Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Москалева, Наталья Евгеньевна

• Москалева, Наталья Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Москалева, Наталья Евгеньевна

1 ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Методы анализа активности 14 и содержания цитохромов Р

2.1 Методы анализа цитохромов Р450 в биологических 17 объектах.

2.1.1 Дифференциальная спектроскопия

2.1.2 Оценка уровня экспрессии цитохромов Р450 по количеству 17 соответствующей мРНК

2.1.3 Иммунологические методы анализа

2.2 Методы протеомного анализа цитохромов Р

2.2.1 Методы предварительного разделения белков 19 суперсемейства Р450 в протеомике

2.2.2 Масс-спектрометрический анализ цитохромов Р450.

2.2.2.1 Идентификация цитохромов Р450 в биологических 23 объектах методами масс-спектрометрии.

2.2.2.2 Методы количественного масс-спектрометрического 24 анализа.

2.2.3 Особенности абсолютного количественного анализа 29 цитохромов Р

2.2.3.1 Выбор масс-спектрометрического оборудования.

2.2.3.2 Получение стандартов для построения калибровочных 31 кривых

2.2.3.3 Относительное масс-спектрометрическое количественное 33 определение цитохромов Р450 без использования изотопной метки

2.2.3.4 Использование методов с введением изотопной метки для 36 масс-спектрометрического анализа цитохромов Р

2.3 Фенотипирование как способ оценки функционального 42 состояния монооксигеназной системы

2.3.1 Методы, основанные на измерении радиоактивности.

2.3.2 Биолюминесцентные методы.

2.3.3 Электрохимические методы оценки актиности 44 цитохромов Р

2.3.4 Флуоресцентный метод как один из наиболее 44 распространенных при оценке активности цитохромов Р450.

2.3.5 Методы, основанные на ВЭЖХ с ультрафиолетовым и 45 масс-спектрометрическим детектированием.

2.4 Сопоставление параметров активности цитохромов Р450 49 с количественным содержанием.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450»

5.2 Особенности разработки методики изоформ-специфичного 138 хромато-масс-спектрометрического количественного анализа цитохромов Р450

5.3 Результаты определения концентрации и активности 142 цитохромов Р450 в микросомах печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном.

6 Выводы 145

7 Список цитируемой литературы 147

8 Приложение 164

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

MALDI-TOF/MS Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота

1-DE Одномерный электрофорез

2-DE Двумерный электрофорез

RPLC-ESI-MS/MS Обращенно-фазовой хроматографии с массспектрометрическим детектированием и электроспрейной ионизацией

IT Ion-trap, масс-спектрометр на основе ионной ловушки

QTOF Квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр

QQQ Масс-спектрометр на основе тройного квадруполя

MRM Мониторинг множественных реакций р-СРВ 2-бромо-4(-хлорацетофеноном) р-ВРВ 2-бромо-4(-бромацетофеноном)

ТСРОВОР 1,4-бис-[2-(3,5-дихлоропиридилокси)] бензолом

ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография

УФ Ультрафиолетовый детектор

Tris-HCl N-гидроксиметиламинометана гидрохлорид

ДТТ 1,4-дитиотриэтол

ТСЕР трис-(2-карбоксиэтил) - фосфин

NADPH Никотинамидадениндинуклеотидфосфат

LOD предел детектирования

1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Ключевая роль первой фазы метаболизма ксенобиотиков принадлежит ферментам суперсемейства цитохромов Р450, которые представляют собой гем-содержащие монооксигеназы и входят в состав микросомальной монооксигеназной системы. Активность монооксигеназной системы в направлении того или иного ксенобиотика определяется главным образом концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохромов Р450. Поэтому для создания моделей лекарственного воздействия необходимо проведение селективного изоформспецифичного количественного анализа цитохромов Р450 в биологических объектах для выявления диапазонов изменения концентраций данных ферментов при воздействии различных факторов и определения взаимосвязей между концентрацией цитохромов Р450 и их активностью.

Мыши являются наиболее распространенными объектами для исследования монооксигеназной системы, так как они обеспечивают целостную, физиологически адекватную модель для изучения влияния различных факторов на активность цитохромов Р450, позволяя предсказать биотрансформацию лекарственных препаратов у человека.

Развитие персонализированной медицины требует создания новых методов оценки концетраций и активностей цитохромов Р450 и их изменений в процессе индукции или ингибирования лекарственными препаратами. Исследование активности и количественных характеристик цитохромов Р450 представляет собой трудную задачу. Факторами, усложняющими разработку методики масс-спектрометрического анализа применительно к цитохромам Р450, являются высокая гомология между белками в одном семействе, а зачастую и между семействами, что приводит к тому, что большая часть пептидов отражают присутствие различных изоформ. Кроме того, цитохромы Р450 являются гидрофобными мембранными белками, которые трудно поддаются анализу. Исследования активности цитохромов Р450 ограничиваются трудностями подбора изоформспецифичных субстратов, ферментативную реакцию с которыми катализировала бы только одна изоформа, а также необходимостью разработки методики количественного анализа метаболитов с высокой чувствительностью и минимальным количеством требуемого биологического материала.

Цель исследования: разработка метода определения активности и концентрации основных изоформ цитохромов Р450 печени мыши с использованием масс-спектрометрии и валидация методики на пробах микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать цитохромы Р450 микросомальной фракции печени контрольных мышей и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном методом общего протеомного профилирования.

2. Создать хромато-масс-спектрометрический метод мониторинга множественных реакций для определения концентраций фармакологически значимых изоформ подсемейств 1А, 2С, 2Б, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.

3. Разработать хромато-масс-спектрометрическую методику определения активности фармакологически значимых подсемейств 1А, 2С, 2В, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.

4. Апробировать и валидировать разработанные методики на примере микросомальной фракции печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

Сопоставить изменения активности и концентрации исследуемых цитохромов Р450 вследствие индукции.

Научная новизна работы. Впервые разработан изоформспецифичный метод количественного анализа цитохромов Р450 печени мыши при помощи хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без использования изотопных меток. Метод требует минимального количества биологического материала, чувствительность составляет до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка, воспроизводимость результатов более 80%. Впервые исследованы диапазоны вариации концентраций и активности цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном, приведена активность в пересчете на молекулу фермента, а также показано, что изменение активности и концентрационных характеристик коррелирует между собой, что подтверждает правильность разработанных методов.

Практическая значимость работы. Разработанный метод позволяет проводить измерение концентрации и активности цитохромов Р450 печени мыши в биологическом материале с чувствительностью до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка и воспроизводимостью результатов более 80% без использования изотопных меток. Оценка воздействия различных факторов на цитохромы Р450 необходима при использования мыши как биологической модели при разработке лекарственных препаратов, а также для создания моделей лекарственного воздействия. Описанная концепция и этапы разработки МЯМ метода применимы для разработки методик анализа цитохромов Р450 монооксигеназной системы человека, что требуется для развития персонализированной медицины.

Положения, выносимые на защиту.

Протеомное профилирование микросомальной фракции печени мыши для идентификации и оценки количественных характеристик цитохромов Р450.

Разработка методики количественного анализа изоформ цитохромов Р450 в микросомах печени мыши без использования изотопных меток с высокой чувствительностью и воспроизводимостью, а также методики определения активности подсемейств 1А, 2С, 2В, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши методом мониторинга множественных реакций на масс-спектрометре с тройным квадруполем.

Определение содержания основных изоформ цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши, а также их вариабельности в процессе индукции.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Москалева, Наталья Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. В результате протеомного профилирования микросомальной фракции печени мышей идентифицировано около 3700 белков, из которых 32 относятся к суперсемейству цитохромов Р450 ( обнаружены изоформы 1А1, 1А2, 2А4, 2А5, 2А12, 2В9, 2В10, 2Е1, 2F2, 2J5, 2J6, 4V3, 4А14, 4А10, 4А12А, 2D9, 2D10, 2D11, 2D26, ЗА11, 3A13, ЗА16, ЗА25, ЗА41, 2С29, 2С39, 2С38, 2С40, 2С54, 2С37, 2С55, 2С70 цитохромов Р450). Общее протеомное профилирование позволило оценить изменения концентраций цитохромов Р450 в процессе индукции.

2. Создана методика количественного анализа изоформ 1А1, 1А2, 2С29, 2С39, 2С50,54, ЗА11,16,41, 2Е1, 2D9, 2D10 и 2D26 цитохромов Р450 в микросомах печени мыши при помощи хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без использования изотопных меток. Корреляция результатов измерения концентраций Р450 с данными полученными с использованием изотопно-меченных пептидов составляет 0,97.

3. Разработана масс-спектрометрическая методика определения активности подсемейств 1А, 1А2, 2С, ЗА, 2Е1, 2D цитохромов Р450 по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом. В качестве изоформспецифичных субстратов использовали фенацетин для CYP1A (метаболит - ацетаминофен), тестострон (CYP3A, 6(3-гидрокситестостерон), хлорзоксазон (CYP2E, 6-гидроксихлорзоксазон), диклофенак (CYP2C, 4-гидроксидиклофенак) и дебризохин (CYP2D, 4-гидроксидебризохин).

4. Установлено, что содержание цитохромов Р450 в микросомальной фракции в контрольной пробе составляло от 1 до 113 фмоль/мкг микросомального белка. Индукция метилхолантреном приводит к увеличению содержания цитохромов Р450 подсемейства 1А 4,34 и 4,98 раза (для изоформ 1А1 и 1А2 соответственно), а индукция фенобарбиталом приводит к увеличению концентрации цитохромов Р450 подсемейств ЗА в 3,4 раза, 2С в 1,7 и 2 раза (для изоформ 2С29 и 2С50,54 соответственно) и 2В 10 и 3 раза (для изоформ 2В10 и 2В9Д9 соответственно), при этом изменения концентраций коррелировали с изменениями активности.

2.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время, несмотря на значительное количество работ, посвященное цитохромам Р450, разработка эффективных методов их количественного анализа остается актуальной задачей. Так как монооксигеназной системе, и в особенности цитохромам Р450 принадлежит ключевая роль в метаболизме ксенобиотиков, для изучения молекулярных механизмов действия лекарств необходимы исчерпывающие знания о концентрации и активности данных ферментов. Неслучайно, исследование взаимодействия нового лекарственного препарата с цитохромами Р450, отслеживание возможных ингибирующих и индуцирующих эффектов является необходимой стадией доклинических испытаний. Кроме того, оптимизация фармакотерапии возможна только зная индивидуальную вариабельность цитохромного профиля человека и влияние на него различных факторов, а также связь концентрационных характеристик ферментов с активностью монооксигеназной системы по отношению к лекарственным препаратам.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Качественный и количественный анализ цитохромов Р450 в микросомах печени мыши

3.1.1 Подготовка проб микросом печени мыши к масс-спектрометрическому анализу.

Для исследования использовали микросомы печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Мыши (Albino mice, самцы) получали внутрибрюшинные инъекции индуктора в течение 5 дней в дозировке 80 мг/кг веса фенобарбитал (раствор натриевой соли) или 50 мг/кг веса 3-метилхолантрен (в кукурузном масле). Контрольным животным вводили изотонический раствор или масло, соответственно. Выделенную печень перфузировали холодным (4°С) изотоническим КС1 и готовили гомогенаты с использованием гомогенизатора Даунса в 2-х кратном объема калий фосфатного буфера 0.1 М, рН 7.4. Выделение микросом проводили методом, описанным в [112]. Концентрацию общего белка измеряли методом ВСА (Pierce, США) согласно рекомендациям производителя.

3.1.2. Проведение гидролитического ферментативного расщепления белков микросомальной фракции.

Подготовку пробы микросом для масс-спектрометрического анализа проводили при помощи трипсинолиза в растворе с предварительным пиридилэтилированием восстановленных SH-групп аминокислотных остатков цистеинов.

Для анализа отбирали объем пробы, соответствующий 100 мкг микросомального белка, и растворяли в денатурирующем буфере, состоящем из 12 мМ натриевой соли дезоксихолиевой кислоты, 2 М тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА натриевой соли двухзамещённой и 75 мМ Tris-HCl (N-гидроксиметиламинометан гидрохлорида) с рН 8,2, до концентрации 10 мг\мл по микросомальному белку. Далее к полученному раствору добавляли 1,4-дитиотриэтол (ДТТ) и трис-(2-карбоксиэтил) -фосфин (ТСЕР) до конечной концентрации 87 мМ и 6,7 мМ соответственно. После перемешивания пробу инкубировали при температуре 44°С в течение 60 мин. В полученную пробу добавляли 1мкл 5% раствора 4-винилпиридина в ]Ч,1Ч-диметилформамиде и денатурирующем буфере 40/50 (до конечной концентрации 4-винилпиридина 37 мМ), инкубировали в течение 60 мин в недоступном для света месте.

После восстановления и пиридилэтилирования к пробу добавляли буфер для трипсинолиза, состоящий из 42 мМ триэтиламмония бикарбоната и 3 мМ кальция хлорида, до концентрации 1 мг/мл микросомального белка и раствор трипсина (200 нг/мкл) в соотношении 1:100 по массовой доле содержащегося белка. После инкубирования в течении 2 часов при 37°С к пробе добавляли 50 мкл концентрированной муравьиной кислоты, перемешивали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин.

3.1.3 Приготовление "небелковой матрицы" для калибровочных стандартов

Небелковую матрицу" для калибровочных стандартов готовили по методике для трипсинолиза без добавления белковой пробы.

3.1.4 Общее протеомное профилирование микросом печени мыши для идентификации и выявления протеотипических пептидов цитохромов Р450 при помощи ионной ловушки и Q-TOF.

Хромато-масс-спектрометрический анализ для определения протеотипических пептидов цитохромов Р450 проводили при помощи высокоэффективного жидкостного хроматографа "Agilent 1200", включающего в себя нанонасос, капиллярный насос и термостатируемый автосамплер для работы с малыми объемами проб. Хроматографическое разделение осуществляли при помощи чипа Agilent, включающего в себя обогащающую колонку Zorbax 300SB-C18 40 нл 5 мкм, и аналитическую колонку Zorbax 300SB-C18 5 мкм 75 мкл х 43 мм. Подвижная фаза для загрузки и промывки обогащающей колонки - 0,1% муравьиная кислота в воде, скорость потока 3 мкл/мин. Подвижная фаза А -0,1% муравьиная кислота в воде, В - 0,1% муравьиная кислота в 80% ацетонитриле, скорость потока 0.4 мкл/мин. Градиент подвижной фазы от 5% В до 40% В течение 48 мин, далее до 100% В к 50 мин.

Для детектирования использовали ионную ловушку Agilent 6330 Series ХСТ и тандемный масс-спектрометрический детектор высокого разрешения"Agilent 6510 QTOF" с источником ионизации Chip Cube в нанопотоковом режиме.

Для ионной ловушки диапазон сканирования составлял 300-1800 m/z в режиме детектирования положительных ионов. Нижний порог интенсивности в пределах 1,5*105, активный ICC-режим контроля аккумуляции пептидных ионов - не менее 25000 ионов за интервал времени не более, чем 50 миллисекунд.

На тандемном масс-спектрометрическом детекторе высокого разрешения"Agilent 6510 QTOF" MS/MS анализ проводили в режиме положительной ионизации. Диапазон сканирования от 400 до 2400 m/z, скорость сканирования 3 скана/сек, порог интенсивности иона для MS/MS 2000 относительных единиц. Для источника ионизации использовали следующие параметры: температура осушающего газа 325°С, поток осушающего газа 5 л/мин, напряжение на капилляре 2000 V. Идентификацию белков и выбор протеотипических пептидов осуществляли с использованием программного обеспечения Spectrum Mill MS Proteomics Workbench Rev A.03.03.078 (Agilent). Идентификацию белка проводили поиском по базе данных для протеома мыши SwissProt Release 56.6 of 16-December-2008. В качестве параметров для поиска использовали следующие: фермент для расщепления - трипсин, допустимое отклонение для массы моноизотопного пептида 7200 ррш, для MS/MS 70,5 Da. В качестве модификаций выбирали пиридилэтилирование цистеина и возможное окисление метионина.

Выбор пептидов для последующего количественного анализа при помощи масс-спектрометрического детектора на основе тройного квадруполя осуществляли согласно следующим критериям: пептид должен состоять не менее чем из шести и не более чем из 15 аминокислотных остатков, причем молекулярная масса должна быть менее 2000 Da (оптимальный диапазон для масс-спектрометра с тройным квадруполем). Пептиды не должны содержать пропущенных сайтов ферментативного расщепления, для них не должно быть известно пост-трансляционных модификаций и они должны, по возможности, быть уникальными для данной исследуемой изоформы. Далее пептиды должны быть стабильны в растворе на протяжении анализа.

Проверка уникальности пептида проводили при помощи программного обеспечения Spectrum Mill MS Proteomics Workbench Rev A.03.03.078 (Agilent) MS Edman по всей базе данных SwissProt Release 56.6 of 16-December-2008.

3.1.5 Количественный анализ выбранных изоформ цитохромов Р450 с использованием QQQ.

Количественный анализ протеотипических триптических пептидов цитохромов Р450 осуществляли на тандемном масс-спектрометрическом детектор в режиме MRM "Agilent 6410" QQQ с источником ионизации электроспрей. Хроматографическое разделение проводили при помощи высокоэффективного жидкостного хроматографа "Agilent 1200", включающего в себя капиллярный насос и термостатируемый автосамплер для работы с малыми объемами проб. Хроматографическое разделение осуществляли при помощи микроаналитической колонки Zorbax SB-C 18, 150 х 0.5 mm, 5 um. Подвижная фаза А - 0,1% муравьиная кислота в воде, В - 0,1% муравьиная кислота в 80% ацетонитриле, скорость потока 4 мкл/мин. Градиент подвижной фазы от 5% В до 65% В течение 32 мин, далее до 100% В к 34 мин.

Для источника ионизации электроспрей использованы следующие параметры: температура осушающего газа 300°С, давление в небулайзере 20 psi, поток осушающего газа бл/мин, напряжение на капилляре 3000V. В таблице 3.1 приведены оптимизированные масс-спектрометрические параметры количественного анализа пептидов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Москалева, Наталья Евгеньевна, 2013 год

1. Арчаков А.И. Монооксигеназное окисление.// Наука. М. 1975.

2. Nelson D. R. Progress in tracing the evolutionary paths of cytochrome P450. //BBA.2011. V. 1814. P. 14-18.

3. Кукес В.Г., Грачев С.И., Сычев Д.А., Раменская Г.В. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонифицированной медицины. // ГЭОТАР-Медиа. М. 2008.

4. Tingle M.D., Helsby N.A. Can in vitro drug metabolism studies with human tissue replace in vivo animal studies? // Environmental Toxicology and Pharmacology. 2006. V. 21. P. 184-190

5. Turpeinen M., Ghiciuc C., Opritoui M., Tursas L., Pelkonen O., Pasanen M. Predictive value of animal models for human cytochrome P450 (CYP)-mediated metabolism: a comparative study in vitro,// Xenobiotica. 2007. V. 37(12). P.1367-77.

6. Court M.H., Moltke L.L., Shader R.I. Greenblatt D.J. Biotransformation of chlorzoxazone by hepatic microsomes from humans and ten other mammalian species. // Biopharm. and Drug Dispos. 1997. V. 18(3). P. 213-226.

7. Muruganandan S., Sinai CJ. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. // Clin Pharmacol Ther. 2008. V.83(6). P. 818-28

8. Omura T., Sato T. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification, and properties. // J. Biol. Chem. 1964. V. 239. P. 2379-2385.

9. Peisach J., Stern J.O., Blumberd W.E. Optical and magnetic probes of the structure of cytochrome P-450's. // Drug Metab. Dispos. 1973. V.l. P. 45 61.

10. Anderson L., Seilhamer J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. // Electrophoresis. 1997. V.l8. P. 533 537.

11. Raunio H., Hakkola J., Hukkanen J., Pelkonen O., Edwards R., Boobis A., Anttila S. Expression of xenobiotic-metabolizing cytochrome P450s in human pulmonary tissues. // Arch. Toxicol. Suppl. 1998. V. 20. P. 465-469.

12. Pradet-Balade B., Boulme F., Beug H., Mullner E.W., Garcia-Sanz J.A. Translation control: bridging the gap between genomics and proteomics? // Trends Biochem. Sci. 2001. V.26(4). P. 225-229.

13. Mace K., Bowman E.D., Vautravers P., Shields P.G., Harris C.C., Pfeifer A.M. Characterisation of xenobiotic-metabolising enzyme expression in human bronchial mucosa and peripheral lung tissues. // Eur. J. Cancer. 1998. V. 34(6). P. 914-920.

14. Caron E., Rioux N., Olivier N., Lebel-Talbot H., Hamelin B. Quantification of the expression and inducibility of 12 rat cytochrome P450 isoforms by quantitative RT-PCR. // J. Biochem. Molecular. Toxicology. 2005. V. 19. P. 368-378.

15. Edwards R.J., Boobis A.R., Davis D.S. A strategy for investigating the CYP superfamily using targeted antibodies is a paradigm for functional genomic studies. // DrugMetab. Dispos. 2003. V. 31. P. 1470-1480.

16. Kornilayev B.A., Alterman M.A. Utility of polyclonal antibodies targeted toward unique tryptic peptides in the proteomic analysis of cytochrome P450 isozymes. // Toxicology In Vitro. 2008. V. 22. P. 779-787.

17. Walther T., Mann M. Mass-spectrometry based proteomics in cell biology. // J. Cell Biol. 2010. V. 190. P. 491-500.

18. Galeva N., Alterman M. Comparison of one-dimensional and twodimensional gel electrophoresis as a separation tool for proteomic analysis of rat liver microsomes: Cytochromes P450 and other membrane proteins. // Proteomics. 2002. V. 2. P. 713-722.

19. Petushkova N.A., Lisitsa A.V. Producing a one-dimensional proteomic map for human liver cytochromes p450. // Methods in molecular biology. 2012. V. 909. P. 63-82.

20. Sutton C. W., Sutherland M., Shnyder S., Patterson L. H. Improved preparation and detection of cytochrome P450 isoforms using MS methods. // Proteomics. 2010. V. 10. P. 327-331.

21. Langenfeld E., Meyer H.E., Marcus K. Quantitative analysis of highly homologous proteins: the challenge of assaying the "CYP-ome" by mass spectrometry. //Anal. Bioanal. Chem. 2008. V. 392. P. 1123-1134.

22. Galeva N., Yakovlev D., Koen Y., Duzhak Т., Alterman M. Direct identification of cytochrome P450 isozymes by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight-based proteomics approach. // Drug Metab. Dispos. 2003. V. 31. P. 351-355.

23. Dail M. В., Shack A., Chambers J. E., Burgess S.C. Global Liver Proteomics of Rats Exposed for 5 Days to Phenobarbital Identifies Changes Associated with Cancer and with CYP Metabolism. // Toxicological Sciences. 2008. V. 106(2). P. 556-569.

24. Lee H.J., Kwon M.S., Lee E.Y., Cho S.Y., Paik Y.K. Establishment of a PF2D-MS/MS platform for rapid profiling and semiquantitative analysis of membrane protein biomarkers.

25. Proteomics. 2008. V. 8. P. 2168-2177.

26. Копылов A.T., Згода В.Г. Количественные методы в протеомике. // Биомед. химия. 2007. V. 53. Р. 613-643.

27. Bantscheff М., Schirle М., Sweetman G., Rick .J, Kuster В. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. // Anal. Bioanal. Chem. 2007. V. 389. P.1017-1031.

28. Ong S.E., Mann M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). // Nature Protocols. 2006. V. 1. P. 2650-2660.

29. Gerber S.A., Rush J., Stemman O., Kirschner M.W., Gugi S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 6940-6945.

30. Ong S.E., Kratchmarova I., Mann M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). // J. Proteome Res. 2003. V. 2(2). P. 173-181.

31. Everley P.A., Krijgsveld J., Zetter B.R., Gygi S.P. Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) as a tool for prostate cancer research. // Mol. Cell Proteomics. 2004. 3. P. 729735.

32. Jia N., Liu X., Wen J., Qian L., Qian X., Wu L., Fan G. Proteomic method for analysis of CYP450s protein expression changes in carbon tetrachloride induced male rat liver microsomes.//Toxicology. 2007. V. 237. P. 1-11.

33. Ji C., Guo N., Li L. Differential dimethyl labeling of N-termini of peptides after guanidination for proteome analysis. // J. Proteome Res. 2005. V. 4. P. 2099-2108.

34. Hsu J.L., Huang S.Y., Chow N.H., Chen S.H. In vacuo isotope coded alkylation technique (IVICAT); an N-terminal stable isotopic label for quantitative liquid chromatography/mass spectrometry proteomics. // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 6843-6852.

35. Gygi S.P., Rist B., Griffin T.J., Eng J. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. // J. Proteome Res. 2002. V. 1(1). P. 47-54.

36. Gygi S.P., Rist B., Gerber S.A., Turecek F., Gelb M.H., Aebersold R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.//Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 994-999.

37. Yu, L.-R., Conrads, T.P., Uo, T., Isaaq, H.J. Evaluation of the acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagents: application to camptothecin-treated cortical neurons. // J. Proteome Res. 2004. V. 3. P.469-477.

38. Parker, K.C., Pattern, D., Williamson, B., Marches, J. Depth of proteome issues: a yeast isotope-coded affinity tag reagent study. // Mol. Cell. Proteomics. 2004. V. 3. P.625 659.

39. Sethuraman, M., McComb, M.E., Heibeck, T., Costello, C.E., Cohen, R.A. Isotope-coded affinity tag approach to identify and quantify oxidant-sensitive protein thiols. // Mol. Cell. Proteomics. 2004. V. 3. P.273-278.

40. Schmidt A., Kellermann J., Lottspeich F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. // Proteomics. 2005. V. 5(1). P. 4-15.

41. Ross P.L., Huang Y.N., Marchese J.N., Williamson B., Parker K., Hattan S., Khainovski N., Pillai S., Dey S., Daniels S., Purkayastha S., Juhasz P., Martin

42. S., Bartlet-Jones M., He F., Jacobson A., Pappin DJ. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.//Mol. Cell Proteomics. 2004. V. 3(12). P. 1154-1169.

43. Griffin T.J., Xie H., Bandhakavi S., Popko J. Mohan A., Carlis J.V., Higgins L. iTRAQ reagent-based quantitative proteomic analysis on a linear ion trap mass spectrometer.//J. Proteome Res. 2007. V. 6. P. 4200-4209.

44. Wiese S., Reidegeld K.A., Meyer H.E., Warscheid B. Protein labeling by iTRAQ: a new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. // Proteomics. 2007. V. 7(3). P. 340-350.

45. Fenselau C., Yao X. . Proteolytic labeling with 180 for comparative proteomics studies: preparation of 180-labeled peptides and the 180/160 peptide mixture.//Methods Mol. Biol. 2007. V. 359. P. 135-142.

46. Ramos-Fernandez A., Lopez-Ferrer D., Vazquez J. Improved method for differential expression proteomics using trypsin-catalyzed 180 labeling with a correction for labeling efficiency. // Mol. Cell Proteomics. 2007. V. 6. P. 1274-1286.

47. Lopez-Ferrer D., Ramos-Fernandez A., Martinez-Bartolome S., Garcia-Ruiz P. Quantitative proteomics using 160/180 labeling and linear ion trap mass spectrometry. // Proteomics. 2006. V. 6(1). P. 4-11.

48. Mirgorodskaya, O.A., Kozmin, Y.P., Titov, M.I., Korner, R., Sonksen, C.P., Roepstoroff, P.

49. Quantitation of peptides and proteins by matrix-assisted laserdesorption/ionization mass spectrometry using (18)0-labeled internal standards.

50. Rapid Comm. Mass Spectrom. 2000. V. 14. P.1226-1232.

51. Stewart, I.I., Thomson, T., Figeys, D. 180 labeling: a tool for proteomics.

52. Rapid Comm. Mass Spectrom. 2001. V. 15. P.2456-2465.

53. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J, Dmitriev, P.A., Fenselau, C. Proteolytic 180labeling for comparative proteomics: model studies with two serotypes ofadenovirus. //Anal Chem. 2001. V. 73. P.2836-2842.

54. Gerber S.A., Rush J., Stemman O., Kirschner M.W. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100(12). P. 6940-6945.

55. Beynon R.J., Doherty M.K., Pratt J.M., Gaskell S.J. Multiplexed absolute quantification in proteomics using artificial QCAT proteins of concatenated signature peptides. // Nature Methods. 2005. V. 2. P. 587-589.

56. Pratt J.M., Simpson D.M., Doherty M.K., Rivers J., Gaskell S.J., Beynon R.J. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. // Nature Protocols. 2006. V. 1. P. 1029-1043.

57. Rivers J., Simpson D.M., Robertson D.H., Gaskell S.J. Absolute multiplexed quantitative analysis of protein expression during muscle development using QconCAT. // Mol. Cell Proteomics. 2007. V. 6. P. 1416— 1427.

58. Brun V., Dupuis A., Adrait A., Marcellin M. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. // Mol. Cell Proteomics. 2007. 6. P. 2139-2149.

59. Yu A.M., Qu J., Felmlee M.A., Cao J., Jiang X.L. Quantitation of human cytochrome P450 2D6 protein with immunoblot and mass spectrometry analysis. // Drug Metab. Dispos. 2009. V. 37(1). P. 170-177.

60. Alterman M.A., Kornilayev B., Duzhak T., Yakovlev D. Quantitative analysis of cytochrome p450 isozymes by means of unique isozyme-specific tryptic peptides: a proteomic approach. // Drug Metabolism and Disposition. 2005. V. 33(9). P. 1399-1407.

61. Huang J.H., Tsai M.L., Chen Y.W., Chen S.H. Quantitative shot-gun proteomics and MS-based activity assay for revealing gender differences in enzyme contents for rat liver microsome. // J. of Proteomics. 2001. V.74(12). P. 2734-2744.

62. Wang Y., Al-Gazzar A., Seibert C., Sharif A., Lane C„ Griffiths W.J. Proteomic analysis of cytochromes P450: a mass spectrometry approach. // Biochem. Soc. Trans. 2006. V. 34(6). P. 1246-1251.

63. Lane C., Wang Y., Betts R. Comparative cytochrome P450 proteomics in the livers of immunodeficient mice using 180 stable isotope labeling. // Mol. Cell Proteomics. 2007. V. 6(6). P. 953-962.

64. Langenfeld E., Zanger U.M., Jung K., Meyer H.E., Marcus K. Mass spectrometry-based absolute quantification of microsomal cytochrome P450 2D6 in human liver.//Proteomics. 2009. V. 9. P. 2313 -2323.

65. Zlokarnic G, Grootenhuis P., Watson J. High throughput P450 inhibition screens in early drug discovery. // Drug discovery today. 2005. V. 10(21). P. 1440-1450.

66. Shumyantseva V.V., Bulko T.V., Suprun E.V., Chalenko Y. M., Vagin М. Y., Rudakov Y.O., Shatskaya M.A., Archakov A.I. Electrochemical investigations of cytochrome P450. // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1814. P. 94-101.

67. Schneider E., Clark D. Cytochrome P450 (CYP) enzymes and the development of CYP biosensors. // Biosens. Bioelectron. 2013. V.39. P. 1-13.

68. Phillips I., Shephard E. Cytochrome P450 Protocols. //Humana Press Inc. Totowa. New Jersey. USA. 2006.

69. Yan Z., Caldwell G. Optimization in Drug Discovery: In Vitro Methods. // Humana Press Inc. Totowa. New Jersey. USA. 2007.

70. Stresser D.M., Turner S.D., Blanchard A.P., Miller V.P., Crespi L. Cytochrome P450 fluorometric substrates: identification of isoform-selective probes for rat CYP2D2 and human CYP3A4. // Drug Metab. Dispos. 2002. V. 30. P. 845-852.

71. Петушкова H.A., Лисица A.B., Позднев В.Ф., Карузина И.И. Флуориметрический метод определения каталитической активности CYP51bl (стерол 14 - деметилазы) с производными кумарина. // Биомед. Химия. 2010. V. 56, 132-137.

72. Donato М.Т., Jimenes N., Castell J., Gomez-Lechon J. Fluorescence-based assays for screening nine cytochrome P450 (P450) activities in intact cells expressing individual human P450 enzymes. // Drug Metab. Dispos. 2004. V. 32(7). P. 699-706.

73. Dixit V., Hariparsad N., Desai P., Unadkat J. In vitro LC-MS cocktail assays to simultaneously determine human cytochrome P450 activities. // Biopharm. Drug Dispos. 2007. V. 28. P. 257-262.

74. Lahos A., Donato L., Gomez-Lechon J., Castell J. Determination of major human cytochrome P450s activities in 96-well plates using liquid chromatography tandem mass spectrometry. // Toxicology in Vitro. 2007. V. 21. P.1247-1252.

75. Smith D., Sadagopan N., Zientek M., Reddy A., Cohen L. Analytical approaches to determine cytochrome P450 inhibitory potential of new chemical entities in drug discovery. // J. Chrom. B. 2007. V. 850. P. 455^163.

76. Testino S.A., Patoney G. High-throughput inhibition screening of major human cytochrome P450 enzymes using an in vitro cocktail and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2003. V. 30. P. 1459-1467.

77. Li X., Chen X., Li Q., Wang L., Zhong D. Validated method for rapid inhibition screening of six cytochrome P450 enzymes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. // J. Chrom. B. 2007. V. 852, 128137.

78. Walsky R., Obach R. Validated assays for human cytochrome P450 activities. // Drug Metab. Dispos. 2004. V. 32(6). P. 23-29.

79. Turpeinen M., Uusitalo J., Jorma J., Pelkonen O. Multiple P450 substrates in a single run: rapid and comprehensive in vitro interaction assay. // Eur. J. Pharmac. Sci. 2005. V. 24. P. 123-132.

80. O'Donnell C., Grime K., Courtney P., Slee D., Riley R.J. The development of a cocktail CYP2B6, CYP2C8, and CYP3A5 inhibition assay and a preliminary assessment of utility in a drug discovery setting. // Drug Metab. Dispos. 2007. V. 35(3). P. 381-385.

81. Williamson B.L., Purkayastha S., Hunter C.L., Nuwaysir L., Hill J., Easterwood L., Hill J. Quantitative protein determination for CYP induction via LC-MS/MS. //Proteomics. 2011. V. 11. P. 33-41.

82. Zgoda V., Tikhonova O., Viglinskaya A., Serebriakova M., Lisitsa A., Archakov A. Proteomic profiles of induced hepatotoxicity at the subcellular level. //Proteomics. 2006. T. 6. № 16. C. 4662-4670.

83. Копылов A.T., Згода В.Г., Арчаков А.И. Количественный масс-спектрометрический анализ содержания белков в биологических пробах без использования изотопных меток. // Биомедицинская химия. 2009. V. 2. Р.125-139.

84. Wang D., Zhang M. Rapid quantitation of testosterone hydroxyl metabolites by ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry. // J. of Chrom. B. 2007. V. 855. P. 290-294.

85. Jennie Lill. Proteomics tools for quantitayion by mass spectrometry // Mass spectrometry Reviews. 2003. V. 22. P.182-194.

86. Hacket M. Science, Marketing and wishful thinking in quantitative proteomics.//Proteomics. 2008. V. 8. P.4618^1623.

87. Fiehn O., Weckwerth W. Mass spectrometry: Quantitation. // Meth in Mol Biol. 2006. V. 358. P.3-18.

88. Li, X. J., Pedrioli, P. G., Eng, J., Martin, D., Yi, E. C., Lee, H., Aebersold,R. A tool to visualize and evaluate data obtained by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P .3856-3860.

89. Heikkinen A.T., Friedle A. Mass Spectrometry-Based Quantification of CYP Enzymes to Establish In Vitro/In Vivo Scaling Factors for Intestinal and Hepatic Metabolism in Beagle Dog. // Pharm Res. 2012. V. 29. P. 1832-1842.

90. Ludwig C, Claassen M, Schmidt A, Aebersold R. Estimation of absolute protein quantities of unlabeled samples by selected reaction monitoring mass spectrometry. //Mol Cell Proteomics. 2012. V. 11(3). P. 1-16.