Получение моноспецифических антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка и онкодиагностики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Аскарова, Елена Владимировна

• Аскарова, Елена Владимировна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Аскарова, Елена Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СУРВИВИНА - ПРЕДСТАВИТЕЛЯ СЕМЕЙСТВА БЕЛКОВ-ИНГИБИТОРОВ АПОПТОЗА»

1.1. сурвивин - представитель семейства белков-ингибиторов апоптоза

12. Структурные особенности сурвивина

121 BIR-домен

12 2 С-концевая а-спиралъ

12 3 Участки димеризации

12 4 Сигнал ядерного экспорта 13 1.3 Белки-партнеры сурвивина

13 1 Ran 16 13 2 Комплекс хромосомных пассажиров 17 1 3 3 Гистон НЗ 18 1 34 Smac 19 13 5 IAP-IAP комплексы 20 1 3 6 Hsp90

13 7 Тубулин 21 1 3 8 HBXIP 22 139 STAT3

1 4. Функции сурвивина в клетке

14 1 Ингибироеание апоптоза 23 14 2 Регуляция клеточного депения

14 3 Функции сурвивина в онкогенезе

1.5. Изоформы сурвивина

15 1 Строение основных изоформ сурвивина 30 15 2 Локализация изоформ сурвивина в клетке 32 15 3 Функции изоформ сурвивина

1.6. Взаимосвязь локализации сурвивина в клетке и выполняемых им функций

1.7. Димеризация сурвивина и ее влияние на локализацию белка в клетке

1 8 Взаимосвязь структуры и функций сурвивина

18 1 Гомодимер сурвивина

18 2 Гетеродимеры сурвивина 41 1 9. Посттрансляционные модификации сурвивина и их влияние на функции белка

19 1 Фосфорилирование 43 19 2 Ацетилирование 46 19 3 Убиквитинирование

110 сурвивин как прогностический биомаркер онкозаболеваний

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2 1 Выбор фрагментов сурвивина для получения антител

2 2 Получение панели моноспецифических антител к различным участкам сурвивина с помощью синтетических пептидов

2 21 .Получение иммунных сывороток к синтетическим фрагментам сурвивина и изучение их свойств

2 2 2 Выделение моноспецифических антител из сывороток с помощью аффинной хроматографии

2 3 Исследование свойств полученных моноспецифических антител к сурвивину 75 2 31 Определение способности антител связываться с рекомбинантным сурвивином 75 2 3 2 Изучение способности антител к пептидам (122-Е129-!34) и (122-К129-134) различать природную аминокислотную замену

23 3 Установление участков связывания антител

2 3 4 Изучение способности противопептидных антител выявлять эндогенный сурвивин в лизатах опухолевых клеток

2 3 5 Иммуноцитохимическое исследование клеток HeLa, находящихся на различных стадиях клеточного цикла, с помощью противопептидных антител к сурвивину

2 4 Разработка подхода к выделению сурвивина из лизата опухолевых клеток HeLa помощью противопептидных антител

2 5 Исследование диагностического потенциала противопептидных антител к сурвивину

2 5 1 Исспедование образцов опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы с помощью моноспецифических антител к сурвивину

2 5 2 Исспедование серии образцов опухолевых тканей мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину методом им муноблота

2 5 3 Ичмуногистохимическое исследование серии образцов рака мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3 1 Химические реагенты и биологические препараты 98 3 2 Оборудование и расходные материалы 99 3 3 Животные 100 3 4 Культуры клеток 100 3 5 Образцы тканей 100 3 6 Состав буферов 103 3 7 Получение конъюгатов пептидных фрагментов с овальбумином 103 3 8 Получение конъюгатов пептидных фрагментов с KLH 104 3 9 Иммунизация животных и приготовление сывороток крови 104 3 10 Твердофазный иммуноферментный анализ 104 3 11 Приготовление аффинных сорбентов

3 111 Приготовление аффинного сорбента с иммобилизованным пептидом

3 112 Приготовление аффинного сорбента с иммобилизованными антителами

3 12 Аффинная хроматография противопептидных сывороток

3 121 Проведение аффинной хроматографии — стандартная методика

3 12 2 Проведение аффинной хроматографии — модифицированная методика

3.13. Приготовление лизатов клеток

3 13 1 Ведение клеточных культур

3 13 2 Замораживание и размораживание клеток

3 13 3 Приготовление лизатов клеток

3.14. Приготовление гомогенатов ткеней молочной железы и мочевого пузыря

3.15. Определение концентрации тотального белка в лизатах клеток и гомогенатах тканей по методу Брэдфорд

3 15 1 Приготовление реагента Брэдфорд

3 15 2 Определение концентрации белка по Брэдфорд

3.16. Иммунопреципитация сурвивина с помощью сорбентов с иммобилизованными антителами к сурвивину

3 161 Иммунопреципитация рекомбинантного сурвивина из раствора

3 16 2 Иммунопреципитация сурвивина из лизата клеток HeLa

3 17. Иммуноблот

3.18 Иммуноцитохимическое исследование клеток линии HeLa

3 19 иммуногистохимическое исследование образцов опухолевых тканей мочевого пузыря и молочной железы

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

AT - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин ИФА - иммуноферментный анализ НАФ - неполный адъювант Фрейнда ПАФ - полный адъювант Фрейнда ЦОМТ - центр организации микротрубочек

BIR - высококонсервативный домен, характерный для всех представителей семейства СРС - комплекс хромосомных пассажиров HeLa - линия клеток карциномы шейки матки IAP - семейство белков-ингибиторов апоптоза

IBM - тетрапептид, связывающийся с BIR-доменами белков семейства IAP

GFP - зеленый флуоресцентный белок

GST - глутатион-Б-трансфераза

KLH - гемоцианин улитки Megathura crenulata

MCF-7 - линия клеток аденокарциномы молочной железы

OVA - овальбумин

PBS - фосфатный буфер

SDS - додецилсульфат натрия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение моноспецифических антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка и онкодиагностики»

Введение

Онкологические заболевания в структуре смертности населения занимают второе место после сердечно-сосудистых заболеваний, в развитых европейских странах они являются причиной смертности 20% населения. В связи с изменением экологии и образа жизни людей их частота в последние десятилетия неуклонно возрастает. Разработка новых методов уточняющей диагностики рака является актуальным направлением в современной онкологии, так как адекватное лечение в большинстве случаев заканчивается полным выздоровлением больного.

Опухоль - это патологический процесс, представленный новообразованной тканью, в которой изменения генетического аппарата клеток приводят к нарушению регуляции их роста и дифференцировки. Для большинства злокачественных опухолей также характерны нарушения в регуляции программированной клеточной смерти - апоптоза. Важная роль в регуляции апоптоза принадлежит семейству белков-ингибиторов апоптоза (1АР), которые выполняют функции внутриклеточных ингибиторов каспаз. Наибольшее внимание из белков данного семейства привлекает к себе сурвивин.

Различный уровень экспрессии сурвивина в нормальных и раковых тканях обусловливает значительный интерес исследователей к возможности использования данного белка в качестве биомаркера онкологических заболеваний, а также определению взаимосвязи уровня его экспрессии и локализации в раковых клетках с клинико-патологическими показателями. Результаты подобных исследований, однако, зачастую противоречивы, и связано это не только с различной специфичностью применяемых антител, но и с особенностями самого белка. Сурвивин - это один из так называемых «узловых» белков, он образует сложную сеть взаимодействий с белками-посредниками и принимает участие в таких важнейших процессах, как регуляция клеточного деления и ингибирование программированной смерти. Накапливается все больше данных о том, что функции сурвивина в клетке могут зависеть от его локализации в клетке и структурного состояния. Становится очевидным, что для успешной диагностики рака необходимо иметь информацию не только о его содержании в тканях, но и о его локализации в опухолевых клетках, а также о мономер-димерном состоянии. Для подобных исследований необходимы антитела, способные селективно связывать различные структурные формы сурвивина.

В связи с этим, данная работа направлена на получение антител, с одной стороны пригодных для проведения структурно-функциональных исследований сурвивина, с

другой - для уточняющей диагностики онкозаболеваний. Для получения антител было предложено использовать синтетические фрагменты сурвивина. Такой подход позволяет получить узконаправленные антитела к структурно и функционально важным участкам белковой цепи. Для выбора фрагментов сурвивина для последующего получения антител, было необходимо проанализировать имеющуюся информацию о структурных и функциональных особенностях сурвивина, и именно этому посвящен обзор литературы.

I. Обзор литературы «Структурные и функциональные особенности сурвивина - представителя семейства белков-

ингибиторов апоптоза»

1.1. Сурвивин - представитель семейства белков-ингибиторов

апоптоза

Семейство белков-ингибиторов апоптоза (IAP) - это группа структурно и функционально родственных белков, принимающих участие в целом ряде клеточных процессов, начиная с ингибирования каспаз - цистеиновых протеиназ, принимающих участие в программированной клеточной смерти - и заканчивая регуляцией клеточного деления. В семействе IAP человека к настоящему времени идентифицировано 8 представителей. Пять членов этого семейства экспрессируются в нормальных взрослых тканях: c-IAPl (cellular IAP1), C-IAP2, XIAP (X-linked IAP), NAIP (neuronal apoptosis inhibitory protein) and Appolon/BRUCE (BIR-repeat-containing-ubiquitin-conjugating enzyme). Экспрессия еще двух представителей данного семейства, а именно сурвивина и ML-IAP (melanoma IAP)/Livin, наблюдается только в опухолевых тканях [1, 2]. Экспрессия же последнего известного представителя - ILP2 (IAP-like protein 2) в нормальных и опухолевых тканях практически не изучена, однако данный белок был обнаружен в лимфобластоидных клетках и семенниках [3] и в образцах сыворотки крови пациентов с диагнозом рак молочной железы [4].

Первоначально полагали, что функции белков данного семейства связаны лишь с подавлением активности каспаз, то есть с ингибированием апоптоза. Более поздние исследования показали, что белки IAP также участвуют в убиквитин-зависимых сигнальных событиях, которые регулируют активацию транскрипционного фактора NF-кВ, который в свою очередь активирует экспрессию генов, принимающих участие в развитии процессов воспаления, иммунитета, миграции клетки и ее выживании. Кроме того, было показано, что белки данного семейства способны модулировать сигнальные события, приводящие к активации киназ, ответственных за подвижность клетки и метастазирование, а также они регулируют сигнальные пути митотических киназ, клеточную пролиферацию и митоз [5, 6]. Регуляция многих из упомянутых выше клеточных процессов нарушена в раковых клетках, что, как полагают, прямым или

косвенным образом требуется для инициации перерождения клеток в раковые и поддержания и/или развития опухоли [7].

Такое обилие функций белков 1АР может быть связано с многообразием специфических доменов, присутствующих у отдельных представителей семейства (рис.1).

xiAP — ДД n'Cgiw^^H

C-IAP2 —' Н—1 CARD KÜR'NGT) I

Сурвивин ——

ILP2 -J

ML-IAP -

LRR

NAip ^lor^-^Ä-iTiiiV

Рис. 1. Доменная организация представителей белков семейства IAP человека. BIR -высококонсервативный домен, характерный для всех представителей семейства IAP; RING - С-концевой домен, обладающий убиквитин-лигазной активностью; UBC -убиквитин-конъюгирующий домен; CARD - домен взаимодействия с каспазами; LRR -обогащенный остатками лейцина повтор; NOD - домен олигомеризации [8].

Характерная особенность всех белков семейства IAP - это наличие по крайней мере одного, а как правило двух-трех, высококонсервативных участков, названных BIR (baculoviral IAP repeat). Такое название данный домен получил из-за того, что впервые эти супрессоры апоптоза были обнаружены в геноме бакуловирусов. BIR-домен - это цинк-связывающая область белка приблизительно из 70 аминокислотных остатков, которая имеет характерную последовательность R-X2-OF-X2-4-a-X5.jo-pXh-X3-Ghha-X2.6-pX2-6-ChXC-X3-h-X2-aX3-pphhXpH-X5-pCXah, где X - это любой аминокислотный остаток; О - это остаток серина или треонина; а, р, и h - это ароматические, полярные и гидрофобные остатки соответственно. Подчеркнутые аминокислотные остатки в этой последовательности инвариантны, что предполагает их важность для правильной укладки BIR-домена и/или его функций. Таким образом, практически все BIR-домены содержат 3 остатка цистеина и 1 остаток гистидина, координирующие ион цинка, в результате чего формируется мотив «цинковый палец».

Имея в своей последовательности как гидрофобные, так и гидрофильные аминокислотные остатки, BIR-домен, как полагают, принимает участие в белок-белковых взаимодействиях и важен для реализации анти-апоптозного потенциала большинства белков семейства IAP.

В зависимости от наличия в BIR-домене пептид-связывающей впадины их условно подразделяют на 2 группы: BIR-домены I типа (BIR1) и BIR-домены II типа (BIR2). В отличие от BIR1, не имеющего пептид-связывающей впадины, BIR2 имеет характерную гидрофобную щель, через которую происходит связывание с N-концевыми тетрапептидами белков-мишеней, называемыми IAP-связывающими мотивами (IBMs). Наиболее характерная черта всех IBMs - это присутствие на N-конце остатка аланина или серина, которые должны быть экспонированы и незаблокированы. Такой аминокислотный остаток может взаимодействовать с пептид-связывающим участком на поверхности BIR-домена, образуя водородные связи с соседними аминокислотными остатками. Боковая цепь остатка аргинина в третьем положении обеспечивает лучшее взаимодействие с гидрофобной составляющей BIR, гидрофобные остатки во втором и четвертом положении также необходимы для связывания IBM-содержащих белков с BIR.

Белки семейства IAP, принимающие участие в регуляции апоптоза, такие как XIAP, cIAPl, cIAP2 имеют по два BIR2, а кроме того содержат домены I типа, которые не связываются с каспазами или IAP антагонистами, но принимают участие во взаимодействии с рядом других белков. Например, BIR1-домен cIAPl и с1АР2 может связываться с белком TRAF1 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 1) и TRAF2, тогда как BIR 1-домен XIAP участвует во взаимодействии с киназа ТАК1 (transforming growth factor-P-activated кта8е)-связывающим белком TAB 1.

Другой характерный для представителей семейства IAP домен - это С-концевой RING-домен, обладающий убиквитин-лигазной ЕЗ активностью. В состав данного домена (С3НС4) входят два атома цинка, один из которых хелатирован тремя остатками цистеина и одним остатком гистидина, а второй - хелатирован четыремя остатками цистеина.

Белки cLAPl и с1АР2 имеют также каспаза-захватывающие домены CARD, которые, как полагают, принимают участие в белок-белковых взаимодействиях. Кроме того, в некоторых белках IAP были выявлены уникальные для этого семейства домены, такие как нуклеотид-связывающий и олигомеризационный домен (NOD) и лейцин-обогащенные повторы (LRR) в NAIP и убиквитин-конъюгирующий домен в Apollon.

Сурвивин - это структурно и функционально уникальный представитель семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP). Он является самым малым представителем семейства (молекулярная масса всего 16390Да), имеет лишь один BIR-домен, экспрессируется только в опухолевых клетках и участвует как в ингибировании апоптоза, так и в регуляции клеточного деления.

1.2. Структурные особенности сурвивина

Сурвивин - это один из важнейших представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза, так как его экспрессия является наиболее специфичной для опухолевых клеток среди всех транскриптомов человека [9]. Его экспрессия была обнаружена практически во всех типах рака человека [10]. Кроме того, недавнее исследование Кхана и соавторов [11] показало, что раковые клетки способны высвобождать во внеклеточное пространство сурвивин, упакованный в экзосомы. Авторы предполагают, что данный процесс может быть новым механизмом коммуникации опухолевых клеток друг с другом и влияния этих клеток на опухолевое микроокружение, что можно будет использовать для разработки нацеленной терапии рака. Таким образом, сурвивин является привлекательной мишенью для изучения патофизиологии рака, разработки методов уточняющей диагностики опухолей и новых лекарств для лечения онкозаболеваний.

1.2.1. BIR-домен

В отличие от других представителей семейства IAP, сурвивин имеет лишь один BIR-домен. Третичная структура BIR-домена сурвивина соответствует типичной структуре BIR-домена других представителей семейства IAP. В ней можно выделить три антипараллельные ß-складки и четыре короткие a-спирали. Аминокислотные остатки Cys57, Cys60, His77 и Cys84 формируют с ионом цинка мотив «цинковый палец» и стабилизируют третичную структуру всего домена [12]. Как и в случае BIR-доменов других представителей семейства IAP, важную роль в стабилизации его третичной структуры играет остаток Arg 18, расположенный вблизи N-конца первой a-спирали данного домена [13].

Единственный BIR-домен сурвивина является BIR-доменом II типа [14, 15]. Хотя он не способен физически взаимодействовать с каспазами, было показано, что сурвивин может связываться с IBM-содержащим белком Smac/DIABLO [16]. В недавнем

исследовании [17] было также установлено, что BIR-домен сурвивина способен

1 2

физически взаимодействовать с N-концевой последовательностью гистона НЗ Ala -Arg -Thr3-Lys4 при условии, что остаток треонина находится в фосфорилированном состоянии.

1.2.2. С-концевая а-спираль

Другая характерная особенность сурвивина - это наличие на С-конце длинной а-

спирали из 42 аминокислотных остатков (участок белка 98-142). На N-концевом участке данной спирали расположен кластер из гидрофобных аминокислотных остатков.

Полагают, что этот кластер может принимать участие в образовании димера сурвивина, а также он может быть вовлечен в белок-белковые взаимодействия [12]. С-концевая а-спираль необходима для правильной локализации сурвивина в ходе митоза и его функционирования в качестве регулятора хода клеточного деления, так как именно с ее помощью сурвивин взаимодействует с тубулиновыми структурами и членами комплекса хромосомных пассажиров [19].

Группа исследователей, возглавляемая Скоуфиасом, трансфецировала HeLa (линия клеток карциномы шейки матки) полноразмерным сурвивином длиной 142 а.о. и его усеченной с С-конца мутантной формой длиной 106 а.о. Авторы показали, что в отличие от полноразмерной формы белка, мутантный сурвивин был не способен локализоваться ни в кинетохорах во время метафазы, ни в зоне перетяжки или остаточных тельцах во время телофазы, а на всех стадиях митоза был равномерно распределен в цитоплазме клетки [20].

1.2.3. Участки димеризации

Сурвивин имеет высокую склонность к димеризации, при этом димеры образуются

за счет сильных гидрофобных взаимодействий между двумя молекулами белка. В аминокислотной последовательности сурвивина установлено 2 участка димеризации: участок цепи 6-10 перед BIR-доменом и участок 89-102, соединяющий B1R-домен с С-концевым a-спиральным доменом (рис.2).

В гидрофобном контакте принимают участие остаток Leu98 одной молекулы

сурвивина и гидрофобный карман, сформированный остатками Leu6, Trp10, Phe93, Phe101 и 102

Leu другой молекулы [12]. Важную роль в димеризации сурвивина играют аминокислотные остатки в 101 и 102 положении. Было показано, что замена остатков Phe101 и Leu102 на остатки Ala приводит к нарушению гидрофобной поверхности и такой мутантный белок не способен образовывать димеры [21, 22]. В то же время аминокислотные остатки 6-10, по-видимому, играют менее важную роль в димеризации белка. Для изучения влияния N-концевых аминокислотных остатков в образовании димера Гао и соавторы [23] экспрессировали полноразмерную форму сурвивина и три его усеченных мутантных формы: SurAN7 (отсутствует участок 1-7), Sur AN 13 (отсутствует участок 1-13) и SurAN18 (отсутствует участок 1-18). Сравнив способность к димеризации полноразмерного сурвивина и его мутантных форм, а также исследовав силу взаимодействия мономеров в гомодимерах, образованных этими вариантами белка,

1 о

авторы пришли к выводу, что N-концевые аминокислотные остатки вплоть до Arg не играют существенной роли в димеризации белка.

а)

с

Рис. 2. Димер сурвивина [12].

1.2.4. Сигнал ядерного экспорта

Ранее полагали, что малый молекулярный вес сурвивина позволяет ему свободно

проникать во все компартменты клетки, включая ее ядро, за счет пассивной диффузии, однако более поздние исследования показывают, что возможен его активный экспорт из ядра в цитоплазму [24-27]. Было выдвинуто предположение, что аминокислотная последовательность данного белка может содержать участок, ответственный за экспорт сурвивина из ядра в цитоплазму - сигнал ядерного экспорта (NES). Это подтверждается тем фактом, что при экспрессии сурвивина, меченного зеленым флуоресцентным белком (GFP), преимущественно наблюдается его цитоплазматическая локализация. Было показано, что локализация такой белковой конструкции (сурвивин-GFP) зависит от рецепторной системы CRM1, которая осуществляет активный транспорт белков из ядра в цитоплазму. При воздействии на клетки лептомицина В, ингибирующего зависимый от CRM1 ядерный экспорт, сурвивин накапливается в ядре. Так как сурвивин теоретически способен выходить из ядра в цитоплазму за счет пассивной диффузии, то для исследования его ядерного экспорта методом микроинъекций в ядро клетки была получена белковая конструкция GST~cypBHBHH~GFP (GST - глутатион-8-трансфераза). В клетках сквамозно-клеточной карциномы головы и шеи (линия клеток 1624) и остеобластах кисты крысы (линия клеток RKO) конъюгат GST-GFP, имея размер 54 кДа,

был не способен выйти из ядра за счет пассивной диффузии, тогда как конструкция GST~cypBHBHH~GFP количественно экспортировалась из ядра в цитоплазму [27]. Таким образом, было показано, что в последовательности сурвивина присутствует сигнал ядерного экспорта.

Большинство описанных в литературе сигналов ядерного экспорта - это короткие гидрофобные последовательности, содержащие множество остатков лейцина. Такие последовательности часто предваряются кислыми аминокислотными остатками (например, Glu) и располагаются в областях перехода между различными структурными элементами или сайтами белок-белкового взаимодействия. Участок NES белка связывается с экспортным рецептором CRM1, в результате чего белок выходит из ядра в цитоплазму клетки [28].

В настоящее время точная локализация сигнала ядерного экспорта в белковой цепи сурвивина неизвестна. Предполагают наличие NES на участке 84-109 [21]. Группа исследователей, возглавляемая Р. Колнаги [24], используя статистическую программу NetNES 1.1 [29] поиска последовательностей, с высокой вероятностью являющихся сигналом ядерного экспорта, установила участок сурвивина между BIR-доменом и С-концевой a-спиралью, который согласуется с типичной для NES последовательностью: 96LTLGEFLKL104. Другая группа исследователей, возглавляемая Ш. Кнауер [25], изучив активность различных фрагментов внутри участка сурвивина (88-119), показала, что только рекомбинантная белковая конструкция GST~cypBHBHH~GFP (GST - глутатион-S-трансфераза), содержащая участок 89VKKQFEELTL98 активно экспортируется из ядра. Обе группы исследователей показали, что точечные мутации на этих участках, в результате которых происходит замена Phe93 на Pro93, Leu96 на Ala96, Thr97 на Ala97 или Glu97, Leu98 на Ala98, приводят к равномерному распределению белка между ядром и цитоплазмой, а также большей чувствительности клеток к действию облучения и химиотерапии. Третья группа исследователей [21] показала, что аминокислотные замены Phe101 на Ala101 и Leu102 на Ala102 не оказывают значительного влияния на связывание сурвивина с CRM1 и, таким образом участок (96-104) не может быть сигналом ядерного экспорта. Авторы показали, что наиболее эффективно с CRM1 связывается пептид сурвивина (84-109), причем это взаимодействие полностью исчезает при аминокислотной

до до

замене Leu на Ala .

Некоторые исследователи, например, Родригес и соавторы [30], полагают, что в последовательности сурвивина может также располагаться и неклассический сигнал ядерного экспорта, расположенный в С-концевой части молекулы. Хотя данный участок

не содержит богатой остатками лейцина последовательности, тем не менее, усеченная форма белка, состоящая только из С-концевой части сурвивина (119-142), эффективно экспортировалась из ядра в цитоплазму клетки.

1.3. Белки-партнеры сурвивина

Одна из удивительных черт сурвивина - это вовлечение в его функционирование напрямую или опосредованно огромного числа регуляторов, ферментов и транскрипционных факторов. В связи с этим сурвивин считают одним из так называемых «узловых» белков, что означает, что он задействован во множестве сигнальных механизмов клетки. Ниже будет рассмотрено взаимодействие сурвивина с основными его белковыми партнерами и роль этих взаимодействий в жизни клетки.

1.3.1. Ran

Ran - это малая ГТФаза массой 25 кДа, принимающая участие в транспорте РНК и белков через ядерные поры, а также вовлеченная в ход клеточного деления. В течение митоза Ran участвует в формировании веретена деления и в образовании ядерной мембраны после расхождения хромосом. В работе [26] было показано, что Ran может образовывать комплекс с сурвивином как в ядре, так и в цитоплазме клетки, причем это взаимодействие происходит только в S-фазе клеточного цикла и во время митоза. Используя фрагменты белков Ran и сурвивина, авторы установили, что в образование комплекса вовлечены участок 45-74 Ran и участок 55-70 сурвивина, при этом важную роль играет аминокислотный остаток в 65 положении сурвивина. Замена остатка Glu65 на Ala65 приводила к тому, что мутантный сурвивин был не способен связывать Ran.

Активность белка Ran определяется тем фактом, связан ли он ГДФ или ГТФ, поэтому для дальнейших исследований были использованы две его мутантных формы: активированная мутантная форма Ran с заменой Gin69 на остаток Leu (Ran Q69L), не

29

способная гидролизовать ГТФ, и мутантная форма с заменой Туг на Asn (Ran T29N), имеющая низкую аффинность к ГТФ и ГДФ. С помощью GST пул-дауна было показано, что Ran Q69L связывается с сурвивином значительно активнее, чем белок дикого типа, тогда как Ran T29N практически не способен взаимодействовать с сурвивином.

Авторы показали, что комплекс сурвивин-Ran, образующийся на микротрубочках,

играет важную роль в делении клетки: он увеличивает локальную концентрацию ТРХ2 -

эффекторного белка, так называемого «фактора сборки веретена» - в митотическом

аппарате клетки, таким образом, стабилизируя микротрубочки и активизируя

веретенообразование. Подавление экспрессии сурвивина в клетках HeLa с помощью

миРНК, даже частичное, приводило к серьезным дефектам веретена деления, снижению

экспрессии ТРХ2 на полюсах и метафазных нитях веретена деления, хотя не влияло на

уровень экспрессии Ran ни в асинхронных, ни в митотических клетках. Подавление

16

экспрессии Ran с помощью миРНК в первичных фибробластах человека WS-1, в отличие от опухолевых клеток, не приводило к отклонениям в образовании веретена деления или изменению уровня экспрессии ТРХ2. Таким образом, исследователи пришли к выводу, что комплекс сурвивин-Ran функционирует только в опухолевых, но не в нормальных клетках.

1.3.2. Комплекс хромосомных пассажиров

Комплекс хромосомных пассажиров (СРС) - это комплекс из четырех белков:

помимо сурвивина в него входят внутренний кинетохорный белок INCENP (inner centromere protein, молекулярная масса 106 кДа), борелин/Dasra-B (молекулярная масса 31 кДа) и киназная субъединица Aurora-B (молекулярная масса 39 кДа) [31]. В СРС могут быть выделены две функциональные зоны: сурвивин, борелин и INCENP являются компонентами, регулирующими активность и локализацию ферментного компонента комплекса - киназы Aurora В [32].

При формировании регуляторного кора комплекса хромосомных пассажиров во взаимодействие вовлечены участок (1-57) борелина, участок (10-109) INCENP и С-концевой спиральный участок сурвивина, включающий сайт димеризации, в результате чего образуется гетеротример (рис.4). Белок INCENP играет роль стабилизатора комплекса, борелин способствует взаимодействию сурвивина с INCENP, сурвивин же, будучи связанным с INCENP, даже в отсутствие борелина способен восстанавливать функции комплекса хромосомных пассажиров, связывая его с центромерами и остаточными тельцами и таким образом «нацеливая» киназу Aurora В.

В начале митоза белки СРС перемещаются с плеч конденсирующихся хромосом на внутренние центромеры. В стадии метафазы и анафазы, когда хромосомы перемещаются к полюсам, белки СРС локализуются в микротрубочках центрального веретена деления до тех пор, пока не свяжутся с остаточными тельцами внутри межклеточных мостиков пучков микротрубочек, формируемых во время цитокинеза. Функции комплекса хромосомных пассажиров соответствуют его локализации: он вовлечен в конденсацию хромосом, сборку веретена деления, коррекцию взаимодействия микротрубочек с кинетохорами, завершение цитокинеза.

Рис. 4. Структура комплекса хромосомных пассажиров [33]. 1.3.3. Гистон НЗ

Одна из характерных особенностей митоза - это появление большого количества фосфорилированных гистонов. Было показано, что фосфорилирование гистона НЗ по остатку треонина в третьем положении важно для правильной локализации СРС в ходе клеточного деления [34]. В недавнем исследовании было установлено, что такое «нацеливание» происходит благодаря взаимодействию N-концевой части молекулы фосфорилированного гистона с BIR доменом сурвивина - одного из регуляторных компонентов комплекса СРС [35].

В экспериментах по пул-дауну эндогенного сурвивина из лизата клеток HeLa было показано, что сурвивин способен эффективно взаимодействовать с участком гистона НЗ (1-21), в котором остаток Thr фосфорилирован (НЗТЗ), тогда как связывание с нефосфорилированным или же фосфорилированным по положениям Ser10 или Thr11 участком было очень слабым. Триметилирование же гистона НЗТЗ по остатку Lys4 полностью блокировало связывание. Эти данные были подтверждены и в опытах с рекомбинантным сурвивином [35]. Следует заметить, что сурвивин способен связываться с гистоном НЗТЗ в отсутствие других членов СРС [34].

Важную роль в связывании фосфорилированного гистона НЗ играют аминокислотные остатки 70 и 71 сурвивина, расположенные в его BIR домене. Аминокислотные замены Asp70 и Asp71 на Ala приводили к тому, что рекомбинантный сурвивин с такими мутациями не взаимодействовал с гистоном НЗ в условиях in vitro, а в

клетках такой белок в отличие от белка дикого типа был диффузно распределен по хроматину.

1.3.4. Smac

Smac/DIABLO - это митохондриальный белок, который при воздействии на клетку некоторых стимулов апоптоза, таких как УФ-облучение, действие этопозида и глюкокортикоидов, высвобождается в цитозоль [36, 37]. После выхода в цитоплазму N-концевой участок молекулы-предшественника Smac/DIABLO отщепляется путем ограниченного протеолиза, давая зрелую форму белка [36, 38]. Smac/DIABLO в своей зрелой форме, как было показано, способствует активации каспаз, связываясь и нейтрализуя белки семейства IAP, включая XIAP, cIAPl и с1АР2 [36, 37]. В случае ассоциации Smac/DIABLO с XIAP во взаимодействии принимают участие N-концевая часть зрелого Smac/DIABLO и BIR2 и BIR3 домены молекулы XIAP [38, 39]. Схожим образом, как оказалось, Smac/DIABLO способен взаимодействовать и с сурвивином.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Аскарова, Елена Владимировна, 2013 год

Список литературы

1. Kitamura, Н. Prognostic biomarkers of renal cell carcinoma: recent advances / H. Kitamura, T. Tsucamoto // Indian J. Urol.- 2008,- № 24,- P.10-15.

2. Srinivasula, S.M. IAPs: what's in a name? / S.M. Srinivasula, J.D. Ashwell // Mol. Cell-2008,-№30,-P. 123-135.

3. Molecular cloning of ILP-2, a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family / B.W.M. Richter, S.S. Mir, L.J. Eiben [et al] //Mol. Cell Biol.- 2001,-№ 21.-P. 4292-4301.

4. Inhibitor of apoptosis protein-like protein-2 as a novel serological biomarker for breast cancer / M. Xiang, W. Zhou, D. Gao [et al] // Int. J. Mol. Sci.- 2012,- Vol. 13, N 12,- P. 16737-16750.

5. IAP regulation of metastasis / S. Mehrotra, L.R. Languino, C.M. Raskett [et al] // Cancer Cell.-2010,-№ 17,-P. 53-64.

6. X-linked and cellular IAPs modulate the stability of C-RAF kinase and cell motility / T. Dogan, G.S. Harms, M. Hekman [et al] // Nature Cell Biol.- 2008,- № 10,- P. 1447-1455.

7. IAP-targeted therapies for cancer / LaCasse E.C., Mahoney D.J., Cheung H.H. [et al] // Oncogene.- 2008,-№ 21.- P. 6252-6275.

8. Rumble, J.M. Diverse functions within the IAP family / J.M. Rumble, C.S. Duckett // J. Cell Sci.-2008,-№ 121.- P. 3505-3507.

9. Velculescu, V.E. Analysis of human transcriptomes / V.E. Velculescu, S.L. Madden, L. Zhang // Nat. Genet.- 1999,- Vol. 23, N 4,- P. 387-388.

10. The universal character of the tumor-associated antigen survivin / M.H. Andersen, I.M. Svane, J.C. Becker [et al] // Clin. Cancer Res.- 2007.- Vol. 13, N 20,- P. 5991-5994.

11. Extracellular, cell-permeable survivin inhibits apoptosis while promoting proliferative and metastatic potential / S. Khan, J.R. Aspe, M.G. Asumen [et al] // Br. J. Cancer- 2009 - Vol. 100, N7,-P. 1073-1086.

12. Crystal structure of human survivin reveals a bow tie-shaped dimmer with two unusual a-helical extensions / L. Chantalat, D.A. Skoufias, J.-P. Kleman [et al] // Mol. Cell.- 2000,- № 6,-P. 183-189.

13. Luque, L.E. A highly conserved arginine is critical for the functional folding of inhibitor of apoptosis (IAP) BIR domains / L.E. Luque, K.P. Grape, M. Junker // Biochemistry - 2002.- № 41.- P. 13663-13671.

14. The evolution of BIR domain and its containing proteins / L. Cao, Z. Wang, X. Yang [et al] // FEBS Letters.- 2008.- Vol. 582, N 21.- P. 3817-3882.

15. Lens, S.M.A. The case for survivin as mitotic regulator / S.M.A. Lens, G. Vader, R.H. Medema // Current opinion in Cell Biology - 2006,- № 18,- P. 616-622.

16. Song, Z. Direct interaction between survivin and Smac/DIABLO is essential for the anti-apoptotic activity of survivin during taxol-induced apoptosis / Z. Song, X. Yao, M. Wu // J. Biol. Chem.- 2003,- № 278,- P. 23130-23140.

17. Structural basis for the recognition of phosphorylated histone H3 by survivin subunit of the chromosomal passenger complex / A.A. Jeyaprakash, C. Basquin, U. Jayachandran [et al] // Structure-2011.-№ 19,-P. 1625-1634.

18. Nuclear interaction of Smac/DIABLO with Survivin at G2/M arrest prompts docetaxel-induced apoptosis in DU 145 prostate cancer cells / J. Y. Kim, J.Y. Chung, S.G. Lee [et al] // Biochem. Biophys. Res. Comraun.- 2006,- Vol. 350, N 4,- P. 949-54.

19. Altieri, D.C. The case for survivin as a regulator of microtubule dynamics and cell-death decisions / D.C. Altieri // Cell Biol.- 2006,- № 18,- P. 609-615.

20. Human survivin is a kinetochore-associated passenger protein / D.A. Skoufias, C. Mollinari, F.B. Lacroix [et al] // J. Cell Biol.-2000,-Vol. 151, N7,-P. 1575-1581.

21. Homodimerization Antagonizes Nuclear Export of Survivin / D. Engelsma, J.A. Rodriguez, A. Fish [et al] // Traffic.- 2007,- Vol. 8, N 11,- P. 1496-1502.

22. Survivin monomer plays an essential role in apoptosis regulation / M.S. Pavlyukov, N.V. Antipova, M.V. Balashova [et al] // J. Biol. Chem.- 2011- Vol. 286, N 26,- P. 23296-23307.

23. N-terminal deletion effects of human survivin on dimerization and binding to Smac/DIABLO in vitro / Y. Gao, H. Zhang, M. Zhang [et al] // J. Phys. Chem.- 2010,- № 114,- P. 1565615662.

24. Separating the anti-apoptotic and mitotic roles of survivin / R. Colnaghi, C.M. Connell, R.M.A. Barret [et al] // J. Biol. Chem.- 2006.- № 281P. 33450-33456.

25. Nuclear export is essential for the tumor-promoting activity of survivin / S.K. Knauer, O.H. Krämer, T. Knösel [et al] // FASEB J.- 2007.- №21.- P. 207-216.

26. A survivin-Ran complex regulates spindle formation in tumor cells / F. Xia, P.M. Canovas, T.M. Guadagno [et al] // Mol. Cell. Biol.-2008.- Vol. 28, N 17,- P. 5299-5311.

27. The isoform surviving-3B is cytoprotective and can function as a chromosomal passenger complex protein / S.K. Knauer, C. Bier, P. Schlag, et al // Cell Cycle.- 2007.- Vol. 6, N 12 - P. 1502-1509.

28. Weis, K. Regulating access to the genome: nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle / K. Weis // Cell.- 2003,- № 112,- P. 441-451.

29. NetNES 1.1 Server- URL: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNes. Дата обращения: 01.09.2010.

30. CRM 1-mediated nuclear export determines the cytoplasmic localization of the antiapoptotic protein survivin / J.A. Rodriguez, S.W. Span, C.G. Ferreira [et al] // Exp. Cell Res - 2002 - № 275,-P. 44-53.

31. Ruchaud, S. The chromosomal passenger complex: one for all and all for one / S. Ruchaud, M. Carmena, W.C. Earnshaw//Cell.-2007,-№ 131,-P. 230-231.

32. Survivin dynamics increases at centromeres during G2/M phase transition and is regulated by microtubule-attachment and Aurora В kinase activity / V.A. Beardmore, L.J. Ahonen, G.J. Gorbsky [et al] // J. Cell Sei.- 2004,- № 117.- P. 4033-4042.

33. Structure of a survivin-borealin-INCENP core complex reveals how chromosomal passengers travel together / A.A. Jeyaprakash, U.R. Klein, D. Lindner [et al] // Cell.- 2007- № 131,-P. 271-285.

34. Survivin reads phosphorylated histone H3 threonine 3 to activate the mitotic kinase Aurora В / A.E. Kelly, C. Ghenoiu, J.Z. Xue [et al] // Science.- 2010,- № 330.- P. 235-239.

35. Histone H3 Thr-3 phosphorylation by Haspin positions Aurora-B at centromeres in mitosis / F. Wang, J. Dai, J.R. Daum [et al] // Science.- 2010,- № 330,- P. 231-235.

36. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition / C. Du, M. Fang, Y. Li [et al] // Cell.- 2000.- № 102,- P. 33-42.

37. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins / A. M. Verhagen, P.G. Ekert, M. Pakusch [et al] // Cell - 2000- № 102,-P. 43-53.

38. Molecular determinants of the caspase-promoting activity of Smac/DIABLO and its role in the death receptor pathway / S. M. Srinivasula, P. Datta, X.J. Fan [et al] // J. Biol. Chem-2000,- №275,-P. 36152-36157.

39. Structural basis of caspase-7 inhibition by XIAP / J. Chai, E. Shiozaki, S.M. Srinivasula [et al] // Cell.- 2001.- № 104,- P. 769-780.

40. An IAP-IAP complex inhibits apoptosis / T. Dohi, K. Okada, F. Xia [et al] // J. Biol. Chem. 2004. V.279. P.34087-34090.

41. Pohl, С. Final stages of cytokinesis and midbody ring formation are controlled by BRUCE / C. Pohl, S. Jentsch // Cell.- 2008,- № 132,- P. 832-845.

42. cIAPl localizes to the nuclear compartment and modulates the cell cycle / T. Samuel, K. Okada, M. Hyer [et al] // Cancer Res.- 2005,- № 65.- P. 210-218.

43. Regulation of survivin function by Hsp90 / P. Fortugno, E. Beltramy, J. Plescia [et al] // PNAS-2003.-Vol. 100, N24.-P. 13791-13796.

44. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin / F. Li, G. Ambrosini, E.Y. Chu [et al] // Nature.- 1998,- № 396,- P. 580-584.

45. Butner, K.A. Tau protein binds to microtubules through a flexible array of distributed weak sites /K.A. Butner, M.W. Kirschner//J. Cell Biol.- 1991.-№ 115,-P. 717-730.

46. HBXIP functions as a cofactor of surviving in apoptosis suppression / H. Marusawa, S. Matsuzawa, K. Welsh [et al] // EMBO.- 2003,- Vol. 22, N 11,- P. 2729-2740.

47. Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2 phosphorylation of survivin / D.S. O'Connor, D. Grossman, J. Plescia [et al] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000,- № 91.- P. 13103-13107.

48. Barrett, R.M.A. Phosphorylation of survivin at treonine 34 inhibits its mitotic function and enhances its cytoprotective activity / R.M.A. Barrett, T.P. Osborne, S.P. Wheatley // Cell Cycle.-2009,- Vol. 8, N 2,- P. 278-283.

49. Acetylation directs survivin nuclear localization to repress Stat3 oncogenic activity / H. Wang, M.P. Holloway, L. Ma [et al] // J Biol. Chem.- 2010.- Vol. 285, N 46,- P. 36129-36137.

50. Interleukin-11 up-regulates survivin expression in endothelial cells through a signal transducer and activator of transcription-3 pathway / K. Mahboubi, F. Li, J. Plescia [et al] // Lab Invest.- 2001,- Vol. 81, N3,-P. 327-334.

51. Eckelman, B.P. Human inhibitor of apoptosis proteins: why XIAP is the black sheep of the family / B.P. Eckelman, G.S. Salvesen, F.L. Scott // EMBO Rep.- 2006.- № 7,- P. 988-994.

52. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases / Q.L. Deveraux, R. Takahashi, G.S. Salvesen, J.C. Reed // Nature.- 1997.- № 388,- P. 300-304.

53. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs / I. Tamm, Y. Wang, E. Sausville [et al] // Cancer Res-1998,-№58,-P. 5315-5320.

54. Structure of the human anti-apoptotic protein survivin reveals a dimeric arrangement / M.A. Verdecia, H. Huang, E. Dutil [et al] // Nat. Struct. Biol.- 2000,- № 7,- P. 602-608.

55. Survivin does not inhibit caspase-3 activity / D.P. Banks, J. Plescia, D.C. Altieri [et al] // Blood.- 2000,- № 96,- P. 4002-4003.

56. Dohi, T. Compartmentalized phosphorylation of IAP by protein kinase A regulates cytoprotection / T. Dohi, F. Xia, D.C. Altieri // Mol. Cell.- 2007,- № 21.- P. 17-28.

57. Activation of dual apoptotic pathways in human melanocytes and protection by survivin / T. Liu, D. Biddle, A.N. Hanks [et al] // J. Invest. Dermatol.- 2006.- Vol. 126, N 10.- P. 2247-2256.

58. Liu, T. Rapid induction of mitochondrial events and caspase-independent apoptosis in Survivin-targeted melanoma cells / T. Liu, B. Brouha, D. Grossman // Oncogene - 2004- Vol. 23, N 1- P. 39-48.

59. Zangemeister-Wittke, U. An IAP in action: the multiple roles of survivin in differentiation, immunity and malignancy / U. Zangemeister-Wittke, H.U. Simon // Cell Cycle - 2004 - Vol. 3, N9.-P. 1121-1123.

60. Survivin counteracts the therapeutic effect of microtubule de-stabilizers by stabilizing tubulin polymers / C.H.A. Cheung, H.H. Chen, C.C. Kuo [et al] // Mol. Cancer.- 2009,- Vol. 8, N 43.

61. Li, F. The cancer antiapoptosis mouse survivin gene: characterization of locus and transcriptional requirements of basal and cell cycle-dependent expression / F. Li, D.C. Altieri // Cancer Res.- 1999,-№ 59,-P. 3143-3151.

62. Survivin and the inner centromere protein INCENP show similar cell- cycle localization and gene knockout phenotype / A.G. Uren, L. Wong, M. Pakusch [et al] // Curr. Biol.- 2000 - № 10,-P. 1319-1328.

63. Survivin exists in immuno-chemically distinct subcellular pools and is involved in spindle microtubule function / P. Fortugno, N.R. Wall, A. Giodini [et al] // J. Cell Sci.- 2002,- № 115-P. 575-585.

64. Regulation of microtubule stability and mitotic progression by survivin / A. Giodini, M.J. Kallio, N.R. Wall [et al] // Cancer Res.- 2002,-№ 62,- P. 2462-2467.

65. Differential requirements for survivin in hematopoietic cell development / S. Gurbuxani, Y. Xu, G. Keerthivasan [et al] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005,- № 102,- P. 11480-11485.

66. Pisarev, V. Full-length dominant-negative survivin for cancer immunotherapy / V. Pisarev, Y. Bin, R. Salup // Clin. Cancer Res.- 2003,- № 9.- P. 6523-6533

67. Survivin modulates microtubule dynamics and nucleation throughout the cell cycle / J. Rosa, P. Canovas, A. Islam [et al] // Mol. Biol. Cell.- 2006,- № 17.- P. 1483-1493.

68. Survivin enhances aurora-B kinase activity and localizes aurora-B in human cells / J. Chen, S. Jin, S.K. Tahir [et al] // J. Biol. Chem.- 2003,- № 278,- P. 486-490.

69. Phosphorylation by aurora-B negatively regulates survivin function during mitosis / S.P. Wheatly, R.M. Barrett, P.D. Andrews [et al] // Cell Cycle.- 2007,- Vol. 6, N 10,- P. 1220-1230.

70. Chromosome alignment and segregation regulated by ubiquitination of survivin / Q.P. Vong, K. Cao, H.Y. Li [et al] // Science.- 2005,- №310,- P. 1499-1504.

71. Altieri, D.C. The case for survivin as a regulator of microtubule dynamics and cell-death decisions / Altieri, D.C. // Cell Biol.- 2006,- № 18,- P. 609-615.

72. Differential subcellular localization of functionally divergent survivin splice variants / C. Mahotka, J. Liebmann, M. Wenzel [et al] // Cell Death Differ.- 2002,- № 9.- P. 1334-1342.

73. Mitochondrial survivin inhibits apoptosis and promotes tumorogenesis / T. Dohi, E. Beltrami, N.R. Wall [et al] // J. Clin. Invest.- 2004,- № 114,- P. 1117-1127.

74. Nuclear survivin expression is associated with a pore prognosis in Caucasian non-small lung cancer patients / Y.L. Xie, L. An, H. Jiang, J. Wang // Clin. Chim. Acta.- 2012,- № 414,- P.41-43.

75. Expression of survivin in different stages of carcinogenesis and progression of breast cancer / S.Q. Zhang, S.Y. Qiang, W.B. Yang [et al] // Ai Zheng.- 2004,- № 35,- P. 40-47.

76. Wang, M. A novel antiapoptosis gene, survivin, and bcl-2 expression in cervical carcinomas / Wang M, Wang B, Wang X.//Chin. Med J.-2001,-№ 114,-P. 149-153.

77. Survivin expression in ovarian cancer and its correlation with clinico-pathological, surgical and apoptosis-related parameters / G. Ferrandina, F. Legge, E. Martinelli [et al] // Br. J. Cancer.-2005,-№92,-P. 271-277.

78. Expression of survivin gene in the scar endometriosis and in normal human endometrium / R. Tarcowski, J. Kotarski, G. Polak, J. Wojcierowski //Ginecol. Pol.-2001.-№ 72,-P. 1539-1542.

79. Expression of the antiapoptosis gene survivin in human leukemia / A. Mori, H. Wada, Y. Nishimura [et al] // Int. J. Hematol.-2002,-№ 75.-P. 161-165.

80. Increased expression of survivin in gastric cancer patients and in first degree relatives / Yu J., W.K. Leung, M.P. Ebert [et al] // Br. J. Cancer.- 2002,- № 87,- P. 91-97.

81. Yang, D. Expression and clinical significance of survivin gene and PTEN protein in colorectal adenocarcinoma / D. Yang, Y.Q. Zhu, J. Qi // Ai Zheng.- 2004,-№ 23,- P. 306-309.

82. Chiou, S.K. Survivin - an anti-apoptosis protein: its biological roles and implications for cancer and beyond / S.K. Chiou, M.K. Jones, A.S. Tarnawski // Med. Sci. Monit - 2003 - № 9-P. 125-129.

83. Wang, W. Expression of survivin and correlation with PCNA in osteosarcoma / W. Wang, H. Luo, A. Wang // J. Surg. Oncol.- 2006,- № 93.- P. 578-584.

84. Expression of (3-tubulin III and survivin in advance stage breast cancer correlates with chemotherapeutic effects of docetaxel / S.F. Yuan, L.J. Zhu, W.E. Zheng [et al] // Asian Pac. J. Cancer Prev.-2012.-Vol. 13, N l.-P. 361-365.

85. Survivin expression as a strong indicator of recurrence in urothelial bladder cancer. Predictive value of nuclear versus cytoplasmic staining / L. Skagias, E. Politi, A. Karameris // Anticancer Res.- 2009,- Vol. 29, N 10,- P. 4163-4167.

86. Aberrant survivin expression in endometrial hyperplasia: another mechanism of progestin resistance / X. Chen, Z. Zhang, Y. Feng [et al] // Mod. Pathol.- 2009.- Vol. 22, N 5.- P. 699708.

87. Nuclear survivin expression is a positive prognostic factor in taxane-platinum-treated ovarian cancer patients / A. Felisiak-Golabek, A. Rembiszewska, I.K. Rzepecka [et al] // J. Ovarian Res.- 2011,- Vol.4, N20.

88. Survivin expression in human lung cancer and the influence of its downregulation on the biological behavior of human lung cancer cells / X.Q. Chen, S. Yang, M.Q. Kang [et al] // Exp. Ther. Med.-2012,-Vol. 3,N6.-P. 1010-1014.

89. Regulation of survivin expression by IGF-l/mTOR signaling / V. Vaira, C.W. Lee, H.L. Goel [et al] // Oncogene.- 2007,- № 26,- P. 2678-2684.

90. Survivin, survivin-2B, and survivin-deltaEx3 expression in medulloblastoma: biologic markers of tumour morphology and clinical outcome / J.R. Fangusaro, Y. Jiang, M.P. Holloway [et al] // Br J Cancer.- 2005,- № 92,- P.359-365.

91. Forced expression of survivin-2B abrogates mitotic cells and induces mitochondria-dependent apoptosis by blockade of tubulin polymerization and modulation of bcl-2, bax, and survivin / X. Ling, Q. Cheng, J.D. Black, F. Li // J. Biol. Chem.- 2007,- Vol. 282, N 37,- P. 27204-27214.

92. Survivin splice variants regulate the balance between proliferation and cell death / H. Caldas, Y. Jiang, M.P. Holloway [et al] // Oncogene.- 2005,- Vol. 24, N 12,- P. 1994-2007.

93. Characterization of the anti-apoptotic function of survivin-AEx3 during TNFa-mediated cell death / M.-H. Malcles, H.-W. Wang, A. Koumi [et al] // Br J Cancer.- 2007,- № 96,- P. 16591666.

94. Differential expression of survivin-2B and survivin-AEx3 is inversely associated with relapse and patients survival in non-small-cell lung cancer (NSCCL) / X. Ling, J. Yang, D. F. Tan [et al] // Lung Cancer.- 2005,- № 49,- P. 353-361.

95. Roles of survivin isoforms in the chemopreventive actions of NSAIDS on colon cancer cells / S. Mandayam, R. Huang, A.S. Tarnawski, S.-K Chiou // Apoptosis.- 2007,- № 12.- P. 11091116.

96. Inhibition of lymphotoxin-P receptor-mediated cell death by survivin-ÀEx3 / R.-I. You, M.-C. Chen, H.-W. Wang [et al] // Cancer Res.- 2006,- Vol. 66, N 6.- P. 3051-3061.

97. Caldas, H. Survivin 2a: a novel survivin splice variant expressed in human malignancies / H. Caldas, L.E. Honsey, R.A. Altura // Mol. Cancer.- 2005.- Vol. 4, N 11.

98. Posttranslational modification of Bcl-2 facilitates its proteasome-dependent degradation: molecular characterization of the involved signaling pathway / K. Breitschopf, J. Haendeler, P. Malchow [et al] // Mol. Cell Biol.- 2000.- № 20,- P. 1886-1896.

99. Colnaghi, R. Liaisons between survivin and Plkl during cell division and cell death / R. Colnaghi, S.P. Wheatly // J. Biol. Chem.- 2010,- Vol. 285, N 9,- P. 22592-22604.

100. Supression of survivin phosphorylation by flavopiridol enhances tumor cell apoptosis / N.R. Wall, D.S. O'Connor, J. Plescia [et al] // Cancer Res.- 2003,- № 63,- P. 230-235.

101. Aurora-B phosphorylation in vitro identifies a residue of survivin that is essential for its localization and binding to inner centromere protein (INCENP) in vivo / S.P. Wheatly, A.J. Henzing, H. Dodson [et al] // J. Biol. Chem.- 2004.- № 279,- P. 5655-5660.

102. Role of survivin phosphorylation by Aurora B in mitosis / M. Delacour-Larose, M.N. Thi, S. Dimitrov, A. Molla//Cell Cycle.-2007,-Vol. 6,N 15.-P. 1878-1885.

103. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions / C. Choudhary, C. Kumar, F. Gnad [et al] // Science.- 2009,- № 325.- P. 834-840.

104. HDAC6 deacetylates survivin for its nuclear export in breast cancer / M.T. Riolo, Z.A. Cooper, M.P. Holloway [et al] // J. Biol. Chem.- 2012,- Vol. 287, N 14,- P. 10885-10893.

105. The ubiquitin-proteasome pathway regulates survivin degradation in a cell cycle-dependent manner / J. Zhao, T. Tenev, L.M. Martins [et al] // J. Cell Sci.- 2000,- № 113.- P. 4363-4371.

106. Connell, C.M. Nuclear survivin has reduced stability and is not cytorotective / C.M. Connell, R. Colnaghi, S.P. Wheatley // J. Biol. Chem.- 2008,- № 283,- P. 3289-3296.

107. Survivin withdrawal by nuclear export failure as a physiological switch to commit cells to apoptosis / K.S. Chan, C.H. Wong, Y.F. Huang, H.Y. Li // Cell Death Dis.- 2010.- Vol. 1, N 57.

108. Degradation of survivin by the X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-XAFl complex / V. Arora, H.H. Cheung, S. Plenchette [et al] // J. Biol. Chem.- 2007.- Vol. 282, N 36.- P. 2620226209.

109. The phosphorylation of survivin Thr34 by p34cdc2 in carcinogenesis of oral submucous fibrosis / S. Zhou, L. Li, X. Jian [et al] // Oncol. Rep.- 2008.- Vol. 20, N 5,- P. 1085-1091.

110. Characterization of an anti-apoptotic glycoprotein encoded by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus which resembles a spliced variant of human survivin / H.W. Wang, T. V. Sharp, A. Koumi [et al] // EMBO J.-2002,-№ 21,-P. 2602-2615.

111. Zaffaroni, N. Survivin expression and resistance to anticancer treatments: perspectives for new therapeutic interventions / N. Zaffaroni, M.G. Daidone // Drug Resist. Updat.- 2002 - № 5,-P. 65-72.

112. Ryan, B.M. Survivin expression in breast cancer predicts clinical outcome and is associated with HER2, VEGF, urokinase plasminogen activator and PAI-1 / B.M. Ryan, G.E. Konecny, S. Kahlert//Ann. Oncol.-2006,-№ 17,-P. 597-604.

113. Expression of survivin in renal cell carcinomas: association with pathologic features and clinical outcome / S.S. Byun, W.G. Yeo, S.E. Lee, E. Lee // Urology.- 2007,- № 69.- P. 34-37.

114. Survivin expression in ovarian cancer and its correlation with clinico-pathological, surgical and apoptosis-related parameters / G. Ferrandina, F. Legge, E. Martinelli [et al] // Br. J. Cancer-2005,-№92,-P. 271-277.

115. Prognostic importance of survivin in breast cancer / S.M. Kennedy, L. O'Driscoll, R. Purcell [et al] // Br. J. Cancer.- 2003,- № 88,- P. 1077-1083.

116. Nuclear localization of survivin is a positive prognostic factor for survival in advanced non-small-cell lung cancer / B. Vischioni B., P. van der Valk, S.W. Span [et al] // Ann. Oncol.-2004,- № 15,-P. 1654-1660.

117. Nuclear and cytoplasmic expression of survivin in 67 surgically resected pancreatic cancer patients / G. Tonini, B. Vincenzi, D. Santini [et al] // Br. J. Cancer.- 2005,- № 92,- P. 22252232.

118. Expression of survivin and clinical correlation in patients with breast cancer / D.M. Sohn, S.Y. Kim, M.J. Baek [et al] // Biochem. Pharmacol.- 2006.- № 60,- P. 289-292.

119. Prognostic significance of survivin expression in diffuse large B-cell lymphomas / C. Adida, C. Haioun, P. Gaulard [et al] // Blood.- 2000,- № 96,- P. 1921-1925.

120. Survivin, a member of the inhibitors of apoptosis family, is down-regulated in breast carcinoma effusions / L. Kleinberg, V.A. Florenes, J.M. Nesland, B. Davidson // Am. J. Clin. Pathol.- 2007.- № 128,-P. 389-397.

121. Survivin expression in in situ and invasive breast cancer relates to COX-2 expression and DCIS recurrence / N. Barnes, P. Haywood, P. Flint [et al] // Br. J. Cancer.- 2006.- № 94,- P. 253-258.

122. Role of survivin, whose gene is mapped to 17q25, in human neuroblastoma and identification of a novel dominant-negative isoform, survivin-beta/2B / A. Islam, H. Kageyama, K. Hashizume [et al] // Med. Pediatr. Oncol.- 2000.- № 35.- P. 550-553.

123. Distinct in vivo expression patterns of survivin splice variants in renal cell carcinomas / C. Mahotka, T. Krieg, A. Krieg [et al] // Int. J. Cancer.- 2002,- № 100.- P. 30-36.

124. Expression level of wild-type survivin in gastric cancer is an independent predictor of survival / H. Meng, C.-D. Lu, D.-J Dai [et al] // World J. Gastroenterol.- 2004,- Vol. 10, N. 22-P. 3245-3250.

125. Expression of different survivin variants in gastric carcinomas: first clues to a role of survivin-2B in tumour progression / A. Krieg, C. Mahotka, T. Krieg [et al] // Br. J. Cancer-2002,-№86,-P. 737-743.

126. Do the survivin (BIRC5) splice variants modulate or add to the prognostic value of total survivin in breast cancer? / P.N. Span, V.C.G. Tjan-Heijen, J.J. Heuvel [et al] // Clin. Chem-2006,-Vol. 52, N9,-P. 1693-1700.

127. Elevated expression of survivin-splice variants predicts a poor outcome for soft-tissue sarcomas patients / H. Taubert, M. Kappler, M. Bâche [et al] // Oncogene - 2005 - № 24 - P. 5258-5261.

128. Expression of survivin and its splice variants in gastric cancer / Z. Cheng, L. Hu, W. Fu [et al] // J. Huazhong. Univ. Sci. Technol - 2007.- Vol. 27, N 4,- P. 393-398.

129. Identification of a novel splice variant of the human anti-apoptosis gene survivin / A. Badran, A. Yoshida, K. Ishikava [et al] // Biochem. Biophis. Res. Commun - 2004 - № 314 - P. 902-907.

130. Survivin gene-expression and splicing isoforms in oral squamous cell carcinoma / S. Maria, G. Pannone, P. Bufo [et al] // J. Cancer. Res. Clin. Oncol.- 2009.- № 135,- P. 107-116.

131. Survivin and its spliced isoform gene expression is associated with proliferation of renal cancer cells and clinical stage of renal cancer / K. Okamura, H. Koike, Y. Sekine [et al] // Cancer Epidemiol.- 2009.- № 33,- P. 137-141.

132. Gene expression of survivin and its spliced isoforms associated with proliferation and aggressive phenotypes of prostate cancer / H. Koike, Y. Sekine, M. Kamiya [et al] // Urology.-2008,-Vol. 72, N6,-P. 1229-1233.

133. Total Survivin and acetylated Survivin correlate with distinct molecular subtypes of breast cancer / E. Yakirevich, A. Samkari, M.P. Holloway [et al] // Hum. Pathol - 2012,- Vol. 43, N 6,- P. 865-73.

134. Пакет программ для анализа структур белков [Электронный ресурс]. URL: http://antheprot-pbil.ibcp.fr/ Дата обращения: 1.07.2008.

135. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей / Вольпина О.М., Титова М.А., Жмак М.Н. [и др.] // Биоорган, химия - 2002.- Т. 28, №5,-С. 387-395.

136. Каталог антител к сурвивину фирмы Abeam [Электронный ресурс]. URL: http://www.abcam.com/products?keywords=survivin&fReset=l&pt=l&source=TopSearch&btn Search=Search. Дата обращения: 5.10.2013.

137. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature.- 1970,- № 221.- P. 680-685.

138. Qualtiere, L.F. Effects of ionic and nonionic detergents on antigen-antibody reactions / L.F. Qualtiere, A.G. Anderson, P. Meyers // J. Immunol.- 1977,- Vol. 119, N 5.- P. 1645-1651.

139. Differential effect of proIGF-II and IGF-II on resveratrol induced cell death by regulating survivin cellular localization and mitochondrial depolarization in breast cancer cells / S.K. Singh,

D. Moretta, F. Almaguel [et al] // Growth Factors.- 2007.- Vol. 25, N 6,- P. 363-372.

140. Survivin-dependent angiogenesis in ischemic brain. Molecular mechanisms of hypoxia-induced up-regulation / E.M. Conway, F. Zwerts, V.V. Eygen [et al] // Am. J. Path - 2003.- Vol. 163, N3,-P. 935-946.

141. Антитела к синтетическим пептидам для выявления сурвивина в опухолевых тканях /

E. В. Ахидова, Т. Д. Волкова, Д. О. Короев [и др.] // Биоорган. Химия.- 2010.- Т. 36, № 2,-С. 178-186.

142. Получение аффинноочищенных антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка / Е.В. Ахидова, Т.Д. Волкова, Д.О. Короев [и др.] // Биоорг. Химия,- 2013,- Т. 39, № 3,- С. 326-337.

143. Chromosome passenger homepage [Электронный ресурс] URL: http://homepages.ed.ac.uk/rradams/passengers.html. Дата обращения 24.10.2013.

/

fne\