Исследование механизма цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Шелудченков, Антон Александрович

• Шелудченков, Антон Александрович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Шелудченков, Антон Александрович

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Пути клеточной смерти

1.1.1. Апоптоз

1.1.2. Некроз: нерегулируемый и программируемый

1.1.3. Лутофаговая клеточная смерть

1.1.4. Другие типы клеточной смерти

1.1.5. Участие лизосом в механизмах клеточной смерти

1.2. Основные лиганды и рецепторы запуска запрограммированной клеточной смерти

1.2.1. Общие сведения о лигандах и рецепторах клеточной смерти

1.2.2. Общие сигнальные процессы, запускаемые рецепторами смерти

L2.3. Рецептор TNF-R1 и его лиганд TNF-a

1.2.4. Рецептор Fas и его лиганд FasL

1.2.5. Рецепторы TRAIL-R и лиганд TRAIL

1.3. Белок Tag7 как представитель семейства PGLYRP

1.4. Цитотоксический белковый комплекс Tag7-Hsp70

1.5. Белок-шаперон Hsp70

1.6. Белок HspBPl - кошаперон Hsp70

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Влияние белка HspBPl на цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-Hsp70

2.2. Исследование механизмов цитотоксических процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70

2.3. Выявление рецептора на поверхности клеток L-929, способного взаимодействовать с комплексом Tag7-Hsp70

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Белки, ферменты и реактивы

3.2. Получение и очистка белков

3.3. Получение белковых комплексов,

3.5. Мечение биотином

3.6. Культивирование клеточных линий, использованных в работе

3.7. Получение отдельных клонов клеток L-929

3.8. Аффинная хроматография

3.9. Элетрофорез и вестерн-блоттинг

3.11. Иммуноферментный анализ (ИФА)

3.12. Выделение мембранного рецептора

3.13. Определение цитотоксической активности

3.14. Микроскопия

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Список сокращений

CAD - каспазо-активируемая ДНКаза (caspase activated DNAse) DISC - индуцирующий смерть сигнальный комплекс (death-inducing signaling complex)

FADD - Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (Fas-associated protein

with death domain)

HLA - человеческий лейкоцитарный антиген (human leucocyte antigen)

Hsp70/HSP70-lA - белок теплового шока молекулярной массой 70 кДа (heat

shock protein 70 kDa)

HspBPl - Н8р70-связывающий белок 1 (Hsp70 binding protein 1)

ICAD - ингибитор каспазо-активируемой ДНКазы (inhibitor of caspase activated DNAse)

JNKs - c-Jun-N-терминальные киназы (c-Jun N-terminal kinases) LMP - пермеабилизация лизосомальной мембраны (lysosomal membrane permeabilization)

MOMP - пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны (mitochondrial outer membrane permeabilization)

NCCD - Комитет по номенклатуре клеточной смерти (Nomenclature Committee

on Cell Death)

NEF - фактор обмена нуклеотидов (nucleotide-exchange factor) PARP - поли(АДФ-рибоза)-полимераза (poly(ADP-ribose) polymerase) PGRP/PGLYRP - пептидогликан распознающий белок (peptidoglycan recognition protein)

SDS - додецил сульфата натрия (sodium dodecil sulfate)

TRADD - TNFR-ассоциированный белок с доменом смерти (TNFR-associated death domain protein)

TNF - фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor)

TNFR - рецептор к фактору некроза опухоли (tumor necrosis factor receptor) TRAIL - апоптоз-индуцирующий лиганд семейства TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand)

TRAILR - рецептор к апоптоз-индуцирующему лиганду семейства TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor)

TUNEL - терминальное TdT-опосредованное мечение концов ДНК (terminal

deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin nick end labeling)

XIAP - связанный с Х-хромосомой белок-ингибитор апоптоза (X-linked inhibitor of apoptosis protein)

JIAK - лимфокин-активированные киллерные клетки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки»

Введение

Баланс между клеточным делением и клеточной смертью играет важную роль в процессе развития и гомеостаза многоклеточных организмов. При этом нарушения в любом из этих процессов могут иметь патологические последствия для организма, вызывая нарушения эмбриогенеза, нейродегенеративные заболевания или же возникновение и развитие опухолей. Именно поэтому критически важную роль играют механизмы регуляции клеточного цикла и, в частности, механизмы запуска программы клеточной смерти. В настоящее время вызывает несомненный интерес исследование регуляции процессов, запускаемых под действием цитотоксических белков в клетках. Охарактеризовано множество цитотоксических белковых факторов, секретируемых клетками иммунной системы и способных запускать программу клеточной смерти, взаимодействуя с рецептором на поверхности клетки. В число этих факторов входят TNF-a, FasL, TRAIL и другие. Описаны случаи, когда стимуляция одного и того же рецептора может, в зависимости от физиологического состояния клетки, приводить к запуску двух альтернативных программ клеточной смерти: апоптоза и некроптоза. Такая ситуация, в частности, имеет место для рецептора TNFR1: стимуляция лигандом TNF-a может приводить как к запуску апоптоза, так и некроптоза. При этом продолжают обнаруживаться всё новые цитотоксические факторы, а также новые регуляторные белки. Регуляция механизма цитотоксического действия важна для предотвращения неконтролируемого уничтожения клеток, при этом белки-регуляторы могут проявлять функциональную активность, конкурентно связываясь с цитотоксическим фактором или с рецептором, препятствуя запуску цитотоксического сигнала.

В лаборатории «Молекулярной иммуногенетики рака» было показано, что Tag7/PGLYRP1, представляющий собой пептидогликан-распознающий белок, и главный белок теплового шока, шаперон Hsp70/Hsp70-1A, способны взаимодействовать с формированием устойчивого белкового комплекса Tag7-Hsp70 - нового цитотоксического агента, проявляющего активность в отношении опухолевых клеток различных линий. Было также показано, что этот же самый

комплекс способны секретировать лимфокин-активированные киллерные клетки CD8+-nina, культивируемые в отсутствии клеток-мишеней. Кроме того, было установлено, что в роли белков-регуляторов цитотоксического действия Tag7-Hsp70 могут выступать Са2+-связывающий белок метастазин-1 (Mtsl/S100A4), способный взаимодействовать как с Tag7, так и с Hsp70, препятствуя формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70, а также ингибитор АТФазной активности Hsp70, его кошаперон HspBPl. При этом оставались невыясненными механизмы запуска цитотоксических процессов в клетках-мишенях под действием Tag7-Hsp70, а также механизмы самих процессов. Исследование механизма действия новых цитотоксических агентов, как и поиск новых белков-регуляторов их активности, представляют значительный интерес как для фундаментальных, так и для прикладных исследований.

Цель настоящей работы состояла в расширении представления о механизмах регуляции цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 и выяснении механизмов цитотоксических процессов, запускаемых под действием Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1) изучить взаимодействие внеклеточного HspBPl с Tag7 в кондиционной среде опухолевых клеток линии CSML-0 и в сыворотке крови человека;

2) охарактеризовать цитотоксические процессы, индуцируемые комплексом Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках;

3) выявить рецептор на поверхности опухолевых клеток, участвующий в индукции цитотоксических процессов под действием Tag7-Hsp70.

1. Обзор литературы

1.1. Пути клеточной смерти

Одна из первых попыток дать классификацию клеточной смерти была предпринята в 1973 году: на основе данных, полученных при обработке крысиных эмбрионов токсинами, было описано 3 типа клеточной смерти: тип I, ассоциированный с гетерофагией; тип II, ассоциированный с аутофагией, и тип III, который не был ассоциирован с перевариванием продуктов клеточной деградации (Schweichel and Merker, 1973). В современной терминологии эти типы клеточной смерти соответствуют апоптозу, аутофагии и некрозу. Помимо этих трёх, ставших классическими, типов клеточной смерти в настоящее время охарактеризовано также много других. Более подробно каждый из трёх этих типов, а также некоторые другие типы клеточной смерти рассмотрены ниже.

1.1.1. Апоптоз

Апоптоз (от греч. «ало» - отделение и «ятюац» - падение) - это процесс запрограммированного уничтожения клетки, вызванный внутренними или внешними физиологическими и патологическими факторами, активирующими генетическую программу гибели клетки и ее удаления из ткани. Термин «апоптоз» происходит от греческого слова «атгоятозстц», обозначающего «опадение лепестков цветка» и «опадение листвы с дерева осенью». Действительно, в процессе старения в листьях растений обнаруживается фрагментация ДНК, характерная для апоптоза, которая не обнаруживается в зелёных листьях (Cheng-Hung and Chang-Hsien, 1998). Характерными признаками апоптотической клетки являются изменения морфологии ядра, включающие конденсацию ядерного хроматина (кариопикноз) и его фрагментацию (кариорексис), межнуклеосомальные разрывы ДНК, сморщивание и пузырчатая морфология плазматической мембраны, уменьшение клетки в объёме и её последующая фрагментация на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым, так называемые апоптотические тельца, фагоцитируемые макрофагами и клетками-соседями, в которых они утилизируются при участии

лизосом. Характерным признаком апоптотической клетки является также транслокация остатков фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю сторону плазматической мембраны, что служит сигналом для привлечения фагоцитов. Макрофаги выделяют особый гликопротеин MFG-E8, который специфически связывается с фосфатидилсерином на поверхности апоптотических клеток, служа меткой для узнавания и фагоцитоза макрофагами этих клеток (Hanayama et al., 2002). Весь процесс от инициации апоптоза до элиминации апоптотических клеток обладает высокой кинетикой и протекает в течение 1-3 ч (Gavrieli et al., 1992).

Апоптоз наблюдается у всех эукариот, начиная от одноклеточных простейших и вплоть до высших организмов. Одной из основных функций апоптоза является уничтожение дефектных (повреждённых, мутантных, инфицированных) клеток. На основе генетического анализа, проведённого для нематоды Caenorhabditis elegans, была также установлена ключевая роль апоптоза в регуляции клеточной смерти в процессе развития и гомеостаза многоклеточных организмов (Ellis and Horvitz, 1986; Metzstein et al., 1998). Апоптоз играет также важную роль в обеспечении развития и функционирования иммунной системы. В клетках позвоночных апоптоз обычно протекает по одному из двух сигнальных каскадов, один из которых запускается при стимуляции рецепторов клеточной поверхности (рецепторный путь), а другой запускается внутриклеточно, при участии митохондрии (митохондриальный путь). В обоих случаях в осуществлении программы апоптоза ключевую роль играют каспазы (за исключением случаев каспазо-независимого апоптоза, которые также рассмотрены ниже).

Каспазы (семейство Cys-Asp-протеаз) принадлежат семейству эволюционно консервативных протеаз - ферментов, катализирующих ограниченное расщепление клеточных белков. Слово каспаза произошло от англ. caspase, где буква с соответствует цистеину (cysteine), корень asp - аспартату (aspartate), ase -суффиксу в названиях ферментов. В активном центре каспаз находится остаток цистеина, при этом каспазы узнают тетрапептидные мотивы белков вида Х-Х-Х-Asp (X соответствует произвольной аминокислоте) и расщепляют пептидную

связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты, отщепляя тетрапептидные мотивы. В настоящее время насчитывают не менее 15 видов каспаз, пронумерованных в порядке их открытия (Eckhart et al., 2005). Из них в человеческом организме экспрессируются каспазы 1-10, 12 и 14, причём каспаза 12 в большинстве человеческих популяций экспрессируется в нефункциональной укороченной форме (Saleh et al., 2004). В апоптозе, индуцированном цитотоксическим фактором гранзимом В или лигандами TNF-a, FasL или TRAIL, принадлежащими семейству TNF (фактора некроза опухоли), участвуют каспазы 2, 3 и 6-10. Остальные каспазы выполняют иные функции, не связанные с запуском клеточной смерти: каспазы 1, 4 и 5 принимают участие в активации противовоспалительных цитокинов (Martinon and Tschopp, 2004), а прокаспаза 14 активируется при созревании кератиноцитов эпидермиса (Lippens et al., 2000; Eckhart et al., 2000).

Каспазы, принимающие участие в осуществлении программы апоптоза, подразделяют на две группы: инициаторные (каспазы 2, 8, 9 и 10) и эффекторные (каспазы 3, 6 и 7). Инициаторные каспазы присутствуют в клетке в форме неактивных проферментов - прокаспаз (32-56 кДа), представляющих собой мономеры, состоящие из N-концевого продомена, большой (17-21 кДа) и малой (10-13 кДа) субъединиц и коротких связующих областей (Earnshaw et al., 1999). При активации инициаторных каспаз происходит димеризация мономерных прокаспаз, после чего N-концевой продомен и связующие области в составе каждого из мономеров расщепляются, при этом большая и малая субъединицы формируют гетеродимеры (Рис. 1) (Liang and Fesik, 1997). Активная каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух таких гетеродимеров (Kohler et al., 2002). Этот тетрамер структурно состоит из центральной части, сформированной двенадцатью ß-листами, которую окружают а-спирали (MacKenzie and Clark, 2012). На примере инициаторных каспазы 8 и каспазы 9 показано, что димеризация прокаспаз является ключевым событием в их активации, после которого происходит ограниченный протеолиз, способствующий стабилизации димеров (Boatright et al., 2003). В случае каспазы-

и

9 ограниченный протеолиз выполняет скорее регуляторную, чем активирующую, роль в каспазной активности (Malladi et al., 2009). Субстратная специфичность инициаторных каспаз ограничивается инициаторными, эффекторными каспазами, а также проапоптотическим белком Bid.

Механизм активации эффекторных каспаз отличается от механизма активации инициаторных каспаз. Эффекторные каспазы 3, 6 и 7 присутствуют в клетке в форме стабильных, но неактивных димеров. Эти димерные прокаспазы не обладают активностью, поскольку активные сайты находятся в таком расположении относительно друг друга, которое препятствует эффективному катализу. В результате протеолитической активации происходит расщепление м ежсу бъ един ич но го линкера, что позволяет активным сайтам перестроиться, приняв расположение, обеспечивающее ферментативную активность (MacKenzie and Clark, 2012). Активация эффекторных каспаз в клетке приводит к расщеплению множества белков, необходимых для поддержания жизнеспособности клетки. При этом каспаза-3 вызывает активацию ДНКазы CAD за счёт протеолитической деградации её специфичного ингибитора ICAD. CAD присутствует в клетке в виде комплекса CAD-ICAD. В результате расщепления ICAD ДНКаза CAD выходит из неактивного комплекса CAD-ICAD и вызывает межнуклеосомальное расщепление ядерной ДНК на короткие фрагменты (Enari et al., 1998). Число нуклеотидов в этих фрагментах кратно числу нуклеотидов, соответствующему одной нуклеосоме.

Как уже отмечалось выше, каспазы расщепляют по остатку Asp, узнавая тетрапептидный мотив X-X-X-Asp с аспарагиновой кислотой в положении Pl. По субстратной специфичности каспазы можно разделить на 3 группы, при этом для каждой из групп характерны определённые аминокислоты в положении Р4 узнаваемого тетрапептидного мотива: для группы I, включающей провоспалительные каспазы (1, 4, 5, 11, 12), предпочтение отдаётся крупным ароматическим аминокислотным остаткам; для группы II, включающей эффекторные каспазы 3 и 7, а также каспазу 2, критически важен аминокислотный остаток Asp в положении Р4; для группы III, включающей инициаторные каспазы

8, 9 и 10 и каспазу 6, предпочтительны аминокислотные остатки с большими алифатическими боковыми цепями (Thornberry et al., 1997; Rozman-Pungercar et al., 2003).

Были также установлены наиболее характерные тетрапептидные мотивы, узнаваемые каспазами различных трупп: каспазы 1, 4, 5 и 14 лучше всего распознают тетрапептидный аминокислотный мотив Trp-Glu-His-Asp; каспазы 2, 3 и 7 - мотив Asp-Glu-X-Asp; каспазы 6, 8, 9 и 10 наиболее специфичны в отношении мотива (Leu/Val)-Glu-X-Asp (Thornberry et al., 1997; MacKenzie and Clark, 2012). Таким образом, обеспечивается специфичность каспаз в отношении узнаваемых и расщепляемых субстратов.

Инициаторные каспазы

Большая Малая

Про домен

субьединица субъединица

1 it J—I Каспаза 2,

'Л ^Wffi^^T^fc

} каспаза 8 и каспаза 9

Активация каспазы 8

Эффекторные каспазы

Большая Малая

субъединица субъединица

I---1 1 J--Каспаза 3,

ч (* о

каспаза 6 и каспаза 7

Активация эффекторной каспазы

Активная инициаторная ! каспаза

г>

г)

qy

Неактивный Димеризация и Активная

мономер межцепочечное каспаза 8

расщепление (гетеродимер)

Неактивный димер

у

Активный димер

Рис. 1. Классификация, строение и процесс активации каспаз двух типов: инициаторной и эффекторной. Рисунок адаптирован из статьи (Tait and Green, 2010).

Детекцию апоптотических клеток часто определяют по деградации ДНК на фрагменты, размеры которых кратны размеру ДНК, приходящемуся на одну нуклеосому. Фрагменты ДНК обнаруживаются на электрофорезе в виде характерной «лесенки». Для детекции апоптоза in situ широко используется TUNEL-метод, позволяющий детектировать апоптоз на уровне одной клетки,

сохраняя неповреждённой её архитектуру (Gavrieli et al., 1992). Этот метод основан на способности фермента терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (TdT) связываться со свободным З'-ОН концом ДНК, катализируя реакцию присоединения дезоксинуклеозид-трифосфатов с образованием цепочки ДНК с экспонированными З'-гидроксильными концами. В качестве субстрата может выступать как одноцепочечная, так и двуцепочечная цепь ДНК. Использование дезоксиуридин-трифосфата (dUTP), меченного биотином, одновременно с TdT позволяет детектировать фрагменты ДНК с экспонированным З'-ОН, используя окраску конъюгатом авидина (или стрептавидина) с пероксидазой. Альтернативным вариантом является использование dUTP, конъюгированного с флуоресцентной меткой, с последующей детекцией при помощи световой микроскопии. Для устранения влияния конденсации хроматина, белкового окружения на доступ TdT к ДНК и с целью повышения чувствительности метода TUNEL проводится предварительная обработка образца ДНК детергентами, протеазами или воздействием микроволн (Negoescu et al., 1996; Negoescu et al., 1998).

На детекции фосфатидилсерина, экспонированного на поверхности апоптотических клеток, основан метод по подсчёту количества апоптотических клеток при помощи проточной цитометрии с использованием конъюгата аннексии

V-FITC в качестве детектирующего агента (Vermes et al., 1995). Аннексии V

11

представляет собой Са -зависимый фосфолипид-связывающий белок, обладающий высокой аффинностью к фосфатидилсеринам и очень низкой - к другим фосфолипидам: фосфатидилэтаноламину, сфингомиелину и фосфатидилхолину. Поскольку фосфатидилсерин экспонируется на внешней стороне мембраны как при апоптозе, так и при некрозе, используется комбинированное окрашивание конъюгатом аннексии V-FITC и пропидиум иодидом: в результате живые клетки оказываются неокрашенными, апоптотические окрашиваются только аннексином V-FITC, а некротические, целостность мембран которых нарушена - и аннексином V-FITC, и пропидиум иодидом (Vermes etal., 1995).

Исследования на клетках прокариот обнаружили, что при адаптации к стрессорным условиям в них протекают процессы, схожие с апоптозом в эукариотах: фрагментация ДНК, уменьшение объёма клетки, протеолиз и синтез новых белков, а также накопление АФК (Hochman, 1997). Кроме того, у бактерии iStreptomyces spp. были обнаружены гомологи каспаз, ключевых протеаз, участвующих в осуществлении апоптоза, однако их роль в осуществлении запрограммированной клеточной смерти в прокариотах до конца не установлена (Гордеева и др., 2004).

Как уже отмечалось выше, апоптоз может запускаться по одному из двух сигнальных путей: рецепторному или митохондриальному. Остановимся подробнее на каждом из них.

Апоптоз, запускаемый через активацию рецепторов клеточной поверхности.

Клеточная смерть по механизму апоптоза может запускаться при стимуляции рецептора клеточной поверхности. В случае запуска через рецептор апоптоз всегда протекает при участии каспаз, при этом известны 3 ключевых сигнальных пути:

1) стимуляция рецептора смерти (death receptor) приводит к активации инициаторной каспазы-8 (или, в некоторых случаях, каспазы-10), которая непосредственно активирует эффекторную каспазу 3, участвующую в каскаде реакций апоптоза;

2) стимуляция рецептора смерти приводит к активации инициаторной каспазы-8 (или каспазы-10), которая путём протеолиза активирует белок BID, вызывающий проницаемость митохондриальной мембраны, выход цитохрома С и формирование апоптосомы, вызывающей активацию инициаторной каспазы 9, активирующей эффекторную каспазу 3;

3) стимуляция рецептора зависимости (dependence receptor), вызванная снижением концентрации его лигандов, приводит к активации каспазы 9 (либо напрямую, либо вызывая пермеабилизацию внешней митохондриальной мембраны), активирующей каспазу 3 (Galluzzi et al., 2012).

В первых двух случаях рецепторного пути сигнал к апоптозу передаётся в клетку за счёт связывания лигандов, таких как FasL/CD95L, TNFa, TRAIL/TNFSF10, с соответствующими рецепторами смерти на поверхности клетки: Fas/CD95, TNFR1, TRAILR1-2, соответственно. Лигирование рецептора смерти привлекает особые адапторные молекулы, которые способны связываться с инициаторной каспазой-8, приводя к её димеризации и активации (Guicciardi and Gores, 2009). Активированная каспаза-8 способна активировать эффекторные каспазы, каспазу-3 и каспазу-7. При этом в так называемых клетках I типа (например, лимфоцитах) активации эффекторных каспаз за счёт каспазы-8 уже достаточно для запуска апоптоза, который протекает без участия митохондрии (Barnhart et al., 2003; Scaffidi et al., 1998). В клетках же II типа (например, гепатоцитах печени и ^-клетках поджелудочной железы) проницаемость митохондриальной мембраны является ключевым событием для осуществления сигнального пути апоптоза, запущенного лигированием рецептора смерти: активированная каспаза-8 вызывает активацию путём ограниченного протеолиза белка BID, который в форме tBID вызывает проницаемость митохондриальной мембраны (Barnhart et al., 2003; Scaffidi et al., 1998). Каспаза 10, представляющая собой близкого гомолога каспазы 8, также может активироваться после стимуляции рецепторов TRAIL и Fas при участии адаптерной молекулы FADD (Sprick et al., 2002). При этом показано, что каспаза 10 может участвовать в осуществлении клеточной смерти, запускаемой при лигировании FasL, в присутствии ингибитора каспаз широкого спектра действия zVAD-fmk, а также в клетках Jurkat I9-2d, не экспрессирующих каспазу 8 (Lafont et al., 2010).

В третьем случае сигнал к запуску клеточной смерти передаётся в клетку другим типом рецепторов, получивших название рецепторов зависимости ((dependence receptors). Эти рецепторы не похожи по структуре, но похожи функционально: когда концентрация их лигандов достаточна, они принимают участие в сигнальных путях, обеспечивающих выживаемость, миграцию и дифференцировку клеток. В случае, если концентрация их специфичных лигандов падает ниже критической пороговой величины, рецепторы активируются,

запуская сигнал к апоптозу. Каспазный каскад в этом случае протекает при участии инициаторной каспазы 9, активирующей эффекторную каспазу 3. В настоящее время обнаружено 17 таких рецепторов, в число которых входят нетриновые рецепторы прототипа Net-1 DCC и UNC5H, а также неогенин, RET, TrkC, ALK, эфрин A4, Patched, МЕТ, белок-предшественник бета-амилоида (ß-amyloid precursor protein/APP), p75NTR, андрогеновый рецептор и некоторые интегрины (Mehlen and Bredesen, 2011). Рецепторы зависимости играют важную роль в осуществлении развития организма, онкогенеза, а также в нейродегенеративных процессах. В частности, интегрины, представляющие собой большое семейство гетеродимерных мембранных белков, входящих в состав внеклеточного матрикса и связывающих внутриклеточный цитоскелет с лигандами внеклеточного матрикса, запускают сигнал к апоптозу при нарушении адгезии клеток, препятствуя возникновению метастаз и прогрессированию опухоли (Feiding-Habermann, 2003; Ganguly et al., 2013). Такое явление запуска апоптоза в адгезионных клетках, утративших связь с матриксом, получило в литературе даже особое название «аноикис» (Frisch S.M. and Francis Н, 1994).

Апоптоз, запускаемый внутриклеточным сигналом.

Апоптоз может запускаться и без участия рецепторов, под действием внутриклеточных стрессорных факторов, таких как повреждение ДНК, активные формы кислорода (АФК), повышение цитозольной концентрации ионов накопление несвёрнутых белков в эндоплазматическом ретикулуме и множества других. При этом основным участником сигнального пути апоптоза, запускаемого без участия рецепторов, является митохондрия: выход цитохрома С из митохондриального матрикса в цитозоль способствует формированию апоптосомы, в состав которой входят белок Apaf-1, прокаспаза 9, dATP и цитохром С. После формирования апоптосомы происходит активация инициаторной каспазы 9 и эффекторных каспаз 3, 6 и 7 (Finucane et al., 1999; Acehan et al., 2002).

Участие митохондрий в апоптозе.

Митохондрии представляют собой клеточные органеллы, в составе которых имеются матрикс, окружённый внутренней митохондриальной мембраной (IMM), межмембранное пространство и внешняя митохондриальная мембрана (ОММ), отделяющая межмембранное пространство митохондрий от цитоплазмы клетки. И внешняя, и внутренняя митохондриальные мембраны состоят из фосфолипидных бислоёв и белков. За счёт присутствия в своём составе кардиолипина (особого фосфолипида, содержащего сразу 4 жирные кислоты), в норме внутренняя митохондриальная мембрана является практически непроницаемой для воды и для всех ионов, включая протоны. Это делает возможным комплексам I-IV дыхательной цепи митохондрии обеспечение протонного градиента вдоль внутренней митохондриальной мембраны, тем самым создавая трансмембранный потенциал (A1?™), необходимый для осуществления окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ. Кроме того, митохондрия является главным источником АФК в клетке, которые генерируются главным образом за счёт комплексов I и III дыхательной цепи: комплексы генерируют супероксид анион 02~, который выходит как в матрикс, так и в межмембранное пространство, а также диффундирует в цитозоль. Затем за счёт супероксид дисмутаз супероксид анион 02~ конвертируется в перекись водорода Н2О2. Внешняя мембрана митохондрий содержит большое количество особых каналообразующих мембранных белков - митохондриальных поринов, называемых также потенциал-зависимыми анионными каналами (VDACs, voltage-dependent anion channels), -которые позволяют небольшим молекулам и ионам с массой до ~5 кДа свободно диффундировать в межмембранное пространство митохондрий. Более крупные белки могут проникать внутрь митохондрии в случае, если сигнальная последовательность на их N-конце связывается с большим мультисубъединичным транспортным белком, транслоказой внешней митохондриальной мембраны, который способен посредством активного транспорта доставлять белки внутрь митохондрии. В межмембранном пространстве митохондрии содержится большое количество различных белков, часть из которых, в случае выхода из митохондрии

в цитозоль клетки, принимает участие в запуске апоптоза. При этом выход белков из межмембранного пространства митохондрий часто служит индикатором необратимости процесса программируемой клеточной смерти: клетка погибает вне зависимости от каспазной активности (Тейлор и др., 2006; Kroemer et al., 2007).

Выход митохондриальных белков из межмембранного пространства митохондрии может быть вызван как пермеабилизацией внешней митохондриальной мембраны (МОМР), так и открытием поры во внутренней митохондриальной мембране. В последнем случае происходит разбухание митохондриального матрикса при неповреждённой внешней митохондриальной мембране, что впоследствии приводит к разрыву ОММ и активации механизма апоптоза (Haraguchi et al., 2000).

Механизмы проницаемости внешней митохондриальной мембраны.

В регуляции МОМР важную роль играют белки семейства BCL-2: при апоптотических сигналах активируются проапоптотические белки семейства BCL-2, приводя к проницаемости внешней митохондриальной мембраны, напротив, антиапоптотические члены семейства BCL-2 способны предотвращать этот процесс. Семейство белков BCL-2 (BCL-2-подобные белки) включает в себя представителей, содержащих по меньшей мере один BCL-2-гомологичный домен (ВН). Это семейство состоит из двух групп: Bcl-2-подобных белков-ингибиторов апоптоза (BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL1, BCL-B (известный также как BCL-2L10) и Al (BCL-2A1)), содержащих от двух до четырёх BCL-2-гомологичных доменов и Bcl-2-подобных белков-активаторов апоптоза (ВАХ, ВАК, ВОК (MTD), BAD, BIK (BLK), BID, HRK (DP-5), BIM (BOD), BMF, NOXA и PUMA (ВВСЗ)), содержащих от одного до трёх BCL-2-гомологичных доменов, причём в составе второй группы выделяют так называемые белки BHS-only (BAD, BIK, BID, HRK, BIM, BMF, NOXA и PUMA) с единственным BCL-2-гомологичным доменом (ВНЗ) (Youle and Strasser, 2008). Некоторые из представителей каждой из групп имеют дополнительный СООН-концевой трансмембранный домен,

способствующий их встраиванию в ОММ и в другие внутриклеточные мембраны (напр., эндоплазматическую мембрану). Как правило, представители первой группы белков-ингибиторов апоптоза находятся в ОММ, защищая митохондрию от ММР, главным образом за счёт связывания и нейтрализации других, проапоптотических, белков семейства BCL-2, индуцирующих ММР. Однако некоторые из белков-ингибиторов апоптоза функционируют также и на эндоплазматической мембране. Аналогичная ситуация имеет место и для проапоптотических белков второй группы. Представители группы белков ВНЗ-only, обладая консервативным ВНЗ-доменом, способны связываться с анти-апоптотическими представителями семейства BCL-2, регулируя активность последних и благоприятствуя апоптозу (Youle and Strasser, 2008).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шелудченков, Антон Александрович, 2014 год

Список литературы

1. Гордеева А.В., Лабас Ю.А., Звягильская Р.А. (2004). Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция. Биохимия. 69(10): 1301-1313.

2. Коробко Е.В., Прохорчук Е.Б., Коробко ИВ., Георгиев Г.П., Киселев С.Л. (1998). Секреция цитотоксического белка Tag7 в ответ на обработку клеток липополисахаридом. ДАН. 360(6): 838-40.

3. Кустикова О. С., Киселев С. Л., Бородулина О. Р. и др. (1996). Клонирование гена tag7, экспрессирующегося в метастазирующих опухолях мыши. Генетика. 32(5): 621-628.

4. Тейлор Д., Грин Н, Стаут У. (2006). Биология. — М.: МИР.

5. Acehan D., Jiang X., Morgan D.G., Heuser J.E., Wang X., et al. (2002). Three-dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol. Cell. 9: 423-432.

6. Barnhart B.C., Alappat E.C., Peter M.E. (2003). The CD95 type I/type II model. Semin. Immunol. 15: 185-193.

7. Bertelsen E.B., Chang L., Gestwicki J.E., Zuiderweg E.R. (2009). Solution conformation of wild-type E. coli Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106(21): 8471-8476.

8. Bertrand M. et al. (2008). cIAPl and cIAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiquitination. Mol. Cell 30, 689-700.

9. Blomgran R., Zheng L., Stendahl O. (2007). Cathepsin-cleaved BID promotes apoptosis in human neutrophils via oxidative stress-induced lysosomal membrane permeabilization. J. Leukoc. Biol. 81: 1213-1223.

10. Boatright K.M., Renatus M., Scott F.L., Sperandio S., Shin H., Pedersen I.M., Ricci J.E., Edris W.A., Sutherlin D.P., Green D.R., Salvesen G.S. (2003). A unified model for apical caspase activation. Mol. Cell. 11(2): 529-541.

11. Boya P., Kroemer G. (2008). Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene. 27(50): 6434-6451.

12. Brennan M.A., Cookson B.T. (2000). Salmonella induces macrophage death by caspase-1-dependent necrosis. Mol. Microbiol. 38: 31—40.

13. Carswell E. et al. (1975) An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. PNAS USA 72(9): 3666-3670.

14. Cascino I., Fiucci G., Papoff G., Ruberti G. (1995). Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing. J. Immunol. 154: 2706-2713.

15. Castino R., Bellio N., Nicotra G., Folio C., Trincheri N.F., Isidore C. (2007). Cathepsin D-Bax death pathway in oxidative stressed neuroblastoma cells. Free Radie. Biol. Med. 42: 1305-1316.

16. Chan F.K., Chun H.J., Zheng L„ Siegel R.M., Bui K.L., Lenardo M.J. (2000). A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling. Science. 288(5475): 2351-2354.

17. Cheng, J., Zhou, T., Liu, C., Shapiro, J. P., Brauer, M. J., Kiefer, M. C., Barr, P. J., and Mountz, J. D. (1994). Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. Science 263: 1759-1762.

18. Cheng-Hung Yen and Chang-Hsien Yang. (1998). Evidence for Programmed Cell Death during Leaf Senescence in Plants. Plant Cell Physiol. 39(9): 922-927.

19. Clancy L., Mruk K., Archer K., Woelfel M., Mongkolsapaya J., Screaton G., Lenardo M.J. and Chan F.K. (2005). Preligand assembly domain-mediated ligand-independent association between TRAIL receptor 4 (TR4) and TR2 regulates TRAIL-induced apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 18099-18104.

20. Conus S., Perozzo R., Reinheckel T., Peters C., Scapozza L., Yousefi S., Simon H.U. (2008). Caspase-8 is activated by cathepsin D initiating neutrophil apoptosis during the resolution of inflammation. J. Exp. Med. 205 : 685-698.

21. Croft M., Duan W., Choi H., Eun S.Y., Madireddi S., Mehta A. (2012). TNF superfamily in inflammatory disease: translating basic insights. Trends Immunol. 33(3): 144-152.

22. Daugas E., Susin S.A., Zamzami N., Ferri K.F., Irinopoulou T., Larochette N., Prévost M.C., Leber B., Andrews D., Penninger J., Kroemer G. (2000). Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. FASEB J. 14(5): 729-739.

23. De Duve C., Pressman B.C., Gianetto R., Wattiaux R., Appelmans F. (1955). Tissue fractionation studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in rat-liver tissue. Biochem. J. 60(4): 604-917.

24. Degterev A., Huang Z., Boyce M., Li Y., Jagtap P., Mizushima N., Cuny G.D., Mitchison T.J., Moskowitz M.A., Yuan J. (2005). Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat. Chem. Biol. 1(2): 112-119.

25. Denecker G., Hoste E., Gilbert B., Hochepied T., Ovaere P., Lippens S., Van den Broecke C., Van Damme P., D'Herde K., Hachem J.P., et al. (2007). Caspase-14 protects against epidermal UVB photodamage and water loss. Nat. Cell Biol. 9: 666674.

26. Dewson G., Kratina T., Sim H.W., Puthalakath H., Adams J.M., Colman P.M., Kluck R.M (2008). To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell 30: 369-380.

27. Doitsh G., Galloway N.L., Geng X., Yang Z., Monroe K.M., Zepeda O., Hunt P.W., Hatano H., Sowinski S., Munoz-Arias I., Greene W.C. (2014). Cell death by pyroptosis drives CD4 T-cell depletion in HIV-1 infection. Nature. 505(7484): 509-14.

28. Du C., Fang M., Li Y., Li L. and Wang X. (2000). Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 102: 33-42.

29. Dukhanina E.A., Kabanova O.D., Lukyanova T.I., Shatalov Y.V., Yashin D.V., Romanova E.A., Gnuchev N.V., Galkin A.V., Georgiev G.P., Sashchenko L.P. (2009). Opposite roles of metastasin (S100A4) in two potentially tumoricidal mechanisms involving human lymphocyte protein Tag7 and Hsp70. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106(33): 13963-13967.

30. Dussmann H., Rehm M., Concannon C.G., Anguissola S., Wiirstle M., Kacmar S., Voller P., Huber H.J., Prehn J.H. (2010). Single-cell quantification of Bax activation and mathematical modelling suggest pore formation on minimal mitochondrial Bax accumulation. Cell Death Differ. 17: 278-290.

31. Dziarski R., Gupta D. (2006). The peptidoglycan recognition proteins (PGRPs). Genome Biol. 7: 232.1-232.13.

32. Dziarski R., Kashyap D.R., Gupta D. (2012). Mammalian peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating two-component systems and modulate microbiome and inflammation. Microb. Drug Resist. 18(3): 280-285.

33. Dziarski R., Piatt K.A., Gelius E., Steiner H. and Gupta D. (2003). Defect in neutrophil killing and increased susceptibility to infection with non-pathogenic Grampositive bacteria in peptidoglycan recognition protein-S (PGRP-S)-deficient mice. Blood, 102: 689-697.

34. Earnshaw W.C., Martins L.M, Kaufmann S.H. (1999). Mammalian caspases: structure, activation, substrates and functions during apoptosis. Ann. Rev. Biochem. 68: 383-424.

35. Eckelman B.P., Salvesen G.S. and Scott F.L. (2006). Human inhibitor of apoptosis proteins: why XIAP is the black sheep of the family. EMBO Rep. 7: 988-994.

36. Eckhart L., Ballaun C., Uthman A., Kittel C., Stichenwirth M., Buchberger M., Fischer H, Sipos W., Tschachler E. (2005). J. Biol. Chem. 280: 35077-35080.

37. Eckhart L., Ban J., Fischer H, Tschachler E. (2000). Caspase-14: analysis of gene structure and mRNA expression during keratinocyte differentiation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(3): 655-659.

38. Ellis HM, Horvitz H.R. (1986). Genetic Control of Programmed Cell Death in the Nematode C. elegans. Cell. 44, 817-829.

39. Enari M., Sakahira H, Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. (1998). A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD. Nature. 391:43-50.

40. Evdonin A., Kinev A., Tsupkina N., Guerriero V., Raynes D.A., Medvedeva N. (2009). Extracellular HspBPl and Hsp72 synergistically activate epidermal growth factor receptor. Biol. Cell. 101(6): 351-360.

41. Fehrenbacher N., Bastholm L., Kirkegaard-Sorensen T., Rafn B., Bottzauw T., Nielsen C., Weber E., Shirasawa S., Kallunki T., Jaattela M. (2008). Sensitization to the

lysosomal cell death pathway by oncogetie-induced down-regulation of lysosome-associated membrane proteins 1 and 2. Cancer Res. 68: 6623-6633.

42. Felding-Habermann B. (2003). Integrin adhesion receptors in tumor metastasis. Clin. Exp. Metastasis 20: 203-213.

43. Feldstein A.E., Weraeburg N.W., Li Z., Bronk S.F., Gores G.J. (2006). Bax inhibition protects against free fatty acid-induced lysosomal permeabilization. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290: G1339-G1346.

44. Festjens N., Kalai M., Smet J., Meeus A., Van Coster R., Saelens X., Vandenabeele P. (2006). Butylated hydroxyanisole is more than a reactive oxygen species scavenger. Cell Death Differ. 13(1): 166-169.

45. Finucane D.M., Bossy-Wetzel E., Waterhouse N.J., Cotter T.G., Green D.R. (1999). Bax-induced caspase activation and apoptosis via cytochrome c release from mitochondria is inhibitable by Bcl-xL. J. Biol. Chem. 274, 2225-2233.

46. Foghsgaard L., Wissing D., Mauch D., Lademann U., Bastholm L., Boes M., Elling F., Leist M., Jaattela M. (2001). Cathepsin B acts as a dominant execution protease in tumor cell apoptosis induced by tumor necrosis factor. J. Cell Biol. 153: 999-1010.

47. Frisch S.M. and Francis H. (1994). Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. J. Cell Biol. 124: 619-626.

48. Gabai V.L., Meriin A.B., Mosser D.D., Caron A.W., Rits S., et al. (1997). Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. J. Biol. Chem. 272: 18033-18037.

49. Galluzzi L., Kroemer G. (2008). Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis. Cell 135(7): 1161-1163.

50. Galluzzi L., Vanden Berghe T., Vanlangenakker N., Buettner S., Eisenberg T., Vandenabeele P., Madeo F., Kroemer G. (2011). Programmed Necrosis: From Molecules to Health and Disease. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 289: 1-35.

51. Galluzzi L., Vitale I., Abrams J.M., Alnemri E.S., Baehrecke E.H. et al. (2012). Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19: 107-120.

52. Ganguly K.K., Pal S., Moulik S., Chatterjee A. (2013). Integrins and metastasis. Cell Adh. Migr. 7(3): 251-261.

53. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. (1992). Identification of Programmed Cell Death In Situ via Specific Labeling of Nuclear DNA Fragmentation. J. Cell Biol. 119(3): 493-501.

54. George N.M., Evans J.J., Luo X. (2007). A three-helix homo-oligomerization domain containing BH3 and BH1 is responsible for the apoptotic activity of Bax. Genes Dev. 21: 1937-1948.

55. Goldstein J., Waterhouse N., Juin P., Evan G., Green D. (2000). The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nat. Cell Biol. 2: 156-162.

56. Graner M.W., Raynes D.A., Bigner D.D. Guerriero V. (2009). Heat shock protein 70-binding protein 1 is highly expressed in high-grade gliomas, interacts with multiple heat shock protein 70 family members, and specifically binds brain tumor cell surfaces. Cancer Science 100: 1871-1879.

57. Granger G., Kolb W. (1968). Lymphocyte in vitro cytotoxicity: mechanisms of immune and non-immune small lymphocyte mediated target L cell destruction. Journal of Immunology 101: 111-120.

58. Granger G.A., Shacks S.J., Williams T.W., Kolb W.P. (1969). Lymphocyte in vitro cytotoxicity: Specific release of Lymphotoxin-like materials from tuberculin sensitive lymphocyte cells. Nature 221(5186): 1155-1157.

59. Granot T., Milhas D., Carpentier S., Dagan A., Segui B., Gatt S., Levade T. (2006). Caspase-dependent and -independent cell death of Jurkat human leukemia cells induced by novel synthetic ceramide analogs. Leukemia. 20(3): 392-399.

60. Grebenyuk E.S., Stupnikova T.V., Sakharov D.A., Shleptsova V.A., Sashchenko L.P., Tonevitsky E.A. (2010). Long-term exercises increase the concentration of HspBPl, a co-chaperone of 70-KDa heat shock protein. Bull. Exp. Biol. Med. 149: 640e644.

61. Guan R., Wang Q., Sundberg E.J. & Mariuzza R.A. (2005). Crystal structure of human peptidoglycan recognition protein S (PGRP-S) at 1.70 A resolution. J. Mol. Biol. 347(4), 683-691.

62. Guicciardi M.E., Bronk S.F., Werneburg N.W., Yin X.M., Gores G.J. (2005). Bid is upstream of lysosome-mediated caspase 2 activation in tumor necrosis factor alpha-induced hepatocyte apoptosis. Gastroenterology 129: 269-284.

63. Guicciardi M., Gores G. (2009). Life and death by death receptors. FASEB J. 23(6): 1625-1637.

64. Gyrd-Hansen M., Farkas T., Fehrenbacher N., Bastholm L., Hoyer-Hansen M., Elling F., Wallach D., Flavell R., Kroemer G., Nylandsted J., Jaattela M. (2006). Apoptosome-independent activation of the lysosomal cell death pathway by caspase-9. Mol. Cell. Biol. 26: 7880-7891.

65. Hanayama R., Tanaka M., Miwa K., Shinohara A., Iwamatsu A. and Nagata S. (2002). Nature 417: 182-187.

66. Haraguchi M, Torii S., Matsuzawa Si, Xie Z., Kitada S., Krajewski S., Yoshida H., Mak T.W., Reed J.C. (2000). Apoptotic protease activating factor 1 (Apaf-1)-independent cell death suppression by Bcl-2. J. Exp. Med. 191: 1709-1720.

67. Hartl F.U. and Hayer-Hartl M. (2009). Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct. Mol. Biol. 16(6): 574-581.

68. Hayakawa M., Ishida N., Takeuchi K., Shibamoto S., Hon T., Oku N., Ito F., Tsujimoto M. (1993). Arachidonic acid-selective cytosolic phospholipase A2 is crucial in the cytotoxic action of tumor necrosis factor. J. Biol. Chem. 268(15): 11290-11295.

69. Hehlgans T., Pfeffer G. (2005). The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology 115(1): 1-20.

70. Helson L., Green S., Carswell E., Old L.J. (1975). Effect of tumour necrosis factor on cultured human melanoma cells. Nature 258(5537): 731-732.

71. Hochman A. (1997). Programmed cell death in prokariotes. Crit. Rev. Microbiol. 23(3), 207-214.

72. Hoffmann J.A. (2003). The immune response of Drosophila. Nature. 426(6962): 33-38.

73. Jaattela M., Wissing D., Bauer P.A., Li G.C. (1992). Major heat shock protein hsp70 protects tumor cells from tumor necrosis factor cytotoxicity. EMBO J. 11(10): 3507-3512.

74. Kadowaki H., Nishitoh H., Ichijo H. (2004). Survival and apoptosis signals in ER stress: the role of protein kinases. J. Chem. Neuroanat. 28: 93-100.

75. Kagedal K., Zhao M., Svensson I., Brunk U.T. (2001). Sphingosine-induced apoptosis is dependent on lysosomal proteases. Biochem. J. 359(Pt 2): 335-343.

76. Kagedal K., Johansson A.C., Johansson U., Heimlich G., Roberg K., Wang N.S., Jtirgensmeier J.M., Ollinger K. (2005). Lysosomal membrane permeabilization during apoptosis - involvement of Bax? Int. J. Exp. Pathol. 86: 309-321.

77. Kampinga H.H, Craig E.A. (2010). The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11(8): 579-592.

78. Kang D., Liu G., Lundstrom A., Gelius E., Steiner H. (1998). A peptidoglycan recognition protein in innate immunity conserved from insects to humans. PNAS USA. 95(17): 10078-10082.

79. Kashyap D.R., Wang M., Liu L.H., Boons G.J., Gupta D., Dziarski R. (2011). Peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating protein-sensing two-component systems. Nat. Med. 17(6): 676-683.

80. Kietzman C., Tuomanen E. (2011). PGRPs kill with an ancient weapon. Nat. Med. 17(6): 665-666.

81. Kirkegaard T., Roth A.G., Petersen N.H., Mahalka A.K., Olsen O.D., Moilanen I., Zylicz A., Knudsen, J., Sandhoff, K., Arenz, C., Kinnunen, P.K., Nylandsted, J., Jaattela M. (2010). Hsp70 stabilizes lysosomes and reverts Niemann-Pick disease-associated lysosomal pathology. Nature. 463: 549-553.

82. Kiselev S.L., Kustikova O.S., Korobko E.V., Prokhortchouk E.B., Kabishev A.A., Lukanidin E.M., Georgiev G.P. (1998). Molecular Cloning and Characterization of the Mouse tag7 Gene Encoding a Novel Cytokine. J. Biol. Chem. 273: 18633-18639.

83. Kroemer G. (2000). Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. FASEB J. 14: 729-739.

84. Kroemer G., Galluzzi L., Brenner C. (2007). Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87(1): 99-163.

85. Kroemer G. et al. (2009). Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16: 3-11.

86. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

87. Lafont E., Milhas D., Teissie J., Therville N., Andrieu-Abadie N., Levade T., Beoist H., Segui B. (2010). Caspase-10-Dependent Cell Death in Fas/CD95 Signalling Is Not Abrogated by Caspase Inhibitor zVAD-fmk. PloS One. 5(10): el3638.

88. Levine B., Yuan J. (2005). Autophagy in cell death: An innocent convict? J. Clin. Invest. 115: 2679-2688.

89. Li L.Y., Luo X., Wang X. (2001). Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412(6842): 95-99.

90. Liang H., Fesik S.W. (1997). Three-dimensional structures of proteins involved in programmed cell death. J. Mol. Biol. 274(3): 291-302.

91. Lippens S., Kockx M., Rnaapen M,, Mortier L., Polakowska R., Verheyen A., Garmyn M., Zwijsen A., Formstecher P., Huylebroeck D., Vandenabeele P., Declercq W. (2000). Epidermal differentiation does not involve the pro-apoptotic executioner caspases, but is associated with caspase-14 induction and processing. Cell Death Differ. 7(12): 1218-1224.

92. Liu C., Xu Z., Gupta D., Dziarski R. (2001). Peptidoglycan recognition proteins: a novel family of four human innate immunity pattern recognition molecules. J. Biol. Chem. 276: 34686-34694.

93. Lu G., Walsh C. (2012). Programmed necrosis and autophagy in immune function. Immunol. Rev. 249(1): 205-217.

94. Luo X., Budihardjo I., Zou H., Slaughter C., Wang X. (1998). Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell. 94(4): 481-490.

95. MacKenzie S.H., Clark A.C. (2012). Death by caspase dimerization. Adv. Exp. Med. Biol. 747: 55-73.

96. Malladi S., Challa-Malladi M., Fearnhead H.O. and Bratton S.B. (2009). The Apaf-1 *procaspase-9 apoptosome complex functions as a proteolytic-based molecular timer. EMBO J. 28: 1916-1925.

97. Martinon F., Tschopp J. (2004). Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117(5): 561-574.

98. Mehlen P., Bredesen D. (2011). Patched dependence receptor triggers apoptosis through ubiquitination of caspase-9. Sci. Signal. 4(157): mr2.

99. Metzstein M.M., Stanfield G.M., Horvitz H.R. (1998). Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future. Trends Genet. 14(10): 410-416.

100. Michel T., Reichhart J.M., Hoffmann J.A., Royet J. (2001). Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414(6865): 756-759.

101. Miramar M.D., Costantini P., Ravagnan L., Saraiva L.M., Haouzi D., Brothers G., Penninger J.M., Peleato M.L., Kroemer G., Susin S.A. (2001). NADH oxidase activity of mitochondrial apoptosis-inducing factor. J. Biol. Chem. 276: 1639116398.

102. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L., Denis-Larose C., Massie B. (1997). Mol. Cell Biol. 17(9): 5317-5327.

103. Nakagawa T., Zhu H, Morishima N., Li E., Xu J., et al. (2000). Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature 403, 98-103.

104. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F., Drouet C., Robert C., Guillermet C., Brambilla C., Brambilla E. (1996). In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations. J. Histochem. Cytochem. 44(9), 959-68.

105. Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, Labat-Moleur F. (1998). Importance of DNA fragmentation in apoptosis with regard to TUNEL specificity. Biomed Pharmacother. 52(6), 252-258.

106. Overholtzer M., Mailleux A.A., Mouneimne G., Normand G., Schnitt S.J., King R. W., Cibas E.S., Brugge J.S. (2007). A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell, 131: 966-979.

107. Polster B.M., Basanez G., Etxebarria A., Hardwick J.M., Nicholls D.G. (2005). Calpain I induces cleavage and release of apoptosis-inducing factor from isolated mitochondria. J. Biol. Chem. 280(8): 6447-6454.

108. Raynes D.A., Guerriero V. Jr. (1998). Inhibition of Hsp70 ATPase activity and protein renaturation by a novel Hsp70-binding protein. J. Biol. Chem. 273(49): 32883-32888.

109. Reed J.C. (1997). Cytochrome c: Can't Live with It—Can't Live without It. Cell 91: 559-562.

110. Repnik U., Turk B. (2010). Lysosomal-mitochondrial cross-talk during cell death. Mitochondrion 10: 662-669.

111. Rozman-Pungercar J., Kopitar-Jerala N., Bogyo M., Turk D., Vasiljeva O., Stefe I., Vandenabeele P., Brômme D., Puizdar V., Fonovic M., Trstenjak-Prebanda M., Dolenc I., Turk V., Turk B. (2003). Inhibition of papain-like cysteine proteases and legumain by caspase-specific inhibitors: when reaction mechanism is more important than specificity. Cell Death Differ. 10(8), 881-888.

112. Saito M., Korsmeyer S.J. and Schlesinger P.H. (2000). BAX-dependent transport of cytochrome c reconstituted in pure liposomes. Nature Cell Biol. 2, 553555.

113. Saleh M., Vaillancourt J.P., Graham R.K., Huyck M., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Steinberg M.H., Nolan V., Baldwin C.T., Hotchkiss R.S., Buchman T.G., Zehnbauer B.A., Hayden M.R., Farrer L.A., Roy S., Nicholson D.W. (2004). Differential modulation of endotoxin responsiveness by human caspase-12 polymorphisms. Nature. 429 (6987): 75-79.

114. Sashchenko L.P., Dukhanina E.A., Yashin D.V., Shatalov Y.V., Romanova E.A., Korobko E.V., Demin A.V., Lukyanova T.I., Kabanova O.D., Khaidukov S.V., Kiselev S.L., Gabibov A.G., Gnuchev N.V., Georgiev G.P. (2004). Peptidoglycan

recognition protein tag7 forms a cytotoxic complex with heat shock protein 70 in solution and in lymphocytes. J. Biol. Chem. 279(3): 2117-2124.

115. Scaffidi C. et al. (1998). Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways. EMBO J. 17: 1675-1687.

116. Schulze-Osthoff K., Bakker A.C., Vanhaesebroeck B., Beyaert R., Jacob W.A., Fiers W. (1992). Cytotoxic activity of tumor necrosis factor is mediated by early damage of mitochondrial functions. Evidence for the involvement of mitochondrial radical generation. J. Biol. Chem. 267: 5317-5323.

117. Schweichel J.-U., Merker H.-J. (1973). The morphology of various types of cell death in prenatal tissues. Teratology 7: 253-266.

118. Shomura Y., Dragovic Z., Chang H.C., Tzvetkov N., Young J.C., Brodsky J.L., Guerriero V., Hartl F.U., Bracher A. (2005). Regulation of Hsp70 function by HspBPl: structural analysis reveals an alternate mechanism for Hsp70 nucleotide exchange. Mol. Cell 17: 367-379.

119. Siegel R.M., Frederiksen J.K., Zacharias D.A., Chan F.K., Johnson M., Lynch D., Tsien R.Y., Lenardo M.J. (2000). Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations. Science 288(5475): 23542357.

120. Sprick M.R., Rieser E., Stahl H., Grosse-Wilde A., Weigand M.A., Walczak H. (2002). Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO J. 21: 4520-4530.

121. Stauber G.B., Aiyer R.A., Aggarwal B.B. (1988). Human tumor necrosis factor-a receptor. J. Biol. Chem. 263, 19098-19104.

122. Suzuki Y. et al. (2001). A serine protease, HtrA2, is released from the mitochondria and interacts with XIAP, inducing cell death. Mol. Cell 8: 613-621.

123. Tait W.G., Green D.R. (2010). Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11(9): 621-632.

124. Tanimura S., Hirano A.I., Hashizume J., Yasunaga M., Kawabata T., Ozaki K., Kohno M. (2007). Anticancer drugs up-regulate HspBPl and thereby antagonize the prosurvival function of Hsp70 in tumor cells. J. Biol. Chem. 282(49): 35430-35439.

125. Thornberry N.A., Rano T.A., Peterson E.P., Rasper D.M., Timkey T., Garcia-Calvo M., Houtzager V.M., Nordstrom P.A., Roy S., Vaillancourt J.P., Chapman K.T., Nicholson D.W. (1997). A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J. Biol. Chem. 272(29): 17907-17911.

126. Turk B., Stoka V., Rozman-Pungercar J., Cirman T., Droga-Mazovec G., Oresic K., Turk V. (2002). Apoptotic pathways: involvement of lysosomal proteases. Biol. Chem. 383(7-8): 1035-1044.

127. Vandenabeele P., Galluzzi L., Berghe T.V., Kroemer G. (2010). Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11(10): 700-714.

128. Vanhaesebroeck B., Bladel S.V., Leanarts A., Suffys P., Beyaert R., Lucas R., Roy F.V., Fiers W. Two discrete types of tumor necrosis factor-resistant cells derived from the same cell line. (1991). Cancer research. 51: 2469-2477.

129. Vanlangenakker N., Vanden Berghe T., Rrysko D.V., Festjens N., Vandenabeele P. (2008). Molecular mechanisms and pathophysiology of necrotic cell death. Curr. Mol. Med. 8(3): 207-220.

130. Vercammen D., Beyaert R., Denecker G., Goossens V., Van Loo G., Declercq W., Grooten J., Fiers W., Vandenabeele P. (1998). Inhibition of caspases increases the sensitivity of L929 cells to necrosis mediated by tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 187(9): 1477-1485.

131. Verhagen A.M., Ekert P.G., Pakusch M., Silke J., Connolly L.M., Reid G.E., Moritz R.L., Simpson R.J., Vaux D.L. (2000). Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell 102:43-53.

132. Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C. (1995). A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression

on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods 184(1), 39-51.

133. Wang Y., Kim N.S., Haince J.F., Kang H.C., David K.K., Andrabi S.A. Poirier G.G., Dawson V.L., Dawson T.M. (2011). Poly(ADP-ribose) (PAR) binding to apoptosis-inducing factor is critical for PAR polymerase-1-dependent cell death (parthanatos). Sci. Signal 4: ra20.

134. Wei M.C., Zong W.X., Cheng E.H., Lindsten T., Panoutsakopoulou V., Ross A.J., Roth K.A., MacGregor G.R., Thompson C.B., Korsmeyer SJ. (2001). Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292, 727-730.

135. Werneburg N., Guicciardi M.E., Yin X.M., Gores G.J. (2004). TNF-alpha-mediated lysosomal permeabilization is FAN and caspase 8/BID dependent. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 287, G436-G443.

136. Youle R.J. and Strasser A. (2008). The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9(1): 47-59.

137. Yue X.L., Lehri S., Li P., Barbier-Chassefiere V., Petit E., Huang Q.F., Albanese P., Barritault D., Caruelle J.P., Papy-Garcia D., Morin C. (2009). Insights on a new path of pre-mitochondrial apoptosis regulation by a glycosaminoglycan mimetic. Cell Death Differ. 16: 770-781.

138. Yuste R., MacLean J.N., Smith J., Lansner A. (2005). The cortex as a central pattern generator. Nat. Rev. Neurosci. 6(6): 477-483.

139. Zhao M., Brunk U.T., Eaton J.W. (2001). Delayed oxidant-induced cell death involves activation of phospholipase A2. FEBS Lett. 509: 399-404.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность доктору биологических наук, профессору Сащенко Лидии Павловне за чуткое и всестороннее руководство на всех этапах исследования. Автор искренне благодарен к.б.н. Яшину Денису Владимировичу за руководство исследованиями, помощь в планировании и постановке экспериментов. Автор благодарит сотрудников лаборатории «Молекулярной иммуногенетики рака» за помощь и поддержку на всех этапах работы и создание тёплой доброжелательной атмосферы в лаборатории, способствующей научному процессу: к.б.н. Кабанову Ольгу Дмитриевну, к.б.н. Лукьянову Тамару Ивановну, к.б.н. Духанину Елену Анатольевну, к.б.н. Романову Елену Анатольевну, Лупкину Наталью Ивановну и чл.-корр. РАН Гнучева Николая Васильевича.

Автор благодарит чл.-корр. РАН Тоневицкого Александра Григорьевича и сотрудников Всероссийского НИИ физической культуры и спорта за предоставление антител и сыворотки крови для исследований.

Автор признателен д.б.н. Шидловскому Юлию Валерьевичу и всем сотрудникам лаборатории «Регуляции экспрессии генов в развитии» за доброжелательное отношение и моральную поддержку.

Отдельно хочется выразить благодарность дирекции и администрации ИБГ РАН за создание благоприятных условий и атмосферы для научных исследований.