Молекулярный анализ особенностей радиационного мутагенеза генов black и cinnabar Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.01, кандидат биологических наук Давкова, Лилиана Николаевна

• Давкова, Лилиана Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Давкова, Лилиана Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классический период в изучении радиационного мутагенеза высших эукариот (локус-специфический мутагенез)

1.1.1. Исследования на Drosophila melanogaster

1.1.2. Исследования на других лабораторных тест- объектах

1.2. Биофизические механизмы радиационного мутагенеза

1.2.1. Классический период исследований

1.2.2. Современные представления о структуре трека

1.3. Молекулярная природа радиационно-индуцированных генных мутаций

1.3.1. Исследования на генеративных клетках

1.3.2. Исследования на соматических клетках

1.4. Репарационные механизмы радиационного мутагенеза

1.5. Заключение

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Радиационно-индуцированные мутации двух изучаемых генов D.melanogaster и методические особенности их получения

2.2 Общая и молекулярная генетика генов Ыаск+ и сп+

D.melanogaster

2.3. Методы молекулярного анализа «точковых» мутантов двух

генов

2.3.1 Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.3.2. Секвенирование ДНК гена black у «точковых» мутантов

2.4. Статистический анализ данных

3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Общая характеристика радиомутабильности двух генов

3.2. Результаты ПЦР-анализа

3.2.1. Мутанты black

3.2.2. Мутанты cinnabar

3.3. Результаты секвенирования «точковых» мутантов black

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярный анализ особенностей радиационного мутагенеза генов black и cinnabar Drosophila melanogaster»

ВВЕДЕНИЕ

Современные молекулярно-генетические исследования по изучению природы генных мутаций, индуцированных ионизирующими излучениями, ведутся в основном на соматических клетках in vitro или in vivo с определением мутационных изменений, главным образом, в виде делеций всего или части гена методами блот-гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) и в редких случаях методом секвенирования (UNSCEAR 2000 Report Vol. II).

Аналогичные исследования по выяснению молекулярной природы

радиационно-индуцированных генных мутаций в генеративных клетках

главных для радиационной генетики лабораторных тест-объектов (дрозофила,

мышь) остаются немногочисленными, а их результаты фрагментарны,

поскольку получены на ограниченном материале. В частности, первые

молекулярно-генетические работы с использованием метода блот-

гибридизации показали, что в основе генных мутаций, индуцированных

редко-ионизирующим излучением, как у дрозофилы (Ashburner et. al.,1982;

Kelley et. al., 1985), так и у мыши (Rinchik et.al., 1993) лежат, в основном,

молекулярные делеции варьирующей величины. Близкие результаты

получены и для генных мутаций в опытах на дрозофиле с нейтронами, как

плотноионизирующим излучением (Pastink et.al., 1987). В то же время,

использование метода секвенирования позволило обнаружить более широкий

спектр рентген-индуцированных молекулярных изменений ДНК гена

дрозофилы, включающий наряду с делециями/инсерциями и изменения на

уровне отдельных оснований ДНК (Eeken J.C. et.al., 1994). Вопрос о характере

молекулярных изменений, выявляемых методом секвенирования при

индукции генных мутаций плотноионизирующими излучениями, в частности

нейтронами, в генеративных клетках до сих пор остается открытым. Таким

образом, ограниченность имеющихся данных для генеративных клеток

затрудняет экстраполяцию на них результатов, полученных на соматических,

и не позволяет выявить общие и специфические для двух типов клеток

4

закономерности образования радиационно-индуцированных молекулярных изменений гена.

Важным и актуальным при проведении таких исследований является также изучение молекулярной природы мутаций разных генов в одних условиях эксперимента, что открывает перспективу для оценки характера модификации реакции гена на действие редко- и плотноионизирующего излучения такими его переменными параметрами, как величина, экзонно-интронная организация, положение на хромосоме и в ЗБ генома. В процессе проведения этих исследований наибольший интерес представляет индукция первичных повреждений ДНК в гаплоидном геноме зрелых гамет (спермиев), поскольку репарация этих повреждений осуществляется репарационными системами зиготы после сингамии. Последующий молекулярно-генетический анализ реализованных предмутационных повреждений гена позволяет по характеру наблюдаемых изменений ДНК установить, активность какой репарационной системы в зиготе генерирует эти изменения.

Между тем знание молекулярной природы генных мутаций, индуцированных в генеративных клетках высших организмов ионизирующими излучениями с низкой и высокой ЛПЭ и особенно нейтронами, с которыми, как известно, человек все чаще сталкивается на Земле и в Космосе, имеет наряду с отмеченным выше фундаментальным и большое практические значение. В самом деле, получение таких фундаментальных данных может стать экспериментальным обоснованием новых молекулярно-генетических подходов к сравнительной оценке риска редкоионизирующих излучений и нейтронов в индукции качественно разных молекулярных изменений гена, проявляющих себя в чреде поколений в виде дополнительного популяционно-генетического груза.

Вполне очевидно, что подобные исследования возможны лишь на немногих генетически хорошо изученных и относительно недорогих для эксперимента тест-объектах, среди которых в этом отношении наиболее

перспективной остается плодовая мушка - Ого8орЫ1а melanogaster.

5

Цель и задачи работы. Целью работы являлось сравнительное изучение молекулярной природы мутаций двух близких по величине и организации, но с разной локализацией на хромосоме, генов Ыаск+ и cinnabar+ (сп+) Drosophila melanogaster, индуцированных ионизирующими излучениями с низкой и высокой ЛПЭ.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Систематизировать коллекционный материал для двух генов по характеру генетических изменений «точковой» или аберрационной природы, виду и дозе радиации.

2. Установить характер зависимости частоты мутаций «точковой» и аберрационной природы от дозы у-излучения и нейтронов для двух генов и оценить ОГЭ нейтронов в индукции этих мутаций.

3. Изучить методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) характер и локализацию на карте двух генов регистрируемых изменений у у- и нейтрон-индуцированных «точковых» мутантов.

4. Провести сравнительный анализ секвенированных последовательностей ДНК родительских (контрольных) аллелей black,1 и Ыаск+п и спонтанных мутаций этого гена.

5. Проанализировать секвенированные последовательности оснований ДНК у- и нейтрон-индуцированных аллелей black у «точковых» мутантов без выявляемых методом ПЦР изменений и определить характер доминирующих повреждений для двух видов радиации.

Положения, выносимые на защиту.

1. Геноспецифичность молекулярной картины радиомутабильности, установленная методом ПЦР, для двух изученных генов и видов радиации проявляется в доминировании делеционных мутантов у гена сп, находящегося в районе прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R, и мутантов с «точковыми» изменениями у гена black, локализованного в средней части эухроматина хромосомы 2L.

2. У у-индуцированных «точковых» мутантов black доминируют, согласно результатам секвенирования, однонуклеотидные изменения ДНК, а у нейтрон- индуцированных - изменения ДНК, специфичные для аллеля-маркера black1 из материнской (родительской) тестер-линии.

3. Генная конверсия в ранней зиготе является одним из основных механизмов репарации ЛПЭ- зависимых повреждений ДНК, определяющих высокую ОГЭ нейтронов в индукции «точковых» мутаций гена Ыаск.

4. Конверсионный механизм репарации ЛПЭ- зависимых повреждений ведет к гомозиготности по уже имеющемуся у гетерозиготы Fi материнскому мутантному аллелю black1.

Научная новизна работы. Впервые в одних условиях эксперимента на примере двух генов D. melanogaster и для двух видов радиации установлена геноспецифичность в молекулярной картине их радиомутабильности, проявляющаяся в доминировании мутантов сп с частичными делениями гена, а мутантов black - с «точковыми» изменениями, не определяемыми методом ПЦР.

Впервые показано образования генных («точковых») мутаций в генеративных клетках дрозофилы на основе нейтрон-индуцированных ЛПЭ-зависимых первичных повреждений ДНК.

Впервые установлена важная роль межаллельной рекомбинации по типу генной конверсии как механизма репарации ЛПЭ- зависимых предмутационных повреждений ДНК гена в облученных спермиях дрозофилы, функционирующего в ранней зиготе после сингамии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Классический период в изучении радиационного мутагенеза высших эукариот (локус-специфический мутагенез)

1.1.1. Исследования на Drosophila melanogaster

Открытие мутагенного действия рентгеновских лучей на Drosophila melanogaster с использованием метода учета рецессивных сцепленных с полом леталей (РСПЛ) ознаменовало рождение нового для общей генетики и радиационной биологии направления - радиационной генетики (Muller H.J., 1927). Это открытие стало возможным благодаря тому, что дрозофила была к этому времени генетически хорошо изученным лабораторным тест-объектом и были разработаны наряду с методом РСПЛ и другие методы учета индуцированных мутаций (метод сцепленных Х-хромосом, метод специфического локуса). Среди названных методов лишь метод специфического локуса позволял учитывать весь возможный спектр генетических изменений изучаемого гена. Другим достоинством этого метода являлась возможность изучения радиомутабильности именно рецессивных генов дрозофилы, частота мутирования которых среди видимых мутаций в несколько раз выше, чем доминантных (Ли Д.Е., 1963).

Уже в ранних работах с использованием этого метода был установлен

достаточно сложный спектр радиационно-индуцированных изменений гена,

который по физиологическим проявлениям мутации был классифицирован

на три основных категории мутаций: 1) мутанты Fi с доминантной

стерильностью 2) мутанты с сопутствующей рецессивной летальностью 3)

жизнеспособные в гомозиготном состоянии мутанты, позже определяемые

как «точковые» или истинно генные мутации (Глембоцкий Я.Л., 1936;

Patterson J.T., 1932;ГептнерМ.А. и ДемидоваЗ.А., 1936;ГептнерМ.А., 1938).

Также этими авторами, а позже и другими (ShuKLa Р.Т. et al., 1979) было

установлено, что разные локусы могут мутировать с разной частотой. Первая

попытка определить природу этих различий показала, что разная

8

мутабильность может определяться структурой самого гена или ближайшего его генетического окружения (Timofeeff-Ressowsky N. W., 19326).

Детальные исследования более поздних работ показали, что стерильность и летальность обусловлены сложными хромосомными перестройками, а именно, в основе стерильности чаще всего лежат транслокации, тогда как делеции, захватывающие смежные изучаемому гену локусы (так называемые мультилокусные делеции), лежат в основе летальности (Demerec М., 1938; Lefevre G., 1967; Lifschytz Е. and Falk R., 1968; Valencia R.M., 1970).

Проанализировав данные литературы и проведя собственный цитогенетический анализ рентген-индуцированных рецессивных видимых мутаций в 8-ми локусах Х-хромосомы в постмейотических генеративных клетках самцов D. melanogaster, Valencia J.I. and Muller H.J (1949) пришли к выводу о том, что значительная часть жизнеспособных, плодовитых, не мозаичных видимых мутаций могут считаться «генными» мутациями без дальнейшего анализа. В тоже время, генными мутациями можно считать мутации и тех генов, например cat, car, ras, которым свойственен летальный эффект, но только в том случае, если цитологически показано, что такие мутации не связаны с аберрациями хромосом (Muller H.J,1954а).

Дальнейшие и более комплексные генетические и цитогенетические

исследования генетической природы у- индуцированных в зрелых спермиях

самцов D. melanogaster мутаций двух сцепленных с полом и трех аутосомных

локусов позволили более детально охарактеризовать спектр генных мутаций

аберрационной и «точковой» природы (Alexandrov I.D., 1984, Александров

И.Д., 1987). В частности, класс аберрационных мутаций гена может включать

такие категории генетических изменений как мультилокусные делеции и

обменные перестройки (инверсии, транслокации, транспозиции), один из

аберрационных разрывов которых всегда ассоциирован с районом

локализации изучаемого гена. Класс «точковых» мутаций может включать

две категории изменений: простого типа соответствующему генным

мутациям по определению Valencia J.I. and Muller H.J (1949), в геноме

9

которых не обнаруживаются дополнительные и независимые генетические повреждения и представляющие собой серию мутантных аллелей гена спонтанного или радиационного происхождения, а также комплексные. Последние представляют собой сочетание в одном геноме простой «точковой» мутации изучаемого локуса с другими независимо индуцированными изменениями других генов «точковой» или хромосомной природы.

Наряду с изучением генетической природы локус-специфических мутаций уже в первых работах была изучена зависимость частоты всех мутаций гена в целом от дозы рентгеновского излучения, которая во всех изученных случаях оказалась линейной (Muller H.J., 1928; Oliver С.Р., 1930; Timofeeff-Ressowsky N.W 1934; Гептнер M.A. и Демидова 3.A., 1936). Эти результаты подтвердили и более поздние исследования, согласно которым дозовая зависимость частоты индукции как всех мутаций в целом, так и мутаций аберрационной и «точковой» природы в отдельности носила линейный характер (Александров И.Д., 1984).

Как это видно из рассмотренных выше работ, изучался радиационный

мутагенез отдельных генов D. melanogaster главным образом после действия

редкоионизирующего излучения. Первая попытка оценить эффективность

плотноионизирующего излучения, в частности нейтронов, была проведена на

D. melanogaster с использованием теста на РСПЛ (Timofeeff-Ressovsky N. W.,

Zimmer K.G., 1947). Полученные результаты показали, что нейтроны менее

эффективны, чем рентгеновское излучение в индукции этого типа мутаций,

которые в то время принимались за генные мутации, учитывая линейную

зависимость их индукции от дозы Х-лучей. Именно эти результаты легли в

основу первых классических представлений о биофизических механизмах

индукции генных мутаций ионизирующими излучениями, известный в

литературе как теория мишени и принцип попадания (Timofeeff-Ressovsky

N.W., Zimmer K.G., 1947; Ли Д.Е., 1963). Согласно этим представлениям к

генным мутациям ведут малоионизационные события попадания в ген-

10

мишень, в отличие от хромосомных аберраций, для индукции которых необходимы многоионизационные события попадания (подробнее см. раздел 1.2.1 в «Обзоре литературы»).

Однако, более поздние работы не подтвердили этих первых данных, однозначно свидетельствуя о том, что нейтроны более эффективны, чем редкоионизирующее излучение в индукции РСПЛ (Александров И.Д.,1991). Это и не удивительно учитывая тот факт, что РСПЛ представляют собой, как показали цитогенетические исследования, смесь «точковых» и хромосомных мутаций с более значительным вкладом последних в их общий спектр (Дубинин Н.П. и др., 1941). Низкая эффективность нейтронов в индукции РСПЛ, установленная в ранних исследованиях, была обусловлена, как полагают, неточной дозиметрией нейтронов и анализом индуцированных мутаций в постмейотических генеративных клетках, имеющих разную радиочувствительность (Dauch F. et al., 1966).

Более поздние и комплексные исследования на D. melanogaster с использованием метода специфического локуса и детальным генетическим, цитогенетическим анализом у- и нейтрон-индуцированных в зрелых спермиях мутаций 5 разных генов показали, что нейтроны заметно более эффективны в индукции мутаций аберрационной природы, чем «точковой». В индукции последних в среднем для 5-ти генов коэффициент ОГЭ нейтронов (0.85МэВ) был равен 1.1 при его традиционной оценке как отношение линейных коэффициентов дозовых кривых и намного меньше единицы (0.3) при изоэффективных дозах, определяющих 15% уровень выживаемости (ЛД!5) (Александров И.Д., 1984).

1.1.2. Исследования на других лабораторных тест- объектах

Почти одновременно с дрозофилой были начаты исследования по

изучению радиомутабильности отдельных генов у Bombix mori после

действия редкоионизирующего излучения. При изучении выживаемости

мутантов-гомозигот по локусам pe, re, ch было установлено, что большая их

11

часть была нежизнеспособной уже на эмбриональной стадии развития из-за аберрационной природы этих мутаций (Tazima Y., 1978). Близкие результаты о преобладании хромосомных аберраций в виде мультилокусных делеций были получены и при изучении радиомутабильности локуса ad-3 у Neurospora crassa после действия рентгеновского излучения (F.J. de Serres, 1989а).

Успехи генетики мыши позволили начать исследования по изучению радиационного мутагенеза с использованием метода специфического локуса на этом лабораторном тест-организме (Russell W.L., 1951). Продолжительные эксперименты на 7-ми локусной тест-системе позволили установить, что, как и у дрозофилы, у мыши разные локусы могут мутировать с разной частотой (Russell W.L., 1965а,b). Как на нейроспоре при исследовании действия рентгеновских лучей на локус ad-3 (F.J. de Serres, 1989a, 1989b), так и на мышах при изучении действия того же вида облучения на локус специфические мутации в регионе dilute-short ear (Russell L.B., 1971; Rinchik E.M. and Russell L.B., 1985) была выявлена неожиданно высокая частота мультилокусных делеций по сравнению с частотой «точковых» мутаций.

Дальнейшие исследования с нейтронами впервые для генов мыши показали более высокую эффективность нейтронов в индукции мультилокусных делеций и леталей по сравнению с редкоионизирующим излучением (Searle A.G and Phillips R.J.S 1964, 1967; Russell L.B.,1979a,b, 1987). Близкие результаты были получены и на тутовом шелкопряде после действия 14МэВ нейтронов (Murakami А., 1971). При этом автор предположил, что «точковые» мутации могут также включать в себя и небольшие потери или делеции.

Таким образом, на всех классических генетических тест-объектах

(дрозофила, тутовый шелкопряд, нейроспора и мышь) получены близкие

качественные и количественные закономерности индукции генных мутаций

в генеративных клетках ионизирующими излучениями с низкой и высокой

ЛПЭ. Одновременно на основе этих данных были сформулированы первые

12

биофизические представления о генетическом действии этих качественно разных видов радиации.

1.2. Биофизические механизмы радиационного мутагенеза

1.2.1. Классический период исследований

Первый и существенный шаг в направлении понимания физических основ биологического действия ионизирующих излучений был предпринят Дессауром, который в 1922 году предложил теорию «точечного тепла», предполагающую, что энергия концентрируется в малых объемах, приводя объект к микролокальному разогреву и конечный эффект будет зависеть от случайных попаданий дискретных порций энергии в жизненно важные микрообъемы объекта - «мишени» (Безэаиег Б., 1922; Тимофеев-Ресовский Н.В. и др., 1968).

Однако, для выяснения этого феномена нужны были точные

количественные эксперименты, которые не могли быть методологически

правильными без установки точной дозиметрии. К началу ЗОх годов была уже

достаточно хорошо разработана ионизационная дозиметрия, позволившая

проводить дальнейшие исследования в этой области и накопить достаточно

материала для предложения новой теории, плавно вытекавшей из теории

«точечного тепла». Впервые в работе «О природе генных мутаций и

структуре гена» ТтоГееГ^Кеззоуэку КУ. (1935), совместно с К. Циммером и

М. Дельбрюком сформулировали принцип попадания и теорию мишени, в

законченном виде которая была представлена в более поздних работах (Ли

Д.Е., 1963). Суть ее заключалась в следующем: наблюдаемый биологический

эффект связан с попаданием (это акт ионизации), мишенью которого является

некая особая молекула (при генных мутациях) или структура (при

хромосомных мутациях) (Ли Д.Е., 1963; Фриц-Ниггли X., 1961). Развивая эту

теорию акты попадания Ли разделил на малоионизационные (одиночные

ионизации, одноударное попадание, один трек), биологическое действие

13

которых носит характер генных мутаций, кривые доза-эффект которых представляют собой линейную зависимость, и многоионизационные (двухударное попадание), доза-эффект которых описывает линейно-квадратичная кривая. Его представление о двухударном механизме образования аберраций было основано на результатах экспериментов Сакса по анализу хромосомных аберраций у традесканции, позволяющие предположить, что минимальное количество энергии, достаточное для разрыва хромосомы, соответствует 15-20 ионизациям (Ли Д.Е., 1963). К аналогичному выводу о более высокой эффективности плотноионизирующих излучений по сравнению с редкоионизируюшими в индукции хромосомных аберраций, но меньшей их эффективности в индукции «точковых» мутаций приходит и WolffS. (1967).

В тех случаях, когда видимые рецессивные и доминантные мутации представляют собой смесь генетических изменений «точковой» и аберрационной природы, зависимость их индукции от дозы редкоионизирующего излучения имеет сложный двухфазный характер и включает одно- и двухударные компоненты (Ives Р.Т., 1959). Однако для определения конкретной генетической природы таких мутаций необходим дополнительный генетический и цитогенетический анализ.

Новые данные, подтверждающие эти классические представления, были получены также и на мышах, где было показано, что нейтроны менее эффективны, чем редкоионизирующее излучение в индукции жизнеспособных «точковых» мутантов мыши по albino и олокусам, но более эффективны в индукции мутантов с летальными и полулетальными рецессивными эффектами (Russell L.B 1979а, b).

Таким образом, физическое понятие принципа попадания оказалось

различным для генных и хромосомных мутаций и в рамках этих

представлений различные типы ионизирующих излучений должны

отличаться в эффективности индукции этих главных классов мутаций.

Другими словами, нейтроны, например, должны быть менее эффективны в

14

индукции генных мутаций и, наоборот, более эффективны в индукции хромосомных мутаций, что и наблюдалось в опытах.

1.2.2. Современные представления о структуре трека Заметный вклад в понимание биофизических механизмов радиационного мутагенеза внесли современные представления о структуре трека, которые выявили ряд новых факторов, необходимых для лучшего понимания механизмов образования различных видов молекулярных повреждений ДНК, наблюдаемых после действия ионизирующих излучений разного качества.

В первую очередь в ряде работ (Goodhead D.T. et а1., 1980, 1985) был

определен чувствительный объем действия ионизирующих излучений как

нанометровой мишени, а экспериментальные данные Райтберга (Rydberg В.,

1996), показавшие не случайное распределение размеров фрагментов после

действии ионизирующих излучений разного качества, экспериментально

доказали, что мишенью является 30 нм нить интерфазного хроматина.

Дальнейшие исследования по изучению различных видов молекулярных

изменений, индуцированных ионизирующими излучениями, таких как

повреждения оснований, однонитевые разрывы (ОР), двунитевые разрывы

(ДР) и вклада этих повреждений в конечные генетические эффекты, такие как

летальные мутации, аберрации, генные мутации (описанные еще в 30-40 годы)

показали, что наиболее опасным является образование ДР, однако не он сам

как считалось ранее, а в сочетании с другими рядом расположенными видами

повреждений (в пределах 10 п.н.), такой вид повреждений был назван

кластерным (Goodhead D.T., 2006). Эти предположения подтверждаются

меньшей зависимостью образования простых ДР от ЛПЭ, в то время как

выживаемость и хромосомные аберрации имеют четкую зависимость от ЛПЭ

(Barendsen G.W., 1994). Так как ЛПЭ описывает физические параметры трека,

для лучшего понимания необходимо разобрать какие возможные механизмы

по современным представлениям лежат в основе различных видов

повреждений. Как было показано в ряде работ, структура трека как с низким,

так и с высоким ЛПЭ, гетерогенна и состоит из частиц с различной энергией

15

и длиной пробега. В опытах по облучению клеток китайского хомячка ионами неона и ионами аргона с ЛПЭ 234 и 117 кэВ/мкм, соответственно, было показано что, сублетальные повреждения индуцируются высоко энергетичными 8-электронами (Ngo F.Q. et al., 1981, 1988). На этой же модельной системе было установлено, что у-излучение 60Со индуцирует ДР кластерного типа, главным образом, 5-электронами в конце их пробега, на который приходиться 30% всей их первоначальной кинетической энергии (Botchway S.W. et al., 1997).

Используя модель Монте-Карло было вычислено, что возникновение кластерных двунитевых разрывов для излучений с высокой ЛПЭ составляет 70%, а если принимать во внимание и повреждения оснований, то доля кластерных повреждений составляет 60% и 90% для излучений с низким и высоким ЛПЭ соответственно. Таким образом, доля кластерных ДР с учетом поврежденных смежных оснований возрастает в два раза от излучений с низкой до высокой ЛПЭ (Nikjoo Н. et al., 1999).

В своей работе, о важности структуры трека в радиационном повреждении ДНК (Hill М.А., 1999) Хилл подтверждает гипотезу о росте кластерных повреждений с ростом ЛПЭ и их большей эффективности, приведя данные исследований по репарации ДР и ОР после действия редко- и плотноионизирующих излучений. Исследования кинетики репарации ДР при помощи импульсного гель-электрофореза установили, что через 3 часа более 90% таких разрывов, индуцированных у-квантами были восстановлены, в то время как лишь 30-50% таких повреждений восстановилось в течении тех же 3 часов после действия а-частиц (Jenner T.J. et al., 1993). При облучении плазмидной ДНК у-квантами и а-частицами в дозе, продуцирующей 50% ОР было обнаружено, что 50% из ОР после облучения а-частицами перешли в ДР, тогда как лишь 12% у-индуцированных ОР перешли в ДР (Botchway S.W. et al., 1997).

Резюмируя все вышесказанное, следует отметить, что современные

представления о сложной структуре трека показывают более сложную

16

картину не только энерговыделений частицы на ее пути, но и формирования первичных повреждений ДНК различной степени сложности и репарируемости (Goodhead D.T., 2006).

Таким образом, теория структуры трека ставит вопрос - какая компонента трека (редко- или плотноионизирующая) и какого типа ими продуцируемые первичные повреждения ДНК ведут к наблюдаемым генным мутациям? Какие реализованные молекулярные изменения ДНК могут наблюдаться после их действия? Все эти вопросы будут рассмотрены в следующем разделе.

1.3. Молекулярная природа радиационно-индуцированных генных

мутаций

1.3.1. Исследования на генеративных клетках

Рождение молекулярной биологии и разработка ее методов блот-гибридизации по Саузерну, секвенирования ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР) (70-80е годы) открыло перспективу решения поставленного еще классической радиационной генетикой вопроса о молекулярной природе генных мутаций, индуцированных ионизирующими излучениями разного качества.

Первым, широко применяемым методом молекулярного анализа стал

метод блот-гибридизации, который позволял определить полную или

частичную потерю гена. Полученные этим методом на Drosophila

melanogaster результаты показали, что значительная доля рентген -

индуцированных мутаций генов Adh, Notch и гу представлены в основном

делециями (Cote В. et al., 1986; Mahmoud J. et al., 1991). В частности, Cote В.

et al. (1986) было обнаружено, что среди выборки из 75 рентген-

индуцированных гу мутантов 30% из них составляли цитологически

детектируемые крупные делеции, 17% нехватки и перестройки,

детектируемые блот-гибридизацией, и 58% составляли возможные

«точковые» мутации. Однако, анализ выборки из 31 рентген-индуцированной

17

мутации локуса Adh методом блот-гибридизации по Саузерну показал, что только 3 мутанта (10%) имели нормальную структуру гена (Kelley M.R. et al., 1985). Такой же анализ этим же методом 6-ти рентген-индуцированных мутаций white выявил делеционную природу только у трех из них (делеции 1.2, 16 и 30 п.н.), остальные 3 имели нормальную структуру гена (Zachar Z. and Bingham P.M., 1982). В другой работе на этом же локусе white и с использованием метода блот-гибридизации было установлено, что только 5 из 11 изученных рентген-индуцированных мутантов имели нормальную рестриктную картину гена, тогда как все остальные, включая 4 нейтрон-индуцированных мутанта, имели структурные изменения типа частичных делеций гена или структурные изменения, связанные с обменами (Pastink А. et. al., 1987) Последующее секвенирование этих 5-ти рентген-индуцированных white мутантов без изменений, выявляемых болт-гибридизацией, позволило установить, что в основе 4-х из них лежат делеции размером от 6 до 29 п.н., а у 5-го - делеция с инсерцией (Pastink A. et al., 1988). Также и в своей работе Eeken J.C. et al. (1994) проведя сиквенс- анализ рентген-индуцированных мутантов vermilion обнаружил 3 небольшие делеции (1-10 п.н.), одну инсерцию (в 2 п.н.), 7 однонуклеотидных замен и 4 мутанта без выявленных изменений. В обеих работах сиквенс- анализ выявил комплексные мутационные изменения в виде делеции с инсерциями, одновременно было установлено, что часто делеции фланкированы прямыми короткими повторами с потерей одного из них при образовании делеций. Сравнительный анализ методом ПЦР случайной выборки у- и нейтрон-индуцированных «точковых» мутантов по гену vestigial, индуцированных в зрелых спермиях D. melanogaster выявил также преобладание у нейтрон-индуцированных частичных делеций того или иного района гена по сравнению с у- индуцированными (Александров и др. 2001).

На мышах в локусе albino(c) методом блот-гибридизации у 13 из 27 радиационно-индуцированных были также обнаружены большие делеции и

перестройки (Rinchik Е.М. et al., 1993).

18

Такие работы по исследованию молекулярной природы индуцированных радиацией мутационных изменений в генеративных клетках (в отличие от классического периода) не многочисленны и отрывочны и, как видно из приведенных выше работ, с очень ограниченными выборками. Эта ситуация возникла в следствии того, что для генеративных клеток сменилось направление исследования в сторону химического мутагенеза как на мышах, так и на других объектах, а в радиационном мутагенезе сменился объект исследований с генеративных клеток на соматические, так как появилась возможность культивировать клетки in vitro, что дает возможность более просто и быстро получить результат.

1.3.2. Исследования на соматических клетках

Уже в первых опытах на соматических клетках с использованием метода блот-гибридизации и гена-репортера hprt (около 40 т.п.н. весь ген, 1-9 экзоны около 2 т.п.н.) было установлено, что значительная доля рентген-индуцированных мутаций представлена потерями всего, либо значительной части гена (как и в локусе white в генеративных клетка) (Thacker J. et al., 1990; Whaley J.M. and Little J.B., 1990), тогда как в случае другого гена-репортера aprt (размер 2,6 т.п.н.) подобных изменений обнаружено не было (Braimer L.H. et al., 1986). Аналогичные результаты для рентгеновского излучения, полученные этим методом на этой же тест-системе, подтверждают тот факт, что у локуса hprt преобладают крупные делеции, тогда как у aprt - скрытые микромолекулярные изменения (H.L. Liber et al., 1987).

Новым этапам исследований природы радиационно-индуцированных

мутаций этих генов- репортеров в соматических клетках стали исследования

с использованием метода ПЦР. Уже в первой работе было показано, что

спектр у-индуцированных (2-5 Гр) мутационных изменений гена aprt в

лимфоцитах человека представлен в основном крупными делециями,

затрагивающими как сам ген, так и смежные геномные последовательности

(Fujimori et al., 1992). Анализ 9 экзонов hprt мутантов после действия

19

рентгеновских- и альфа-лучей 238Ри также методом ПЦР выявил, как и блот-анализ в предыдущих работах, полную потерю гена у половины мутантов (Aghamohammadi S.Z. et al.,1992, Bao C.Y. et al., 1995). Сравнительный анализ мутагенного действия на клетки яичника китайского хомячка (СНО) in vitro тепловых и надтепловых реакторных нейтронов показал, что в спектре hprt-индуцированных мутантов преобладают полные и частичные делении гена (Kinashi Y., et al., 2000).

В более поздней работе (Mognato М. et al., 2001) на клетках лимфоцитов периферической крови человека также была показана сложная и дозово-зависимая картина радиационного мутагенеза локуса hprt. В частности, при низких дозах (до 2 Гр) наблюдалась индукция преимущественно точковых мутаций. С увеличением дозы (до 3 Гр) наблюдался рост делеционных мутантов. Интересно, что после облучения в дозе 3 Гр было обнаружено несколько комплексных мутантов, имеющих 2 независимые делеции внутри гена. Было также установлено, что внутригенные делеции чаще всего затрагивают экзон 3,3'-конец гена со смежными последовательностями ДНК. На лимфобластах человека было установлено, что лишь низкие дозы редко-и плотноионизирующего излучения дают близкий спектр микроизменений гена hprt. С увеличением дозы плотноионизирующего излучения (]251) резко возрастает выход крупных делеций гена (Whaley J.M. and Little J.B., 1990). Фактически все эти результаты подтверждают данные о дозово-зависимом увеличении частоты делеционных мутантов по локусу hprt, полученных на фибробластах человека (Min S.Park et al., 1995).

Первые работы по секвенированию двух мутаций aprt показали наличие

у них микроделеций из 20 п.н и 58 п.н. в комбинации с независимой делецией

в 13 п.н (L.H. Breimer et al., 1986, T.L.Morgan et al., 1990). В дальнейшем, на

большем материале в результате секвенирования 16 «точковых»,

индуцированных редкоионизирующим излучением, мутаций гена aprt было

выявлено 11 замен (4 транзиций, 7 трансверсий), 1 сдвиг рамки считывания и

4 делеции (1-18 п.н) (Grosovsky A.J. et al., 1988). В близких условиях

20

эксперимента другими авторами были получены сходные результаты показывающие, что среди 27 изученных «точковых» мутаций выявлено 15 замен (4 транзиции и 11 трансверсий), 4 сдвигов рамки считывания, 3 множественных изменений и 5 делеций (5-30 п.н.) (Miles С. and Meuth M., 1989).

В экспериментах по изучению молекулярной природы рентген-индуцированных (1-5 Гр) мутаций гена hprt, клонированного в векторе, были получены близкие результаты, показывающие, что у 38 изученных мутантов в 9 экзонах гена наблюдались у 15 (39%) замены оснований, у 9 (24%)- сдвиг рамки считывания, у 11 (29%) - внутригенные делеции, а у 3 (8%)-мутационные изменений неустановленной природы (Hiroshi Kimura et al., 1993). Близкие результаты были получены и в работе Bao C.Y. et al., (1995). Одновременно в работах с генами aprt и hprt авторы отмечали тот интересный факт, что делеции, выявляемые секвенированием, фланкированы короткими прямыми повторами с потерей одного из них при формировании делеций (Miles С. and Meuth M., 1989; Mahmoud J. et al., 1991; Grosovsky A.J. et al., 1988; Morris T. and Thacker J., 1993).

Таким образом, исследования на соматических клетках с использованием всех главных методов молекулярной биологии и генетики показывают, что спектр молекулярных изменений в изученных генах- репортерах, включает наряду со всей или частичной потерей гена и микромолекулярные изменения на уровне отдельных оснований ДНК, и небольшие делеции (до 50 п.н.), которые также, как и в генеративных клетках фланкированы короткими повторами. При этом необходимо отметить, что при небольших дозах редкоионизирующего излучения преобладают микромолекулярные изменения ДНК, тогда как с увеличением дозы радиации доминирующими становятся делеции всего или значительной части гена. Важно также отметить, что как видно из всех выше рассмотренных работ спектры выявляемых всеми молекулярными методами изменений генов как в

генеративных, так и в соматических клетках качественно совпадают.

21

1.4. Репарационные механизмы радиационного мутагенеза

Радиационно-индуцированные генные мутации в генеративных и соматических клетках эукариот можно рассматривать как ошибки уже известных систем репарации тех или иных первичных повреждений ДНК. Хотя сам феномен репарации (восстановления) от радиационного повреждения на клеточном и хромосомном уровнях был описан еще в конце 50-х, начале 60-х годов прошлого века (Корогодин В.И. 1958, 1959, 1966; Лучник Н.В. 1959а, b; Elkind М.М. and Sutton H. 1959, 1960), идентификация отдельных систем репарации повреждений ДНК и молекулярные механизмы, лежащие в их основе, стали проясняться лишь в конце прошлого, начале нашего столетия. При этом необходимо отметить что у Drosophila функционируют все главные консервативные системы репарации, которые свойственны всем представителям эукариот, начиная от дрожжевых клеток и заканчивая человеком. При этом, вклад отдельных систем в репарацию радиационно-индуцированных повреждений ДНК будет рассмотрен ниже.

Одной из наиболее консервативных систем репарации, устраняющей

гетеродуплексы ДНК разной природы, является репарация неспаренных

оснований, впервые описанная у бактерий и вскоре идентифицированная у

высших организмов (Friedberg Е.С. et al., 2006), включая дрозофилу (Flores

С.С., 2001; Skelesky J. et al., 2000a; LaRocque J.R et al., 2007). В 50% случаев

репарация неспаренных оснований безошибочна, а в остальных 50% является

мутагенным фактором, инициирующим мутационные повреждения в виде

сдвига рамки считывания (Modrich Р., 1991; MacPhee D.G., 1996). Небольшие

делеции также могут быть генерированы этим видом репарации, закрепляя

мутационные изменения, возникающие в результате проскальзывания

(slippage) полимеразы во время репликации в местах повторов (Albertini A.M.

et al., 1982). Такой механизм рассматривается как объясняющий появление

выявленных молекулярными методами небольших делеций,

22

индуцированных Х-лучами в локусе white (Pastnik А et al., 1988) в генеративных клетках, и индуцированные небольшие делеции и сдвиги рамки считывания тем же видом радиации в локусе hprt в соматических клетках (Hiroshi Kimura et al.,1993).

Другой путь исправления уже более сложных одноцепочечных повреждений ДНК, индуцированных УФ и ионизирующей радиацией, - это безошибочно работающая нуклеотидная эксцизионная репарация, механизм которой детально описан в ряде обзоров (De Laat W.L. et al., 1999, Sancar A.S., 1996, Wood R.D., 1996).

Наиболее важным с точки зрения генетических последствий являются двунитевые разрывы (ДР), которые индуцируют прямо или косвенно (через активность эндонуклеаз) любые виды ионизирующей радиации. Как стало известно в последнее время, репарация ДР может осуществляться несколькими клеточными репарационными системами и контролироваться такими факторами как природа концов разрыва и смежных последовательностей, тип клеток, стадия клеточного цикла, наличие или отсутствие гомолога (Lambert S. and Lopez B.S., 2000, Fiorenza M.T. et al., 2001, Saintigny Y. et al., 2001, Chmuzh E.V. et al., 2006).

Среди этих систем наибольшее значение для образования структурных перестроек хромосом имеют, как полагают, негомологичное сшивание концов {nonhomologous and joining, NHEJ), хотя результатом ее активности могут являться такие мутационные изменения, как небольшие инсерции и делеции (Preston C.R. et al., 2006; Chmuzh E.V. et al., 2006).

Другой системой репарации, не требующей гомолога и ведущей к небольшим делециям, является система одноцепочечного отжига {singlestrand annealing, SSA), требующая наличие коротких прямых повторов (Preston C.R. et al., 2006; Chmuzh E.V. et al., 2006; Fishman-Lobell J. et al., 1992). Как было показано на D. melanogaster, репарация ДР при транспозициях Р-элемента в генеративных клетках осуществляется чаще всего посредством

SSA при наличии прямых повторов (Preston C.R. et al. 2002; Fishman-Lobell J.

23

et al., 1992). Также установлено, что система SSA доминирует на ранних стадиях развития генеративных клеток, немного меньше в промежуточных стадиях и совсем редко перед мейозом (Preston C.R. et al. 2006).

Среди репарационных систем, основанных на гомологичной рекомбинации в настоящее время идентифицировано несколько молекулярных механизмов, ведущих к конверсии гена, но отличающихся размером репарируемых участков и наличием или отсутствием структуры Холлидея. Первым и наиболее изученным механизмом является рекомбинация с образованием структуры Холлидея, результатом разрешения которой может являться образование кроссоверных или некроссоверных продуктов рекомбинации (Pardo В. et al., 2009).

Другой механизм репарации ДР основан на синтез- зависимом отжиге цепей ДНК (synthesis-dependent strand annealing, SDSA) (Pardo В. et al., 2009). Как было показано в ряде работ, именно этот путь репарации ДР является доминирующим в предмейотических зародышевых и соматических клетках дрозофилы и ведет к конверсии гена без образования кроссоверов (Nassif N. and Engels W. 1993; Nassif N.A. et al., 1994; Adams M.D. et al., 2003; LaRocque J.R et al., 2007; Rong Y.S. and Golic K.G., 2003; Preston C.R. et al., 2006). Доминирование этого механизма репарации у дрозофилы обусловлено, вероятно, гораздо более тесной конъюгацией гомологичных хромосом в интерфазе митотически делящихся клеток, чем у других организмов, в частности, у дрожжевых клеток и человека (Becker H.J., 1976; Hilliker A. J., and Appels R., 1989).

При исследовании репарации ДР, индуцированных рентгеновскими лучами у ранних эмбрионов дрозофилы, было установлено преобладание репарации по механизму гомологичной рекомбинации по-видимому по пути SDSA (Ducau J. et al., 2002), а нейтроны, как было показано ранее на митотически делящихся клетках крыловых иммагинальных дисков Drosophila melanogaster, в 5-6 раз на единицу дозы более эффективны, чем

рентгеновские лучи в индукции конверсионных событий (Ayaki Т. et al. 1990).

24

Авторы также полагают, что столь высокая частота конверсионных событий после действия нейтронов обусловлена специфической для дрозофилы более тесной конъюгацией гомологичных хромосом в интерфазе соматических клеток.

Еще один механизм, ведущий к генной конверсии, так называемая индуцированная разрывом репликация {break induced replication, BIR) предполагает расчистку и застройку по гомологичной хромосоме значительных участков ДНК, что может вести к гомозиготности значительного числа генов в данном генотипе (Pardo В. et al., 2009, Kraus Е. et al., 2001).

1.5. Заключение

Весь спектр мутационных изменений любого гена на различных объектах включает два класса мутаций - хромосомные и «точковые», как было установлено в классический период радиационного мутагенеза (30-80-е года).

Ранние представления Ли Д.Е. (1963) о биофизических механизмах,

лежащих в основе наблюдаемых генетических изменениях, основанные на

экспериментальных данных и классической теории «мишени» и принципа

попадания, в современный период были дополнены и детализированы. А

именно, была описана сложная структура трека как совокупность частиц

разных энергий, формирующих первичные повреждения различной степени

сложности и репарируемости (Goodhead), и более высокая биологическая

эффективность плотноионизирующих излучений, по сравнению с

редкоионизирующим излучением, обусловлена их способностью наиболее

часто индуцировать сложные, кластерные повреждения ДНК.

Подтверждения этих представлений были получены в молекулярную эру,

когда стало возможным определять повреждения на уровне

последовательности оснований ДНК после ионизирующих излучений

разного качества. Было установлено, что после действия любого вида

излучения наблюдается весь спектр мутационных повреждений

25

(модификации оснований, делеции разной величины, инсерции, изменения конверсионной природы), соотношения которых различно для излучений с разной ЛПЭ.

Репарация значительно модифицирует ожидаемые по структуре трека первичные повреждения. Идентификация на данный момент всех видов репарационных механизмов и их особенностей позволяет изучить их вклад в весь возможный спектр изменений гена на молекулярном уровне при действии разных доз и видов ионизирующей радиации. Знание всех слагаемых спектра мутационных изменений, зависимостей их частоты от дозы и ЛПЭ, а также роли тех или иных генетических механизмов их реализации (репликация, рекомбинация или ошибочная репарация ДНК), несомненно представляет большое научное и практическое значение.

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Радиационно-индуцированные мутации двух изучаемых генов D.melanosaster и методические особенности их получения.

Материалом для молекулярно-генетических исследований явились выборки спонтанных и радиационных-индуцированных мутантов генов black+ (Alexandrov I.D., Alexandrova M.V., 1986; Alexandrov I.D. et al., 1997) и cinnabar+ (cn+) cn (Alexandrov I.D., Alexandrova M.V., 1991; Alexandrov I.D. et al., 1997) из обширной генетической коллекции мутантов D.melanogaster (Объединенный институт ядерных исследований, г. Дубна, Россия) и систематизированных на основании протоколов опытов по характеру генетических изменений, виду радиации и дозе.

Физические условия экспериментов, источники у-излучения 60Со и реакторных нейтронов с Еср= 0.85 МэВ описаны в (Капчигашев С.П. и др. 1979; Alexandrov I.D., 1984). Общие принципы классического цитологического и генетического анализа и основанной на его результатах генотипической

классификации регистрируемых мутаций аберрационной и «точковой» природы, также описаны ранее (Alexandrov I.D., 1984; Александров И.Д.,1987; Александров И.Д. и др., 2001; см. также гл. «Литературный обзор» раздел 1.1.1).

Здесь важно отметить, что интактные и облученные самцы из диких лабораторных линии D32 или D18 скрещивались (в течении 1-х суток после облучения) с виргинными самками генотипа у Ins(l) sdljr sc8 + dl49 w° (M5); b1 en1 vg1 (линии KL) (рис.1). Как видно из генотипа самок аутосома 2 в линии KL не содержит инверсий, которые ингибируют митотический и мейотический кроссинговер, в отличие от X хромосомы, где такие инверсии имеются.

Как видно из рис.1 после ряда последовательных скрещиваний уже в F4 мы имеем гомозиготную линию в виде простой «точковой» мутации black (рис.la), если в этой же хромосоме нет одновременно и независимо индуцированной рецессивной летали. В противном случае (рис. 16) рецессивная леталь отделялась рекомбинацией в мейозе у самок генотипа Ьх+ / + В1 или + Ьх/ J +. Для получения «точковых» мутаций сп применяли аналогичную схему генетических скрещиваний, а сопутствующую рецессивную леталь отделяли рекомбинацией в мейозе у самок генотипа В1 + /+ erf или J+ / + erf .

В тех случаях, когда рецессивная леталь оказывалась тесно сцеплена с мутациями генов и не отделялась кроссинговером в выборках стандартного размера (800-1500 некроссоверных особей), мутации переводились в гемизиготное состояние с использованием делеции для последующего выделения ДНК. Гемизиготы black получали путем скрещивания изучаемой мутации black с мультилокусной делецией ¿>81142 (Df(2L) 34Db-34Dg) (Александрова М.В. и др., 1996), в случае сп с небольшой делецией сп79Ь13 (Df(2R)43E2-43El8) (Alexandrov I.D., 2004).

РбгулящхьШуУ^^ \^1скч1ттттиф1угтт Ь): «¿-.«ibrf. lns(l). У W* tf frt1 УУ1

tog), у iv*

V

г*

F3: Су tf BI

+•||* 4-

Inj(2LR)Pm + + +

Су tf В», сп" L4 * Су tfBI, +cn- L4

+ +

F:

4

J^(lOoap)

•+ Ьж 4- + * + b + + ' X

+ b* + / * + Cv rfBJ +CI11 h*

__r_—

1

+• b't +

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Давкова, Лилиана Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Зависимость частоты индукции аберрационных и «точковых» мутантов от дозы для двух видов радиации и двух генов линейна и ОГЭ нейтронов по тесту аберрационные и особенно «точковые» мутации для гена black (коэффициенты 8.6 и 5.0 соответственно) существенно выше, чем для гена сп (коэффициенты 4.0 и 2.6 соответственно).

2. В основе у- и нейтрон-индуцированных «точковых» мутантов генов black и сп D.melanogaster лежат изменения структуры ДНК двух категорий: выявляемые методом ПЦР частичные делеции генов и скрытые, не детектируемые этим методом, «точковые» изменения, соотношение которых геноспецифично. Это выражается в том, что доля мутантов сп с делециями почти в 4 раза больше таковой среди мутантов black независимо от вида радиации.

3. Методом секвенирования идентифицированы делеция (АТСС) с инсерцией (ТАССТАСС) в экзоне 1 (+530) и 27 однонуклеотидных замен в разных районах гена у спонтанного аллеля black1 из материнской тестер-линии KL, с самками которой скрещивались облученные самцы дикой лабораторной линии, а также аналогичные изменения у трех спонтанных мутаций гена Ыаск из нестабильной лабораторной линии D32 как результат конверсии гена.

4. Доминирующими повреждениями структуры ДНК у у-индуцированных «точковых» мутантов black без выявляемых методом ПЦР изменений являются, согласно результатам секвенирования, делеции и модификации на уровне одного нуклеотида (50%), тогда как минорными фракциями -делеции нескольких пар оснований (до 11), фланкированные короткими прямыми повторами (25%) и мутанты конверсионной природы (25%).

5. Секвенирование ДНК нейтрон-индуцированных «точковых» мутантов black показало, что 13 из 15 изученных являются мутантами конверсионной природы, что указывает на важную роль генной конверсии при репарации ЛПЭ-зависимых повреждений ДНК, определяющей наблюдаемую высокую ОГЭ нейтронов в индукции «точковых» мутаций гена black.

6. Качественно разная природа доминирующих повреждений ДНК у у- и нейтрон-индуцированных «точковых» мутантов, установленная методом секвенирования, отражает качественно разную природу первичных повреждений ДНК и репарационных систем, функционирующих в ранней зиготе до и после объединения родительских геномов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность научному руководителю диссертационной работы доктору биологических наук Александрову И.Д. и кандидату биологических наук Александровой М.В. своей помощью и личным участием обеспечивших ее выполнение, а также всем сотрудникам группы № 8 НХП Отдел фазотрона ЛЯП ОИЯИ Афанасьевой К.П., Коровиной Л.Н., Кораблиновой C.B. Выражаю большую благодарность начальнику отдела НХП Отдел фазотрона ЛЯП ОИЯИ к.т.н. Мицыну Г. В.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате радиобиологической характеристики мутабильности двух изученных генов установлен факт неожиданно высокой эффективности нейтронов в индукции «точковых» мутаций, что не согласовалось с классическими представлениями основанными на принципе попадания и теории «мишени». Для выяснения природы наблюдаемого явления был проведен молекулярно-генетический анализ у- и нейтрон-индуцированных таких мутаций методом ПЦР, в результате которого была установлено, что в их основе лежат мутационные изменения двух категорий: частичные делеции гена и скрытые, не определяемые этим методом повреждения ДНК гена.

Одновременно была установлена геноспецифичность в определяемой этим методом молекулярной картине радиомутабильности двух генов,

51 проявляющая себя в разном соотношении для них двух категорий мутаций, а именно, в преобладании у мутантов black скрытых молекулярных изменений в отличие от мутантов сп, значительная часть которых обусловлена частичными делениями гена. Для проверки предположения о высокой эффективности нейтронов в индукции микромолекулярных делеций не определяемых методом ПЦР было проведено секвенирование ДНК у- и нейтрон-индуцированных «точковых» мутантов black. Полученные результаты не подтверждают выдвинутого предположения, а дают первое и важное указание на весьма эффективный и специфический механизм рекомбинационной репарации (по типу генной конверсии) нейтрон-индуцированных повреждений ДНК, функционирующий уже в раннем эмбриогенезе. Предполагаемый этот механизм репарации для мутационных повреждений гена black может являться универсальным и функционировать при формировании мутаций других генов. В пользу этого могут свидетельствовать полученные нами результаты ПЦР- анализа радиационно-индуцированных мутаций гена сп, согласно которым многие из них имеют мутационные изменения (отсутствие 3-й 4-ого фрагментов гена) как и у спонтанного аллеля-маркера сп1, что может указывать на конверсионное происхождение этих радиационных мутантов.

Можно полагать, что этот механизм специфичен для конверсионной репарации первичных повреждений ДНК, характерных и для других видов радиации, в структуре трека частиц которых присутствует плотно-ионизирующая компонента. В пользу этого предположения свидетельствует установленный нами факт, что среди 8-ми изученных у- индуцированных мутантов, два также имеют ДНК аллеля black1 конверсионного происхождения, а в структуре трека фотонов 60Со присутствует, как известно, и плотноионизирующая компонента, определяющая их эффективность в индукции структурных изменений ДНК и хромосом.

В заключение следует подчеркнуть еще один важный результат проведенной работы. Установленная нами на примере одного локуса генная

52 конверсия в ядре зиготы ведет не к потере гетерозиготности (LOH), а скорее к восстановлению гомозиготности по уже имеющемуся в геноме мутантному аллелю (reconstitutuion of homozygosity, ROH). Учитывая тот факт, что состояние гомозиготности не только сохранится в соматических и генеративных клетках данной особи, но при наследовании несомненно увеличит вдвое и вредный популяционный груз по данному мутантному аллелю. Последствия ROH, впрочем, могут оказаться гораздо более значительными, если в геноме данного вида гены в гетеро-аллельном состоянии представлены достаточно широко. О таком состоянии геномов многих видов высших эукариот, включая человека, свидетельствуют как классические (Алтухов Ю.П., 2003), так и современные, посвященные анализу нуклеотидного полиморфизма (SNP) (Hinds D.A. et al., 2005), популяционные исследования. Однако, важный вопрос о том, насколько регулярна генная конверсия в зиготе среди генов разного размера и положения в геноме, пока остается открытым, требуя для своего решения самостоятельных исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Давкова, Лилиана Николаевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

Александров И.Д. разная для генных мутаций ОГЭ промежуточных (Еср=0.35МэВ) нейтронов при облучении спермиев Drosophila/ Доклады академии наук СССР 1984, том275, №2, с.483-486 Александрова М.В., Александров И.Д. Репарационный рекомбиногенез в зиготах со структурной и/или по c(3)G гетерозиготностью // Сб. Рекомбиногенез: его значение в эволюции и селекции, 1986, Кишинев, «Штиинца», С. 29-32. Александров И.Д. Сравнительный механизм радиационного микро- и макромутагенеза высших эукариот и общая теория мутаций// Радиационный мутагенез и его роль в эволюции и селекции.: Наука. 1987. С. 18-42

Александров И.Д. Тимофеев-Ресовский и становление молекулярной радиобиологии гена эукариот.// Отдельный оттиск, Радиобиология, Т.31, вып.4, Москва, 1991г., стр. 555-563 Александров И.Д., Александрова М.В. Нестабильность генома при стабилизирующем отборе у Drosophila melanogasterll Докл. АН. 1994. Т. 337. №4. С. 550-552.

Александрова М.В., Лапидус ИЛ., Александров И.Д., Филимонов A.C. Радиационная цитогенетика мультилокусных делеций и принципы надхромомерной организации эухроматина эукариот// Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. Т. 36. №6. С. 805-814. Александров И.Д., Александрова М.В., Лапидус И.Л., Кораблинова C.B. ОГЭ нейтронов деления при индукции рецессивных мутаций разного типа у Drosophila melanogaster // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41. №3. С. 245-258. Александров И.Д., Намолован Л.Н., Александрова М.В. Радиационная биология структурно разных генов Drosophila melanogaster. Сообщение 3. Ген black: Общая и молекулярная характеристика его радиомутабильности. // Радиационная биология. Радиоэкология, 2012, Т.52, № 5, с. 453-466. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях // 2003, Москва, ИКЦ

«Академкнига», 431 С. Гептнер М.А., З.А. Демидова Зависимость между дозами рентгеновских лучей и мутациями отдельных генов у Drosophila melanogaster //Оттиск из Биологического журнала, Том V, №3, 1936, стр.541-550 Гептнер М.А.Зависимость мутирования определенных генов от их положения в хромосоме//Оттиск из Биологического журнала, Том VII, №5-6, 1938, стр.1121-1138 Глембоцкий Я.Л. Сравнительная скорость прямого и обратного мутационного процесса в локусах yellow, achaete-scute, white и Forked у Drosophila melanogaster.!7Оттиск из Биологического журнала, Том V, No5, «Биомедгиз», Москва, 1936, стр.813-832 Глембоцкий Я.Л., Абелева Э.А., Лапкин Ю.А. Влияние малых доз ионизирующей радиации на частоту возникновения сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций у дрозофилы // Радиационная генетика. Академия наук СССР, Москва, 1962, С. 300-311.

Дубинин Н.П. Хвостова В.В., Мансурова В.В. Хромосомные аберрации, летальные мутации и доза Х-лучей// ДАН СССР. 1941., Т.31, №4, с.386-388

Капчигашев С.П., Обатуров Г.М., Дуба В.В. Физико-дозимитрическая характеристика источников нейтронов (реактор БР-10, ускоритель КГ-2,5 и генератор нейтронов НГ-150М)// Труды 3-й конф. «Использование методов ядерной физики для решения научно-технических и национально экономических проблем», Дубна 1979, с.278-281 Корогодин В.И. Некоторый закономерности пострадиационных изменений

покоящихся дрожжевых клеток. Биофизика, 1958, т.З, вып.6, с.703-71 Корогодин В.И., Малиновский О.В., Порядкова H.A., Изможеров H.A. К вопросу об обратимости различных форм радиационного поражения у диплоидных дрожжевых клеток. Цитология, 1959, т.1, № 3, с.306-315. Корогодин В.И. Проблемы пострадиационного восстановления. М:

Атомиздат 1966, 330 с. Ли Д.Е.. Действие радиации на живые клетки// Москва, 1963, стр.108 Литвинова Е.М. Биология размножения дрозофилы // в кн. Проблемы

генетики в исследованиях на дрозофиле. Новосибирск, Изд-во «Наука», 1977, С. 19-62.

Лучник Н.В. Природа первичных цитогенетических лучевых повреждений и каталитическая активность хромосом// Докл. АН СССР, 1959а, т. 129, № 5, с.1168-1171.

Лучник Н.В., Царапкин Л.С. Об обратимости цитогенетических лучевых

повреждений// Докл. АН СССР, 1959b, т.124, № I, с.213-215 Тимофеев-Ресовский Н.В., Иванов В.И., Корогодин В.И. Применение принципа попадания в радиобиологии // Москва, Атомиздат, 1968, с. 226 Фриц-Ниггли X. Радиобиология ее основы и достижения. Госатомиздат, Москва 1961, с.324

Adams M.D., McVey M., Sekelsky J.J. Drosophila BLM in double-strand- break repair by synthesis-dependent strand annealing. // Science, 2003, V. 299, P.265-267

Aghamohammadi S.Z., Morris T. Stevens D.L Thacker J. Rapid screening for deletion mutations in the HPRT gene using the polymerase chain reaction X-ray and a-particle mutant spectra// Mutat. Res., 1992. V. 269. P.l-7.

kira Fujimori, Akira Tachabona, Kouichi Tatsumi. Allelic losses in mutations at the APRT locus of human lymphoblastoid cells// Mutation research, 1992, 269, 55-62.

Albertini A.M., Hofer M., Calos M.P., Miller J.H// On the formation of spontaneous deletions: the importance of short sequence homologies in the generation of large deletions// Cell 29,1982, p.319-328

Alexandrov I.D. Comparative frequency and spectrum of w mutations induced by y-rays and neutrons in Drosophila melanogaster!! Drosophila Inf. Serv., 58, 1982, p.9-10

Alexandrov I.D. Quality and frequency patterns of y- and neutron-induced visible mutations in Drosophila spermatozoa// Mutation Research,127,1984,p. 123127

Alexandrov I.D., Alexandrova M.V. Genetics and cytogenetics of the black mutations induced by gamma-rays, 252Cf and fussion neutrons// Drosophila Inf. Serv., 63, 1986, p.159-161

Alexandrov I.D., Alexandrova M.V. Cytogenetics of the cinnabar mutations induced by different quality radiations// Drosophila Inf. Serv., 70, 1991, p. 1618

Alexandrov I.D. Different patterns of spontaneous mutability in two wild-type sib stocks of D. melanogaster with long-term laboratory history// Drosophila Inform. Service. 1992. V. 71. P. 213-214

Alexandrov I.D., Zakharov I.A., Alexandrova M.V. The Moscow Regional Drosophila melanogaster Stock Center (Dubna, Russia)// Drosophila Inform. Service. 1997. V. 80. P. 109-130

Alexandrov I.D., Zakharov I.A., Alexandrova M.V. The Moscow Regional Drosophila melanogaster Stock Center // Drosophila Inform. Serv., 2004, № 87, P. 1-22

Ashburner M., Aaron C.S., Tsubota S. The genetic of a small autosomal region of Drosophila melanogaster including the structural gene for alcohol dehydrogenase, V. Characterization of X-ray-induced Adh null mutations// Genetics, 102, 1982, 421-435

Ayaki T., Fujikawa K., Ryo H. et all. Induced rates of mitotic crossing over and possible mitotic gene conversion per Wing Anlage cell in Drosophila melanogaster by X-rays and fission neutrons. // Genetic, 1990, V. 126, P. 157166.

Bao C.Y., Ma A.H., Evans H.H., Horng M.F., Mencl J., Hui T.E., Swdwick W.D. Molecular analysis of hypoxanthine-phosphoribosyltransferase gene deletions induced by a- and X- radiation in human lymphoblastoid cells//Mut. Res. 326, 1995, p. 1-15

Barendsen G.W. The relationships between RBE and LET for different types of lethal damage in mammalian cells: biophysical and molecular mechanisms// RadiatRes. 139(3), 1994, p. 257-70.

Becker H.J. Mitotic recombination// in The Genetics and Biology of Drosophila, Vol. IC, edited by M.ASHBURNE and E. NOVITSKIA. Academic Press, New York, 1976 p.l 019-1087.

Botchway S. W., Stevens D. L., Hill M. A., Jenner T. J., O'Neill P. Induction and Rejoining of DNA Double-Strand Breaks in Chinese Hamster V79-4 Cells Irradiated with Characteristic Aluminum K and Copper L Ultrasoft X Rays// Radiat. Res.1997, Vol. 148, No. 4, pp. 317-324.

Breimer L.H. et al. Structure and sequence of mutants induced by ionizing radiation at selectable loci in Chinese hamster ovary cells//Molecular biology, 1986, 192, 669-677.

Coté B., Bender W., Curtis D., Chovnick A. Molecular mapping of the rosy locus

in Drosophila melanogaster!7 Genetics. 112(4), 1986, p.769-83.

59

, <

Chmuzh E.V., Shestakova L.A. , Volkova V.S., Zakharov I.K. Diversity of mechanisms and functions of enzyme systems of DNA repair in Drosophila melanogasterll Genetika. 42(4), 2006, p. 462-76 Dauch F., Apitzch U., Catsch A., Zimmer K.G. RBE-schneller Neutronen bie der Auslosung von Mutationen bei Drosophila me lanogas terI/Mutzt.Res. 1966, Vol.3,N 3, P.185-193 Demerec M. Relationship between various chromosomal changes in Drosophila

melanogasterll Cytologia, Fujii Jub., 1938,p. 1125-1132 De Laat W.L., Jaspers N.G., Hoeijmakers J.H./ Molecular mechanism of nucleotide

excision repair// Genes Dev. 13, 1999. 768-785. Dessauer F. Uber einige Wirkungen von Strahlen/Zsch. Physik, 12,1922, p.38 Ducau J., Bregliano J-C., C. de La Roche Saint-André Gamma-irradiation stimulates homology-directed DNA double-strand break repair in Drosophila embryo// Mutât Res. 460(1),2000,p. 69-80. Eeken JC, de Jong AW, Loos M, Vreeken C, Romeyn R, Pastink A, Lohman PH. The nature of X-ray-induced mutations in mature sperm and spermatogonial cells of Drosophila melanogasterll Mutât Res. 307(1), 1994, p.201-12 Elkind M.M., Sutton H. X-ray damage and recovery in mammalian cells in culture//

Nature. 184,1959, p.1293-5 Elkind M.M., Sutton H. Radiation response of mammalian cells grown in culture. 1. Repair of X-ray damage in surviving Chinese hamster cells// Radiat. Res. 13, 1960, p.556-93

Engels W.R., Johnson-Schlitz D.M., Eggleston W.B., and J.Sved High-Frequency /'-Element Loss in Drosophila Is Homolog-Dependent// Cell (Cambridge,Mass.), vol. 62, no. 3, 1990, p. 515-525. Fishman-Lobell, J., Rudin, N., and Haber, J.E., Two Alternative Pathways of Double-Strand Break Repair That Are Kinetically Separable and Independently Modulated// Mol. Cell. Biol., 1992, vol. 12, no. 3, pp. 12921303.

Fiorenza, M.T., Bevilacqua, A., Bevilacqua, S., and Mangia, F., Growing Dictyate Oocytes, but Not Early Preimplantation Embryos, of the Mouse Display High Levels of DNA Homologous Recombination by Single-Strand Annealing and Lack DNA Nonhomologous End Joining// Dev. Biol., 2001, vol. 233, no. 1, pp. 214-224.

Flores C.C. Repair of DNA Double-Strand Breaks and Mismatches in Drosophila, DNA Damage and Repair, vol. 3: Advances from Phage to Humans, Nickoloff, J.A.and Hoekstra, M.F., Eds., Totowa: Humana, 2001, pp. 173-206

Friedberg, E. C., Walker, G. C., Siede, W., Wood, R. D., Schultz, R. A., and Ellenberger, T. DNA Repair and Mutagenesis, 2nd Washington, DC: ASM Press2006.

Goodhead, D. T., Munson, R. J., Thacker, J. and Cox, R. Mutation and inactivation of cultured mammalian cells exposed to beams of accelerated heavy ions. IV. Biophysical interpretation// Int. J. Radiat. Biol. 37, 1980, P.135-167.

Goodhead, D. T. and Charlton, D. E. Analysis of high-LET radiation effects in terms of local energy deposition//Radiat. Prot. Dosim. 1985, 13, P.253-258.

D.T Goodhead/ Energy deposition stochastic and track structure: what about the target? // Radiat. Prot. Dosim. 2006. V. 122. P. 3-15.

G.B Gloor, N.A. Nassif, D.M. Johnson-Schlitz, et al. Targeted Gene Replacement m Drosophila Via P Element-Induced Gap Repair// Science, vol. 253,№.5024, 1991, P. 1110-1117.

Gloor G.B., Moretti J., Mouyal J., Keeler K.J. Distinct P-element excision products in somatic and germ line cells of Drosophila melanogaster II Genetics, 2000, V. 155, P. 1821-1830.

Grosovsky, A.J., J.G. de Boer, P.J. de Jong et al. Base substitutions, frame shifts and small deletions constitute ionizing radiation-induced point mutations in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 1988, P. 185-188

Hiroshi Kimura, Hirofumi Higuchi, Hiroaki Iyehara-Ogawa, Takesi Kato. Sequence Analysis of X-Ray Induced Mutation Occurring in a cDNA of

Human hprt Gene Integrated into Mammalian Chromosomal DNA//Radiation Research 134, 1993, P.202-208

Hinds D.A., Stuve L.L., Nilsen G.B. et all. Whole-genome patterns of common DNA variation in three human populations// Science, 2005, V. 307, P.1072-1079.

Hill M.A. Radiation damage to DNA: the importance of track structure// Radiat Meas. 31(1-6), 1999, P. 15-23

Hilliker A. J., and Appels R., The arrangement of interphase chromosomes: structural and functional aspects// Exp.Cell Res. 185,1989, P. 297-318.

Ives P.T. the Relationship between radiation dose and dominant visible mutation rate in Drosophila melanogaster//Genetics, Vol.44, No.5,part 2.,1959, P.969-97

Jenner T.J., de Lara C.M., O'Neill P., Stevens D.L. Induction and rejoining of DNA double-strand breaks in V79-4 mammalian cells following gamma- and alpha-irradiation// Int. J. Radiat Biol. 64(3), 1993, p.265-73.

Kastenbaun M.A., Bowman K.O. Tables for determining the statistical significance of mutation frequencies// Mutat. Res. 1970. V. 9. P. 527-549.

Kelley M. R., Mims I. P., Farnet C. M., Dicharry S. A., Lee W. R. Molecular Analysis ofX-Ray-Induced Alcohol Dehydrogenase ( Adh) Null Mutations in Drosophila melanogaster //Genetics 109(2), 1985, P.365-377.

Kinashi Y., Sakurai Y., Masunaga S., Suzuki M., Takagaki M., Akaboshi M., Ono K. Molecular structural analysis of HPRT mutations induced by thermal and epithermal neutrons in Chinese hamster ovary cells// Radiat Res. 2000, 154 (3), P.313-318

Kraus E., Leung W. Y. and Haber J. E. Break-induced replication: a review and an example in budding yeast// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2001, P. 82558262.

LaRocque J.R Dissertation "DNA damage response in Drosophila melanogaster : orchestrating repair with cell cycle checkpoints", University of North Carolina, Chapel Hill, 2007

LaRocque J.R., JacKLevic B.Su. and Sekelsky J. Drosophila ATR in double-strand break repair// Genetics, 2007, V. 175, P. 1023-1033.

Lambert, S. and Lopez, B.S., Characterization of Mammalian RAD51 Double Strand Break Repair Using Non-Lethal Dominant-Negative Forms// EMBO J., 2000, vol. 19, no. 12, P.3090-3099.

Leenthouts H.P. and Chadwick K.H. The crucial role of DNA double-strand breaks in cellular radiobiological effects // Adv. Radiat. Biol. 1978, V. 7, P. 55-101.

Lefevre G. Sterility, chromosome breakage, x-ray-induced mutation rates and detected mutation frequencies in Drosophila melanogasterl/ Genetics (US)

1967. V. 55. №2. P. 263-275.

Lindsley D.L., Grell E.H. Genetic variations of Drosophila melanogaster II Carnegie Inst. Wash. Publ. 1968. № 627. P.473

Liber H.L., Call K.M., Little J.B. Molecular and biochemical analyses of spontaneous and X-ray induced mutations in human lymphoblastoid cells// Mutation Research, 178, 1987, P.143-153

Lifschytz E., Falk R. Fine structure analysis of a chromosome segment in Drosophila melanogaster, analysis of X-ray-induced lethal// Mutation Res., 6,

1968, P.235-244

MacPhee D. G. Mismatch repair as an important source of new mutations in non-dividing cells//Experientia.52(4), 1996, P.357-63.

Mahmoud J., Fossett N.G., Arbour-Reily P., McDaniel M., Tucker A., Chang S.H.,Lee W.R. DNA sequence analysis of X-ray induced Adh null mutations in Drosophila melanogasterl I Environ Mol Mutagen. 18(3), 1991, P. 157-60

McVey M., Adams M.D., Staeva-Vieira E., Sekelsky J. Evidence for multiple cycles of strand invasion during repair of double-strand gaps in Drosophila II Genetics, 2004, V. 167, P. 699-705.

Min S.Park, Tracy Hanks, Armini Jaberaboansari Molecular Analysis of Gamma-Ray Induced Mutations at the HPRT Locus in Primary Human Skin Fibroblasts by Multiplex Polymerase Chain Reaction/ Radiation research, 1995,141,11-18

» 4

Miles, C. and M. Meuth. DNA sequence determination of gamma-radiation-induced mutations of the hamster aprt locus. Mutat. Res. 227: 97-102 (1989). Morris T. and J. Thacker. Formation of large deletions by illegitimate recombination in the HPRT gene of primary human fibroblasts// Proc. NatLAcad. Sci.U.S.A. 90: 1993, P.1392-1396. Morgan T.L., Feck Earl W., Poston K.A., Denovan B.A., Newman C.N., Rossiter J.F., Miller J.H. Molecular characterization of X-ray indeced mutations at the HPRT locus in plateau-phase Chinese hamster ovary cells// Mutation Research, 232, 1990, P. 171-182 Mognato M., Ferraro P., Canova S., Sobri G., Russo A., Cherubini R. Analysis of mutational effect at the HPRT locus in human Go phase lymphocytes irradiated in vitro with y-ray// Mutation Research, 2001, P. 474. Modrich P. Mechanisms and biological effects of mismatch repair// Annu Rev

Genet. 25,1991, P.229-53. Muller H.J. The problem of genetic modification// Internal Congr. Ot Genetic, 1, 1928

Muller H.J. The nature of the genetic effects produced by radiation/ in A. Hollaender (Ed.) Radiation Biology, Part 1, Chapter 7, McGraw-Hill, New York,1954, P.351-473. Murakami A. The nature of specific locus mutations induced by fast neutrons in silkworm spermatocytes// Annual Report of National Institute of genetics(Japan) No.22,1971, P.62-63 Nassif N. A., Penney J., Pal S., Engels W. R., Gloor G. B. Efficient copying of no homologous sequences from ectopic sites via P element-induced gap repair// Mol. Cell. Biol. 14,1994, P.1613-1625. Nassif N., Engels W. DNA homology requirements for mitotic gap repair in

Z>oso;?/i//tf//Proc.Natl.Acad.Sci., 1993, V. 90, P. 1262-1266 Ngo F.Q., Blakely E.A., Tobias C.A. Sequential exposures of mammalian cells to low- and high-LET radiations: I. Lethal effects following X-rays and neon-ion

irradiation//Radiat. Res. 87, 1981, P.59-78.

64

Ngo F.Q., Blakely E.A, Tobias C.A, Chang P.Y., Lommel L. Sequential exposures of mammalian cells to low- and high-LET radiations. II. As a function of cell-cycle stages//Radiat Res. 115(1), 1988, P.54-69. Nikjoo H„ O'Neill P., Terrissol M., Goodhead D. T. Quantitative Modelling of DNA Damage using Monte Carlo Track Structure Method// Radiat. Environ. Biophys. 38(1), 1999, P.31-38 Oliver C.P. The Effect of Varying the Duration of X-Ray Treatment upon the

Frequency of Mutation// Science, vol. LXXI, No. 1828, 1930, P.44-46 Pastink A, Schalet A.P., Vreeken C., Paradi E., Eeken J.C. The nature of radiation-induced mutations at the white locus of Drosophila melanogasterlI Mutat Res. 1987, 177(1), P.101-15. Pastink A., Vreeken C., Schalet A.P., Eeken J.C. DNA sequence analysis of X-ray-induced deletions at the white locus of Drosophila melanogasterl/Mutat Res. 1988,207(1), P.23-8. Patterson J.T. Lethal mutations and deficiencies produced in the X-chromosome of Drosophila melanogaster by X-radiation.// American naturalist, Vol. LXVI, 1932, P. 193-206

Pardo B., Gomez-Gonzalez D., Aguilera A. DNA double-strand break repair: how

to fix a broken relationship //Cell. Mol. Life Sci., 2009, V. 66, P.1039-1056. Phillips .A.M., Smart R., Strauss R. Brembs B., Kelly L.E. The Drosophila black enigma: the molecular and behavioral characterization of the black1 mutant allele// Gene. 2005. V. 351. P. 131-142 Preston C.R, Engels W., Flores C. Efficient Repair of DNA Breaks in Drosophila: Evidence for Single-Strand Annealing and Competition with Other Repair Pathways// Genetics vol. 161, no. 2, 2002, P.711-720 Preston C. R., Flores C. C., Engels W. R. Differential Usage of Alternative Pathways of Double-Strand Break Repair in Drosophila!/ Genetics. 172(2), 2006, P.1055-1068.

Rinchik E.M., Russell L.B. The dilute-short ear (d-se) complex of the mouse:

lessons from a fancy mutation/ /Trends Genet., 1, 1985, P.170-176

65

Rinchik E.M., Stoye J.P., Frankel W.N., Coffin J., Kwon B.S., Russell L.B Molecular analysis of viable spontaneous and radiation-induced albino (c)-locus mutations in the mouse//Mutat Res. 1993,286(2), P. 199-207 Rong Y.S., Golic K.G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila

II Science, 2000, V. 288, P.2013-2018 Rong Y. S., Golic K. G. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila// Genetics 165, 2003, P.1831—1842.

Rothkamm K., Gunasekara K., Warda S.A. et al. Radiation-induced HPRT mutations resulting from misrejoined DNA double-strain breaks// Radiat. Res., 2008. V. 169. P. 639-648. Russell W.L. X-ray-induced mutation in mice//Cold Spring Harbor Symposia

Quant. Biol. 16, 1951, P 327-336 Russell W.L. Evidence from mice concerning the nature of the mutation

process//Genetic Today, Vol.2, 1965a,P. 257-264 Russell, W. L. Studies in mammalian radiation genetics// Nucleonic, 23, 1965b P.53-62

Russell L.B. Definition of functional units in a small chromosomal segment of the mouse and its use in interpreting the nature of radiation-induced mutations// Mutation. Res., 11, 1971, P.107-123 Russell L.B., Russell W.L., Kelly E.M. Analysis of the albino-locus region of the

mouse, I. Origin and viability// Genetics,91,1979a, P.127-139 Russell L.B. Meiotic non-disjunction in the mouse: methodology for genetic testing and comparison with other methods//Environ. Health Perspect., 31,1979b, P. 113-118

Russell L.B., Rinchik E.M. Genetic and molecular characterization of genomic regions surrounding specific loci of the mouse!I Mammalian Call Mutagenesis (M.M. Moore et. al., Eds.) Banbury Report 28, Cold Spring Harbor, NY, 1987, P.109-121

Rydberg B. Clusters of DNA damage induced by ionizing radiation: formation of short DNA fragments. II. Experimental detection// Radiat Res. 145(2), 1996 P.200-9.

Saintigny Y., Delacote F., Vares G., et al. Characterization of Homologous Recombination Induced by Replication Inhibition in Mammalian Cells// EMBOJ., 2001, vol. 20, no. 14, P.3861-3870. Sancar A.S. DNA excision repair//Annu. Rev. Biochem. 65, 1996. 43-81. Searle A. G, Phillips R. J. S. Genetic effects of neutron irradiation in mice// In Biological Effects of Neutron and Proton Irradiations, I, (Smirnov, P. I., Ed.,Intern. At. Energy Agency, Vienna, 1964, P.361-70 Searle A. G., Phillips R. J. S Genetic effects of high LET radiation in mice//

Radiation Res, 1967, Suppl. 7, P.294-303 Sekelsky J., Brodsky M.H., Burtis K.C. DNA repair in Drosophila. Insights from the Drosophila genome sequence. // J. Cell. Biol., 2000 (a), V.150, P. 31-36. Sekelsky J, Hollis K.J., Eimeri A.I. et all. Nucleotide excision repair endonuclease genes in Drosophila melanogaster // Mutat. Res., 2000 (b), V. 459, P. 219228.

de Serres F.J. X-Ray-induced specific-locus mutations in the ad-3 region of two-component heterokaryons of Neurospora crassa. II More extensive genetic tests reveal an unexpectedly high frequency of multiple-locus mutations// Mutation Res.,210,1989a, P.281-290 de Serres F J. X-Ray-induced specific-locus mutations in the ad-3 region of two-component heterokaryons of Neurospora crassa. IV. Irreparable mutants of genotype ad-A and ad-3B results from multilocus deletion and an unexpectedly high frequency of multiple-locus mutations.// Mutation.Res.,214, 1989b, P.297-319 ShuKLa P.T., Sankaranarayanan K., Sobels F.H. Is there a proportionality between the spontaneous and the x-Ray-induction rates of mutations? Experiments with mutations at 13 X-chromosome loci in Drosophila melanogaster// Mutation Res., 61,1979, P.229-248 i 67

i

v j

Tazima Y. Radiation mutagenesis of the silkworm/ in Y. Tazima(Ed.) The Silkworm: An Important Laboratory tool., Chapter 10, Kodansha, Tokyo, 1978, P.213-245

Timofeeff-Ressowsky N.W. Verschiedenheit der «normallen» Allele der white-

serie usw.// Bilologisches Zentralbatt, Bd5,1932(a) Timofeeff-Ressowsky N.W. Proc. 6th Intern. Congress Genetics, 1932(6), V.l, P.308-330

Timofeeff-Ressowsky N.W. Einige Versuche an D. melanogaster über die Beziehungen zwischen Dosis und Art der Röntgenbestrahlung und der dadurch ausgelosten Mutations/ /ate Strahlentherapie,49, 1934 Timofeeff-Ressovsky N.W., Zimmer K., Delbrück M Ueber die Natur der Genmutation und der Genstruktur // Nachr. Ges. Wiss. Goettingen. 1935. - Bd. I.-S.P. 189-245.

Timofeeff-Ressovsky N.W., Zimmer K.G. Das Trefferprinzip in der Biologie//

Leipzig Hirzel Verlag, 1947, P.317. Thacker J, Fleck E.W., Morris T., Rossiter B.J., Morgan T.L. Localization of deletion breakpoints in radiation-induced mutants of the hprt gene in hamster cells//Mutat Res. 1990,232(2), P.163-70. The Genome of Drosophila melanogaster/ Part I: Genes A-K // Drosophila Inform.

Serv., 1985, V. 62, P. 32-33. United Nat. UNSCEAR 2000. Report Vol. II Annex F. DNA repair and

mutagenesis. N. Y.: United Nat., 2000. P. 1-72. Valencia J.I., Muller H.J. The mutational potentialities of some individual loci in Drosophila.!Proc. VIII Int. Congr. Genet., Stockholm 1948, Hereditas,Suppl., 1949, P.681-683 Valencia R.M. A cytogenetic study of radiation damage in entire genomes of

Drosophilall Mutation. Res., 10, 1970, P.207-219 Warren W.D., Palmer S. and Howells A.J. Molecular characterization of the cinnabar region of Drosophila melanogaster. Identification of the cinnabar

transcription unit // Genetica, 1996, V. 98, P. 249-262.

68

Whaley J.M., Little J.B. Molecular characterization of hprt mutants induced by low- and high-LET radiations in human cells// Mutation Research, 243, 1990, P.35-45

Wolff S. Radiation genetics. Annu. Rev. Genet. 1967.1:221-244

Wolfner M.F. Nuclear envelope dynamics in Drosophila pronuclear formation and in embiyos I I in: Nuclear Envelope Dynamics in Embryos and Somatic Cells, ed. P. Collas, Eurekah. Com. and Cluwer Academic/Plenum Publishers, 2002, P.131-142.

Wood R.D. DNA repair in eukaryotes// Annu. Rev. Biochem.65, 1996. 135-167.

Z. Zachar, P. M. Bingham Regulation of white locus expression: the structure of mutant alleles at the white locus of Drosophila melanogaster// Cell 30, 1982, P.529-541.