико-математических наук Глазачев, Юрий Иванович

• Глазачев, Юрий Иванович
• кандидат физико-математических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Глазачев, Юрий Иванович

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

§ 1. Спектроскопия ЭПР спиновых зондов имидазолинового и имидазолидинового типов.

1.1. Свойства радикалов имидазолинового и имидазолидинового типов: рН-чувствительность спектров ЭПР

1.2. Реакция протонирования нитроксильных радикалов как вид химического (частотного) обмена

1.3. Кинетический изотопный эффект в реакциях протонного обмена

1.4. Форма линии изотропного спектра нитроксильных радикалов, однородное и неоднородное уширение

1.5. Бирадикалы, чувствительность спектра к параметрам микроокружения J

1.6. Развитие методов ЭПР для определения параметров среды in vivo

1.7. Определение концентрации тиолов в растворах и in vivo, применение метода ЭПР

§ 2. Изучение биомембран методом флуоресцентного микрофотолиза

2.1. Биологические мембраны, проблемы латеральной организации

2.2. Метод флуоресцентного микрофотолиза: классический вариант и развитие

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

§1. Стабильные нитроксильные радикалы

§ 2. Метод флуоресцентного микрофотолиза •

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ

§1. Изотопно-замещенные радикалы имидазолинового и имидазолидиного типов

1.1. Влияние изотопного замещения на форму линии

1.2. Протонный обмен в растворе у изотопно замещенных радикалов

1.3. Кинетический изотопный эффект реакции протонного обмена

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение спектроскопии спиновых и флуоресцентных зондов для изучения параметров микроокружения в растворах и биомембранах»

Молекулярные зонды очень широко используются в различных научных исследованиях и имеют большое прикладное значение. С их помощью можно анализировать процессы, происходящие на молекулярном и субмолекулярном уровнях. Одними из самых распространенных являются парамагнитные и люминесцентные зонды, с применением соответствующих методов спектроскопии. Диапазон свойств и, соответственно, методов в каждом классе достаточно широк и многие из них уже стали рутинными. Дальнейший прогресс идет в двух основных направлениях: синтез новых молекулярных зондов и развитие методик.

Данная работа посвящена изучению новых молекулярных зондов: нитроксильных радикалов (HP) имидазолинового и имидазолидинового типов с помощью метода спектроскопии ЭПР и флуоресцентных зондов с помощью метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP), по другому - метод флуоресцентного микрофотолиза. Работа является методической, её цель - это изучение основных спектральных характеристик представленных зондов, чувствительность к параметрам микроокружения. Полученные данные рассматриваются с точки зрения дальнейшего применения изучаемых соединений в научных исследованиях.

Нитроксильные радикалы данных типов являются рН-чувствительными, благодаря наличию легко протонируемого азота в третьем положении гетероцикла, что проявляется во влиянии на константу сверхтонкого взаимодействия (СТВ) и величину g-фактора [1, 2]. Данное свойство позволяет измерять рН в растворе в районе рК радикалов методом ЭПР, что определило широкое применение этих соединений как рН-зондов в биологических системах и дало толчок к обширному изучению и синтезу новых HP. В настоящее время существуют HP с широким диапазоном рК и обладающие различными химическими свойствами [3].

Особый интерес представляют бирадикалы, у которых имеется спин-спиновое взаимодействие между монорадикальными фрагментами. Это приводит к появлению в спектрах ЭПР дополнительных "бирадикальных" компонент.

Величины спин-спинового взаимодействия могут зависеть от структуры бирадикала, пространственного взаимного расположения монорадикальных фрагментов, температуры, вязкости, электростатических свойств среды [4, 5].

Отдельное применение нашли бирадикалы с дисульфидной связью. Они реагируют с тиолами по реакции тиол-дисульфидного обмена. При этом бирадикал расщепляется на два монорадикала, что достоверно детектируется методом ЭПР по уменьшению пиковой интенсивности бирадикальных компонент спектра [6,7]. Применение таких бирадикалов позволяет определять концентрацию SH соединений в биологических системах, что представляет интерес ввиду специфического физиологического значения тиолов [8].

Метод флуоресцентного микрофотолиза был изобретен в 1974 г. [9,10] Он позволяет измерять латеральную подвижность белков или липидов в мембране и в настоящее время стал рутинным. Метод широко используется для изучения влияния различных факторов на физическое состояние мембраны, что в свою очередь может отражать или определять физиологическую роль биомембраны.

В первой части данной работы изучаются новые изотопно-замещенные HP имидазолинового и имидазолидинового типов. У данных радикалов протоны замещены на дейтроны, что приводит к уменьшение гауссовой ширины линии. Также азот в первом положении, 14N, замещен на изотоп 15N, что приводит к уменьшению лоренцевой ширины линии и уменьшению количества пиков с трех до двух. Все это приводит к значительному увеличению пиковой интенсивности в спектрах ЭПР радикалов, в 5-7 раз.

Сужение линии в спектрах ЭПР изотопно-замещенных HP проявляет сверхтонкую структуру: расщепление на присоединенном протоне для протонированной формы имидазолинового радикала, а также на азоте в третьем положении для имидазолидинового радикала; большее спектральное разрешение между протонированной и непротонированной формами радикалов. Это позволяет с хорошей достоверностью наблюдать методом ЭПР химический обмен между двумя формами радикалов в результате протонного обмена с молекулами буфера при рН вблизи рК радикала. Более того, наличие разрешенной структуры на присоединенном протоне у имидазолинового радикала в протонированной форме позволяет наблюдать обмен между этими разрешенными компонентами спектра при увеличении концентрации буфера при рН раствора много меньше рК радикала, что представляется очень важным методически. Были измерены константы скоростей прямой и обратной реакций протонного обмена радикалов с фосфатным и ацетатным буферами. Чувствительность этих радикалов к концентрации буфера предполагает возможность их использования для определения буферной емкости на биологических объектах, что представляет значительный интерес. Также был измерен кинетический изотопный эффект (КИЭ) изучаемых реакций протонного обмена. Величины КИЭ обсуждаются.

Во второй части изучены различные типы бирадикалов имидазолидинового и имидазолинового типов. Показана чувствительность спин-спинового обменного взаимодействия у бирадикалов к рН, причем в зависимости от структуры соединения величина и знак эффекта различный. Также у одного из бирадикалов был обнаружен расширенный диапазон рН-чувствительности константы СТВ по сравнению с монорадикалом, что имеет практический интерес. Наблюдалось также влияние температуры и вязкости на величину обменного взаимодействия, что указывает на то, что спин-спиновый обмен есть результат пространственного столкновения между монорадикальными фрагментами, так называемое прямое взаимодействие. Измерены энергии активации обменного взаимодействия для разных форм бирадикалов, обсуждается влияние структуры на величины наблюдаемых эффектов.

Отдельно представлен новый бирадикал с дисульфидной связью, который является реагентом на SH соединения. В отличие от ранее используемого [6], он позволяет измерять концентрацию тиолов кинетическим методом. Это позволяет значительно уменьшить концентрацию реагента, и он более стабилен в биологических системах. Были измерены константы скоростей реакции дисульфидного бирадикала с низкомолекулярными (глутатион, цистеин) и высокомолекулярными (альбумин и гемоглобин) тиолами. С помощью данного бирадикала была концентрация измерена тиолов в цельной крови, что не представлялось возможным для ранее известных методов.

В третьей части представлен метод флуоресцентного микрофотолиза.

ВВЕДЕНИЕ7

Изучена подвижность флуоресцентного липидного зонда и флуоресцентномеченого цитохрома-bs в зависимости от температуры в липосомах из яичного лецитина (ЯЛ) и димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ). Наблюдался фазовый переход в мембранах из ДМФХ, сильное влияние концентрации холестерина в липосомах из ЯЛ на вязкость мембраны. Полученные данные показывают, что подвижность цитохром-Ьз сильно зависит от вязкости мембраны.

В последней части с помощью методов спектроскопии молекулярных зондов были изучены параметры окислительного повреждения в реальных биологических системах. Измерена концентрация смешанных дисульфидов в плазме крови при помощи дисульфидного бирадикала методом ЭПР и подвижность флуоресцентного зонда в мембране эритроцитов методом FRAP у крыс с наследственной повышенной стресс чувствительностью по сравнению с контрольными животными. Показано, что у крыс, подверженных окислительному стрессу, повышенная концентрация тиолов и пониженная вязкость мембраны эритроцитов.

Основные результаты представленных работ были доложены 8-й Встрече ISSX (1997, Южная Каролина), 39-ой Конференции по Аналитической Химии (1997, Денвер), Международной Школе по Биофизике (2000г, Ровин, Хорватия).

Заключение диссертации по теме «Химическая физика, в том числе физика горения и взрыва», Глазачев, Юрий Иванович

ВЫВОДЫ

1. Изучены новые рН-чувствительные нитроксильные радикалы с изотопным замещением ядер водорода и азота. Измерены спектральные параметры радикалов и константы скоростей реакций протонного обмена с фосфатным и ацетатным буфером. Показано, что применение данных радикалов позволяет значительно увеличить чувствительность метода спиновых зондов и измерять буферную емкость раствора.

2. Изучены новые нитроксильные бирадикалы. Обнаружена чувствительность величины спин-спинового обменного взаимодействия к рН, температуре и вязкости. Наблюдался расширенный диапазон чувствительности константы СТВ к рН. Показано, что данные бирадикалы имеют преимущества по сравнению с монорадикалами при использовании в качестве рН-чувствительных зондов и для определения вязкости растворов методом ЭПР.

3. Измерены константы скоростей реакции нового дисульфидного бирадикала имидазолидинового типа с высоко- и низкомолекулярными тиолами. С его помощью измерены концентрации низкомолекулярных тиолов в плазме крови, эритроцитах и, впервые, в цельной крови. Показано, что применение данного бирадикала для определения концентрации тиолов методом ЭПР обладает рядом преимуществ перед ранее известными методами.

4. Методом флуоресцентного микрофотолиза впервые измерены коэффициенты диффузии флуоресцентномеченого белка цитохрома bs в различных липидных матрицах. Обнаружена сильная зависимость подвижности белка от вязкости мембраны. Результаты указывают на возможность применения данного белка в качестве флуоресцентного зонда для изучения как подвижности биологических мембран, так и латеральной организации компонентов мембраны на её поверхности.

5. Используя разработанные методики, были измерены концентрация тиолов в плазме крови и подвижность флуоресцентного зонда в мембране эритроцитов у крыс с наследственной галактоземией. Обнаружено увеличенное содержание дисульфидов и уменьшение вязкости мембраны у животных с патологией, что указывает на наличие окислительного стресса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Глазачев, Юрий Иванович, 2001 год

1. Keana, J.F.W., Acarregui, М. J., and Boyle, S.L.M., 1982,2,2-disubstituted-4,4-dimethylimidozolidinyl-3-oxy nitroxides indicators of aqueous acidity through variation of aN with pH. J.Am.Chem.Soc. v. 104, p.827-830

2. Khramtsov, V.V., Weiner, L.M., Grigor'ev, I.A., and Volodarsky, L.B., 1982, Proton exchange in stable nitroxyl radicals. EPR study of the pH of aqueous solutions, Chem.Phys.Lett, v.91, p.69

3. Лакхраст, Дж., 1979, Бирадикалы как спиновые зонды, Метод спиновых меток:Мир, с. 156

4. Пармой, В.Н., Кокорин, А.И., Жидомиров, Г.М., 1980, Стабильные бирадикалы. М.:Наука, 240 с.

5. Khramtsov, V.V., Yelinova, V.I., Goryunova, Т.Е., Weiner, L.M. 1991,

6. Quantitative determination and reversible modification of sulfhydryl group of low-and high molecular-weight compounds using a biradical spin label. Biokhimija (Russia) v.9. pp 1567-77

7. Weiner, L.M., Ни, H., Swartz, H.M. 1991, EPR method for measurement of cellular sulfhydryl groups. FEBS Lett, v.290, pp.243-6

8. Packer, L. editor, 1995, Biothiols, Metods Enzymol. v.251, p.529

9. Peters, R., Peters, J., Tews, K.H, and Bahr, W., 1974, A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochem. Biophys Acta. v.367, pp.282-294

10. Poo, M.-m., and Cone, R.A., 1974, Nature, v.247, pp.438-459

11. Розанцев, Э.Г., 1970, Свободные иминоксильные радикалы. Успехи химии:Мир, с.216

12. McConnel, Н.М., McFarland, B.G. 1970, Physics and chemistry of spin labels. Quart.Rev.Biophys., v.3, pp.91-136

13. Гамильтон, Г.М., МакКоннелл Г.М., 1970, Спиновые метки. Успехи химии. т.39, с.531-559

14. Smith, I.C.P. 1972, The spin label method. In: Biological Application of Electron Spin Resonance. New York: Wiley, pp.483-539

15. Лихтенштейн, Г.И. 1974, Метод спиновых меток в молекулярной биологии. Москва:Мир, 256 с.

16. Zhdanov, R.I., 1992, Spin-labeled Medicine: enzymes, biomembrane and possible pharmaceuticals. An overview. In: Bioactive Spin Label, Springer-Verlag, pp. 1-22

17. Zhdanov, R.I., 1992, Nytroxyl radical and non-radical reactions of free radicals. In: Bioactive Spin Label, Springer-Verlag, pp.23-81

18. Volodarsky, L.B., Grigoriev, I.A., Sagdeev, R.Z. 1980, Stable imidazoline nitroxide, In: Biological Magnetic Resonance, New York:Plenum, v.2, pp. 169-242

19. Володарский, Л.Б., Вайнер, Л.М. 1983, Применение стабильных нитроксильных радикалов имидазолинового ряда, Хим. ФармЖурнал. с.658-667

20. Володарский, Л.Б., Вайнер, JI.M. 1983, Синтез и свойства стабильных нитроксильных радикалов имидазолинового ряда,Хим.Фарм.Журнал. с.524-533

21. Khramtsov, V.V., Werner, L.M., Eremenko, S.I., Belchenko, O.I, Schastnev, P.V., Grigor'ev, I.A., Reznikov, V.A., 1985, Proton exchange in stable nitroxyl radicals of imidazoline and imidazolidine series,J.Magn.Res. v.61, p.397

22. Hogeveen, H., Germann, H.R., H.R., and Proat, A.P., 1967, Rec. Trav. Chim. v.86, p.1063

23. Hoffman, B.M., and Eames, T.B. 1969, J.Am.Chem.Soc. v.91, 2169

24. Malatesta, V., and Ingold, K., 1973, J.Am.Chem.Soc. v.95, p.6404

25. Golubev, V.A., Rozantcev, E.C., and Neiman, M.B. 1965, Izv.Akad.Nauk.SSSR, Ser.Khim., p. 1967

26. Osiecki, J.H., and UHrnan, E.F., 1968, J.Am.Chem.Soc. v.90, c.1078

27. Khramtsov, V.V., and Weiner, L.M., 1988, Proton Exchange in Stable Nitroxyl Radicals: pH-sensitive spin probes, in: Imidazoline Nitroxides (Ed. L.B.Volodarsky), vol.2, pp.37-80, CRC Press, Boca Raton

28. Khramtsov, V.V., and Weiner, L.M., 1988, Proton Transfer Reactions in Free Radicals. Spin pH Probes, in: Russian Chemical Reviews, 57 (9), pp.824-839, Springer-verlag.

29. McConnell, H.M., 1958, Reaction rates by nuclear magnetic resonance. J.Chem.Phys. v.28, pp.430-431

30. Храмцов, B.B., Вайнер, JI.M. 1987, Кинетические параметры протонного обмена в стабильных нитроксильных радикалах, Химическая физика, т.6, №4 с.499-505

31. Меландер, Л., Сондерс, У., 1983, Скорости реакций изотопных молекул, (пер. с англ.), Москва: Мир 344 с.

32. Horiuti, J., Polanyi, М., 1935, Actaphysicochim. URSS, v.2, pp.505-532

33. Bell, R.P., 1973, The proton in chemistry, Chapman and Hall, London.

34. Bell, R.P., 1980, The Tunnel Effect in chemistry, Chapman and Hall, London

35. Krishtalik, L.I., 2000, The mechanism of the proton transfer: an outline, Biochem.Biophys.Acta., v. 1458, pp.6-27

36. Scheiner, S., 2000, Calculation of isotope effects from first principles, Biochem.Biophys.Acta., v. 1458, pp.28-42

37. Glasoe, P.K., Long, Г.А., 1960, Use of glass electrodes to measure acitidites in deuterium oxide. J.Phys.Chem. v.64, pp. 180-190

38. Brandsburg-Zabary, S., Freid, O., Marantz, Y., Nachliel, E., Gutman M.,2000, Biophysical aspects of intra-protein proton transfer, Biochem.Biophys.Acta, v.1458, pp. 120-134

39. Heberle, J., 2000, Proton transfer reactions across bacteriorrhodopsin and along the membrane, Biochem.Biophys.Acta, v.1458, pp.135-147

40. Керрингтон, А., Мак-Лечлан, Э., 1970, Магнитный резонанс и его применение в химии (пер. с англ.) Москва:Мир, с. 448

41. Bales, B.L., 1989, Inhomogeneously broadened spin label spectra, in Biological magnetic resonance, v.8, PlenunrNew York, pp.77-130

42. Hausser, K.H., 1961, Z.Electrochem. v.65, pp.636-638

43. Backer, J.M., Budker, V.G., Eremenko, S.I. and Molin Yu.I. 1977, Detection of the kinetics of biochemical reactions with oxygen using exchange broadening in the ESR spectra of nitroxide radicals, Biochem.Biophys.Acta. v.460, pp. 152-156

44. Сагдеев, P.3., Молин, Ю.Н., 1967, ЖСХ, т.8, с.697

45. Добряков, С.Н., Лебедев, Я.С., 1968, Анализ спектральной линии, форма которой описывается композицией гаусса и лоренца, Доклады Академии наук СССР, т.182, №l, с.68-70

46. Ferruti, Р, Gill, D., Klein, М.Р, and Calvin, М., 1969, Correlation between conformation and pairwise spin exchange in flexible biradicals in solution. Control of conformation by pH-dependent ionic forces. J.Am.Chem.Soc. v.91, pp.7765-6

47. Ferruti, P, Gill, D., Klein, M.P, Wang, H.H., Entine, G., and Calvin, M., 1970, J.Am.Chem.Soc. v.92, pp.3704-13

48. Martine, V.V., Keana, J.F.W., 1995, J.Chem.Soc.Chem.Commun. pp. 723-4

49. Feldman A., E. Wildman, G. Bartolinini and L.H. Piette. 1975. In vivo electron spin resonance in rats. Phys Med Biol p.20, p.602-612.

50. Takeshita К., H. Utsumi and A. Hamada. 1991. ESR measurement of radical clearance in lung of whole mouse. Biochem Biophys Res Commun v. 177, p.874-880.

51. Utsumi, H., Muto, E., Masuda S., and Hamada, A., 1990. In vivo ESR measurement of free radicals in whole mice. Biochem Biophys Res Commun. v.172, p.1342-1348.

52. Alecci M., S. Colacicchi, P.L. Indovina, F. Momo, P. Pavone and A. Sotgiu.1990. Three-dimensional in vivo ESR imaging in rats. Magn Reson Imaging v.8, p.59-63.

53. Oikawa К., Т. Ogata, Н. Togashi, Н. Yokoyama, Н. Ohya-Nishiguchi and Н. Kamada. 1996. А 3D- and 4D-ESR imaging system for small animals. Appl Radiatlsot v.47, p.1605-1609.

54. Kuppusamy P., M. Chzhan, P. Wang and J.L. Zweier. 1996. Three-dimensional gated EPR imaging of the beating heart: time-resolved measurements of free radical distribution during the cardiac contractile cycle. Magn Reson Med v.35, p.323-328.

55. Nicholson I., F.J. Robb and D.J. Lurie. 1994. Imaging paramagnetic species using radiofrequency longitudinally detected ESR (LODESR imaging). J Magn Reson В vA 04, p.284-288.

56. Nicholson I., M.A. Foster, F.J. Robb, J.M. Hutchison and D.J. Lurie. 1996. In vivo imaging of nitroxide-free-radical clearance in the rat, using radiofrequency longitudinally detected ESR imaging. J Magn Reson В v. 113, p.256-261.

57. Yokoyama H., T. Sato, T. Ogata, H. Ohya-Nishiguchi and H. Kamada. 1997. In vivo longitudinally detected ESR measurements at microwave regions of 300, 700, and 900 MHz in rats treated with a nitroxide radical. J Magn Reson v. 129, p.201-206.

58. Yokoyama H., T. Sato, N. Tsuchihashi, T. Ogata, H. Ohya-Nishiguchi and H. Kamada. 1997. A CT using longitudinally detected ESR (LODESR-CT) of intraperitoneally injected nitroxide radical in a rat's head. Magn. Reson. Imaging, v. 15, p.701-708.

59. Yokoyama H., T. Sato, H. Ohya-Nishiguchi and H. Kamada. 1998. In vivo 300 MHz longitudinally detected ESR-CT imaging in the head of a rat treated with a nitroxide radical. MAGMA, v.7, p.63-68.

60. Seimenis I., M.A. Foster, D.J. Lurie, J.M. Hutchison, P.H. Whiting and S. Payne. 1997. The excretion mechanism of the spin label proxyl carboxylic acid (PCA) from the rat monitored by X-band ESR and PEDRI. Magn Reson Med v.21, p.552-558.

61. Lurie D.J., M.A. Foster, D. Yeung and J.M. Hutchison. 1998. Design, construction and use of a large-sample field-cycled PEDRI imager. Phys Med Biol v.43,p.1877-1886.

62. Puwanich P., D.J. Lurie and M.A. Foster. 1999. Rapid imaging of free radicals in vivo using field cycled PEDRI. Phys Med Biol v. 44, p.2867-2877.

63. Khramtsov, V.V., Grigor'ev, I.A., Foster, M.A., Lurie, D.J., and Nicholson, I.,2000, Biological applications of spin pH probes, Cell.Mol.Biol., 46 (8), 1361-1374.

64. Mader К., B. Gallez, K.J. Liu and H.M. Swartz. 1996. Non-invasive in vivo characterization of release processes in biodegradable polymers by low-frequency electron paramagnetic resonance spectroscopy. Biomaterials v. 17, p.457-461.

65. Gallez В., Mader, K. and Swartz, H.M., 1996. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn Reson Med у36, p.694-697.

66. Sotgiu A., K. Mader, G. Placidi, S. Colacicchi, C.L. Ursini and M. Alecci. 1998. pH-sensitive imaging by low-frequency EPR: a model study for biological applications. Phys Med Biol v.43, p.1921-1930.

67. Glazachev, Yu.I., Grigor'ev, I.A., Reijerse E.J. and Khramtsov, V.V. 2001, EPR Studies of 15N- and 2H-Substituted pH-Sensitive Spin Probes of Imidazoline and Imidazolidine Types, Appl. Magn. Reson. v.20, p.489-505.

68. Glazachev, Yu.I., Khramtsov, V.V., Berezina, T.A., and Yolodarsky, L.B.,1998(12), Imidazoline biradical spin labels with EPR spectral sensitivity to the local concentration of proton, Appl. Magn. Reson. 15, 407-415

69. Meister, A., and Anderson, M.E., 1983, Annu.Rev.Biochem. v.52, pp.711-760

70. Garrick, M.D., Orfanos, O.P., and Rogers, L., 1981, J.Pediatr. v.92(2), pp.265267

71. Boyne, A.F., Ellman, G. 1972, A methodology for analysis of tissue sulfhydryl components. Anal.Biochem. v.46, pp.639-53

72. Burton, N.K., and Oherne, G.W., 1986, J.Chromatogr. v.382, pp.253-257

73. Werkhoven-Goewie, C.F., Niessen, W.M.A., Brinkman, U.A.F., and Frei, R.F.,1981, J.Chromatogr. v.203, pp.165-172

74. Berliner, L.J., Grunwald, J., Hankovszky, H.O., Higer, K. 1982, Novel reversible thiol-specific spin label: papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. v. 119(2), pp.450-455.

75. Weiner, L.M., 1995, Quantitative determination of thiol group in low- and high-molecular-weight compounds by an electron paramagnetic resonance. Methods Enzymol. v.251, pp.87-105

76. Singer, N., and Nicholson, G., 1972, The fluid mosaic model of the structure of the cell membranes., Science, v. 175, pp.720-731

77. Richter, C., Gut, J. and Kunz, B.C. 1988. Stucture and dynamic of the liver microsomal monoxygenase system. In: Subcellular Biochemisrty. New York and London.Plenum Press, p. 259-279.

78. Cohen, M.H. and Turnbull, D., 1959. JChemPhys v.31,p,1164-l 169.

79. King, M.D. and Marsh, D., 1986. Free volume model for lipid lateral diffusion coefficients. Assessment of the temperature dependence in phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine bilayers. Biochim Biophys Acta v.862, p.231 -234.

80. Almeida, P.F., Vaz, W.L., and Thompson, Т.Е., 1992. Lateral diffusion and percolation in two-phase, two-component lipid bilayers. Topology of the solid-phase domains in-plane and across the lipid bilayer. Biochemistry v.31, p.7198-7210.

81. Saffman P.G. and M. Delbruck. 1975. Brownian motion in biological membranes. Proc Natl Acad Sci USA v.72, р.3111 -3113.

82. Saxton, M.J. 1992. Lateral diffusion and aggregation. A Monte Carlo study. Biophys J v.61, p.l 19-128.

83. Saxton, M.J. 1990. Lateral diffusion in a mixture of mobile and immobile particles. A Monte Carlo study. Biophys J. v.58, p.l303-1306.

84. O'Leary, T.J. 1987. Lateral diffusion of lipids in complex biological membranes. Proc Natl Acad Sci USA v.84, p.429-433.

85. Esterbauer, H., Cheeseman, K.H., Dianzani, M.U., Poli, G., and Slater, T.F.1982. Separation and characterization of the aldehydic products of lipid peroxidation stimulated by ADP-Fe2+ in rat liver microsomes. Biochem J v.208, p.129-140.

86. Zs-Nagy, I., К. Kitani, and M. Ohta. 1989. Age-dependence of the lateral mobility of proteins in the plasma membrane of hepatocytes of C57BL/6 mice: FRAP studies on liver smears. J. Gerontol, v.44, p.B83-B87

87. Axelrod, D., Koppel, D.E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, B.B., 1976, Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery, Biophys. J., v.16, pp. 1065-1069

88. Еременко, С.И., Скалчинский, О.Б., Вайнер, JI.M., Громова, O.A., Ляхович, В.В. 1986, Изучение латеральной диффузии NADPH-цитохром Р-450-редуктазы в мультислоях из фосфатидилхолина, Биологические мембраны, т.З, №Ъ с.253-60

89. Скалчинский, О.Б., Еременко, С.И., Вайнер Л.М. 1986, Влияние цитохрома Р-450 на латеральную диффузию NADH-цитохром Р-450 редуктазыв фосфолипидных мультислоях. Биологические мембраны. т.З, №10, с.1005-9

90. Gordon G.W., В. Chazotte, X.F. Wang and В. Herman. 1995. Analysis of simulated and experimental fluorescence recovery after photobleaching. Data for two diffusing components. Biophys Jv.68, p.766-778.

91. Periasamy N. and A.S. Verkman. 1998. Analysis of fluorophore diffusion by continuous distributions of diffusion coefficients: application to photobleaching measurements of multicomponent and anomalous diffusion. Biophys J v. 75, p.557-567.

92. Tsay T.T. and K.A. Jacobson. 1991. Spatial Fourier analysis of video photobleaching measurements. Principles and optimization. Biophys. J. v.60, p.360-368.

93. Berk D.A., F. Yuan, M. Leunig and R.K. Jain. 1993. Fluorescence photobleaching with spatial Fourier analysis: measurement of diffusion in light-scattering media. Biophys. J. v.65, p.2428-2436.

94. Anderson, M.E., Meister, A. 1980, Dynamic state of glutathione in blood plasma. J.Biol.Chem. v.255, pp.9530-3

95. Imai, Y., 1976, The use of 8-aminooctyl sepharose for the separation of some components of the hepatic microsomal electron transfer system., J.Biochem., v.80, pp.267-276

96. Torchinskii, Yu.M. 1976, Sulphur in proteins. Moscow:Nauka

97. Khramtsov, V.V., Goryunova, Т.Е., Weiner, L.M. 1991, Monitoring of enzymatic activity in situ be EPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. v. 179, pp.520527

98. Nohl, H., Stolze, K., Weiner, L.M. 1995, Noninvasive measurement of thiol levels in cells and isolated organs. Methods Enzymol. v. 251, pp. 191-205

99. Hagenfeldt, L., Arvidsson, A., Larsson, A. 1978, Glutathione and y-glutamylcysteine in whole blood, plasma and erythrocytes. Clin. Chi.Acta. v.85, pp. 167-173

100. Yelinova, V.I., Krainev, A.G., Savelov, A., Grigor'ev, I.A., 1993, Comparative study of the reduction rates of various types of imidazoline radicals in tissues. J.Chem.Soc. PerkTrans. v.2, pp.2053-2055

101. Rogers, M.J., Strittmatter, P., 1974, Evidence for randon distribution and translational movement of cytochrome-bs in endoplasmic reticulum, J.Biol.Chem. v.249, pp.895-900

102. Strittmatter, P., Rogers, M.J. 1972 The binding of cytochrome-b5 to liver microsomes, J.Biol.Chem. v.247, pp.7188-7194

103. Strittmatter, P., Rogers, M.J. 1975 Apparent dependence of interactions between cytochrome-bs and cytochrome-b5 reductase upon translational diffusion in dimyristoyl lecithin liposomes, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. v.12, pp.2658-61

104. Richter, C., Gut, J., and Kunz B.C., 1988, Structure and dynamics of the liver microsomal monoxygenase system. In:Subcellular Biochemistry, v. 13, p.259-279

105. Бородин, E.A., Добрецов, Г.Е., Карасевич, Е.И., Карузина, Е.И., Карякин, А.В., Кузнецова, Г.И., Спирин, М.Н., Арчаков, А.И. 1981, Биохимия, т.46, с.1109-1118

106. Wu, E.-S., Yang, C.S. 1984, Lateral diffusion of cytochrome-P-450 in phospholipid bilayers, Biochemistry, v.23, pp.28-33

107. Gogol, E.P., Engelman, D.M. 1984, Neutron scattering shows that cytochrome-bs penetrates deeply into the lipid bilayer, Biophys. J. v.46, p.491-492

108. Gogol, E.P., Engelman, D.M. Zacca, G. 1983, Neutron diffraction analysis of cytochrome-bs reconstituted in deuterated lipid multilayers, Biophys. J. v.43, p.285-292

109. Hardt,S.L. 1979,Biophys. Chem. v. 10,pp.239-43

110. Taniguchi, H., Imai, Y., Sato, R., 1984, Role of the electron transfer system in microsomal drug monooxygenase reaction catalyzed by cytochrome P-450, Arch.Biochem. and Biophys. v.232, pp.585-596

111. Zaba, B.N., Wilkinson, M.C., Taylor, D.M., Lewis, T.J. and Laidman, D.L.1987, Electrochemical characteristics of platinum electrodes coated with cytochrome bs-phospholipid monolayers, FEBS Lett. v.213(l), pp.49-54.

112. Stadtman, E.R., Oliver, C.N., 1991, Metal-catalyzed oxidation of proteins. Physiological consequences. J.Biol.Chem. v.266, pp.2005-2008

113. Harman, D., 1991, Proc.Natl.Acad.Sci. USA v.88, pp.5360-5363

114. Borodin, P.M., Klotchkov, D.V., Kolpakov, V.G. Markel, A.L., Morozkova, T.S., Silov, A.G., Shumskaya, I.A., Solovjeva, N.A., Seov, O.L., Trut, L.N.1977, Strains (stocks) mutants held. Rat.News Lett. №1, pp.50-51

115. Соловьева, H.A., Морозкова, T.C., Салганик, Р.И. 1975, Получение сублинии крыс с признаками наследственной галактоземии и исследование их биохимических особенностей. Генетика, т. 11, №5, с.63

116. Елисеева, А.Г., Соловьева, Н.А., Морозкова, Т.С., 1975, Исследование высшей нервной деятельности крыс, обладающими признаками наследственной галактоземией. Генетика, т.11, №5, с.72

117. Соловьева, Н.А., Клочков, Д.В., Семенова, Л.А. 1976, Нарушение воспроизводительной функции и другие патологические явления у крыс с наследственнной галактоземией. Изв. СО АН СССР, т.2, №10, с. 144

118. Соловьева, Н.А., Салганик, Р.И. 1982, Исследование биохимических механизмов развития наследственной галактоземии у крыс линии W/SSM. Генетика. №3, с.420-7

119. Соловьева, Н.А., Гинзбург, Э.Х., Казарииова, Ф.С., Кандауров, В.В., Салганик, Р.И. 1987, Повышенный транспорт галактозы в клетки как причина развития наследственной галактоземии у крыс. Вопр. Мед.Химии. т.ЗЗ, с.948-8

120. Хорст, А., 1967, Молекулярная патология. М. :Медицина с. 182