Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, доктор биологических наук Згода, Виктор Гаврилович

• Згода, Виктор Гаврилович
• доктор биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор биологических наук Згода, Виктор Гаврилович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цитохромы Р450, общая характеристика

СУР1А

СУР1А

СУР2В

СУР2В

Подсемейство СУР2С

СУР2Б

СУР2Е

Подсемейство СУРЗА

Протеомика, основные методы протеомных исследований

Методы разделения белков, применяемые в протеомных исследованиях. 38 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ)

Особенности разделения мембранных белков

Безгелевые методы протеомного анализа

Методы протеомного анализа цитохромов Р

Методы предварительного разделения белков суперсемейства Р450 в протеомике

Масс-спектрометрический анализ цитохромов Р450 56 Идентификация цитохромов Р450 в биологических объектах методами массспектрометрии

Методы количественного масс-спектрометрического анализа. 58 Относительное масс-спектрометрическое количественное определение цитохромов Р450 без использования изотопной метк

Использование методов с введением изотопной метки для массспектрометрического анализа цитохромов Р

Фолдинг и сборка белков

Основная роль молекулярных шаперонов

Основы и нарушения белкового фолдинга

Классификация шаперонов.

Система ШР

Шаперонины

Система ШР

Взаимосвязь трансляции и фолдинга

Поддержание протеома и сеть протеостаза

Протеостаз при старении и заболеваниях

Ко-трансляционная вставка гема в апофермент Р

Встраивание гема в молекулу апофермента Р

Факторы, определяющие аффинность взаимодействия гема с белком.

Роль гема в фолдинге гемопротеинов

Ориентация гема в белке

Молекулярный механизм встраивая гема в Р

Окислительная инактивация Р

Окислительная инактивация цитохрома Р450 в процессе катализа и при автоокислении

Исследование окислительной модификации гема и апофермента цитохрома

Р450 в монооксигеназной реконструированной системе

Внутриклеточная окислительная модификация других маромолекул и их деградация

Системы деградации белков

Убиквитин-зависимая 268 протеасомная система

Система деградации белков эндоплазматического ретикулума 109 Цитохромы Р450 как модель для изучения протеолитической деградации интегральных белков ЭР

Деградация белков Р

Деградация отдельных изоформ Р

ERAD нативных CYP 3А4, 2С11 И 2В1 в CEREVISIAE

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Посттрансляционная регуляция цитохромов Р450 подсемейства 2В»

LC-ESI -MS/MS -анализ 132

Структурное и функциональное восстановление CYP2B1 in vitro 136

Обработка цитозоля GA-агарозой 137

Эффект GA и GSH на гемин-зависимое восстановление CYP2B1 138

Анализ вестерн-блот Hsp90 13 8 Анализ вестерн-блот микросом печени с антителами IgG против GRP94,

GRP78 и ERp29 139

Ингибирование гемин-зависимого восстановления 2В1 антителами 139

Исследование деградации Р450 2В 140

Плазмиды для экспрессии СYP2B1 140

Экспрессионный вектор СYP2B1 -3А4СТ 140

Трансформация дрожжевых клеток плазмидами 141 Экспрессия CYP2B1 и CYP2B1-3A4CT в Escherichia coli, функциональная реконструкция монооксигеназной системы 141

Выделение микросом дрожжей 141

Иммуноблотинг CYP2B1 142 Методы исследования окислительной модификации цитохрома Р450 2В4. 143

Выделение НАДФН-цитохром Р450 редуктазы 145

Мономеризация CYP2B4 и НАДФН-цитохром Р450 редуктазы 145

Инактивация Р450 в монооксигеназной реконструированной системе 146

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 150

Сравнительный анализ методов протеомного анализа мембранных белков 150

Разработка метода количественной оценки содержания белков в биоматериале без использования изотопных меток 155

Влияние индукторов Р450 на изменение белкового состава клеток печени мыши 166

Верификация количественных протеомных данных методом МРМ 174

Роль цитозольных факторов и мембранных белков клеток печени во встраивании гема в апобелок CYP2B 185

Гемин-зависимое структурное и функциональное восстановление AIAинактивированного микросомального СYP2B1 186

Роль Hsp90/GRP94 в гемин-зависимом восстановлении CYP2B1, инактивированного суицидным ингибитором 188

Н202-зависимая инактивация цитохрома Р450 в реконструированной монооксигеназной системе 195

Окислительная модификация гема в Р450 200

Агрегация Р450 204

Образование ковалентных сшивок в Р450 207

Изменения в первичной структуре цитохрома Р450 2В4 при его инактивации в MPC 210

Окисление SH-групп при инактивации Р450 210

Образование карбонильных групп в Р450 в ходе инактивации 212

Протеолитическая деградация нативного и модифицированного CYP2B 215

Исследование роли системы деградации UBC/HRD в гидролизе CYP2B1 215

Исследование роли генов РЕР4 в протеолитической деградации CYP2B1 217

Деградация CYP2B1-ЗА4СТ в дрожжах 218

ОБСУЖДЕНИЕ 223

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 240

ВЫВОДЫ 244

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 245

БЛАГОДАРНОСТИ 293

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОН - гидроксильный радикал 16ß-OHT - 1бр-ОН-тестостерон IDE - одномерный электрофорез DNPTi - 2,4-динитрофенилгидразин 2DE - двумерный электрофорез MX - 3-метилхолантрен AIA - аллилазизопропил

AQUA - метод абсолютной количественной оценка белка с использованием изотопно-меченных пептидов АДФ - аденозиндифосфат

CAR - конститутивный андростановый рецептор

СВВ - куммаси голубой

СЕ - капиллярный электрофорез cICAT (Cleavable Isotope Coding Affinity Tag) - расщепляемая изотопная метка CID (Collision Induced Dissociation) - диссоциация ионов в результате столкновений CYP - цитохром Р450

DDEP - диметил-4-этил-1,4-дигидропиридин DEX - дексаметазон

DIGE (Differential Imaging Gel Electrophoresis) - гель-электрофорез с дифференциальной окраской

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

ERAD - ассоциированная с ЭР деградация белков

ESI - метод ионизации методом электростатического распыления

ETD - метод фрагментации пептидов переносом электронов

GA - гелданамицин

GR - глюкокортикоидньтй рецептор

GRP94 - белок, регулируемый глюкозой

GSH - глутатион

GSSG - дисульфид глутатиона

HMGCoA - З-гидрокси-З-метилглутарил-СоА

HSP - белок теплового шока

HUPO - международная организация Протеом человека

ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag) - маркируемая изотопом аффинная метка

ICPL (Isotope-Coded Protein Label) - маркируемая изотопом белковая метка iTRAQ (Isobaric Tagging Reagents Amino-Reactive Quantification) - реагент для изобарной метки

КРВ - калий-фосфатный буфер

LC-ESI-MSYMS - жидкостная тандемная хроматомасс-спектрометрия MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) -времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией веществ лазерной десорбцией при содействии матрицы

МНС - главный комплекс гистосовместимости MRM - мониторинг множественных реакций mRP - обращенная фаза с макропорами MS/MS - тандемная масс-спектрометрия

MudPiT (Multidimentional Protein Identification Technology) - протеомная технология многомерной идентификации белков

MUP - основной белок мочи

NAPQI - N-ацетилхинонимин

NE - норетиндрон nNOS - нейрональная NO-синтаза

NP40 - нонилфеноксиполиэтоксиэтанол

N-ДМБ - N-деметилирование бензфетамина pi - изоэлектрическая точка

PMF (Peptide Mass Fingerprint) - метод протеомной идентификации белков по массам пептидов

PXR - прегнановый X рецептор

QQQ - масс-спектрометр с тройным твадруполем q-TOF- времяпролетный масс-спектрометр с гибридным квадруполем RPLC - обращенно-фазовая жидкостная хроматография RP-LC-MS/MS - метод жидкостной обращено фазовой хроматографии и тандемной масс-спектрометрии

SCX - ионнобменная хроматография на сильнокатионном носителе

SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture) - внесение метки стабильного изотопа в клеточной культуре

SNP - однонуклеотидный полиморфизм

ТАО - ингибитор тролеиомицина

TBS - трис-солевой буфер

TBST - тритон содержащий трис-солевой буфер Ub - убиквитин

UPS - убиквитин протеасомная система

VDR - рецептор витамина D

АТФ - аденозин трифосфат

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВМЗ - цитохром Р450 Bacillius megaterium, CYP103

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФ - гель фильтрация

ДГА - дегидроаскорбиновая кислота

ДСН - додецил-сульфатом натрия

ДСН-ПААГ - полиакриламидный гель с додецил-сульфатом натрия ИЭФ (IEF) - изоэлектрофокусирование, к ДНК - кодирующая ДНК мРНК - матричная РНК

MPC - мономерная реконструированная система

НАДФН - восстановленный никотинамидаденинуклеотидфосфат

02* - супероксиданион

ПМ - пиренмалеимид

ПРОД - пентокси-резурофин О-деметилаза Р450сам - цитохром Р450 Pseudomonasputida CYP101 РРР - 2-фенил-2-(1-пиперидинил)пропан СОД - супероксиддисмутаза ФБ - фенобарбитал цАМФ - циклический адепозинмонофосфат ЦФА - циклофосфамид ЭР - эндоплазматический реитикулум ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

ВВЕДЕНИЕ

Цитохромы Р450 (СУР) являются ключевыми ферментами первой фазы метаболизма и относятся к наиболее важными катализаторам окисления лекарственных препаратов. Р450 широко распространены в природе и обнаружены во всех аэробных организмах. В настоящее время известны геномные последовательности более чем 18500 цитохромов Р450, составляющих десятки и сотни семейств и подсемейств, соответственно. Изоферменты цитохрома Р450 -представители разных семейств и подсемейств, отличаются субстратной специфичностью и регуляторами их активности (ингибиторами и индукторами). В настоящее время у человека идентифицировано 57 форм цитохрома Р450 и 15 из них участвуют в метаболизме ксенобиотиков, включая 90% реакций I фазы метаболизма лекарств [1].

Активность монооксигеназной системы в отношении того или иного лекарственного препарата определяется, главным образом, концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохрома Р450. Поэтому индивидуальные особенности метаболизма лекарственных соединений определяются персональным профилем - концентрацией и активностью цитохромов Р450 [2].

Белки подсемейства СУР2В составляют 0,2-10% от содержания всех цитохромов Р450 в печени, при этом наблюдается высокая межиндивидуальная вариабельность концентрации данных белков [3]. Согласно современным данным, содержание СУР2В6 в микросомах печени человека варьирует в 80 раз [4]. Такие межиндивидуальные различия в концентрации СУР2В6 в печени и его ферментативной активности могут приводить к значительной вариабельности терапевтического действия множества лекарств, которые метаболизируются СУР2В6.

Благодаря достижениям молекулярной биологии механизмы индукции генов, кодирующих СУР2В, изучены достаточно хорошо. Однако концентрация белка и его активность определяются после синтеза полипептидной цепи на рибосомах.

Такие посттрансляционные события, как фолдинг, модификации первичной структуры и, наконец, деградация белка являются определяющими для реализации

11 монооксигеназной функции Р450 [5]. Однако данные механизмы исследованы значительно хуже.

Для определения сложных, многокомпонентных изменений, которые происходят в посттрансляционной судьбе белков, необходимо использовать методические подходы, при которых возможно регистрировать сотни и тысячи белков. Одним из таких подходов является протеомика, которая позволяет идентифицировать и выявлять количественные и качественные изменения в белковом составе клеток и тканей.

В настоящей работе для изучения посттрансляционной регуляции Р450 использовался экспериментальный подход, основанный на комбинации протеомных высокопроизводительных методов и последующей верификации полученных данных с использованием модельных экспериментальных систем.

Цель работы: определение молекулярных механизмов посттрансляционной регуляции микросомальных цитохромов Р450 и взаимодействий белков монооксигеназной системы печени с клеточными компонентами, отвечающими за фолдинг, окислительную модификацию и деградацию белков на примере ферментов подсемейства СУР2В

Основные задачи исследования:

1. Провести экспериментально обоснованный выбор метода протеомного анализа мембранных белков и их количественной оценки.

2. Исследовать влияние индукторов Р450 на изменения в белковом составе клеток печени.

3. Определить роль цитозольных факторов и микросомальных белков клеток печени во встраивании гема в апобелок СУР2В.

4. Исследовать молекулярные механизмы посттрансляционной окислительной модификации СУР2В.

5. Исследовать механизмы протеолитической деградации нативного и модифицированного СУР2В.

Научная новизна.

С использованием разработанного высокопроизводительного протеомного метода установлено, что введение индукторов цитохромов Р450 (фенобарбитала и 3-мегилхолантрена) приводит к значительному изменению белкового профиля в ходе индукции цитохрома Р450 в печени мыши.

Установлен молекулярный механизм сборки полипептидной цепи и гемовой части СУР2В в структурно- и функционально-активный фермент.

Изучены окислительные посттрансляционные изменения цитохрома Р450 и возможное влияние этих изменений на время жизни белка. Предложен механизм, по которому проходит деградация белков подсемейства цитохромов СУР2В и показана роль определенных участков аминокислотной последовательности белка в механизме определении пути деградации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фармакологическая индукция Р450 сопровождается увеличением содержания белковых компонентов мопооксигеназной системы; шаперопов, вовлеченных в фолдинг белков мопооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомсостатические и метаболические функции клетки.

2. В сборке функционально активного холофермента Р450 участвуют эндогенный восстановленный глутатион и шаперон вКР94.

3. Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода (АФК), которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых СУР2В.

4. В реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома СУР2В с АФК приводит к химической модификации трех из четырех остатков цистеина цитохрома и образованию белковых агрегатов. Данные модификации являются сигналом для протеаз. ответственных за деградацию белков иадсемейства.

5. Катаболизм СУР2В в модельных дрожжевых системах включает протсасомпый либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической деградации. В дрожжах, дефицитных по вакуольным (лизосомным) ферментам, скорость деградации CYP2B значительно снижается. При внесении мутаций в первичную структуру CYP2B скорость его деградации значительно увеличивалась за счет вовлечения протеасомных ферментов в этот процесс.

Научно-практическая значимость работы. Разработанные методические подходы протеомного анализа могут быть использованы в работах по поиску маркеров заболеваний и анализу белкового состава биологических объектов. Поскольку цитохромы Р450 активно участвуют в окислении ксенобиотиков (в том числе лекарственных соединений), знание посттрансляционных молекулярных механизмов, контролирующих функцию монооксигеназной системы, может быть использовано при разработке лекарственных соединений и для оптимизации и персонализации фармакотерапии.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: 12-th International symposium on microsomes and drug oxidations (Montpellier, France, 1998); International workshop "From .Sequence to function: Experimental and Bioinformatic Studies of Cytochrome P450 Superfamily" (Moscow, 2000); 12-th International Conference on Cytochrome P450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology (France, 2001); International Meeting on Proteome Analysis (Munchen, 2001); International Conference Genomics and Bioinformatics for Medicine (St.Peterburg-Moscow, 2002); 13-th International Conference on Cytochromes P450 (Prague, 2003); 2nd International Conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004); 14th International conference on Cytochromes P450: biophysics and bioinformatics (Dallas, USA, 2005); HUPO 3th Annual World Congress в Пекине (KFIP) в 2004 г; 3-й международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Новосибирске (Россия) в 2006 г., HUPO 6th Annual World Congress в Сеуле (Южная Корея) в 2007 г., HUPO 7th Annual World Congress в Амстердам (Нидерланды) в 2008 г., 4-ая международная конференция «Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине» в Москве и Нижнем Новгороде (Россия) в 2008 г., HUPO 8th Annual World Congress в Торонто (Канада) в 2009 г.: HUPO 9th Annual World Congress в Сиднее (Австралия) в 2010 г., Taiwan-Russia

Research Cooperation Symposium '"New mass spectrometry methods in proteomics'' в Гаосюне (Тайвань) в 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 научных работ в российских и иностранных научных изданиях, в том числе 46 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК, и 23 публикации в докладах научных конференций. Индекс Хирша составляет 12 по данным систем «Scopus» и «Web Of Science».

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цитохромы Р450, общая характеристика.

Цитохромы Р450 (CYP) являются основным ферментом системы первой фазы метаболизма, вовлеченным в биотрансформацию эндогенных соединений и подавляющего большинства лекарств, используемых в терапии [6]. Белки надсемейства Р450 получили свое название вследствие характерного спектроскопического сдвига, детектируемого при связывании монооксида углерода (СО) с восстановленным атомом железа гема Р450 [7]. Цитохромы Р450 широко распространены в природе и обнаружены во всех аэробных организмах. В настоящее время известны геномные последовательности более чем 18000 цитохромов Р450, составляющих десятки и сотни семейств и подсемейств, соответственно [1]

Классификация надсемейства определяется символами CYP, за которыми следуют цифры, обозначающие номер семейства (группа белков с более чем 40% идентичностью аминокислотной последовательности). Следующая за обозначением семейства буква соответствует группе белков, входящих в подсемейство (белки с более чем 55% идентичностью аминокислотной последовательности) и, наконец, цифра, обозначающая конкретный ген, кодирующий определенную изоформу Р450 [8]. Изоферменты надсемейства цитохромов Р450 отличаются субстратной специфичностью и регуляторами активности (ингибиторами и индукторами). Однако некоторые из них обладают перекрестной субстратной специфичностью, имеют одинаковые ингибиторы и/или индукторы. Белки надсемейства Р450 являются внутриклеточными белками, локализованными в мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР), который также служит местом метаболизма ксенобиотиков [9].

В настоящее время у млекопитающих идентифицировано по крайней мере 17 семейств Р450. Двенадцать из них участвуют в метаболизме ксенобиотиков [6]. При этом в метаболизме лекарственных средств принимают участие ферменты семейств I, II и III. В частности, изоферменты CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E катализируют около 90% реакций гидроксилировання лекарственных соединений [6]. Другие представители CYP участвуют в биосинтезе стероидов, метаболизме желчных кислот, арахидоновой кислоты и других эндогенных соединений [10]. Ниже приведена краткая характеристика основных изоформ Р450 человека, участвующих в метаболизме лекарств.

CYP1A2

Подсемейство CYP1A человека представлено двумя изоформами - CYP1A1 и CYP1A2. Для CYP1A1 наибольшая концентрация белка обнаружена в легких и плаценте, при этом он незначительно представлен в печени [11]. Генетический полиморфизм CYP1A1 и его индукция полицикличными ароматическими углеводородами являются возможными причинами возникновения рака легких [12].

CYP1A2

- основной представитель подсемейства, составляет 13% от общего содержания Р450 печени [13]. Индукторами активности CYP1A2 являются соединения сигаретного дыма. В результате такой индукции метаболизм специфичных для 1А2 субстратов увеличен более чем в 2 раза у курящих людей по сравнению с некурящими [14]. Другим индуктором 1А2 является омепразол, что должно учитываться при использовании сочетанной лекарственной терапии [15]. Вариабельность межиндивидуального содержания CYP1A2 в печени огромна. Например, в работах Klein и соавт. показана разница в активности фермента в 4060 раз для различных этнических групп [11]. Также показано присутствие более десятка SNP в промоторной или кодирующей областях гена CYP1A2 [16,17]. Однако на сегодняшний день не обнаружено ни одного полиморфизма, изменяющего ферментативную активность или содержание CYP1А2 в печени [16]. Цитохром CYP1A2 участвует в метаболизме нескольких лекарств, включая фенацетин, кофеин, теофиллин, парацетамол, оланзапин, лидокаин. Кроме того, CYP1A2 участвует в метаболизме некоторых проканцерогенов [18]. Кофеин используется в качестве маркерного субстрата in vivo, т.к. основной путь метаболизма кофеина у человека (TV-3-деметилирование кофеина до параксантина) опосредован CYP1A2 [19]. Однако в экспериментах in vitro используются более специфичный к данному цитохрому 7-этоксирезоруфин [20].

Эффективными ингибиторами СУР1А2 являются антидепрессант флувоксамин (Кл ~ 0,2 мкМ), антибиотики ципрофлаксин и эноксацин [21]. Применение в клинике этих соединений нередко является причиной побочных лекарственных реакций в результате нарушения метаболизма других субстратов СУР1А2 [22].

СУР2В6

Исследования с использованием чувствительных и селективных методов иммунохимического анализа показали высокий уровень экспрессии СУР2В6 во всех исследованных образцах печени человека. Также была обнаружена высокая межиндивидуальная вариабельность (от 20 до 250 раз в разных исследованиях) [23]. Активность СУР2В6 в микросомах печени человека варьирует в 25 раз при использовании в качестве субстрата 8- мефенитоина [24] и 80 раз - бупропиона

25]. Такие межиндивидуальные различия в уровнях экспрессии СУР2В6 в печени и его ферментативной активности являются причиной вариабельности терапевтического действия значительного перечня лекарств, которые метаболизируются СУР2В6.

В последнее время появились работы, направленные на исследование основных механизмов, лежащих в основе межиндивидуальной вариабельности уровней экспрессии СУР2В6, включая полиморфизм гена СУР2В6, супрессию цитокинами

26] или активацию индукторами при транскрипции [27]. Исследованы ингибирование фермента и его аллостерическая активация [28]. Несмотря на то, что относительный вклад каждого из этих факторов в вариабельность СУР2В6 неизвестен, существуют предположения, что наибольшее значение имеет генетический полиморфизм и/или регуляция транскрипции гена. По сравнению с хорошо известными полиморфизмами СУР2Б6 и СУР2С19, генетическая вариабельность СУР2В6 и ее потенциальное клиническое значение изучено недавно. В настоящее время идентифицировано более 50 мутаций с известным гаплотипом СУР2В6 гена (www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2b6.htm). Присутствие полиморфных аллелей приводит к значительным изменениям уровня экспрессии СУР2В6 и, соответственно, его ферментативной активности [29].

Дополнительным источником вариабельности содержания СУР2В6 в печени и его каталитической активности является активация транскрипции соответствующего гена в ответ на введение ксенобиотиков. В отличие от хорошо изученного CYP2B грызунов, информация о потенциале и амплитуде индукции CYP2B6 человека, диапазоне потенциальных индукторов и ее механизме очень ограничена. Увеличение концентрации мРНК CYP2B6 или экспрессии соответствующего белка связано с введением таких известных индукторов Р450 как дексаметазон, фенобарбитал (ФБ) и рифампицин [30]. Позднее обнаружена индукция CYP2B6 in vitro после обработки первичных культур гепатоцитов циклофосфамидом (ЦФА), антагонистами кальциевых каналов, ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглутарил-СоА (IiMGCoA) редуктазы и триазилидипедионами [31]. Полученные данные показывают, что индукционный профиль CYP2B6 прямым или косвенным образом ассоциирован с активацией нескольких факторов транскрипции клеток печени, таких как pregnane X рецептор (PXR), constitutive androstane рецептор (CAR), глюкокортикоидный рецептор (GR), рецептор витамина D (VDR).

Первый всесторонний обзор о роли CYP2B6 в метаболизме ксенобиотиков человека опубликован почти пятнадцать лет назад [28]. Растущее количество публикаций, касающихся CYP2B6, показывает возросший интерес к данной изоформе надсемейства цитохромов Р450. В настоящем разделе литературного обзора будут рассмотрены новые аспекты механизмов, лежащих в основе межиндивидуальной вариабельности экспрессии CYP2B6. Основное внимание уделено вопросам генетического полиморфизма и клиническому значению генетической вариабельности CYP2B6, регуляции транскрипции и токсичности, ассоциированной с межлекарственными взаимодействиями.

CYP2B6

Индуцированный фенобарбиталом синтез ферментов микросомальной системы, метаболизирующих лекарства, обнаружен 40 лет назад, но первая кДНК основного индуцируемого фенобарбиталом CYP2B клонирована и секвенирована на двадцать лет позднее, [32]. Более того, человеческий ортолог 2В6 изолирован только в 80-х годах [33].

CYP2B6 вместе с связанным с ним псевдогеном CYP2B7 и некоторыми другими генами, кодирующими CYP2C, находится на длинном плече 19 хромосомы [33],

34]. Первоначально белок CYP2B6 с молекулярной массой 48 кДа детектировался только в некоторых образцах печени с крайне низкой экспрессией (менее 1% общего содержания цитохромов Р450 печени). Основной причиной низкого уровня детекции являлось отсутствие эффективного для CYP2D6 селективного антитела. Поэтому полагали, что CYP2B6 играет незначительную роль в метаболизме лекарств у человека. Однако в современных исследованиях концепция изменилась, так как использование более специфичных антител показало, что в среднем относительное содержание CYP2B6 составляет от 2 до 10% общего содержания цитохромов Р450 в печени [23]. Сегодня роль CYP2B6 в биотрансформации ксенобиотиков пересмотрена вследствие того, что: 1) идентифицировано большое количество новых субстратов данного фермента; 2) показана индуцибельность человеческого CYP2B6 разнообразными химическими агентами; 3) большим количеством связанных с CYP2B6 генетических полиморфизмов, которые определяю т высокий уровень межиндивидуальной вариабельности его активности.

CYP2B6распределение и локализация.

В отличие от центрального распределения в долях печени некоторых основных цитохромов Р450, таких как CYP3A4 и CYP2E1, CYP2B6 диффузно экспрессируется в зонах 1 и 3 паренхиматозных клеток на всем протяжении печеночных долей [35]. Иммуногистохимическое окрашивание срезов печени показывает, что паттерны зонального распределения CYP ЗА4, CYP2E1 и CYP2B6 хорошо сохраняются даже после химической индукции, подтверждая, что эти ферменты отвечают за регионально-селективный in situ метаболизм в печени. Например, анальгетик ацетаминофен метаболизируется CYP2E1 и CYP3A4 с образованием более токсичного промежуточного продукта N-ацетилхинонимина (NAPQI) и, как следствие, основные повреждения клеток печени вследствие токсичности ацетаминофена проявляется в центральнодолевой области, там, где главным образом экспрессируются CYP2E1 и CYP3A4 [36], [37]. Следовательно, химические агенты, преимущественно метаболизируемые CYP2B6 с образованием более токсичных метаболитов, будут вызывать повреждения в области локализации экспрессии CYP2B6. Подобно большинству других изоформ цитохромов Р450, CYP2B6 преимущественно экспрессируется в печени и вовлечен в первичный метаболизм лекарств. Экспрессия СУР2В6 также детектируется в мозгу, почках, кишечнике, эндометрии, бронхоальвеолярных макрофагах, лимфоцитах периферического кровообращения и коже [38]. Экспрессия СУР2В6 в головном мозге первоначально обнаружена в нейронах и астроцитах [39]. Авторы данного исследования наблюдали значительно более высокий уровень экспрессии СУР2В6 в головном мозге курящих и употребляющих алкоголь людей по сравнению с контрольной группой [39]. Высокий уровень экспрессии СУР2В6 наблюдался в церебральных клетках Пуркинье и пирамидальных нейронах в гиппокампе, которые, как известно, повреждены у алкоголиков. Следовательно, повышенный уровень экспрессии СУР2В6 может являться маркером повреждения нервных клеток. Другие исследования показали, что вариабельность экспрессии СУР2В6 в почках может приводить к биотрансформации изофосфамида с образованием токсичного метаболита хлорацетальдегида, что накладывает определенные ограничения на его терапевтическое применение [40]. В настоящее время функциональное значение СУР2В6 в различных органах до конца не исследовано, но становится очевидным, что специфическая экспрессия СУР2В6 может вызывать местное накопление реакционно-активных метаболитов и провоцировать повреждения органов.

Субстраты СУР2/36

Первоначально полагали, что СУР2В6 метаболизирует ограниченное количество ксенобиотиков, вследствие недостаточной чувствительности его обнаружения и отсутствия селективных субстратов и ингибиторов. Выделение специфичных моноклональных антител и использование экспрессированного и очищенного белка в реконструированных системах позволило значительно расширить спектр лекарств, которые являются субстратом СУР2В6. Как следствие, данные исследования повлияли на рост интереса к СУР2В6. В 1999 ЕклпБ и \\^1^1"11:оп [28] опубликовали первый обзор о роли СУР2В6 в метаболизме ксенобиотиков, где приведен список из более чем 50 химических агентов, метаболизируемых СУР2В6. С тех пор идентифицировано большое количество субстратов СУР2В6, включая клинически используемые терапевтические препараты, эндогенные соединения, пестициды и канцерогенные вещества, содержащиеся в окружающей среде[41].

Хотя СУР2В6 обладает перекрестной субстратной специфичностью с другими цитохромами Р450, включая СУРЗА4, высокое сродство к определенным субстратам и уникальность катализируемых ферментативных реакций биотрансформации являются отличительной особенностью фармакотоксикологического профиля СУР2В6. Использование микросом печени человека и рекомбинантного СУР2В6 позволило идентифицировать его в качестве уникального фермента, ответственного за 1Ч-деметилирование противоэпилептического препарата метобарбитала. В тоже время, некоторые другие цитохромы Р450 отвечают за его 4-гидроксилирование [42].

Исследования Ни с соавт. [43] показали, что СУР2В6 является единственным ферментом, катализирующим одновременно О-деметилирование и орто-гидроксилирование метоксихлора, в то время как остальные цитохромы Р450 специализированы по одной метаболической реакции. Более того, показано, что СУР2В6 вносит наибольший вклад в биотрансформацию таких клинически важных лекарств, как бупропион, артемизин, пропофол, метадон и петидин [44].

С увеличением роли СУР2В6 в метаболизме ксенобиотиков увеличивается вероятность обусловленных им межлекарственных взаимодействий. В качестве маркерного субстрата обычно используется бупропион, однако есть данные, что метаболизм данного субстрата обусловлен не только СУР2В6 [45]. До настоящего времени не обнаружено уникального субстрата СУР2В6, который не метаболизируется другими изоформами (обычно СУРЗА4, СУР2С9, СУР2С19). Только регистрация специфического метаболита или различия в аффинности могут помочь дифференцировать катализ, обусловленный СУР2В6, от реакций, катализируемых другими изоформами цитохромов Р450. Например, гидроксилирование бупропиона при низких концентрациях субстрата специфично для СУР2В6, в то время как другие ферменты образуют гидроксиметаболиты при гораздо более высоких концентрациях [25]. Недавно было показано, что метаболизм бупропиона под действием СУР2В6 характеризуется стереоселективностыо. Используемый в медицине бупропион представляет собой рацемическую смесь Я- и 8-энантиомеров. СУР2В6 селективно катализирует гидроксилирование 8-бупропиона. Несмотря на известные ограничения при использовании бупропиона в качестве маркерного субстрата для определении активности CYP2B6 in vivo, стереоселективность катализа позволяет проводить более точную оценку активности именно CYP2B6 по количеству образующегося (8,8)-гидроксибупропиона [46]. Стереоселективность катализа CYP2B6 не ограничивается метаболизмом бупропиона. Другим препаратом, используемым в медицине в виде рацемической смеси, является метадон. Метаболизм, обусловленный CYP2B6, стереоспецифичен по отношению к S-энантиомеру метадона. В то время как R —метадон активирует ц-опиоидные рецепторы и имеет наркотический эффект, S-метадон ингибирует калиевые каналы клеток сердца, что обуславливает побочные эффекты при применении метадона [47]. Показано, что уменьшение активности CYP2B6 ассоциируется с высокой концентрацией в плазме S-метадона, что может обуславливать нарушение сердечной деятельности, которые часто заканчиваются летально. Стереоспецифичный метаболизм лекарств CYP2B6 клинически значим и является предметом исследования при проведении заместительной терапии бупропионом или метадоном.

Несмотря на то, что точное число лекарств, метаболизируемых CYP2B6, все еще неизвестно, их количество уже превосходит ранние оценки. Еще в 2001 году полагали, что вклад CYP2B6 в биотрансформацию метаболизируемых цитохромами Р450 лекарств составляет менее 1%. Более поздние публикации показывают, что увеличивающееся количество клинически значимых субстратов CYP2B6 значительно превышает предыдущие оценки [48]. В некоторых публикациях полагают, что вклад CYP2B6 в метаболизм лекарств составляет около 8%. Более того, Xie и Evans [49] считают, что CYP2B6 способен метаболизировать 25-30% известных субстратов CYP3A4 [50]. В 2002 году опубликован обзор, содержащий данные по метаболизму более 1300 субстратов цитохромов Р450, включая CYP2B6. Согласно этим данным, вклад CYP2B6 в метаболизм лекарств составляет 7,6 %. Таким образом, можно отметить, что наблюдается тенденция увеличения роли CYP2B6 в метаболизме лекарств.

Важное значение имеет относительный вклад каждого из цитохромов в метаболизм лекарств, т.е. зависимость удельного содержания отдельной изоформы Р450 в составе общего пула Р450.

Так, CYP2B6, экспрессируемый в относительно низких (0,2-8% от всех Р450 печени), но вариабельных количествах, играет существенную роль в метаболизме клинически значимых лекарств. Здесь прослеживается сходство CYP2B6 с CYP2D6, который экспрессируется в печени в небольших количествах (менее 4% от уровня остальных цитохромов Р450), но вовлечен в метаболизм более 25% клинически используемых лекарств [51].

Ингибирование CYP2B6

Одним из важных аспектов клинической практики и при разработке новых лекарственных препаратов является ингибирование ферментов метаболизма лекарств. Кроме того, что ингибиторы цитохромов Р450 имеют клиническое значение для оценки общих межлекарственных взаимодействий, идентификация селективных и потенциальных химических ингибиторов важна для определения специфической роли каждого цитохрома Р450 в метаболизме/детоксикации ксенобиотиков. Некоторые селективные ингибиторы CYP2B грызунов, например, орфенадрин, вызывают неспецифическое ингибирование человеческих цитохромов Р450 в исследованиях in vitro. Несмотря на то, что большая часть работ нацелена на исследование лекарственных препаратов, показано, что в число потенциальных ингибиторов CYP2B6 входят вещества, которые загрязняют окружающую среду. Например, хлорпирифос, который широко используется как фосфорорганический инсектицид, является эффективным ингибитором ферментативной активности CYP2B6 [52].

В работе Walsky и соав. проведен скрининг веществ CYP2B6, способных ингибировать ферментативную активность CYP2B6. Из 277 соединений, различающихся по структуре, только треть ингибировали CYP2B6 более чем на 50% при концентрации 30 цМ. При этом, шесть лекарственных препаратов обладали высокой способностью ингибировать рекомбинантный человеческий CYP2B6 с IC50 при концентрации менее 1 цМ. В частности антикоагулянты клопидогрель и тиклопидин являлись одними из наиболее сильных ингибиторов ферментативной активности CYP2B6 [50]. Однако, чтобы ингибитор CYP2B6 использовался в исследовательских целях, он должен быть настолько же специфичным. В ряде работ исследована специфичность 4 известных ингибиторов активности CYP2B6, таких как 2-фенил-2-(1-пиперидинил)пропан (РРР), тиоТЕРА. клопидогрель и тиклопидин для определения фенотипа по данной изоформе Р450.

ТиоТЕРА показал минимальную селективность, недостаточную для фенотипирования, в то время как 2-фенил-2-(1-пиперидинил)-пропан (РРР), клопидогрель и тиклопидин продемонстрировали высокую селективность, подтвердив потенциал этих антикоагулирующих агентов в использовании их в качестве селективных ингибиторов CYP2B6. По мнению авторов РРР может служить селективным маркером для ингибиторных исследований активности CYP2B6 in vitro, так как он не используется в качестве лекарственного препарата. Клопидогрель и тиклопидин уже применяются в клинической практике и могут использоваться в медицинских исследованиях. Большая часть ингибиторов CYP2B6, известных в настоящее время, идентифицированы в экспериментах с CYP2B6 in vitro, однако эти данные могут быть использованы для определения возможных межлекарственных взаимодействий.

Генетический полиморфизм CYP2B6

По сравнению с хорошо изученными полиморфизмами CYP2D6 и CYP2C19, генетическая вариабельность CYP2B6 и ее клиническое значение выявлены только в последние годы. Тем пе менее, быстро растет количество фармакогенетических исследований этого фермента, которые указывают на значительную межиндивидуальную вариабельность уровней экспрессии и активности CYP2B6. В настоящее время на вебсайте номенклатуры аллелей CYP (http://www.cvpalleles.ki.se) зарегистрировано 28 охарактеризованных аллелей, 50 гаплотипов и более 100 SNPs. Функциональная характеристика выявила функциональные фенотипические изменения, связанные с полиморфизмом, включая значительное падение каталитической активности или полное отсутствие экспрессии CYP2B6 печени [53]. Генетическая вариабельность CYP2B6 обнаружена на протяжении всей генетической последовательности, включая 5'-промогор, интроны и кодирующую область. Несмотря на то, что большинство идентифицированных SNPs CYP2B6 не ведут к функциональным изменениям, было идентифицировано несколько SNPs, которые оказывают значительное влияние на фармакокинетику некоторых важных лекарств, таких как EFV, ингибитор обратной транскиптазы вируса ВИЧ, и противораковое пролекарство CPA [54]. в кодирующей области

Первый систематический анализ генетического полиморфизма СУР2В6 был направлен на исследование девяти экзонов кодирующей области [55]. В работе были идентифицированы девять единичных базовых мутаций. Из них четыре являлись молчащими мутациями, а пять - несинонимичными, которые приводили к аминокислотным заменам. Каждая из мутаций или их комбинация приводит шести различным аллельным вариантам СУР2В6: СУР2В6*2(64С>Т), СУР2В6*3(777С>А), СУР2В6*4(785А>С), СУР2В6*5(1459С>Т),

СУР2В6*6(5160>Т и 785А>0), СУР2В6*7(5160Т, 785А>в и 1459С>Т). СУР2В6*6, характеризуемая сочетанием 516в>Т в экзоне 4 и 785А>в в 5-ом экзоне, обнаружена у 15-40% азиатов и 40% афроамериканцев [55]. Анализ мРНК в печени человека показал, что аберрантный сплайсинг гена СУР2В6 приводит к СУР2В6*6 аллели, в которой отсутствуют экзоны 4, 5 и 6, что вызывает снижение уровня мРНК и функциональности белка [56]. Как гетерозиготные, так и гомозиготные носители СУР2В6*6 аллели имеют значительно более низкую каталитическую активность и экспрессию белка, по сравнению с носителями дикого типа СУР2В6*1 аллели. СУР2В6*6 связывают с нарушением метаболизма ЕБУ, что приводит к значительному увеличению его концентрации в плазме и токсическим эффектам. Другая полиморфная аллель СУР2В6*5 детектируется у 14-25% белокожего населения и приводит к значительному снижению экспрессии белка и его каталитической активности у женщин [57].

Другие 19 аллелей кодирующей области исследованы в работах нескольких независимых исследовательских групп [58]. Несмотря на то, что все аллели приводят к аминокислотным заменам, функциональные изменения экспрессии/активности СУР2В6 широко варьируются. Последние исследования показали, что включение менее распространенных нефункциональных аллелей значительно увеличивает число предсказанных полиморфизмов СУР2В6, особенно при повышении концентрации ЕБУ [59]. Охарактеризованы такие аллели как СУР2В6* 16(785А>в и 983Т>С), *18(983Т>С), *27(593Т>С), *28(1132С>Т), 4 феногипически нулевые аллели *8(415А>С), *11(136А>С) *12(296С>А) и * 15(1172Т>А) (Пшр://уу\у\у. сура! leles.ki.se/cv p2b6.htm). Ключевые изменения этих несинонимичных мутаций локализуются в кодирующей области, но на экспрессию

26 и активности CYP2B6 это влияет в разной степени. Например, CYP2B6*6 ассоциирован со значительным уменьшением Б-мефенитоин-К-деметилазной активности, при этом наблюдалось незначительное уменьшение экспрессии белка. С другой стороны, полиморфная форма CYP2B6*5 приводит к значительному снижению экспрессии, но слабому уменьшению каталитической активности [60]. Несмотря на то, что механизмы, лежащие в основе этих фенотипических изменений неизвестны, можно отметить: 1) совместно присутствующие в области промотора или интронах SNP могут влиять на экспрессию гена; 2) некоторые несинонимические мутации могут модифицировать активный центр фермента и приводить к субстрат-специфичным изменениям; 3) в числе провоцирующих факторов могут быть условия болезни и применяемые лекарственные препараты, ведущие к индукции или ингибированию CYP2B6.

SNPs в некодирующей области

Кроме кодирующей области, SNPs в регуляторных последовательностях ДНК и интронах также могут влиять на экспрессию гена. Так как CYP2B6 является сильно индуцибельным ферментом, регулируемым на уровне транскрипции, несколько групп исследовали SNPs в области 5'-промотора [61]. Первоначально, Lamba с соавт. определили последовательности промотора в области -3,8 kb, включая PBREM и дистального промотора, содержащего ХРЕМ, в 80 образцах печени человека [57]. Данное исследование позволило обнаружить 9 SNPs, которые наблюдаются в среднем у 1% исследованных этнических популяций. Среди обнаруженных SNP, замена -750Т>С наиболее часто встречается у белого населения (49%), у афроамериканцев (83%) и у латиноамериканцев (79%). Несмотря на то, что мутация -750Т>С локализована на сайте HNF1, функциональные пробы показывают умеренные изменения экспрессии мРНК или белка [57]. Недавно, в 98 исследованных образцах ДНК был выделен новый гаплотип CYP2B6*22, который сочетает 4 мутации в промоторе (-1848С>А, -801G>T, -750Т>С, -82Т>С). Необычно, что эти изменения в последовательности промотора приводили к активации транскрипции в 9 раз больше по сравнению с референсным CYP2B6 промотором [62]. Дальнейшие исследования выявили, что -82Т>С мутация конвертирует TATA бокс в функциональный ССААТ/энхансерсвязывающий сайт, который обуславливает активацию экспрессии CYP2B6*22. Клиническое значение данной повышающей функциональность мутации в промоторе требует дальнейшего исследования, однако авторы считают данный полиморфизм ответственным за фенотип «ультрабыстрого метаболизатора» CYP2B6. Кроме того, в настоящее время, для определения молекулярных механизмов индукции экспрессии CYP2B6 ведутся поиски SNP в PBREM или ХРЕМ, которые отвечают за индукцию экспрессии CYP2B6 ксенобиотиками.

Клиническое значение CYP2B6

В последнее время показано, что CYP2B6 играет критическую роль в биотрансформации многих клинически используемых лекарств, включая CPA, EFV, ифосфамид, тамоксифен, невирапин и артемизин. Клиническое значение ингибирования CYP2B6, изменения его экспрессии и наличие полиморфных аллелей можно проиллюстрировать на примере двух важных лекарственных препаратов: CPA и EFV. Оба препарата характеризуются узким терапевтическим индексом, зависящей от дозировки токсичностью и большей межиндивидуальной вариабельностью по концентрации в крови.

Антиретровирусный препарат EFV является ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы (NNRTI) и используется при комплексной терапии ВИЧ. Фармакокинетический анализ показал, что EFV обладает относительно узким терапевтическим диапазоном и значительной межиндивидуальной вариабельностью концентраций в плазме крови [63]. С использованием микросом печени человека и рекомбинантных цитохромов Р450, Ward с соавт. [64] показал, что CYP2B6 является основным ферментом, метаболизирующим EFV с образованием 4-гидрокси-ЕРУ и 8,14-дигидрокси-ЕРУ. В дальнейшем фармакогенетические исследования были направлены на изучение взаимосвязи между полиморфными аллелями CYP2B6 и известными вариациями концентрации EFV в плазме. Увеличение концентрации EFV в плазме приводит к побочным эффектам, влияющим на центральную нервную систему, таким как бессонница, головокружение, депрессия [65] и отказ от терапии. В последнее время было обнаружено, что у обладателей аллели CYP2B6*6, характеризуемой мутацией 516G>T, наблюдается повышение концентрации EFV в плазме, которое выражается токсическим влиянием на центральную нервную систему [66]. Относительно высокая частота присутствия аллели CYP2B6*6 в отдельных этнических популяциях вынуждает использовать генотипирование по CYP2B6 для расчета дозировки EFV. Например, CYP2B6*6 относительно часто встречается у жителей Восточной Африки и Папуа Новой Гвинеи, где распространение ВИЧ представляет серьезную проблему и идентификация «медленных метаболизаторов» полезна для корректировки дозы EFV и предотвращения токсических эффектов. В Японии корректировка дозировки EFV с учетом специфики генотипа привела к снижению дозы на 33-66% и уменьшению концентрации лекарства в плазме без потери эффективности и без проявления токсических эффектов [67]. Несмотря на то, что роль полиморфизма CYP2B6 в метаболизме EFV хорошо изучена, информация о межлекарственных взаимодействиях между EFV и другими сочетанно принимаемыми лекарствами ограниченна. На практике данное лекарство всегда используется в комплексной терапии, совместно в лекарственными травами и пищевыми добавками, а также другими препаратами для лечения сопутствующих инфекций у инфицированных ВИЧ пациентов [64]. Поскольку большое число клинически используемых лекарств способно к индукции CYP2B6, то вероятность разнообразных эффектов межлекарственных взаимодействий и проблем терапевтического лечения очень высока.

Другим важным лекарственным препаратом, терапевтический эффект которого сильно зависит от активности CYP2B6 является CPA. CPA это алкилирующий агент, широко применяемый при лечении рака молочной железы, саркомы, лейкемии и лимфомы [68]. CPA используется в виде пролекарства, которому для активации требуется образование 4-гидроксиметаболита, которое происходит в ходе ферментативного катализа с участием CYP2B6. Образованный в ходе реакции 4-гидрокси-СРА специфически алкилирует ДР1К, что приводит цитотоксичности раковых клеток [69]. Параллельно CPA метаболизируется в реакции N-дехлорэтилирования, в ходе реакции с CYP3A4, что ведет к образованию нейротоксичного метаболита хлорацетальдегида [70]. Образование хлорацетальдегида в качестве метаболита ограничивает использование CPA и его терапевтическое применение. Таким образом, использование сочетанной терапии для селективной активации CYP2B6 или ингибирования CYP3A4 позволит увеличивать образование терапевтически активного 4-гидрокси-СРА и одновременно снижать скорость генерации токсичного N-дехлорэтилированного производного.

Взаимосвязь между экспрессией CYP2B6 и терапевтическим потенциалом CPA недавно была продемонстрирована Waxman с соавт. [71]. Авторы осуществили доставку аденовируса, кодирующего экспрессию CYP2B6, в ряд раковых клеточных линий человека, что привело к увеличению клеточного 4-гидроксилирования CPA и, соответственно, к увеличению цитотоксичности. В последнее время было показано, что некоторые селективные hCAR активаторы преимущественно индуцируют CYP2B6 при незначительном увеличении концентрации CYP3A4 в первичной культуре гепатоцитов человека [72]. Соответственно, если подтвердится селективность индукторов hCAR для CYP2B6 в экспериментах in vivo, совместный прием CPA с селективным активатором hCAR будет способствовать образованию 4-гидроксиметаболита без одновременного увеличения нейротоксичного хлорацетальдегида. Данные исследования являются примером оптимизации терапевтического регламента для увеличения эффективности и уменьшения токсических эффектов при использовании лекарств в терапии рака.

Как было показано выше, достигнут значительный прогресс в увеличении терапевтического потенциала CPA при помощи увеличения экспрессии CYP2B6 [71], однако влияние полиморфизма CYP2B6 на биотрансформацию CPA исследовано сравнительно недавно. В процессе терапии CPA наблюдаются значительные отличия в метаболизме у разных пациентов, которые выражаются в 10-кратной разнице в образовании метаболитов [73]. Наличие CYP2B6*6 аллели, в частности мутации 156G>T, коррелирует с увеличением ферментной активности, более высоким клиренсом субстрата и уменьшением времени полураспада CPA [74]. Дополнительно обнаружен ряд других SNPs в промоторе и интронах, связанных с уменьшением 4-гидроксилирования CPA и проявлением побочных эффектов, таких как лейкоцитопения [74].

Перспективы на будущее.

Растущее количество исследований, опубликованных в течение последних 10 лет, подтверждает значение CYP2B6 в метаболизме/детоксикации лекарств. Ранее полагали, что CYP2B6 является минорным метаболизирующим лекарства ферментом с незначительной ролыо в фармакологии и токсикологии. В настоящее время увеличивается количество данных о том, что CYP2B6 экспрессируется в клетках в значительно больших концентрациях. CYP2B6 является сильноиндуцибельным ферментом. При этом его химически опосредованная индукция регулируется на уровне транскрипции через комплексное взаимодействие ядерных рецепторов, таких как CAR, PXR и в меньшей степени GR и VDG. Более того, CYP2B6 является полиморфным ферментом, что обуславливает влияние генетических факторов на метаболизм клинически используемых лекарств, таких как EFV и CPA.

Хотя понимание роли CYP2B6 в метаболизме лекарств возрастает, существует ряд вопросов, на которые еще необходимо ответить. В настоящее время hPXR и hCAR признают в качестве первичных транскрипционных факторов, опосредующих химически индуцированную экспрессию CYP2B6. Однако точный качественный и количественный вклад этих рецепторов в наблюдаемую индукцию CYP2B6 не определен в связи с тем, что hPXR и hCAR имеют перекрывающийся диапазон активаторов и целевых генов. Как предполагают, идентификация высокоселективного активатора/деактиватора для hPXR и hCAR обеспечит новые возможности для расшифровки отдельной роли, которую каждый рецептор играет в регулировании экспрессии CYP2B6.

Подсемейство CYP2C

Подсемейство цитохромов CYP2C является одним из наиболее представленных по концентрации цитохромов Р450. Подсемейство включает четыре изоформы Р450: CYP2C8, 2С9, 2С18 и 2С19. Из них CYP2C8 и CYP2C9 - наиболее представленные белки, составляющие 35% и 60% от общего содержания представителей подсемейства CYP2C, соответственно. Содержание CYP2C18 (4%) и CYP2C19 (1%) незначительно [75]. Показано, что CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19 вовлечены в метаболизм 20% лекарств [76]. Несмотря на значительный уровень гомологии между первичными структурами CYP2C9 и CYP2C19, которая составляет 91%, отдельные белки подсемейства CYP2C лишь в незначительной части пересекаются по субстратной специфичности [77].

CYP2C8

CYP2C8 выполняет важную роль в метаболизме лекарств [78]. мРНК CYP2C8 и соответствующий белок индуцируются рифампицином и фенобарбиталом в первичных культурах гепатоцитов человека [79]. Основными субстратами метаболизма для CYP2C8 являются противоопухолевые средства таксол, церивастатин, розиглитазон, троглитазон. Также данная изоформа вовлечена в метаболизм зопиклона, карбамазепина, верапамила и амиодарона [80]. CYP2C8 участвует в цепи метаболизма эндогенной арахидоновой кислоты [81]. Для CYP2C8 показаны генетические полиморфизмы [82]. Найдены две аллели, содержащие аминокислотные замены: 1. CYP2C8*2 с мутацией Ile269Phe в экзоне 5; 2. CYP2C8*3, которая содержит две замены - Argl39Lys и Lys399Arg в экзонах 3 и 8 [81]. Полиморфизм CYP2C8*2 найден только у афроамериканцев с частотой 0,18, а полиморфизм CYP2C8*3 регистрируется у белого населения с частотой 0,13 [81]. Один из полиморфизмов оказывает существенное влияние на метаболизм лекарств. Так, CYP2C8*2 обладает в два раза более высоким сродством к таксолу (Km, константа Михаелиса-Ментен) и, соответственно, укороченным периодом полувыведения по сравнению с нормальным CYP2C8*1 типом, что необходимо учитывать при проведении химиотерапии [83]. Для исследований ингибирования CYP2C8 in vitro, как правило, используется кверцитин [84].

CYP2C9

CYP2C9 является основной изоформой семейства CYP2C, метаболизирующей лекарства в печени. При его участии происходит биотрансформация таких клинически значимых соединений, как толбутамид, фенотоин, s-варфарин, лозартан, ибупрофен, диклофенак, пироксикам, теноксикам и др. [85]. Кроме того, CYP2C9 метаболизирует антидиабетическое средство глизипид и диуретик торземид [78].

Встречается три основных аллельных варианта CYP2C9, которые в значительной степени меняют каталитическую активность данного цитохрома: 1) аллельный тип

32

CYP2C9* 1) Arg-144 Leu-359, 2) аллельный тип CYP2C9*2 с Cys-144 и Leu-359 положениях и 3) CYP2C9*3 с аргинином в положении последовательности Arg-144 и с изолейцином 11е-359 [86]. Полиморфизм CYP2C9 различается в этнических группах. Так, белокожая раса в 10% случаев подвержена мутациям по второму (CYP2C9*2) аллельному типу и по третьему (10%). В тоже время, у представителей азиатской и чернокожей расы частота встречаемости данных полиморфизмов не превышает 3% [87]. Генетические полиморфизмы CYP2C9 могут серьезно влиять на токсическое действие лекарств, которые являются специфическими субстратами данной изоформы Р450. Например, при мутации CYP2C9*3 наблюдается замедление периода полувыведения и, соответственно, величины (Vmax/Km) для толбутамида, S-варфарина, фенотоина, диклофенака и др. [88]. В качестве in vitro субстрата для определения активности CYP2C9 часто используются толбутамид, S-варфарин и диклофенак [89]. Ингибиторами CYP2C9 являются сульфофеназол, сульфаметазин, сульфинпиразон миконазол и флуконазол [90]. Сульфофеназол используется в качестве селективного ингибитора (Ki —0,3 мкМ) в in vitro экспериментах для изучения роли CYP2C9 в окислении того или иного соединения [91]. Индукторами CYP2C9 являются барбитураты, карбамазепин и рифампицин [79].

CYP2C18

CYP2C18 представлен в очень низких концентрациях в печени, однако он участвует в метаболизме некоторых субстратов, например окисляет диазепам, имипрамин и толбутамид [92].

CYP2C19

Другой важной изоформой подсемейства является CYP2C19. В первичной культуре гепатоцитов он индуцируется барбитуратами, карбамазепином и рифампиципом [93]. CYP2C19 вовлечен в метаболизм таких лекарств, как S- мефенитоин, омепразол, диазепам, пропранолол, прогуанил и ряд трицикличных антидепрессантов, таких как имипрамин, кломипрамин и амитриптилин [94]. Генетический полиморфизм ведет к снижению скорости метаболизма и увеличению периода полувыведения указанных выше лекарств. Частоты встречаемости полиморфизмов CYP2C19 различаются в зависимости от этнической представленности и составляют 2 - 6% у белокожего населения, 12-23% для восточных популяций и менее 2% у чернокожих американцев [87]. Молекуляно-генетические основы полиморфизма хорошо изучены. Два наиболее часто встречающихся дефекта заключаются в мутациях пары G —>А в экзоне 5 (CYP2C19*2) и экзоне 4 (CYP2C19*3) [95]

В качестве специфичных субстратов CYP2C19 для in vitro исследований используют б'-мефенитоин и омепразол [96]. При проведении ингибиторных исследований применяют флуконазол и тиклопидин (К; = 2 мкМ) [97].

CYP2D6

CYP2D6 составляет 2% - 5% от общего содержания Р450 печени. Кроме печени 2D6 экспрессируется в тканях желудочно-кишечного тракта, тканях мозга и легких [98]. Несмотря на относительно малое содержание в печени, CYP2D6 участвует в метаболизме 30% лекарств, включая антиритмические средства, антигипертензивные средства, Р-блокаторы, ингибиторы моноаминооксидазы, производные морфина, трицикличные антидепрессанты [99].

Цитохромы CYP2D6 человека очень полиморфны. Идентифицировано более 70-ти аллелей CYP2D6, большинство из которых не изменяет активности данного фермента [100]. Однако, некоторые вариантные аллели, такие как CYP2D6*9, *10 и * 17, снижают каталитическую активность белка по сравнению с нормальным типом [101].

Буфуралол и дексометорфан используются в качестве маркерных субстратов для in vitro исследований активности CYP2D6 [102]. В качестве ингибиторов CYP2D6 применяются хинидин, пароксетин, флуоксетин и тиклопидин [103]. Среди названных выше ингибиторов только хинидин получил широкое применение в исследованиях in vitro (К; = 0,06 мкМ) [103]. В настоящий момент индукторы CYP2D6 неизвестны [104].

CYP2E1

CYP2E1 составляет приблизительно 6% от общего содержания Р450 печени. Кроме печени, данная изоформа обнаруживается в легких, почках, слизистой носа, костном мозге и в лейкоцитах периферической крови [13]. Несколько факторов,

34 например избыточный вес или режим питания, могут влиять на активность CYP2E1 [105]. Этанол при нерегулярном использовании является ингибитором CYP2E1, но при хроническом употреблении спирты индуцируют данную изоформу Р450 [106].

CYP2E1 вовлечен в биотрансформацию большого числа низкомолекулярных токсинов и канцерогенов, включая нитрозамины табачного дыма, бензен, этанол, и ряда лекарственных средств: хлорзоксазон, ацетаминофен, дапсон, анилин и некоторые анестетики [107].

Изоформа CYP2E1 отличается значительной межиндивидуальной вариацией содержания. Показаны различия концентрации данной изоформы в печени более чем в 20 раз между индивидуумами. Идентифицировано несколько полиморфизмов гена. Активность CYP2E1 измеряют in vitro и in vivo по скорости гидроксилирования хлорзоксазона [108].

В экспериментах по ингибированию активности CYP2E1 используют диэтилдитиокарбамат, который является суицидным ингибитором CYP2E1 [109].

Подсемейство CYP3A

Ферменты подсемейства CYP3A являются наиболее представленными цитохромами Р450 в печени. Их содержание составляет от 30 до 40% от общего содержания Р450 печени, при этом данные ферменты вовлечены в метаболизм 4030% лекарств, используемых в клинике. [110]. Подсемейство CYP3A представлено тремя функциональными изоформами: CYP3A4, CYP3A5 и CYP3A7 [1].

CYP3A4

CYP3A4, главным образом, экспрессирован в печени и тканях кишечника [111], его содержание и активность индуцируется рифам пицином, барбитуратами, карбамазепином, дексаметазоном. Индукция фермента проходит как in vivo, так и в in vitro экспериментах на линиях первичных гепатоцитов [112]. Изоформа CYP3A4 играет важную роль в метаболизме почти трети всех лекарственных средств [110]. При этом активность CYP3A4 имеет огромную межиндивидуальную вариабельность (более 40 раз в микросомах печени). Различия в активности фермента обусловлены влиянием окружающей среды (индукция/ингибированис) и генетическими факторами [113].

Кинетика ферментативных реакций, катализируемых цитохромом CYP3A4, указывает на аллостеричность активного сайга и способность связывать две и более молекулы субстрата одновременно [114]. Данное множественное связывание выражается в атипичности ферментативной кинетики и непредсказуемости взаимодействия лекарств [115]. Вследствие аллостеричности активного сайта ЗА4 обычно используют два химически различных маркерных субстрата для определения активности данного фермента: мидазолам и тестостерон [116]. Ряд лекарств и ксенобиотиков ингибируют активность CYP3A4. Например, кетоконазол (К, ~15 нМ), кларитромицин (К, 10 —28 мкМ), флувоксамин (К, = 5,6 мкМ), грейпфрутовый сок и многие другие могут в заметной степени снижать активность данной изоформы цитохрома Р450 in vivo [117]. В экспериментах in vitro для определения роли ЗА4 используется суицидный ингибитор тролеандомицин [109]. Кетоконазол используют в качестве специфичного ингибитора CYP3A4 в in vitro и in vivo экспериментах [91].

CYP3A5

Гомологичность белков CYP3A5 и CYP3A4 составляет 83%. При этом содержание CYP3A5 составляет только 10-30% от концентрации ЗА4 [118]. CYP3A5 индуцируется теми же индукторами, что и основная форма подсемейства: фенобарбиталом и рифампицииом [119]. CYP3A5 метаболизирует, в основном, тс же самые субстраты, что и ЗА4 [118].

CYP3A7

CYP3A7 является основной изоформой, которая регистрируется в фетальной печени [120]. Роль CYP3A7 в метаболизме ксенобиотиков не изучена [121].

Протеомика, основные методы протеомных исследований

Основной задачей протеомикн, сравнительно молодого направления современных биохимических исследований, является проведение инвентаризации белков, которые экспрессируются в клетке. Согласно современным представлениям, более 30% всех белков являются мембранными. Интерес исследования мембранных белков обусловлен не только их широкой представленностью в клетке, но также важностью функций, которые они выполняют. Межклеточные взаимодействия, рецепторные функции, передача сигнала от внешнего воздействия внутрь клетки - это лишь незначительный перечень функций белков внешней мембраны, большинство наиболее важных жизнеобеспечивающих функций клетки также связаны с мембранами органелл.

Одной из самых трудных задач современных протеомных исследований является эффективное разделение и идентификация белков, входящих в состав различных биологических мембран. Методический подход, который используется для проведения исследования протеома мембран, должен отвечать нескольким требованиям:

Во-первых, разделение должно быть в достаточной степени эффективным, т.е., исходя из того факта, что мембранные белки составляют более 30% белков всей клетки, используемый метод должен обладать разрешающей способность порядка 3000-5000 тыс белков.

Во-вторых, идентифицированные белки должны быть оценены количественно, поскольку знание уровня экспрессии биологических молекул является необходим7>тм условием для дальнейшего использования этих данных в диагностике, медицине и в фармпромышленности для поиска мишеней для новых лекарственных соединений.

В-третьих, желательно, чтобы избранный метод обладал возможностью регистрации белков с дефектной и/или модифицированной структурой, поскольку эти изменения также влияют на функцию белка.

Несмотря на огромное разнообразие методов, используемых в современных протеомных исследованиях, в настоящее время существует три основных методических подхода, которые отвечают описанным выше требованиям.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Згода, Виктор Гаврилович

выводы

1. Разработанный метод протеомного анализа, основанный на ЗЭ фракционировании белков и пептидов с последующим тандемным масс-спектрометрическим анализом, позволяет идентифицировать более 3700 белков в одном эксперименте.

2. Индукция цитохромов Р450 фенобарбиталом или метилхолантреном параллельно с увеличением содержания белковых компонентов монооксигеназной системы сопровождается индукцией: шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

3. В формировании функционального цитохрома Р450 участвуют эндогенный низкомолекулярный фактор (идентифицированный как восстановленный глуташон) и шаперон ОИР94, способствующие связывании гема апоцитохромом.

4. Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции фенобарбиталом или метилхолантреном является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода, которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых СУР2В.

5. При отсутствии катал азы в реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома СУР2В с АФК приводит к химической модификации 8Н-групп трех из четырех остатков цистеипа цитохрома, образованию карбонильных групп, нековалентных белковых агрегатов, с последующим формированием межмолекулярных ковалентных сшивок СУР2В. Данные модификации служат сигналом для протеолитической деградации этого цитохрома.

6. Катаболизм СУР2В в модельных дрожжевых системах включает протсасомиый либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической деградации. Анализ скорости деградации в дрожжах, дефицитных по лизосомальньш ферментам по сравнению с нативными штаммами, предполагает основную роль лизосомальной протеазы Рер4 в деградации СУР 2В1. При внесении мутаций в первичную структуру СУР2В скорость его деградации значительно увеличивалось за счет вовлечения ггротеасомных ферментов в этот процесс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе работы для изучения посттрансляционной регуляции Р450 использовался экспериментальный подход, основанный на комбинации высокопроизводительных протеомных методов и последующей верификации полученных результатов с использованием модельных экспериментальных систем.

Фармакологическая индукция Р450 сопровождается увеличением содержания белковых компонентов монооксигеназной системы; шаперонов, вовлеченных в фолдинг белков монооксигеназной системы; антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД, пероксидазы и др.) и белков, выполняющих гомеостатические и метаболические функции клетки.

В сборке функционально активного холофермента Р450 участвуют эндогенный восстановленный глутатион и шаперон 011Р94.

Увеличение содержания антиоксидантных ферментов в ходе индукции является компенсаторным ответом клетки на повышение концентрации активных форм кислорода (АФК), которые генерируются в результате разобщения монооксигеназных реакций, катализируемых СУР2В.

В реконструированной монооксигеназной системе взаимодействие цитохрома СУР2В с АФК приводит к химической модификации трех из четырех остатков цистеина цитохрома и образованию белковых агрегатов. Данные модификации являются сигналом для протеаз, ответственных за деградацию белков надсемейства.

Катаболизм СУР2В в модельных дрожжевых системах включает протеасомный либо вакуольный (лизосомный) пути протеолитической деградации. В дрожжах, дефицитных по вакуольным (лизосомным) ферментам скорость деградации СУР2В значительно снижается. При внесении мутаций в первичную структуру СУР2В скорость его деградации значительно увеличивалась за счет вовлечения протеасомных ферментов в этот процесс.

На основании полученных данных можно предположить следующую схему посттрансляционной регуляции Р450 (рис 37), а именно механизма встраивании гема в апофермент, окислительной модификации аминокислотных остатков и роли этих модификаций в деградации белка.

Как видно из схемы, потеря гема цитохромом Р450 происходит при окислении СуБ436 СУР2В перекисью водорода, образующейся в активном центре в ходе разобщения монооксигеназной реакции или в ходе окисления суицидного субстрата А1А. Сульфоксидные группы цистеинов могут быть восстановлены при участии эндогенного глутатиона. Однако одного восстановления цистеина недостаточно для сборки гема и апофермента. Очевидно, что только в комплексе с СТ1Р94 у СУР2В возникает конформация, при которой апобелок способен принять гем и восстановить характерные для Р450 спектральные и функциональные свойства. Совместная индукция цитохромов и ОЯР94, а также некоторых других шаперонов, позволяет предположить участие этой группы белков не только в восстановлении инактивированной формы СУР2В, но также и в фолдинге белка в ходе его синтеза.

Так как восстановление активности и спектральных свойств возможно только при взаимодействии гема с тиолом цистеина 436 цитохрома Р450, вполне вероятно, что вБН необходим для восстановления 8Н группы данного аминокислотного остатка.

Протеомные данные об увеличении в ходе индукции концентрации каталазы и других ферментов, участвующих в утилизации АФК, говорят о защитных реакциях клетки в ответ на окислительный стресс. Такая реакция клетки позволяет снизить уровень инактивации Р450, происходящей из-за перекиси водорода, образующейся непосредственно в активном центре фермента. В результате потери гема и окислительной модификации аминокислотных остатков изменяется конформация гемопротеина. Именно эти изменения цитохрома Р450, по нашему мнению, ответственны за агрегацию белка за счет ионных и гидрофобных взаимодействий.

Низкая скорость образования межмолекулярных сшивок между агрегатами указывает на вторичность этого процесса. Данные, полученные нами при исследовании полимеризации в присутствии каталазы, которая ингибирует этот процесс, указывают на вовлеченность перекиси водорода в образование межмолекулярных сшивок. Вероятно, ведущую роль в этом процессе играют высокореакционные гидроксильные радикалы, образующиеся при распаде перекиси водорода в реакции Фентона при участии ионов железа, освобождающихся при распаде гема. Одним из показателей участия гидроксильных радикалов в модификации апофермента Р450 является образование карбонильных групп в модифицированных белках [481].

Окислительная модификация и агрегация белков является сигналом для эндогенных протеаз к деградации белков [371].

При этом предполагается, что основную роль в катаболическом гидролизе СУР2В играют ферменты лизосомальной системы, а при модификации первичной структуры СУР2В скорость деградации белка увеличивается за счет участия протеасомных белков. сэ в; гп гч н2о2

Каталаза 14 3 раза

Продукты разрушения гема. Образование *ОН радикалов в реакции Фентона

Эндогенный СБН Восстановление 8Н-групп цистеинов

Нашивная конформация

Деградация по лизосомальному пути

Полимеризация

ЦО

Деградация по иВС пути о на ю ^

СО гч

О 'О

СЬ л

•г" г О

О. X о н к а к к а « е; >-. и о о.

Ж О о к я о га о о с га и х О г^ т V

О Е >-, О о X и н

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Згода, Виктор Гаврилович, 2013 год

1. Nelson, D.R., The cytochrome p450 homepage. Hum. Genomics 2009, 4, 59-65.

2. Archakov, A.I., Lisitsa, A. V, Petushkova, N.A., Karuzina, I.I., Cytochromes P450, drug disease and personified medicine. Part 2. Therapeutic drug monitoring as a method of monooxygenase activity assessment], Klin. Med. (Mosk). 2008, 86, 4-6.

3. Hesse, L.M., He, P., Krishnaswamy, S., Hao, Q., et al., Pharmacogenetic determinants of interindividual variability in bupropion hydroxylation by cytochrome P450 2B6 in human liver microsomes. Pharmacogenetics 2004, 14, 225-38.

4. Wang, M.Z., Wu, J.Q., Dennison, J.B., Bridges, A.S., et al., A gel-free MS-based quantitative proteomic approach accurately measures cytochrome P450 protein concentrations in human liver microsomes. Proteomics 2008, 8, 4186-96.

5. Aguiar, M., Masse, R., Gibbs, B.F., Regulation of cytochrome P450 by posttranslational modification. Drug Me tab. Rev. 2005, 37, 379-404.

6. Zanger, U.M., Schwab, M., Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation. Pharmacol. Ther. 2013, 138, 103-41.

7. OMURA, Т., SATO, R., A new cytochrome in liver microsomes. J. Biol. Chem. 1962, 237, 1375-6.

8. Nelson, D.R., Cytochrome P450 nomenclature, 2004. Methods Mol. Biol. 2006, 320, 1-10.

9. Nebert, D.W., Russell, D.W., Clinical importance of the cytochromes P450. Lancet 2002, 360, 1155-62.

10. Guengerich, F.P., Cytochrome p450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 2008, 21, 70-83.

11. Klein, K., Winter, S., Turpeinen, M., Schwab, M., Zanger, U.M., Pathway-Targeted Pharmacogenomics of CYP1A2 in Human Liver. Front. Pharmacol. 2010, 1, 129.

12. Nebert, D.W., Petersen, D.D., Puga, A., Human AH locus polymorphism and cancer: inducibility of CYP1A1 and other genes by combustion products and dioxin. Pharmacogenetics 1991, 1, 68-78.

13. Anttila, S., Hakkola, J., Tuominen, P., Elovaara, E., et al., Methylation of cytochrome P4501A1 promoter in the lung is associated with tobacco smoking. Cancer Res. 2003, 63, 8623-8.

14. Yoshinari, K., Ueda, R., Kusano, K., Yoshimura, T., et al., Omeprazole transactivates human CYP1A1 and CYP1A2 expression through the common regulatory region containing multiple xenobiotic-responsive elements. Biochem. Pharmacol. 2008, 76, 139-45.

15. Jiang, Z., Dragin, N., Jorge-Nebert, L.F., Martin, M. V, et al., Search for an association between the human CYP1A2 genotype and CYP1A2 metabolic phenotype. Pharmacogenet. Genomics 2006, 16, 359—67.

16. Browning, S.L., Tarekegn, A., Bekele, E., Bradman, N., Thomas, M.G., CYP1A2 is more variable than previously thought: a genomic biography of the gene behind the human drug-metabolizing enzyme. Pharmacogenet. Genomics 2010, 20, 64764.

17. Shaik, A.P., Jamil, K., Das, P., CYP1A1 polymorphisms and risk of prostate cancer: a meta-analysis. Urol. J. 2009, 6, 78-86.

18. Dobrinas, M., Cornuz, J., Oneda, B., Kohler Serra, M., et al., Impact of smoking, smoking cessation, and genetic polymorphisms on CYP1A2 activity and inducibility. Clin. Pharmacol. Ther. 2011, 90, 117-25.

19. Zhou, S.-F., Wang, B., Yang, L.-P., Liu, J.-P., Structure, function, regulation and polymorphism and the clinical significance of human cytochrome P450 1A2. Drug Metab. Rev. 2010, 42, 268-354.

20. Hiemke, C., Hartter, S., Pharmacokinetics of selective serotonin reuptake inhibitors. Pharmacol. Ther. 2000, 85, 11-28.

21. Kinzig-Schippers, M., Fuhr, U., Zaigler, M., Dammeyer, J., et al., Interaction of Pefloxacin and enoxacin with the human cytochrome P450 enzyme CYP1A2. Clin. Pharmacol. Ther. 1999,65,262-74.

22. Stresser, D.M., Kupfer, D., Monospecific antipeptide antibody to cytochrome P-450 2B6. Drug Metab. Dispos. 1999, 27, 517-25.

23. Ekins, S., Vandenbranden, M., Ring, B.J., Gillespie, J.S., et al., Further characterization of the expression in liver and catalytic activity of CYP2B6. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998,286, 1253-9.

24. Faucette, S.R., Hawke, R.L., Lecluyse, E.L., Shord, S.S., et al., Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human cytochrome P450 2B6 catalytic activity. Drug Metab. Dispos. 2000, 28, 1222-30.

25. Pascussi, J.M., Gerbal-Chaloin, S., Fabre, J.M., Maurel, P., Vilarem, M.J., Dexamethasone enhances constitutive androstane receptor expression in human hepatocytes: consequences on cytochrome P450 gene regulation. Mol. Pharmacol. 2000, 58, 1441-50.

26. Faucette, S.R., Wang, FI., Hamilton, G.A., Jolley, S.L., et al., Regulation of CYP2B6 in primary human hepatocytes by prototypical inducers. Drug Metab. Dispos. 2004, 32, 348-58.

27. Ekins, S., Wrighton, S.A., The role of CYP2B6 in human xenobiotic metabolism. Drug Metab. Rev. 1999, 31, 719-54.

28. Zanger, U.M., Klein, K., Saussele, T., Blievernicht, J., et al., Polymorphic CYP2B6: molecular mechanisms and emerging clinical significance. Pharmacogenomics 2007, 8, 743—59.

29. Gervot, L., Rochat, B., Gautier, J.C., Bohnenstengel, F., et al., Human CYP2B6: expression, inducibility and catalytic activities. Pharmacogenetics 1999, 9, 295306.

30. Kocarek, T.A., Dahn, M.S., Cai, H., Strom, S.C., Mercer-Haines, N.A., Regulation of CYP2B6 and CYP3A expression by hydroxymethylglutaryl coenzyme A inhibitors in primary cultured human hepatocytes. Drug Metab. Dispos. 2002, 30, 1400-5.

31. Mizukami, Y., Sogawa, K., Suwa, Y., Muramatsu, M., Fujii-Kuriyama, Y., Gene structure of a phenobarbital-inducible cytochrome P-450 in rat liver. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1983, 80, 3958-62.

32. Phillips, I.R., Shephard, E.A., Povey, S., Davis, M.B., et al., A cytochrome P-450 gene family mapped to human chromosome 19. Ann. Hum. Genet. 1985, 49, 26774.

33. Santisteban, I., Povey, S., Shephard, E.A., Phillips, I.R., The major phenobarbital-inducible cytochrome P-450 gene subfamily (P450IIB) mapped to the long arm of human chromosome 19 .Ann. Hum. Genet. 1988, 52, 129-35.

34. Murray, G.I., Taylor, A., Barnes, T.S., Weaver, R., et al., The distribution of different forms of cytochrome P-450 in human liver. Biochem. Soc. Trans. 1990, 18, 1202.

35. Anundi, I., Lahteenmaki, T., Rundgren, M., Moldeus, P., Lindros, K.O., Zonation of acetaminophen metabolism and cytochrome P450 2El-mediated toxicity studied in isolated periportal and perivenous hepatocytes. Biochem. Pharmacol. 1993, 45, 1251-9.

36. Lieber, C.S., Microsomal ethanol-oxidizing system (MEOS): the first 30 years (1968-1998)—a review. Alcohol. Clin. Exp. Res. 1999, 23, 991-1007.

37. Ding, X., Kaminsky, L.S., Human extrahepatic cytochromes P450: function in xenobiotic metabolism and tissue-selective chemical toxicity in the respiratory and gastrointestinal tracts. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2003, 43, 149-73.

38. Miksys, S., Lerman, C., Shields, P.G., Mash, D.C., Tyndale, R.F., Smoking, alcoholism and genetic polymorphisms alter CYP2B6 levels in human brain. Neuropharmacology 2003, 45, 122-32.

39. Aleksa, K., Matsell, D., Krausz, K., Gelboin, H., et al., Cytochrome P450 3A and 2B6 in the developing kidney: implications for ifosfamide nephrotoxicity. Pediatr. Nephrol. 2005, 20, 872-85.

40. Yamada, H., Ishii, Y., Yamamoto, M., Oguri, K., Induction of the hepatic cytochrome P450 2B subfamily by xenobiotics: research history, evolutionary aspect, relation to tumorigenesis, and mechanism. Curr. Drug Metab. 2006, 7, 397-409.

41. Kobayashi, K„ Kogo, M., Tani, M., Shimada, N„ et al., Role of CYP2C19 in stereoselective hydroxylation of mephobarbital by human liver microsomes. Drug Metab. Dispos. 2001, 29, 36-^0.

42. Hu, Y., Kupfer, D., Enantioselective metabolism of the endocrine disruptor pesticide methoxychlor by human cytochromes P450 (P450s): major differences in selective enantiomer formation by various P450 isoforms. Drug Metab. Dispos. 2002, 30, 1329-36.

43. Ramirez, J., Innocenti, P., Schuetz, E.G., Flockhart, D.A., et al., CYP2B6, CYP3A4, and CYP2C19 are responsible for the in vitro N-demethylation of meperidine in human liver microsomes. Drug Metab. Dispos. 2004, 32, 930-6.

44. Loboz, K.K., Gross, A.S., Williams, K.M., Liauw, W.S., et al., Cytochrome P450 2B6 activity as measured by bupropion hydroxylation: effect of induction by rifampin and ethnicity. Clin. Pharmacol. Ther. 2006, 80, 75-84.

45. Kharasch, E.D., Mitchell, D., Coles, R., Stereoselective bupropion hydroxylation as an in vivo phenotypic probe for cytochrome P4502B6 (CYP2B6) activity. J. Clin. Pharmacol. 2008, 48, 464-74.

46. Eap, C.B., Crettol, S., Rougier, J.-S., Schlapfer, J., et al., Stereoselective block of hERG channel by (S)-methadone and QT interval prolongation in CYP2B6 slow metabolizers. Clin. Pharmacol. Ther. 2007, 81, 719-28.

47. Anzenbacher, P., Anzenbacherovâ, E., Cytochromes P450 and metabolism of xenobiotics. Cell. Mol. Life Sci. 2001, 58, 737-47.

48. Xie, W., Evans, R.M., Orphan nuclear receptors: the exotics of xenobiotics. J. Biol. Chem. 2001, 276, 37739-42.

49. Walsky, R.L., Astuccio, A. V, Obach, R.S., Evaluation of 227 drugs for in vitro inhibition of cytochrome P450 2B6. J. Clin. Pharmacol. 2006, 46, 1426-38.

50. Joo, I-L, Choi, K., Rose, R.L., Hodgson, E., Inhibition of fipronil and nonane metabolism in human liver microsomes and human cytochrome P450 isoforms by chlorpyrifos. J. Biochem. Mol. Toxicol. 2007, 21, 76-80.

51. Rotger, M., Tegude, H., Colombo, S., Cavassini, M., et al., Predictive value of known and novel alleles of CYP2B6 for efavirenz plasma concentrations in HIV-infected individuals. Clin. Pharmacol. Ther. 2007, 81, 557-66.

52. Desta, Z., Saussele, T., Ward, B., Blievernicht, J., et al., Impact of CYP2B6 polymorphism on hepatic efavirenz metabolism in vitro. Pharmacogenomics 2007, 8, 547-58.

53. Lang, T., Klein, K., Fischer, J., Ntissler, A.K., et al., Extensive genetic polymorphism in the human CYP2B6 gene with impact on expression and function in human liver. Pharmacogenetics 2001, 11, 399-415.

54. Hesse, L.M., Venkatakrishnan, K., Court, M.PI., von Moltke, L.L., et al., CYP2B6 mediates the in vitro hydroxylation of bupropion: potential drug interactions with other antidepressants. Drug Metab. Dispos. 2000, 28, 1176-83.

55. Lang, T., Klein, K., Richter, T., Zibat, A., et al., Multiple novel nonsynonymous CYP2B6 gene polymorphisms in Caucasians: demonstration of phenotypic null alleles. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 311, 34-43.

56. Zukunft, J., Lang, T., Richter, T., Hirsch-Ernst, K.I., et al., A natural CYP2B6 TATA box polymorphism (-82T~> C) leading to enhanced transcription and relocation of the transcriptional start site. Mol. Pharmacol. 2005, 67, 1772-82.

57. He, M.-L., Lin, C., Tong, K., Xu, B., et al., Absence of CYP2B6 promoter -82T>C mutation in Chinese as an additional factor for slow metabolism of drugs commonly used in infections. Eur. J. Clin. Pharmacol. 2006, 62, 585—6.

58. Marzolini, C., Telenti, A., Decosterd, L.A., Greub, G., et al., Efavirenz plasma levels can predict treatment failure and central nervous system side effects in ITIV-1-infected patients. AIDS 2001, 15, 71-5.

59. Haas, D.W., Human genetic variability and HIV treatment response. Curr. HIV/AIDS Rep. 2006, 3, 53-8.

60. Gatanaga, H., Hayashida, T., Tsuchiya, K., Yoshino, M., et al., Successful efavirenz dose reduction in HIV type 1-infected individuals with cytochrome P450 2B6 *6 and *26. Clin. Infect. Dis. 2007, 45, 1230-7.

61. Jones, R.B., Matthes, S., Dufton, C., Bearman, S.I., et al., Pharmacokinetic/pharmacodynamic interactions of intensive cyclophosphamide, cisplatin, and BCNU in patients with breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 1993, 26 Suppl, SI 1-7.

62. Roy, P., Tretyakov, O., Wright, J., Waxman, D.J., Stereoselective metabolism of ifosfamide by human P-450s 3A4 and 2B6. Favorable metabolic properties of Renantiomer. Drug Metab. Dispos. 1999, 27, 1309-18.

63. Huang, Z., Roy, P., Waxman, D.J., Role of human liver microsomal CYP3A4 and CYP2B6 in catalyzing N-dechloroethylation of cyclophosphamide and ifosfamide. Biochem. Pharmacol. 2000, 59, 961-72.

64. Jounaidi, Y., Waxman, D.J., Use of replication-conditional adenovirus as a helper system to enhance delivery of P450 prodrug-activation genes for cancer therapy. Cancer Res. 2004, 64, 292-303.

65. Faucette, S.R., Sueyoshi, T., Smith, C.M., Negishi, M., et al., Differential regulation of hepatic CYP2B6 and CYP3A4 genes by constitutive androstane receptor but not pregnane X receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2006, 317, 1200-9.

66. De Jonge, M.E., Huitema, A.D.R., Rodenhuis, S., Beijnen, J.H., Clinical pharmacokinetics of cyclophosphamide. Clin. Pharmacokinet. 2005, 44, 1135-64.

67. Nakajima, M., Komagata, S., Fujiki, Y., Kanada, Y., et al., Genetic polymorphisms of CYP2B6 affect the pharmacokinetics/pharmacodynamics of cyclophosphamide in Japanese cancer patients. Pharmacogenet. Genomics 2007, 17, 43 1-45.

68. Naraharisetti, S.B., Lin, Y.S., Rieder, M.J., Marciante, K.D., et al., Human liver expression of CYP2C8: gender, age, and genotype effects. Drug Metab. Dispos. 2010,38,889-93.

69. Rodrigues, A.D., Rushmore, T.H., Cytochrome P450 pharmacogenetics in drug development: in vitro studies and clinical consequences. Curr. Drug Metab. 2002, 3, 289-309.

70. Lee, C.R., Goldstein, J.A., Pieper, J.A., Cytochrome P450 2C9 polymorphisms: a comprehensive review of the in-vitro and human data. Pharmacogenetics 2002, 12, 251-63.

71. Lai, X.-S., Yang, L.-P., Li, X.-T., Liu, J.-P., et al., Human CYP2C8: structure, substrate specificity, inhibitor selectivity, inducers and polymorphisms. Curr. Drug Metab. 2009, 10, 1009-47.

72. Gerbal-Chaloin, S., Daujat, M., Pascussi, J.-M., Pichard-Garcia, L., et al., Transcriptional regulation of CYP2C9 gene. Role of glucocorticoid receptor and constitutive androstane receptor. J. Biol. Chem. 2002, 277, 209-17.

73. Kerb, R., Fux, R., Morike, K., Kremsner, P.G., et al., Pharmacogenetics of antimalarial drugs: effect on metabolism and transport. Lancet Infect. Dis. 2009, 9, 760-74.

74. Dai, D., Zeldin, D.C., Blaisdell, J.A., Chanas, B., et al., Polymorphisms in human CYP2C8 decrease metabolism of the anticancer drug paclitaxel and arachidonic acid. Pharmacogenetics 2001, 11, 597-607.

75. Parikh, S., Ouedraogo, J.-B., Goldstein, J.A., Rosenthal, P.J., Kroetz, D.L., Amodiaquine metabolism is impaired by common polymorphisms in CYP2C8: implications for malaria treatment in Africa. Clin. Pharmacol. Ther. 2007, 82, 197-203.

76. Muschler, E., Lai, J., .letter, A., Rattay, A., et al., The role of human CYP2C8 and CYP2C9 variants in pioglitazone metabolism in vitro. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2009, 105, 374-9.

77. Gao, Y., Liu, D., Wang, H., Zhu, J., Chen, C., Functional characterization of five CYP2C8 variants and prediction of CYP2C8 genotype-dependent effects on in vitro and in vivo drug-drug interactions. Xenobiotica. 2010, 40, 467-75.

78. Goldstein, J. A., Clinical relevance of genetic polymorphisms in the human CYP2C subfamily. Br. J. Clin. Pharmacol. 2001, 52, 349-55.

79. Rettie, A.E., Jones, J.P., Clinical and toxicological relevance of CYP2C9: drug-drug interactions and pharmacogenetics. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005, 45, 477-94.

80. Scott, S.A., Jaremko, M., Lubitz, S.A., Kornreich, R., et al., CYP2C9*8 is prevalent among African-Americans: implications for pharmacogenetic dosing. Pharmacogenomics 2009, 10, 1243—55.

81. Takanashi, K., Tainaka, H., Kobayashi, K., Yasumori, T., et al., CYP2C9 Ile359 and Leu359 variants: enzyme kinetic study with seven substrates. Pharmacogenetics 2000, 10, 95-104.

82. Doecke, C.J., Veronese, M.E., Pond, S.M., Miners, J.O., et al., Relationship between phenytoin and tolbutamide hydroxylations in human liver microsomes. Br. J. Clin. Pharmacol. 1991, 31, 125-30.

83. Ong, C.E., Miners, J.O., Birkett, D.J., Bhasker, C.R., Baculovirus-mediated expression of cytochrome P4502C8 and human NADPH-cytochrome P450 reductase: optimization of protein expression. Xenobiotica. 1998, 28, 137-52.

84. Bourrie, M., Meunier, V., Berger, Y., Fabre, G., Cytochrome P450 isoform inhibitors as a tool for the investigation of metabolic reactions catalyzed by human liver microsomes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996, 277, 321-32.

85. Komatsu, K., Ito, K., Nakajima, Y., Kanamitsu, S. i, et al., Prediction of in vivo drug-drug interactions between tolbutamide and various sulfonamides in humans based on in vitro experiments. Drug Me tab. Dispos. 2000, 28, 475-81.

86. Boulenc, X., Djebli, N., Shi, J., Perrin, L., et al., Effects of omeprazole and genetic polymorphism of CYP2C19 on the clopidogrel active metabolite. Drug Metab. Dispos. 2012, 40, 187-97.

87. Rosemary, J., Adithan, C., The pharmacogenetics of CYP2C9 and CYP2C19: ethnic variation and clinical significance. Curr. Clin. Pharmacol. 2007, 2, 93-109.

88. Stingl, J.C., Brockmoller, J., Viviani, R., Genetic variability of drug-metabolizing enzymes: the dual impact on psychiatric therapy and regulation of brain function. Mol. Psychiatry 2013, 18, 273-87.

89. Brauch, H., Miirdter, T.E., Eichelbaum, M., Schwab, M., Pharmacogenomics of tamoxifen therapy. Clin. Chem. 2009, 55, 1770-82.

90. Stevens, J.C., Marsh, S.A., Zaya, M.J., Regina, K.J., et al., Developmental changes in human liver CYP2D6 expression. Drug Metab. Dispos. 2008, 36, 1587-93.

91. Khojasteh, S.C., Prabhu, S., Kenny, J.R., Halladay, J.S., Lu, A.Y.H., Chemical inhibitors of cytochrome P450 isoforms in human liver microsomes: a reevaluation ofP450 isoform selectivity. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 201 1, 36, 1-16.

92. Glaeser, H., Drescher, S., Eichelbaum, M., Fromm, M.F., Influence of rifampicin on the expression and function of human intestinal cytochrome P450 enzymes. Br. J. Clin. Pharmacol. 2005, 59, 199-206.

93. Aubert, J., Begriche, K., Knockaert, L., Robin, M.A., Fromenty, B., Increased expression of cytochrome P450 2E1 in nonalcoholic fatty liver disease: mechanisms and pathophysiological role. Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 2011, 35, 630-7.

94. Caro, A.A., Cederbaum, A.I., Oxidative stress, toxicology, and pharmacology of CYP2E1. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004, 44, 27-42.

95. Lu, Y., Cederbaum, A.I., CYP2E1 and oxidative liver injury by alcohol. Free Radic. Biol. Med. 2008, 44, 723-38.

96. Marchand, L.L., Wilkinson, G.R., Wilkens, L.R., Genetic and dietary predictors of CYP2E1 activity: a phenotyping study in Hawaii Japanese using chlorzoxazone. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1999, 8, 495-500.

97. Newton, D.J., Wang, R.W., Lu, A.Y., Cytochrome P450 inhibitors. Evaluation of specificities in the in vitrometabolism of therapeutic agents by human liver microsomes. Drug Metab. Dispos. 1995, 23, 154-8.

98. Zanger, U.M., Turpeinen, M., Klein, K., Schwab, M., Functional pharmacogenetics/genomics of human cytochromes P450 involved in drug biotransformation. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 392, 1093-108.

99. Daly, A.K., Significance of the minor cytochrome P450 3A isoforms. Clin. Pharmacokinet. 2006, 45, 13-31.

100. Goodwin, B., Hodgson, E., Liddle, C., The orphan human pregnane X receptor mediates the transcriptional activation of CYP3A4 by rifampicin through a distal enhancer module. Mol. Pharmacol. 1999, 56, 1329-39.

101. Lamba, J., Lamba, V., Strom, S., Venkataramanan, R., Schuetz, E., Novel single nucleotide polymorphisms in the promoter and intron 1 of human pregnane X receptor/NRH2 and their association with CYP3A4 expression. Drug Metab. Dispos. 2008, 36, 169-81.

102. Ozdemir, V., Kalow, W., Tang, B.K., Paterson, A.D., et al., Evaluation of the genetic component of variability in CYP3 A4 activity: a repeated drug administration method. Pharmacogenetics 2000, 10, 373-88.

103. VandenBranden, M., Wrighton, S.A., Ekins, S., Gillespie, J.S., et al., Alterations of the catalytic activities of drug-metabolizing enzymes in cultures of human liver slices. Drug Metab. Dispos. 1998,26, 1063-8.

104. Araki, N., Tsuruoka, S., Hasegawa, G., Yanagihara, PI., et al., Inhibition of CYP3A4 by 6',7'-dihydroxybergamottin in human CYP3A4 over-expressed hepG2 cells./. Pharm. Pharmacol. 2012, 64, 1715-21.

105. Williams, J.A., Ring, B.J., Cantrell, V.E., Jones, D.R., et al., Comparative metabolic capabilities of CYP3A4, CYP3A5, and CYP3A7. Drug Metab. Dispos. 2002, 30, 883-91.

106. Asghar, A., Gorski, J.C., Haehner-Daniels, B., Hall, S.D., Induction of multidrug resistance-1 and cytochrome P450 mRNAs in human mononuclear cells by rifampin. Drug Metab. Dispos. 2002, 30, 20-6.

107. Leeder, J.S., Gaedigk, R., Marcucci, K.A., Gaedigk, A., et al., Variability of CYP3A7 expression in human fetal liver. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 314, 626-35.

108. Sim, S.C., Edwards, R.J., Boobis, A.R., Ingelman-Sundberg, M., CYP3A7 protein expression is high in a fraction of adult human livers and partially associated with the CYP3A7* 1C allele. Pharmacogenet. Genomics 2005, 15, 625-31.

109. O'Farrell, P.H., High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 1975, 250, 4007-21.

110. Cash, P., Protein mutations revealed by two-dimensional electrophoresis. J. Chromatogr. A 1995, 698, 203-24.

111. Klose, J., Kobalz, U., Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis 1995, 16, 1034-59.

112. Ames, G.F., Nilcaido, K., Two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins. Biochemistry 1976, 15, 616-23.

113. Perdew, G.H., Schaup, H.W., Selivonchick, D.P., The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal. Biochem. 1983, 135, 453-5.

114. Gyenes, T., Gyenes, E., Effect of "stacking" on the resolving power of ultrathin-layer two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 1987, 165, 155-60.

115. Rabilloud, T., Gianazza, E., Catto, N., Righetti, P.G., Amidosulfobetaines, a family of detergents with improved solubilization properties: application for isoelectric focusing under denaturing conditions. Anal. Biochem. 1990, 185, 94-102.

116. Felsted, R.L., Gupta, S.K., Glover, C.J., Fischkoff, S.A., Gallagher, R.E., Cell surface membrane protein changes during the differentiation of cultured human promyelocytic leukemia HL-60 cells. Cancer Res. 1983, 43, 2754-61.

117. Ltiddens, IT, Flavsteen, B., Characterization of the porcine ACTH receptor with the aid of a monoclonal antibody. Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 1986, 367, 539-47.

118. Sweetnam, P., Nestler, E., Gallombardo, P., Brown, S., et al., Comparison of the molecular structure of GABA/benzodiazepine receptors purified from rat and human cerebellum. Brain Res. 1987, 388, 223-33.

119. Alla, S.A., Buschko, J., Quitterer, U., Maidhof, A., et al., Structural features of the human bradykinin B2 receptor probed by agonists, antagonists, and anti-idiotypic antibodies. J. Biol. Chem. 1993, 268, 17277-85.

120. Englund, A.K., Lundahl, P., The isoelectric point of the human red cell glucose transporter. Biochim. Biophys. Acta 1991, 1065, 185-94.

121. Rubin, R.W., Minkowski, C., Over two hundred polypeptides resolved from the human erythrocyte membrane. Biochim. Biophys. Acta 1978, 509, 100-10.

122. Quaranta, S., Giuffrida, M.G., Cavaletto, M., Giunta, C., et al., Human proteome enhancement: high-recovery method and improved two-dimensional map of colostral fat globule membrane proteins. Electrophoresis 2001, 22, 1810-8.

123. Chevallet, M., Santoni, V., Poinas, A., Rouquié, D., et al., New zwitterionic detergents improve the analysis of membrane proteins by two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 1998, 19, 1901-9.

124. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J., Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pIT gradients. Electrophoresis n.d., 18, 307-16.

125. Fazekas de St Groth, S., Webster, R.G., Datyner, A., Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta 1963, 71, 377-91.

126. The Proteomics Protocols Handbook, Springer, 2005.

127. Patton, W.F., Detection technologies in proteome analysis. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2002, 771, 3-31.

128. Archakov, A., Ivanov, Y., Lisitsa, A., Zgoda, V., Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins. Proteomics 2009, 9, 1326-43.

129. Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E., An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue. Anal. Biochem. 1972,48, 617-20.

130. Neuhoff, V., Stamm, R., Eibl, H., Clear background and highly sensitive protein staining with Coomassie Blue dyes in polyacrylamide gels: A systematic analysis. Electrophoresis 1985, 6, 427-448.

131. Anderson, N.L., Esquer-Blasco, R., Hofmann, J.P., Anderson, N.G., A two-dimensional gel database of rat liver proteins useful in gene regulation and drug effects studies. Electrophoresis 1991, 12, 907-30.

132. Fountoulakis, M., Soumaka, E., Rapti, K., Mavroidis, M., et al., Alterations in the heart mitochondrial proteome in a desmin null heart failure model. J. Mol. Cell. Cardiol. 2005, 38, 461-74.

133. Smejkal, G.B., Robinson, M.H., Lazarev, A., Comparison of fluorescent stains: relative photostability and differential staining of proteins in two-dimensional gels. Electrophoresis 2004, 25, 2511-9.

134. Switzer, R.C., Merril, C.R., Shifrin, S., A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 1979, 98, 231-7.

135. Oakley, B.R., Kirsch, D.R., Morris, N.R., A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 1980, 105, 361-3.

136. Merril, C.R., Switzer, R.C., Van Keuren, M.L., Trace polypeptides in cellular extracts and human body fluids detected by two-dimensional electrophoresis and a highly sensitive silver stain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979, 76, 4335-9.

137. Hochstrasser, D.F., Harrington, M.G., Hochstrasser, A.C., Miller, M.J., Merril, C.R., Methods for increasing the resolution of two-dimensional protein electrophoresis. Anal. Biochem. 1988, 173,424-35.

138. Heukeshoven, J., Dernick, R., Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electrophoresis 1985, 6, 103-112.

139. Blum, H., Beier, H., Gross, H.J., Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 1987, 8, 93-99.

140. Rabilloud, T., Silver staining of2-D electrophoresis gels. Methods Mol. Biol. 1999, 112, 297-305.

141. Westermeier, R., Marouga, R., Protein detection methods in proteomics research. Biosci. Rep. n.d., 25, 19-32.

142. Rabilloud, T., A comparison between low background silver diammine and silver nitrate protein stains. Electrophoresis 1992, 13, 429-39.

143. Chevalier, F., Rofidal, V., Vanova, P., Bergoin, A., Rossignol, M., Proteomic capacity of recent fluorescent dyes for protein staining. Phytochemistry 2004, 65, 1499-506.

144. Schlags, W., Walther, M., Masree, M., Kratzel, M., et al., Towards validating a method for two-dimensional electrophoresis/silver staining. Electrophoresis 2005, 26, 2461-9.

145. Giometti, C.S., Gemmell, M.A., Tollaksen, S.L., Taylor, J., Quantitation of human leukocyte proteins after silver staining: a study with two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis n.d., 12, 536-43.

146. Sinha, P., Poland, J., Schnolzer, M., Rabilloud, T., A new silver staining apparatus and procedure for matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis of proteins after two-dimensional electrophoresis. Proteomics 2001, 1, 835-40.

147. Steinberg, T.H., Jones, L.J., Haugland, R.P., Singer, V.L., SYPRO orange and SYPRO red protein gel stains: one-step fluorescent staining of denaturing gels for detection of nanogram levels of protein. Anal. Biochem. 1996, 239, 223-37.

148. Steinberg, T.H., Haugland, R.P., Singer, V.L., Applications of SYPRO orange and SYPRO red protein gel stains. Anal. Biochem. 1996, 239, 238-45.

149. Walker, J.M., editor., The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, Totowa, NJ 2005.

150. Berggren, K., Steinberg, T.H., Lauber, W.M., Carroll, J.A., et al., A luminescent ruthenium complex for ultrasensitive detection of proteins immobilized on membrane supports. Anal. Biochem. 1999, 276, 129-43.

151. Barbara Sitek, B.S., Proteomics in Drug Research, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, FRG 2006.

152. Tonge, R., Shaw, J., Middleton, B., Rowlinson, R., et al., Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics 2001, 1, 377-96.

153. Shaw, J., Rowlinson, R., Nickson, J., Stone, T., et al., Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics 2003, 3, 1181-95.

154. Gharbi, S., Gaffney, P., Yang, A., Zvelebil, M.J., et al., Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol. Cell. Proteomics 2002, 1, 91-8.

155. Gonzalez-Begne, M., Lu, B., Han. X., Hagen, F.K., et al., Proteomic analysis of human parotid gland exosomes by multidimensional protein identification technology (MudPIT). J. Proteome Res. 2009, 8, 1304-14.

156. Washburn, M.P., Wolters, D., Yates, J.R., Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 242-7.

157. Wang, W., Guo, T., Song, T., Lee, C.S., Balgley, B.M., Comprehensive yeast proteome analysis using a capillary isoelectric focusing-based multidimensional separation platform coupled with ESI-MS/MS. Proteomics 2007, 7, 1 178-87.

158. Blonder, J., Goshe, M.B., Moore, R.J., Pasa-Tolic, L., et al., Enrichment of integral membrane proteins for proteomic analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Proteome Res. n.d., 1, 351-60.

159. Chen, E.I., Cociorva, D., Norris, J.L., Yates, J.R., Optimization of mass spectrometry-compatible surfactants for shotgun proteomics. J. Proteome Res. 2007, 6, 2529-38.

160. Strader, M.B., Tabb, D.L., Hervey, W.J., Pan, C„ Hurst, G.B., Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Anal. Chem. 2006, 78, 125-34.

161. Russell, W.K., Park, Z.Y., Russell, D.H., Proteolysis in mixed organic-aqueous solvent systems: applications for peptide mass mapping using mass spectrometry. Anal. Chem. 2001, 73, 2682-5.

162. Fischer, F., Wolters, D., Rogner, M., Poetsch, A., Toward the complete membrane proteome: high coverage of integral membrane proteins through transmembrane peptide detection. Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 444-53.

163. Hervey, W.J., Strader, M.B., Hurst, G.B., Comparison of digestion protocols for microgram quantities of enriched protein samples. J. Proteome Res. 2007, 6, 305461.

164. Zhang, N., Chen, R., Young, N., Wishart, D., et al., Comparison of SDS- and methanol-assisted protein solubilization and digestion methods for Escherichia coli membrane proteome analysis by 2-D LC-MS/MS. Proteomics 2007, 7, 484-93.

165. Wu, C.C., MacCoss, M.J., Howell, K.E., Yates, J.R., A method for the comprehensive proteomic analysis of membrane proteins. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 532-8.

166. Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E.L., Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 2001, 305, 567-80.

167. Giddings, J.C., Concepts and comparisons in multidimensional separation. J. High Resolut. Chromatogr. 1987, 10,319-323.

168. Bushey, M.M., Jorgenson, J.W., Automated instrumentation for comprehensive two-dimensional high-performance liquid chromatography of proteins. Anal. Chem. 1990, 62, 161-7.

169. Larmann, J.P., Lemmo, A. V, Moore, A.W., Jorgenson, J.W., Two-dimensional separations of peptides and proteins by comprehensive liquid chromatography-capillary electrophoresis. Electrophoresis n.d., 14, 439-4-7.

170. Galeva, N., Altermann, M., Comparison of one-dimensional and two-dimensional gel electrophoresis as a separation tool for proteomic analysis of rat liver microsomes: cytochromes P450 and other membrane proteins. Proteomics 2002, 2, 713-22.

171. Petushkova, N.A., Kanaeva, I.P., Lisitsa, A. V, Sheremetyeva, G.F., et al., Characterization of human liver cytochromes P450 by combining the biochemical and proteomic approaches. Toxicol. In Vitro 2006, 20, 966-74.

172. Zgoda, V.G., Moshkovskii, S.A., Ponomarenko, E.A., Andreewski, T. V, et al., Proteomics of mouse liver microsomes: performance of different protein separation workflows for LC-MS/MS. Proteomics 2009, 9, 4102-5.

173. Petushkova, N.A., Lisitsa, A. V, Producing a one-dimensional proteomic map for human liver cytochromes p450. Methods Mol. Biol. 2012, 909, 63-82.

174. Walther, T.C., Mann, M., Mass spectrometry-based proteomics in cell biology. J. Cell Biol. 2010, 190, 491-500.

175. Langenfeld, E., Meyer, H.E., Marcus, K., Quantitative analysis of highly homologous proteins: the challenge of assaying the "CYP-ome" by mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2008, 392, 1123-34.

176. Galeva, N., Yakovlev, D., Koen, Y., Duzhak, T., Alterman, M., Direct identification of cytochrome P450 isozymes by matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight-based proteomic approach. Drug Metab. Dispos. 2003, 31, 351-5.

177. Roy, L., Laboissière, S., Abdou, E., Thibault, G., et al., Proteomic analysis of the transitional endoplasmic reticulum in hepatocellular carcinoma: an organelle perspective on cancer. Biochim. Biophys. Acta 2010, 1804, 1869-81.

178. Dail, M.B., Shack, L.A., Chambers, J.E., Burgess, S.C., Global liver proteomics of rats exposed for 5 days to phénobarbital identifies changes associated with cancer and with CYP metabolism. Toxicol. Sci. 2008, 106, 556-69.

179. Everley, P.A., Krijgsveld, J., Zetter, B.R., Gygi, S.P., Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) as a tool for prostate cancer research. Mol. Cell. Proteomics 2004, 3, 729-35.

180. Gerber, S.A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M.W., Gygi, S.P., Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100, 6940-5.

181. Kopylov, A.T., Zgoda, V.G., Methods of quantitative proteomics]. Biomeditsinskaia khimiia n.d., 53, 613-43.

182. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B., Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Anal. Bioanal. Chem. 2007, 389, 1017-31.

183. Jia, N., Liu, X., Wen, J., Qian, L., et al., A proteomic method for analysis of CYP450s protein expression changes in carbon tetrachloride induced male rat liver microsomes. Toxicology 2007, 237, 1-1 1.

184. Ji, C., Guo, N., Li, L., Differential dimethyl labeling of N-termini of peptides after guanidination for proteome analysis. J. Proteome Res. n.d., 4, 2099-108.

185. FIsu, J.-L., Huang, S.-Y., Chow, N.-H., Chen, S.-FI., Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Anal. Chem. 2003, 75, 6843-52.

186. Jenkins, R.E., Kitteringham, N.R., Hunter, C.L., Webb, S., et al., Relative and absolute quantitative expression profiling of cytochromes P450 using isotope-coded affinity tags. Proteomics 2006, 6, 1934-47.

187. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F., A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. Proteomics 2005, 5, 4-15.

188. Ross, P.L., Huang, Y.N., Marchese, J.N., Williamson, B., et al., Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell. Proteomics 2004, 3, 1154-69.

189. Griffin, T.J., Xie, H., Bandhakavi, S., Popko, J., et al., iTRAQ reagent-based quantitative proteomic analysis on a linear ion trap mass spectrometer. J. Proteome Res. 2007, 6, 4200-9.

190. Wiese, S., Reidcgeld, K.A., Meyer, H.E., Warscheid, B., Protein labeling by iTRAQ: a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics 2007, 7, 340-50.

191. Rivers, J., Simpson, D.M., Robertson, D.H.L., Gaskell, S.J., Beynon, R.J., Absolute multiplexed quantitative analysis of protein expression during muscle development using QconCAT. Mol. Cell. Proteomics 2007, 6, 1416-27.

192. Yu, A.-M., Qu, J., Felmlee, M.A., Cao, J., Jiang, X.-L., Quantitation of human cytochrome P450 2D6 protein with immunoblot and mass spectrometry analysis. DrugMetab. Dispos. 2009, 37, 170-7.

193. Fenselau, C., Yao, X., Proteolytic labeling with 180 for comparative proteomics studies: preparation of 180-labeled peptides and the 180/160 peptide mixture. Methods Mol. Biol. 2007, 359, 135-42.

194. Ramos-Fernández, A., López-Ferrer, D., Vázquez, J., Improved method for differential expression proteomics using trypsin-catalyzed 180 labeling with a correction for labeling efficiency. Mol. Cell. Proteomics 2007, 6, 1274-86.

195. López-Ferrer, D., Ramos-Fernández, A., Martínez-Bartolomé, S., Garcia-Ruiz, P., Vázquez, J., Quantitative proteomics using 160/180 labeling and linear ion trap mass spectrometry. Proteomics 2006, 6 Suppl 1, S4-11.

196. Alterman, M.A., Kornilayev, B., Duzhak, T., Yakovlev, D., Quantitative analysis of cytochrome p450 isozymes by means of unique isozyme-specific tryptic peptides: a proteomic approach. Drug Metab. Dispos. 2005, 33, 1399—407.

197. Seibert, C., Davidson, B.R., Fuller, B.J., Patterson, L.H., et al., Multiple-approaches to the identification and quantification of cytochromes P450 in human liver tissue by mass spectrometry. J. Proteome Res. 2009, 8, 1672-81.

198. Huang, H.-J., Tsai, M.-L., Chen, Y.-W., Chen, S.-H., Quantitative shot-gun proteomics and MS-based activity assay for revealing gender differences in enzyme contents for rat liver microsome. J. Proteomics 2011, 74, 2734-44.

199. Wang, D., Zhang, M., Rapid quantitation of testosterone hydroxyl metabolites by ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 855, 290-^1.

200. Lane, C.S., Wang, Y., Betts, R., Griffiths, W.J., Patterson, L.H., Comparative cytochrome P450 proteomics in the livers of immunodeficient mice using 180 stable isotope labeling. Mol. Cell. Proteomics 2007, 6, 953-62.

201. Wang, Y., Al-Gazzar, A., Seibert, C., Sharif, A., et al., Proteomic analysis of cytochromes P450: a mass spectrometry approach. Biochem. Soc. Trans. 2006, 34, 1246-51.

202. Langenfeld, E., Zanger, U.M., Jung, K., Meyer, H.E., Marcus, K., Mass spectrometry-based absolute quantification of microsomal cytochrome P450 2D6 in human liver. Proteomics 2009, 9, 2313-23.

203. Bartlett, A.I., Radford, S.E., An expanding arsenal of experimental methods yields an explosion of insights into protein folding mechanisms. Nat. Struct. Mol. Biol. 2009, 16, 582-8.

204. Dunker, A.K., Sihnan, I., Uversky, V.N., Sussman, J.L., Function and structure of inherently disordered proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 2008, 18, 756—64.

205. Hütt, D.M., Powers, E.T., Balch, W.E., The proteostasis boundary in misfolding diseases of membrane traffic. FEBS Lett. 2009, 583, 2639^16.

206. Morimoto, R.I., Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes Dev. 2008, 22, 1427-38.

207. Hartl, F.U., Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 1996, 381, 571-9.

208. Herbst, R., Schäfer, U., Seckler, R., Equilibrium intermediates in the reversible unfolding of firefly (Photinus pyralis) luciferase. J. Biol. Chem. 1997, 272, 7099105.

209. Ellis, R.J., Minton, A.P., Protein aggregation in crowded environments. Biol. Chem. 2006, 387, 485-97.

210. Tokuriki, N., Tawfik, D.S., Chaperonin overexpression promotes genetic variation and enzyme evolution. Nature 2009, 459, 668-73.

211. Skach, W.R., Cellular mechanisms of membrane protein folding. Nat. Struct. Mol. Biol. 2009, 16, 606-12.

212. Kerner, M.J., Naylor, D.J., Ishihama, Y., Maier, T., et al., Proteome-wide analysis of chaperonin-dependent protein folding in Escherichia coli. Cell 2005, 122, 20920.

213. Eichner, T., Kalverda, A.P., Thompson, G.S., Homans, S.W., Radford, S.E., Conformational conversion during amyloid formation at atomic resolution. Mol. Cell 2011, 41, 161-72.

214. Chiti, F., Dobson, C.M., Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 2006, 75, 333-66.

215. Bolognesi, B., Kumita, J.R., Barros, T.P., Esbjorner, E.K., et al., ANS binding reveals common features of cytotoxic amyloid species. ACS Chem. Biol. 2010, 5, 735-40.

216. Hartl, F.U., Hayer-Hartl, M., Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct. Mol. Biol. 2009, 16, 574-81.

217. Langer, T., Lu, C., Echols, H., Flanagan, J., et al., Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding. Nature 1992, 356, 683-9.

218. Auluck, P.K., Chan, H.Y.E., Trojanowski, J.Q., Lee, V.M.Y., Bonini, N.M., Chaperone suppression of alpha-synuclein toxicity in a Drosophila model for Parkinson's disease. Science 2002, 295, 865-8.

219. Mayer, M.P., Gymnastics of molecular chaperones. Mol. Cell 2010, 39, 321-31.

220. Arndt, V., Dick, N., Tawo, R., Dreiseidler, M., et al., Chaperone-assisted selective autophagy is essential for muscle maintenance. Curr. Biol. 2010, 20, 143-8.

221. Riidiger, S., Buchberger, A., Bukau, B., Interaction of Hsp70 chaperones with substrates. Nat. Struct. Biol. 1997, 4, 342-9.

222. Rousseau, F., Serrano, L., Schymkowitz, J.W.H., Iiow evolutionary pressure against protein aggregation shaped chaperone specificity. J. Mol. Biol. 2006, 355, 1037-47.

223. Kampinga, H.H., Craig, E.A., The FISP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11, 579-92.

224. Sharma, S.K., De los Rios, P., Christen, P., Lustig, A., Goloubinoff, P., The kinetic parameters and energy cost of the FIsp70 chaperone as a polypeptide unfoldase. Nat. Chem. Biol. 2010, 6, 914-20.

225. Iiorwich, A.L., Fenton, W.A., Chaperonin-mediated protein folding: using a central cavity to kinetically assist polypeptide chain folding. Q. Rev. Biophys. 2009, 42, 83-116.

226. Brinker, A., Pfeifer, G. Kerner, M.J., Naylor, D.J., et al., Dual function of protein confinement in chaperonin-assisted protein folding. Cell 2001, 107, 223-33.

227. Douglas, N.R., Reissmann, S., Zhang, J., Chen, B., et al., Dual action of ATP hydrolysis couples lid closure to substrate release into the group II chaperonin chamber. Cell 2011, 144, 240-52.

228. Reissmann, S., Parnot, C., Booth, C.R., Chiu, W., Frydman, J., Essential function of the built-in lid in the allosteric regulation of eukaryotic and archaeal chaperonins. Nat. Struct. Mol. Biol. 2007, 14, 432-40.

229. Tam, S., Geller, R., Spiess, C., Frydman, J., The chaperonin TRiC controls polyglutamine aggregation and toxicity through subunit-specific interactions. Nat. Cell Biol. 2006, 8, 1155-62.

230. Taipale, M., Jarosz, D.F., Lindquist, S., HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11, 515-28.

231. Scheufler, C., Brinker, A., Bourenkov, G., Pegoraro, S., et al., Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the PIsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell 2000, 101, 199-210.

232. Wandinger, S.K., Richter, K., Buchner, J., The PIsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 2008, 283, 18473-7.

233. Shiau, A.K., Harris, S.F., Southworth, D.R., Agard, D.A., Structural Analysis of E. coli hsp90 reveals dramatic nucleotide-dependent conformational rearrangements. Cell 2006, 127, 329-40.

234. Neckers, L., Heat shock protein 90: the cancer chaperone. J. Biosci. 2007, 32, 51730.

235. Cabrita, L.D., Hsu, S.-T.D., Launay, H., Dobson, C.M., Christodoulou, J., Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009, 106, 22239^14.

236. Ferbitz, L., Maier, T., Patzelt, IT, Bukau, B., et al., Trigger factor in complex with the ribosome forms a molecular cradle for nascent proteins. Nature 2004, 431, 590-6.

237. Kaiser, C.M., Chang, H.-C., Agashe, V.R., Lakshmipathy, S.K., et al., Real-time observation of trigger factor function on translating ribosomes. Nature 2006, 444, 455-60.

238. Elcock, A.H., Molecular simulations of cotranslational protein folding: fragment stabilities, folding cooperativity, and trapping in the ribosome. PLoS Comput. Biol. 2006, 2, e98.

239. Netzer, W.J., ITartl, F.U., Recombination of protein domains facilitated by cotranslational folding in eukaryotes. Nature 1997, 388, 343-9.

240. Agashe, V.R., Guha, S., Chang, H.-C., Genevaux, P., et al., Function of trigger factor and DnaK in multidomain protein folding: increase in yield at the expense of folding speed. Cell 2004, 117, 199-209.

241. Zhang, G., Ignatova, Z., Generic algorithm to predict the speed of translational elongation: implications for protein biogenesis. PLoS One 2009, 4, e5036.

242. Vabulas, R.M., Hartl, F.U., Protein synthesis upon acute nutrient restriction relies on proteasome function. Science 2005, 310, 1960-3.

243. Vavouri, T., Semple, J.I., Garcia-Verdugo, R., Lehncr, B., Intrinsic protein disorder and interaction promiscuity are widely associated with dosage sensitivity. Cell 2009, 138, 198-208.

244. Arndt, V., Rogon, C., Hohfeld, J., To be, or not to be—molecular chaperones in protein degradation. Cell. Mol. Life Sci. 2007, 64, 2525-41.

245. Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J., Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments. Nature 2008, 454, 1088-95.

246. Kopito, R.R., Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends Cell Biol. 2000, 10, 524-30.

247. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A.M., Duerk, H., Behl, C., HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One 2010, 5, e8568.

248. Demontis. F., Perrimon, N., FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell 2010, 143, 813-25.

249. Olzscha, H., Schermann, S.M., Woerner, A.C., Pinkert, S., et al., Amyloid-like aggregates sequester numerous metastable proteins with essential cellular functions. Cell 2011, 144, 67-78.

250. Xu, J., Reumers, J., Couceiro, J.R., De Smet, F., et al., Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat. Chem. Biol. 2011, 7, 285-95.

251. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K.PI., Brignull, H.R., Morimoto, R.I., Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science 2006, 311, 1471-4.

252. Behrends, C., Langer, C.A., Boteva, R., Böttcher, U.M., et al., Chaperonin TRiC promotes the assembly of polyQ expansion proteins into nontoxic oligomers. Mol. Cell 2006, 23, 887-97.

253. Lee, B.-H., Lee, M.J., Park, S., Oh, D.-C., et al., Enhancement ofproteasome activity by a small-molecule inhibitor of USP14. Nature 2010, 467, 179-84.

254. Negishi, M., Fujii-Kuriyama, Y., Tashiro, Y., Imai, Y., Site of biosynthesis of cytochrome P450 in hepatocytes of phenobarbital treated rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976,71, 1153-60.

255. Avadhani, N.G., Sangar, M.C., Bansal, S., Bajpai, P., Bimodal targeting of cytochrome P450s to endoplasmic reticulum and mitochondria: the concept of chimeric signals. FEBS J. 2011, 278, 4218-29.

256. Monier, S., Van Luc, P., Kreibich, G., Sabatini, D.D., Adesnik, M., Signals for the incorporation and orientation of cytochrome P450 in the endoplasmic reticulum membrane. J. Cell Biol. 1988, 107,457-70.

257. Lazarow, P.B., de Duve, C., The synthesis and turnover of rat liver of rat liver peroxisomes. IV. Biochemical pathway of catalase synthesis. J. Cell Biol. 1973, 59, 491-506.

258. Negishi, M., Kreibich, G., Coordinated polypeptide synthesis and insertion of protoheme in cytochrome P-450 during development of endoplasmic reticulum membranes. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4791-7.

259. Sadano, H., Omura, T., Incorporation of heme to microsomal cytochrome P-450 in the absence of protein biosynthesis. J. Biochem. 1985, 98, 1321-31.

260. Correia, M.A., Meyer, U.A., Apocytochrome P-450: reconstitution of functional cytochrome with hemin in vitro. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1975, 72, 400-4.

261. Meyer, R.P., Lindberg, R.L.P., Hoffmann, F., Meyer, U.A., Cytosolic persistence of mouse brain CYP1A1 in chronic heme deficiency. Biol. Chem. 2005, 386, 1157-64.

262. Abbritti, G., De Matteis, F., Effect of 3,5-diethoxycarbonyl-l,4-dihydrocollidine on degradation of liver haem. Enzyme 1973, 16, 196-202.

263. Unseld, A., de Matteis, F., Destruction of endogenous and exogenous haem by 2-allyl-2-isopropylacetamide: role of the liver cytochrome P-450 which is inducible by phenobarbitone. Int. J. Biochem. 1978, 9, 865-9.

264. Ogundipe, O.A., A case of variegate porphyria in association with coeliac disease and bisphosphonate associated dental osteonecrosis. J. Clin. Med. Res. 2009, 1, 292-6.

265. Omiecinski, C.J., Bond, J.A., Juchau, M.R., Stimulation by hematin of monooxygenase activity in extra-hepatic tissues from rats, rabbits and chickens. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, 83, 1004-1 1.

266. Namkung, M.J., Faustman-Watts, E., Juchau, M.R., Hematin-mediatcd increases of benzo(a)pyrene mono-oxygenation in maternal, fetal and placental tissues of inducible and non-inducible mouse strains. Dev. Pharmacol. Ther. 1983, 6, 199— 206.

267. Schneider, S., Maries-Wright, J., Sharp, K.H., Paoli, M., Diversity and conservation of interactions for binding heme in b-type heme proteins. Nat. Prod. Rep. 2007, 24, 621-30.

268. Idkowiak, J., Randell, T., Dhir, V., Patel, P., et al., A missense mutation in the human cytochrome b5 gene causes 46,XY disorder of sex development due to true isolated 17,20 lyase deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2012, 97, E465-75.

269. Landfried, D.A., Vuletich, D.A., Pond, M.P., Lecomte, J.T.J., Structural and thermodynamic consequences of b heme binding for monomeric apoglobins and other apoproteins. Gene 2007, 398, 12-28.

270. Tomlinson, E.J., Ferguson, S.J., Conversion of a c type cytochrome to a b type that spontaneously forms in vitro from apo protein and heme: implications for c type cytochrome biogenesis and folding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97, 515660.

271. De Matteis, F., Gibbs, A.H., Martin, S.R., Milek, R.L., Labelling in vivo and chirality of griseofulvin-derived N-alkylated protoporphyrins. Biochem. J. 1991, 280 (Pt3, 813-6.

272. Modi, S., Primrose, W.U., Lian, L.Y., Roberts, G.C., Effect of replacement of ferriprotoporphyrin IX in the haem domain of cytochrome P-450 BM-3 on substrate binding and catalytic activity. Biochem. J. 1995, 310 ( Pt 3, 939-43.

273. Dean, P.A., Rettie, A.E., Turnblom, S.M., Namkung, M.J., Juchau, M.R., Cytosolic activation of hematin-dependent microsomal monooxygenase activity in the lung. Chem. Biol. Interact. 1986, 58, 79-94.

274. Billecke, S.S., Draganov, D.I., Morishima, Y., Murphy, P.J.M., et al., The role of hsp90 in heme-dependent activation of apo-neuronal nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 2004, 279, 30252-8.

275. Sosa, V., Moline, T., Somoza, R., Paciucci, R., et al., Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing Res. Rev. 2013, 12, 376-90.

276. Zuo, L., Otenbaker, N.P., Rose, B.A., Salisbury, K.S., Molecular mechanisms of reactive oxygen species-related pulmonary inflammation and asthma. Mol. Immunol. 2013, 56, 57—63.

277. Musatov, A., Robinson, N.C., Susceptibility of mitochondrial electron-transport complexes to oxidative damage. Focus on cytochrome c oxidase. Free Radie. Res. 2012, 46, 1313-26.

278. Musatov, A., Hebert, E., Carroll, C.A., Weintraub, S.T., Robinson, N.C., Specific modification of two tryptophans within the nuclear-encoded subunits of bovine cytochrome c oxidase by hydrogen peroxide. Biochemistry 2004, 43, 1003-9.

279. Jaeschke, H., Gores, G.J., Cederbaum, A.I., Hinson, J.A., et al., Mechanisms of hepatotoxicity. Toxicol. Sci. 2002, 65, 166-76.

280. Archakov and Bachmanova (1990) Cytochrome P-450 and active oxygen n.d.

281. Fontana, E., Dansette, P.M., Poli, S.M., Cytochrome p450 enzymes mechanism based inhibitors: common sub-structures and reactivity. Curr. Drug Metab. 2005, 6,413-54.

282. Kondrova, E., Stopka, P., Soucek, P., Cytochrome P450 destruction by benzene metabolites 1,4-benzoquinone and 1,4-hydroquinone and the formation of hydroxyl radicals in minipig liver microsomes. Toxicol. In Vitro 2007, 21, 566-75.

283. Kuthan, H., Tsuji, H., Graf, H., Ullrich, V., Generation of superoxide anion as a source of hydrogen peroxide in a reconstituted monooxygenase system. FEBS Lett. 1978, 91, 343-5.

284. Ristau, O., Wagnerova, D.M., Rein, H., Ruckpaul, K., Demethylation of tertiary amines by a reconstituted cytochrome P-450 enzyme system: kinetics of oxygen consumption and hydrogen peroxide formation. J. Inorg. Biochem. 1989, 37, 111— 8.

285. Gorsky, L.D., Koop, D.R., Coon, M.J., On the stoichiometry of the oxidase and monooxygenase reactions catalyzed by liver microsomal cytochrome P-450. Products of oxygen reduction. J. Biol. Chem. 1984, 259, 6812-7.

286. Ghio, A.J., Stonehuerner, J., Dailey, L.A., Carter, J.D., Metals associated with both the water-soluble and insoluble fractions of an ambient air pollution particle catalyze an oxidative stress. Inhal. Toxicol. 1999, 11, 37-49.

287. Dutton, D.R., Parkinson, A., Reduction of 7-alkoxyresorufins by NADPH-cytochrome P450 reductase and its differential effects on their O-dealkylation by rat liver microsomal cytochrome P450. Arch. Biochem. Biophys. 1989, 268, 617— 29.

288. Kusirisin, W., Jaikang, C., Chaiyasut, C., Narongchai, P., Effect of polyphenolic compounds from Solanum torvum on plasma lipid peroxidation, superoxide anion and cytochrome P450 2E1 in human liver microsomes. Med. Chem. 2009, 5, 5838.

289. Borthiry, G.R., Antholine, W.E., Kalyanaraman, B., Myers, J.M., Myers, C.R., Reduction of hexavalent chromium by human cytochrome b5: generation of hydroxyl radical and superoxide. Free Radic. Biol. Med. 2007, 42, 738-55; discussion 735-7.

290. GILLETTE, J.R., BRODIE, B.B., LA DU, B.N., The oxidation of drugs by liver microsomes: on the role of TPNH and oxygen. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1957, 119, 532-40.

291. Kuthan, H., Ullrich, V., Oxidase and oxygenase function of the microsomal cytochrome P450 monooxygenase system. Eur. J. Biochem. 1982, 126, 583-8.

292. Martinkova, M., Kubickova, B., Stiborova, M., Effects of cytochrome P450 inhibitors on peroxidase activity. Neuro Endocrinol. Lett. 2012, 33 Suppl 3, 33^40.

293. Tripathi, S., Li, H., Poulos, T.L., Structural basis for effector control and redox partner recognition in cytochrome P450. Science 2013, 340, 1227-30.

294. Hildebrandt, A.G., Bergs, C., Heinemeyer, G., Schlede, E., et al., Studies on the mechanism of stimulation of microsomal H202 formation and benzo(a)pyrene hydroxylation by substrates and flavone. Adv. Exp. Med. Biol. 1981, 136 Pt A, 179-98.

295. Clejan, L.A., Cederbaum, A.I., Structural determinants for alcohol substrates to be oxidized to formaldehyde by rat liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 1992, 298, 105-13.

296. Zhukov, A. A., Archakov, A.I., Complete stoichiometry of free NADPH oxidation in liver microsomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982, 109, 813-8.

297. Schulz, E., Anter, E., Keaney, J.F., Oxidative stress, antioxidants, and endothelial function. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 1093-104.1326. Naviaux, R.K., Oxidative shielding or oxidative stress? J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012, 342, 608-18.

298. Bae, Y.-A., Cai, G.-B., Kim, S.-H., Zo, Y.-G., Kong, Y., Modular evolution of glutathione peroxidase genes in association with different biochemical properties of their encoded proteins in invertebrate animals. BMC Evol. Biol. 2009, 9, 72.

299. Loosemore, M., Light, D.R., Walsh, C., Studies on the autoinactivation behavior of pure, reconstituted phenobarbital-induced cytochrome P-450 isozyme from rat liver. J. Biol. Chem. 1980, 255, 9017-20.

300. Komori, M., Imai, Y., Sato, R., Purification and characterization of cytochrome P-450 with high affinity for 7-alkoxycoumarins. J. Biochem. 1984, 95, 1379-88.

301. Deloria, L., Abbott, V., Gooderham, N., Mannering, G.J., Induction of xanthine oxidase and depression of cytochrome-P-450 by interferon inducers: genetic difference in the responses of mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, 131, 109-14.

302. Guengerich, F.P., Destruction of heme and hemoproteins mediated by liver microsomal reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-cytochrome P-450 reductase. Biochemistry 1978, 17, 3633-9.

303. Karuzina, I.I., Zgoda, V.G., Kuznetsova, G.P., Samenkova, N.F., Archakov, A.I. Iin in monooxygenase reconstituted system. Free Radic. Biol. Med. 1999, 26, 62032.

304. Ichinose, H., Michizoe, J., Maruyama, T., Kamiya, N., Goto, M., Electron-transfer reactions and functionalization of cytochrome P450cam monooxygenase system in reverse micelles. Langmuir 2004, 20, 5564-8.

305. Karuzina, 1.1., Archakov, A.I., Hydrogen peroxide-mediated inactivation of microsomal cytochrome P450 during monooxygenase reactions. Free Radic. Biol. Med. 1994, 17, 557-67.

306. Larsen, B.T., Gutterman, D.D., Sato, A., Toyama, K., et al., Hydrogen peroxide inhibits cytochrome p450 epoxygenases: interaction between two endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 2008, 102, 59-67.

307. Sluis-Cremer, N., Naidoo, N., Dirr, H., Class-pi glutathione S-transferase is unable to regain its native conformation after oxidative inactivation by hydrogen peroxide. Eur. J. Biochem. 1996, 242, 301-7.

308. Gergel, D., Misik, V., Riesz, P., Cederbaum, A.I., Inhibition of rat and human cytochrome P4502E1 catalytic activity and reactive oxygen radical formation by nitric oxide. Arch. Biochem. Biophys. 1997, 337, 239-50.

309. Schaefer, W.H., Harris, T.M., Guengerich, F.P., Characterization of the enzymatic and nonenzymatic peroxidative degradation of iron porphyrins and cytochrome P-450 heme. Biochemistry 1985, 24, 3254-63.

310. Uvarov VYu, Tretiakov, V.E., Archakov, A.I., Heme maintains catalytically active structure of cytochrome P-450. FEBS Lett. 1990, 260, 309-12.

311. Wang, X., Medzihradszky, K.F., Maltby, D., Correia, M. a, Phosphorylation of native and heme-modified CYP3 A4 by protein kinase C: a mass spectrometric characterization of the phosphorylated peptides. Biochemistry 2001, 40, 11318-26.

312. Wang, Y., Liao, M., Hoe, N., Acharya, P., et al., A role for protein phosphorylation in cytochrome P450 3A4 ubiquitin-dependent proteasomal degradation. J. Biol. Chem. 2009, 284, 5671-84.

313. Bachmanova, G.I., Skotselyas, E.D., Kanaeva, I.P., Kuznetsova, G.P., et al., Reconstitution of liver monooxygenase system in solution from cytochrome P-450 and NADPIi-specific flavoprotein monomers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986, 139, 883-8.

314. Bray, R.C., Cockle, S.A., Fielden, E.M., Roberts, P.B., et al., Reduction and inactivation of superoxide dismutase by hydrogen peroxide. Biochem. J. 1974, 139, 43-8.

315. Fuchs, H.J., Borders, C.L., Affinity inactivation of bovine Cu,Zn superoxide dismutase by hydroperoxide anion, H02-. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983, 116, 1107-13.

316. Kowalik-Jankowska, T., Rajewska, A., Jankowska, E., Grzonka, Z., Products of Cu(II)-catalyzed oxidation of alpha-synuclein fragments containing M1-D2 and H50 residues in the presence of hydrogen peroxide. Dalton Trans. 2008, 832-8.

317. DeLuca, D.C., Dennis, R., Smith, W.G., Inactivation of an animal and a fungal catalase by hydrogen peroxide. Arch. Biochem. Biophys. 1995, 320, 129-34.

318. Blum, J., Fridovich, I., Inactivation of glutathione peroxidase by superoxide radical. Arch. Biochem. Biophys. 1985, 240, 500-8.

319. Barbouti, A., Amorgianiotis, C., Kolettas, E., Kanavaros, P., Galaris, D., Plydrogen peroxide inhibits caspase-dependent apoptosis by inactivating procaspase-9 in an iron-dependent manner. Free Radic. Biol. Med. 2007, 43, 1377-87.

320. Galbusera, C., Orth, P., Fedida, D., Spector, T., Superoxide radical production by allopurinol and xanthine oxidase. Biochem. Pharmacol. 2006, 71, 1747-52.

321. Hall, R.D., Chamulitrat, W., Takahashi, N., Chignell, C.F., Mason, R.P., Detection of singlet (102) oxygen phosphorescence during chloroperoxidase-catalyzed decomposition of ethyl hydroperoxide. J. Biol. Chem. 1989, 264, 7900-6.

322. Kim, K., Erman, J.E., Methionine modification in cytochrome-c peroxidase. Biochim. Biophys. Acta 1988, 954, 95-107.

323. Conner, G.E., Salathe, M., Forteza, R., Lactoperoxidase and hydrogen peroxide metabolism in the airway. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002, 166, S57-61.

324. Matheson, N.R., Wong, P.S., Travis, J., Isolation and properties of human neutrophil myeloperoxidase. Biochemistry 1981, 20, 325—30.

325. Ohno, Y., Gallin, J.I., Diffusion of extracellular hydrogen peroxide into intracellular compartments of human neutrophils. Studies utilizing the inactivation of myeloperoxidase by hydrogen peroxide and azide. J. Biol. Chem. 1985, 260, 8438-46.

326. Vaananen, A.J., Kankuri, E., Rauhala, P., Nitric oxide-related species-induced protein oxidation: reversible, irreversible, and protective effects on enzyme function of papain. Free Radic. Biol. Med. 2005, 38, 1 102-11.

327. Draczynska-Lusiak, B., Brown, O.R., Asparagine synthetase: an oxidant-sensitive enzyme in Escherichia coli. Microbios 1994, 77, 141-52.

328. Tsoukatos, D.C., Liapikos, T.A., Tselepis, A.D., Chapman, M.J., Ninio, E., Platelet-activating factor acetylhydrolase and transacetylase activities in human plasma low-density lipoprotein. Biochem. J. 2001, 357, 457-64.

329. Breusing, N., Grune, T., Regulation of proteasome-mediated protein degradation during oxidative stress and aging. Biol. Chem. 2008, 389, 203-9.

330. Xiang, W., Weisbach, V., Sticht, H., Seebahn, A., et al., Oxidative stress-induced posttranslational modifications of human hemoglobin in erythrocytes. Arch. Biochem. Biophys. 2013, 529, 34-44.

331. Davies, K.J., Delsignore, M.E., Lin, S.W., Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids. J. Biol. Chem. 1987, 262, 99027.

332. Meinnel, T., Serero, A., Giglione, C., Impact of the N-terminal amino acid on targeted protein degradation. Biol. Chem. 2006, 387, 839-51.

333. Du, J., Gebicki, J.M., Proteins are major initial cell targets of hydroxyl free radicals. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004, 36, 2334-43.

334. Pickering, A.M., Davies, K.J.A., Degradation of damaged proteins: the main function of the 20S proteasome. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2012, 109, 227-48.

335. Park, E., Lee, J.W., Yoo, H.M., Ha, B.H., et al., Structural Alteration in the Pore Motif of the Bacterial 20S Proteasome Homolog HslV Leads to Uncontrolled Protein Degradation. J. Mol. Biol. 2013, 425, 2940-54.

336. Kastle, M., Reeg, S., Rogowska-Wrzesinska, A., Grune, T., Chaperones, but not oxidized proteins, are ubiquitinated after oxidative stress. Free Radic. Biol. Med. 2012,53,1468-77.

337. Carlson, E., Bays, N., David, L., Skach, W.R., Reticulocyte lysate as a model system to study endoplasmic reticulum membrane protein degradation. Methods Mol. Biol. 2005, 301, 185-205.

338. Neelam, S., Kakhniashvili, D.G., Wilkens, S., Levene, S.D., Goodman, S.R., Functional 20S proteasomes in mature human red blood cells. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2011, 236, 580-91.

339. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A., Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ. Res. 2013, 112, 1046-58.

340. Fisher, E.A., Khanna, N.A., McLeod, R.S., Ubiquitination regulates the assembly of VLDL in HepG2 cells and is the committing step of the apoB-100 ERAD pathway. J. Lipid Res. 2011, 52, 1170-80.

341. Dunlop, R.A., Rodgers, K.J., Dean, R.T., Recent developments in the intracellular degradation of oxidized proteins. Free Radio. Biol. Med. 2002, 33, 894-906.

342. Pickering, A.M., Koop, A.L., Teoh, C.Y., Ermak, G., et al., The immunoproteasome, the 20S proteasome and the PA28a(3 proteasome regulator are oxidative-stress-adaptive proteolytic complexes. Biochem. J. 2010, 432, 585-94.

343. Ciechanover, A., Intracellular protein degradation: from a vague idea through the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 3400-10.

344. Suraweera, A., Munch, C., Hanssum, A., Bertolotti, A., Failure of amino acid homeostasis causes cell death following proteasome inhibition. Mol. Cell 2012, 48, 242-53.

345. Dice, J.F., Chaperone-mediated autophagy. Autophagy n.d., 3, 295-9.

346. Ronis, M.J., Johansson, I., Hultenby, K., Lagercrantz, J., et al., Acetone-regulated synthesis and degradation of cytochrome P450E1 and cytochrome P4502B1 in rat liver corrected], Eur. J. Biochem. 1991, 198, 383-9.

347. Yin, X.-M., Ding, W.-X., Gao, W., Autophagy in the liver. Hepatology 2008, 47, 1773-85.

348. Ahlberg, J., Berkenstam, A., Henell, F., Glaumann, H., Degradation of short and long lived proteins in isolated rat liver lysosomes. Effects of pH, temperature, and proteolytic inhibitors. J. Biol. Chem. 1985, 260, 5847-54.

349. Sadano, IT., Omura, T., Turnover of two drug-inducible forms of microsomal cytochrome P-450 in rat liver. J. Biochem. 1983, 93, 1375-83.

350. Ono, Y., Sorimachi, IT., Calpains: an elaborate proteolytic system. Biochim. Biophys. Acta 2012, 1824, 224-36.

351. Finley, D., Ubiquitin chained and crosslinked. Nat. Cell Biol. 2002, 4, E121-3.

352. Wrighton, K.H., Ubiquitylation: E3 ligases team up. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2011, 12, 6.

353. Sun, L., Trausch-Azar, J.S., Ciechanover, A., Schwartz, A.L., E2A protein degradation by the ubiquitin-proteasome system is stage-dependent during muscle differentiation. Oncogene 2007, 26, 441-8.

354. Hampton, R.Y., ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr. Opin. Cell Biol. 2002, 14, 476-82.

355. Mogk, A., Bukau, B., Cell biology. When the beginning marks the end. Science 2010, 327, 966-7.

356. Baumeister, W., Walz, J., Ziihl, F., Seemuller, E., The proteasome: paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell 1998, 92, 367-80.

357. Liu, C.-W., Jacobson, A.D., Functions of the 19S complex in proteasomal degradation. Trends Biochem. Sci. 2013, 38, 103-10.

358. Li, X., Huang, T., Jiang, G., Gong, W., et al., Proteasome inhibitor MG132 enhances TRAIL-induced apoptosis and inhibits invasion of human osteosarcoma OS732 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2013.

359. Orlowski, M., Cardozo, C., Michaud, C., Evidence for the presence of five distinct proteolytic components in the pituitary multicatalytic proteinase complex.

360. Properties of two components cleaving bonds on the carboxyl side of branched chain and small neutral amino acids. Biochemistry 1993, 32, 1563-72.

361. Ciechanover, A., The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell 1994, 79, 13-21.

362. Reinheckel, T., Sitte, N., Ullrich, O., Kuckelkorn, U., et al., Comparative resistance of the 20S and 26S proteasome to oxidative stress. Biochem. J. 1998, 335 ( Pt 3, 637-42.

363. Davies, K.J., Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimie n.d., 83, 301-10.

364. Reinheckel, T., Ullrich, O., Sitte, N., Gruñe, T., Differential impairment of 20S and 26S proteasome activities in human hematopoietic K562 cells during oxidative stress. Arch. Biochem. Biophys. 2000, 377, 65-8.

365. Liu, C.-W., Corboy, M.J., DeMartino, G.N., Thomas, P.J., Endoproteolytic activity of the proteasome. Science 2003, 299, 408-11.

366. Hampton, R.Y., Sommer, T., Finding the will and the way of ERAD substrate retrotranslocation. Curr. Opin. Cell Biol. 2012, 24, 460—6.

367. Braun, S., Matuschewski, K., Rape, M., Thorns, S., Jentsch, S., Role of the ubiquitin-selective CDC48(UFD1/NPL4 )chaperone (segregase) in ERAD of OLE1 and other substrates. EMBO J. 2002, 21,615-21.

368. Hill, K., Cooper, A.A., Degradation of unassembled Vphlp reveals novel aspects of the yeast ER quality control system. EMBO J. 2000, 19, 550-61.

369. Wilhovsky, S., Gardner, R., Hampton, R., PIRD gene dependence of endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell 2000, 11, 1697-708.

370. Gardner, R.G., Shearer, A.G., Hampton, R.Y., In vivo action of the FIRD ubiquitin ligase complex: mechanisms of endoplasmic reticulum quality control and sterol regulation. Mol. Cell. Biol. 2001, 21, 4276-91.

371. Rabinovich, E., Kerem, A., Fröhlich, K.-U., Diamant, N., Bar-Nun, S., AAA-ATPase p97/Cdc48p, a cytosolic chaperone required for endoplasmic reticulum-associated protein degradation. Mol. Cell. Biol. 2002, 22, 626-34.

372. Bays, N.W., Gardner, R.G., Seelig, L.P., Joazeiro, C.A., Hampton, R.Y., Hrdlp/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 24-9.

373. Yamazaki, S., Sato, K., Suhara, K., Sakaguchi, M., et al., Importance of thesproline-rich region following signal-anchor sequence in the formation of correct conformation of microsomal cytochrome P-450s. J. Biochem. 1993, 1 14, 652-7.

374. Gonzalez, F.J., Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress: studies with CYP2E1. Mutat. Res. 2005, 569, 101-10.

375. Lown, K.S., Bailey, D.G., Fontana, R.J., Janardan, S.K., et al., Grapefruit juice increases felodipine oral availability in humans by decreasing intestinal CYP3A protein expression. J. Clin. Invest. 1997, 99, 2545-53.

376. Roberts, E.S., Hopkins, N.E., Foroozesh, M., Alworth, W.L., et al., Inactivation of cytochrome P450s 2B1, 2B4, 2B6, and 2B11 by arylalkynes. Drug Metab. Dispos. 1997, 25, 1242-8.

377. Bock, K.W., Siekevitz, P., Turnover of heme and protein moieties of rat liver microsomal cytochrome b5. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970, 41, 374-80.

378. Yang, J., Liao, M., Shou, M., Jamei, M., et al., Cytochrome p450 turnover: regulation of synthesis and degradation, methods for determining rates, and implications for the prediction of drug interactions. Curr. Drug Metab. 2008, 9, 384-94.

379. Benharouga, M., Flaardt, M., Kartner, N., Lukacs, G.L., COOH-terminal truncations promote proteasome-dependent degradation of mature cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from post-Golgi compartments. J. Cell Biol. 2001, 153, 957-70.

380. Huan, J.Y., Koop, D.R., Tightly regulated and inducible expression of rabbit CYP2E1 using a tetracycline-controlled expression system. Drug Metab. Dispos. 1999, 27, 549-54.

381. Yao, K., Falick, A.M., Patel, N., Correia, M.A., Cumene hydroperoxide-mediated inactivation of cytochrome P450 2B1. Identification of an active site heme-modified peptide. J. Biol. Chem. 1993, 268, 59-65.

382. He, K., Bornheim, L.M., Falick, A.M., Maltby, D., et al., Identification of the heme-modified peptides from cumene hydroperoxide-inactivated cytochrome P450 3A4. Biochemistry 1998, 37, 17448-57.

383. Wang, H.F., Figueiredo Pereira, M.E., Correia, M.A., Cytochrome P450 3A degradation in isolated rat hepatocytes: 26S proteasome inhibitors as probes. Arch. Biochem. Biophys. 1999, 365, 45-53.

384. Korsmeyer, K.K., Davoll, S., Figueiredo-Pereira, M.E., Correia, M.A., Proteolytic degradation of heme-modified hepatic cytochromes P450: A role for phosphorylation, ubiquitination, and the 26S proteasome? Arch. Biochem. Biophys. 1999, 365, 31-44.

385. Krappmann, D., Scheidereit, C., A pervasive role of ubiquitin conjugation in activation and termination oflkappaB kinase pathways. EMBO Rep. 2005, 6, 3216.

386. Zhukov, A., Werlinder, V., Ingelman-Sundberg, M., Purification and characterization of two membrane bound serine proteinases from rat liver microsomes active in degradation of cytochrome P450. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 197, 221-8.

387. Mapoles, J., Berthou, F., Alexander, A., Simon, F., Menez, J.F., Mammalian PC-12 cell genetically engineered for human cytochrome P450 2E1 expression. Eur. J. Biochem. 1993,214,735-45.

388. Jansson, I., Curti, M., Epstein, P.M., Peterson, J.A., Schenkman, J.B., Relationship between phosphorylation and cytochrome P450 destruction. Arch. Biochem. Biophys. 1990,283,285-92.

389. Goasduff, T., Cederbaum, A.I., CYP2E1 degradation by in vitro reconstituted systems: role of the molecular chaperone hsp90. Arch. Biochem. Biophys. 2000, 379, 321-30.

390. Zangar, R.C., Kimzey, A.L., Okita, J.R., Wunschel, D.S., et al., Cytochrome P450 3A conjugation to ubiquitin in a process distinct from classical ubiquitination pathway. Mol. Pharmacol. 2002, 61, 892-904.

391. Jones, B.E., Liu, H., Lo, C.R., Koop, D.R., Czaja, M.J., Cytochrome P450 2E1 expression induces hepatocyte resistance to cell death from oxidative stress. Antioxid. Redox Signal. 2002, 4, 701-9.

392. Bardag-Gorce, F., Li, J., French, B.A., French, S.W., Ethanol withdrawal induced CYP2E1 degradation in vivo, blocked by proteasomal inhibitor PS-341. Free Radic. Biol. Med. 2002, 32, 17-21.

393. Masaki, R., Yamamoto, A., Tashiro, Y., Cytochrome P-450 and NADPH-cytochrome P-450 reductase are degraded in the autolysosomes in rat liver. J. Cell Biol. 1987, 104, 1207-15.

394. Tsuji, H., Akasaki, K., Identification and characterization of lysosomal enzymes involved in the proteolysis of phenobarbital-inducible cytochrome P450. Biol. Pharm. Bull. 1994, 17, 568-71.

395. Bardag-Gorce, F., Li, J., French, B.A., French, S.W., The effect of ethanol-induced CYP2E1 on proteasome activity: the role of 4-hydroxynonenal. Exp. Mol. Pathol. 2005, 78, 109-15.

396. Eliasson, E., Mkrtchian, S., Halpert, J.R., Ingelman-Sundberg, M., Substrate-regulated, cAMP-dependent phosphorylation, denaturation, and degradation of glucocorticoid-inducible rat liver cytochrome P450 3A1. J. Biol. Chem. 1994, 269, 18378-83.

397. Murray, B.P., Correia, M.A., Ubiquitin-dependent 26S proteasomal pathway: a role in the degradation of native human liver CYP3A4 expressed in Saccharomyces cerevisiae? Arch. Biochem. Biophys. 2001, 393, 106-16.

398. Ronis, M.J., Ingelman-Sundberg, M., Acetone-dependent regulation of cytochrome P-450j (IIE1) and P-450b (IIB1) in rat liver. Xenobiotica. 1989, 19, 1161-5.

399. Furuno, K., Ishikawa, T., Kato, K., Isolation and characterization of autolysosomes which appeared in rat liver after leupeptin treatment. J. Biochem. 1982, 91, 194350.

400. Ueno, T., Muno, D., Kominami, E., Membrane markers of endoplasmic reticulum preserved in autophagic vacuolar membranes isolated from leupeptin-administered rat liver. J. Biol. Chem. 1991, 266, 18995-9.

401. Huan, J.-Y., Streicher, J.M., Bleyle, L.A., Koop, D.R., Proteasome-dependent degradation of cytochromes P450 2E1 and 2B1 expressed in tetracycline-regulated HeLa cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2004, 199, 332-43.

402. Licad-Coles, E., He, K„ Yin, H., Correia, M.A., Cytochrome P450 2C11: Escherichia coli expression, purification, functional characterization, and mechanism-based inactivation of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 1997, 338, 35-42.

403. Ortiz de Montellano, P.R., Beilan, H.S., Kunze, K.L., N-Alkylprotoporphyrin IX formation in 3,5-dicarbethoxy-l,4-dihydrocollidine-treated rats. Transfer of the alkyl group from the substrate to the porphyrin. J. Biol. Chem. 1981, 256, 6708-13.

404. Barmada, S., Kienle, E„ Koop, D.R., Rabbit P450 2E1 expressed in CHO-K1 cells has a short half-life. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 206, 601-7.

405. Zhukov, A., Ingelman-Sundberg, M., Selective fast degradation of cytochrome P-450 2E1 in serum-deprived hepatoma cells by a mechanism sensitive to inhibitors of vesicular transport. Eur. J. Biochem. 1997, 247, 37^13.

406. Freeman, J.E., Wolf, C.R., Evidence against a role for serine 129 in determining murine cytochrome P450 Cyp2e-1 protein levels. Biochemistry 1994, 33, 13963-6.

407. Yang, M.X., Cederbaum, A.I., Role of the proteasome complex in degradation of human CYP2E1 in transfected HepG2 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 226, 711-6.

408. Burrows, J.F., Johnston, J.A., Regulation of cellular responses by deubiquitinating enzymes: an update. Front. Biosci. (Landmark Ed. 2012, 17, 1184-200.

409. Banerjee, A., Kocarek, T.A., Novak, R.F., Identification of a ubiquitination-Target/Substrate-interaction domain of cytochrome P-450 (CYP) 2E1. Drug Metab. Dispos. 2000, 28, 118-24.

410. Lewis, M.D., Roberts, B.J., Role of CYP2E1 activity in endoplasmic reticulum ubiquitination, proteasome association, and the unfolded protein response. Arch. Biochem. Biophys. 2005, 436, 237-45.

411. He, K., Iyer, K.R., Hayes, R.N., Sinz, M.W., et al., Inactivation of cytochrome P450 3A4 by bergamottin, a component of grapefruit juice. Chem. Res. Toxicol. 1998, 11, 252-9.

412. Wilkinson, D., Ramsdale, M., Proteases and caspase-like activity in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Soc. Trans. 2011, 39, 1502-8.

413. Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T.A., Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002, 3, 246-55.

414. Wilm, M., Shevchenko, A., Houthaeve, T., Breit, S., et al., Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. Nature 1996, 379, 466-9.

415. Zgoda, V., Tikhonova, O., Viglinskaya, A., Serebriakova, M., et al., Proteomic profiles of induced hepatotoxicity at the subcellular level. Proteomics 2006, 6, 4662-70.

416. Wiechelman, K.J., Braun, R.D., Fitzpatrick, J.D., Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal. Biochem. 1988, 175, 231-7.

417. Bornheim, L.M., Underwood, M.C., Caldera, P., Rettie, A.E., et al., Inactivation of multiple hepatic cytochrome P-450 isozymes in rats by allylisopropylacetamide: mechanistic implications. Mol. Pharmacol. 1987, 32, 299-308.

418. Wang, H., Dick, R., Yin, H., Licad-Coles, E., et al., Structure-function relationships of human liver cytochromes P450 3A: aflatoxin B1 metabolism as a probe. Biochemistry 1998, 37, 12536^15.

419. Karuzina, 1.1., Bachmanova, G.I., Mengazetdinov, D.E., Miasoedova, K.N., Zhikhareva, V.O., Isolation and properties of cytochrome P-450 from rabbit liver microsomes]. Biokhimiia (Moscow, Russ. 1979, 44, 1049-57.

420. Yasukochi, Y., Masters, B.S., Some properties of a detergent-solubilized NADPPI-cytochrome c(cytochrome P-450) reductase purified by biospecific affinity chromatography. J. Biol. Chem. 1976, 251, 5337-44.

421. OMURA, T., SATO, R., THE CARBON MONOXIDE-BINDING PIGMENT OF LIVER MICROSOMES. II. SOLUBILIZATION, PURIFICATION, AND PROPERTIES. J. Biol. Chem. 1964, 239, 2379-85.

422. NASPI, T., The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsch reaction. Biochem. J. 1953, 55, 416-21.

423. Thurman, R.G., Ley, H.G., Scholz, R., Hepatic microsomal ethanol oxidation. Hydrogen peroxide formation and the role of catalase. Eur. J. Biochem. 1972, 25, 420-30.

424. Sardiu, M.E., Washburn, M.P., Construction of protein interaction networks based on the label-free quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 2011, 781, 71-85.

425. Kopylov, A.T., Zgoda, V.G., Lisitsa, A. V, Archakov, A.I., Combined use of irreversible binding and MRM technology for low- and ultralow copy-number protein detection and quantitation. Proteomics 2013, 13, 727-42.

426. Kopylov, A.T., Zgoda, V.G., Archakov, A.I., Label-free quantitative analysis of proteins using mass-spectrometry], Biomeditsinskaia khimiia n.d., 55, 125-39.

427. Correia, M.A., Farrell, G.C., Olson, S., Wong, J.S., et al., Cytochrome P-450 heme moiety. The specific target in drug-induced heme alkylation. J. Biol. Chem. 1981, 256, 5466-70.

428. Billecke, S.S., Draganov, D.I., Morishima, Y., Murphy, P.J.M., et al., The role of hsp90 in heme-dependent activation of apo-neuronal nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 2004, 279, 30252-8.

429. Chu, F., Maynard, J.C., Chiosis, G., Nicchitta, C. V, Burlingame, A.L., Identification of novel quaternary domain interactions in the PIsp90 chaperone, GRP94. Protein Sci. 2006, 15, 1260-9.

430. Im, S.-C., Waskell, L., The interaction of microsomal cytochrome P450 2B4 with its redox partners, cytochrome P450 reductase and cytochrome b(5). Arch. Biochem. Biophys. 2011, 507, 144-53.

431. Stadtman, E.R., Role of Oxidant Species in Aging. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 1105-1112.

432. Tavares, A.F.N., Nobre, L.S., Saraiva, L.M., A role for reactive oxygen species in the antibacterial properties of carbon monoxide-releasing molecules. FEMS Microbiol. Lett. 2012, 336, 1-10.

433. Kostova, Z., Wolf, D.PI., Importance of carbohydrate positioning in the recognition of mutated CPY for ER-associated degradation. J. Cell Sci. 2005, 118, 1485-92.

434. Walsh, A.A., Szklarz, G.D., Scott, E.E., Pluman cytochrome P450 1A1 structure and utility in understanding drug and xenobiotic metabolism. J. Biol. Chem. 2013, 288, 12932-43.

435. Archakov, A., Zgoda, V., Kopylov, A., Naryzhny, S., et al., Chromosome-centric approach to overcoming bottlenecks in the Human Proteome Project. Expert Rev. Proteomics 2012, 9, 667-76.

436. Pan, C., Xu, S., Zhou, IT., Fu, Y., et al., Recent developments in methods and technology for analysis of biological samples by MALDI-TOF-MS. Anal. Bioanal. Chem. 2007, 387, 193-204.

437. Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M.M., Kuster, B., Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Anal. Bioanal. Chem. 2012, 404, 939-65.

438. Megger, D.A., Pott, L.L., Ahrens, M., Padden, J., et al., Comparison of label-free and label-based strategies for proteome analysis of hepatoma cell lines. Biochim. Biophys. Acta 2013.

439. Ono, M., Shitashige, M., Honda, K., Isobe, T., et al., Label-free quantitative proteomies using large peptide data sets generated by nanoflow liquid chromatography and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomies 2006, 5, 1338-47.

440. Yu, C., Gunsalus, I.C., Cytochrome P-450cam. III. Removal and replacement of ferriprotoporphyrin IX. J. Biol. Chem. 1974, 249, 107-10.

441. Lundberg, M., Johansson, C., Chandra, J., Enoksson, M., et al., Cloning and expression of a novel human glutaredoxin (Grx2) with mitochondrial and nuclear isoforms. J. Biol. Chem. 2001, 276, 26269-75.

442. Davies, K.J., Delsignore, M.E., Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertiary structure. J. Biol. Chem. 1987, 262, 9908-13.

443. Henderson, C.J., Otto, D.M.E., Carrie, D., Magnuson, M.A., et al., Inactivation of the hepatic cytochrome P450 system by conditional deletion of hepatic cytochrome P450 reductase. J. Biol. Chem. 2003, 278, 13480-6.

444. McGehee, R.E., Ronis, M.J., Badger, T.M., Regulation of the hepatic CYP 2E1 gene during chronic alcohol exposure: lack of an ethanol response element in the proximal 5'-flanking sequence. DNA Cell Biol. 1997, 16, 725-36.

445. Bonifacino, J.S., Traub, L.M., Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu. Rev. Biochem. 2003, 72, 395-447.

446. Pickart, C.M., Cohen, R.E., Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004, 5, 177-87.

447. Faucette, S.R., Zhang, T.-C., Moore, R., Sueyoshi, T., et al., Relative activation of human pregnane X receptor versus constitutive androstane receptor defines distinct classes of CYP2B6 and CYP3A4 inducers. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007, 320, 72-80.

448. Zhang, M., Pickart, C.M., Coffino, P., Determinants of proteasome recognition of ornithine decarboxylase, a ubiquitin-independent substrate. EMBOJ. 2003, 22, 1488-96.1. БЛАГОДАРНОСТИ:

449. Автор выражает искреннюю признательность научному консультанту академику Арчакову Александру Ивановичу, к.б.н. Тихоновой Ольге Валентиновне и всем сотрудникам лаборатории Системной биологии за помощь и поддержку при написании данной работы.