Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Вайшля, Наталья Аркадьевна

• Вайшля, Наталья Аркадьевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вайшля, Наталья Аркадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Апоптоз - запрограммированная клеточная смерть.

2.1.1 Молекулярные механизмы апоптоза.

Каспазы.

Семейство белков Bcl-2.

2.1.2 Внешний путь развития апоптоза.

2.1.3 Внутренний (митохондриальный) путь развития апоптоза.

2.2. Ингибиторы апоптоза.

2.3. Сурвивин.

2.3.1 Структура сурвивина.

2.3.2 Экспрессия гена BIRC5.

2.3.3 Биологические активности сурвивина.

Ингибирование апоптоза.

Роль сурвивина в митотическом делении клетки.

Влияние сурвивина на ангиогенез.

2.4. PML - (promyelocytic leukemia gene - ген промиелоцитарной лейкемии).

2.4.1 Структура гена PML и классификация изоформ мРНК.

2.4.2 Доменная структура белка PML, характеристика его изоформ и компартментализации в клетке.

2.4.3 Экспрессия гена PML.

2.4.4 Биологические активности PML.

PML —регулятор экспрессии генов.

Супрессия клеточного роста и проапоптотическая активность PML.

Противовирусная активность PML.

2.5. SMAC/DIABLO (Second Mitohondria-derived Activator of Caspases).

2.5.1 Структура SMAC/DIABLO.

2.5.2 Экспрессия гена SMAC/DIABLO.

2.5.3 Проапоптотическая активность SMAC/DIABLO.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML»

4.2. Анализ экспрессии гена BIRC5 и генов его ингибиторов SMAC и PML.58

Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях человека при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода.58

Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека.66

4.2. Создание экспрессионных генно-инженерных конструкций, содержащих гены SMAC и PML.69

4.3. Получение клеточных линий А549, HeLa, Calul и NCI-H358, стабильно экспрессирующих SMAC и PML.72

4.4. Анализ эффекта экспрессии гена PML в условиях транзиентной трансфекции клеток линий HeLa, А549 и НТ1080 плазмидой pEGFP-N1-PML1 75

4.5. Анализ влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента PML1 на активность промотора гена BIRC5.78

4.6 Анализ чувствительности к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358.80

4.7 Анализ влияния стабильной экспрессии гена SMAC на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, HeLa, Calu-1 и NCI-H358.82

4.8. Заключение.84

5. ВЫВОДЫ .86

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.87

БЛАГОДАРНОСТИ. 100

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ п.н. - пар нуклеотидов ед. — единица об/мин — оборотов в минуту ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК-аза I - дезоксирибонуклеаза I

BIR - baculoviruses inhibitor of apoptosis repeat domains, повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза

BIRC5 - baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin), белок, содержащий повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза PML — promyelocyte leukaemia, ген промиелоцитарной лейкемии

SMAC/DIABLO - second mitohondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pi, второй митохондриальный активатор каспаз/связывающийся с ингибиторами апоптоза белок с низким значением изоэлектрической точки

IAP — inhibitors of apoptosis proteins, белки ингибиторы апоптоза

XIAP - X-linked inhibitor of apoptosis, ассоциированный с X хромосомой ингибитор апоптоза

RING — Really Interesting New Gene

RAR-a — receptor a-retinoic acid, рецептор а-ретиноевой кислоты PML-NB - PML nuclear body, PML ядерное тельце CARD — caspase recruitment domain, домен рекрутирующий каспазы RBCC/TRIM - RING-B-Coiled-Coil/TRIpartite Motif

МНС I - major histocompatibility complex I, главный комплекс гистосовместимости I

HDAC — гистондеацетилаза

ОПЛ — острый промиелоцитарный лейкоз

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа

GFP — green fluorescence protein, зелёный флуоресцентный белок

NF-kB - nuclear factor kappa-B, ядерный фактор к В

NLS - nuclear localisation signal, сигнал ядерной локализации

NES - nuclear export signal, сигнал ядерного экспорта

Taq ДНК-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus

ДТТ — дитиотриэтол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота кДНК - кодирующая ДНК мРНК - матричная РНК рРНК - рибосомная РНК кДа - килоДальтон

ОТ - обратная транскрипция

ПААГ - полиакриламидный гель

ТЕМЕД - тетраэтиленметилендиамин

X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-Б-галактопиранозид

ЭДТА — этилендиаминтетраацетат

SV40 - simian virus 40, обезьяний вирус 40

BRUCE - BIR Repeat Containing Ubiquitin-conjugating Enzyme, коньюгированный с убиквитином белок, содержащий BIR-домен c-IAP - cellular inhibitor of apoptosis protein 1, клеточный ингибитор апоптоза NAIP - Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein, нейрональный белок, ингибирующий апоптоз

TNF - tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли

VEGF - vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфаты

HMPJI — немелкоклеточный рак легкого

АК - аденокарцинома

ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ПРП - плоскоклеточный рак пищевода

IgG - иммуноглобулин G

INF - интерферон

ISRE - INF-a и —/З-stimulated response element GAS - INF-^-activation site DISC - death-inducing signalling complex PARP - поли-АДФ-рибоза-полимераза

1. ВВЕДЕНИЕ

Выявление генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, может значительно облегчить раннюю диагностику и создание новых лекарственных противоопухолевых препаратов. Нарушение путей передачи апоптотического сигнала и реализации апоптоза играет ключевую роль в онкогенезе. Особый интерес в последние годы вызывают белки, вовлеченные в апоптоз, которые могут быть использованы как маркеры опухолевых процессов и/или как потенциальные мишени для различных терапевтических агентов. Одним из наиболее интересных с этой точки зрения является сурвивин (BIRC-5), относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза (IAP, Inhibitor of Apoptosis Protein) [1]. Помимо ингибирования апоптоза сурвивин участвует в других клеточных процессах, в частности, в митотическом делении клетки и процессе ангиогенеза.

Ген BIRC5 экспрессируется в процессе эмбрионального развития, но его мРНК и белок не детектируются в конечно дифференцированных нормальных тканях взрослого организма. Тем не менее, его повышенная экспрессия наблюдается в трансформированных клетках и практически во всех типах злокачественных опухолей [1].

Уровень сурвивина в клетках регулируется активностью ряда генов. Одним из природных ингибиторов сурвивина является белок SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). SMAC - митохондриальный белок, который выходит в цитозоль во время апоптоза и обеспечивает активацию каспаз за счёт связывания с белками семейства IAP, предотвращая тем самым их ингибирующее действие по отношению к каспазам [2].

Другим известным природным ингибитором сурвивина является белок PML (Promyelocytic Leukemia) [3]. PML - многофункциональный белок, представленный двенадцатью изоформами и участвующий в процессах регуляции транскрипции и трансляции, удлинении теломер, репарации ДНК, а также регуляции клеточной смерти. Потеря гетерозиготности по гену PML или мутации в этом гене присутствуют при многих типах рака различной гистологии, что часто ассоциировано с прогрессией опухоли и неблагоприятным прогнозом [4]. Один из механизмов включения апоптоза с участием PML связан с подавлением активности промотора гена BIRC5. Такая функциональная активность показана только для изоформы PML6, относительно подобной активности других изоформ данные отсутствуют [3].

Таким образом, на основании литературных данных можно сделать вывод о том, что белки PML и SMAC могут быть использованы в противоопухолевой терапии для ингибирования сурвивина, ключевого белка в регуляции апоптоза. Однако, несмотря на значительное количество работ, посвященных исследованию функций этих генов, ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, данные по экспрессии генов SMAC и PML при опухолеобразовании противоречивы, а возможность корреляции повышенной экспрессии BIRC5 в опухолевой ткани с экспрессией генов его ингибиторов SMAC и PML вообще не исследовали. Терапевтический противопухолевый эффект белка SMAC, в том числе его влияние на активность белка сурвивина, в большинстве работ наблюдали при непосредственной обработке клеток препаратом белка [5-7], и лишь в нескольких работах проводили исследование возможности использования генно-инженерных экспрессионных терапевтических конструкций, содержащих кДНК SMAC [8, 9]. Способность подавлять активность промотора BIRC5 и уменьшать количество эндогенного сурвивина в опухолевых клетках была изучена лишь в двух работах и показана только для одной изоформы PML, PML6 [3, 10].

Настоящая работа состоит из двух частей. В первой части проведено исследование экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях пациентов с диагнозами пемелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода, а также в опухолевых клеточных линиях человека. Было определено, что увеличение экспрессии гена BIRC5 в опухолевых тканях по сравнению с нормальными не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML. Во второй части изучали влияние стабильной и транзиентной экспрессии SMAC и PML1 (наиболее представленной изоформы PML в клетке) на клетки опухолевых клеточных культур человека. Было показано, что стабильная экспрессия SMAC не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358. Транзиентная и стабильная экспрессия последовательности кДНК PML, кодирующей С-концевой фрагмент белка PML1, в опухолевых клетках человека вызывает выраженный апоптотический эффект. Цель работы

Целью данной работы было выявление корреляций между экспрессией сурвивина и его ингибиторов на уровне РНК и белка в нормальных и опухолевых тканях пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода и оценка терапевтического потенциала природных ингибиторов сурвивина SMAC и PML в генной терапии злокачественных опухолей.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Онкологические заболевания являются одной из важнейших причин смертности в мире и их число с каждым годом растет. Нарушение процесса программируемой клеточной гибели, или апоптоза, играет ключевую роль в прогрессии злокачественных опухолей. Процесс апоптоза контролируется большим числом индукторов и ингибиторов [11]. Семейство белков-ингибиторов апоптоза IAPs (Inhibitors of apoptosis proteins) включает в себя белки различного происхождения, способные ингибировать процесс апоптоза путём снижения активности каспаз [12]. Сурвивин (BIRC5) - уникальный белок семейства IAP, который участвует в трёх клеточных процессах (ангиогенез, клеточное деление и процесс апоптоза) и экспрессируется на повышенном уровне практически при всех типах рака [1]. SMAC и PML - природные ингибиторы сурвивина [2, 3], которые могут быть использованы для подавления сурвивина в опухолевых клетках.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Вайшля, Наталья Аркадьевна

5. ВЫВОДЫ

1. При немелкоклеточном раке легкого человека экспрессия гена BIRC5 повышена в опухолевых тканях по сравнению с прилегающими к опухолям тканями и в здоровых легких не детектируется.

2. При плоскоклеточном раке пищевода человека повышенная экспрессия BIRC5 в большинстве случаев наблюдается как в опухолевых, так и в прилегающих к опухоли тканях, но не в нормальных тканях пищевода.

3. Полученные результаты в сочетании с литературными данными позволяют рассматривать экспрессию гена BIRC5 как диагностический маркер при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода человека.

4. Продемонстрировано, что экспрессия генов природных ингибиторов сурвивина, SMAC и PML, одинакова в нормальных и опухолевых тканях легкого и пищевода. Увеличение экспрессии гена BIRC5 при опухолеобразовании в легком и пищеводе не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML.

5. Стабильная гетерологичная экспрессия SMAC приводит к компенсаторному увеличению количества эндогенного сурвивина и не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358 к противоопухолевому препарату цисплатину.

6. Показано, что С-концевой фрагмент белка PML1 обладает проапоптотической активностью. Интенсивность индукции апоптоза в клеточных линиях в условиях транзиентной трансфекции зависит от статуса р53 и минимальна в клетках с функционально дефектным белком р53. С-концевой фрагмент белка PML1, в отличие от С-копцевого фрагмента PML6, не влияет на активность опухолеспецифического промотора гена BIRC5 человека. Таким образом, С-концевой фрагмент PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении опухолей с функционально активным белком р53.

4.8. Заключение

Полученные в данной работе результаты позволяют утверждать, что ген BIRC5 является надежным маркером при опухолеобразовании у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и плоско клеточным раком пищевода, в то время как гены SMAC и PML не могут быть использованы в качестве диагностических маркеров опухолеобразования. PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении злокачественных опухолей с функционально активным р53, и, в отличие от PML6, его проапототическое действие не связано с подавлением активности промотора гена BIRC5. SMAC не является перспективным агентом в противоопухолевой терапии, по крайней мере для опухолей легкого, поскольку его повышенная экспрессия в раковых клеточных культурах легочного происхождения приводит к компенсаторному увеличению содержания эндогенного сурвивина, который является ингибитором апоптоза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Вайшля, Наталья Аркадьевна, 2009 год

1. Altieri DC. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery. Nat Rev Cancer 2008,8:61-70.

2. Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 2000,102:33-42.

3. Xu ZX, Zhao RX, Ding T, Tran TT, Zhang W, Pandolfi PP, Chang KS. Promyelocytic leukemia protein 4 induces apoptosis by inhibition of survivin expression. J Biol Chem 2004,279:1838-1844.

4. Salomoni P, Ferguson BJ, Wyllie AH, Rich T. New insights into the role of PML in tumour suppression. Cell Res 2008,18:622-640.

5. Arnt CR, Chiorean MV, Heldebrant MP, Gores GJ, Kaufmann SH. Synthetic Smac/DIABLO peptides enhance the effects of chemotherapeutic agents by binding XIAP and cIAPl in situ. J Biol Chem 2002,277:44236-44243.

6. Petrucci E, Pasquini L, Petronelli A, Saulle E, Mariani G, Riccioni R, et al. A small molecule Smac mimic potentiates TRAIL-mediated cell death of ovarian cancer cells. Gynecol Oncol 2007,105:481-492.

7. Mao HL, Liu PS, Zheng JF, Zhang PH, Zhou LG, Xin G, Liu C. Transfection of Smac/DIABLO sensitizes drug-resistant tumor cells to TRAIL or paclitaxel-induced apoptosis in vitro. Pharmacol Res 2007,56:483-492.

8. McNeish IA, Lopes R, Bell SJ, McKay TR, Fernandez M, Lockley M, et al. Survivin interacts with Smac/DIABLO in ovarian carcinoma cells but is redundant in Smac-mediated apoptosis. Exp Cell Res 2005,302:69-82.

9. Li L, He D, He H, Wang X, Zhang L, Luo Y, Nan X. Overexpression of PML induced apoptosis in bladder cancer cell by caspase dependent pathway. Cancer Lett 2006,236:259-268.

10. Zimmermann КС, Bonzon C, Green DR. The machinery of programmed cell death. Pharmacol Ther 2001,92:57-70.1213,14,15,16,17,18,19,20,21.22,23,24.25,26.

11. Schimmer AD. Inhibitor of apoptosis proteins: translating basic knowledge into clinical practice. Cancer Res 2004,64:7183-7190.

12. В.Д. Самуилов A.B. Олескин, E.M. Лагунова. Программируемая клеточная смерть. Биохимия 2000,65:1029-1046.

13. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972,26:239-257.

14. Wyllie AH, Kerr JF, Currie AR. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol1980,68:251-306.

15. Cohen GM, Sun XM, Fearnhead H, MacFarlane M, Brown DG, Snowden RT, Dinsdale D. Formation of large molecular weight fragments of DNA is a key committed step of apoptosis in thymocytes. J Immunol 1994,153:507-516.

16. Fischer U, Janicke RU, Schulze-Osthoff K. Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates. Cell Death Differ 2003,10:76-100.

17. Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci 1997,22:299-306.

18. Stennicke HR, Salvesen GS. Properties of the caspases. Biochim Biophys Acta 1998,1387:17-31.

19. Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN. Apoptosis: mechanisms and relevancein cancer. Ann Hematol 2005,84:627-639.

20. Wajant II. Death receptors. Essays Biochem 2003,39:53-71.

21. Ashkenazi A, Dixit VM. Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr Opin Cell Biol 1999,11:255-260.

22. Peter ME, Krammer PH. The CD95(APO-l/Fas) DISC and beyond. Cell Death Differ 2003,10:26-35.

23. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, Friesen C, Li F, Tomaselli KJ, et al. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. Embo J 1998,17:1675-1687.27