Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Шепелев, Михаил Валентинович

• Шепелев, Михаил Валентинович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шепелев, Михаил Валентинович

Оглавление.

Список используемых сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Семейство Юю ГТФаз человека.

2.1.1. Введение.

2.1.2. Структура Шю ГТФаз и регуляция ГТФазного цикла.

2.1.3. Регуляция мембранной локализации Шю ГТФаз.

2.2. Подсемейство ШюХТУ.

2.3. Шю ГТФаза СЬр/КЬоУ/\УгсЬ2.

2.3.1. Экспрессия гена ЛНОУ в нормальных и опухолевых тканях и клеточных линиях млекопитающих.

2.3.2. Регуляция экспрессии гена ЯНОУ.

2.3.3. Характеристика белка СЬр и его биохимические свойства.

2.3.4. Взаимодействие с регуляторными белками и активация ГТФазы СЬр.

2.3.5. Взаимодействие СЬр с предполагаемыми эффекторами.

Протеинкиназа Рак1.

Протеинкиназы Рак2, РакЗ, Рак4.

Другие белки.

2.3.6. Внутриклеточная локализация СЬр и липидные модификации С-конца.

2.3.7. Биологические эффекты ГТФазы СЬр.

Активация протеинкиназы Л\К.

Влияние на актиновый цитоскелет.

Возможное влияние ГТФазы СЬр на процесс митоза.

Возможная роль ГТФазы СЬр в злокачественной трансформации.

Экспрессия и функции ГТФазы СЬр в эмбриональном развитии позвоночных

2.3.8. Резюме.

2.4. Шю ГТФаза \¥гсЬ-1/Шши.

2.4.1. Экспрессия гена ЛН017 в тканях и клеточных линиях.

2.4.2. Регуляция экспрессии гена ЯН017.

2.4.3. Характеристика белка \Vrch-l и его биохимические свойства.

2.4.4. Взаимодействие с регуляторными белками.

2.4.5. Внутриклеточная локализация и липидные модификации С-конца.

2.4.6. Взаимодействие с эффекторами.

Протеинкиназа Рак1.

2.4.8. Протеинкиназы Рук2 и ГАК и регуляция \Vrch-l протеинкиназой 8гс.

2.4.9. 8НЗ-домен содержащие белки ]Чск, вгЬ2 и РЬСу.

2.4.10. АМГСАРЗО и С(ЮАР.

2.4.11. Биологические эффекты ГТФазы \УгсЬ-1.

Активация ЛЧК.

Влияние на актиновый цитоскелет.

Возможная роль ГТФазы \¥гсЬ-1 в злокачественной трансформации.

Влияние ГТФазы \Vrch-l на фокальные контакты.

Роль \Vrch-l в дифференцировке остеокластов.

Другие эффекты.

2.4.12. Резюме.

2.5. Эффекторные молекулы ГТФазы СЬр: Семейство протеинкиназ Рак человека

2.5.1. Общая характеристика семейства протеинкиназ Рак человека.

2.5.2. Структура протеинкиназ Рак.

2.5.3. Механизмы активации протеинкиназ Рак.

Активация протеинкиназ Pak I с участием Rho ГТФаз.

Механизмы активации протеинкиназ Pak I без участия ГТФаз.

2.5.4. Регуляция активности протеинкиназ Pak II.

2.6. Серин-треониновая протеинкиназа Рак5.

2.6.1. Ген РАК7 и его экспрессия у млекопитающих.

2.6.2. Свойства и структура протеинкиназы Рак5.

2.6.3. Характеристика и регуляция каталитической активности Рак5.

2.6.4. Влияние Rho ГТФаз на киназную активность Рак5.

2.6.5. Интерактом протеинкиназы Рак5.

Взаимодействие Рак5 с Rho ГТФазами.

Протеинкиназа MARK2/Par-1.

Протеинкиназа Raf-1.

2.6.6. Внутриклеточная локализация Рак5.

Локализация Рак5 на митохондриях.

Локализация Рак5 на везикуло-подобных структурах.

Ядерная локализация Рак5.

Локализация Рак5 на фокальных контактах и центросомах.

2.6.7. Влияние Рак5 на актиновый и тубулиновый цитоскелеты.

2.6.8. Индукция роста нейритов под влиянием Рак5.

2.6.9. Роль Рак5 в активации МАРК сигнальных путей: активация JNK.

2.6.10. Ингибирование апоптоза под влиянием Рак5.

2.6.11. Экспрессия Рак5 в опухолевых клеточных линиях и образцах опухолей человека.

2.6.12. Возможная роль протеинкиназы Рак5 в развитии диабета.

2.6.13. Нокаут гена Рак7 у мыши.

2.6.14. Резюме.

2.7. Серин-треониновая протеинкиназа Ракб.

2.7.1. Структура Ракб и регуляция киназной активности.

2.7.2. Белки, взаимодействующие с Ракб.

Rho ГТФазы.

Транскрипционные факторы.

Другие белки.

2.7.3. Экспрессия гена РАК6 в нормальных и опухолевых тканях и возможная роль Ракб в онкогенезе.

2.7.4. Нокаут гена Ракб.

2.7.5. Резюме.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Реактивы.

3.2. Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики.

3.3. Получение химически компетентных клеток Е. coli.

3.4. Приготовление электрокомпетентных клеток Е.coli XL 1 Blue MRF'.

3.5. Электропорация бактериальных клеток.

3.6. Трансформация клеток Е. coli.

3.7. Гидролиз ДНК с помощью эндонкуклеаз рестрикции.

3.8. Секвенирование ДНК.

3.9. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli (мини-преп).

3.10. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli (макси-преп).

3.11. Очистка фрагментов ДНК из агарозного геля и растворов.

3.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.13. Лигирование фрагментов ДНК.

3.14. Клонирование продуктов ПЦР.

3.15. Получение плазмидных конструкций.

3.16. Культуры клеток, реагенты и трансфекция.

3.17. Вестерн-блот анализ и антитела.

3.18. Очистка рекомбинантных белков GST и GST-Chp.

3.19. Коиммунопреципитация myc-Chp и FLAG-Ракб.

3.20. Коиммунопреципитация FLAG-Chp и myc-IRSp53.

3.21. Коиммунопреципитация myc-Chp и а-тубулина.

3.22. Иммунофлуоресценция.

3.23. Анализ формирования филоподий в клетках HeLa В.

3.24. Аффинная очистка ГТФазы Chp с FLAG-эпитопом из лизатов клеток РС12ТеЮп.

3.25. Масс-спектрометрия.

3.26. GST пул-даун анализ с использованием цитозоля клеток HeLa В.

3.27. Анализ взаимодействия GST-Chp с микротрубочками полимеризованными in vitro.

3.28. Анализ взаимодействия myc-Chp с микротрубочками полимеризованными в лизатах клеток НЕК

3.29. Гель-оверлей анализ.

3.30. Измерение жизнеспособности клеток PC12TetOn.

3.31. Измерение активности ЛДГ в культуральной среде.

3.32. Измерение активности каспаз.

3.33. Проточная цитофлуориметрия.

3.34. Анализ активации протеинкиназы JNK в клетках PC12TetOn.

3.35. Измерение активности АР-1 репортерного гена.

3.36. Статистический анализ.

3.37. Анализ белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе.

3.37.1. Штаммы дрожжей.

3.37.2. Среды и реактивы.

3.37.3. Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.

3.37.4. Анализ белок-белковых взаимодействий в дрожжевой двугибридной системе (штамм Y153).

3.37.5. Анализ активации репортерного гена LacZ в дрожжах.

3.37.6. Скрещивание штаммов Y187 и CG-1945.

3.38. Скрининг библиотеки кДНК в дрожжевой двугибридной системе «Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 2».

3.38.1. Проверка активации транскрипции репортерных генов «приманкой».

3.38.2. Скрещивание штамма CG-1945, содержащего «приманку», со штаммом Y187, трансформированным библиотекой кДНК.

3.38.3. Выделение плазмидной ДНК (библиотечной плазмиды) из клеток дрожжей

3.38.4. Анализ LacZ? HIS3+ позитивных клонов.

3.39. Выделение РНК из клеточных линий и синтез кДНК.

3.40 Анализ уровня транскрипта гена RHOVс помощью полуколичественной ПЦР.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Идентификация протеинкиназ Рак5 и Ракб как новых потенциальных эффекторов ГТФазы Chp.

4.2. Chp взаимодействует с Ракб в лизатах клеток млекопитающих.

4.3. Chp связывается с CRIB-последовательностью в Ракб.

4.4. Эффекторный домен Chp необходим для взаимодействия с Ракб.

4.5 Chp не влияет на уровень фосфорилирования аминокислотного остатка S560 у

Ракб.ЮЗ

4.6. Chp колокализуется с Ракб на везикулярных структурах в клетках NCI-H

4.7. Поиск белков взаимодействующих с ГТФазой Chp в дрожжевой двугибридной системе.

4.8. Анализ результатов скрининга.

4.8.1. IRSp53 (Insulin Receptor Substrate p53)/BAIAP2 и Cyfip2 (Cytoplasmic FMR1 interacting protein 2)/PIR121/Sra-l.

4.9. Картирование фрагмента IRSp53, необходимого для взаимодействия с Chp.

4.10. Взаимодействие Chp и IRSp53 в лизатах клеток млекопитающих.

4.11. Взаимодействие GST-Chp и эндогенного белка IRSp53.

4.12. Колокализация Chp и IRSp53 на филоподиях в клетках HeLa В.

4.13. ГТФаза СЬр вызывает формирование филоподий в клеточной линии НеЬа В.

4.14. Идентификация ос-тубулина как партнера по взаимодействию для ГТФазы СЬр

4.15. а-тубулин связывается с ГТФазой Chp при проведении коиммунопреципитации и GST пул-даун анализа.

4.16. Взаимодействие Chp с микротрубочками.

4.17. ГТФаза Chp напрямую связывается с 0-тубулином.

4.18. Получение стабильных клеточных линий РС12ТеЮп с тетрациклин-регулируемой экспрессией ГТФазы Chp с N-концевым FLAG эпитопом.

4.19. Экспрессия Chp снижает жизнеспособность клеток PC12TetOn.

4.20. Экспрессия Chp является цитотоксичной для клеток PC12TetOn.

4.21. Chp вызывает апоптоз клеток PC12TetOn.

4.22. Chp активирует протеинкиназу JNK в клетках PC12TetOn.

23. Цитотоксический эффект Chp блокируется ингибитором JNK, SP600125.

4.24. Ингибитор JNK, SP600125 снижает Chp-индуцированную активацию каспаз в клетках РС12ТеЮп.

4.25. Chp активирует протеинкиназу JNK и AP-1-зависимую транскрипцию в клетках НЕК293.

4.26. Ингибирование JNK блокирует активацию АР-1 под влиянием Chp.

4.27. Мембранная локализация и N-концевой домен Chp важны для активации JNK сигнального каскада.

4.28. Резюме: роль Chp в развитии апоптоза в клетках PC12TetOn.

4.29. Изучение экспрессии гена RHOV в образцах немелкоклеточного рака легких человека.

4.30. Экспрессия гена RHOVв клеточных линиях рака легкого человека.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение свойств и молекулярных механизмов действия Rho ГТФазы Chp/Wrch2»

Жизнедеятельность всех клеток эукариот подвержена сложной регуляции, в которой важную роль играют внеклеточные стимулы, такие как гормоны, факторы роста, цитокины, молекулы внеклеточного матрикса и многие другие. Внеклеточные молекулы, взаимодействуя со своими рецепторами на поверхности клеток, вызывают активацию внутриклеточных сигнальных каскадов, представляющих собой цепь белок-белковых взаимодействий и биохимических реакций. В конечном итоге в результате активации определенного сигнального каскада в клетке формируется адекватный биологический ответ на поступивший внеклеточный стимул.

Представители суперсемейства Ras-подобных ГТФаз, к которым относится семейство Rho ГТФаз, являются одними из ключевых регуляторов множества сигнальных путей у эукариот. Семейство Rho ГТФаз человека насчитывает 20 белков, разделяемых на 8 подсемейств. «Атипичная» Rho ГТФаза Chp/RhoV/Wrch-2 и ее близкий гомолог Wrch-1/RhoU составляют подсемейство RhoU/V.

Rho ГТФазы реализуют свои биологические функции через специфические взаимодействия с белками-эффекторами. Очевидно, что чем шире спектр известных эффекторов ГТФазы, тем глубже наши представления о свойствах и функциях этой ГТФазы. Поэтому одним из главных подходов к изучению молекулярных механизмов действия Rho ГТФаз является поиск специфических белков-партнеров по взаимодействию. Опираясь на свойства и функции обнаруженных белков, можно ассоциировать ГТФазу с определенным клеточным процессом, в который вовлечен ее партнер по взаимодействию.

К настоящему времени был идентифицирован ряд потенциальных эффекторов ГТФазы Chp, включающий р21-активируемые киназы (Pakl, Pak2 и Pak4) и белки N-WASP, Рагб и MLK3, и выявлено участие Chp в ряде клеточных процессов. В частности, Chp может активировать протеинкиназы Pakl и JNK, регулировать локализацию Е-кадгерина на адгезионных межклеточных контактах при участии протеинкиназы Pakl и белка |3PIX, а также участвует в дифференцировке клеток нервного гребня. Тем не менее, молекулярные механизмы действия ГТФазы Chp во многом остаются неизвестными. Это определяет актуальность исследования свойств белка Chp для расширения фундаментальных представлений о биологии клеток эукариот и о сигнальных путях, регулируемых Rho ГТФазами.

Кроме того, белок Chp способен вызывать злокачественную трансформацию фибробластов мыши. Это определяет актуальность исследования свойств ГТФазы Chp с прикладной точки зрения, так как это способствует более глубокому пониманию механизмов возникновения и прогрессии опухолей, а в перспективе - выявлению новых молекулярных мишеней для направленного воздействия.

Важно отметить, что в настоящее время находят все более широкое применение лекарственные средства направленного действия («таргетные» препараты), влияющие на различные этапы процессов внутриклеточной передачи сигнала, от лиганд-рецепторных взаимодействий до процессов, протекающих в ядре клеток. Поэтому изучение белков, участвующих во внутриклеточных сигнальных каскадах, безусловно, важно не только для расширения фундаментальных представлений о биологии клеток эукариот, но и для понимания молекулярных механизмов патогенеза различных заболеваний человека и выявления новых молекулярных мишеней для направленного воздействия на них. С учетом вышеизложенного цель и задачи данной работы были сформулированы следующим образом:

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось выявление и изучение новых свойств и функций атипичной Шю ГТФазы СЬр.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать взаимодействие белка СЬр с возможными эффекторами, протеинкиназами Рак5 и Ракб.

2. Провести поиск новых белков, взаимодействующих с ГТФазой СЬр, с помощью различных экспериментальных подходов.

3. Создать экспериментальную модель для изучения влияния ГТФазы СИр на клеточные процессы.

4. Выявить и исследовать клеточные процессы, в которых принимает участие ГТФаза СИр.

5. Изучить экспрессию гена ЯНОУ, кодирующего белок СЬр, в образцах немелкоклеточного рака легких человека.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Семейство Rho ГТФаз человека 2.1.1. Введение

Суперсемейство Ras-подобных ГТФаз (часто называемых «малые ГТФазы») у человека насчитывает более 150 представителей. На основе сравнения аминокислотных последовательностей суперсемейство разделяют на пять семейств: Ras, Rho, Rab, Ran и Arf [1]. В Таблице 1 приведено количество генов у человека, входящих в каждое семейство [1]. ГТФазы Miro-1 и Miro-2 ранее относили к семейству Rho ГТФаз [1,2], однако впоследствии они были выделены в самостоятельное семейство Ras-подобных ГТФаз [3, 4].

Таблица 1. Суперсемейство Ras-подобных ГТФаз человека.

Семейство Количество генов в геноме человека Описано изоформ

Rab 61 63

Ras 36 39

Arf 27 30

Rho 20 22

Ran 1 1

Гены HRAS и KRAS, кодирующие ГТФазы H-Ras и K-Ras, были открыты как онкогены вирусов саркомы Harvey и Kirsten в конце 70-х годов [5, 6]. Позднее были идентифицированы соответствующие клеточные протоонкогены, и было установлено, что мутации в этих генах встречаются во многих карциномах человека [7-10]. Также было показано, что мутантные формы белков, кодируемые этими генами, стимулируют пролиферацию и трансформацию клеток в культуре [11, 12]. Эволюционно консервативных ортологов Ras-подобных ГТФаз находят у таких организмов, как дрожжи и простейшие, а также у растений [1]. Ген Rho был обнаружен как гомолог гена Ras у морского моллюска Aplysia в 1985 году [13]. Семейство Rho ГТФаз человека насчитывает 20 белков и на основе сравнения аминокислотных последовательностей может быть разделено на восемь подсемейств (Рис.1) [2, 3, 14-16]: Cdc42: Cdc42, ТС 10 (RhoQ), TCL (RhoJ) Rae: Racl, Rac2, Rac3, RhoG

Rho: RhoA, RhoB, RhoC

Rnd: Rndl, Rnd2, Rnd3 (RhoE)

RhoD: RhoD и Rif (RhoF)

RhoH: RJ10H (TTF)

RhoBTB: RhoBTBl и RhoBTB2 RhoUV: Clip и Wrch 1

Подсемейства Cdc42, Rae и RhoUV объединяют в один кластер. Кроме данного кластера выделят еще три кластера - RhoBTB; Rho, RhoD и Rnd; и RhoH [4] (Рис.1).

Arf5 ЛИ

A riß

Рис. 1. Семейство И1ю ГТФаз человека (адаптировано из [4]). Па рисунке представлено филогенетическое дерево белков из семейства Ию ГТФаз. Свстло-ссрым цветом выделены кластеры Rho ГТФаз, темно-серым цветом выделены подсемейства. ГТФазы Мп'о-1 и Мно-2 выделяют как отдельное семейство Ras-]Юдoбпыx ГТФаз.

2.1.2. Структура Rho ГТФаз и регуляция ГТФазного цикла

Все Ras-подобные ГТФазы, и Rho ГТФазы в том числе, характеризуются наличием высоко консервативного ГТФазного. или G домена (аминокислотные остатки 5-166 (а.о.) у белка Ras), молекулярной массой около 20 кДа. Структура и биохимические свойства G домена сходны с таковыми для Ga субъединиц гегерогримерных G белков [1]. В G домене выделяют пять так называемых «G боксов» или мотивов, которые являются высоко консервативными и играют важную роль в связывании ГДФ/ГТФ и катализе. Ниже приведены канонические аминокислотные последовательности G боксов (обозначения -стандартные одпобуквенные обозначения аминокислот; X - любая аминокислота): G1 бокс - GXXXXGKS/T: G2 бокс - Т: G3 бокс - DXXGQ/H/T; G4 бокс - T/NKXD; С.5 бокс -C/SAK/L/T.

Малые ГТФазы проявляют три вида биохимической активности: высокоаффинное связывание ГДФ/ГТФ, ГДФ/ГТФ обменная активность и ГТФазная активность. Различают два функциональных состояния ГТФаз: неактивное ГДФ-связаиное и активное ГТФсвязанное. Переход из неактивного состояния в активное, взаимодействие с эффекторным белком, и последующее возвращение в исходное, неактивное состояние, составляют ГТФазный цикл (Рис.2).

Рис. 2. ГТФазный цикл белков

Pi

Rho ГТФ семейства Rho. Подробности в тексте.

Эффекторы

Биологический ответ

Конформаниоино ГДФ-, и ГТФ-связзнные состояния различаются в основном в областях, называемых «Switch I» и «Switch II». У белка Ras это аминокислоты 30-38 и 5976, соответственно, у Cdc42/Rac - 25-46 и 59-74 [17, 18], соответственно. За счет конформанионных изменений в данных областях при переходе из неактивного состояния в активное, ГТФаза приобретает высокую аффинность к эффекторным белкам, по сравнению с неактивным состоянием. В связи с этим важно отмстить еще один структурный элемент Ras-подобных ГТФаз: эффекторпый домен (32-40 а.о. у Ras: 26-50 а.о. у Cdc42). Он включает в себя «Switch I» область и является критически важным структурным элементом для взаимодействия с эффекторными молекулами. Замены отдельных аминокислот в данном домене могут селективно нарушать взаимодействие Rho ГТФаз с теми, или иными эффекторами [17]. Уникальной особенностью всех Rho ГТФаз (кроме белка RhoL D.melanogaster), отличающих данные белки от других представителей супсрссмсйства, является наличие так называемого «вставочного региона» («insert region», 123-135 а.о. у Racl) [18].

Как было сказано выше, Rho ГТФазы действуют как «молекулярные переключатели», которые под влиянием различных стимулов переходят из своего неактивного, ГДФ-свя зан пою состояния, в активное. ГТФ-связанное состояние, в котором они способны взаимодействовать с эффекторными белками [18], и тем самым обеспечивать передачу сигнала по сигнальным каскадам (Рис.2). Переход между неактивным, ГДФсвязанным состоянием, и активным, ГТФ-связанным состоянием, осуществляется за счёт реакций ГДФ/ГТФ обмена и ГТФазной реакции, которые находятся под строгим контролем ряда регуляторных белков, что обеспечивает надлежащую пространственно-временную активацию и инактивацию Rho ГТФаз [17]. Rho ГТФазы удерживаются в цитоплазме в неактивном, ГДФ-связанном состоянии с помощью белков, называемых RhoGDI (Guanine nucleotide Dissociation Inhibitors). Известно три таких белка: RhoGDIa, RhoGDip и RhoGDIy [19]. В роли сигналов, индуцирующих освобождение ГТФазы из комплекса с RhoGDI, могут выступать фосфорилирование RhoGDI, например протеинкиназой Pakl; взаимодействие RhoGDI с белковыми факторами (например, с доменами типа FERM) и различными фосфолипидами [19]. После освобождения из комплекса с RhoGDI ГТФазы связываются с мембранами, находясь при этом в ГДФ-связанном состоянии.

При поступлении сигнала от компонентов сигнального пути, действующих в каскаде выше Rho ГТФаз, активируется ещё один тип регуляторов ГТФазного цикла. Белки, называемые GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors), активируются при передачи сигнала и связываются с неактивными, связанными с мембранами Rho ГТФазами, вызывая диссоциацию ГДФ из комплекса с ГТФазой [20]. Далее, ГДФ легко замещается на ГТФ, так как внутриклеточная концентрация ГТФ намного выше концентрации ГДФ, что приводит к изменению конформации и активации ГТФазы [21].

Механизм активации ГТФаз под действием GEF белков в деталях можно рассмотреть на примере ГТФазы Ras. Данный процесс является консервативным у большинства представителей суперсемейства Ras-подобных ГТФаз, в том числе у Rho ГТФаз. Ras-ГДФ связывается с GEF белками с достаточно низкой аффинностью (>10 мкМ). В результате связывания освобождается молекула ГДФ и образуется высокоаффинный переходный комплекс между свободным от нуклеотида Ras и GEF белком (IQ 4-5*10"у М) [22]. Однако в клетке ГТФ присутствует в миллимолярных концентрациях и обладает еще большей аффинностью к свободной от нуклеотидов ГТФазе Ras (IQ 10"ш М), и поэтому ГТФ замещает GEF из комплекса с Ras [22]. Вследствие этого Ras ГТФаза становится активной и может взаимодействовать с эффекторными белками. Данный процесс протекает сходно и у Rho ГТФаз, а аминокислотные остатки, важные для связывания нуклеотидов, являются консервативными у большинства белков суперсемейства. В настоящий момент известно множество GEF белков, активных в отношении Rho ГТФаз. Такие GEF белки, как Dbl и Vavl являются одними из наиболее хорошо изученных и обладают свойствами онкогенов [20].

С помощью сайт-направленного мутагенеза был обнаружен ряд мутаций у ГТФазы Ras, которые влияли на ГТФазный цикл [23, 24]. Как оказалось, данные мутации обладают таким же эффектом и у других представителей суперсемейства, в том числе и у Rho ГТФаз.

Например, замена консервативного остатка серина на аспарагин в 17 позиции (S17N) блокирует ГТФазу Ras в неактивном, ГДФ-связанном состоянии. Ras S17N обладает более высокой аффинностью к ГДФ по сравнению с ГТФ [23], но, тем не менее, сохраняет способность связывать и ГТФ [25, 26], однако, даже в ГТФ-связанном состоянии не способна взаимодействовать с эффекторными молекулами [25]. Остаток серина в данной позиции координирует ион Mg2+, который находится в нуклеотид-связывающем кармане ГТФазы [27]. Также с данным ионом при переходе в активное состояние взаимодействует консервативный остаток треонина, находящийся в эффекторном домене ГТФазы (Т35). Взаимодействие S17 с ионом магния может быть важно для достижения ГТФазой активной конформации. Как было установлено, данный тип доминант-негативных мутантов ГТФаз ингибирует функцию белков дикого типа путем конкурирования за связывание с GEF белками. Во-первых, Ras S17N обладает пониженной аффинностью к нуклеотидам, во-вторых, повышенной аффинностью к GEF белкам [22, 28]. Поэтому данная мутантная форма ГТФазы прочно связывается с эндогенными GEF белками тем самым предотвращая активацию эндогенных ГТФаз дикого типа.

Другой тип мутаций, влияющих на ГТФазный цикл, - активационные мутации. Данные мутации (G12V или Q61L в Cdc42) нарушают ГТФазную активность и тем самым блокируют ГТФазу в активном состоянии. Остаток глутамина Q61 стабилизирует у-фосфат при гидролизе ГТФ. Несмотря на то, что а.о. G12 и Q61 в первичной последовательности белка находятся на значительном расстоянии, тем не менее, пространственно они находятся в одной области и их мутации обладают сходным эффектом. При этом было показано, что данные мутации не равнозначны. В отличие от Cdc42 G12V, Cdc42 Q61L не взаимодействует с RhoGDIa [29].

И, наконец, третий тип мутаций - так называемые «fast cycling» мутации. У Cdc42 это мутации F28L и С18А. Замена С18А приводит к нарушению водородной связи с а-фосфатом и снижению аффинности взаимодействия Cdc42 с нуклеотидом и увеличению аффинности ГТФазы к GEF белку, что приводит к быстрому обмену нуклеотидов. In vivo такая замена делает ГТФазу доминант-негативной; механизм действия в данном случае такой же как и для T17N мутаций [30]. В случае замены F28L Cdc42 приобретает способность спонтанно претерпевать обмен ГДФ на ГТФ, без изменения ГТФазной активности [31]. Интересно отметить, что в отличие от ГТФазы Ras, способность которой к злокачественной трансформации клеток млекопитающих, прежде всего, увеличивается при введении активирующих мутаций, для Cdc42 именно «fast-cycling» мутация, но не активирующие мутации приводят к увеличению трансформирующей способности. По всей видимости, для функции Cdc42 важен интактный ГТФазный цикл, тогда как активирующие мутации лишь способствуют взаимодействию с эффекторами.

После взаимодействия с эффектором, которое обеспечивает передачу сигнала далее по каскаду, Rho ГТФазы должны вернуться в исходное, неактивное состояние. Это осуществляется за счёт гидролиза ГТФ до ГДФ и неорганического фосфата. Rho ГТФазы обладают эндогенной ГТФазной активностью, которая может быть значительно увеличена за счёт действия белков, называемых GTPase Acivating Proteins (GAPs) [32]. В геноме человека имеется более 60 генов, кодирующих белки с потенциальной RhoGAP активностью [32, 33]. Механизм действия некоторых GAP белков заключается в следующем: pl20RasGAP и p50RhoGAP белки ориентируют должным образом критический важный для ГТФазной активности консервативный остаток глутамина ГТФазы (Q61 у Cdc42), а консервативный остаток аргинина у GAP белка напрямую участвует в гидролизе ГТФ путем стабилизации отрицательного заряда, образующегося при переходном состоянии [34].

После гидролиза ГТФ Rho ГТФазы вновь связываются с белками RhoGDI и возвращаются в неактивное состояние. Первый этап экстракции Rho ГТФаз из мембран заключается в связывании N-концевого «гибкого» домена RhoGDI с областями «Switch I» и «Switch II». RhoGDI связывается с консервативным остатком треонина Т35 в области «Switch I», который координирует ион магния, необходимый для GEF-опосредованной активации [19]. Тем самым RhoGDI может конкурировать с GEF белками за данный остаток. Также происходит связывание с областью «Switch I», что может влиять на необходимый для ГТФазной активности остаток глутамина Q61 и тем самым ингибировать ГТФазную активность. Второй этап включает изомеризацию изопрениловых остатков и их связывание с гидрофобной полостью на С-конце RhoGDI, что приводит к экстракции ГТФазы из мембраны. Ряд работ указывают на то, что фосфорилирование ГТФазы может способствовать связыванию ГТФазы с RhoGDI [19]. Нарушение ГТФазного цикла может вносить существенный вклад в развитие и прогрессию опухолей, так как Rho ГТФазы способствуют Gj-S переходу в клеточном цикле и активируют сигнальные каскады, стимулирующие пролиферацию и ингибирующие развитие апоптоза [35, 36]. Однако, в отличие от онкогенных мутаций в гене Ras, к настоящему времени не было обнаружено подобных мутаций в генах Rho ГТФаз при онкологических заболеваниях человека.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Шепелев, Михаил Валентинович

Основные результаты работы получены автором лично. Масс-спектрометрический анализ белков проводился Р. Зиганшиным (ИБХ РАН, г. Москва), образцы кДНК опухолей легкого человека и прилежащей нормальной ткани были получены от Е.Д. Свердлова, Т.В. Виноградовой, Е.П. Копанцева (ИБХ РАН, г. Москва). Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Благодарности

Автору хотелось бы выразить искреннюю благодарность следующим людям:

• своему научному руководителю Игорю Викторовичу Коробко за многолетнее чуткое руководство моей работой, неоценимые практические и теоретические советы и, в целом, за становление меня как научного работника;

• Джонатану Чернофф (Онкологический центр «Фокс Чейз», г. Филадельфия, США) за возможность работы по данному проекту, который начинался именно в его лаборатории, за обсуждения результатов, критическое чтение статей и предоставление многих плазмидных конструкций, использованных в данной работе;

• Сотрудникам лабораторий молекулярной онкогенетики и генной терапии рака ИБГ РАН за советы и помощью в работе и за создание теплого и дружественного микроклимата на рабочем месте, без которого была бы невозможна плодотворная работа;

• Рустаму Зиганшину (ИБХ РАН, г. Москва) за проведение масс-спектрометрического анализа;

• Елене Надеждиной (ИФХБ им. А.Н. Белозерского, г. Москва) за предоставленный препарат очищенного тубулина;

• Е.Д. Свердлову, Т.В. Виноградовой, Е.П. Копанцеву (ИБХ РАН, г. Москва) за образцы кДНК опухолей легкого и прилежащей нормальной ткани;

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГТФаза СЬр является одним из наименее изученных представителей семейства Юю ГТФаз человека, что определяет актуальность исследования свойств и функций СЬр с точки зрения понимания фундаментальных механизмов функционирования клеток и организма. Исследуя молекулярные механизмы действия СЬр, нами был идентифицирован ряд новых белков-партнеров по взаимодействию с ГТФазой СЬр. Это открывает дальнейшие перспективы для изучения клеточных процессов, в которых принимает участие СЬр. Выявленные в данной работе взаимодействие СЬр с белком Ж8р53 и способность СЬр индуцировать формирование филоподий, вместе с ранее описанным С1тр-зависимым формированием ламеллиподий и фокальных контактов, предполагают участие СЬр в контроле адгезионных, миграционных и инвазивных свойств клеток, изменения которых лежат в основе процесса метастазирования. Кроме того, была выявлена способность СЬр взаимодействовать с (3-тубулином и микротрубочками, что является механистической основой для возможной роли СЬр как регулятора координированных перестроек актинового и микротрубочкового цитоскелетов клеток. Наконец, в результате работы впервые была выявлена способность СЬр вызывать апоптотическую гибель клеток линии РС12ТеЮп, частично опосредованную активацией протеинкиназы ШК. Таким образом, результаты работы существенно расширяют представления о фундаментальных свойствах атипичной Мю ГТФазы СЬр. Кроме того, было выявлено частое повышение уровня транскрипта гена ЯНОУ, кодирующего белок СЬр, при немелкоклеточном раке легких человека. Высокая специфичность экспрессии ШОУ для опухолей легкого открывает перспективы использования уровня экспрессии гена ШОУ в качестве молекулярного маркера рака легких. Современные тенденции в молекулярной медицине указывают на то, что персонализированная медицина будет получать все большее распространение. Статус экспрессии гена КНОУ в перспективе может быть использован как биомаркер, используемый в диагностических и/или прогностических целях. Это определяет практическую значимость результатов работы, так как в настоящее время существуют насущная потребность в улучшении методов, как диагностики, так и лечения рака легких, одного из наиболее распространенных онкологических заболеваний человека. Полученные нами данные предполагают участие СЬр как в контроле миграционных и инвазивных свойств клеток, так и в регуляции внутриклеточных сигнальных путей, гиперактивация которых наблюдается в опухолевых клетках. Результаты данной работы являются основанием для дальнейшего исследования роли СЬр в процессах возникновения и прогрессии опухолей, а также позволяют рассматривать СЬр как потенциальную молекулярную мишень для противоопухолевой терапии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шепелев, Михаил Валентинович, 2012 год

1. Wennerberg, K, Rossman, K.L. and Der, C J. (2005) J Cell Sci, 118, 843-846.

2. Aspenstrom, P., Fransson, A. and Saras, J. (2004) Biochem J, 377, 327-337.

3. Aspenstrom, P., Ruusala, A. and Pacholsky, D. (2007) Exp Cell Res, 313, 3673-3679.

4. Boureux, A., Vignal, E., Faure, S. and Fort, P. (2007) Mol Biol Evol, 24, 203-216.

5. Chien, U.H., Lai, M., Shih, T.Y., Verma, I.M., Scolnick, E.M., Roy-Burman, P. and Davidson, N. (1979) J Virol, 31, 752-760.

6. Shih, T.Y., Williams, D.R., Weeks, M.O., Maryak, J.M., Vass, W.C. and Scolnick, E.M. (1978) J Virol, 27, 45-55.

7. Parada, L.F., Tabin, C.J., Shih, C. and Weinberg, R.A. (1982) Nature, 297, 474-478.

8. Murray, M.J., Cunningham, J.M., Parada, L.F., Dautry, F., Lebowitz, P. and Weinberg, R.A. (1983) Cell, 33, 749-757.

9. Der, C.J. and Cooper, G.M. (1983) Cell, 32, 201-208.

10. Hall, A., Marshall, C.J., Spurr, N.K. and Weiss, R.A. (1983) Nature, 303, 396-400.

11. Brown, R, Marshall, C.J., Pennie, S.G. and Hall, A. (1984) Embo J, 3, 1321-1326.

12. Capon, D.J., Seeburg, P.H., McGrath, J.P., Hayflick, J.S., Edman, U., Levinson, A.D. and Goeddel, D.V. (1983) Nature, 304, 507-513.

13. Madaule, P. and Axel, R. (1985) Cell, 41, 31-40.

14. Takai, Y., Sasaki, T. and Matozaki, T. (2001) Physiol Rev, 81, 153-208.

15. Wherlock, M. and Mellor, H. (2002) / Cell Sci, 115, 239-240.

16. Wennerberg, K. and Der, C.J. (2004) J Cell Sci, 117, 1301-1312.

17. Johnson, D.I. (1999) Microbiol Mol Biol Rev, 63, 54-105.

18. Bishop, A.L. and Hall, A. (2000) Biochem J, 348 Pt 2, 241-255.

19. Dovas, A. and Couchman, J.R. (2005) Biochem J, 390, 1 -9.

20. Schmidt, A. and Hall, A. (2002) Genes Dev, 16, 1587-1609.

21. Manser, E.J. (2002) Methods Mol Biol, 189, 3-11.

22. Lai, C.C., Boguski, M., Broek, D. and Powers, S. (1993) Mol Cell Biol, 13, 1345-1352.

23. Feig, L.A. and Cooper, G.M. (1988) Mol Cell Biol, 8, 3235-3243.

24. Powers, S., O'Neill, K. and Wigler, M. (1989) Mol Cell Biol, 9, 390-395.

25. Farnsworth, C.L. and Feig, L.A. (1991) Mol Cell Biol, 11, 4822-4829.

26. John, J., Rensland, H., Schlichting, I., Vetter, I., Borasio, G.D., Goody, R.S. and Wittinghofer, A. (1993) J Biol Chem, 268, 923-929.

27. Milburn, M.V., Tong, L., deVos, A.M., Brunger, A., Yamaizumi, Z., Nishimura, S. and Kim, S.H. (1990) Science, 247, 939-945.

28. Farnsworth, C.L., Marshall, M.S., Gibbs, J.B., Stacey, D.W. and Feig, L.A. (1991) Cell, 64, 625-633.

29. Michaelson, D., Silletti, J., Murphy, G., D'Eustachio, P., Rush, M. and Philips, M.R.2001) J Cell Biol, 152, 111-126.

30. Rossman, K.L., Worthylake, D.K., Snyder, J.T., Cheng, L., Whitehead, I.P. and Sondek, J.2002) J Biol Chem, 277, 50893-50898.

31. Lin, R., Bagrodia, S., Cerione, R. and Manor, D. (1997) Curr Biol, 7, 794-797.

32. Moon, S.Y. and Zheng, Y. (2003) Trends Cell Biol, 13, 13-22.

33. Bernards, A. (2003) Biochim Biophys Acta, 1603, 47-82.

34. Scheffzek, K., Ahmadian, M.R., Kabsch, W., Wiesmuller, L., Lautwein, A., Schmitz, F. and Wittinghofer, A. (1997) Science, 277, 333-338.

35. Aznar, S., Fernandez-Valeron, P., Espina, C. and Lacal, J.C. (2004) Cancer Lett, 206, 181191.

36. Boettner, B. and Van Aelst, L. (2002) Gene, 286, 155-174.

37. Cox, A.D. and Der, C.J. (2002) Cancer Biol Ther, 1, 599-606.

38. Fiordalisi, J.J., Holly, S.P., Johnson, R.L., 2nd, Parise, L.V. and Cox, A.D. (2002) J Biol Chem, 277, 10813-10823.

39. Ashby, M.N., King, D.S. andRine, J. (1992) Proc Natl Acad Sci USA, 89, 4613-4617.

40. Otto, J.C., Kim, E., Young, S.G. and Casey, P.J. (1999) J Biol Chem, 274, 8379-8382.

41. Notarnicola, C., Le Guen, L., Fort, P., Faure, S. and de Santa Barbara, P. (2008) Dev Dyn, 237, 1165-1171.

42. Aronheim, A., Broder, Y.C., Cohen, A., Fritsch, A., Belisle, B. and Abo, A. (1998) Curr Biol, 8, 1125-1128.

43. Katoh, M. (2002) Int J Oncol, 20, 977-982.

44. Sbrana, I., Zavattari, P., Barale, R. and Musio, A. (1998) Hum Genet, 102, 409-414.

45. Stopera, S.A., Ray, M., Riordan, D., Christie, N. and Wickstrom, D. (1990) Cancer Lett, 55, 249-253.

46. Gagos, S., Hopwood, V.L., Iliopoulos, D., Kostakis, A., Karayannakos, P., Yatzides, H., Skalkeas, G.D. andPathak, S. (1995) Anticancer Res, 15, 369-378.

47. Smolarek, T.A., Blough, R.I., Foster, R.S., Ulbright, T.M., Palmer, C.G. and Heerema, N.A. (1999) Cancer Genet Cytogenet, 108, 57-69.

48. Chun, Y.H., Kil, J.I., Suh, Y.S., Kim, S.H., Kim, H. and Park, S.H. (2000) Cancer Genet Cytogenet, 119, 18-25.

49. Guemar, L., de Santa Barbara, P., Vignal, E., Maurel, B., Fort, P. and Faure, S. (2007) Dev Biol, 310, 113-128.

50. Tao, W., Pennica, D., Xu, L., Kalejta, R.F. and Levine, A.J. (2001) Genes Dev, 15, 17961807.

51. Chenette, E.J., Abo, A. and Der, C.J. (2005) J Biol Chem, 280, 13784-13792.

52. Shutes, A., Berzat, A.C., Cox, A.D. and Der, C.J. (2004) Curr Biol, 14, 2052-2056.

53. Chenette, E.J., Mitin, N.Y. and Der, C.J. (2006) MolBiol Cell, 17, 3108-3121.

54. Weisz Hubsman, M., Volinsky, N., Manser, E., Yablonski, D. and Aronheim, A. (2007) Biochem J, 404, 487-497.

55. Kim, G.H., Park, E., Kong, Y.Y. and Han, J.K (2006) Cell Signal, 18, 553-563.

56. Tay, H.G., Ng, Y.W. and Manser, E. (2010) PLoS One, 5, el0125.

57. Yasuda, S., Taniguchi, H., Oceguera-Yanez, F., Ando, Y., Watanabe, S., Monypenny, J. andNarumiya, S. (2006) FEBS Lett, 580, 3375-3380.

58. Huang, X. and Saint-Jeannet, J.P. (2004) Dev Biol, 275, 1-11.

59. Kirikoshi, H. and Katoh, M. (2002) Int J Oncol, 20, 777-783.

60. Millar, J.K., Wilson-Annan, J.C., Anderson, S., Christie, S., Taylor, M.S., Semple, C.A., Devon, R.S., Clair, D.M., Muir, W.J., Blackwood, D.H. and Porteous, D.J. (2000) Hum Mol Genet, 9, 1415-1423.

61. Daigo, Y., Takayama, I., Ponder, B.A., Caldas, C., Ward, S.M., Sanders, K.M. and Fujino, M.A. (2004) J Gastroenterol Hepatol, 19, 211-217.

62. Chuang, Y.Y., Valster, A., Coniglio, S.J., Backer, J.M. and Symons, M. (2007) J Cell Sci, 120, 1927-1934.

63. Brazier, H., Pawlak, G., Vives, V. and Blangy, A. (2009) Int J Biochem Cell Biol, 41, 1391-1401.

64. Schiavone, D., Dewilde, S., Vallania, F., Turkson, J., Di Cunto, F. and Poli, V. (2009) Biochem J, 421, 283-292.

65. Saras, J., Wollberg, P. and Aspenstrom, P. (2004) Exp Cell Res, 299, 356-369.

66. Satoh, T., Nakamura, S., Nakafuku, M. and Kaziro, Y. (1988) Biochim Biophys Acta, 949, 97-109.

67. Alan, J.K., Berzat, A.C., Dewar, B.J., Graves, L.M. and Cox, A.D. (2010) Mol Cell Biol, 30, 4324-4338.

68. Naji, L., Pacholsky, D. and Aspenstrom, P. (2011) Biochem Biophys Res Commun, 409, 96-102.

69. Berzat, A.C., Brady, D.C., Fiordalisi, J.J. and Cox, A.D. (2005) Methods Enzymol, 407, 575-597.

70. Berzat, A.C., Buss, J.E., Chenette, E.J., Weinbaum, C.A., Shutes, A., Der, C.J., Minden, A. and Cox, A.D. (2005) J Biol Chem, 280, 33055-33065.

71. Ory, S., Brazier, H. and Blangy, A. (2007) Biol Cell, 99, 701 -716.

72. Ruusala, A. and Aspenstrom, P. (2008) Mol Cell Biol, 28, 1802-1814.

73. Lamarche, N., Tapon, N., Stowers, L., Burbelo, P.D., Aspenstrom, P., Bridges, T., Chant, J. and Hall, A. (1996) Cell, 87, 519-529.

74. Brady, D.C., Alan, J.K., Madigan, J.P., Fanning, A.S. and Cox, A.D. (2009) Mol Cell Biol, 29, 1035-1049.

75. Puto, L.A., Pestonjamasp, K., King, C.C. and Bokoch, G.M. (2003) J Biol Chem, 278, 9388-9393.

76. Sells, M.A., Knaus, U.G., Bagrodia, S., Ambrose, D.M., Bokoch, G.M. and Chernoff, J. (1997) Curr Biol, 7, 202-210.

77. Nüsse, R., van Ooyen, A., Cox, D., Fung, Y.K. and Varmus, H. (1984) Nature, 307, 131136.

78. Khosravi-Far, R., Solski, P.A., Clark, G.J., Kinch, M.S. and Der, C.J. (1995) Mol Cell Biol, 15, 6443-6453.

79. Qiu, R.G., Chen, J., Kirn, D., McCormick, F. and Symons, M. (1995) Nature, 374, 457459.

80. Qiu, R.G., Chen, J., McCormick, F. and Symons, M. (1995) Proc Natl Acad Sei USA, 92, 11781-11785.

81. Whitehead, I.P., Abe, K., Gorski, J.L. and Der, C.J. (1998) Mol Cell Biol, 18, 4689-4697.

82. Boyle, W.J., Simonet, W.S. and Lacey, D.L. (2003) Nature, 423, 337-342.

83. Brazier, H., Stephens, S., Ory, S., Fort, P., Morrison, N. and Blangy, A. (2006) J Bone Miner Res, 21, 1387-1398.

84. Cotteret, S. and Chernoff, J. (2002) Genome Biol, 3, REVIEWS0002.

85. Manning, G., Whyte, D.B., Martinez, R., Hunter, T. and Sudarsanam, S. (2002) Science, 298, 1912-1934.

86. Cotteret, S., Jaffer, Z.M., Beeser, A. and Chernoff, J. (2003) Mol Cell Biol, 23, 5526-5539.

87. Jaffer, Z.M. and Chernoff, J. (2002) IntJBiochem Cell Biol, 34, 713-717.

88. Manser, E., Leung, T., Salihuddin, H., Zhao, Z.S. and Lim, L. (1994) Nature, 367, 40-46.

89. Cullen, P.J., Schultz, J., Horecka, J., Stevenson, B.J., Jigami, Y. and Sprague, G.F., Jr. (2000) Genetics, 155, 1005-1018.

90. Lee, B.N. andElion, E.A. (1999) Proc Natl Acad Sei USA, 96, 12679-12684.

91. Elion, E.A. (2000) Curr Opin Microbiol, 3, 573-581.

92. Leberer, E., Dignard, D., Harcus, D., Thomas, D.Y. and Whiteway, M. (1992) Embo J, 11, 4815-4824.

93. Ramer, S.W. and Davis, R.W. (1993) Proc Natl Acad Sei USA, 90, 452-456.

94. Roberts, R.L. and Fink, G.R. (1994) Genes Dev, 8, 2974-2985.

95. Mosch, H.U., Roberts, R.L. and Fink, G.R. (1996) Proc Natl Acad Sei USA, 93, 53525356.

96. O'Rourke, S.M. and Herskowitz, I. (1998) Genes Dev, 12, 2874-2886.

97. Raitt, D.C., Posas, F. and Saito, H. (2000) Embo J, 19, 4623-4631.

98. Bokoch, G.M. (2003) Annu Rev Biochem, 72, 743-781.

99. Dan, I., Watanabe, N.M. and Kusumi, A. (2001) Trends Cell Biol, 11, 220-230.

100. Knaus, U.G. and Bokoch, G.M. (1998) IntJBiochem Cell Biol, 30, 857-862.

101. Lei, M., Lu, W., Meng, W., Parrini, M.C., Eck, M.J., Mayer, B.J. and Harrison, S.C. (2000) Cell, 102, 387-397.

102. Bokoch, G.M., Wang, Y., Bohl, B.P., Sells, M.A., Quilliam, L.A. and Knaus, U.G. (1996) J Biol Chem, 271, 25746-25749.

103. Zhao, Z.S., Manser, E. and Lim, L. (2000) Mol Cell Biol, 20, 3906-3917.

104. Galisteo, M.L., Chernoff, J., Su, Y.C., Skolnik, E.Y. and Schlessinger, J. (1996) J Biol Chem, 271, 20997-21000.

105. Manser, E., Loo, T.H., Koh, C.G., Zhao, Z.S., Chen, X.Q., Tan, L., Tan, I., Leung, T. and Lim, L. (1998) Mol Cell, 1, 183-192.

106. Wang, J., Frost, J.A., Cobb, M.H. and Ross, E.M. (1999) J Biol Chem, 274, 31641-31647.

107. Leeuw, T., Wu, C., Schräg, J.D., Whiteway, M., Thomas, D.Y. and Leberer, E. (1998) Nature, 391, 191-195.

108. King, C.C., Gardiner, E.M., Zenke, F.T., Bohl, B.P., Newton, A.C., Hemmings, B.A. and Bokoch, G.M. (2000) J Biol Chem, 275, 41201-41209.

109. Bokoch, G.M. (1998) Cell Death Differ, 5, 637-645.

110. Bokoch, G.M., Reilly, A.M., Daniels, R.H., King, C.C., Olivera, A., Spiegel, S. and Knaus, U.G. (1998) J Biol Chem, 273, 8137-8144.

111. Zhou, G.L., Zhuo, Y., King, C.C., Fryer, B.H., Bokoch, G.M. and Field, J. (2003) Mol Cell Biol, 23, 8058-8069.

112. Papakonstanti, E.A. and Stournaras, C. (2002) Mol Biol Cell, 13, 2946-2962.

113. Thiel, D.A., Reeder, M.K., Pfaff, A., Coleman, T.R., Sells, M.A. and Chernoff, J. (2002) CurrBiol, 12, 1227-1232.

114. Banerjee, M., Worth, D., Prowse, D.M. and Nikolic, M. (2002) Curr Biol, 12, 1233-1239.

115. Renkema, G.H., Pulkkinen, K. and Saksela, K. (2002) Mol Cell Biol, 22, 6719-6725.

116. Roig, J., Tuazon, P.T., Zipfel, P.A., Pendergast, A.M. and Traugh, J.A. (2000) Proc Natl Acad Sei USA, 97, 14346-14351.

117. Loo, T.H., Ng, Y.W., Lim, L. and Manser, E. (2004) Mol Cell Biol, 24, 3849-3859.

118. Abo, A., Qu, J., Cammarano, M.S., Dan, C., Fritsch, A., Baud, V., Belisle, B. and Minden, A. (1998)EmboJ, 17, 6527-6540.

119. Dan, C., Nath, N., Liberto, M. and Minden, A. (2002) Mol Cell Biol, 22, 567-577.

120. Pandey, A., Dan, I., Kristiansen, T.Z., Watanabe, N.M., Voldby, J., Kajikawa, E., Khosravi-Far, R., Blagoev, B. and Mann, M. (2002) Oncogene, 21, 3939-3948.

121. Yang, F., Li, X., Sharma, M., Zarnegar, M., Lim, B. and Sun, Z. (2001) J Biol Chem, 276, 15345-15353.

122. Lee, S.R., Ramos, S.M., Ko, A., Masiello, D., Swanson, K.D., Lu, M.L. and Balk, S.P. (2002) Mol Endocrinol, 16, 85-99.

123. Schrantz, N., Da Silva Correia, J., Fowler, B., Ge, Q., Sun, Z. and Bokoch, G.M. (2003) J Biol Chem,

124. Cau, J., Faure, S., Comps, M., Delsert, C. and Morin, N. (2001) J Cell Biol, 155, 10291042.

125. Mackay, D J. and Hall, A. (1998) J Biol Chem, 273, 20685-20688.

126. Wells, C.M. and Jones, G.E. (2010) Biochem J, 425, 465-473.

127. Li, X. and Minden, A. (2003) Mol Cell Biol, 23, 7134-7142.

128. Niehof, M. and Borlak, J. (2005) Mol Pharmacol, 67, 604-611.

129. Coisy-Quivy, M., Sanguesa-Ferrer, J., Weill, M., Johnson, D.S., Donnay, J.M., Hipskind, R, Fort, P. and Philips, A. (2006) Biol Cell, 98, 577-588.

130. Nekrasova, T., Jobes, M.L., Ting, J.H., Wagner, G.C. and Minden, A. (2008) Dev Biol,

131. Cotteret, S. and Chernoff, J. (2006) Mol Cell Biol, 26, 3215-3230.

132. Belmonte, M.A., Santos, M.F., Kihara, A.H., Yan, C.Y. and Hamassaki, D.E. (2006) Invest Ophthalmol Vis Sei, 47, 1193-1200.

133. Ching, Y.P., Leong, V.Y., Wong, C.M. and Kung, H.F. (2003) J Biol Chem, 278, 3362133624.

134. Kaur, R., Liu, X., Gjoerup, O., Zhang, A., Yuan, X., Balk, S.P., Schneider, M.C. and Lu, M.L. (2005) J Biol Chem, 280, 3323-3330.

135. Eswaran, J., Lee, W.H., Debreczeni, J.E., Filippakopoulos, P., Turnbull, A., Fedorov, O., Deacon, S.W., Peterson, J.R. and Knapp, S. (2007) Structure, 15, 201-213.

136. Wu, X. and Frost, J.A. (2006) Biochem Biophys Res Commun, 351, 328-335.

137. Owen, D., Mott, H.R., Laue, E.D. and Lowe, P.N. (2000) Biochemistry, 39, 1243-1250.

138. Matenia, D., Griesshaber, B., Li, X.Y., Thiessen, A., Johne, C., Jiao, J., Mandelkow, E. and Mandelkow, E.M. (2005) Mol Biol Cell, 16, 4410-4422.

139. Wu, X., Carr, H.S., Dan, I., Ruvolo, P.P. and Frost, J.A. (2008) J Cell Biochem,

140. Schmitt-Ulms, G., Matenia, D., Drewes, G. and Mandelkow, E.M. (2009) Cell Motil Cytoskeleton, 66, 661-672.141.142.143.144.145.146.147.148.149.150.151.152.153,154.155.156.157,158,159.160.161,162,163.164,165,166167168,169,

141. Gong, W., An, Z., Wang, Y., Pan, X., Fang, W., Jiang, B. and Zhang, H. (2009) Int J Cancer, 125, 548-555.

142. Ebneth, A., Drewes, G., Mandelkow, E.M. and Mandelkow, E. (1999) Cell Motil Cytoskeleton, 44, 209-224.

143. Bryan, B., Kumar, V., Stafford, L.J., Cai, Y., Wu, G. and Liu, M. (2004) J Biol Chem, 279, 45824-45832.

144. Guo, X., Stafford, L.J., Bryan, B., Xia, C., Ma, W., Wu, X., Liu, D., Songyang, Z. and Liu, M. (2003) J Biol Chem, 278, 13207-13215.

145. Hofmann, C., Shepelev, M. and Chernoff, J. (2004) J Cell Sci, 117, 4343-4354. Gnesutta, N. and Minden, A. (2003) Mol Cell Biol, 23, 7838-7848.

146. Schurmann, A., Mooney, A.F., Sanders, L.C., Sells, M.A., Wang, H.G., Reed, J.C. and Bokoch, G.M. (2000) Mol Cell Biol, 20, 453-461.

147. Zhang, M., Siedow, M., Saia, G. and Chakravarti, A. (2010) Prostate, 70, 807-816.

148. Jin, S., Zhuo, Y., Guo, W. and Field, J. (2005) J Biol Chem, 280, 24698-24705.

149. Giroux, V., Iovanna, J. and Dagorn, J.C. (2006) FASEB J, 20, 1982-1991.

150. Wang, X., Gong, W., Qing, H., Geng, Y., Zhang, Y., Peng, L., Zhang, H. and Jiang, B.2010) Tumour Biol, 31, 575-582.

151. Pavey, S., Zuidervaart, W., van Nieuwpoort, F., Packer, L., Jager, M., Gruis, N. and Hayward, N. (2006) Melanoma Res, 16, 285-296.

152. Xie, Y., Zhao, W., Wang, W., Zhao, S., Tang, R, Ying, K., Zhou, Z. and Mao, Y. (2001) Biochem Genet, 39, 117-126.

153. McCarty, S.K., Saji, M., Zhang, X., Jarjoura, D., Fusco, A., Vasko, V.V. and Ringel, M.D. (2010) Endocr Relat Cancer, 17, 989-999.

154. Wen, X., Li, X., Liao, B., Liu, Y., Wu, J., Yuan, X., Ouyang, B., Sun, Q. and Gao, X. (2009) Urology, 73, 1407-1411.

155. Wang, Y., Yu, Q., Cho, A.H., Rondeau, G., Welsh, J., Adamson, E., Mercola, D. and McClelland, M. (2005) Neoplasia, 7, 748-760.1.e, E.J., McClelland, M., Wang, Y., Long, F., Choi, S.H. and Lee, J.H. (2010) Oncol Res, 18, 401-408.

156. Zhao, W., Yang, J., Shi, W., Wu, X., Shao, B., Wu, Q., Chen, J. and Ni, L. (2011) J Mol Histol, 42, 195-203.

157. Chen, X.D., Zhao, W. and Shen, A.G. (2011) Chin J Traumatol, 14, 277-281.

158. Dabrowska, M., Skoneczny, M. and Rode, W. (2011) Tumour Biol,

159. Chevray, P.M. and Nathans, D. (1992) Proc Natl Acad Sci USA, 89, 5789-5793.

160. Cohn, M.A., Hjelmso, I., Wu, L.C., Guldberg, P., Lukanidin, E.M. and Tulchinsky, E.M. (2001) Nucleic Acids Res, 29, 3335-3346.

161. Kalinichenko, S.V., Kopantzev, E.P., Korobko, E.V., Palgova, I.V., Zavalishina, L.E., Bateva, M.V., Petrov, A.N., Frank, G.A., Sverdlov, E.D. and Korobko, I.V. (2008) Lung Cancer, 62, 173-180.

162. Liu, D.W., Chen, S.T. and Liu, H.P. (2005) Eur Respir J, 26, 1002-1008.

163. Dummler, B., Ohshiro, K, Kumar, R. and Field, J. (2009) Cancer Metastasis Rev, 28, 5163.

164. Davis, C.R., Richman, T.J., Deliduka, S.B., Blaisdell, J.O., Collins, C.C. and Johnson, D.I. (1998) JBiol Chem, 273, 849-858.

165. Ottilie, S., Miller, P.J., Johnson, D.I., Creasy, C.L., Sells, M.A., Bagrodia, S., Forsburg, S.L. and Chernoff, J. (1995)EMBOJ, 14, 5908-5919.

166. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M. and Golemis, E.A. (2000) Biotechniques, 28, 328330, 332-326.

167. Krugmann, S., Jordens, I., Gevaert, K, Driessens, M., Vandekerckhove, J. and Hall, A. (2001) CurrBiol, 11, 1645-1655.

168. Miki, H. and Takenawa, T. (2002) Biochem Biophys Res Commun, 293, 93-99.

169. Ahmed, S., Goh, W.I. and Bu, W. (2010) Semin Cell Dev Biol, 21, 350-356.

170. Kobayashi, K, Kuroda, S., Fukata, M., Nakamura, T., Nagase, T., Nomura, N., Matsuura, Y., Yoshida-Kubomura, N., Iwamatsu, A. and Kaibuchi, K. (1998) JBiol Chem, 273, 291295.

171. Watanabe, T., Wang, S., Kakeno, M., Usukura, J. and Kaibuchi, K. (2008) Cell Struct Fund, 33, 101-107.

172. Scita, G., Confalonieri, S„ Lappalainen, P. and Suetsugu, S. (2008) Trends Cell Biol, 18, 52-60.

173. Pellegrin, S. andMellor, H. (2005) CurrBiol, 15, 129-133.

174. Kravit, N.G., Regula, C.S. and Berlin, R.D. (1984) J Cell Biol, 99, 188-198.

175. Best, A., Ahmed, S., Kozma, R. and Lim, L. (1996) JBiol Chem, 271, 3756-3762.

176. Wittmann, T., Bokoch, G.M. and Waterman-Storer, C.M. (2003) J Cell Biol, 161, 845-851.

177. Wittmann, T., Bokoch, G.M. and Waterman-Storer, C.M. (2004) JBiol Chem, 279, 61966203.

178. Vadlamudi, R.K., Barnes, C.J., Rayala, S., Li, F., Balasenthil, S., Marcus, S., Goodson, H.V., Sahin, A.A. and Kumar, R. (2005) Mol Cell Biol, 25, 3726-3736.

179. Xu, Z., Kukekov, N.V. and Greene, L.A. (2003) EMBO J, 22, 252-261.

180. Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. and Bujard, H. (1995) Science, 268, 1766-1769.

181. Etienne-Manneville, S. and Hall, A. (2002) Nature, 420, 629-635.

182. Bazenet, C.E., Mota, M.A. and Rubin, L.L. (1998) Proc Natl Acad Sei USA, 95, 39843989.

183. Chuang, T.H., Hahn, K.M., Lee, J.D., Danley, D.E. and Bokoch, G.M. (1997) Mol Biol Cell, 8, 1687-1698.

184. Su, J.L., Lin, M.T., Hong, C.C., Chang, C.C., Shiah, S.G., Wu, C.W., Chen, S.T., Chau, Y.P. and Kuo, M.L. (2005) Carcinogenesis, 26, 1-10.

185. Degterev, A., Boyce, M. and Yuan, J. (2003) Oncogene, 22, 8543-8567.

186. Dhanasekaran, D.N. and Reddy, E.P. (2008) Oncogene, 27, 6245-6251.

187. Xia, Z., Dickens, M., Raingeaud, J., Davis, R.J. and Greenberg, M.E. (1995) Science, 270, 1326-1331.

188. Kummer, J.L., Rao, P.K. and Heidenreich, K.A. (1997) JBiol Chem, 212, 20490-20494.

189. Ham, J., Eilers, A., Whitfield, J., Neame, S.J. and Shah, B. (2000) Biochem Pharmacol, 60, 1015-1021.

190. Xu, Z., Maroney, A.C., Dobrzanski, P., Kukekov, N.V. and Greene, L.A. (2001) Mol Cell Biol, 21,4713-4724.

191. Davydov, M.I. (2009) Journal of N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, 20,91.

192. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Murray, T., Xu, J., Smigal, C. and Thun, M.J. (2006) CA Cancer J Clin, 56, 106-130.

193. Mazieres, J., He, B., You, L., Xu, Z. and Jablons, D.M. (2005) Cancer Lett, 222, 1-10.

194. You, L., He, B., Xu, Z., Uematsu, K., Mazieres, J., Mikami, I., Reguart, N., Moody, T.W., Kitajewski, J., McCormick, F. and Jablons, D.M. (2004) Oncogene, 23, 6170-6174.

195. He, B., You, L., Uematsu, K., Xu, Z., Lee, A.Y., Matsangou, M., McCormick, F. and Jablons, D.M. (2004) Neoplasia, 6, 7-14.

196. Liu, Y., Wang, Y., Zhang, Y., Miao, Y., Zhao, Y., Zhang, P.X., Jiang, G.Y., Zhang, J.Y., Han, Y., Lin, X.Y., Yang, L.H., Li, Q.C., Zhao, C. and Wang, E.H. (2009) Lung Cancer, 63, 375-382.

197. Yuan, K., Qian, C. and Zheng, R. (2009) Med Sci Monit, 15, BR313-319.

198. Zhang, C., Zhou, F., Li, N., Shi, S., Feng, X., Chen, Z., Hang, J., Qiu, B., Li, B., Chang, S., Wan, J., Shao, K., Xing, X., Tan, X., Wang, Z., Xiong, M. and He, J. (2007) Ann Surg Oncol, 14, 2628-2635.

199. Zhang, P., Zhang, Z., Li, X., Lei, J., Su, K. and Wang, X. (2010) Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 13,598-601.

200. Han, Y., Wu, Y., Gao, S., Xu, Y., Guan, Z., Qiu, X. and Wang, E. (2008) Zhongguo Fei Ai ZaZhi, 11, 391-397.

201. Shikada, Y., Yoshino, I., Okamoto, T., Fukuyama, S., Kameyama, T. and Maehara, Y. (2003) Clin Cancer Res, 9, 5282-5286.

202. Wang, S., Yan-Neale, Y., Fischer, D., Zeremski, M., Cai, R., Zhu, J., Asselbergs, F., Hampton, G. and Cohen, D. (2003) Oncogene, 22, 6204-6213.

203. Mazieres, J., Tovar, D., He, B., Nieto-Acosta, J., Marty-Detraves, C., Clanet, C., Pradines, A., Jablons, D. and Favre, G. (2007) BMC Cancer, 7, 220.

204. Sato, N., Fukui, T., Taniguchi, T., Yokoyama, T., Kondo, M., Nagasaka, T., Goto, Y., Gao, W„ Ueda, Y., Yokoi, K., Minna, J.D., Osada, H., Kondo, Y. and Sekido, Y. (2007) Int J Cancer, 120, 543-551.

205. Arias-Romero, L.E. and Chernoff, J. (2010) Small Gtpases, 1, 124-128.