Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Колобов Алексей Александрович

• Колобов Алексей Александрович
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Колобов Алексей Александрович

1.1. Актуальность темы исследования

1.2. Степень разработанности темы

1.3. Цель

1.4. Методология и методы исследования

1.5. Научная новизна

1.6. Теоретическая и практическая значимость работы

1.7. Положения, выносимые на защиту

1.8. Апробация результатов

1.9. Личное участие автора в получении результатов

1.10. Структура и объём диссертации

2. Обзор литературы

2.1. Структура и функции цитокинов группы ИЛ-36

2.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1

2.1.2. Структура генов ИЛ-36

2.1.3. Профиль экспрессии генов ИЛ-36

2.1.4. Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов

2.1.5. Секреция ИЛ-36

2.1.6. Пост-трансляционные модификации и процессинг ИЛ-36

2.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1

2.1.8. Биологические функции ИЛ-36

2.2. Псориаз и цитокины группы ИЛ-36

2.2.1. Клинико-демографическая характеристика псориаза

2.2.2. Современные представления о патогенезе псориаза

2.2.3. Роль ИЛ-36 в патогенезе псориаза

2.2.4. Лечение псориаза и антицитокиновая терапия

3. Материалы и методы исследования

3.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА

3.1.1. Штаммы бактерий

3.1.2. Получение компетентных клеток E.coli для электротрансформации

3.1.3. Электротрансформация клеток E. coli

3.1.4. Отбор трансформированных клонов

3.1.5. Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E. coli

3.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА

3.2.1. Криоконсервация культур штаммов-продуцентов ИЛ-36РА

3.2.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах

3.2.3. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в биореакторе (ферментере)

3.3. Лизис биомассы клеток штаммов-продуцентов ИЛ-36РА

3.4. Осветление лизата биомассы клеток штамма-продуцента ИЛ-36РА

3.4.1. Флоккуляция

3.4.2. Кислотное фракционирование

3.5. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА

3.5.1. Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow

3.5.2. Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow

3.5.3. Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S

3.5.4. Аффинная хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами к ИЛ-36РА

3.5.4.1. Иммобилизация антител на сорбенте

3.5.4.2. Аффинная хроматография

3.6. Ультрафильтрационное концентрирование раствора ИЛ-36РА

3.7. Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия

3.8. Вестерн блот для определения ИЛ-36РА

3.9. Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114

3.10. Очистка растворов от Triton X-114 с помощью диализа

3.11. Количественное определение ЛПС

3.12. Количественное определение содержания ИЛ-36РА в растворах

3.12.1. Спектрофотометрическое определение

3.12.2. Биуретовый метод с бицинхонициновой кислотой

3.12.3. Определение концентрации ИЛ-36РА методом ИФА

3.13. Оценка биологической активности ИЛ-36РА in vitro с использованием тест-системы на основе клеточной линии А549

3.13.1. Культивирование клеток А549+36

3.13.2. Оценка биологической активности ИЛ-36РА

3.13.3. Определение концентрации ИЛ-8 методом ИФА

3.13.4. Расчет активности образцов ИЛ-36РА

3.14. Искусственное окисление ИЛ-36РА

3.15. Искусственное дезамидирование ИЛ-36РА

3.16. ВЭЖХ анализ чистоты и гомогенности ИЛ-36РА

3.16.1. ОФ-ВЭЖХ для определения чистоты ИЛ-36РА

3.16.2. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси непроцессированной и окисленной форм ИЛ-36РА

3.16.3. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси Triton X-114

3.16.4. ГП-ВЭЖХ для определения агрегатов ИЛ-36РА

3.17. Определение примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА с помощью капиллярного изоэлектрофокусирования

3.18. Динамическое светорассеяние

3.19. Статистическая обработка результатов

4. Результаты и обсуждение

4.1. Получение штамма-продуцента ИЛ-36РА, исследование биологических свойств ИЛ-36РА

4.1.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основе E. coli BL21[DE3]

4.1.2. Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммами-продуцентами безметионинового ИЛ-36РА

4.1.3. Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА

4.1.4. Изучение биологической активности ИЛ-36РА

4.1.4.1. Сравнение биологической активности ИЛ-36РА от различных штаммов-продуцентов

4.1.4.2. Биологическая активность ИЛ-36РА в модели псориазоподобного дерматита на мышах

4.1.5. Масштабирование культивирования штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА

4.2. Разработка методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА

4.2.1. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в исследовательском масштабе, исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА

4.2.1.1. Отработка условий лизиса биомассы штамма-продуцента в лабораторном масштабе

4.2.1.2. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в лабораторном масштабе

4.2.1.3. Изучение гетерогенности ИЛ-36РА

4.2.1.4. Оптимизация условий хранения ИЛ-36РА

4.2.2. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА в масштабе лабораторного производства

4.2.2.1. Оптимизация метода лизиса биомассы штамма-продуцента и осветление лизатов методом флоккуляции

4.2.2.2. Масштабирование метода очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии

4.2.2.3. Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114

4.2.2.4. Метод очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии: материальный баланс

4.2.3. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА в масштабе пилотного промышленного производства

4.2.3.1. Оптимизация метода кислотного фракционирования лизата биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА

4.2.3.2. Оптимизация метода очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии

4.2.3.3. Метод очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии: материальный баланс

5. Заключение

6. Выводы

7. Список сокращений

8. Список литературы

9. Приложение

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств»

1.1. Актуальность темы исследования

Работа проводилась в рамках проекта по разработке перспективных подходов к терапии псориаза.

Псориаз является многофакторным заболеванием, поражающим до 5% населения в экономически развитых странах. Псориатический артрит развивается у 5-25% больных псориазом, проявляется симметричными деструктивными изменениями суставов [17]. В России проживает более 300 тысяч больных псориазом [2]. Помимо вульгарного псориаза выделяют более тяжёлые формы заболевания, характеризующиеся обширными болезненными высыпаниями, их особенной локализацией, образованием пустул, поражением суставов и системными расстройствами. Наиболее тяжёлой формой псориаза является генерализованный пустулёзный псориаз (ГПП).

Для лечения среднетяжелых и тяжелых форм псориаза, наряду со средствами местного лечения и системными иммунодепрессантами [64] в последние год широкое применение получили фармацевтические препараты с антицитокиновой активностью. Высокую клиническую эффективность демонстрируют препараты, нейтрализующие биологическую активность фактора некроза опухолей-альфа [113], блокаторы рецептора интерлейкина (ИЛ)-12 и ИЛ-23 [101], терапевтические антитела против ИЛ-17А [112].

Важную роль в активации и поддержании воспаления в коже, пораженной псориазом, играют цитокины семейства ИЛ-36. Это семейство включает три провоспалительных цитокина - ИЛ-36а, ИЛ-36Р и ИЛ-36у - и специфический антагонист рецептора ИЛ-36 (ИЛ-36РА). Ряд мутаций в гене ¡ЬЗбКЫ, кодирующем ИЛ-36РА, способен вызывать развитие генерализованного пустулёзного псориаза.

Предполагается, что блокада активации рецептора ИЛ-36 с помощью введения рекомбинантного ИЛ-36РА человека может быть высокоэффективным подходом к терапии данного дерматоза. В связи с этим разработка новых лекарственных средств на основе ИЛ-36РА для лечения псориаза является актуальной задачей.

Настоящее исследование посвящено разработке методик получения рекомбинантного ИЛ-36РА человека в бактериальном продуценте и его очистки, а также изучению физико-химических свойств и биологической активности полученного цитокина. Результаты

проведенных исследований легли в основу лабораторного и опытно-промышленного регламентов получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА.

1.2. Степень разработанности темы

Наиболее тяжёлые формы псориаза, такие как генерализованный пустулёзный псориаз, не отвечают на обычную терапию. Для их лечения активно применяют различные антицитокиновые иммуносупрессивные препараты. Это этанерцепт (внеклеточный домен рецептора ФНОа, сшитый с Fc-фрагментом IgG1 человека), инфликсимаб и адалимумаб (моноклональные антитела к ФНОа) [113], секукинумаб (моноклональные антитела к ИЛ-17А) [112], устекинумаб (моноклональные антитела к общей для ИЛ-12 и ИЛ-23 субъединице p40) [101] и др. Однако, эти препараты обладают системными побочными эффектами [45, 84, 112]. В связи с этим разработка препаратов, селективно действующих на уровне наружных кожных покровов, например, ингибирующих активность ИЛ-36, является актуальной практической задачей [32].

В настоящее время разрабатывается несколько таких препаратов. Моноклональные антитела к рецептору ИЛ-36 независимо получены компаниями Boehringer Ingelheim (Германия) [44] и Anaptys Bio (США) [156]. Оба препарата находятся на первой стадии клинических испытаний. Преимущество разрабатываемого препарата на основе рекомбинантного ИЛ-36РА человека в использовании при его производстве прокариотического продуцента и неаффинных методов очистки, что обуславливает меньшую стоимость его производства. Получение ИЛ-36РА с отщеплённым N-концевым остатком метионина (безметионинового) позволяет добиться максимальной биологической активности препарата.

1.3. Цель

Цель данной работы - получение рекомбинантного безметионинового антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств

Задачи:

1. Создать бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного безметионинового ИЛ-36РА человека

2. Разработать технологию получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА

3. Изучить физико-химические свойства полученного ИЛ-36РА

4. Изучить биологические свойства полученного ИЛ-36РА

1.4. Методология и методы исследования

В ходе работы создан штамм-продуцент на основе E. coli BL21[DE3], синтезирующий растворимый биологически активный рекомбинантный ИЛ-36РА человека с отщепленным N-концевым остатком метионина. Для этого штамм трансформирован плазмидой, несущей ген, кодирующий ИЛ-36РА человека, и плазмидой, несущей ген метионинаминопептидазы E. coli. Разработана схема двухстадийной хроматографической очистки ИЛ-36РА, включающей катионообменную и гидрофобную хроматографию. Изучены пост-трансляционные модификации полученного препарата ИЛ-36РА, показана способность ИЛ-36РА к спонтанному дезамидированию при значениях рН среды выше 7, показана зависимость биологической активности ИЛ-36РА от отщепления N-концевого инициаторного остатка метионина. Биологическая активность полученного препарата ИЛ-36РА подтверждена in vitro в модельной системе на основе клеточной линии А549. Также показана способность полученного препарата ИЛ-36РА купировать индуцированный псориазоподобный фенотип у мышей при подкожном введении.

1.5. Научная новизна

Технология получения безметиониновых белков, состоящая в создании штамма, несущего плазмиду с геном интереса и плазмиду с геном метионинаминопептидазы, применена по отношению к ИЛ-36РА впервые. Кроме того, впервые исследованы пост-трансляционные модификации ИЛ-36РА, изучено их влияние на его биологическую активность, подобраны условия выделения и очистки ИЛ-36РА, минимизирующие эти изменения.

Впервые разработана технология получения биологически активного ИЛ-36РА, позволяющая получать до 10 г высокоочищенного ИЛ-36РА из 160 л культуры в течение трехнедельного производственного цикла.

1.6. Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА, позволяющее более полно понимать механизм действия этого цитокина в организме млекопитающих, определяет теоретическую значимость работы. Тот факт, что ИЛ-36РА человека способен купировать псориазоподобный фенотип у мышей, является прямым доказательством структурной схожести ИЛ-36РА человека и мыши, и косвенным доказательством относительно недавнего возникновения семейства ИЛ-36 в эволюции.

Практическая ценность работы состоит в разработке промышленной технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА человека с доказанной биологической активностью, на основе которой изготавливается готовая лекарственная форма ИЛ-36РА в виде раствора для подкожного введения, 5 мг/мл. Успешно завершены доклинические испытания эффективности и безопасности препарата в качестве кандидатного лекарственного средства для терапии тяжёлых форм псориаза.

1.7. Положения, выносимые на защиту

1. Создана серия штаммов-продуцентов безметионинового рекомбинантного ИЛ-36РА человека на основе E. coli BL21[DE3]. Установлено, что штамм E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) наиболее продуктивен и обеспечивает получение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формы менее 5%.

2. Биологическая активность получаемого ИЛ-36РА соответствует биологической активности коммерческого стандартного препарата.

3. Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7,0 препарат ИЛ-36РА подвергается дезамидированию.

4. Подобраны условия выделения и хранения ИЛ-36РА, минимизирующие его дезамидирование.

5. Впервые разработан метод получения ИЛ-36РА, позволяющий получать 8-10 г высокоочищенного ИЛ-36РА за один производственный цикл (заявка на патент РФ № 2017103888 от 06.02.2017).

1.8. Апробация результатов

Основные результаты работы изложены в статьях:

Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Кудлинг Т.В., Карасев М. М., Калинин Р.С., Хижина А.А., Нимирицкий П.П., Стефанов В.Е., Петров А.В. 2017. Получение ИЛ-36РА человека в Escherichia coli при коэкспресии с метионинаминопептидазой E. coli. I. Сравнение продукции ИЛ-36РА различными штаммами. Цитология. 59 (7): 482-488

Колобов А. А., Кондратьева Е.В., Шарафутдинова Т.А., Калинин Р.С., Нимирицкий П.П., Стефанов В.Е., Петров А.В. 2017 Получение ИЛ-36РА человека в Escherichia coli при коэкспресии с метионинаминопептидазой E. coli. II. Сравнение биологической активности ИЛ-36РА от различных штаммов. Цитология. 59 (8): 534-538

Также результаты работы представлены на ряде конференций: в виде постерных докладов на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург 2015, 2016, 2017) и в виде устного доклада на всероссийском научном форуме «Дни Иммунологии» (Санкт-Петербург, 2017).

Всего по теме диссертации опубликовано 2 статьи, 5 тезисов докладов и подана 1 заявка на патент РФ (№ 2017103888 от 06.02.2017).

Работа прошла практическую апробацию. Препарат ИЛ-36РА, полученный по разработанной методике, успешно прошёл доклинические испытания в качестве кандидатного лекарственного средства для терапии тяжёлых форм псориаза.

1.9. Личное участие автора в получении результатов

Личный вклад автора состоит в личном участии в проведении всех этапов работ: в организации и проведении экспериментов, планировании работ, подборе и оптимизации производственных и аналитических методик, теоретическом обобщении и статистической обработке результатов, подготовке к публикации статей, патентов и отчётов по теме, а также в руководстве научной группой. Экспериментальная часть работы выполнена на базе ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России.

Ряд исследований проведён совместно с сотрудниками ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» Кондратьевой Е.В., Кудлинг Т.В. (генная инженерия) и к.м.н. Петровым А.В. (тестирование биологической активности ИЛ-36РА). Работы по культивированию штамма-продуцента ИЛ-36РА в пилотном биореакторе проводились на базе ИБФМ РАН под руководством к.б.н. Самойленко В.А..

Все полученные совместно результаты опубликованы или в настоящее время по ним готовятся совместные публикации. Соискатель приносит соавторам и коллегам свою искреннюю благодарность.

1.10. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, иллюстрирована 58 рисунками, 5 таблицами и 1 приложением. Список литературы содержит 178 литературных источников.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура и функции цитокинов группы ИЛ-36

2.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1

Семейство ИЛ-1 включает 12 членов (Таблица 1). Группа интерлейкинов 36 (ИЛ-36) входит в него и включает три провоспалительных цитокина ИЛ-36 а, в, у и один противовоспалительный - рецепторный антагонист интерлейкинов 36 (ИЛ-36РА) [48]. Все они были открыты в 1999-2000 годах [11, 71, 123, 167] и фигурируют в литературе под рядом различных названий. Современная номенклатура белков семейства ИЛ-1 была утверждена в 2010 году [33] (Таблица 1).

Таблица 1. Цитокины семейства ИЛ-1, их рецепторы и функции [121, 152].

Название Синонимы Рецептор Корецептор Основная функция

ИЛ-1а 1Ь-1Б1 Ш-1М IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-1Р 1Ь-1Б2 Ш-1М Ш-ЖАсР Провоспалительная

ИЛ-1РА 1Ь-1Б3 Ш-1М - Рецепторный антагонист

ИЛ-18 1Ь-1Б4 Ш-^р Провоспалительная

ИЛ-33 1Ь-1Б11 1Ь-1КЬ1 IL-1RAcР Провоспалительная

ИЛ-36а 1Ь-1Б6, 1Ь-1е 1Ь-36Я IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-36Р 1Ь-1Б8, 1Ь-1И2, 1Ь-1п 1Ь-36Я ГЬ-ЖАсР Провоспалительная

ИЛ-36у 1Ь-1Б9, 1Ь-1И1, 1Ь-1е, 1Ь-1ЯР2 1Ь-36Я IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-36РА 1Ь-1Б5, 1Ь-15, ГЬ-1КР3, 1Ь-1ИУ1, 1Ь-1Ь1 1Ь-36Я Рецепторный антагонист

ИЛ-37 1Ь-1Б7, 1Ь-1ЯР1, 1Ь-1Н, 1Ь-1Н4, 1Ь-1^ IL-18Rа IL-1R8 (1Ж8, IL-1RAPL-1, БЮШК) Противовоспалительная

ИЛ-38 ГЬ-1Б10, ТЬ-10, ТЬ-1НУ2 ТЬ-36Я - Противовоспалительная

В настоящее время ИЛ-36 рассматриваются как часть суперсемейства ИЛ-1 [121], т.к. они имеют ряд общих свойств. В первую очередь это структурная близость самих молекул [53] и их рецепторов [150]. Так, хотя рецепторной субъединицей ИЛ-1 (ИЛ-1 а, в и ИЛ-1РА) является IL-1R1 [142], а рецепторной субъединицей ИЛ-36 (ИЛ-36 а, в, у и ИЛ-36РА) является IL-36R, корецепторная субъединица у обеих групп общая - IL-1RAcP [48].

Для ИЛ-36, как и для ИЛ-1, характерна регуляция воспаления по принципу обратной связи с помощью рецепторных антагонистов соответствующих цитокинов (ИЛ-1РА, ИЛ-36РА). Они способны связывать рецептор, не активируя его, т.к. их связывание делает невозможной димеризацию рецептора с корецептором [53]. Причиной ряда хронических воспалительных заболеваний являются мутации в генах рецепторных антагонистов ИЛ-1 [158] и ИЛ-36 [118].

Большая часть белков семейства ИЛ-1 синтезируется в виде биологически неактивных предшественников, для активации которых необходим протеолиз [4].

2.1.2. Структура генов ИЛ-36

Высокая схожесть свойств различных членов семейства ИЛ-1 может указывать на их эволюционное родство [34]. В пользу этого также говорит близкое расположение генов всех членов семейства ИЛ-1 кроме ИЛ-18 [97] и ИЛ-33 [116] на длинном плече второй хромосомы (2^73) [96]. Гены цитокинов ИЛ-1а, ИЛ-1Р и ИЛ-1РА находятся в интервале 430 т.п.н. Между генами, кодирующими ИЛ-1Р и ИЛ-1РА, в интервале 300 т.п.н. находятся гены, кодирующие ИЛ-37, ИЛ-36у, ИЛ-36а, ИЛ-36Р, ИЛ-36РА и ИЛ-38 [96] (Рисунок 1).

Рисунок 1. Схема расположения генов цитокинов семейства ИЛ-1 на длинном плече второй хромосомы человека (2д73) [174].

Близость генов семейства ИЛ-1 на хромосоме может определять возможность их совместной транскрипции одним комплексом транскрипционных факторов [119]. Вероятно, это является одним из механизмов регуляции функции этих генов.

В генах большинства членов семейства ИЛ-1 присутствуют три т.н. общих экзона (common exons, CE). Они кодируют последовательность центральной части молекулы белка, состоящей из двенадцати Р-складок (S1-S12) с одиннадцатью петлями. Экзон CE1 кодирует мотивы S1-S3, CE2 кодирует S4-S6 и большую часть S7, а CE3 кодирует остаток S7 и S8-S12 [35, 96].

Часть представителей группы ИЛ-36 имеет иное строение генов. Гены ИЛ-36а и ИЛ-36РА устроены типично [21]. Ген ИЛ-36а содержит четыре экзона, из них экзон 1 кодирует 5' нетранслируемую область, а экзоны 2-4 соответствуют общим экзонам CE1-CE3 [21]. Ген ИЛ-36Р имеет 6 экзонов, из них экзон 1 кодирует 5' нетранслируемую область, а остальные кодируют последовательность белка.

2.1.3. Профиль экспрессии генов ИЛ-36

Экспрессия генов ИЛ-36 происходит в норме в ряде тканей, преимущественно эпителиальных, и активируется при развитии воспаления. В коже наиболее активно экспрессируется ген IL36G, кодирующий ИЛ-36у. Его экспрессия фиксируется в кератиноцитах дифференцирующихся слоев эпидермиса, но не в меланоцитах, фибробластах или эндотелиоцитах [123]. Слабая экспрессия генов ИЛ-36а, Р, у показана также в миндалинах, легких, кишечнике, пищеводе [34], мозге [48] и в клетках иммунной системы: дендритных клетках [132], моноцитах/макрофагах, Т-лимфоцитах [103] и нейтрофилах [18].

Наибольшую роль в развитии воспаления в коже играет ИЛ-36у, т.к. среди всех провоспалительных ИЛ-36 только он конститутивно продуцируется в коже [32] и его уровень сильнее всего повышается при псориатическом воспалении [163]. Увеличение экспрессии гена IL36G в коже обнаруживается также на фоне реакции гиперчувствительности [34]. В клетках эпителия трахеи и бронхов повышенная экспрессия гена IL36G наблюдался у пациентов с астмой в ответ на контакт с антигеном [133, 163].

Изучение промоторной области IL36G показало, что одним из транскрипционных факторов, активирующих его экспрессию в клетках миелоидного ряда, является T-bet [155]. Этот фактор играет ключевую роль в развитии Тх-1 иммунного ответа и выработке ИФНу [74]. Однако, этот фактор не продуцируется кератиноцитами, и поэтому не важен для продукции

основной массы ИЛ-36у. В кератиноцитах одним из активаторов экспрессии IL36G является фактор Nrf2, стимулирующий также пролиферацию кератиноцитов [72]. При этом обработка ИЛ-36у также стимулирует пролиферацию кератиноцитов, формируя таким образом петлю положительной обратной связи, вероятно, играющую ключевую роль в хронических воспалительных заболеваниях кожи [72].

Экспрессия IL36G в клетках эпителия бронхов [27] и кератиноцитах [22, 79] стимулируется фактором некроза опухоли а (ФНОа), ИЛ-17, ИЛ-1в и интерфероном у (ИФНу). Наиболее сильно экспрессия гена IL36G повышалась в ответ на совместную обработку парой ИЛ-1в и ФНОа или ИЛ-17А и ИЛ-22, однако ИЛ-22 сам по себе такого эффекта не давал [163]. Экспрессия IL36G активируется также лигандами Toll-like рецепторов (TLR), такими как двуцепочечная РНК или её синтетический аналог полиинозин-полицитидиловая кислота (pI:C) и флагеллин [79]. Кератиноциты ротовой полости человека отвечали повышением экспрессии IL36G, но не секрецией ИЛ-36у на обработку лизофосфатидной кислотой, обычно применяемой как активатор ранозаживления [129].

Конститутивная экспрессия гена IL36RN, кодирующего ИЛ-36РА, наблюдается прежде всего в кератиноцитах, приэтом уровень ее повышается в псориатических бляшках [15]. IL36RN также экспрессируется в почках, мозге и тимусе, преимущественно в эпителиальных клетках, либо клетках макрофагального ряда [11, 96, 163].

Ген IL1RL2, кодирующий специфический рецептор ИЛ-36, экспрессируется в коже, лёгких, яичках и глиальных клетках мозга [13, 85] в следующих типах клеток: в кератиноцитах и клетках эпителия почечных канальцев, эпителиоцитах бронхов и альвеол, фибробластах дермы, бронхов и легких [27, 133], синовиальных фибробластах и суставных хондроцитах [88], адипоцитах [9], моноцитах и макрофагах [138], а также в зрелых дендритных клетках (ДК) моноцитарного происхождения и плазмоцитоидных ДК, но не миелоидных ДК [95], микроглии ЦНС [6]. Экспрессия гена этого рецептора характерна также для CD4+ T-лимфоцитов мышей, особенно Th1 и Th2 [22, 138].

2.1.4. Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов

Методом рентгеноструктурного анализа было показано, что ИЛ-36РА и ИЛ-36у имеют типичную для белков семейства ИЛ-1 структуру в-трилистника [35, 53] (Рисунок 2). Учитывая высокую гомологичность аминокислотных последовательностей ИЛ-36а и ИЛ-36в по

сравнению с ИЛ-36у и их способность взаимодействовать с общим рецептором, предполагается, что их структура похожа на описанную [34].

Рисунок 2. Схема третичной структуры молекулы ИЛ-36РА мыши [35].

Рецептор ИЛ-36 устроен подобно рецептору ИЛ-1. Он состоит из внеклеточного домена, спирального трансмембранного домена, единожды принизывающего мембрану, и внутриклеточного Toll/IL-1 receptor (TIR) домена [46, 133]. Внеклеточный домен содержит три Ig-подобных домена, связанных дисульфидными связями [150], что характерно для рецептов цитокинов семейства ИЛ-1 [136, 142]. Гликозилизование по Asn41, Asn234 и Asn250 критически важно для экстернализации рецептора, но не для связывания лиганда [150]. После присоединения к комплексу рецептор-лиганд корецептора внутриклеточные TIR-домены рецептора и корецептора взаимодействуют и активируют содержащие TIR-домен белки внутри клетки, такие как MyD88, IRAKI или IRAK2, активируя NF-кВ сигнальный каскад [42].

Несмотря на схожесть самих цитокинов групп ИЛ-36 и ИЛ-1 и их рецепторов, существуют различия в их механизмах рецепции. И в случае цитокинов группы ИЛ-1, и в случае цитокинов группы ИЛ-36 при связывании рецептора с лигандом образовавшийся комплекс привлекает корецепторную субъединицу IL-1AcP (IL-1 Accessory protein), общую для обеих групп [53]. При этом, если в случае ИЛ-1 рекрутирующее IL-1AcP взаимодействие

происходит при участии молекулярной поверхности лиганда и конформационно изменившегося рецептора, то в случае ИЛ-36 боковые цепи лигандов не играют такой роли.

Области ИЛ-1, взаимодействующие с IL-1RAcP - это петли Р4/5 и Р11/12 (петля между 4 и 5 или 11 и 12 Р-складками, соответственно). Остатки Asp54 в Р4/5 и Asp145 в Р11/12 образуют водородные связи с А^286 и Ser185, соответственно, в составе корецепторной субъединицы. В молекуле ИЛ-1РА петля Р4/5 слишком коротка для взаимодействия с корецептором, а на соответвующей позиции в петле Р11/12 находится положительно-заряженный Lys145, что делает невозможным прикрепление корецептора к лиганду [127, 142].

В молекуле в ИЛ-36у аминокислотные остатки на соответвующих позициях иные. А^71 в Р4/5 занят созданием связи внутри молекулы ИЛ-36у, а на изгибе петли Р11/12 находятся незаряженная аминокислота А1а162. А ИЛ-36РА больше структурно похож на ИЛ-1, т.к. имеет отрицательно заряженный Asp148 в Р11/12, из-за чего у него изначально предполагали способность активировать рецептор [35]. Вероятно, при формирования комплекса ИЛ-36-рецептор-корецептор эти петли не играют той роли, что в случае ИЛ-1 [53]. По этой причине потерпели неудачу попытки создать химерную молекулу с повышенной деактивирующей рецептор ИЛ-36 активностью при замене этих петель в молекулах ИЛ-36у и ИЛ-36РА [53].

2.1.5. Секреция ИЛ-36

Несмотря на увеличение экспрессии генов ИЛ-36 при воспалении, секреция белков наблюдается не всегда [27, 163]. Причиной этого может быть то, что ИЛ-36 не содержат секреторного пептида, отщепляемого сигнальной пептидазой, их секреция происходит по неканоническому пути [123]. Это характерно и для прочих представителей семейства ИЛ-1, кроме ИЛ-1РА [135].

ИЛ-36у секретируется различными видами клеток в ответ на различные маркеры повреждения или инфекции. ИЛ-36у секретируется кератиноцитами в ответ на обработку кателицидином, антимикробным пептидом, уровень которого значительно повышен в коже при псориатическом воспалении [77]. Однако кератиноциты секретируют ИЛ-36у только в присутствии в среде АТФ, который считается маркером тканевого повреждения [163]. АТФ в среде также необходим для секреции ИЛ-1Р [54]. Кератиноциты или эпителиоциты бронхов секретируют ИЛ-36у в ответ на обработку двуцепочечной РНК или её синтетическим аналогом полиинозин-полицитидиновой кислотой (р1:С). ИЛ-36у при этом выходит через разрывы в мембране, образованные под действием протеаз каспазы-3 и каспазы-7 - в результате пироптоза

[27, 79]. Пироптоз отличается от апоптоза доминирующей активностью каспазы-1 и наличием активных инфламмасом. В случае апоптоза содержимое клетки, способное вызвать воспаление, изолируется в апоптотических тельцах. В случае пироптоза активные провоспалительных цитокины и другие маркеры тканевого повреждения выходят в межклеточное пространство, начинается воспаление [61]. Таким образом, ИЛ-36у может функционировать, в том числе, как алармин при вирусных инфекциях эпителиев [79].

Другие типы клеток способны секретировать ИЛ-36у иначе. Так, в ответ на бактериальную инфекцию ИЛ-36у секретируется макрофагами лёгких по Гольджи-независимому пути в составе микрочастиц и экзосом [69].

2.1.6. Пост-трансляционные модификации и процессинг ИЛ-36

Помимо того, что было показано отсутствие сайтов гликозилирования у ИЛ-36РА [11], исследование пост-трансляционных модификаций ИЛ-36 до сих пор сводится, в основном, к вопросам их процессинга. Для получения полной биологической активности всем членам группы ИЛ-36 необходимо отщепление части аминокислот с N-конца молекулы [134]. Предположили, что процессинг ИЛ-36 происходит, как у прочих членов семейства ИЛ-1. В результате такого процессинга N-терминальным а.о. в последовательности остаётся а.о., расположенный на удалении в 9 а.о. от мотива A-X-Asp (где А - а.о. с алифатическим боковым радикалом) [4, 46, 134]. Экспериментально доказали, что биологическая активность процессированных таким образом ИЛ-36 возросла в 103-104 раз [134] (Рисунок 3).

IL-36Ra.............--MVLSGALCFRMKDSALKVLYLHNNQLLAGGLHAGKVIK

IL-Зба............MEKALKIDTPQRGSIQDINHRVWVLQDQTLIAVPRKDRMS PV

IL-Збр......-.....MNPQREAAPKSYAIRDSRQMVWVLSGNSLIAAPLSRSIKPV

II-Збу MRGTPGDADGGGRAVYQSMCKPITGTINDINQQVWTLQGQNLVAVPRSDSVTPV

consensus ..............xxxxxxxxx@xdxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

Рисунок 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей N-концов непроцессированных молекул ИЛ-36 относительно консенсусной последовательности A-X-Asp [134]. Стрелкой и красным цветом обозначен аминокислотный остаток, который должен остаться N-концевым в результате процессинга молекул интерлейкинов согласно гипотезе.

В случае ИЛ-36РА для подобного процессинга достаточно внутриклеточной метионинаминопептидазы. В случае ИЛ-36а, в, у процессинг происходит уже вне клетки с помощью катепсина О, эластазы и протеиназы 3, которые являются протеазами гранул нейтрофилов, поэтому процессинг и активация ИЛ-36 возможны только при дегрануляции нейтрофилов [56]. Однако, при таком процессинге ИЛ-36 отщепляется меньше а.о., чем было предсказано ранее (Рисунок 4). Биологическая активность ИЛ-36 при таком процессинге ниже, чем при отщеплении а.о. вплоть до 9 а.о. от мотива Л-Х-Лбр [56, 134]. Протеазы, которые могли бы осуществлять такой процессинг ИЛ-36, пока не выявлены.

Рисунок 4. Сайты расщепления молекул ИЛ-36 протеазами гранул нейтрофилов.

Контакт ИЛ-36 во внеклеточном пространстве с ферментами эластазой и катепсином О происходит не только в свободном межклеточном пространстве, но также в хроматиновых сетях, образующихся в результате нетоза нейтрофилов [28]. Нетоз (КБТо81в) - это процесс программируемой смерти нейтрофилов, при котором во внешнюю среду выходит хроматин нейтрофилов в виде сети с впутанными в неё молекулами антимикробных белков и протеаз. Этот процесс играет важную роль в иммунном ответе на бактериальную инфекцию [60] и развитии аутоиммунных заболеваний [20].

Процессинг с помощью протеаз нейтрофилов показан и для других членов семейства ИЛ-1. Так, ИЛ-1Р и ИЛ-18 могут быть активированы вне клетки протеазами нейтрофилов, либо внутри клетки в инфламмасоме с помощью каспазы-1 [91]. ИЛ-37 процессируется каспазой-1 [70].

2.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1

Рецепторы всех цитокинов семейства ИЛ-1, кроме IL-18BP (IL-18 binding protein) и IL-1R8, устроены похожим образом. Они состоят из внеклеточного домена, трансмембранного домена и внутриклеточного Toll/IL-1 receptor (TIR) домена [46]. После связывания лиганда с рецептором образовавшийся комплекс связывает корецептор. Внутриклеточные TIR-домены рецептора и корецептора взаимодействуют и активируют содержащие TIR-домен белки внутри клетки, активируя NF-кВ сигнальный каскад [42].При этом используемые сигнальные пути общие для всех представителей семейства ИЛ-1 [122]. Такое дублирование эффектов обеспечивает амплификацию сигнала от патогенов без их диссеминации и генерализации местных эффектов воспаления [122].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Колобов Алексей Александрович, 2017 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Знаменская Л.Ф. Заболеваемость и распространенность псориаза в Российской Федерации / Л. Ф. Знаменская, Л. Е. Мелехина, Е. В. Богданова, А. А. Минеева // Вестник Дерматологии И Венерологии - 2012. - № 5 - 20-29 c.

2. Мишина О.С. Заболеваемость псориазом и псориатическим артритом среди городского и сельского населения Российской федерации / О. С. Мишина, А. С. Дворников, Е. С. Донцова, Л. Н. Борзунова, А. П. Обухов // Вестник Новых Медицинских Технологий Электронное Издание - 2012. - № 1.

3. Abbas O. Acrodermatitis continua of Hallopeau is a clinical phenotype of DITRA: evidence that it is a variant of pustular psoriasis / O. Abbas, S. Itani, S. Ghosn, A. G. Kibbi, G. Fidawi, M. Farooq, Y. Shimomura, M. Kurban // Dermatol. Basel Switz. - 2013. - Т. 226 - № 1 - 28-31 p.

4. Afonina I.S. Proteolytic Processing of Interleukin-1 Family Cytokines: Variations on a Common Theme / I. S. Afonina, C. Müller, S. J. Martin, R. Beyaert // Immunity - 2015. - Т. 42 - № 6 - 9911004 p.

5. Aida Y. Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-114 / Y. Aida, M. J. Pabst // J. Immunol. Methods - 1990. - Т. 132 - № 2 - 191-195 p.

6. Andre R. Regulation of expression of the novel IL-1 receptor family members in the mouse brain / R. Andre, D. Lerouet, I. Kimber, E. Pinteaux, N. J. Rothwell // J. Neurochem. - 2005. - Т. 95 - № 2 -324-330 p.

7. Anspach F.B. Removal of endotoxins by affinity sorbents / F. B. Anspach, O. Hilbeck // J. Chromatogr. A - 1995. - Т. 711 - № 1 - 81-92 p.

8. Aoyagi T. IL-36 receptor deletion attenuates lung injury and decreases mortality in murine influenza pneumonia / T. Aoyagi, M. W. Newstead, X. Zeng, S. L. Kunkel, M. Kaku, T. J. Standiford // Mucosal Immunol. - 2017. - Т. 10 - № 4 - 1043-1055 p.

9. Asseldonk E.J.P. van The effect of the interleukin-1 cytokine family members IL-1F6 and IL-1F8 on adipocyte differentiation / E. J. P. van Asseldonk, R. Stienstra, T. B. Koenen, L. J. H. van Tits, L.

A. B. Joosten, C. J. Tack, M. G. Netea // Obes. Silver Spring Md - 2010. - T. 18 - № 11 - 2234-2236 p.

10. Bal E. Mutation in IL36RN impairs the processing and regulatory function of the interleukin-36 receptor antagonist and is associated with DITRA syndrome / E. Bal, A. C. Lim, M. Shen, J. Douangpanya, M. Madrange, R. Gazah, M. Tauber, W. Beghdadi, J. L. Casanova, E. Bourrat, H. Bachelez, J. E. Towne, A. Smahi // Exp. Dermatol. - 2017.

11. Barton J.L. A tissue specific IL-1 receptor antagonist homolog from the IL-1 cluster lacks IL-1, IL-1ra, IL-18 and IL-18 antagonist activities / J. L. Barton, R. Herbst, D. Bosisio, L. Higgins, M. J. Nicklin // Eur. J. Immunol. - 2000. - T. 30 - № 11 - 3299-3308 p.

12. Ben-Bassat A. Processing of the initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionine aminopeptidase and its gene structure / A. Ben-Bassat, K. Bauer, S. Y. Chang, K. Myambo, A. Boosman, S. Chang // J. Bacteriol. - 1987. - T. 169 - № 2 - 751-757 p.

13. Berglöf E. IL-1Rrp2 expression and IL-1F9 (IL-1H1) actions in brain cells / E. Berglöf, R. Andre,

B. R. Renshaw, S. M. Allan, C. B. Lawrence, N. J. Rothwell, E. Pinteaux // J. Neuroimmunol. - 2003.

- T. 139 - № 1-2 - 36-43 p.

14. Bhosale M. Characterization of two M17 family members in Escherichia coli, Peptidase A and Peptidase B / M. Bhosale, S. Pande, A. Kumar, S. Kairamkonda, D. Nandi // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. - T. 395 - № 1 - 76-81 p.

15. Blumberg H. Opposing activities of two novel members of the IL-1 ligand family regulate skin inflammation / H. Blumberg, H. Dinh, E. S. Trueblood, J. Pretorius, D. Kugler, N. Weng, S. T. Kanaly, J. E. Towne, C. R. Willis, M. K. Kuechle, J. E. Sims, J. J. Peschon // J. Exp. Med. - 2007. - T. 204 - № 11 - 2603-2614 p.

16. Boehncke W.-H. Etiology and Pathogenesis of Psoriasis / W.-H. Boehncke // Rheum. Dis. Clin. North Am. - 2015. - T. 41 - № 4 - 665-675 p.

17. Boehncke W.-H. Psoriasis / W.-H. Boehncke, M. P. Schön // Lancet Lond. Engl. - 2015. - T. 386

- № 9997 - 983-994 p.

18. Bozoyan L. Interleukin-36y is expressed by neutrophils and can activate microglia, but has no role in experimental autoimmune encephalomyelitis / L. Bozoyan, A. Dumas, A. Patenaude, L. Vallieres // J. Neuroinflammation - 2015. - T. 12 - 173 p.

19. Brau-Javier C.N. Chronic cutaneous pustulosis due to a 175-kb deletion on chromosome 2q13: excellent response to anakinra / C. N. Brau-Javier, J. Gonzales-Chavez, J. R. Toro // Arch. Dermatol. -2012. - T. 148 - № 3 - 301-304 p.

20. Bruschi M. Post-translational modified proteins are biomarkers of autoimmune-processes: NETosis and the inflammatory-autoimmunity connection / M. Bruschi, A. Petretto, R. Bertelli, M. Galetti, A. Bonanni, F. Pratesi, P. Migliorini, G. Candiano, A. Vaglio, G. M. Ghiggeri // Clin. Chim. Acta Int. J. Clin. Chem. - 2017. - T. 464 - 12-16 p.

21. Busfield S.J. Identification and gene organization of three novel members of the IL-1 family on human chromosome 2 / S. J. Busfield, C. A. Comrack, G. Yu, T. W. Chickering, J. S. Smutko, H. Zhou, K. R. Leiby, L. M. Holmgren, D. P. Gearing, Y. Pan // Genomics - 2000. - T. 66 - № 2 - 213216 p.

22. Carrier Y. Inter-regulation of Th17 cytokines and the IL-36 cytokines in vitro and in vivo: implications in psoriasis pathogenesis / Y. Carrier, H.-L. Ma, H. E. Ramon, L. Napierata, C. Small, M. O'Toole, D. A. Young, L. A. Fouser, C. Nickerson-Nutter, M. Collins, K. Dunussi-Joannopoulos, Q. G. Medley // J. Invest. Dermatol. - 2011. - T. 131 - № 12 - 2428-2437 p.

23. Cassell S. Psoriatic arthritis: pathogenesis and novel immunomodulatory approaches to treatment / S. Cassell, A. Kavanaugh // J. Immune Based Ther. Vaccines - 2005. - T. 3 - 6 p.

24. Cavallaro A.S. Endotoxin-free purification for the isolation of bovine viral diarrhoea virus E2 protein from insoluble inclusion body aggregates / A. S. Cavallaro, D. Mahony, M. Commins, T. J. Mahony, N. Mitter // Microb. Cell Factories - 2011. - T. 10 - 57 p.

25. Chen H. Alterations of plasma inflammatory biomarkers in the healthy and chronic obstructive pulmonary disease patients with or without acute exacerbation / H. Chen, Y. Wang, C. Bai, X. Wang // J. Proteomics - 2012. - T. 75 - № 10 - 2835-2843 p.

26. Chen R.H. Factors affecting endotoxin removal from recombinant therapeutic proteins by anion exchange chromatography / R. H. Chen, C.-J. Huang, B. S. Newton, G. Ritter, L. J. Old, C. A. Batt // Protein Expr. Purif. - 2009. - T. 64 - № 1 - 76-81 p.

27. Chustz R.T. Regulation and function of the IL-1 family cytokine IL-1F9 in human bronchial epithelial cells / R. T. Chustz, D. R. Nagarkar, J. A. Poposki, S. Favoreto, P. C. Avila, R. P. Schleimer, A. Kato // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2011. - T. 45 - № 1 - 145-153 p.

28. Clancy D.M. Neutrophil extracellular traps can serve as platforms for processing and activation of IL-1 family cytokines / D. M. Clancy, C. M. Henry, G. P. Sullivan, S. J. Martin // FEBS J. - 2017. - T. 284 - № 11 - 1712-1725 p.

29. Cohen P. The TLR and IL-1 signalling network at a glance / P. Cohen // J. Cell Sci. - 2014. - T. 127 - № Pt 11 - 2383-2390 p.

30. Costa L. Efficacy of tocilizumab in a patient with refractory psoriatic arthritis / L. Costa, F. Caso, L. Cantarini, A. Del Puente, R. Scarpa, M. Atteno // Clin. Rheumatol. - 2014. - T. 33 - № 9 - 13551357 p.

31. Dalb0ge H. In vivo processing of N-terminal methionine in E. coli / H. Dalb0ge, S. Bayne, J. Pedersen // FEBS Lett. - 1990. - T. 266 - № 1-2 - 1-3 p.

32. D'Erme A.M. IL-36y (IL-1F9) Is a Biomarker for Psoriasis Skin Lesions / A. M. D'Erme, D. Wilsmann-Theis, J. Wagenpfeil, M. Hölzel, S. Ferring-Schmitt, S. Sternberg, M. Wittmann, B. Peters, A. Bosio, T. Bieber, J. Wenzel // J. Invest. Dermatol. - 2015. - T. 135 - № 4 - 1025-1032 p.

33. Dinarello C. IL-1 family nomenclature / C. Dinarello, W. Arend, J. Sims, D. Smith, H. Blumberg, L. O'Neill, R. Goldbach-Mansky, T. Pizarro, H. Hoffman, P. Bufler, M. Nold, P. Ghezzi, A. Mantovani, C. Garlanda, D. Boraschi, A. Rubartelli, M. Netea, J. van der Meer, L. Joosten, T. Mandrup-Poulsen, M. Donath, E. Lewis, J. Pfeilschifter, M. Martin, M. Kracht, H. Muehl, D. Novick, M. Lukic, B. Conti, A. Solinger, P. Kelk, K. Peyman, F. van de Veerdonk, C. Gabel // Nat. Immunol. -2010. - T. 11 - № 11 - 973 p.

34. Dunn E. Annotating genes with potential roles in the immune system: six new members of the IL-1 family / E. Dunn, J. E. Sims, M. J. Nicklin, L. A. O'Neill // Trends Immunol. - 2001. - T. 22 - № 10 -533-536 p.

35. Dunn E.F. High-resolution structure of murine interleukin 1 homologue IL-1F5 reveals unique loop conformations for receptor binding specificity / E. F. Dunn, N. J. Gay, A. F. Bristow, D. P. Gearing, L. A. J. O'Neill, X. Y. Pei // Biochemistry (Mosc.) - 2003. - T. 42 - № 37 - 10938-10944 p.

36. Farahnik B. Topical Botanical Agents for the Treatment of Psoriasis: A Systematic Review / B. Farahnik, D. Sharma, J. Alban, R. K. Sivamani // Am. J. Clin. Dermatol. - 2017. - T. 18 - № 4 - 451468 p.

37. Farooq M. Mutation analysis of the IL36RN gene in 14 Japanese patients with generalized pustular psoriasis / M. Farooq, H. Nakai, A. Fujimoto, H. Fujikawa, A. Matsuyama, N. Kariya, A. Aizawa, H. Fujiwara, M. Ito, Y. Shimomura // Hum. Mutat. - 2013. - T. 34 - № 1 - 176-183 p.

38. Finch A. Analysis of mitogen-activated protein kinase pathways used by interleukin 1 in tissues in vivo: activation of hepatic c-Jun N-terminal kinases 1 and 2, and mitogen-activated protein kinase kinases 4 and 7 / A. Finch, W. Davis, W. G. Carter, J. Saklatvala // Biochem. J. - 2001. - T. 353 - № Pt2 - 275-281 p.

39. Fits L. van der Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis / L. van der Fits, S. Mourits, J. S. A. Voerman, M. Kant, L. Boon, J. D. Laman, F. Cornelissen, A.-M. Mus, E. Florencia, E. P. Prens, E. Lubberts // J. Immunol. Baltim. Md 1950 -2009. - T. 182 - № 9 - 5836-5845 p.

40. Franken K.L. Purification of his-tagged proteins by immobilized chelate affinity chromatography: the benefits from the use of organic solvent / K. L. Franken, H. S. Hiemstra, K. E. van Meijgaarden, Y. Subronto, J. den Hartigh, T. H. Ottenhoff, J. W. Drijfhout // Protein Expr. Purif. - 2000. - T. 18 - № 1

- 95-99 p.

41. Frottin F. The proteomics of N-terminal methionine cleavage / F. Frottin, A. Martinez, P. Peynot, S. Mitra, R. C. Holz, C. Giglione, T. Meinnel // Mol. Cell. Proteomics MCP - 2006. - T. 5 - № 12 -2336-2349 p.

42. Gabay C. Regulation and function of interleukin-36 cytokines in homeostasis and pathological conditions / C. Gabay, J. E. Towne // J. Leukoc. Biol. - 2015. - T. 97 - № 4 - 645-652 p.

43. Gagnon P. Monoclonal antibody purification with hydroxyapatite / P. Gagnon // New Biotechnol. -2009. - T. 25 - № 5 - 287-293 p.

44. Ganesan R. Generation and functional characterization of anti-human and anti-mouse IL-36R antagonist monoclonal antibodies / R. Ganesan, E. L. Raymond, D. Mennerich, J. R. Woska, G. Caviness, C. Grimaldi, J. Ahlberg, R. Perez, S. Roberts, D. Yang, K. Jerath, K. Truncali, L. Frego, E. Sepulveda, P. Gupta, S.-E. Brown, M. D. Howell, K. A. Canada, R. Kroe-Barrett, J. S. Fine, S. Singh, M. L. Mbow // mAbs - 2017. - 0 p.

45. Garber C. Systemic Treatment of Recalcitrant Pediatric Psoriasis: A Case Series and Literature Review / C. Garber, M. Creighton-Smith, E. P. Sorensen, N. Dumont, A. B. Gottlieb // J. Drugs Dermatol. JDD - 2015. - Т. 14 - № 8 - 881-886 p.

46. Garlanda C. Decoys and Regulatory «Receptors» of the IL-1/Toll-Like Receptor Superfamily / C. Garlanda, F. Riva, E. Bonavita, S. Gentile, A. Mantovani // Front. Immunol. - 2013. - Т. 4 - 180 p.

47. Gasteiger E. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server / под ред. J. Walker. Humana Press, 2005. - 571-607 p.

48. Gresnigt M.S. Biology of IL-36 cytokines and their role in disease / M. S. Gresnigt, F. L. van de Veerdonk // Semin. Immunol. - 2013. - Т. 25 - № 6 - 458-465 p.

49. Griffiths C.E.M. Pathogenesis and clinical features of psoriasis / C. E. M. Griffiths, J. N. W. N. Barker // Lancet Lond. Engl. - 2007. - Т. 370 - № 9583 - 263-271 p.

50. Grote A. JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host / A. Grote, K. Hiller, M. Scheer, R. Münch, B. Nörtemann, D. C. Hempel, D. Jahn // Nucleic Acids Res. - 2005. - Т. 33 - № suppl 2 - W526-W531 p.

51. Grunberg-Manago M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages / M. Grunberg-Manago // Annu. Rev. Genet. - 1999. - Т. 33 - 193-227 p.

52. Gudjonsson J.E. Immunopathogenic mechanisms in psoriasis / J. E. Gudjonsson, A. Johnston, H. Sigmundsdottir, H. Valdimarsson // Clin. Exp. Immunol. - 2004. - Т. 135 - № 1 - 1-8 p.

53. Günther S. Molecular determinants of agonist and antagonist signaling through the IL-36 receptor / S. Günther, E. J. Sundberg // J. Immunol. Baltim. Md 1950 - 2014. - Т. 193 - № 2 - 921-930 p.

54. Hamon Y. Interleukin-1beta secretion is impaired by inhibitors of the Atp binding cassette transporter, ABC1 / Y. Hamon, M. F. Luciani, F. Becq, B. Verrier, A. Rubartelli, G. Chimini // Blood

- 1997. - T. 90 - № 8 - 2911-2915 p.

55. Heidenreich R. Angiogenesis drives psoriasis pathogenesis / R. Heidenreich, M. Röcken, K. Ghoreschi // Int. J. Exp. Pathol. - 2009. - T. 90 - № 3 - 232-248 p.

56. Henry C.M. Neutrophil-Derived Proteases Escalate Inflammation through Activation of IL-36 Family Cytokines / C. M. Henry, G. P. Sullivan, D. M. Clancy, I. S. Afonina, D. Kulms, S. J. Martin // Cell Rep. - 2016. - T. 14 - № 4 - 708-722 p.

57. Hoffman S.J. Expression of fully functional tetrameric human hemoglobin in Escherichia coli / S. J. Hoffman, D. L. Looker, J. M. Roehrich, P. E. Cozart, S. L. Durfee, J. L. Tedesco, G. L. Stetler // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1990. - T. 87 - № 21 - 8521-8525 p.

58. Hussain S. IL36RN mutations define a severe autoinflammatory phenotype of generalized pustular psoriasis / S. Hussain, D. M. Berki, S.-E. Choon, A. D. Burden, M. H. Allen, J. I. Arostegui, A. Chaves, M. Duckworth, A. D. Irvine, M. Mockenhaupt, A. A. Navarini, M. M. B. Seyger, P. Soler-Palacin, C. Prins, L. Valeyrie-Allanore, M. A. Vicente, R. C. Trembath, C. H. Smith, J. N. Barker, F. Capon // J. Allergy Clin. Immunol. - 2015. - T. 135 - № 4 - 1067-1070.e9 p.

59. Jiang Z. Interleukin-36y induced by the TLR3-SLUG-VDR axis promotes wound healing via REG3A / Z. Jiang, Y. Liu, C. Li, L. Chang, W. Wang, Z. Wang, X. Gao, B. Ryffel, Y. Wu, Y. Lai // J. Invest. Dermatol. - 2017.

60. Jorgensen I. Programmed cell death as a defence against infection / I. Jorgensen, M. Rayamajhi, E. A. Miao // Nat. Rev. Immunol. - 2017. - T. 17 - № 3 - 151-164 p.

61. Julien O. Caspases and their substrates / O. Julien, J. A. Wells // Cell Death Differ. - 2017. - T. 24

- № 8 - 1380-1389 p.

62. Kanazawa N. Novel IL36RN mutation in a Japanese case of early onset generalized pustular psoriasis / N. Kanazawa, T. Nakamura, N. Mikita, F. Furukawa // J. Dermatol. - 2013. - T. 40 - № 9 -749-751 p.

63. Keermann M. Transcriptional landscape of psoriasis identifies the involvement of IL36 and IL36RN / M. Keermann, S. Koks, E. Reimann, E. Prans, K. Abram, K. Kingo // BMC Genomics -2015. - T. 16 - 322 p.

64. Kelly J.B. Current and future oral systemic therapies for psoriasis / J. B. Kelly, P. Foley, B. E. Strober // Dermatol. Clin. - 2015. - T. 33 - № 1 - 91-109 p.

65. Kerwin B.A. Polysorbates 20 and 80 used in the formulation of protein biotherapeutics: structure and degradation pathways / B. A. Kerwin // J. Pharm. Sci. - 2008. - T. 97 - № 8 - 2924-2935 p.

66. Kingsbury D.J. Safety, effectiveness, and pharmacokinetics of adalimumab in children with polyarticular juvenile idiopathic arthritis aged 2 to 4 years / D. J. Kingsbury, B. Bader-Meunier, G. Patel, V. Arora, J. Kalabic, H. Kupper // Clin. Rheumatol. - 2014. - T. 33 - № 10 - 1433-1441 p.

67. Klotsche J. Long-term safety of etanercept and adalimumab compared to methotrexate in patients with juvenile idiopathic arthritis (JIA) / J. Klotsche, M. Niewerth, J.-P. Haas, H.-I. Huppertz, A. Zink, G. Horneff, K. Minden // Ann. Rheum. Dis. - 2016. - T. 75 - № 5 - 855-861 p.

68. Kovach M.A. IL-36y is a crucial proximal component of protective type-1-mediated lung mucosal immunity in Gram-positive and -negative bacterial pneumonia / M. A. Kovach, B. Singer, G. Martinez-Colon, M. W. Newstead, X. Zeng, P. Mancuso, T. A. Moore, S. L. Kunkel, M. PetersGolden, B. B. Moore, T. J. Standiford // Mucosal Immunol. - 2017.

69. Kovach M.A. IL-36y is secreted in microparticles and exosomes by lung macrophages in response to bacteria and bacterial components / M. A. Kovach, B. H. Singer, M. W. Newstead, X. Zeng, T. A. Moore, E. S. White, S. L. Kunkel, M. Peters-Golden, T. J. Standiford // J. Leukoc. Biol. - 2016. - T. 100 - № 2 - 413-421 p.

70. Kumar S. Interleukin-1F7B (IL-1H4/IL-1F7) is processed by caspase-1 and mature IL-1F7B binds to the IL-18 receptor but does not induce IFN-gamma production / S. Kumar, C. R. Hanning, M. R. Brigham-Burke, D. J. Rieman, R. Lehr, S. Khandekar, R. B. Kirkpatrick, G. F. Scott, J. C. Lee, F. J. Lynch, W. Gao, A. Gambotto, M. T. Lotze // Cytokine - 2002. - T. 18 - № 2 - 61-71 p.

71. Kumar S. Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1 family / S. Kumar, P. C. McDonnell, R. Lehr, L. Tierney, M. N. Tzimas, D. E. Griswold, E. A.

Capper, R. Tal-Singer, G. I. Wells, M. L. Doyle, P. R. Young // J. Biol. Chem. - 2000. - T. 275 - № 14 - 10308-10314 p.

72. Kurinna S. Autocrine and Paracrine Regulation of Keratinocyte Proliferation through a Novel Nrf2-IL-36y Pathway / S. Kurinna, S. Muzumdar, U. A. Köhler, T. Kockmann, U. Auf dem Keller, M. Schäfer, S. Werner // J. Immunol. Baltim. Md 1950 - 2016. - T. 196 - № 11 - 4663-4670 p.

73. Langley R.G. Evaluating psoriasis with Psoriasis Area and Severity Index, Psoriasis Global Assessment, and Lattice System Physician's Global Assessment / R. G. Langley, C. N. Ellis // J. Am. Acad. Dermatol. - 2004. - T. 51 - № 4 - 563-569 p.

74. Lazarevic V. T-bet in disease / V. Lazarevic, L. H. Glimcher // Nat. Immunol. - 2011. - T. 12 - № 7 - 597-606 p.

75. Levine D. Evaluation and management of psoriasis: an internist's guide / D. Levine, A. Gottlieb // Med. Clin. North Am. - 2009. - T. 93 - № 6 - 1291-1303 p.

76. Levitt M. A simplified representation of protein conformations for rapid simulation of protein folding / M. Levitt // J. Mol. Biol. - 1976. - T. 104 - № 1 - 59-107 p.

77. Li N. Alarmin function of cathelicidin antimicrobial peptide LL37 through IL-36y induction in human epidermal keratinocytes / N. Li, K. Yamasaki, R. Saito, S. Fukushi-Takahashi, R. Shimada-Omori, M. Asano, S. Aiba // J. Immunol. Baltim. Md 1950 - 2014. - T. 193 - № 10 - 5140-5148 p.

78. Li R. Increased ßTrCP are associated with imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice via NF-kB signaling pathway / R. Li, J. Wang, X. Wang, J. Zhou, M. Wang, H. Ma, S. Xiao // Gene - 2016.

79. Lian L.-H. The double-stranded RNA analogue polyinosinic-polycytidylic acid induces keratinocyte pyroptosis and release of IL-36y / L.-H. Lian, K. A. Milora, K. K. Manupipatpong, L. E. Jensen // J. Invest. Dermatol. - 2012. - T. 132 - № 5 - 1346-1353 p.

80. Liang J. Mutations in IL36RN are associated with geographic tongue / J. Liang, P. Huang, H. Li, J. Zhang, C. Ni, Y. Wang, J. Shen, C. Li, L. Kang, J. Chen, H. Zhang, Z. Wang, Z. Zhang, M. Li, Z. Yao // Hum. Genet. - 2017. - T. 136 - № 2 - 241-252 p.

81. Liao Y.-D. Removal of N-terminal methionine from recombinant proteins by engineered E. coli methionine aminopeptidase / Y.-D. Liao, J.-C. Jeng, C.-F. Wang, S.-C. Wang, S.-T. Chang // Protein Sci. Publ. Protein Soc. - 2004. - T. 13 - № 7 - 1802-1810 p.

82. Liu H.F. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production / H. F. Liu, J. Ma, C. Winter, R. Bayer // mAbs - 2010. - T. 2 - № 5 - 480-499 p.

83. Liu S. Removal of endotoxin from recombinant protein preparations / S. Liu, R. Tobias, S. McClure, G. Styba, Q. Shi, G. Jackowski // Clin. Biochem. - 1997. - T. 30 - № 6 - 455-463 p.

84. Lopez-Ferrer A. The safety of ustekinumab for the treatment of psoriatic arthritis / A. Lopez-Ferrer, A. Laiz, L. Puig // Expert Opin. Drug Saf. - 2017. - T. 16 - № 6 - 733-742 p.

85. Lovenberg T.W. Cloning of a cDNA encoding a novel interleukin-1 receptor related protein (IL 1R-rp2) / T. W. Lovenberg, P. D. Crowe, C. Liu, D. T. Chalmers, X. J. Liu, C. Liaw, W. Clevenger, T. Oltersdorf, E. B. De Souza, R. A. Maki // J. Neuroimmunol. - 1996. - T. 70 - № 2 - 113-122 p.

86. Lowe A.J. Methods for chromatographic removal of endotoxin / A. J. Lowe, C. L. Bardliving, C. A. Batt // Methods Mol. Biol. Clifton NJ - 2012. - T. 899 - 265-275 p.

87. Machado S.H. Safety of tocilizumab in the treatment of juvenile idiopathic arthritis / S. H. Machado, R. M. Xavier // Expert Opin. Drug Saf. - 2017. - T. 16 - № 4 - 493-500 p.

88. Magne D. The new IL-1 family member IL-1F8 stimulates production of inflammatory mediators by synovial fibroblasts and articular chondrocytes / D. Magne, G. Palmer, J. L. Barton, F. Mezin, D. Talabot-Ayer, S. Bas, T. Duffy, M. Noger, P.-A. Guerne, M. J. H. Nicklin, C. Gabay // Arthritis Res. Ther. - 2006. - T. 8 - № 3 - R80 p.

89. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli / S. C. Makrides // Microbiol. Rev. - 1996. - T. 60 - № 3 - 512-538 p.

90. Marrakchi S. Interleukin-36-receptor antagonist deficiency and generalized pustular psoriasis / S. Marrakchi, P. Guigue, B. R. Renshaw, A. Puel, X.-Y. Pei, S. Fraitag, J. Zribi, E. Bal, C. Cluzeau, M. Chrabieh, J. E. Towne, J. Douangpanya, C. Pons, S. Mansour, V. Serre, H. Makni, N. Mahfoudh, F. Fakhfakh, C. Bodemer, J. Feingold, S. Hadj-Rabia, M. Favre, E. Genin, M. Sahbatou, A. Munnich, J-L. Casanova, J. E. Sims, H. Turki, H. Bachelez, A. Smahi // N. Engl. J. Med. - 2011. - T. 365 - № 7 -620-628 p.

91. Martinon F. The inflammasomes: guardians of the body / F. Martinon, A. Mayor, J. Tschopp // Annu. Rev. Immunol. - 2009. - T. 27 - 229-265 p.

92. Medina-Contreras O. Cutting Edge: IL-36 Receptor Promotes Resolution of Intestinal Damage / O. Medina-Contreras, A. Harusato, H. Nishio, K. L. Flannigan, V. Ngo, G. Leoni, P.-A. Neumann, D. Geem, L. N. Lili, R. A. Ramadas, B. Chassaing, A. T. Gewirtz, J. E. Kohlmeier, C. A. Parkos, J. E. Towne, A. Nusrat, T. L. Denning // J. Immunol. Baltim. Md 1950 - 2015.

93. Mehta D. Ultraviolet B Phototherapy for Psoriasis: Review of Practical Guidelines / D. Mehta, H. W. Lim // Am. J. Clin. Dermatol. - 2016. - T. 17 - № 2 - 125-133 p.

94. Milora K.A. Interleukin-36p provides protection against HSV-1 infection, but does not modulate initiation of adaptive immune responses / K. A. Milora, S. R. Uppalapati, J. C. Sanmiguel, W. Zou, L. E. Jensen // Sci. Rep. - 2017. - T. 7 - № 1 - 5799 p.

95. Mutamba S. Expression of IL-1Rrp2 by human myelomonocytic cells is unique to DCs and facilitates DC maturation by IL-1F8 and IL-1F9 / S. Mutamba, A. Allison, Y. Mahida, P. Barrow, N. Foster // Eur. J. Immunol. - 2012. - T. 42 - № 3 - 607-617 p.

96. Nicklin M.J.H. A sequence-based map of the nine genes of the human interleukin-1 cluster / M. J. H. Nicklin, J. L. Barton, M. Nguyen, M. G. FitzGerald, G. W. Duff, K. Kornman // Genomics - 2002. - T. 79 - № 5 - 718-725 p.

97. Nolan K.F. The human interleukin 18 gene IL18 maps to 11q22.2-q22.3, closely linked to the DRD2 gene locus and distinct from mapped IDDM loci / K. F. Nolan, D. R. Greaves, H. Waldmann // Genomics - 1998. - T. 51 - № 1 - 161-163 p.

98. Onoufriadis A. Mutations in IL36RN/IL1F5 are associated with the severe episodic inflammatory skin disease known as generalized pustular psoriasis / A. Onoufriadis, M. A. Simpson, A. E. Pink, P. Di Meglio, C. H. Smith, V. Pullabhatla, J. Knight, S. L. Spain, F. O. Nestle, A. D. Burden, F. Capon, R. C. Trembath, J. N. Barker // Am. J. Hum. Genet. - 2011. - T. 89 - № 3 - 432-437 p.

99. Pace A.L. Asparagine deamidation dependence on buffer type, pH, and temperature / A. L. Pace, R. L. Wong, Y. T. Zhang, Y.-H. Kao, Y. J. Wang // J. Pharm. Sci. - 2013. - T. 102 - № 6 - 17121723 p.

100. Pan G. IL-1H, an interleukin 1-related protein that binds IL-18 receptor/IL-1Rrp / G. Pan, P. Risser, W. Mao, D. T. Baldwin, A. W. Zhong, E. Filvaroff, D. Yansura, L. Lewis, C. Eigenbrot, W. J. Henzel, R. Vandlen // Cytokine - 2001. - T. 13 - № 1 - 1-7 p.

101. Papp K. Safety Surveillance for Ustekinumab and Other Psoriasis Treatments From the Psoriasis Longitudinal Assessment and Registry (PSOLAR) / K. Papp, A. B. Gottlieb, L. Naldi, D. Pariser, V. Ho, K. Goyal, S. Fakharzadeh, M. Chevrier, S. Calabro, W. Langholff, G. Krueger // J. Drugs Dermatol. JDD - 2015. - T. 14 - № 7 - 706-714 p.

102. Paul C. Fixed combination calcipotriol plus betamethasone dipropionate aerosol foam in the treatment of psoriasis vulgaris: rationale for development and clinical profile / C. Paul, B. Bang, M. Lebwohl // Expert Opin. Pharmacother. - 2017. - T. 18 - № 1 - 115-121 p.

103. Penha R. IL-36 receptor is expressed by human blood and intestinal T lymphocytes and is dose-dependently activated via IL-36P and induces CD4+ lymphocyte proliferation / R. Penha, J. Higgins, S. Mutamba, P. Barrow, Y. Mahida, N. Foster // Cytokine - 2016. - T. 85 - 18-25 p.

104. Piatkov K.I. Formyl-methionine as a degradation signal at the N-termini of bacterial proteins / K. I. Piatkov, T. T. M. Vu, C.-S. Hwang, A. Varshavsky // Microb. Cell - 2015. - T. 2 - № 10 - 376-393 p.

105. Podlipnik S. Pneumocystis jirovecii pneumonia in a patient with pustular psoriasis with an IL-36RN deficiency treated with infliximab: Case report and review of the literature / S. Podlipnik, L. de la Mora, M. Alsina, J. M. Mascaro // Australas. J. Dermatol. - 2017. - T. 58 - № 2 - e44-e47 p.

106. Proudfoot A.E. Extension of recombinant human RANTES by the retention of the initiating methionine produces a potent antagonist / A. E. Proudfoot, C. A. Power, A. J. Hoogewerf, M. O. Montjovent, F. Borlat, R. E. Offord, T. N. Wells // J. Biol. Chem. - 1996. - T. 271 - № 5 - 2599-2603 p.

107. Rabhi-Essafi I. A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon alpha as a GST-fusion protein in E. coli / I. Rabhi-Essafi, A. Sadok, N. Khalaf, D. M. Fathallah // Protein Eng. Des. Sel. PEDS - 2007. - T. 20 - № 5 - 201-209 p.

108. Raj D. Keratinocyte apoptosis in epidermal development and disease / D. Raj, D. E. Brash, D. Grossman // J. Invest. Dermatol. - 2006. - T. 126 - № 2 - 243-257 p.

109. Reichelt P. Single step protocol to purify recombinant proteins with low endotoxin contents / P. Reichelt, C. Schwarz, M. Donzeau // Protein Expr. Purif. - 2006. - T. 46 - № 2 - 483-488 p.

110. Renert-Yuval Y. IL36RN mutation causing generalized pustular psoriasis in a Palestinian patient / Y. Renert-Yuval, L. Horev, S. Babay, S. Tams, Y. Ramot, A. Zlotogorski, V. Molho-Pessach // Int. J. Dermatol. - 2014. - T. 53 - № 7 - 866-868 p.

111. Rossi-Semerano L. First clinical description of an infant with interleukin-36-receptor antagonist deficiency successfully treated with anakinra / L. Rossi-Semerano, M. Piram, C. Chiaverini, D. De Ricaud, A. Smahi, I. Kone-Paut // Pediatrics - 2013. - T. 132 - № 4 - e1043-1047 p.

112. Ryoo J.Y. Meta-analysis of the Efficacy and Safety of Secukinumab for the Treatment of Plaque Psoriasis / J. Y. Ryoo, H.-J. Yang, E. Ji, B. K. Yoo // Ann. Pharmacother. - 2016. - T. 50 - № 5 -341-351 p.

113. Saikaly S.K. Biologics and Pediatric Generalized Pustular Psoriasis: An Emerging Therapeutic Trend / S. K. Saikaly, M. Mattes // Cureus - 2016. - T. 8 - № 6 - e652 p.

114. Salem S.A.M. Bath psoralen+ultraviolet A photochemotherapy vs. narrow band-ultraviolet B in psoriasis: a comparison of clinical outcome and effect on circulating T-helper and T-suppressor/cytotoxic cells / S. A. M. Salem, M. A. E.-T. Barakat, C. M. Z. M. Morcos // Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. - 2010. - T. 26 - № 5 - 235-242 p.

115. Scheiermann P. Application of IL-36 receptor antagonist weakens CCL20 expression and impairs recovery in the late phase of murine acetaminophen-induced liver injury / P. Scheiermann, M. Bachmann, L. Härdle, T. Pleli, A. Piiper, B. Zwissler, J. Pfeilschifter, H. Mühl // Sci. Rep. - 2015. - T. 5 - 8521 p.

116. Schmitz J. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines / J. Schmitz, A. Owyang, E. Oldham, Y. Song, E. Murphy, T. K. McClanahan, G. Zurawski, M. Moshrefi, J. Qin, X. Li, D. M. Gorman, J. F. Bazan, R. A. Kastelein // Immunity - 2005. - T. 23 - № 5 - 479-490 p.

117. Sehgal V.N. Anthralin/dithranol in dermatology / V. N. Sehgal, P. Verma, A. Khurana // Int. J. Dermatol. - 2014. - T. 53 - № 10 - e449-460 p.

118. Setta-Kaffetzi N. Rare pathogenic variants in IL36RN underlie a spectrum of psoriasis-associated pustular phenotypes / N. Setta-Kaffetzi, A. A. Navarini, V. M. Patel, V. Pullabhatla, A. E. Pink, S.-E. Choon, M. A. Allen, A. D. Burden, C. E. M. Griffiths, M. M. B. Seyger, B. Kirby, R. C. Trembath, M. A. Simpson, C. H. Smith, F. Capon, J. N. Barker // J. Invest. Dermatol. - 2013. - T. 133 - № 5 -1366-1369 p.

119. Sharaf N. Long-range DNA interactions at the IL-1/IL-36/IL-37 gene cluster (2q13) are induced by activation of monocytes / N. Sharaf, M. J. Nicklin, F. S. di Giovine // Cytokine - 2014. - T. 68 - № 1 - 16-22 p.

120. Shirokov D.A. [Designing of hybrid human interferon alfa-2 strain-producers and the use of enteropeptidase for obtaining N-terminal methionine-free interferons] / D. A. Shirokov, V. V. Riabichenko, R. I. Akishina, T. P. Ospel'nikova, A. V. Glazunov, G. G. Chestukhina, V. P. Veîko // Mol. Biol. (Mosk.) - 2011. - T. 45 - № 3 - 510-516 p.

121. Sims J.E. A new nomenclature for IL-1-family genes / J. E. Sims, M. J. Nicklin, J. F. Bazan, J. L. Barton, S. J. Busfield, J. E. Ford, R. A. Kastelein, S. Kumar, H. Lin, J. J. Mulero, J. Pan, Y. Pan, D. E. Smith, P. R. Young // Trends Immunol. - 2001. - T. 22 - № 10 - 536-537 p.

122. Sims J.E. The IL-1 family: regulators of immunity / J. E. Sims, D. E. Smith // Nat. Rev. Immunol.

- 2010. - T. 10 - № 2 - 89-102 p.

123. Smith D.E. Four new members expand the interleukin-1 superfamily / D. E. Smith, B. R. Renshaw, R. R. Ketchem, M. Kubin, K. E. Garka, J. E. Sims // J. Biol. Chem. - 2000. - T. 275 - № 2

- 1169-1175 p.

124. Solbiati J. Processing of the N termini of nascent polypeptide chains requires deformylation prior to methionine removal / J. Solbiati, A. Chapman-Smith, J. L. Miller, C. G. Miller, J. E. Cronan // J. Mol. Biol. - 1999. - T. 290 - № 3 - 607-614 p.

125. Sugiura K. IL36RN mutations underlie impetigo herpetiformis / K. Sugiura, N. Oiso, S. Iinuma, H. Matsuda, M. Minami-Hori, A. Ishida-Yamamoto, A. Kawada, H. Iizuka, M. Akiyama // J. Invest. Dermatol. - 2014. - T. 134 - № 9 - 2472-2474 p.

126. Sugiura K. A novel IL36RN/IL1F5 homozygous nonsense mutation, p.Arg10X, in a Japanese patient with adult-onset generalized pustular psoriasis / K. Sugiura, T. Takeichi, M. Kono, Y. Ogawa, Y. Shimoyama, Y. Muro, M. Akiyama // Br. J. Dermatol. - 2012. - T. 167 - № 3 - 699-701 p.

127. Thomas C. Structure of the activating IL-1 receptor signaling complex / C. Thomas, J. F. Bazan, K. C. Garcia // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2012. - T. 19 - № 4 - 455-457 p.

128. Thomi R. Increased expression of the interleukin-36 cytokines in lesions of hidradenitis suppurativa / R. Thomi, M. Kakeda, N. Yawalkar, C. Schlapbach, R. E. Hunger // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. JEADV - 2017.

129. Thorlakson H.H. Lysophosphatidic acid induces expression of genes in human oral keratinocytes involved in wound healing / H. H. Thorlakson, S. A. Engen, O. Schreurs, K. Schenck, I. J. S. Blix // Arch. Oral Biol. - 2017. - T. 80 - 153-159 p.

130. Tomuschat C. Altered expression of IL36y and IL36 receptor (IL1RL2) in the colon of patients with Hirschsprung's disease / C. Tomuschat, A. M. O'Donnell, D. Coyle, P. Puri // Pediatr. Surg. Int. -2017. - T. 33 - № 2 - 181-186 p.

131. Torsekar R. Topical Therapies in Psoriasis / R. Torsekar, M. M. Gautam // Indian Dermatol. Online J. - 2017. - T. 8 - № 4 - 235-245 p.

132. Tortola L. Psoriasiform dermatitis is driven by IL-36-mediated DC-keratinocyte crosstalk / L. Tortola, E. Rosenwald, B. Abel, H. Blumberg, M. Schäfer, A. J. Coyle, J.-C. Renauld, S. Werner, J. Kisielow, M. Kopf // J. Clin. Invest. - 2012. - T. 122 - № 11 - 3965-3976 p.

133. Towne J.E. Interleukin (IL)-1F6, IL-1F8, and IL-1F9 signal through IL-1Rrp2 and IL-1RAcP to activate the pathway leading to NF-kappaB and MAPKs / J. E. Towne, K. E. Garka, B. R. Renshaw, G. D. Virca, J. E. Sims // J. Biol. Chem. - 2004. - T. 279 - № 14 - 13677-13688 p.

134. Towne J.E. Interleukin-36 (IL-36) ligands require processing for full agonist (IL-36a, IL-36ß, and IL-36y) or antagonist (IL-36Ra) activity / J. E. Towne, B. R. Renshaw, J. Douangpanya, B. P. Lipsky, M. Shen, C. A. Gabel, J. E. Sims // J. Biol. Chem. - 2011. - T. 286 - № 49 - 42594-42602 p.

135. Tsutsui H. Interleukin-1 Family Cytokines in Liver Diseases / H. Tsutsui, X. Cai, S. Hayashi // Mediators Inflamm. - 2015. - T. 2015 - 630265 p.

136. Tsutsumi N. The structural basis for receptor recognition of human interleukin-18 / N. Tsutsumi, T. Kimura, K. Arita, M. Ariyoshi, H. Ohnishi, T. Yamamoto, X. Zuo, K. Maenaka, E. Y. Park, N. Kondo, M. Shirakawa, H. Tochio, Z. Kato // Nat. Commun. - 2014. - T. 5 - 5340 p.

137. Veerdonk F.L. van de IL-38 binds to the IL-36 receptor and has biological effects on immune cells similar to IL-36 receptor antagonist / F. L. van de Veerdonk, A. K. Stoeckman, G. Wu, A. N. Boeckermann, T. Azam, M. G. Netea, L. A. B. Joosten, J. W. M. van der Meer, R. Hao, V. Kalabokis, C. A. Dinarello // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2012. - T. 109 - № 8 - 3001-3005 p.

138. Vigne S. IL-36R ligands are potent regulators of dendritic and T cells / S. Vigne, G. Palmer, C. Lamacchia, P. Martin, D. Talabot-Ayer, E. Rodriguez, F. Ronchi, F. Sallusto, H. Dinh, J. E. Sims, C. Gabay // Blood - 2011. - T. 118 - № 22 - 5813-5823 p.

139. Vigne S. IL-36 signaling amplifies Th1 responses by enhancing proliferation and Th1 polarization of naive CD4+ T cells / S. Vigne, G. Palmer, P. Martin, C. Lamacchia, D. Strebel, E. Rodriguez, M. L. Olleros, D. Vesin, I. Garcia, F. Ronchi, F. Sallusto, J. E. Sims, C. Gabay // Blood -2012. - T. 120 - № 17 - 3478-3487 p.

140. Vlasak J. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody / J. Vlasak, M. C. Bussat, S. Wang, E. Wagner-Rousset, M. Schaefer, C. Klinguer-Hamour, M. Kirchmeier, N. Corvaia, R. Ionescu, A. Beck // Anal. Biochem. - 2009. - T. 392

- № 2 - 145-154 p.

141. Wakankar A.A. Formulation considerations for proteins susceptible to asparagine deamidation and aspartate isomerization / A. A. Wakankar, R. T. Borchardt // J. Pharm. Sci. - 2006. - T. 95 - № 11

- 2321-2336 p.

142. Wang D. Structural insights into the assembly and activation of IL-1P with its receptors / D. Wang, S. Zhang, L. Li, X. Liu, K. Mei, X. Wang // Nat. Immunol. - 2010. - T. 11 - № 10 - 905-911 p.

143. Wang J. A systematic review on the efficacy and safety of Infliximab in patients with psoriasis / J. Wang, Q. Zhan, L. Zhang // Hum. Vaccines Immunother. - 2016. - T. 12 - № 2 - 431-437 p.

144. Wang W. Dual effects of Tween 80 on protein stability / W. Wang, Y. J. Wang, D. Q. Wang // Int. J. Pharm. - 2008. - T. 347 - № 1-2 - 31-38 p.

145. Weber A. Interleukin-1 (IL-1) pathway / A. Weber, P. Wasiliew, M. Kracht // Sci. Signal. - 2010. - Т. 3 - № 105 - cm1 p.

146. Wetzel R. Assignment of the disulphide bonds of leukocyte interferon / R. Wetzel // Nature -1981. - Т. 289 - № 5798 - 606-607 p.

147. Winter G. Formulation Strategies for Recombinant Protein and Related Biotech Drugs / под ред. O. Kayser, H. Warzecha. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2012. - 235-256 p.

148. Yan R. Topical calcipotriol/betamethasone dipropionate for psoriasis vulgaris: A systematic review / R. Yan, S. Jiang, Y. Wu, X.-H. Gao, H.-D. Chen // Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. -2016. - Т. 82 - № 2 - 135-144 p.

149. Yao J. Interleukin-1 (IL-1)-induced TAK1-dependent Versus MEKK3-dependent NFkappaB activation pathways bifurcate at IL-1 receptor-associated kinase modification / J. Yao, T. W. Kim, J. Qin, Z. Jiang, Y. Qian, H. Xiao, Y. Lu, W. Qian, M. F. Gulen, N. Sizemore, J. DiDonato, S. Sato, S. Akira, B. Su, X. Li // J. Biol. Chem. - 2007. - Т. 282 - № 9 - 6075-6089 p.

150. Yi G. Structural and functional attributes of the Interleukin-36 receptor / G. Yi, J. A. Ybe, S. S. Saha, G. Caviness, E. Raymond, R. Ganesan, M. L. Mbow, C. C. Kao // J. Biol. Chem. - 2016.

151. Yordanova D. Molecular Modeling of Triton X Micelles: Force Field Parameters, Self-Assembly, and Partition Equilibria / D. Yordanova, I. Smirnova, S. Jakobtorweihen // J. Chem. Theory Comput. -2015. - Т. 11 - № 5 - 2329-2340 p.

152. Yuan X. Role of IL-38 and Its Related Cytokines in Inflammation// Mediators of Inflammation [Электронный ресурс]. URL: https://www.hindawi.com/journals/mi/2015/807976/ (дата обращения: 31.07.2017).

153. Zelickson B.D. Generalized pustular psoriasis. A review of 63 cases / B. D. Zelickson, S. A. Muller // Arch. Dermatol. - 1991. - Т. 127 - № 9 - 1339-1345 p.

154. Zimmerman T. Simultaneous metal chelate affinity purification and endotoxin clearance of recombinant antibody fragments / T. Zimmerman, C. Petit Frère, M. Satzger, M. Raba, M. Weisbach, K. Dohn, A. Popp, M. Donzeau // J. Immunol. Methods - 2006. - Т. 314 - № 1-2 - 67-73 p.

155. Bachmann M. IL-36y/IL-1F9, an Innate T-bet Target in Myeloid Cells / M. Bachmann, P. Scheiermann, L. Härdle, J. Pfeilschifter, H. Mühl // J. Biol. Chem. - 2012. - T. 287 - № 50 - 4168441696 p.

156. Bowers P. Antibodies directed against interleukin 36 receptor (il-36r) / P. Bowers, A. J. Mcknight, D. J. King, M. Londei - 2016.

157. Bufler P. A complex of the IL-1 homologue IL-1F7b and IL-18-binding protein reduces IL-18 activity / P. Bufler, T. Azam, F. Gamboni-Robertson, L. L. Reznikov, S. Kumar, C. A. Dinarello, S.-H. Kim // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2002. - T. 99 - № 21 - 13723-13728 p.

158. Cowen E.W. DIRA, DITRA, and New Insights Into Pathways of Skin Inflammation / E. W. Cowen, R. Goldbach-Mansky // Arch. Dermatol. - 2012. - T. 148 - № 3 - 381-384 p.

159. Davies M.J. Protein oxidation and peroxidation / M. J. Davies // Biochem. J. - 2016. - T. 473 -№ Pt 7 - 805-825 p.

160. FitzGerald O. Psoriatic arthritis: from pathogenesis to therapy / O. FitzGerald, R. Winchester // Arthritis Res. Ther. - 2009. - T. 11 - № 1 - 214 p.

161. Gu T. Clouding of Triton X-114: The effect of added electrolytes on the cloud point of Triton X-114 in the presence of ionic surfactants / T. Gu, P. A. Galera-Gómez // Colloids Surf. Physicochem. Eng. Asp. - 1995. - T. 104 - № 2-3 - 307-312 p.

162. Hirel P.H. Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. / P. H. Hirel, M. J. Schmitter, P. Dessen, G. Fayat, S. Blanquet // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1989. - T. 86 - № 21 - 8247-8251 p.

163. Johnston A. IL-1F5, F6, F8, and F9: a novel IL-1 family signaling system that is active in psoriasis and promotes keratinocyte antimicrobial peptide expression / A. Johnston, X. Xing, A. M. Guzman, M. Riblett, C. M. Loyd, N. L. Ward, C. Wohn, E. P. Prens, F. Wang, L. E. Maier, S. Kang, J. J. Voorhees, J. T. Elder, J. E. Gudjonsson // J. Immunol. Baltim. Md 1950 - 2011. - T. 186 - № 4 -2613-2622 p.

164. Li S. Extracellular forms of IL-37 inhibit innate inflammation in vitro and in vivo but require the IL-1 family decoy receptor IL-1R8 / S. Li, C. P. Neff, K. Barber, J. Hong, Y. Luo, T. Azam, B. E.

Palmer, M. Fujita, C. Garlanda, A. Mantovani, S. Kim, C. A. Dinarello // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2015. - T. 112 - № 8 - 2497-2502 p.

165. Lorenzo J.R. Prediction of Spontaneous Protein Deamidation from Sequence-Derived Secondary Structure and Intrinsic Disorder / J. R. Lorenzo, L. G. Alonso, I. E. Sánchez // PLOS ONE - 2015. - T. 10 - № 12 - e0145186 p.

166. Molgora M. Regulatory Role of IL-1R8 in Immunity and Disease / M. Molgora, I. Barajon, A. Mantovani, C. Garlanda // Front. Immunol. - 2016. - T. 7.

167. Mulero J.J. IL1HY1: A Novel Interleukin-1 Receptor Antagonist Gene / J. J. Mulero, A. M. Pace, S. T. Nelken, D. B. Loeb, T. R. Correa, R. Drmanac, J. E. Ford // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1999. - T. 263 - № 3 - 702-706 p.

168. Nestle F.O. Psoriasis / F. O. Nestle, D. H. Kaplan, J. Barker // N. Engl. J. Med. - 2009. - T. 361 -№ 5 - 496-509 p.

169. Newton D.L. Single Amino Acid Substitutions at the N-Terminus of a Recombinant Cytotoxic Ribonuclease Markedly Influence Biochemical and Biological Properties / D. L. Newton, L. Boque, A. Wlodawer, C. Y. Huang, S. M. Rybak // Biochemistry (Mosc.) - 1998. - T. 37 - № 15 - 5173-5183 p.

170. Parikh J. Clouding Behavior and Thermodynamic Study of Nonionic Surfactants in Presence of Additives / J. Parikh, J. Rathore, D. Bhatt, M. Desai // J. Dispers. Sci. Technol. - 2013. - T. 34 - № 10 - 1392-1398 p.

171. Pryde J.G. Fractionation of membrane proteins by temperature-induced phase separation in Triton X-114. Application to subcellular fractions of the adrenal medulla. / J. G. Pryde, J. H. Phillips // Biochem. J. - 1986. - T. 233 - № 2 - 525-533 p.

172. Rossi-Semerano L. Tolerance and efficacy of off-label anti-interleukin-1 treatments in France: a nationwide survey / L. Rossi-Semerano, B. Fautrel, D. Wendling, E. Hachulla, C. Galeotti, L. Semerano, I. Touitou, I. Koné-Paut // Orphanet J. Rare Dis. - 2015. - T. 10.

173. Shen T.J. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. / T. J. Shen, N. T. Ho, V. Simplaceanu, M. Zou, B. N. Green, M. F. Tam, C. Ho // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1993. - T. 90 - № 17 - 8108-8112 p.

174. Smith A.J.P. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality / A. J. P. Smith, S. E. Humphries // Cytokine Growth Factor Rev. - 2009. - T. 20 - № 1 - 43-59 p.

175. Teodorowicz M. Optimized Triton X-114 assisted lipopolysaccharide (LPS) removal method reveals the immunomodulatory effect of food proteins / M. Teodorowicz, O. Perdijk, I. Verhoek, C. Govers, H. F. J. Savelkoul, Y. Tang, H. Wichers, K. Broersen // PLOS ONE - 2017. - T. 12 - № 3 -e0173778 p.

176. Weber J.R. Determination of Nonionic Ethylene Oxide Adduct in Some Commercial Products. / J. R. Weber, E. F. Degner, K. S. Bahjat // Anal. Chem. - 1964. - T. 36 - № 3 - 678-679 p.

177. Zhang J. Endotoxin Removal from Recombinant Human-like Collagen Preparations by Triton X-114 Two-phase Extraction / J. Zhang, C. Zhu, D. Fan // Biotechnology(Faisalabad) - 2013. - T. 12 -№ 2 - 135-139 p.

9. ПРИЛОЖЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Регистрационное удостоверение №_

Дата регистрации «_»_20_г.

Федеральное государственное унитарное предприятие

«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства (ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России) Россия, 197110, г. Санкт-Петербург, ул.Пудожская, д.7

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ПРЕДПРИЯТИЯ

_(номер)

Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека

субстанция

ПРОИЗВОДИТЕЛЬ

ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России, Россия

ФАСОВЩИК (ПЕРВИЧНАЯ УПАКОВКА) ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России, Россия

УПАКОВЩИК (ВТОРИЧНАЯ (ПОТРЕБИТЕЛЬСКАЯ) УПАКОВКА) ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России, Россия

ВЫПУСКАЮЩИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России, Россия

СПЕЦИФИКАЦИЯ

«Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека», субстанция

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства, Россия

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Прозрачная или слегка

опалесцирующая бесцветная

жидкость

Подлинность: 1. Биологический, по 1. Должен достоверно подавлять

- рецепторный разделу «Специфическая продукцию интерлейкина-8

антагонист активность» клетками линии А-549/IL36R+,

интерлейкина-36 вызванную интерлейкином-36 гамма

2. Электрофорез в ПААГ 2. На электрофореграмме в

восстанавливающих условиях

должна быть 1 полоса рецепторного

антагониста интерлейкина-36 с

кажущейся молекулярной массой

(17000±500) Да

3. Обращенно-фазная 3. Время удерживания основного

высокоэффективная пика на хроматограмме раствора

жидкостная субстанции должно соответствовать

хроматография (ОФ- времени удерживания основного

ВЭЖХ), по разделу пика рабочего стандартного образца

«Посторонние примеси»

4. Капиллярное 4. Изоэлектрическая точка основной

изоэлектрическое формы белка должна быть

фокусирование (кИЭФ), по (5,23+0,05)

разделу «Родственные

примеси»

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Прозрачность ГФ XIII, визуальный Должен быть прозрачным по сравнению с водой или выдерживать сравнение с эталоном I

Цветность ГФ XIII, визуальный Должен быть бесцветным

рН ГФ XIII, Потенциометрический От 6,0 до 6,5

Посторонние примеси 1. ВЭЖХ 2. ОФ-ВЭЖХ 1. Суммарное содержание посторонних, неидентифицированных примесей не должно превышать 5 %, содержание единичной неидентифицированной примеси - не более 2,5 % от площади основного пика 2. Суммарное содержание посторонних примесей не должно превышать 5 %.

Родственные примеси кИЭФ Содержание дезамидированной формы с pI (5,06+0,05) не должно превышать 5 %.

Белок клеток-продуцентов Иммуноферментный анализ Не более 100 нг на 1 мг белка

ДНК клеток-продуцентов Полимеразная цепная реакция в реальном времени Не более 2 нг на 1 мг белка

Бактериальные эндотоксины ГФ XIII Не более 10 ЕЭ на 1 мг белка

Аномальная токсичность ГФ XIII Должен быть нетоксичным

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Стерильность ГФ XIII, метод прямого посева Должен быть стерильным

Количественное определение: - рецепторный антагонист интерлейкина-36 ГФ XIII, спектрофотометрический метод Не менее 10,0 мг/мл

Специфическая активность Биологический Должен достоверно подавлять продукцию ИЛ-8 клетками линии А-549/IL36R+, вызванную 10 нг/мл интерлейкина-36 гамма, в концентрации не более 12 нг/мл

Упаковка 10 или 20 мл в стеклянной бутылке для крови, трансфузионных и инфузионных препаратов, укупоренной пробкой из резины и обжатой колпачком алюминиевым или в пластиковой бутылке из перфторированного сополимера этиленпропилена, укупоренной навинчиваемой крышкой из сополимера этилентетрафторэти-лена. 1 бутылка в пачке из картона

Маркировка В соответствии с ФСП

Транспортирование СП 3.3.2.1248-03 При температуре от 2 до 8 °С. Допускается транспортирование при темп. от 2 до 25 °С в течение 5 сут

Xранение СП 3.3.2.1248-03 При температуре от 2 до 8 °С

Срок годности 2 года

Настоящая фармакопейная статья предприятия распространяется на «Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека», субстанцию, применяемую для изготовления стерильных лекарственных средств. Субстанцию получают биотехнологическим способом с использованием рекомбинантных технологий на основе клеток-продуцентов E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15a). Субстанция представляет собой рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека в буферном растворе с рН 6,0-6.5, содержащем натрия цитрат (EP/BP/USP, ГОСТ 245-76) - 14,705 мг, динатрия эдетат (EP/BP/USP, ГОСТ 10652-73) - 0,3362 мг, полисорбат-80 (EP/BP/USP, ФС 42-2540-88) - 0,099 мг, воду для инъекций (ФС 42-2620-97) - до 1 мл.

МНН: не существует

Номенклатурное название

Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека относится к цитокинам семейства интерлейкина-1.

Номенклатурного названия IUPAC и IUMAB не существует.

Официальное научное полное название - рецепторный антагонист интерлейкина-36 (interleukin-36 receptor antagonist).

Первичная структура

Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека состоит из 154 аминокислот, не содержит N-концевого метионина, по физико-химическим и биологическим свойствам полностью идентичен природному белку.

Аминокислотная последовательность:

Val- Leu- Ser- -Gly-Ala- Leu- Cys- Phe- Arg- -Met- -Lys- -Asp Ser- -Ala- Leu- Lys -Val Leu-

Tyr- Leu- His Asn- Asn- Gln- Leu- Leu- -Ala- -Gly- -Gly- Leu- -His -Ala- -Gly- Lys -Val Ile-

Lys- Gly- Glu- Glu- Ile- Ser- Val- Val- Pro- Asn- Arg- -Trp Leu- -Asp- -Ala- Ser- Leu- Ser-

Pro- Val- Ile- Leu- -Gly- Val- Gln- Gly- -Gly- Ser- Gln- -Cys Leu- Ser- -Cys- Gly -Val -Gly-

Gln- Glu- Pro- Thr- Leu- Thr- Leu- Glu- Pro- -Val- Asn- Ile- -Met Glu- Leu- Tyr- Leu- -Gly-

Ala- Lys- Glu- Ser- -Lys- Ser- Phe- Thr- Phe- Tyr- Arg- Arg- -Asp -Met- -Gly- Leu- Thr- Ser-

Ser- Phe- Glu- Ser- -Ala- Ala- Tyr- Pro- -Gly- -Trp- Phe- Leu- -Cys Thr- -Val- Pro- Glu- -Ala-

Asp- Gln- Pro- -Val -Arg- Leu- Thr- Gln- Leu- Pro- Glu- Asn- -Gly -Gly- -Trp- Asn- -Ala Pro-

Ile- Thr- Asp Phe- Tyr- Phe- Gln- Gln- -Cys- -Asp

Эмпирическая формула: C756H1172N196O223S8.

Молекулярная масса: 16,8 кДа. Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая бесцветная жидкость.

Подлинность. Определяют четырьмя методами: биологический (1), электрофорез в ПААГ (2), ОФ-ВЭЖХ (3), кИЭФ (4).

1. Должен достоверно подавлять продукцию интерлейкина-8 клетками линии А-549/IL36R+, вызванную интерлейкином-36 гамма. Определяют биологическим методом по разделу «Специфическая активность».

2. На электрофореграмме должна быть одна полоса рецепторного антагониста интерлейкина-36 с кажущейся молекулярной массой (17000±500) Да. Определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле (градиент 4-20 %) в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих условиях.

Электрофорез выполняют на приборе типа BioRad, Mini-Protean Tetra Cell, используя набор стандартных белков с молекулярной массой от 14400 до 116000 Да (Thermo Fisher Scientific, кат. №26610). Полимеризацию геля проводят между пластинами из стекла в специальном приспособлении для заливки геля, входящем в комплект прибора или аналогичном в соответствии с инструкцией к прибору.

Приготовление 30 % раствора акриламида/бисакриламида. 29,2 г акриламида («Серва», кат. № 10675 или аналогичного качества) и 0,8 г N,N'-метиленбисакриламида («Серва», кат. № 29195 или аналогичного качества) помещают в химический стакан вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды при перемешивании. Раствор фильтруют через фильтр типа «Syringе Filter NY» с размером пор 0,45 мкм (Corning, кат. №431225) и хранят в закрытом флаконе темного стекла при температуре 4-6 С в течение 1 мес.

Приготовление 1,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 8,8. 9,08 г трис-(оксиметил)аминометана («Серва», кат. № 37190 или аналогичного качества) помещают в мерный химический стакан вместимостью 100 мл, растворяют при перемешивании в 40 мл воды и потенциометрически доводят рН раствора до значения 8,8 кислотой хлористоводородной концентрированной. Объем раствора доводят водой до 50 мл, перемешивают. Раствор фильтруют через фильтр типа «Syringе Filter NY» с размером пор 0,45 мкм (Corning, кат.№ 431225,) и хранят при температуре 4-6 С в течение 3 мес в закрытом флаконе.

Приготовление 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 6,8. 3,03 г трис-(оксиметил)аминометана помещают в мерный химический стакан вместимостью 100 мл и растворяют при перемешивании в 40 мл воды, потенциометрически доводят рН раствора до значения 6,8 кислотой хлористоводоводородной концентрированной. Объем раствора доводят

водой до 50 мл и перемешивают. Раствор фильтруют через фильтр типа Syring Filter NY с размером пор 0,45 мкм (Corning, кат. № 431225) и хранят при температуре 4-6 °С в течение 3 мес в закрытом флаконе.

Приготовление 10 % раствора натрия додецилсульфата (ДСН). 10,0 г натрия додецил сульфата («Серва», кат. № 20760 или аналогичного качества) помещают в мерный химический стакан вместимостью 100 мл, добавляют 90 мл воды и перемешивают до полного растворения. Хранят при температуре 18-25 °С.

Приготовление 10 % раствора аммония персульфата (ПСА). 100 мг аммония персульфата («Серва», кат. № 13375 или аналогичного качества) помещают во флакон вместимостью 2-5 мл, растворяют в 1,0 мл воды при перемешивании встряхиванием. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Приготовление электродного буферного раствора. Используют буферный рабочий раствор для электрофореза в системе натрия додецилсульфат - полиакриламидный гель (ГФ XI^T, с.334). Хранят при температуре 4-6 °С в течение 6 мес.

Приготовление раствора для приготовления образца. В пробирку вместимостью 10 мл помещают 2,5 мл 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 6,8, 4,0 мл 10 % раствора ДСН, 2,0 мл глицерина, 1,0 мл Р-меркаптоэтанола (Sigma, кат. № М 7154 или аналогичного качества), 0,5 мл воды и 4,0 мг бромфенолового синего, тщательно перемешивают. Срок годности раствора 2 недели при температуре 18-25 С.

Приготовление раствора концентрирующего геля. В пробирку вместимостью 10 мл с помощью автоматических микропипеток с переменным объемом помещают 0,76 мл воды, 0,31 мл 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора с pH 6,8, 0,17 мл 30 % раствора акриламида/бисакриламида, 0,012 мл 10 % раствора ДСН, 0,006 мл 10 % раствора ПСА, 0,001 мл тетраметил-этилендиамина (ТЕМЕД, «Серва», кат. № 35925 или аналогичного качества) и тщательно перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Приготовление раствора исследуемого препарата. 10 мкл образца исследуемой субстанции помещают в пробирку типа Эппендорф, добавляют 90 мкл дистиллированной воды, 100 мкл раствора для приготовления образца, выдерживают в твердотельном термостате при температуре 70° в течение 10 мин и охлаждают до температуры 18-25 °С. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Заливка геля. Градиентный смеситель (Amersham Biosciences, кат. № 18-1013-72 или подобный) устанавливают на магнитной мешалке, ячейку с выходным отверстием соединяют

шлангом с перистальтическим насосом, соединение между ячейками перекрывают. В ячейку без выходного отверстия с помощью автоматических микропипеток с переменным объемом помещают 0,325 мл 30 % раствора акриламид/бисакриламида, 0,625 мл 1,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора pH 8,8, 1,525 мл воды, 0,025 мл 10 % раствора ДСН, тщательно перемешивают («легкий» раствор - 4% Т, 2,7 % С).

В ячейку с выходным отверстием с помощью автоматических микропипеток с переменным объемом помещают 1,65 мл 30 % раствора акриламида/бисакриламида, 0,625 мл 1,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора pH 8,8, 0,175 мл воды и 0,025 мл 10 % раствора ДСН («тяжелый» раствор - 20 % Т, 2,7 % С). Полученный раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке, помещая в ячейку магнит для перемешивания.

Растворы готовят непосредственно перед использованием. В каждую ячейку добавляют по 0,025 мл 10 % раствора персульфата аммония и 0,002 мл ТЕМЕД («Серва», кат. № 35925 или аналогичного качества), включают насос и открывают соединение между ячейками.

Заливку растворов между стеклами установки осуществляют с помощью перистальтического насоса со скоростью около 25 мл/ч при постоянном перемешивании в ячейке с «тяжелым» раствором. Затем с помощью шприца (ТУ 64-1-378-83 или аналогичный) сверху аккуратно наслаивают 100 мкл изопропанола. Время полимеризации 10-15 мин при температуре 18-20 °С. После окончания процесса полимеризации, о чем свидетельствует появление четкой границы раздела между слоями изопропанола и геля, изопропанол сливают через край, поверхность геля тщательно просушивают с помощью фильтровальной бумаги. Потом между стеклами при помощи шприца заливают раствор концентрирующего геля и вставляют гребенку с 10 зубьями толщиной, равной толщине прокладок (1,00 мм). Время полимеризации 10-15 мин при температуре 18-20 °С.

Проведение электрофореза

Штатив вынимают из столика для заливки геля и устанавливают в ячейке с электродами, которую затем помещают в ванну. Ванну и ячейку заливают электродным буферным раствором таким образом, чтобы он был выше слоя геля на 0,5-0,6 см. Затем вынимают гребенку из концентрирующего геля. Образцы исследуемого препарата наносят в объеме 5 мкл на дорожку, раствор стандартных белков - также 5 мкл на дорожку. Все образцы наслаиваются на дно лунок под слой электродного буферного раствора с помощью микрошприца (Hamilton или аналогичного).

Сразу после нанесения образцов ванну закрывают крышкой и подключают электроды к источнику питания. На источнике питания устанавливают напряжение 200 В. Процесс заканчивают, когда лидирующий краситель достигнет нижней границы стекол. Длительность электрофореза (45 ± 5) мин. По окончании процесса отключают источник питания, разбирают электрофоретическую установку и освобождают гель.

Гель переносят в ванночку с чистой дистиллированной водой на 15 минут. Затем воду сливают и заливают гель коммерческим окрашивающим раствором PageBlue Protein Staining Solution (Thermo Fisher Scientific, кат.№24620) объемом около 15 мл и выдерживают в течение 60 мин. Затем гель трехкратно отмывают чистой дистиллированной водой. Объем воды для одной отмывки около 30 мл, продолжительность отмывки 1 - 2 мин.

После отмывки геля строят градуировочную зависимость длины пробега полосы от десятичного логарифма молекулярной массы маркерных белков, по которой определяют кажущуюся молекулярную массу исследуемого образца.

3. Время удерживания основного пика на хроматограмме раствора субстанции должно соответствовать времени удерживания основного пика рабочего стандартного образца. Определяют методом ОФ-ВЭЖХ по разделу «Посторонние примеси».

4. Изоэлектрическая точка основной формы белка должна быть (5,23+0,05). Определяют методом капиллярного изоэлектрического фокусирования (кИЭФ) по разделу «Родственные примеси».

Прозрачность. Должен быть прозрачным по сравнению с водой или выдерживать сравнение с эталоном сравнения I (ГФ XIII, 0ФС.1.2.1.007.15).

Цветность. Должен быть бесцветным (ГФ XIII, 0ФС.1.2.1.006.15).

рН. От 6,0 до 6,5 (ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0004.15, потенциометрически).

Посторонние примеси. Определяют двумя методами: ВЭЖХ (1), ОФ-ВЭЖХ (2).

1. Суммарное содержание посторонних, неидентифицированных примесей не должно превышать 5 %, содержание единичной неидентифицированной примеси - не более 2,5 % от площади основного пика. Определение проводят методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Приготовление буферного раствора для хроматографии:

а) приготовление 0,2 М раствора динатрия гидрофосфата (раствор А). 71,8 г динатрия гидрофосфата вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют около 700 мл воды, растворяют и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают.

б) приготовление 0,2 М раствора натрия дигидрофосфата (раствор В). 31,2 г натрия дигидрофосфата вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют около 700 мл воды, растворяют и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают.

в) в мерную колбу вместимостью 1 л вносят 130 мл раствора А, 120 мл раствора В и навеску аммония сульфата в количестве 26,4 г, растворяют при перемешивании. Затем доводят объем раствора водой до метки, перемешивают. Значение рН полученного раствора должно быть 6,5 ± 0,1 (контролируют потенциометрически). При необходимости рН раствора доводят до нужного значения 1 М раствором кислоты хлористоводородной или 1 М раствором натрия гидроксида. Срок годности растворов 4 дня при температуре 4-6 °С.

Проверка пригодности хроматографической системы

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:

- относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площади основного пика на основании 6 введений раствора (1) составляет не более 5,0 % (ГФ XI, вып.1, с.199);

- эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по основному пику (раствор 1), должна быть не менее 1500 теоретических тарелок (ГФ XI, вып.1, с.105);

Эффективность хроматографической колонки вычисляют по формуле:

N = 5,545

V ^ 0)

где: t - время удерживания основного пика, мин; W - ширина пика у основания, мин.

Коэффициент асимметрии пика, рассчитанный по пику интерлейкина-7 (раствор 1) должен быть не более 3,0.

Коэффициент асимметрии пика (Т) вычисляют по формуле:

Ж

Ж 0,05

2а (2)

где: а - расстояние от начала пика на высоте 5 % от базовой линии до перпендикуляра, проведенного из его вершины, в мм;

W0 05 - ширина пика на высоте 5 % от базовой линии, в мм.

0,1 мл препарата разбавляют в 20 раз буферным раствором для хроматографии в мерной колбе вместимостью 10 мл (раствор с концентрацией 0,5 мг/мл).

40 мкл полученного раствора анализируют на хроматографе высокого давления HP 1O9O M (Hewlett Packard, США) или аналогичного типа с УФ-детектором, получая не менее 5 хроматограмм в следующих условиях:

- Колонка Superdex 75 10/30 GL (GE, США);

- детекция при длине волны 220 нм (с интегратором или комплектом для компьютерной обработки результатов хроматографии);

- скорость потока подвижной фазы - 0,75 мл/мин;

- подвижная фаза: 0,2 М аммония сульфат, 50 мМ натрия фосфат с рН 6,5 (буферный раствор для хроматографии);

- время детекции - 30 мин;

- температура колонки - 20 оС;

- масштаб регистрации - 0,05 единиц оптической плотности.

- время удерживания пика рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 около 20 мин;

- обработка результатов анализа - с помощью интегратора или подходящей компьютерной программы.

Суммарное содержание посторонних, неидентифицированных примесей или единичной примеси в процентах от содержания основного вещества (Х) вычисляют по формуле:

у S

X = у x X100,

Sa +У (3)

где: Sx сумма площадей минорных пиков или площадь пика единичной

примеси на хроматограмме испытуемого раствора;

Sd площадь основного пика на хроматограмме испытуемого

раствора;

100 пере счет в проценты

Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы».

2. Суммарное содержание посторонних примесей не должно превышать 5 %. Определение проводят методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).

Хроматографическое исследование образцов проводят на хроматографе высокого давления НР-1050 с DAD детектором (Hewlett-Packard, США) или аналогичном хроматографе, имеющем градиентную систему подачи элюента, термостат для колонки, УФ-детектор и систему сбора и обработки данных (интегратор или компьютер с соответствующим программным обеспечением).

Приготовление буферного раствора А. В конической колбе вместимостью 1 л на весах взвешивают 699,0 г воды, 300 мл ацетонитрила с учетом плотности 0,782 г/мл, добавляют 1,0 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают и дегазируют любым удобным способом. Хранят в плотно укупоренном флаконе при температуре 18-25 °С. Срок годности раствора 7 сут.

Приготовление буферного раствора В. В конической колбе вместимостью 1 л на весах взвешивают 299,0 г воды, 700 мл ацетонитрила с учетом плотности 0,782 г/мл, добавляют 1,0 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают и дегазируют любым удобным способом. Хранят в плотно укупоренном флаконе при температуре 18-25 °С. Срок годности раствора 7 сут.

Приготовление рабочего раствора определяемого вещества. Концентрация рабочего раствора исследуемого образца должна быть не менее 1,25 мг/мл, т.е. не менее 25 мкг рекомбинантного ИЛ-36РА человека на введение в объеме, не превышающем 0,02 мл. Для приготовления рабочего раствора исследуемый образец субстанции разбавляют в 8 раз. Для этого в пробирку типа эппендорф помещают 25 мкл исследуемого образца и 175 мкл воды.

Приготовление образцов для калибровки (стандартных образцов). В качестве калибровочного (стандартного) образца используют раствор рабочего стандартного образца (РСО) с концентрацией не менее 1,0 мг/мл.

Уравновешивают хроматографическую колонку буферным раствором А минимум в течение 15 мин с помощью перистальтического насоса.

Хроматографию растворов стандартного образца и испытуемого образца субстанции проводят в следующих условиях:

- колонка Jupiter, 5 мкм, 300 А (Phenomenex), или аналогичная колонка из нержавеющей стали, длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная силикагелем С18 для хроматографии (диаметр частиц 5 мкм, размер пор 300 А);

- детектирование на УФ-детекторе при длине волны 220 нм;

- температура колонки - 35 °С;

- скорость потока подвижной фазы 1,5 мл/мин;

- объем вводимой пробы 20 мкл;

- масштаб регистрации - 0,5 единиц оптической плотности;

- время анализа - 20 мин;

- градиент - 30-70 % ацетонитрила за 20 мин (от 100% буферного раствора А до 100% буферного раствора B).

- обработка результатов анализа - с помощью интегратора или подходящей компьютерной программы.

Сравнивают хроматограммы раствора стандартного образца и раствора испытуемого препарата по количеству пиков и временам их удерживания.

Суммарное содержание посторонних примесей в процентах от содержания основного вещества (Х) вычисляют по формуле:

у s

X = у x X100,

Sa + У Sx (4)

Где: Sx сумма площадей минорных пиков на хроматограмме испытуемого

раствора;

Sd площадь основного пика на хроматограмме испытуемого раствора

100 пере счет в проценты

Родственные примеси. Содержание дезамидированной формы с р1 (5,06+0,05) не должно превышать 5 %. Определяют методом капиллярного изоэлектрического фокусирования (кИЭФ).

Исследование проводят с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М», или аналогичной, с возможностью детекции на длине волны 280 нм и системой обработки результатов, предусматривающей интегрирование пиков. Изоэлектрическое

фокусирование проводится в капилляре с нейтральным покрытием eCAPTM (Beckman-Coulter, США). Все растворы готовят на деионизированной воде.

Приготовление анодного электродного раствора - анолита. В пробирку объемом 15 мл наливают 7 мл деионизированной воды, затем добавляют 137 мкл 85% фосфорной кислоты и доводят объем водой до 10 мл. Раствор перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение 30 дней.

Приготовление катодного электродного раствора - католита. В пробирку объемом 15 мл наливают 7 мл воды, затем при перемешивании и охлаждении добавляют 0,12 г натрия гидроксида, растворяют и доводят объем водой до 10 мл. Хранят при комнатной температуре в течение 30 дней.

Приготовление химического мобилизатора. В пробирку объемом 15 мл наливают 7 мл деионизированной воды, затем добавляют 200 мкл ледяной уксусной кислоты и доводят объем водой до 10 мл. Раствор перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение 30 дней.

Приготовление катодного стабилизатора. 43,5 мг L-аргинина помещают в пробирку типа Эппендорф, добавляют 300 мкл воды и перемешивают до полного растворения. Затем объем доводят водой до 500 мкл, перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение 30 дней.

Приготовление анодного стабилизатора. 13,5 мг иминодиуксусной кислоты помещают в пробирку типа Эппендорф, добавляют 300 мкл воды и перемешивают до полного растворения. Затем объем доводят водой до 500 мкл, перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение 30 дней.

Приготовление 4,3 М раствора мочевины. 2,6 г мочевины помещают в пробирку объемом 15 мл, добавляют 5 мл воды и перемешивают до полного растворения. Затем объем доводят водой до 10 мл, перемешивают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 30 дней.

Приготовление геля для кИЭФ, содержащего 3 Ммочевину. 0,5 г мочевины помещают в пробирку объемом 15 мл, добавляют 1,5 мл геля для кИЭФ (Beckman Coulter) и перемешивают до полного растворения. Затем добавляют гель для кИЭФ до объема 2,75 мл, перемешивают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 30 дней.

Приготовление 20 мМ трис-буфера рН 8.0. В пробирке объемом 15 мл растворяют 24 мг трис(гидроксиметил)аминометана в 9 мл деионизованной воды, доводят рН буфера

концентрированной соляной кислотой до 8, затем объем раствора доводят водой до 10 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 30 дней.

Обессоливание образца субстанции. Раствор белка объемом до 500 мкл наносят на ультрафильтрационную спин-колонку Amicon Пкга-0.5 (Merck-Millipore, США) и центрифугируют при 14000g в течение 7 минут. Затем фильтрат удаляют, в колонку добавляют раствор 20 мМ трис-буфера рН 8.0 до конечного объема 500 мкл и повторяют центрифугирование. Замену буфера проводят дважды.

Приготовление пробы для кИЭФ. Для приготовления пробы в пробирку объемом 1,5 мл добавляют 100 мкл геля для кИЭФ, содержащего 3 М мочевину, 6 мкл амфолитов Pharmalyte 310, 10 мкл катодного стабилизатора, 1 мкл анодного стабилизатора, по 0,5 мкл каждого пептидного маркера и 5 мкл обессоленного образца субстанции. Пробу перемешивают и центрифугируют в течение 5 минут при 5000g.

Подготовка капилляра к проведению капиллярного изоэлектрического фокусирования

В начале каждого дня проводят предварительную подготовку капилляра к проведению капиллярного изоэлектрического фокусирования. После выполнения анализов в конце дня осуществляют подготовку капилляра к хранению.

Для всех растворов, устанавливающихся в систему капиллярного электрофореза, используют пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл с удаленными крышками. Объем заполнения - 700 мкл для рабочих растворов и 300 мкл для слива. Перед установкой пробирки центрифугируют в течение 5 мин при 5000 g.

Кассету с установленным покрытым капилляром длиной 45 см и внутренним диаметром 50 мкм помещают в систему капиллярного электрофореза Капель-105М (Люмэкс, Россия), при этом концы капилляра не должны находиться на воздухе более пяти минут и должны быть немедленно помещены в деионизированную воду.

В начале каждого дня в прибор устанавливают рабочие растворы и проводят кондиционирование капилляра. Для этого осуществляют последовательные промывки капилляра деионизованной водой (4 мин, 2000 мбар), химическим мобилизатором (4 мин, 2000 мбар), деионизованной водой (1 мин, 2000 мбар), гелем для кИЭФ (8 мин, 2000 мбар). Во время всех этапов осуществляется термостатирование капилляра при температуре 20 °С и детекция на длине волны 205 нм.

Проведение капиллярного изоэлектрического фокусирования

Перед введением пробы капилляр промывается раствором 4,3 М мочевины (4 мин, 2000 мбар), затем деионизованной водой (4 мин, 2000 мбар). Образцы вводят при давлении 2000 мбар в течение 2 мин с последующим погружением входного и выходного электрода в воду. Фокусировка проводится раствором анолита на входном конце и католита на выходном конце капилляра при напряжении 25 кВ в течение 20 минут. Затем для химической мобилизации на выходе капилляра устанавливается пробирка с уксусной кислотой (химическим мобилизатором) и подается напряжение 25 кВ в течение 60 минут, после чего капилляр промывается деионизованной водой (5 мин, 2000 мбар). Во время всех этапов осуществляется термостатирование капилляра при температуре 20 °С и детекция на длине волны 280 нм.

Обработка результатов

На полученных во время этапа мобилизации электрофореграммах отмечают пики, соответствующие пептидным маркерам и изоформам белка. Интегрирование пиков производится автоматически в программе Эльфоран (Люмэкс, Россия). Расчет изоэлектрических точек белков осуществляется по уравнению, полученному методом линейной регрессии по зависимости изоэлектрических точек пептидных маркеров от времени их миграции. Отмечают пики, соответствующие нативной форме ИЛ-36РА (pI = 5,23±0,03) и дезамидированной форме белка (pI =5,06+0,03).

Содержание примеси дезамидированной формы в процентах от содержания основного вещества (Х) вычисляют по формуле:

s

X =-дез-X100,

S + S

s нат ^ s дез (5)

где: Здех площадь пика дезамидированной формы на хроматограмме