Изучение нового типа мутаций, индуцированных мобильными элементами у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Бирюкова, Инна Владимировна

• Бирюкова, Инна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бирюкова, Инна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Механизмы репрессии транскрипции у Вгояорк'йа те1апо%ся1ег

1.1 Гены группы Ро1усотЪ (Рс)

1.2 Регуляторные элементы, ответственные за образование репрессионного Рс-О-комплекса

1.3 Возможные механизмы сборки репрессионного Рс-О-комплекса и его структура

1.4 Взаимодействия между Рс-О-комплексами

1.5 Возможные механизмы репрессии транскрипции с помощью Рс-О-комплексов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Генетические методы

2.1.1. Мутации и линии ИгозорИИа те1апо%а$1ег, использованные в работе

2.1.2. Генетические скрещивания и создание комбинаций мутаций 2.2 Биохимические методы

2.2.1. Выделение ДНК дрозофилы для рестрикционного анализа

2.2.2. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций

2.2.3. Саузерн-блот-анализ

2.2.4. Гибридизация на фильтрах

2.2.5. Молекулярное клонирование

2.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами

2.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса

2.2.8. Выделение РНК

2.2.9. Электрофорез РНК и гибридизация

2.2.10. Иммуноокрашивание и гибридизация in situ

2.2.11. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.2.12. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов

2.2.13. Создание конструкции Pfw', М*-yellow] и трансформация эмбрионов дрозофилы 45 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Генетические исследования модификатора мутаций, индуцированных встраиванием /"-элемента

3.2 Молекулярная структура мутации phPI

3.3 Транскрипция проксимальногоph гена в phP1 -линии

3.4 Молекулярный анализ ревертантов /^-мутации

3.5 Иммунолокализация белка P-Ph в дистальном районе Х-хромосомы

3.6 Сайты связывания химерного белка P-Ph на политенных хромосомах совпадают с новыми сайтами связывания для других белков Pc-G-комплекеа в местах инсерции Р-элемента

3.7 Влияниеphpl-мутации на различные jy-аллели

3.8 Картирование последовательностей Р-элемента, которые отвечают за ингибирование транскрипции гена yellow в присутствии /^-мутации

3.9 Зависимость эффекта мутации phpl от гомологичного спаривания

3.10 Влияние цис-элементов на ингибирующий эффектpff1 -мутации в гене yellow

3.11 Действие химерного белка Р-Р1* может быть супрессировано $>и(у)-мутациями

3.12 Молекулярный анализ жиеР/-аллеля

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Химерный белок Р-РЬ, обладающий ДНК-связывающей активностью транспозазы, может создавать на последовательностях Р-элемента комплексы, состоящие из белков Рс-группы

4.2 Анализ роли последовательностей Р-элемента в -репрессии транскрипции гъшуе11оч>

4.3 Эффект мутациирИР1 зависит от гомологичного спаривания

4.4 Действие мутацииркР1 зависит от цис-регуляторных элементов

4.5 Активная транскрипция 1.2-т.п.н. копии Р-элемента супрессирует ингибиторный эффект химерного Р-РЬ белка на экспрессию ^-аллелей, имеющих инсерцию Р-элемента

5. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение нового типа мутаций, индуцированных мобильными элементами у Drosophila melanogaster»

Геномы живых организмов содержат разнообразные по структуре мобильные элементы (МЭ). Так, например, у дрозофилы их известно более 30 видов. Перемещение МЭ могут вызывать хромосомные перестройки, а также мутации в генах-мишенях, вследствие этого они оказывают большое влияние на изменчивость видов. Известно, что более половины спонтанных мутаций, изученных у дрозофилы, индуцированы МЭ. Одним из наиболее изученных МЭ у дрозофилы является Р-элемент. Р-элемент кодирует фермент транспозазу, который связывается с концевыми последовательностями Р-элемента и катализирует его транспозиции в геноме. Мутагенный эффект Р-элемента зависит от места его встраивания, ориентации и точности его вырезания в гене-мишени. Известно, что Р-элементы часто встраиваются в промоторную область гена-мишени. После вырезания Р-элемента часто остаются его концевые последовательности, которые могут участвовать в регуляции транскрипции гена. Так, в нашей лаборатории было продемонстрировано, что 140 п.н. с 5'-конца Р-элемента могут компенсировать делецию регуляторных последовательностей теш yellow.

Настоящая работа посвящена изучению нового типа мутаций, индуцированных МЭ. Нами была получена мутация в гене polyhomeotic (ph), вызванная инсерцией Р-элемента. Эта мутация приводит к образованию химерного белка, состоящего из ДНК-связывающего домена белка транспозазы Р-элемента и всего белка Ph. Белок Ph является частью большого белкового комплекса, который репрессирует транскрипцию. Сам белок Ph не имеет ДНК-связывающей активности, но химерный белок P-Ph связывается с последовательностями /"-элемента и рекрутирует другие белки репрессионного комплекса. В результате этого в присутствии химерного белка P-Ph все Р-элементы в геноме потенциально становятся точками образования репрессионных комплексов, которые могут модифицировать транскрипцию рядом расположенных генов. Не исключено, что такого типа мутации могут возникать и в других регуляторных белках. Образовавшиеся в результате химерные белки могут регулировать экспрессию генов-мишеней, в которых есть инсерция Р-элемента. При этом образуется новая регуляторная система, которая может быстро эволюционировать, так как Р-элемент активно перемещается по геному дрозофилы. Оптимальное количество сайтов связывания химерного белка может быстро подбираться за счет происходящих дупликаций Р-элемента или его частичных делеций, в результате которых возникают стабильно интегрированные в геном части Р-элементов. Таким образом может происходить быстрая эволюция регуляторных систем, что во многом определяет скорость эволюции в целом.

Основная цель данной работы состояла в изучении и описании нового типа мутаций, индуцированных мобильными элементами. В нашей лаборатории был проведен генетический и молекулярный анализ модификатора фенотипического проявления мутаций в гене yellow, индуцированных встраиванием Р-элемента.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МЕХАНИЗМЫ РЕПРЕССИИ ТРАНСКРИПЦИИ У DROSOPHHA

MELANOGASTER

В процессе развития эукариотического организма происходит переход от единичной полипотентной клетки к системе органов и тканей, в которых клетки находятся в дифференцированном состоянии. В отличие от начальной стадии эмбрионального развития, где функционально активным может быть каждый ген, в любой, отдельно взятой дифференцированной клетке работает свой, строго определенный набор генов, тогда как остальные находятся в репрессированном состоянии. Другими словами, в процессе развития наблюдается возрастающее состояние репрессии. Очень важно, чтобы экспрессия генов, отвечающих за правильную закладку тканей, находилась под строгим контролем, - иначе могут произойти необратимые нарушения в развитии организма. Таким образом, правильная ткане- и времеспецифичность репрессии транскрипции играют важную роль в развитии и поддержании дифференцированного состояния клетки. Ниже будут расмотрен механизм репрессии как отдельных генов, так и целых генных комплексов на примере известных репрессоров транскрипции белков группы Polycomb (Jürgens, 1985).

Впервые семейство генов, регулирующих транскрипцию на уровне образования структурных комплексов, было описано у Drosophila melanogaster. В дальнейшем гомологичные гены были найдены у млекопитающих (Muller et al., 1995; Schumacher and Magnuson, 1996), Xenopus laevis (Reijnen et al., 1995), растений (Goodrich et al., 1997; Grossnikiaus et al., 1998), Caenorhabditis elegans

Holdeman et al., 1998; Korf et al., 1998) и птиц (Yamaguchi et al., 1998). Репрессия транскрипции на уровне хроматина имеет особое значение в процессе раннего развития дрозофилы, когда от экспрессии ключевых генов зависит правильная закладка сегментов и органов (Paro and Harte, 1996). Гомеозисные гены определяют детерминацию сегментов и органов дрозофилы (Struhl et al., 1981; Lewis, 1978). Мутации, возникающие вследствие нарушения правильной экспрессии гомеозисных генов, приводят к нарушениям нормального строения сегментов и органов.

1.1 Гены группы Polycomb (Pe)

Гены группы Polycomb (Рс) были идентифицированы как мутации в локусах, имеющих комплекс фенотипов, наблюдаемых при мутациях по гомеозисным генам, но локализованным в других районах генома (Lewis, 1978). В ходе исследований было обнаружено, что на ранних стадиях развития паттерны экспрессии гомеозисных генов в эмбрионах, мутантных по генам Рс, не отличаются от паттернов экспрессии этих генов в эмбрионах дикого типа. Однако, на более поздних стадиях развития транскрипция гомеозисных генов в мутантных линиях продолжается в тех районах, где она в норме должна быть зарепрессирована. Из сопоставления этих данных следует, что белковые продукты семейства генов Рс поддерживают и стабилизируют репрессию конкретных гомеозисных генов, превращая эту репрессию в стабильное наследуемое состояние, способное сохраняться на протяжении всего периода развития дрозофилы (Dura and Ingham, 1988; Franke et al., 1992; Strhul and Akam, 1985; Simon et al., 1992).

К настоящему времени генетически охарактеризовано около 14 генов группы Рс, причем девять из них проклонированы и определены свойства их белковых продуктов (Pirrotta, 1997; Yamamoto et al., 1997). Оказалось, что белки группы Рс имеют различную природу, но в каждом из этих белков найден домен, предположительно отвечающий за белок-белковое взаимодействие.

Биохимический анализ белков группы Рс у млекопитающих и у Drosophila показал, что эти белки образуют мультипротеиновые комплексы (~2-5 Мд) (Franke et al., 1992; Rastrelli et al., 1993; Platero et al., 1996; Alkema et al., 1997; Strutt et al., 1997) ), которые были названы как Pc-G-комплексы. На сегодняшний момент на основании полученных биохимических данных показано существование двух разных Pc-G-комплексов (Jones et al., 1998; Sewalt et al., 1998; van Lohuizen et al., 1998; 1999). Первый комплекс - Pc-Gí включает в себя белки Extra sexcombs (Esc) и Enhanser of zeste (E[z]), которые требуются для начальной стадии репрессии (Bienz and Muller, 1995). Второй комплекс - Pc-Gm является более многочисленным и включает в себя такие белки, как Polycomb (Pc), Polyhomeotic (Ph-d и Ph-p), Posterior sex comb (Psc), Sex comb on midleg (Sem) и некоторые другие. Этот комплекс стабильно поддерживает инициированную репрессию в локусе-мишени. Считается, что качественный состав этих комплексов может несколько варьировать в зависимости от их конкретных мишеней.

Из выше перечисленных белков наиболее хорошо изучены белки, входящие во второй комплекс. Собственно белок Polycomb (Pc), по которому было названо все семейство белков Polycomb, имеет гомологию с белком НР1, который является основным структурным компонентом гетерохроматина (Paro and Hogness, 1991; Cavalli and Paro, 1998). Гомология ограничивается 37 аминокислотами хромодомена в N-концевой части двух белков (Paro and Hogness, 1991; Messmer et al., 1992). Удаление С-конца Рс-гена никак не влияет на связывание белкового продукта с хроматином. Напротив, мутации, затрагивающие хромодомен (полученные как in vitro, так и являющиеся результатом точечных мутаций), нарушают способность белка к связыванию с хроматином. Было показано, что на политенных хромосомах белок Pc активно связывается только с эухроматиновыми районами (Messmer et al., 1992). Химерный белок НР1-Рс связывается как с эухроматиновыми, так и с гетерохроматиновыми районами (Platero et al., 1995). Это предполагает способность двух белков связываться с разными сайтами через белок-белковые контакты. Кроме того, такой химерный белок усиливал гетерохроматин-зависимую репрессию репортерного гена. Этот факт и наличие общего белкового мотива (хромо-домена) позволили предположить сходные механизмы действия для репрессии в гетерохроматине и репрессии белками группы Рс (Gaunt and Singh, 1990; Paro, 1990; Paro and Hogness, 1991). Возможно, что белки группы Рс способны репрессировать гомеозисные гены путем создания гетерохроматин-подобных репрессорных структур (Paro and Hogness, 1991). Подобно гетерохроматину, белки Рс способны образовывать мультипротеиновые комплексы, распространяющиеся на большие расстояния (Franke et al., 1992). В опытах in vivo показано, что в гомеозисном комплексе bithorax (ВХ-С), когда происходит его репрессия, белок Рс покрывает большие районы ДНК (Orlando and Paro, 1993). В то же время белка Рс не обнаруживается в случае активной экспрессии ВХ-С комплекса (Orlando and Paro, 1993). На основании полученных данных была предложена модель, согласно которой белок Рс агрегирует сам с собой, с другими белками и гистонами нуклеосом, образуя более компактный хроматин, который не доступен для активаторов транскрипции. Для изучения функциональных доменов белка Рс были использованы конструкции химерного белка Gal4-Pc, в которых к ДНК-связывающему домену известного дрожжевого активатора транскрипции Gal4 пришивались различные домены белка Рс (Muller, 1995; Franke et al., 1995). Для анализа репрессии использовалась конструкция, содержащая участки связывания для белка Gal4 и ген, у которого можно легко определять уровень экспрессии. Было показано, что химерный белок Gal4-Pc репрессирует транскрипцию только при наличии С-концевого домена; делеция С-концевого домена Pc приводит к нарушению его функции (Muller, 1995).

Другим хорошо изученным белком Pc-Gm-комплекса является Posterior sex combs (Psc), который имеет множественные сайты связывания на политенных хромосомах, почти полностью совпадающие с сайтами для белка Pc (Rastelli et al., 1993). Белок Psc, как и Pc, не связывается с гетерохроматином. Было высказано предположение, что эти два белка непосредственно взаимодействуют друг с другом в едином комплексе (Martin and Adler, 1993; Rastelli et al., 1993). Прямым подтверждением этого предположения являются эксперименты с химерным белком НР1-Рс, в которых наблюдалась аккумуляция белка Psc в гетерохроматиновых районах. Следовательно, наличие хромодомена Pc в окружении последовательностей НР1 оказывалось достаточно для связывания с гетерохроматином, по крайней мере, двух белков, Pc и Psc. Белок Psc имеет размер 1603 а.к., содержит RING-мотив, домен цинковых пальцев СЗНС4; однако, ДНК-связывающего домена в Psc найдено не было (Brunk et al., 1991). Делеционный анализ показал, что за белок-белковые взаимодействия в Psc отвечает RING-домен. Гомологи белка Psc, Bmi-1 и Mel-18, найденные у млекопитающих; представляют собой протоонкогены (Brunk et al., 1991; Van Lohuizen et al., 1991; Kanno et al., 1995).

Polyhomeotic (Ph) - это третий белок, участки связывания которого на политенных хромосомах почти полностью совпадают с белками Pc и Psc (DeCamillis et al., 1992; Franke et al., 1992; Lonie et al., 1994). Локус ph состоит из двух тандемно расположенных гомологичных генов - дистального (ph-d) и проксимального (ph-p). Белок Ph-d отличается от Ph-p отсутствием N-концевого домена (193 а. к ), который содержит РххРххРххР-мотив, распознаваемый SH3доменом. Белки Ph содержат несколько глутаминовых повторов, а также серин-треонин-богатый район. На С-конце обнаружены два мотива, которые присутствуют в гомологе Ph-белка у млекопитающих. Первый мотив - HI, нетипичный С4-цинковый палец, который потенциально может участвовать в связывании с ДНК (DeCamillis et al., 1992). Однако, опыты in vitro не выявили ДНК-связывающей активности у этого белка, возможно, белок Ph связывается с ДНК не сам по себе, а в комплексе с другими белками. Второй мотив - SPM-домен, который участвует в гомо- и гетеромеризации между Ph и Sem белками in vitro (DeCamillis et al., 1992). Было показано, что белки Ph и Psc копреципитируют с белком Рс из ядерных экстрактов. Домены, необходимые для их взаимодействия были проанализированы, используя дигибридную систему и анализ связывания белков in vitro. Было показано, что белки Psc и Ph взаимодействуют через HI-домен белка Ph и домен СЗНС4 белка Psc, который также участвует в контакте с белком Рс. Хромодомен белка Рс не требуется для этого взаимодействия (Kyba et al., 1998).

Sex comb on midleg (Sem) - еще один белок, относящийся к комплексу Рс-Gm. Показано, что его локализация на политенных хромосомах совпадает с белком Ph (Peterson, 1997). Его размер - 877 а.к. Он содержит два домена цинковых пальцев на N-конце, один из которых гомологичен домену цинковых пальцев белка Ph. На N-конце белка Sem находится SPM-домен, который имеет 98% гомологии с SPM-доменом белка Ph (DeCamillis et al., 1992). Было показано, что домен SPM служит для прямого взаимодействия белков Sem и Ph. Благодаря ему с большой частотой происходит образование гетеродимеров Scm-Ph. Белок-белковые взаимодействия в гетеродимерах Scm-Ph, а также в гомодимерах Scm-Scm значительно сильнее по сравнению с гомодимером Ph-Ph. По-видимому, это связано с высокой специфичностью домена SPM, отвечающего за белок-белковые взаимодействия (Peterson, 1997).

Известно, что выше перечисленные белки - Pc, Ph, Psc и Sem входят в состав, так называемого PRC 1-комплекса (Polycomb repressive complex 1) (Shao et al., 1999). Было показано, что этот комплекс не содержит белка Enhanser of zeste (E[z]), относящегося к группе Polycomb. Известно, что E(z) взаимодействует с другим белком группы Polycomb - Extra sexcombs (Esc). Было показано, что белок E(z) разделяется хроматографически от PRC 1-комплекса. Аналогичные результаты были получены у млекопитающих: гомологи Рс-белков строго разделялись на два комплекса. Один комплекс состоял из гомологов белков Pc, Ph и Psc, другой - из гомологов Esc и E(z) (Jones et al., 1998). Еще одним аргументом в пользу того, что Esc и E(z) образуют отдельный комплекс с отличными от PRC1 функциями, являются данные полученные в C.elegans. В нематоде были обнаружены гомологи этих генов, в то время как гомологи белков Pc, Ph и Psc - нет.

Существование Pc-Gj-комлекса, как было выше сказано, предполагает иные функции по сравнению с PRC1. Считается, что такой комплекс, включающий в себя белки (Esc) и (E[z]), требуются для начальной стадии Pc-G-зависимой репрессии. Известно, что ген esc экспрессируется в узком временном интервале, и белок Esc требуется в период перехода от временной к стабильной репрессии. В этом плане белок Esc является уникальным, в отличие от других белков группы Polycomb, которые экспрессируются в широком интервале в течение эмбрионального развития. Известно, что белок Esc содержит пять копий WD-мотивов (ß-трансдуциновые повторы) и три копии WD-подобных мотивов, которые предположительно могут участвовать в белок-белковых и белокнуклеиновых взаимодействиях (Frei et al., 1985). Известно, что WD-мотив встречается у таких белков, как TAFn80 и Groucho (Dychlacht et al.,1993; Hartley et al., 1988) y Drosophila, Tupi y дрожжей (Komachi et al., 1994) и COP1 y Ârabidopsis (Deng et al., 1992). Groucho и Tupi - это известные корепрессоры транскрипции. Мутации esc, вызванные заменой аминокислот в WD-мотиве, приводят к дерепрессии транскрипции гомеозисных генов.

Другой участник Pc-Gi-комплекса - белок Enhanser of zeste (E[z]). Белок E(z) состоит из 760 аминокислот. Район из 116 аминокислот, прилежащий к карбоксильному концу, идентичен на 41.2% участку карбоксильного конца trx-гена (Jones and Gelbart, 1993), который относится к белкам группы trithorax (trx). trx-белки являются антагонистами белков Рс-группы, активируя транскрипцию гомеозисных генов. Известно, что сайты связывания trx-белков перекрываются с сайтами для Рс-белков. Как же имея домен, гомологичный белку-акгиватору Тгх, можно объяснить участие белка E(z) в репрессии транскрипции? Одно из возможных объяснений заключается в том, что общий домен для этих белков может участвовать во взаимодействиях с общими мишенями: или нуклеиновой кислотой, или белками. Противоположные эффекты этих белков на транскрипцию могут быть связаны с другими функциональными доменами этих белков (Jones et al., 1993).

Результаты экспериментов in vitro, используя дигибридную систему, показали прямое взаимодействие между белками Esc и E(z). Коиммунопрецшшгация из эмбриональных экстрактов показала ассоциацию этих белков in vivo. Было продемонстрировано, что белки Psc и Suppressor of zeste 2 (Su[z]2) взаимодействуют с белком E(z) и при введении температурочувствительной мутации по белку E(z) диссоциируют с политенных хромосом (LaJeuness and Shearn, 1996). При этом наблюдается деконденсация политенных хромосом и дерепрессия транскрипции (Rastelli et al., 1993).

Белок E(z), как и все выше перечисленные представители Рс-группы, имеет своего гомолога у млекопитающих: EZH1. Было показано, что EZH1 образует комплекс с белком eed (heed), который является гомологом Esc.

На настоящий момент идентифицированы далеко не все члены репрессионых Pc-G-комплексов. Одним из возможных кандидатов как в Pc-Gi-комплекс, так и в Pc-Gm-комплекс является белок Pleiohomeotic (Pho). Pho первый и пока единственный белок из группы Pc, который специфично связывается с ДНК (Brown et al., 1998). Было показано, что белок Pho является гомологом Yin-Yang-1 (УУ1)-фактора. Этот фактор является высоко консервативным белком от X. laevis до млекопитающих. YY1- это транскрипционный фактор, который связывается с ДНК с помощью цинковых пальцев. Белок Pho содержит четыре цинковых пальцев, из которых 2-ой и 3-ий имеют почти 100% гомологию таковым у YY1 (Brown et al., 1998). Известно, что YY1 связывается с консенсусной последовательностью 5'-(C/g/a)(G/t)(C/c/a)CATN(T/a)(T/g/c)-3', где CCATNTT - коровый мотив. Учитывая это, был проведен анализ последовательностей, на которых образуются Pc-G-комплексы, в генах: ph (Fauvarque et al., 1993), Antennapedia (Zink et al., 1991) и Ubx (Chang et al., 1995). Во всех трех были обнаружены консенсусы для связывания с белком YY1. Недавно было показано in vivo связывание белка Pho с консенсусной последовательностью GCCAT(T/a/c)AC в гене Ubx (Fritsch et al., 1999). Точечные мутации в этом мотиве приводят к ослаблению Pc-G-зависимой репрессии in vivo. Однако, как было показано в (Mihaly et al., 1998; Fritsch et al., 1999), одного этого мотива не достаточно для установления полной репрессии. По-видимому, в этот процесс вовлечены дополнительные, еще неидентифицированные факторы, которые помогают белку Pho рекрутировать на ДНК другие Рс-белки. До сих пор неизвестно, в какой из комплексов Pc-Gi или Pc-Gm (PRC1) входит белок Pho. Недавние эксперименты in vitro, используя антитела против консервативной части белка YY1 показали, что белок Pho отсутствует в PRC 1-комплексе (Shao et al., 1999). Однако, для подтверждения этих результатов необходимо повторить эксперимент с антителами, специфичными к белку Pho.

Таким образом, белки Рс-группы имеют различную природу, но в каждом из этих белков найден домен, предположительно отвечающий за белок-белковое взаимодействие. Эти белки необходимы для нормального развития организма. Недостаточность всего лишь по двум различным Рс-генам часто приводит к летальному эффекту. У восьми из девяти клонированных к настоящему времени генов Рс-грутшы найдены гомологи у млекопитающих (мыши и человека) (Muller et al., 1995; Schumacher and Magnuson, 1996). Интересно, что белок МЗЗ, мышиный гомолог Рс-белка Drosophila, способен компенсировать отсутствие белка Рс в трансгенных мухах, мутантных по гену Рс (Рс) (Bunker and Kingston, 1994; Muller et al., 1995; Core et al., 1997). Этот факт свидетельствует о высокой консервативности молекулярных механизмов клеточной детерминации в природе.

1.2 Регуляторные элементы, ответственные за образование репрессионного

Pc-G-комплекса

Участки ДНК, на которых собираются репрессорные комплексы, были найдены в регуляторных зонах гомеозисных генов Sex combs reduced, Antennapedia, Proboscipedia, Abdominal-A, Abdominal-B и Ultrabithorax, а также в собственно генах Рс-группы: engrailed и ph (Busturia and Biens, 1993; Simon et al., 1993; Chiang et al., 1995). Эти участки ДНК были названы PRE (Polycomb Responsible Element). PRE-сайты - это цис-регуляторные элементы, на которых происходит образование комплексов, состоящих из белков - продуктов генов Рс-группы. PRE способны поддерживать прилежащие к ним энхансеры в неактивном состоянии в процессе многих клеточных делений на протяжении всего развития дрозофилы (Chan et al., 1994). Эти элементы были идентифицированы благодаря эффекту, который они оказывали в конструкциях, на маркерный ген white. PRE индуцировали мозаичную репрессию гена white, которая аналогична по фенотипическому проявлению наблюдаемой под действием гетерохроматина в инверсиях (Chan et al., 1994), хотя ни для одной из конструкций не было зафиксировано случаев встраивания в гетерохроматиновые районы (Zink and Paro, 1995). Таким образом, PRE, как и гетерохроматин, отвечают за мозаичную репрессию близлежащих генов, что свидетельствует об общности механизмов репрессии в случае природного гетерохроматина и Pc-G-комплекса. При этом можно наблюдать два типа мозаичной репрессии - либо на уровне клеточных клонов, когда репрессия устанавливается на ранних эмбриональных стадиях развития; либо в хаотично разбросанных клетках, что свидетельствует о случайном происхождении репрессии на более поздних стадиях развития. Мозаичная репрессия гена white в конструкциях с PRE частично супрессируется в комбинации с мутацими по генам группы Polycomh. Образование комплексов с участием основных белков группы Рс на PRE-white-конструкциях было показано с помощью иммунологических методов. В районе инсерции конструкции с PRE обнаруживается специфическое связывание определенных белков группы Рс и отсутствие других: состав комплекса при этом зависит от сайта инсерции (Gindhart and Kaufman, 1995).

Фрагменты ДНК, обладающие PRE-активностью, имеют размер от 1 до 3 т.п.н. (Pirrotta, 1997). Делеционный анализ PRE-сайтов показал, что это сложные структуры, которые могут быть разбиты на субфрагменты с остаточной PRE-активностью. Известно, что нуклеотидная последовательность этих субфрагментов не содержит общего мотива для всех известных PRE-сайтов. В &£-С-комплексе идентифицированы и достаточно хорошо изучены два PRE-элемента: FAB и MCP. Они отличаются по силе действия: MCP в конструкции с геном white полностью его репрессирует, а действие FAB приводит к появлению только мозаичной репрессии (Zink and Paro, 1995). Размер этих элементов находится в пределах 1-2 т.п.н. (Strutt and Paro, 1997). Для FAB-элемента показана зависимость силы его действия от ориентации, что возможно связано с тем, что на одном из концов этого элемента находится инсулятор (Mihaly et al., 1997).

Большинство из известных Рс-белков не имеет ДНК-связывающей активности, но они обладают способностью связываться с определенными структурами хроматина в гомеозисных генах (Zink and Paro, 1989). Как же белки Рс-группы рекрутируются на PRE-сайтах? Ответ на этот вопрос до сих пор не получен. Несмотря на то, что на сегодняшний момент известен белок Pho, который специфично связывается с ДНК, и, как предполагается, может рекрутировать остальные белки, входящие в состав репрессионного комплекса, единого мнения по этому вопросу нет. Кроме белка Pho, к возможным кандидатам относят белки Esc и E(z) (Strhul and Brower, 1982; Rastelli et al., 1993), специфично связывающиеся с ДНК белки: GAGA-фактор (Strutt et al., 1997), Hunchback (Hb) (Zhang and Bienz, 1992) и белок, взаимодействующий с HB - dMi-2 (Kehle et al., 1998).

Известно, что многие PRE-элементы содержат сайты связывания для GAGA-фактора, продукта гена Tritirax-like (Tri) дрозофилы (Farkas et al., 1994). GAGA-фактор является белком, который индуцирует и поддерживает открытую форму хроматина (O'Brien, 1995). Было показано, что этот фактор обеспечивает другим ДНК-связывающим белкам возможность доступа к ДНК с помощью АТФ-зависимого ремоделинга нуклеосом (Wall et al., 1995; Pirrotta, 1997). Интересно, что FAB-7-фрагмент содержит три потенциальных сайта для связывания GAGA-фактора и два консенсуса для белка Pho. Как было обнаружено, мутации в GAGA-факторе приводят к снижению репрессии в гомозиготных конструкциях с геном white. Кроме того, фрагмент, содержащий только сайты связывания для белка Pho, не действовал как транскрипционный сайленсер на транскрипцию гена white (Brown et al., 1998). Возможно, присутствие GAGA-фактора в контексте PRE-сайтов облегчает доступ к ДНК белков Рс-группы и тем самым способствует образованию репрессионного комплекса (Pirrotta, 1997). Однако, известно, что между белками Pc и GAGA-факгором существуют конкурентные взаимоотношения, так как Pc-G-комплексы обычно отсутствуют в районах, где идет активная транскрипция (Strutt and Paro, 1997). В этом случае, возможно, роль GAGA-фактора сводится к созданию альтернативного комплекса, который поддерживает открытую форму хроматина и мешает образованию репрессионного комплекса (Wall et al., 1995). Делеционный анализ PRE-сайтов из ВХ-генного комплекса показал, что последовательности ДНК, нужные для действия белков trx-группы, перекрываются с теми же для белков Рс-группы. Недавно было показано, что эти участки представляют собой все же разные дискретные районы, расположенные близко друг к другу (Tillib et al., 1999). Ранее была предложена гипотеза для объяснения образования противоположных по действию комплексов на перекрывающихся сайтах сборки. Считается, что белки обеих групп генов конкурируют за одни и те же белки или участки связывания, что и приводит к образованию альтернативных комплексов, способствующих либо активации, либо репрессии транскрипции (LaJeuness and Shearn, 1996). Возможность образования альтернативных комплексов подтверждается наблюдением, что Рс не обнаруживается в случае активной экспрессии Вх, а белок Тгх, наоборот, не связывается с зарепрессированнымДг-комплексом (Strutt and Paro, 1997).

Ранее упомянутый белок, E(z), может также выступать в роли белка, за который идет конкуренция между Pc-G- и trx-G-комплексами. Используя температурочувствительную мутацию [E(z)ts], удалось показать, что под действием критической температуры происходит потеря практически всех сайтов связывания для белков Psc, Su(z)2, Рс и Ph. При этом, гены, находившиеся в зарепрессированном состоянии, переходят в активную форму: политенные хромосомы становятся деконденсированными (Rastelli et al., 1993). Из этого следует, что белок E(z) является необходимым для образования репрессорного комплекса. С другой стороны, существуют данные, что белок E(z) может прямо взаимодействовать с белками trx-группы с помощью домена, гомологичного домену белка Тгх.

Однако, недавно полученные данные показали, что PRC 1-комплекс не содержит ни GAGA-фактора, ни белок E(z) (Shao et al., 1999).

Другой возможный кандидат на роль ДНК-связывающего белка - белок НЬ. Известно, что белок НЬ специфично связывается с ранним энхансером Ubx-гена, репрессируя его транскрипцию в определенных парасегментах эмбриона Drosophila (Poux et al., 1996). Далее репрессивный статус поддерживается белками Рс-группы. Если же ранней репрессии f/éx-гена не происходит, то этот локус остается транскрипционно активным. Однако, PRE-сайт Шнг-гена не содержит сайты связывания для НЬ, кроме того, сверхэкспрессия белка НЬ не имела никакого эффекта на функции PRE-сайта. По-видимому, процесс образования репрессионного комплекса напрямую зависит от транскрипционной активности локуса-мишени. Недавно был найден белок, который взаимодействует с белком НЬ (КеЫе et al., 1998). Это белок - dMi-2. Генетические эксперименты показали, что мутации по белку dMi-2 очень напоминают мутации по белку E(z). Возможно, что белок dMi-2 один из участников Pc-G-комплекса. Однако, пока не было показано прямого взаимодействия этого белка с другими членами Pc-G-комплекса.

Таким образом, пока неизвестно, входят ли белки НЬ, dMi-2 и Esc в состав репрессионного комплекса - PRC1, и вопрос о белке-'якоре" для Pc-G-комплекса остается открытым.

1.3 Возможные механизмы сборки репрессионного Pc-G-комплекса и его структура

Известно, что все Pc-G-комплексы имеет сайт-специфическую локализацию на политенных хромосомах. Однако, пока остается не решенной проблема, что общего между последовательностями различных PRE-сайтов и какой фактор или группа факторов, кроме белка Pho, могут рекрутировать Pc-G-комплексы. Для основных белков Рс-группы. Psc/Ph/Pc/Su(z)2 было показано, что если хотя бы один из перечисленных белков приобретает ДНК-специфическое связывание (в конструкциях с химерными белками, содержащими ДНК-связывающий домен), то другие белки также связываются с этим районом (Pirrotta, личное сообщение). Можно предположить, что еще не идентифицированные белки группы Рс содержат ДНК-связывающий домен, распознающий специфические PRE-последовательности; эти белки в комплексе с белком Pho формируют первичный сайт связывания, на котором, впоследствии, и происходит сборка всего репрессионного комплекса. Так, например, человеческий белок Mel-18, имеющий значительную гомологию с белками дрозофилы Psc и Su(z)2, может связываться непосредственно с ДНК, предпочтительно распознавая (ТТАС)ОАСТ№гАСТ-последовательность в регуляторной области генов Hox (Kanno et.al., 1995). При наличии четырех связывающих последовательностей котрансфекция Mel-18 с репортерным геном приводит к значительной репрессии последнего; предполагается, что белок Mel-18, вероятно, способен вовлечь и другие белки в образование активного репрессионного комплекса. Полагают также, что у дрозофилы белки Sem и Ph могут в комплексе связываться с ДНК и тем самым служить инициаторами образования репрессионного комплекса.

Альтернативный сценарий сборки предполагает кооперативное взаимодействие сразу многих компонентов, каждый из которых обладает слабой специфичностью к определенным последовательностям ДНК. Так, например, сверхэкспрессия белков дрозофилы Psc или Su(z)2 приводит к их активной, но практически равномерной ассоциации с политенными хромосомами, что предполагает низкую степень сродства к часто встречающимся нуклеотидным последовательностям или некоему равномерно распределенному по хромосоме компоненту хроматина (Pirrotta, 1997). Кластер низкоспецифичных сайтов связывания для нескольких компонентов Pc-G-комплекса может заменять PRE-сайт, в котором при наличии подходящих условий способно сформироваться начальное ядро организации репрессионного комплекса (Pirrotta and Rastelli, 1994).

Эксперименты по сшивке белка с ДНК показали, что комплекс, состоящий из Рс-белков, в зарепрессированных генах распространяется на десятки т.п.н. (Orlando and Paro, 1993). Стабильность и степень распространения такого комплекса зависит от наличия фланкирующих районов, а также последовательностей для связывания индивидуальных компонентов, которые являются сами по себе слишком слабыми для инициации формирования репрессорного комплекса, но взаимодействуют с сайтом нуклеации Pc-G-комплекса, образующимся на PRE-сайтах. Такой механизм хорошо объясняет сильную зависимость образующегося на PRE-сайтах репрессионного комплекса от хромосомного окружения, а также участие разных наборов индивидуальных Рс-белков при формировании комплекса в разных сайтах (Pirrotta, 1997).

В гене Ubx, где необходимо наличие сильного и стабильного репрессионного комплекса, было идентифицировано несколько слабых сайтов взаимодействия с Рс-белками (Chan et al., 1994). Один из этих сайтов, находящийся вблизи BXD-энхансера, обладает очень слабой PRE-активностью, но в комбинации с другими слабыми PRE-сайтами способен поддерживать зарепрессированное состояние хроматина (Poux et. al., 1996). Недавно было показано, что белок Pc не расположен равномерно вдоль хромосомы, а имеет предпочтительные сайты связывания на протяжении всего ВХ-С (Strutt and Paro, 1997).

Таким образом, в разных участках генома могут быть реализованы оба выше описанных механизма сборки репрессионных комплексов: в одних участках происходит кооперативное связывание большого количества белков, имеющих низкую степень сродства к ДНК; в других - специфический ДНК-связывающий белок вовлекает остальные белки в образование репрессионного комплекса.

1.4 Взаимодействия между Pc-G-комилексами

PRE-сайты и PRE-зависимая репрессия обладают некоторыми характерными свойствами, о которых говорилось выше. Эти свойства дали ключ к пониманию такого явления как взаимодействия между PRE-сайтами, к которым относятся феномены "хоуминга" (homing) транспозонов; репресии, засисящей от спаривания гомологичных хромосом (транс-репрессия) и косупрессии.

Явление "хоуминга" заключается в том, что PRE-содержащий транспозон часто встраивается в геноме вблизи других PRE-сайтов (Fauvarque and Dura, 1993). По-видимому, Pc-G-комплекс, собираясь на транспозоне, инъецированном в эмбрион, стремится ассоциировать с Pc-G-комплексом, расположенным в геноме, тем самым увеличивая вероятность встраивания конструкции в непосредственной близости от него.

Стабильное взаимодействие между Pc-G-комплексами также объясняет другое явление - спаривание PRE-сайтов в PRE-содержащих транспозонах. Известно, что репрессия в PRE-содержащих транспозонах слабая или вовсе отсутствует. Однако, при огомозигочивании такой конструкции наблюдается полная репрессия транскрипции репортерного гена (Fauvarque and Dura, 1993). По-видимому, две копии PRE, благодаря гомологичному спариванию, приводят к резкому увеличению степени и стабильности репрессии. Кроме того, было показано, что такого рода взаимодействия наблюдаются для PRE-содержащих транспозонов, находящихся в различных местах разных хромосом (Vazquez et al., 1993).

Очень сходное явление было ранее описано для мутации brown-Dominant (bw°), которая вызвана инсерцией последовательности гетерохроматина перед геном bw. В результате данной перестройки наблюдается доминантная репрессия транскрипции гена bw. Из чего можно сделать вывод, что репрессировалась транскрипция не только в аллеле bW3, но и в гомологично спареном аллеле bw". Эта репрессия сильно увеличивалась при инверсии ЪтР к центромерному гетерохроматину. Гибридизация in situ показала, что аллели bwD и bw+ ассоциированы с центромерным гетерохроматином. В то же время как в диком типе гена bw, такое явление не наблюдается. По-видимому, гетерохроматиновая последовательность перед геном bw стремится ассоциировать с центромерным гетерохроматином, и это взаимодействие способствует образованию гетерохроматина и репресии транскрипции как ЪуР, так и спареного с ним bw+ -копии.

Недавно у Drosophila было показано, что на конструкции, состоящей из промотора гена white и кодирующей части гена Adh, происходит образование репрессионного комплекса с участием белков Рс и Ph (Pal-Bhadra et ai., 1997). Оказалось, что увеличение копийности данной конструкции в геноме (с двух до шести) приводит к прогрессирующей репрессии транскрипции гена Adh, как на личиночной стадии, так и на имагиальной. Ожидаемого дозового эффекта от количества конструкции не наблюдалось. Кроме того, в трансгенных мухах, имеющих множественные инсерции такого транспозона, наблюдалось уменьшение количества эндогенного ^¿//мгранскрипта. Это явление напоминает феномен косупрессии, впервые открытый в растениях. Интересно, что до сих пор это явление не встречалось у животных. Авторы предполагают, что именно взаимодействие гомологичных последовательностей между собой может индуцировать сборку репрессорного комплекса (Pal-Bhadra et al., 1997). По данным in situ гибридизации и генетических экспериментов в районе гена Adh уже предсуществуют PRE-сайты, что предполагает предсуществование белков группы Рс, связанных с ДНК районами гена Adh. Следовательно, можно предположить, несколько копий одной конструкции находятся определенное время в контакте, что приводит к синергетическому взаимодействию между белками Рс и усилению репрессии. Аналогичное явление было описано в работе (Sigrist and Pirrotta, 1997). В этой работе PRE был помещен в констукцию рядом с геном white и ограничен с обеих сторон инсулятором su(Hw), который изолировал конструкцию от влияния окружающих регуляторных районов. В части независимых инсерций этой конструкции PRE не влиял на экспрессию гена white, что объснялось тем, что для образования функционального репрессорного комплекса необходимо взаимодействие нескольких PRE-сайтов, которые изолированы в данном месте инсерции 8и(Н\¥)-инсулятором. В то же время комбинация двух или более конструкций, расположенных в разных местах генома приводила к сильной репрессии транскрипции гена white, что можно было объяснить синергичным взаимодействием PRE-сайтов, находящихся в окружении гомологичных последовательностей гена white.

Таким образом, Pc-G-комплекеы имеют тенденцию к самоассоциации и, неисключено, в определенных компартментах ядра, что приводит к локальному повышению концентрации Рс-белков и стаблизации Pc-G-комплексов.

1.5 Возможные механизмы репрессии транскрипции с помощью Pc-Gкомплексов

Считается, что действие Рс-белков происходит на уровне изменения структуры хроматина. Однако, в настоящее время пока не выяснено, каким образом меняется структура хроматина в результате образования репрессионного комплекса: либо увеличивается стабильность нуклеосом на ДНК, что затрудняет доступ сайт-специфическим активаторам транскрипции к ДНК, либо увеличивается компактизация хроматина в целом.

Как известно, стабильность нуклеосом связана с посттрансляционными модификациями лизиного остатка в N-конце НЗ- и Н4-гистонов деацетилазами. Кроме того, известно, что различные деацетилазы функционально ассоциированы с репрессорами транскрипции, которые специфично связываются с ДНК (Laherty et al., 1997). Предполагается, что структура хроматина, измененная таким комплексом, может узнаваться белками Рс-группы. Недавно у Drosophila был найден белок dMi-2, который гомологичен белку Mi-2 у позвоночных. Известно, что белок Mi-2 является компонентом гистон-деацетилазного комплекса, который обладает также способностью АТФ-зависимого ремоделинга нуклеосом (Wade et al., 1998). Возможно, что ранний репрессор транскрипции Hb рекрутирует dMi-2-деацетилазный комплекс, в результате чего происходит локальное изменение хроматина. Именно такую структуру и узнают Рс-белки. Однако, на сегодняшний момент экспериментально не детектировалась стабильная деацетилазная активность в Pc-G-комплексах (Voncken, van Lohuizen неопубликованные данные). Недавно также было показано, что активный репрессионный комплекс может собираться на матрице, содержащей гистоны с делецией N-конца (Shao et al., 1999). Кроме того, в X.laevis показано, что ингибирование деацетилаз трихостатином А не влияло на Pc-G-зависимую репрессию (Strouboulis et al., 1999). По-видимому, модификация гистонов деацетилазами не играет главную роль в установлении Pc-G-репрессии.

Ранее было показано, что репрессия, индуцированная PRE, уменьшает доступ рестриктаз к их сайтам на ДНК (Schlossherr et al., 1994), а также метилазы E.coli к сайтам метилирования на ДНК. В присутствии мутаций в генах Рс-группы эти эффекты супрессируются. В лаборатории Бендера показано, что РНК-полимераза фага Т7, которая имеет маленькие размеры, может нормально функционировать в условиях репрессионного комплекса (McCall and Bender, 1996). Но если Т7 РНК-полимеразу увеличить путем пришивания к ней инертного хвоста, то происходит репрессия ее функционирования, которое восстанавливается в присутствии мутации в генах Рс-группы. Таким образом, маленькие по размерам комплексы имеют доступ к ДНК, тогда как крупные - нет, что предполагает наличие более компактного хроматина в местах действия PRE. В то же время образование репрессионного комплекса является обратимым состоянием и его можно супрессировать добавлением активатора транскрипции. Такие результаты были получены на конструкции, содержащей ген white, PRE- и сайты связывания для дрожжевого активатора Gal4. Увеличение концентрации активатора Gal4 приводило к дерепрессиии транскрипции гена white на любой стадии развития дрозофилы.

Кроме опосредованной репрессии транскрипции через изменения в структуре хроматина, не исключено прямое ингибирование транскрипции отдельными членами Рс-группы. Известно, что белок TAFn80 - один из факторов, ассоциированых с ТАТА-связывающимся белком (ТВР), имеет на С-конце семь

WD-доменов (Dynlacht et al., 1993), которые участвуют в белок-белковых контактах. Белок Esc, как было показано, имеет шесть WD-доменов на С-конце (Gutjahr et al., 1995). Возможно, что белок Esc конкурирует с транскрипционным фактором TAFn80 за места связывания с другими транскрипционными факторами, с ТВР или другими компонентами базального транскрипционного комплекса. В результате происходит ингибирование транскрипции, и в дальнейшем репрессионное состояние поддерживается благодаря изменениям в структуре хроматина.

Таким образом, пока не известен механизм действия Pc-G-комплексов. Однако, не исключено, что репрессия включает в себя несколько этапов (рис.1). Сначала происходит ингибирование транскрипции ранними сайт-специфичными репрессорами и/или факторами, ассоциированными с ними, что сопровождается локальными изменениями в структуре хроматина. Затем, такая измененная структура хроматина узнается компонентами Pc-Gi-комплекеа, и далее поддержание репрессионного статуса осуществляется Pc-Gm-комплексом

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Генетические методы

Линии D.melanogaster велись при температуре 25°С, используя стандартный корм: агар, дрожжи, сахар. Скрещивания проводились в стандартных стеклянных пробирках, на одну пробирку брали 2-3 самца и 10-15 самок (Lindsley and Zimm, 1992).

2.1.1. Мутации и линии Drosophila melanogaster, использованные в работе. Происхождение и генетическая символика лабораторных линий, использованных в работе, описаны в статьях (Georgiev et al., 1997; Гергиев и др., 1992). Перечень мутаций, содержащихся в этих линиях, приведен в табл. 1. Обозначения даны согласно принятой символике (Lindsley and Zimm, 1992).

Таблица 1. Перечень мутаций, использованных в данной работе. символ локус фенотипическое проявление

У yellow желтое тело, черные щетинки

У* yellow желтое тело, черные щетинки

У yellow желтое тело, желтые щетинки wa white глаза абрикосовые е sn singed опаленные щетинки (сильное проявление) sn™ singed опаленные щетинки (слабое проявление) е ebony черное тело, черные щетинки

Описание мутации в Л-генах приведено в табл.4 и в (Lindsley and Zimm, 1992). Мутация wa (1-1.5) использовалась как ближайший маркер ph-гена (0.5-1). Линии D.melanogaster, использованные в данной работе.

Oregon R - лабораторная линия дикого типа; y'z1, y?scDlwaGcfg - стабильные лабораторные линии, имеющие маркерные мутации и использованные для картирования модификатора; y'scD>wa - лабораторная линия, маркированная мутациями у, sc и w.

C(l) RM,yf - лабораторная линия, самки которой содержат сцепленные Х-хромосомы (XX), маркированные мутациями / и /; у ас w1118 - лабораторная линия, несущая доминантные маркеры на второй хромосоме In(2RL),CyO и In(3LR)TM3,Sb - на третьей хромосоме у ас w67c - лабораторная линия, несущая делецию в локусах у и ас;

FM4 - мутантная линия с балансерной хромосомой, несущая запиратели кроссинговера по Х-хромосоме; w;Sb Pfry Л2-3](99В) е /ТМ6,е - линия, полученная из Bloomington stock center, Л2-3(99В) - обозначение генетической конструкции, кодирующей функциональную транспозазу Р элемента (Robertson et al., 1988). Эта линия использовалась для индукции Р-мутагенеза.

2.1.2. Генетические скрещивания и создание комбинаций мутаций. Определение хромосомной локализации модификатора осуществлялось по схеме: F0 о y'z1 х о y2sphplw+, в Fi анализировался фенотип самок. При наличии одного класса самок (у1 zlly2"phflw+) делался вывод о Х-хромосомной локализации. Рекомбинационное картирование выполнялось по следующей схеме: Fo о /sf'w^cfg х o/>ÄFV, в Fi o/HVGc/y/>ÄFV х o/sphplw\ в F2 поколении проводился фенотипический анализ полученных рекомбинантных событий. Определение частот кроссинговера и генетическое картирование выполнялось по стандартной методике (Ashburner, 1989).

Индукции мутагенеза Р-элемента выполнялось по следующей схеме: F0 о y+!lphpl х о w^Sb P[ry+А2-3](99В) е /1Мб,е , в F, oy s'phpl/Y; Sb А2-3 е/Ш6,е /+ х о XX C(l)RM,yf, которые содержат сцепленные Х-хромосомы.

В F2 поколении самцов с измененным фенотипом скрещивали индивидуально с самками XX C(l) RM,yf и в поел едущем поколении анализировали у самцов степень пигментации тела, крыльев и щетинок.

Комбинации мутации phF1 с различными у-аллелями были получены по следующей схеме:

Fo: о у1 scD1 wa/y!scD1wa х о у */Y, где .у* любой использованный ^-аллель; Fi: oy'scp'wa /у* х oy!scD1pff'wa /У;

F2: Самцы с генотипом y*phPIw" (sc+ фенотип и оранжевые глаза) скрещивались индивидуально с самками C(l) RM,yf для дальнейшего молекулярного анализа. В F3 анализировали у самцов степень пигментации тела, крыльев и щетинок.

Выведение pïfl с Х-хромосомы на фоне ^*-аллелей выполнялось по следущей схеме:

F0: oylscp!wa ly'scD'wa xoy*phFÎ /Y; в Fb о y'scD'wa/y*pîf! x о y'scD'wa /Y; в F2: Самцы с генотипом y*w" (sc+ фенотип и оранжевые глаза) скрещивались индивидуально самками C(l) RM,yf для дальнейшего молекулярного анализа. В F3 проводился анализа-фенотипа у самцов.

Анализ супрессии мутантного фенотипа: комбинации аутосомных Su(y) мутаций cy*phFl были получены и проанализированы по следующей схеме: F„: oy*phf'1 /FM4 х о y+slphfL, Su(y) /СуО или Su(y)/TM3,Sb

PI

В Fi анализировалсяj-фенотип у самцовy*ph /Y; Sn(y)/+.

Определение yellow фенотипа проводилось путем визуального анализа степени пигментации кутикулы тела, крыловых пластинок и щетинок у 3-5 дневных самцов и самок при температуре 25°С. Результаты сравнивались с контрольными мухами известного фенотипа. Уровень экспрессия гена yellow в мухах дикого типа условно принят за 5, отсутствие экспрессии - за 0, 1

2PR!

-аллеля, 3 - фенотипу частичного ревертанта у (Georgiev and Kozicina, 1996), 4 - промежуточный уровень между у и диким типом (Georgiev et al., 1997).

2.2 Биохимические методы

2.2.1. Выделение ДНК дрозофилы для рестрикционного анализа.(А)

Мух (0.1-0.12г) растирали пестиком в буфере, содержащем 0.1М Tris, рГО.О; 0.1М ЭДТА, рН8.0; 1%SDS и DEPC в концентрации 1%. Смесь выдерживали 30-40 мин. при 70°С, затем добавляли КАс (1/7V 8М КАс от объема буфера) и оставляли на 30 мин. в ледяной бане, после чего центрифугировали, ДНК экстрагировали смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом. ДНК осаждали, добавляя 0.6 V изопропанолового спирта, промывали 70% этанолом и растворяли в деионизированной воде или 1хТЕ.

Б) Выделение ДНК дрозофилы для клонирования. Мух (0.5-1.Ог) растирают в жидком азоте до образования гомогенного порошка, затем добавляют 7 мл лизирующего буфера (20мМ ЭДТА рН8.0; 0.2М Tris, рГО.О; 0,5%SDS; 150мМ NaCl). После оттаивания добавляли 35% саркозил до концентрации 0.5-1.0% и ресуспендировали 5 мин. при комнатной температуре. Затем добавляли протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и инкубировали смесь 3 ч. при 55 °С. Депротеинизацию проводили последовательно фенолом, фенол-флороформом (1:1) и хлороформом до исчезновения видимой интерфазы. Далее ДНК осаждалась 0.6-0.8V изопропанолом, промывалась 70% этанолом и растворялась в деионизированной воде или 1хТЕ.

2.2.2. Выделение фрагментов ДНК из геля и чистка ДНК от продуктов ферментативных реакций.(А) Выделение фрагментов ДНК из агарозы и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций осуществлялась с помощью наборов QIAquick PCR Purifacation Kit и QIAquick Gel extraction Kit (фирмы QIAGEN).(B) Выделение фрагментов электроэлюцией. Создавали специальную конструкцию, ограниченную с одной стороны мембраной из диализного мешка. Полоску агарозы, содержащую фрагменты нужного размера, помещали в конструкцию, заполняли ее буфером 1хТАЕ и проводили элюцию фрагментов из агарозы путем электрофореза. Фрагменты ДНК последовательно чистили фенол-хлороформом и хлороформом, затем добавляли т-РНК, 2,5У этанола, 1/10У №Ас и выдерживали 1 ч. при -80°С, после чего центрифугировали, промывали 70% этанолом и растворяли в деионизированной воде.

2.2.3. Саузери-блот-анализ. Выделенную геномную ДНК дрозофилы обрабатывали рестрицирующими эндонуклеазами в стандартных условиях, потом разделяли в горизонтальном 0,7% агарозном геле в 1х трис-ацетатном буфере (ТАЕ: 40 мМ трис-НС1, рН 7.6; 5 мМ ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА). В качестве маркеров молекулярного веса фрагментов ДНК использовалась ДНК фага Л, обработанная рестриктазами НМШ или РяМ. Затем гель депуринизировался либо путем вымачивания 20-30 мин. в растворе 0,25 н НС1, либо 3-5 мин. экспозицией на трансиллюминаторе при коротковолновом ЦУ-освещении, каппилярный перенос проводился в 0.4 н ИаОН в течение 12-18 ч. на мембрану НуЬопё-ЬГ, затем фильтр нейтрализовался 1-3 мин. в 5х ББС.

2.2.4. Гибридизация на фильтрах. Гибридизацию блотов с меченой ДНК зондов осуществляли по стандартной методике (БатЬгоок, РгквсЬ, Матайв, 1989). Фильтры инкубировали 0.5-1 ч. при 65°С в предгибридизационном растворе (0.1% БСА, 0.1% фикола, 0.1% РУР, 4х88С, 0,2%808). Гибридизацию проводили при 65°С 6-18 ч. в растворе того же состава, что и для предгибридизации, но с добавлением денатурированного 32Р-ДНК зонда.

Радиоактивные зонды готовились методом статистической затравки (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989), используя меченые а[32Р]-дАТФ (ИМБ РАН, Москва). Отмывка фильтров выполнялась по схеме 30 мин. в растворе 2xSSC и 0,1% SDS при температуре 65°С, затем 30 мин. в растворе lxSSC и 0,1% SDS, затем 30 мин. в 0,lxSSC с 0,1% SDS. Далее фильтр подсушивали, заворачивали в Saran Wrap, экспонировали с рентгеновской пленкой Retina х ray в кассете с усиливающим экраном ЭУИ-1. Для последующих перегибридизаций фильтр откипячивался в 0.5% SDS.

2.2.5. Молекулярное клонирование. Клонирование проводили по стандартной методике (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989).

2.2.5.1. Получение геномных библиотек. Геномную ДНК выделяли по описанной выше методике (Б). Полученную ДНК обрабатывали рестрицирующими эндонуклеазами BamHI. Далее из геля вырезали полосу, соответствующую фрагменту нужной длины (в диапозоне 9-12 т.п.н.), ДНК из полосы выделялась методом электроэлюции. В качестве вектора для клонирования использовали фаг A.GEM11 с плечами по BamHI (фирмы Promega). Оптимизация условий дотирования осуществлялась по методике, прилагаемой к набору для клонирования геномной ДНК фирмы Promega. Реакцию дотирования проводили в 1х лигазном буфере (фирма Promega) с добавлением 3 ед. ДНК-лигазы бактериофага Т4 при комнатной температуре в течение 3 ч. В работе использовались упаковочные экстракты Packagene® Extract, поставляемые фирмой "Promega". Фагом заражались клетки E.coli штамма LE 392, которые выращивались в среде, содержащей 0.2% мальтозу и 10 мМ Mg2S04 (Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989). Продукты дотирования (не более 0.5 мкг или не более 5 мкл лигазной смеси) добавляли к 50 мкл упаковочного экстракта. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре 3 ч. Затем добавляли 445 мкл буфера БМ (ЮОмМ ЫаС1; ЮмМ Ме2804; 20мМ трис-НС1, рН 7,5; 0,01% желатин) и 25 мкл хлороформа. Определение титра и высев фаговой библиотеки осуществлялись по стандартной методике (БашЬгоок, РгквсЬ, Машайв 1989).

2.2.5.2. Выделение рекомбинантных клонов из геномной библиотеки. Полученные рекомбинантные фаговые частицы высевали в 0,7% верхний агар на чашки с 1,5% ЖУ-агаром. Интересующий нас рекомбинантный фаг идентифицировали гибридизацией фильтров со специфичным меченым зондом. Для переноса бляшек фага использовался фильтр НуЬопё-М, который накладывали на газон с бляшками и оставляли на 1 мин., затем фильтр вместе с агаром прокалывали иглой для последующего определения местонахождения сигнала. Далее фильтр с перенесенными на него бляшками обрабатывали в течение 5 мин. при комнатной температуре лизирующем раствором 0,5н №ОН; 1.5М ШС1; затем нейтрализовали 5 мин. в растворе 0.5М Трис-НС1, рН8.0; 1.5 М 1ЧаС1, далее споласкивали 5 мин. - в 2х88С. Затем фильтр кросслинкировали в ЦУ-печке (фирма Stratagene).

Гибридизацию полученных фильтров с меченой ДНК зонда проводили по стандартной методике (см. раздел 2.2.4. "Материалы и методы"). Бляшки, дающие положительные сигналы с зондом, скалывали Пастеровской пипеткой, помещали в БМ и рассеивали на новых чашках. В результате трех последовательных скринингов выделяли рекомбинантный фаг, содержащий интересующий нас район.

2.2.5.3. Выделение ДНК рекомбинантного фага. Фаговую бляшку вырезали из агара и суспендировали в 100 мкл БМ буфера. Суспензию ( инкубировали 2 ч. при 37°С или оставляли при +4°С на ночь для высвобождения фаговых частиц. Потом 10-20 мкл фагового элюата добавляли к 500 мкл ночной культуры Е.соН (ЬЕ-392) и инкубировали при37°С 20 мин. Далее эта смесь переносилась в колбу с 500 мл среды ЖУ, содержащей ЮмМ Mg2S04. Клетки инкубировали 6-8 ч. на качалке при температуре 37°С до полного лизиса. Затем добавляли несколько 500 мкл хлороформа и инкубировали еще 15 мин. при тех же условиях. Лизат центрифугировали 10 мин. при 10 000 об/мин при 4°С для освобождения от клеточного дебриса. Супернатант обрабатывали растворами панкреатической ДНКазы и РНКазы (конечная концентрация 1мкг/мл) в течение 30 мин. при 37°С, после чего добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ 6000) до конечной концентрации 10% и ЫаС1 - до концентрации 1М. Пробирки инкубировали при 0°С не менее 1 ч. Собранный высокоскоростным центрифугированием осадок ресуспендировали в 1 мл буфера БМ. К суспензии добавляли БОБ (до конценрации 1%) и ЭДТА (до 50мМ), смесь инкубировали 15 мин. при 68°С. Затем проводили экстрацию фенолом, фенол-хлороформом и хлороформом. ДНК фага осаждали из водной фазы добавлением равного объема изопропанола. Полученный осадок промывали 1 мл 70% этанолом и растворяли в воде. При необходимости проводили дополнительную обработку РНКазой в концентрации 20 мкг/мл при 37°С 30 мин., с последующей экстракцией и осаждением, как было описано выше.

Далее выполнялось рестрикционное картирование полученных рекомбинантных фагов. Интересующие фрагменты были переклонированы в плазмиды ВЫевспр! БК -/+ (фирма 81га1а§епе) и рОЕМ®57^+/-) и 1X^+1-) (фирма Ргоп^а).

2.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами. Для наращивания плазмид для дальнейшего молекулярного анализа использовались клетки E.coli: штамм DH-5a или XL-blue. Компетентные клетки готовили по стандартной методике, с использованием стандартных растворов (Гловер, 1988), с последующим замораживанием в жидком азоте и хранением при -70°С. Для трансформации клетки размораживали в ледяной бане (0°С). К 200мкл клеток добавляли не больше 20 мкл лигазной смеси или 0,01мкг ДНК плазмиды и инкубировали 15-30 мин. при 0°С. Затем на 1.5 мин. пробирку помещали на 42°С и после добавления 1мл среды LB, инкубировали 30 мин. при 37°С. Аликвоту высевали на чашки с LB-агаром с ампициллином (до концентрации 20-60 мкг/мл LB-агара) и инкубировали ночь при 37° С.

Клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирали на среде LB-агара с ампициллином, содержащей X-gal (40 мкг/мл среды) и IPTG(40 мкг/мл среды).

2.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса.

Выросшую на ампициллиновой чашке с X-gal и IPTG белую колонию переносили в колбу с 3 мл среды LB с ампициллином и выращивали в течение ночи на качалке при 37° С. 2мл среды с клетками центрифугировали 1 мин. при 12000 об/мин при 4° С. Осадок суспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (50мМ глюкоза, 25мМ Трис-HCl, рН8,0; ЮмМ ЭДТА) и инкубировали при комнатной температуре. Затем добавляли 400 мкл денатурирующего буфера (0,2М NaOH; 1% SDS) и инкубировали 5мин. при 0°С. Далее добавляли предварительно охлажденный 300 мкл 7,5М раствор NBUAc и инкубировали 5 мин. при 0°С. Центрифугировали 5 мин. при 12000 об/мин при 4°С. Супер переносили в новую пробирку, добавляли 0,6V изопропанола и оставляли в течение 10 мин. при комнатной температуре. Проводили еще одно центрифугирование при 12000 об/мин. К осадку добавляли 100 мкл 2М NH4AC, рН 7.4, встряхивали, оставляли в ледяной бане на 5 мин. После центрифугирования отбирали супер, осаждали ДНК равным объемом изопропанола, осадок промывали 70% этанолом, растворяли в 1хТЕ.

2.2.8. Выделение РНК. РНК выделялась из эмбрионов, личинок и куколок, собранных на соотвествущих стадиях (Ashburner, 1989). Тотальную РНК выделяли горячим кислым фенольным методом (Spradling and Mahowald, 1979). Собранный материал (от 0.1 до1 г) растирали в жидком азоте с добавлением равного объема фенола (рН5,1) и лизирующего буфера (SDS 1%; NaAc 50мМ; ЕДТА ЮмМ), прогревали 10 мин. при 60°С и центрифугировали. Затем РЖ экстрагировали смесью фенол-хлороформ и хлороформом, осаждали 2,5 объемами этанола в присутствии 1/10V ЗМ NaAc; осадок споласкивали 70% этанолом. мРНК выделяли с помощью набора PolyATtrack® mRNA Isolation Systems (фирма Promega).

2.2.9. Электрофорез РНК и гибридизация. Электрофорез РНК проводили в 1% агарозном геле в присутствии 6% формальдегида и lx FGRB буфера (1мМ ЕДТА, 10 мМ NaAc, 20мМ MOPS рН7.0). В лунку наносилось по 3 мкг мРНК или по 30 мкг тотальной РНК. В качестве маркера использовали стандартный РНКовый маркер или денатурированный ДНКовый маркер A/HindIII. Далее гель инкубировали 20 мин. в 20х SSC и переносили на мембрану HybondN методом блотгинга, фильтр кросслинкировали в UV-печке (фирма Stratagene). Гибридизацию проводили с ДНК зондом в 50% формамиде в HSB буфере (7%SDS; 5xSSC; ЮхДенхардт; 50мМ NaP, рН7.0; 0,1% саркозил; 50мкг/мл тРНК).

2.2.10. Иммуноокрашивание и гибридизация in situ на политениых хромосомах.(А) Гибридизация in situ. Препараты слюнных желез приготавливались из личинок третьего возраста, выращенных при 17°С. Приготовление, фиксация, денатурация и гибридизация выполнялись по методике, предложенной в (Fauvarque and Dura, 1993). Мечение выполнялось методом статистической затравки, используя [3Н]дАТФ. (Б). Иммуноокрашивание политенных хромосом. Приготовление препаратов слюнных желез и окрашивание антителами выполнялось по методике, описанной в (Platero et al., 1996). Поликлональные антитела к Ph, Psc Pc были любезно предоставлены доктором Р.Паро, в качестве вторичных антител использовались СуЗ-коньгированные антитела, полученные из кролика (фирма Sigma).

2.2.11. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для получения амплифицированных последовательностей ДНК интересующих нас аллелей использовался метод ПЦР (Saiki et al, 1985; Mullis and Faîoona, 1987). Были использованы следующие праймеры для локуса ph: TCGCGTGCACAGGTGCTT (phi), GTATGTAACGTGGAACGCAAGA (ph2), AGTTGAGTGCGTGCGTTA (ph3), GGGCGTGCCACAATCGTAT (ph4), AAGTGCCTGCAAGCCAGCG (ph5). Для получения кДНК-ПЦР продуктов локуса ph использовалось 0.5 мкг мРНК. Синтез первой копиии кДНК выполнялся по методике, описанной в (Kawasaki, 1990), используя праймер ph3 из локуса ph. Дальнейшая амплификация выполнялась с использованием phi и ph3 праймеров. Для локуса yellow: ATGCATTCTATGCACGAGCCTCC (у-1, 2409-2432 п.н), CAGCGAAAGGTGATGTCTGACTC (у-2, 2606-2628 п.н.),

TCTGTGGACCGTGGCGCGGTAAC (y-3, 2898-2877 п.н.),

ACTTCCACTTACCATCACGCCAC (y-4, 3293-3270 п.н.), согласно сиквенсу гена yellow (Geyer et al., 1986), CGCTGAGGAACTCGAGAAAGGCC (c-1) и ACTGCGTGCTTCAAGCTTCTACC (c-2) для внутренней геномной последовательности /;*-аллеля, AAGCTAACAGCGCTGTTGGCTAG (sn-1, 875898 п.н.) и АСАССС TTCACTTCGCCAATTCG (sn-2, 1632-1609 п.н.) для гена singed согласно сиквенсу гена singed, представленного в работе (Paterson and O'Hare, 1991). CTCTCAACAAGCAAACGTGCACTG (p-1, 89-66 п.н), CGTCCGCACA3, 2802-2824 п.н ), ATACGTTAAGTGGATGTCTCTTG (p-4, 28532875 п.н.) для Р-элемента в соответствии с последовательностью /'-элемента (O'Hare and Rubin, 1983). Программа ПЦР-амплификации включала следующие циклы: первый - 94° С 2 мин., 30 циклов по1 мин. при 94°С, 1 мин. при 64-68°С (температура зависит от Тт праймеров) и 2 мин. при 72°С, последний - 4 мин. при72° С. Продукты амплификации анализировались электрофорезом в 1.5% агарозном геле в 1х ТАЕ-буфере. Амплификация проводилась на приборе фирм Techne РНС-3 или Perkin-Elmer2400.

2.2.12. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов. ДНК секвенировали по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977), используя набор Sequenase II (фирмы Amersham) для секвенирования плазмид и ПЦР продуктов Форез проводили в 6% полиакриламидном геле в lxGTGB буфере (10 мМ трис основной, 3 мМ таурин, 0.05 мМ ЭДТА).

2.2.13. Создание конструкции P[w+, AP-yellmv/ и трансформация эмбрионов дрозофилы. Структура и экспрессия гена yellow раннее описаны в (Geyer et al., 1986; Geyer and Corees, 1987).10-т.п.н. фрагмент, включающий ген yellow и его 3-т.п.н. регуляторный район были представлены Р. Geyer.

Регуляторный Sall/BamHIyellow район (3 т.п.н.) был субклонирован в pGEM7 по рестриктазам BamHI и Xhol. Xhol-Scal фрагмент Р-элемента был элюирован из геля и залигирован по тупым концам в pGEM7. Отбор плазмид с двойной вставкой Xhol-Scal фрагмента осуществлялся с помощью ПЦР. Потом двойной Xhol-Scal фрагмент был переклонирован в регуляторный Sail!BamHI yellow район по Крп I сайту (рис.6). Один из полученных клонов был сиквенирован для контроля отсутствия ошибок в гене yellow и затем переклонирован по BamHI и Xbal в плазмиду CaSpeR 3, содержащую 5-т.п.н. кодирующего района гена yellow (рис.6). Эта конструкции была названа как Pfw+, ЛР-yellow], где w+ - это mini-white ген, входящий в состав вектора и ДР-yellow - полный yellow ген с инсерцией центральной части Р-элемента. Контрольная конструкция Pfw+, yellow+] имела не измененную структуру гена yellow. Эта конструкция была получена с помощью прямого клонтрования 10-т.п.н. фрагмента, включающего ген yellow в CaSpeR3 плазмиду. ДНК конструкций P[w+, ЛР-yellow] и P[w+, yellow+]vi Р-элемент с дефектными инвертированными повторами, использованный как источник транспозазы, Р25.7wc (Kares and Rubin, 1984), были инъецированы в линию у ас w67c на стадии пребластодермального эмбриона, как описано в (Rubin and

Sprandling, 1982). Выжившие мухи были скрещены с линией у ас w67c, трансгенные мухи были отобраны на основе цвета глаз. Для определение места встраивания конструкций трансформанты скрещивались с линией у ас w1118 , несущей доминантные маркеры на второй хромосоме In(2RL),CyO и In(3LR)TM3,Sb - на третьей хромосоме. Инсерции Pfw+, ЛР-yellow] and P[w\ yellow+] были огомозигочены, количество копий было определено методом Саузерну-блот-гибридизации, используя в качестве проб фрагменты генов yellow и white.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Генетические исследования модификатора мутаций, индуцированных встраиванием Р-элемента. Ранее в нашей лаборатории была получена серия ^-аллелей локуса yellow, индуцированных Р-элементом. Использованный в дальнейшей работе у^4-аллель имел инсерцию одного Р-элемента в положении -69 п.н. относительно точки начала транскрипции гена yellow (рис.2). Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур личинок и имаго. Его экспрессия в различных тканях контролируется энхансерами, расположенными как перед промотором гена yellow (энхансеры кутикулы тела и крыловых пластинок), так и в его интроне (энхансер щетинок), у2*14- аллель является производным от у*-аллеля. При этом фенотип у^-мутации идентичен исходной у2-мутации (Georgiev et al., 1997), индуцированной инсерцией мобильного элемента МДГ4 в положение -700 п.н. относительно точки начала транскрипции гена yellow. Причиной мутантного фенотипа ^-мутации -желтое тело и крылья, черные щетинки - является наличие в 5'-регуляторной области МДГ4 зи(Н\у)-инсулятора, который блокирует энхансеры гена yellow, отвечающие за экспрессию в кутикуле тела и крыловых пластинках.

Клонирование и секвенирование У^-аллеля (Georgiev et al., 1997) показали, что копия Р-элемента имеет размер 1.2 т.п.н. и включает 829 п.н. с 5'-конца и 347 п.н. с З'-конца (с 2560 по 2907 п.н.) в соответствии с последовательностью полноразмерного Р-элемента (O'Hare and Rubin, 1983). В точке разрыва была обнаружена дополнительная последовательность TAGCTACAAA, которая не имела гомологии с последовательностями Р-элемента. Ориентация Р-элемента была противоположной направлению транскрипции гена yellow.

В результате мобилизации Р-элементов в у1*14-линии была полнена одна производная линия, в которой наблюдалась репрессия гена yellow в грудных и ножных щетинках (табл.2) (см. Материалы и методы, раздел 2.1.2).

X Н Н X ! II I

GH

Н X у*

X НН X 2s

1-L-23-^

H "®2 X J X I H

T f sA3

HK

Эн.-кр Эн.-т

МДГ 4

ДКП su(Hw) ДКП дкп в к

Эн.-щ н yellow умгв X y+sry«8|

1 т.п.н. s7 +s8

У ,у рис.2. Структура локуса yellow в j-аллелях, индуцированных инсерцией Р-элемента.

Направление транскрипции гена yellow показано стрелкой. Энхансеры гена yellow обозначены черными овалами: Эн.-кр, энхансер, отвечающий за экспрессию гена в крыловых пластинках, Эн.-т, в кутикуле тела, Эн.-щ, в щетинках. Стрелки, ограничивающие МДГ4, представляют его длинные концевые повторы (ДКП). 5и(Н\у)-инсулятор, расположенный в 5'-регуляторной области МДГ4, обозначен серым овалом. Р - обозначение 1.2-т.п.н. Р-элемента. Сокращения для использованных рестрикционных ферментов: Н, Hindlll, G, BglH; X, Xhol; К, Kpnl; В, BamHI; S, Sali.

Таблица 2. Эффект мутации phF1 на индуцированные Р-элементом аллели в локусе yellow. j-аллель Уровень пигментации

T Кр г Н К Б

У 10) 1(1) 5(5) 5(5) 5(5) 5(5) y2sl4 ^2s20^2sA3 1(1) 1(1) 5(1) 5(2) 5(4) 5(4) y2s7 yds62^2sll 1(0) 1(0) 5(0) 5(0) 5(0) 5(2) yb.34 1(1) 1(1) 5(5) 5(5) 5(5) 5(5) y2s42 1(1) 1(1) 5(3) 5(3) 5(5) 5(5) y76d28 3(0) 3(3) 2(0) 3(0) 2(0) 4(2) y2s25 у2.ч26 1(0) 1(0) 5(0) 5(0) 5(0) 5(0)

Примечание. Уровень пигментации тела (Т), крыловых пластинок (Кр), грудных (Г), ножных (Н), крыловых (К) и брюшных (Б) щетинок оценивался по 5-бальной шкале у 3-5 дневных самцов, выращенных при температуре 25°С. Цифры в скобках определяют эффект мутации р}?1 в комбинации с соответствующем аллелем. О- соответвествует пигментации ноль-мутанта, 5- пигментации у+-аллеля.

С целью установления причины изменения фенотипа бьш проведен сравнительный Саузерн-блот-анализ ДНК, выделенной из исходной у2**14-линии и ее производной (см. Материалы и методы, раздел 2.2.3). Оказалось, что обе линии имеют аналогичный паттерн рестриктных фрагментов в области гена yellow. Следовательно, изменение мутантного фенотипа производной У'^-линии связано с наличием некоего модификатора. Для доказательства этого предположения было проведено генетическое картирование этого модификатора в геноме (см.Материалы и методы, раздел 2.1.2). С целью локализации хромосомы, на которой расположен модификатор, использовалась jV-линия. Оказалось, что модификатор находится на Х-хромосоме. Для дальнейшей, более точной, локализации модификатора использовалась у2$cDl4>aGct6g-smmvi. С помощью рекомбинационного картирования модификатор был локализован в районе 0.5-0.6 сантиморганид Х-хромосомы.

Модификатор имел доминантный эффект в комбинациях с у-аллелями, индуцированными инсерцией Р-элемента, но не влиял на фенотип аллелей у2, у3*, y'd, у+, которые были индуцированы инсерцией мобильных элементов другого происхождения (Lindsley and Zimm, 1992). Для выяснения возможной роли Р-элемента в индукции мутации в модификаторе были проведены эксперименты по мобилизации Р-элемента (см. Материалы и методы, раздел 2.1.2). В результате было получено несколько ревертантов мутации модификатора. Саузерн-блот-анализ линии, содержащей модификатор, выявил наличие уникальной полосы размером около 10.5 т.п.н., которая гибридизовалась с пробой из Р-элемента. Эта полоса отсутствовала в ревертантах. Полученные результаты позволили заключить, что модификатор у^-аллеля вызван инсерцией Р-элемента.

Наличие инсерции Р-элемента в мутации модификатора позволило клонировать соответствующий ген. Для клонирования гена-модификатора была использована у^/ио*/-линия, в которой при рестрикции по BamHI и гибридизации с зондом из Р-элемента наблюдается присутствие трех полос - 2.6 т.п.н., 10.5. т.п.н. (соответствует гену модификатора), 14 т.п.н. (см. Материалы и методы, раздел 2.2.10). Нами была получена библиотека из ДНК у^дао^-линии, рестрикцированной по ВатН (см. Материалы и методы, раздел 2.2.5.1). Фрагмент Hindlll-Xhol из Р-элемента использовался в качестве меченой пробы для скрининга библиотеки. Фаговый клон, сгибридизовавшийся с Р-элементом был переклонирован в вектор pBluescript+SKII/BamHI, и последовательности, окружающие инсерцию Р-элемента, были просеквенированы (см. Материалы и методы, разделы 2.2.5, 2.2.11, 2.2.12). Поиск на гомологию с использованием программы BLASTN (Altschul et al., 1991) выявил 100% идентичность с 5'-районом гена polyhomeotyc (ph) который относится к группе Рс-белков - известных репрессоров транскрипции. Таким образом, полученный модификатор является результатом инсерции Р-элемента в ген ph, и поэтому модификатор был обозначен как ptf1.

3.2 Молекулярная структура мутации phpl. Известно, что локус ph состоит из двух тандемно расположенных генов: дистального и проксимального (Deatrick et al., 1991). Для изучения структуры мутации ptf1 было выполнено рестрикционное картирование субклонированных фрагментов клонированного фага (см. Материалы и методы, раздел 2.2.5.3). Мутация phPI была вызвана инсерцией дефектной копии 1.2-т.п.н. Р-элемента в нетранслируемую лидерную последовательность проксимального гена ph в положение 109 п.н. согласно карте кДНК клона, полученной Дитриком (Deatrick et al., 1991) (рис.ЗА). Направление транскрипции Р-элемента совпадало с направлением транскрипции гена ph. Кроме того, Р-элемент имел длину 1.2 т.п.н. и по нуклеотидной последовательности оказался идентичным Р-элементу, который индуцировал у2*14 -аллель гена yellow. С помощью Саузерн-блот-анализа было показано отсутствие других изменений в области ph -локуса.

3.3 Транскрипция проксимального ph гена в ph"-лштн. Известно, что инсерция Р-элемента может влиять на уровень транскрипции и на сплайсинг гена-мишени (Engels, 1989). Было сделано предположение, что появление модификатора je/Zcw-фенотипа связано с изменениями в транскрипции проксимального гена ph (далее в тексте - ph).

Для изучения предполагаемых изменений в транскрипции гена ph был выполнен Нозерн-блот-анализ (см. Материалы и методы, разделы 2.2.8, 2.2.9). Субклонированные BamHI-SacI (лидерная последовательность и часть первого интрона, уникальная для проксимального гена (Deatrick et al., 1991, De Camfflis et al., 1992) и SacI-EroRV (первый интрон проксимального гена) фрагменты были использованы в качестве меченых проб (рис.ЗБ, ЗВ). Ранее было описано два мажорных транскрипта размером 6.4 т.п.н. и 6.1 т.п.н., которые гибридизовались с рестрицированными фрагментами ДНК, содержащими последовательность генов ph (Dura et al., 1987). Кроме того, известно, что с проксимального ph-гена считывается два транскрипта размером 6.1 и 6.4 т.н., а с дистального ph-гена - один транскрипт длиной 6.4 т.н. (Hodgson et al., 1997). Нами было показано, что в линии ph+ BamHI-SacI фрагмент гибридизовался с одним мажорным транскриптом - 6.4 т.н. и двумя минорными транскриптами - 6.1 и 9.0 т.н. на всех стадиях развития - от эмбриональной до стадии имаго (рис.ЗБ).

Транскрипт размером в 9.0 т.п.н. ранее не был идентифицирован. Можно было предположить, что этот транскрипт содержит первый большой интрон гена ph. Для изучения природы 9.0-т.п.н. транскрипта фильтр был перегибридизован с фрагментом SacI-EcoRV, который является частью первого интрона (рис.ЗА). Меченая проба гибридизовалась только с 9.0-т.н. транскриптом, следовательно, в этом транскрипте не вырезается первый интрон (рис.ЗА). Роль 9.0-т.п.н. транскрипта неизвестна, возможно, это случай регуляции экспрессии гена на уровне сплайсинга, так как такой транскрипт скорее всего не кодирует функциональный белок.

В линии, несущей мутацию phF1, BamHI-SacI фрагмент гибридизовался с тремя мажорными полосами размером 1.0, 6.4 и 10.1 т.н. (рис.ЗВ) на стадии средней куколки, т.е. тогда же, когда экспрессируется и ген yellow (Geyer et al., 1986). Для выяснения роли инсерции Р-элемента в изменении паттерна транскрипции рй-гена фильтр с мРНК был перегибридизован с зондом HindlH-XhoI из Р-элемента (рис.ЗВ). Зонд гибридизовался с теми же полосами, что и при гибридизации с BamHI-SacI фрагментом. Следовательно, все транскрипты содержат последовательности Р-элемента и 5'-нетранслируемый район гена ph.

Транскрипт размером 1.0 т.н., по-видимому, образуется в результате преждевременной терминации транскрипции внутри Р-элемента, так как он не гибридизовался с фрагментом из 3'-района Р-элемента, который находится за сигналом полиаденилирования в последовательностях Р-элемента (рис.ЗА). Транскрипт 6.4 т.п.н. гибридизовался с Xhol фрагментом (рис.ЗА), включающим в себя последовательности со втрого по пятый экзоны гена, и BamHI-SacI фрагментом. Однако, этот транскрипт не гибридизовался с фрагментом из З'-района Р-элемента и первым интроном гена ph. Для более детального изучения структуры 6.4-т.н. транскрипта, 5'-часть его, включая последовательность Р-элемента, была клонирована с помощью ОТР-ПЦР с использованием праймеров, расположенных в 5'-нетранслируемом районе и во втором экзоне р/г-гена. (см. Материалы и методы, раздел 2.2.11). В результате были получены два отличающихся по размеру ПЦР-продукта, которые были просеквенированы. Один из них содержал 5'-нетранслируемый район гена ph и 5'-конец Р-элемента до первого экзона, сплайсированного со вторым экзоном гена ph без сдвига рамки считывания (рис.ЗГ).

Расчитанная длина этого транскрипта совпадала с размером транскрипта дикого типа (6.4 т.н.). Предполагаемый белок, кодируемый этим транскриптом, имеет начало трансляции с ATG-кодона из Р-элемента и содержит 199 аминокислот с N-конца белка транспозазы Р-элемента и почти весь белок Ph за исключением 12 N-концевых аминокислот. Такой химерный белок был обозначен как P-Ph. Белок P-Ph включает в себя ДНК-связывающий домен транспозазы Р-элемента и часть домена лейциновой молнии, отвечающего за белок-белковые взаимодействия (Andrews and Gloor, 1995). Можно было предположить, что такой химерный белок приобрел способность связываться с последовательностями Р-элемента, расположенными в тот yellow, что приводило к репрессии транскрипции последнего.

Второй ПЦР продукт также содержал 5-концевые последовательности Р-элемента, при этом, первый экзон Р-элемента был соединен со вторым экзоном, а в положении 880 п.н. (соответствующем положению 2580 п.н. полноразмерного Р-элемента (O'Hare and Rubin, 1983)) образовался новый сплайс-сигнал, который соединил последовательности Р-элемента и ph-гена. Таким образом, белок, кодируемый этим транскриптом, содержит ДНК-связывающий домен и два участка, отвественных за белок-белковые взаимодействия транспозазы Р-элемента (Lee et al., 1996), а также весь белок Ph за исключением 12 N-концевых аминокислот. Скорее всего, количество этого транскрипта незначительно, так как соответствующая по размеру полоса, 6.7 т.н., не выявляется при Нозерн-блот-анализе (рис.ЗБ).

Как было показано выше, транскрипт размером 10.1 т.п.н. гибридизовался с пробами из первого интрона гена ph и из З'-района Р-элемента. Следовательно, этот транскрипт содержит почти весь Р-элемент, включая его З'-конец, часть первого экзонаph, первый интрон и все оставшиеся экзоны генаph. Интересно, что 10.1-т.н. транскрипт в линии рУ?1 более интенсивно транскрибируется, чем 9.0-т.н. транскрипт в линии ph+ (рис.ЗБ). Возможное объяснение этого явления заключается в том, что инсерция Р-элемента частично супрессирует сплайсинг первого интрона jp/г-гена. По-видимому, с такого транскрипта транслируется нефункциональный белок.

3.4 Молекулярный анализ ревертантов /^"-мутации. Для изучения роли последовательностей Р-элемента в составе химерного белка P-Ph были получены и проанализированы 36 независимых ревертантов ph+p. Места инсерций Р-элемента в ревертантах были амплифицированы с помощью ПЦР с использованием праймеров, расположенных с двух сторон от инсерции Р-элемента и в дальнейшем просеквенированы. Девятнадцать ревертантов были индуцированы почти полной делецией Р-элемента, находящегося в ph-локусе. Из них было просеквенировано два ревертанта, ph+PH и ph+P2?. Анализ нуклеотидной последовательности этих ревертантов показал, что от Р-элемента остались 16-18 п.н. из инвертированных концевых повторов (табл.3). В четырех ревертантах произошла частичная делеция Р~ элемента. Три из них имели делеции с точками разрыва в 31-п.н. инвертированном повторе (5-разрыв) и З'-разрыв в положении от 209 п.н. до 472 п.н. внутри Р-элемента. У четвертого ревертанта границы делеции были между 130 п.н. и 701 п.н. (табл.3).

Таблица 3. Анализ районов границ делеций в ревертантах/»¿''-мутации. у- 5'- 3'- аллель разрыв разрыв Первичная последовательность места делеции (5'-»3') ph+P12 16 335 (852) CATGATGAAATAACAT/gcttatcgactgctgagctgccatcaa/GAGCATTTTCATCATG ph+P14 17 472 (715) CATGATGAAATAACATA/tgtatataacataac/ATGTAA-TTTCATCATG ph+P18 130 701 (386) CATGATGAAA-CATTAA/CAAGCTA-TTTCATCATG ph+P22 19 209 (978) CATGATGAAATAACATAAG/GCCGGA-TTCATCATG ph+PU 16 2892 (16) CATGATGAAATAACAT/ATGTTATTTCATCATG ph+P27 18 2892 (16) CATGATGAAATAACATAA/ATGTTATTTCATCATG

Примечание. В /?/гру-мугации ориентация Р-элемента совпадает с направлением транскрипции /»/г-гена, поэтому последовательность Р-элемента приведена в прямой ориентации (5'->3'). Нуклеотиды Р-элемента на границе делеции пронумерованы соотвественно сиквенсу полноразмерного Р-элемента. Цифры в колонках 5'-разрыв и 3'-разрыв определяют номер нуклеотида соответственно карте (O'Hare and Rubin, 1983), с которого начинается делеция. Цифры в скобках в колонке 3'-разрыв показывают количество нуклеотидов, которые остались с данного конца Р-элемента. Последовательности ДНК на границе делеции приведены таким образом, что косые линии отделяют те нуклеотиды, которые могут принадлежать обоим концам Р-элемента. Большими буквами обозначены известные последовательности Р-элемента, маленькие буквы определяют те последовательности, которые не имеют прямой гомологии к Р-элементу.

Таким образом, все изученные ревертанты имели делецию в первом экзоне Р-элемента, который кодирует ДНК-связывающий домен транспозазы Р-элемента. Согласно результатам Саузерн-блот-анализа оставшихся ревертантов, в семи из них вместе с делецией Р-элемента были делегированы прилегающие к месту инсерции Р-элемента последовательности проксимального р/г-гена. Кроме того, три ревертанта имели делецию от 1 до 3 т.н. в 5'-регуляторном районе, включая промотор /?/г-гена.

Таким образом, химерный белок P-Ph является функциональным при наличии интактного ДНК-связывающего домена транспозазы Р-элемента и всей кодирующей части белка Ph.

3.5 Имму но локализация белка P-Ph в дистальном районе Х-хромосомы.

Следующей задачей данного исследования было выяснение механизмов действия химерного белка P-Ph. Учитывая, что химерный P-Ph белок, содержит ДНК-связывающий домен транспозазы Р-элемента, можно предположить, что он связывается с последовательностями Р-элемента в гене yellow и репрессирует его транскрипцию. С целью прямого доказательства связывания белка P-Ph с Р-элементом была проведена иммунолокализация антител к белку Ph на политенных хромосомах y*sl4ph+- и -линий (рис.4А, 4Б) (см. Материалы и методы, раздел

2.2.10). В соответствии с литературными данными сайты связывания для белка Ph были локализованы в 1А-, 2D-, 4С-, 5А- и 50-дистальных районах Х-хромосомы (DeCamillis et al., 1992). Присутствие сайтов связывания для белка Ph в 1А районе, месте локализации гена yellow, не позволило идентифицировать образование нового сайта в локусе yellow. Однако, на политенных хромосомах линии были идентифицированы новые сайты связывания белка Ph в 2С-, ЗА- и ЗВ- дистальных районах Х-хромосомы по сравнению с контрольной у2*14-линией (рис.4Б).

Гибридизация in situ с меченой пробой Р-элемента показала, что эти районы также содержат инсерции Р-элемента. Таким образом, последовательности Р-элемента способны связывать белок Ph на политенных хромосомах в линии, несущей ptf1

-мутацию. Следовательно, химерный белок способен связываться с последовательностями Р-элемента. рис.4. Иммунолокалюация Рс-белков в дистальном районе X-хромосомы в линиях у2'14 и уг'14ркР1.

A. Локализация белка РЬ в у^'-линии в 1 А- и 2А-районах.

Б. Локализация дополнительных сайтов связывания для белка Рбс в ^"рЬГ1-линии в 2С-, ЗА- и ЗВ-районах.

B. Локализация дополнительных сайтов связывания для белка РЬ в у2'1^//1-линии в 2С-, ЗА- и ЗВ-районах]

Г. Локализация дополнительных сайтов связывания для белка Рс в у2"1^}/1-линии в 2С-, ЗА- и ЗВ-районах.

Таблица 4. Эффект мутаций в Рс-генах на репрессию транскрипции гена уе11ом> ъуЫ4ркР1- и линиях.

Мутация | Тип мутации Уровень пигментации

РУГ1 /"/яй" г Н Г Н

1 2 1 3

Е(г/ Неоморф 1 2 1-3 4

Щ*)51 Антиморф 1 2 1-3 4

Рс1 1 2 3-4 5

Рс3 я 1-3 3 4-5 5

Зиф Неоморф 1-5 2-5 4-5 5

8и(2)2ш 2-3 4 5 5

8и(г)24 2-4 4-5 3-5 4-5

Неоморф 1 2 3-5 4-5

Ряс1 Неоморф - - 3-5 4

Бсп^4 Ноль ' 1-2 2 2-4 4

Ясгп01 Ноль 1-2 2 2-4 4

8и(г)302 Неоморф 3-4 4-5 5 5

Обозначения те же, что и в табл. 1.

3.6 Сайты связывания химерного белка Р-РЬ на политенных хромосомах совпадают с новыми сайтами связывания для других белков Pc-G-комплекса в местах инсерции Р-элемента. Известно, что белки Pc-G- группы репрессируют транскрипцию в составе мультимерных комплексов (2-5 МД) (Franke et al., 1992; Rastelli et al., 1993; Platero et al., 1996; Strutt and Paro, 1997), состав которых может варьировать в зависимости от гена-мишени. Наиболее хорошо охарактеризован комплекс, который содержит, наряду с белком Ph, белки Psc (Posterior sex combs) и Pe (Polycomb) (Pirrotta, 1997). Для того, чтобы выяснить возможность образования такого репрессивного комплекса в местах инсерции Р-элемента, была проведена иммунолокализация антител к белкам Psc и Рс на политенных хромосомах линий уЬ14 и y2sl4phF1 (см. Материалы и методы, раздел 2.2.10). В этих линиях сайты связывания для белков Psc и Рс совпали с сайтами связывания для белка Ph: 1А, 2D, 4С, 5 А и 5D, что соответствует литературным данным (Zink and Paro, 1989; De Camillis et al., 1992; Rastelli et al., 1993). Однако, на Х-хромосоме линии y2sl4pff1 появляются те же дополнительные сайты связывания, что и для белка Ph - 2С, ЗА и ЗВ, которые совпадают с локализацией Р-элемента (рис.4В, 4Г). Таким образом, в линии, несущей -мутацию, в местах инсерции г-элемента связывается не только белок Ph, но и белки Psc и Рс, что предполагает образование на последовательностях Р-элемента репрессионного Pc-G-комплекса.

Для подтверждения участия этих белков в репрессии транскрипции у-аллелей, индуцированных Р-элементом, были проанализированы комбинации у2*14- и /^7-аллелей на фоне мутаций в генах Psc (Psc1) и Рс (Рс1 и

PcJ). В таких комбинациях наблюдалась почти полная супрессия мутантного фенотипа (табл.4), что подтверждало участие этих белков в репрессионном комплексе.

С целью идентификации других возможных членов репрессионного комплекса были изучены комбинации j-аллелей с другими мутациями в генах Рс-группы. В комбинациях с различными мутациями в гене Su(z) (табл.4) наблюдалась супрессия мутантного фенотипа. Однако, ноль-мутации (Breen and Dunkan, 1986; Wu et al., 1989; Borneman et al., 1996) Sem (Sem*™4 и ScmD') и E(z) (E(z)sl и E(z)') слабо супрессировали мутацию ph¡ !. Следовательно, из изученных белков, кроме Psc и Рс, только Su(z) заметно влияет на уровень репрессии белком P-Ph транскрипции гена yellow в у2"14- и j+íi7-аллелях.

3.7 Влияние />й/7-мутации на различные j-аллели. Следующей задачей исследования было изучение зависимости репрессии белком P-Ph транскрипции у-аллелей, индуцированных инсерцией Р-элемента, от их молекулярной структуры. Большинство j-аллелей, использованных для этой цели, произошли из супернестабильных линий на фоне У-мутации в локусе yellow (Georgiev et al., 1992; 1997). В результате оказалось, что эффект /гй^-мутации на экспрессию гена yellow зависит от структуры у-аллелей.

Из литературных данных известно, что ориентация Р-элемента в локусе-мишени может влиять на уровень ее транскрипции (Engels, 1989). С целью изучения влияния ориентация Р-элемента на уровень транскрипции гена yellow в у-аллелях был проанализирован комбинации У^-аллеля, который имеет инсерцию Р-элемента той же структуры, что и в У^-аллеле, только его ориентация была противоположной и совпадала с направлением транскрипции гена yellow. Мутация pif1 усиливает мутантный фенотип аллелей уЫ4, у2*20 и у2*43 в одинаковой степени: грудные и ножные щетинках становились желтыми (табл.2). Таким образом, ориентация Р-элемента не влияла на эффект мутации ph'1.

С целью изучения эффекта мутации ph1'1 на у-аллели, вызванные инсерцией Р-элемента в разные места гена yellow, была проанализирована комбинация у7Ш8~ аллеля с мутацией ph'1. Данный аллель имеет инсерцию Р-элемента в транскрибируемую, но нетранслируемую 5'-область гена yellow в положение +76 по отношению к старту транскрипции (Geyer et al., 1988). Уровень пигментации кутикулярных структур у взрослых мух в этой линии понижен (табл.2). Мутации phP1 также репрессировала транскрипцию аллеля уШ28^ следовательно, ингибирующее действие мутации не определяется строго позицией Р-элемента относительно промотора генаyellow.

Для того, чтобы изучить влияние мутации pif1 на нормально транскрибируемый ген yellow были проанализированы фенотипы ревертантов y2si4-аллеля на фоне мутации pif1. Аллели y+s? и у 38 имеют один ДКП мобильного элемента МДГ4, оставшийся после его делеции. Так как в /+,-ревертантах отсутствует su(Hw)-HHcymrrop, то ген yellow имеет нормальную эксперссию в теле и крыльях. В этих ревертантах pif1-мутация репрессировала транскрипцию только в щетинках, при этом она была слабее, чем в исходном У^-аллеле (табл.2). Следовательно, мутации pif1 имеет слабый эффект на нормально транскрибируемый тт. yellow.

С целью выяснения зависимости степени репрессии от количества копий Р-элемента были проанализированы фенотипы ранее полученных /-аллелей, имеющие одну (уЫ4), две (у2s?) и три (yds62) копии Р-элемента, на фоне phP1-мутации (рис.2, табл.2). Известно, что инсерции Р-элемента в промоторный район гена yellow не влияют на фенотипическое проявление ^-мутаций (Georgiev et al., 1997). Однако, на фоне /г/г^-мутации в аллелях, содержащих дупликацию или трипликацию Р-элемента, наблюдалась полная репрессия транскрипции гена yellow, тогда как в аллеле с одной копией Р-элемента репрессия была слабой. Следовательно, репрессия транскрипции напрямую зависит от количества Р-элементов, т.е. от количества сайтов связывания для химерного белка в гене-мишени.

Аллель y2slJ, как и аллель у2"7, имел сильный мутантный фенотип в комбинации с мутацией phpi (табл.2). Клонирование и секвенирование места инсерции Р-элемента в у2''"-аллеле выявил наличие неизмененного Р1-элемента (дистальный по отношению к промотору гена yellow) и Р2-элемента (проксимальный по отношению к промотору гена yellow) с делецией 5'-коцевых 82 п.н. Эта делеция включает в себя 5'-концевой сайт связывания для транспозазы и, следовательно, белка P-Ph. Чтобы обнаружить мининальный район Р2-элемента, который необходим для сильного эффекта мутации php\ была проанализирована структура двух у*-аллелей, у2"25 и у2"26, которые в комбинации с pif1 ведут к полной инактивации экспрессии гена yellow (табл.2). Саузерн-блот-анализ показал, что эти линии содержат не полные две копии 1.2.-т.п.н. Р-элемента. Клонирование и секвенирование показали, что оба аллеля содержали неизмененный Р1 элемент. В то время как отР2 элемента в аллеле^25 осталось 39 п.н. с 5'-концевого повтора и 349 п.н. с З'-конца, а в аллеле у2*26 осталось только 153 п.н. с 3-концевого повтора (рис.5). Известно, что эти участки содержат сайты связывания для транспозазы Р-элемента. При введении мутации pff1 наблюдалась полная репрессирия экспрессию гена yellow в этих аллелях. Таким образом, дополнительные сайты связывания для транспозазы и 11-п.н. инвертированный повтор одного Р-элемента в комбинации со вторым Р-элементом были достаточны для резкого усиления эффекта мутации ptf1.

3.8 Картирование последовательностей Р-элемента, которые отвечают за ингибирование транскрипции гена yellow в присутствии />йР7-мутации. Следующей задачей данного исследования было определение последовательностей Р-элемента, которые отвечают за ингибирование транскрипции гена yellow в присутствии phP1-щгс&щт. Из литературных данных известно, что транспозаза Р-элемента связывается с концевыми последовательностями, которые находятся рядом с 31-п.н. инвертированными повторами Р-элемента. Следовательно, можно предположить, что степень репрессии транскрипции гена yellow мутацией phF1 непосредственно зависит от количества данных сайтов в регуляторной области у-аллелей.

С целью определения районов Р-элемента, ответственных за эффект phpi-мутации, были получены и изучены делеционные производные У'^-аллеля. Точки разрывов делеций в Р-элементе были клонированы с помощью ПЦР и затем просеквенированы. В результате генетического скрининга были получены несколько аллелей, в которых произошла частичная делеция внутренних районов Р-элемента. При этом наблюдалась супрессия эффекта /»/¡^-мутации. В одном из полученных аллелей, У'3*, от Р-элемента осталось 767 п.н. с 5'-конца и 93 п.н. с 3- конца. В такой делегированной копии Р-элемента остаются сайты связывания для белка транспозазы, однако, 11-п.н.инвертированный повтор на З'-конце Р-элемента при этом был делегирован (рис.5). Супрессия эффекта рЯ1 в >^^-аллеле может быть объяснена тем, что 5'- и З'-концевых сайтов связывания транспозазы недостаточно для полной репрессии. Известно, что в отличие от транспозазы, кодируемой полноразмерным 2.9-т.п.н. Р-элементом, транспозаза, кодируемая 1.2-т.п.н. Р-элементом, дополнительно связывается с 11-п.н. инвертированным повтором (энхансером транспозиции). Такая усеченная форма транспозазы имеет только ДНК-связывающий домен и домены, ответственные за белковые взаимодействия (Lee et al., 1996). По-видимому, наличие 11-п.н. инвертированного повтора важно для связывания с химерным белком, так как его отсутствие приводит к потере репрессионного эффекта.

В комбинации с другим производным аллелем, у2"42, действие мутации phpl супрессировано не полностью: наблюдается слабое ингибирование транскрипции в грудных и брюшных щетинках (табл.2). Секвенирование делегированной копии Р-элемента в аллеле у2"42 выявил, что Р-элемент содержит только 41 п.н. с З'-конца и 852 п.н. с 5-конца (рис.5). Такая делегированная копия Р-элемента содержит только 5-концевой сайт связывания для транспозазы.

Для объяснения причины неполной супрессии в д^-аллеле по сравнению с у2"34 было предположено, что в центральном районе Р-элемента также содержатся сайты связывания для белка P-Ph. При этом в Р-элементе у^-аллеля этот фрагмент делегирован, а в Р-элементе у2*42- аллеля - нет. Следовательно, этот фрагмент Р-элемента находится между 767 п.н. и 852 п.н. относительно 1.2-т.п.н. Р-элемента.

Данный фрагмент Р-элемента также включает в себя точки разрыва делеции и дополнительную последовательность ТАСгСТАСААА.

Для проверки этой гипотезы была создана конструкция P[w+, АР-yellowJ, содержащая два 179 п.н. Xhol-Scal фрагмента из 1.2-т.п.н. Р-элемента (фрагмент между 730 и 909 п.н. Р-элемента) в положении -340 п.н. по отношению к старту транскрипции гена yellow (рис.6) (см. Материалы и методы, разделы 2.2.13). Было получено семь независимых трансформантов с единичной инсерцией конструкции. Все полученные трансформанты имели уровень экспрессии yellow как у дикого типа. Комбинация /»//^-мутации и конструкции P[w+, AP-yellow] в 5 случаях приводила к мозаичной пигментации щетинок, в то время как пигментация тела и крыльев не была изменена. В качестве контроля использовался транспозон P[w+, yellow*], который содержит неизмененный теп yellow.

1 т.п.н.

G Н Н

Эн.-кр Эн.-т

P[w\ AP-yellow]

В К

Эн.-щ yellow рис.6. Структура конструкции Р/н>+,АР-уеШт]. Серыми прямоугольниками показана дупликация ХИо1-8са1 фрагмента из 1.2-т.п.н. Р-элемента. Все остальные обозначения те же, что и на рис.2.

Были получены 9 трансгенных линий, содержащих единичные инсерции Pfw\ yellow '/-транспозона. В комбинации с plf1 уе//ом>-фенотип этих мух не изменился. Этот результат подтверждает, что центральный район 1.2-т.п.н. Р-элемента участвует в репрессии транскрипции гена yellow в присутствии pff1-мутации. Следовательно, можно предположить, что белок P-Ph может связываться с центральным районом Р-элемента.

3.9 Зависимость эффекта мутации phF1 от гомологичного спаривания.

Из литературных данных известно, что уровень репрессии PRE-содержащих транспозонов увеличивается в линиях, гомозиготных по инсерции такого транспозона (Fauvarque and Dura, 1993; Chan et al., 1994; Kasis, 1994; Pirrotta, 1997; Sigrist and Pirrotta, 1997). С целью изучения зависимости эффекта мутации pif1 от гомологичного спаривания, были проанализированы комбинации мутации pif1 с различными j-аллелями, имеющими инсерции Р-элемента.

В присутствии мутации phpl самки, гомозиготные по у-аллелю с одной копией Р-элемента (y2s14 и y+s?), показали слабый мутантный фенотип (табл.5). В качестве контроля использовались гетерозоготные самки, имеющие комбинацию того же^-аллеля с аллелемУ, не содержащим инсерцию Р-элемента. Таким образом, одна копия Р-элемента в присутствии pif1 мутации имеет слабый кооперативный эффект на транскрипцию генаyellow.

В гетерозиготных самках, содержащих комбинацию j-аллелей с дупликацией Р-элемента (у2*11) и одним Р-элементом (у2"14) в присутствии мутации pif1 имели фенотип близкий к У, то есть наблюдалась полная инактивация транскрипции гена yellow (табл.5).

Таблица 5. Зависимость уровня транс-репрессии мутацией phF1 транскрипции гена yellow.

Комбинация ^-аллелей на фоне мутации pht1 Уровень пигментации

T Kp Г н К Б у2'14//'14 1 1 1 2 4 4

1 1 1 2 5 5 уЫ4уЫ1 0 0 0 0 0 0 y+s7/y+s7 5 5 3 4 5 5

-/у 5 5 5 5 5 5 y+s7/y2sU 3 4 1 2 4 5 ys7/yds62 3 3 0 0 2 4 или//!б2 1 1 5 5 5 5 y+ews(l)/yews(l) 3 5 2 3 5 5 y^OJ/y1 2 5 2 3 5 5 y+ews(l)//s11 или /yds62 2 5 2 3 5 5 y+ews(2)/y+ews(2) 3 5 2 3 5 5 yews(2)/y 2 5 2 3 5 5 y+ews(2)/y*s11 1 3 0 1 4 4 y+ev>s(2)/yds62 0 2 0 0 2 2 y+lVy+b/ 3 3 5 5 5 5 y+ls//s14 1 1 4 4 5 5 y+Is//sI1 1 1 2 2 4 4 y+ls/yds62 0 0 0 0 3 2

Обозначения те же, что и в табл.2. у+<™*(1) и у+ет(2)~ обозначение У ^-аллелей соответственно первого и второго класса.

Комбинация аллелейy*s"/y'i7 на фоне мутацииpif1 вызывала также сильную репрессию транскрипции. Аллель yds62, имеющий три копии Р-элемента в yellow, в комбинации с у+?7-аллелем показал сильную репрессию транскрипции (табл.5). В качестве контроля были использованы комбинации у2/у2*11 и у2/yds62, где ^-аллель не имеет инсерции Р-элемента, на фоне мутации pif1 (табл.5). Мутация phFl не влияла на экспресиию тот yellow в таких комбинациях.

Таким образом, репрессия транскрипции гена yellow зависит от гомологичного спаривания, и уровень этой репрессии прямо коррелирует с количеством копий Р-элемента в/-аллелях.

С целью определения минимальной последовательности Р-элемента, необходимой для транс-ингибирования, были использованы производные из линий у2"'4, y+s? и у2"7. В линии y+s7 после вырезания Р-элемента были получены несколько y+ews-аллелей, которые характеризовались незначительным уменьшением пигментации кутикулы тела и щетинок по сравнению с исходным у+г7-аллелем. По результатам молекулярного анализа /+£Ш-аллелей, все производные можно разделить на два класса (рис.5). К первому классу относятся два y+ews-аллеля, которые произошли в результате делеции Р-элемента. В результате от последовательности Р-элемента осталось по 14-18 п.н. с 5- и З'-концевых инвертированных повторов. Мутация pif1 не влияла на фенотип как гомозиготных мух y+ews-аллеля, так и на его комбинацию с аллелями/2^7 иyds62 (рис.5; табл.5). Таким образом, 18-п.н. концевые инвертированные повторы Р-элемента не достаточны для транс-репрессии гена yellow мутацией pif1.

Четыре уею-аллеля из второго класса имели частичную делецию Р-элемента с точкой разрыва в 5'-инвертированном повторе Р-элемента и 3'-разрыв в положении от 198 до 971 п.н. (рис.5). Мутация phPI также не влияла на уровень пигментации самцов и гомозиготных самок ни одного из этих аллелей. Этот результат показывает, что одна 3'-область Р-элемента не достаточна для репрессии белком Р-Ph. Однако, в комбинациях у+еш-аллелей с у2*"- и У^-аллелями на фоне мутации pi/1 наблюдалась сильная транс-репрессия транскрипции гена yellow. Таким образом, 198 п.н. З'-области Р-элемента, включающей сайты связывания для транспозазы, достаточны для зависимой от спаривания репрессии белком P-Ph.

Производные аллеля у2"14 (рис.5) - yls имели внутренние делеции между 31 п.н. З'-концевого инвертированного повтора и 108-404 п.н с 5-конца Р-элемента. Пигментация кутикулы тела и крыловых пластинок была промежуточной между у1 и у+. Мутация pbP1 не влияла на уровень пигментации У*-самцов и самок. Таким образом, оба конца Р-элемента важны для репрессии белком P-Ph. В комбинация аллелей yls с аллелем у2'" (две копии Р-элемента), и в большей степени, с аллелем yds62 (три копии Р-элемента) наблюдалась сильная репрессия транскрипции (табл.5). Таким образом, 108 п.н. 5'-области Р-элемента достаточны для транс-репрессии транскрипции тона, yellow мутацией pli1.

3.10 Влияние цис-элементов на ингибирующий эффект /^'-мутации в гене yellow. Известно, что на степень репрессии Рс-белками влияют различные цис-регуляторные элементы гена-мишени. С целью изучения репрессии белком P-Ph транскрипции гена yellow от структуры его регуляторной области были проанализированы производные -аллеля. У ^-аллель был ранее получен в нашей лаборатории (Georgiev et al., 1997). Он содержит дупликацию 2.9-т.п.н. геномной последовательности из 1А-района Х-хромосомы, встроенной между двумя 1.2-т.п.н. Р-элементами (рис.7А) в гене yellow. yKv7-MyxH имеют дикий тип пигментации тела и крыльев по сравнению с исходным у2-аллелем. Такой фенотип у' г/-мух был связан с наличием энхансерного элемента в дуплицированной последовательности из 1А-района (Georgiev et al., 1997), который активировал транскрипцию гена yellow в теле и крыльях. Мутация phpl только частично репрессировала транскрипцию гена yellow в >»+*;-аллеле: пигментация тела, крыльев, торакальных и ножных щетинок была понижена (рис.ТБ). По-видимому, присутствие геномной инсерции, содержащей 1А-энхансер, снижает эффект белка P-Ph на транскрипцию гена yellow. Для изучения роли энхансерного элемента в образовании репрессивного комплекса, нами были проанализированы ^"''-производные, полученные после мобилизации Р-элементов в линиях y+slpff' и y+sl. Структура новых j-аллелей была определена с помощью Саузерн-блот-анализа и секвенирования ПЦР-продуктов. Отсутствие изменений в plf1-мутации проверялось с помощью Саузерн-блот-анализа.

Все полученные производные можно разделить на несколько классов по их структуре и взаимодействию с phpl. Для упрощения, на рис. 7А представлен только один j-аллель из каждого класса производных, хотя в каждом случае были проанализированы несколько независимо полученных ^-аллелей с идентичной или сходной структурой. приводит к полному ингибированию экспрессии гена yellow (рис.7). Следовательно, в отсутствии сильного активатора транскрипции - энхансера 1А, на фоне мутации phpl наблюдается полная репрессия ослабленной транскрипции теш yellow.

Другой аллель, y+s27, был получен в результате вырезания Р1-элемента. Секвенирование ПЦР-продукта показало, что от Р-элемента остались только 15-17 п.н. с каждого конца (рис.7А). Мутация prf1 не влияет на фенотип y+s . Следовательно, 1 А-энхансер полностью предотвращает репрессию белком P-Ph, при наличии одного Р-элемента в локусе>>е//аи'.

Аллели y+sAI2 и y+sAH были получены в результате дупликации Р-элемента (Р1 или Р2) и характеризуются нормальным уровнем экспрессии гена yellow (рис.7). Однако, в комбинации с мутацией phP1 оба аллеля имеют одинаково сильный мутантный фенотип. Следовательно, с увеличением количества копий Р-элемента в локусе yellow наблюдается полная его инактивация даже в присутствии сильного энхансерного элемента.

Ранее в нашей лаборатории был получен аллель y+s22 в результате инверсии центрального 2.9-т.п.н. района (Georgiev et al., 1997). Мухи ys22 имели дикий тип пигментации, следовательно, 1 А-энхансер активирует транскрипцию гена yellow независимо от своей ориентации. Однако, мутация phF1 имеет более сильный эффект на У ^-аллель, чем на первоначальный аллель у+^(рис.7Б). Следовательно, ориентация 2.9-т.п.н. района влияет на уровень репрессии белком P-Ph транскрипции гена yellow. Возможно, нахождение 1А-промотора между 1А-энхансером и ^//о^-промотором усиливает ингибирование белком P-Ph действия 1А-энхансера на траскрипцию гена yellow. Другое объяснение этого явления заключается в том, что в 2.9-т.п.н. районе есть некий негативный элемент, действие которого зависит от его ориентации или местонахождения. В результате инверсии этот негативный элемент оказывается в непосредственной близости к промотору гена yellow. Однако, на аллель у2"2, который имеет, кроме Р2-элемента, 410 п.н. последовательности из дистальной части 2.9-т.п.н. инсерции с предполагаемым негативным элементом (рис. 7А), мутация pif1 влияет в той же степени, как и на у2'-аллели с инсерцией только Р2-элемента (рис.7).

Для дальнейшего изучения зависимости репрессии pi/1 от ориентации химерного мобильного элемента, был индуцирован мутагенез в линии y+s22pbfl. В результате был получен аллель y*s32, характеризующийся вариабельной пигментацией щетинок в комбинации с pif1 (рис.7Б). Аллель y+s32 произошел в результате вырезания Р2-элемента, от которого осталось 14 п.н. и 18 п.н. инвертированных концевых повторов. Следовательно, мутация pif1 может ингибировать экспрессию yellow в присутствии только дистального Р-элемента, расположенного на расстоянии 3 т.п.н. от промотора yellow при наличии инверсии 2.9-т.п.н. последовательности.

3.11 Действие химерного белка P-Ph может быть супрессировано Su(y)-мутациями. После мобилизации Р-элементов в линии y+slphpl в потомстве наблюдалось появление с высокой частотой супрессоров мутации phpl (Su(y)-мутации). Эти мутации, обнаруженные на X-, второй и третьей хромосоме, по-разному супрессировали эффект мутации pff1 на транскрипцию гена yellow. Семь ¿"«(^-мутаций были летальными в гомозиготе, девять имели нормальный или пониженный уровень жизнеспособности, две были связаны со стерильностью у самок. Одна ¿"m^í-мутация появилась одновременно с мутацией в локусе ebony (е), рекомбинационный анализ показал, что это было одно и то же событие. Другая мутация Su(y) была получена в локусе singed (sneP1).

Для дальнейшего изучения этого явления нами были выбраны три Su(y)~ мутации: Su(y)P31 (третья хромосома), Su(y)P22 (вторая хромосома) и sneP1 (Х-хромосома). Для оценки уровня супрессии Ли^-мутации были скомбинированы с различными/-аллелями на фоне мутации phP1 (рис. 8А) (см. Материалы и методы, раздел 2.1.2). Все три мутации полностью супрессировали эффект pif1 в аллеле y+sl и уЪ14, более того, мутация Su(y)psl также полностью супрессировала эффект pif1 в y+sAn- и у+л4/2-аллелях, имеющих дупликацию из 1А-района с инсерцией трех Р-элементов (рис.8А). Su(y)P22 и sneP1 имели слабый уровень супрессии в комбинации с данными аллелями. Однако, ни одна Лм^-мутация не имела видимого эффекта на аллели, имеющими две (у2"7) или три (yds62) копии Р-элемента, в комбинации с pif1, при которой экспрессия yellow была полностью блокирована. Наиболее вероятное объяснение механизма действия ¿«(^-мутаций заключается в том, что они индуцированы инсерциями Р-элементов в регуляторный или в транскрибируемый район гена-мишени, что приводит к повышению транскрипции находящегося в Р-элементе гена, кодирующего транспозазу. По-видимому, при повышенной концентрации транспозаза эффективно конкурирует за сайты связывания с белком Р-Ph, супрессируя эффект /?// 7-мутации. Для проверки этой гипотезы, был сделан Нозерн-блот-анализ Su(y)-mmvm, при этом в качестве зонда использовалась последовательность Р-элемента (фрагмент HindIII-Xhol), которая кодирует ДНК-связывающий домен транспозазы (Andrews and Gloor, 1995; Lee et al., 1996). Высокий уровень гибридизации с последовательностью Р-элемента был только в линии 8и(у)Р31 на личиночной, кукольной и взрослой стадиях развития (рис.8Б).

А Эи(у) 8и(у) 8и(у)

•• •••• •• •••• •• ••••

ТКрГНКБ ТКрГНКБ ТКрГНКБ

Б 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 рис.8. Фенотипическое проявление у*ркР1-аллелей на фоне Яи(у) и результаты Нозерн-блот-анализа й'иО^-мутантов.

А. Общее количество кружков показывает. уровень пигментации у*рИР1 -аллелей в присутствии 8и(у). Черные кружки отражают уровень пигментации у-аллелей в отсутствии 5и(у). Все остальные обозначения, как на рис.5 А.

Б. Результаты гибридизации мРНК, выделенной из линий у2"14 (1, 8, 12, 16, 20), у2*14рИР1; 8и(у/3'/ШЗ,8Ь (3, 6,10, 14, 18), у"1^'; $и(у)™/СуО (4, 5, 9, 13, 17) п у2*1^1 зпеР' (2, 7, 11, 15, 19) с ШгиШ1-ХИо1 фрагментом Р-элемента на разных стадиях развития: 1-4 личинка первого возраста, 5-8 личинка второго возраста, 9-12 личинка третьего возраста, 13-16 ранняя куколка, 17-20 поздняя куколка.

Аллель Su(y)P22 имел более низкий уровень транскрипции Р-элемента по сравнению с Su(y)PBI, но достаточно высокий по сравнению с контролем на всех тестируемых стадиях развития (рис.8Б). В аллеле sneP1 высокий уровень транскрипции был только на ранней куколочной стадии развития, когда ген singed активно транскрибируется. Таким образом, эффективность действия -мутации прямо коррелирует с количеством транскрипта Р-элемента

3.12 Молекулярный анализ теР1-яллеля. Для выяснения структуры Р-элемента, который может блокировать действие белка P-Ph, было проведено клонирование места изменения в локусе sn (singed). Мутация at*1 была выбрана для дальнейшего молекулярного анализа, потому что структура локуса singed является наиболее охарактеризованной (Roiha et al., 1988; Paterson and O'Hare, 1991). Саузерн-блот анализ показал наличие ~1.0-т.п.н. инсерции между EcoRI и Sali сайтами (рис.9) в так называемый "hotspot''-район гена singed (Roiha et al., 1988; Hawley et aL, 1988). Район изменения был проклонирован. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что мутация sneP1 вызвана инсерцией 1.2-тп.н. Р-элемента. Основываясь на опубликованную последовательность полноразмерного Р-элемента (O'Hare and Rubin, 1983), была определена его структура. Оказалось, что Р-элемент в sneP1 содержит внутренную делецию с 830 п.н. по 2560 п.н. и дополнительную последовательность TAGCTACAAA в точке разрыва, то есть по структуре он идентичен Р-элементам, ответственным за супернестабильные у-аллели и мутацию pli1. Интересно, что как и в случае высоконестабильных у-мутаций, так и в случае sneP1 инсерция Р-элемента в локус singed сопровождалась делецией 4 п.н. (CGCG) в сайте-мишени, при этом также не наблюдалось дупликации 8 п.н. мутантный фенотип в комбинации y2sl4phpi (рис.9). Кроме того, были изучены две wP wP13 wPI4 +Р1 л мутации sn : sn и sn , полученные из sn , в результате дупликации двух Р-элементов в ориентации голова-к-голове, как в случае хорошо известной мутации snw (Roiha et al., 1988). Мутация snw слабо супрессирует /?йр;-мутантный фенотип, возможно, вследствие низкой транскрипции Р-элемента (рис.9). Интересно, что раннее описанные мутации snw и sn (Engels, 1989), в которых Р-элемент находится в том же районе, что и в мутации srf1, не влияют на plf1-эффект. Аллель srf содержит две копии Р-элемента размером 1.15 т.п.н. и 0.95 т.п.н. в одном и том же месте в инвертированной ориентации. Вырезание 0.95 т.п.н. Р-элемента приводит к мутации sne, в то время как вырезание 1.15 т.п.н. Р-элемент - sn (Engels 1989). Мутации srf и sn не влияют на /»^-эффект, только srf имеет слабое супрессирующее действие (рис.9). Р-элементы в аллелях sn и sneP! находились в одной и той же ориентации и в одном и том же районе с разницей в 13 п.н. (рис.9). Единственное отличие между Р-элементами заключалось в делеции второго важного района для белок-белковых взаимодействий в аллеле srí, который увеличивает аффинность транспозазы к ДНК. (Lee et al., 1996). Следовательно, высокоаффинное связывание с ДНК важно для реализации 8и(у)-эффекта.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Химерный белок P-Ph, обладающий ДНК-связывающей активностью транснозазы, может создавать на последовательностях Р-элемента комплексы, состоящие из белков Рс-группы. Полученные в данной работе результаты показали, что белок P-Ph, включающий ДНК-связывающий домен транспозазы Р-элемента, и почти весь Ph белок, действует как репрессор транскрипции, вызывая репрессию гена yellow, в регуляторной области которого находится инсерция Р-элемента.

Известно, что белок Ph содержит глутаминовые повторы, предположительно один цинковый палец и SPM-домен на С-конце (DeCamillis et al., 1992). Однако, сам белок не имеет специфичной ДНК-связывающей активности in vitro (Franke et al., 1992; Rastelli et al., 1993). В тоже время, химерный белок P-Ph имеет способность специфично связываться с ДНК независимо от других членов Рс-группы. 1.2-т.п.н. Р-элемент, индуцировавший мутацию /?//', имеет внутренную делецию между 829 и 2560 п.н. и напоминает ранее описанный ^Р-элемент, имеющий делецию между 800 и 2560 п.н. (Black et al., 1987). ÄTP-элемент кодирует усеченную транспозазу, которая включает в себя интактный ДНК-связывающий домен и два домена, ответственных за белок-белковые взаимодействия, необходимые для эффективного связывания усеченной транспозазы не только с сайтами связывания транспозазы, но и с 11-п.н. инвертированным повтором и 31-п.н. концевыми инвертированными повторами Р-элемента (Lee et al., 1996).

Мажорный 6.4-т.н. мРНК продукт генаph" кодирует химерный P-Ph белок, состоящий из 119 N-концевых аминокислот транспозазы Р-элемента, которые включают в себя ДНК-связывающий домен и часть только одного из двух доменов, необходимых для димеризации транспозазы и высокоаффинного связывания с ДНК (Andrews and Gloor, 1995). Возможно, что эти белок-белковые домены заменяются SPM-доменом белка Ph, участвующим в его димеризации.

Минорная мРНК, идентифицированная с помощью ПЦР, также кодирует химерный белок, состоящий из ДНК-связывающий домен транспозазы Р-элемента и двух белок-белковых доменов. Следовательно, белок P-Ph может высокоаффинно связываться с последовательностями Р-элемента, используя только один из белок-белковых доменов.

Известно, что белки Рс-группы, к которым относится белок Ph, могут формировать мультимерные белковые комплексы, репрессирующие транскрипцию генов-мишеней (Locke et al., 1988). Так, было показано, что белки Pc и Ph связываются с одними сайтами на политенных хромосомах и иммунокопреципируются (Franke et al., 1992). Сайты связывания для белков Psc и Su(z) на политенных хромосомах существенно перекрываются с сайтами для Pc и Ph (Martin and Adler, 1993; Rastelli et al., 1993). Механизм сборки Pc-G-комплекса в Drosophila был показан в экспериментах с химерным белком Pc, имеющим Gal4 ДНК-связывающий домен (Muller, 1995) и с химерным белком НР1-Рс, который связывается с сайтами как в гетеро-, так и в эухроматине (Platero et al., 1996). Эксперименты по иммунопреципитации, используя кросслинкирование хроматина in vivo, показали, что белки Psc, Рс и Ph ассоцированы с одинаковыми регуляторными элементами селекторного гена engrailed в культуре клеток (Stmtt and Paro, 1997). Недавно было показано, что белок Ph непосредствено взаимодействует с белками Рс и Psc (Cyba and Brock, 1998). Полученный нами химерный белок P-Ph, связываясь с последовательностями Р-элемента, способен рекрутировать, по меньшей мере, два других члена Рс-группы - Psc и Рс, чьи сайты связывания совпадали с инсерциями Р-элемента в экспериментах по иммунолокализации этих белков на политенных хромосомах. По-видимому, механизм действия комплекса, собирающегося на Р-элементе, идентичен действию Pc-G-комплекса.

4.2 Анализ роли последовательностей Р-элемента в рйи-репрессии транскрипции гена yellow. Как было показано, химерный белок P-Ph может связываться с последовательностями Р-элемента и индуцировать репрессию транскрипции теш yellow. Следовательно, на фоне ¿»// '-мутации последовательности Р-элемента функционируют как известные Pc-G Responsible Elements (PREs), которые ответственны за репрессию транскрипции гомеозисных генов (Pirrotta, 1997). Впервые они были обнаружены благодаря своему репрессионному эффекту на репортерный ген, а также явлению мозаичности и чувствительной к эффекту спариванию экспрессии гена white в трансгенных мухах (Fauvarque and Dura, 1993; Simon et al., 1993; Kassis, 1994; Chan et al., 1994). Фрагмент ДНК, обладающий PRE активностью, обычно имеет размер от нескольких сотен до нескольких тысяч п.н. Они имеют сложную структуру и могут быть разделены на множественные субфрагменты, каждый из которых имеют слабую репрессирующую активность. PREs обладают сильным кооперативным репрессионным эффектом. На пример, в гене Ubx, в котором на определенных этапах развития происходит полная репрессия транскрипции, несколько слабых сайтов связывания для Рс-белков участвуют в установлении сильного репрессионного комплекса (Poux et al., 1996; Müller and Bienz, 1991). Из полученых генетических данных следует, что мутация php> слабо репрессирует /-аллели, имеющие одну копию Р-элемента в 5-нетранскрибируемой области гена yellow. Следовательно, одна копия Р-элемента не достаточна для образования сильного репрессионного комплекса. При увеличении количества копий Р-элемента наблюдается полная инактивация экспрессии гена yellow. Таким образом, степень репрессии прямо коррелировала с количеством копий Р-элемента, а следовательно, с количеством участков связывания для белка P-Ph в локусе yellow, что говорит в пользу кооперативного механизма образования репрессионного комплекса на последовательностях Р-элементов.

В данной работе было показано, что концевые последовательности Р-элемента, включающие сайты связывания для транспозазы, необходимы для репрессии мутацией pif1 транскрипции теш yellow. Комбинация одного 1.2-т.п.н. Р-элемента с 153-п.н. З'-концевой последовательностью Р-элемента резко усиливает pif1-репрессию, приводя к полной инактивации экспрессии гена yellow. Как предполагалось, делеция сайтов связывания транспозазы или 11-п.н. инвертированного повтора уменьшают эффект мутации pif1. Последние данные согласуются с литературными данными о наличии внутри Р-элемента дополнительных сайтов связывания для усеченной транспозазы, в частности, 11-п.н. инвертированного повтора. В данной работе было выявлено, что внутренний район

1.2-т.п.н. Р-элемента также важен для /?/гр/-репрессии, что предполагает наличие потенциальных сайтов связывания для химерного белка P-Ph в этом районе.

4.3 Эффект мутации phF1 зависит от гомологичного спаривания. Известно, что уровень репрессии в PRE-содержащих транспозонах увеличивается в линиях, гомозиготных по инсерции такого транспозона. По-видимому, это связано с тем, что гомологично спареные PRE-сайты образуют более стабильный и сильный репрессионный Pc-G-комплекс (Fauvarque and Dura, 1993; Chan et a!., 1994; Kasis, 1994; Pirrotta, 1997; Sigrist and Pirrotta, 1997). В генетических экспериментах было показано транс-взаимодействие между ^-аллелями, имеющими различные уровни репрессии мутацией /Л™. Для транс-репрессии гена yellow необходимо наличие в гомологичных хромосомах последовательностей Р-элемента, содержащих сайты связывания для транспозазы. Эти области Р-элемента играют роль слабого PRE-сайта, который репрессирует транскрипцию в присутствии другого PRE-сайта в гомологе.

4.4 Действие мутации phpt зависит от цис-регуляторных элементов.

Генетический анализ различных комбинаций ^-аллелей с phpl -мутациеи выявил, что степень репрессии P-Ph зависят от цис-расположенных элементов. Появление перед геном yellow сильного энхансера в дупликации 1А-района разрушает репрессионный эффект т?/^7-мутации даже при наличии двух копий Р-элемента. По-видимому, в присутствии сильного активатора транскрипции phF1-мутация не может эффективно репрессировать транскрипцию. Следует отметить, что этот факт согласуется с ранее полученными данными (Pirrotta, 1997), показывающими, что сборка репрессионного комплекса зависит как от силы PRE-сайтов, так и от транскрипционной активности конкретного района (Cavalli and Paro, 1998). Так, процессы образования Pc-G-комплекса и связывания GAL4, активатора транскрипции, одновременно взаимно исключают друг друга, и репрессия может быть предотвращена сильной активацией транскрипции (Zink and Paro, 1995; Cavalli and Paro, 1998).

В аллеле y's32 Р-элемент находится на расстоянии 3 т.п.н. от промотора гена yellow и отделен от него энхансером 1А. Однако, и в этом случае мутация ptf1 репрессирует транскрипцию yellow. В этом отношении последовательности Р-элемента обладают еще одним свойством PRE-сайтов - распространением репрессии в прилегающие районы (Orlando and Paro, 1993; Pirrotta, 1997).

4.5 Активная транскрипция 1.2-т.п.н. копии Р-элемента супрессирует ингибиторный эффект химерного P-Ph белка на экспрессию у-аллелей, имеющих инсерцию Р-элемента. Ингибирование транскрипции j-алеллей, содержащих Р-элемент, в комбинации с /гй^'мутацией может быть частично или полностью супрессированно мутациями Su(y), индуцированными инсерциями Р-элемента в регуляторный или кодирующий район различных генов. Было показано, что эффективность действия Л'и^-мутаций зависит от силы репрессионного комплекса. Так, 5м(3^-мутации не супрессируют эффект мутации phF1 на ^-аллели, содержащие две копии Р-элемента. Однако, они влияют на уровень репрессии в y+sl аллеле, содержащем, кроме двух копий Р-элемента, 1А-энхансер. По-видимому, образование сильного репрессионного комплекса в отсутствии 1А-энхансера предотвращает связывание транспозазы с сайтами связывания на Р-элементе.

Одна из Л'г/^-мутаций была детально изучена на молекулярном уровне. Было показано, что мутация sneP1 вызвана инсерцией 1.2-т.п.н. Р-элемента в 586 транскрибируемый, но нетранслируемый район гена, что привело к усилению транскрипции Р-элемента. По-видимому, при повышенной концентрации транспозаза эффективно конкурирует за сайты связывания с белком P-Ph и, следовательно, супрессирует эффект phPJ-мутации.

Как упоминалось выше, 1.2-т.п.н. Р-элемент напоминает по структуре ранее описаный ÄP-элемент (Black et aL, 1987), который кодирует усеченную форму транспозазы. Такая транспозаза имеет ДНК-связывающий домен, расположенный на N-конце транспозазы (Rio, 1990; Andrews and door, 1995). Она также содержит два белок-белковых домена, которые участвуют в гомодимеризации, что необходимо для ее высокоаффинного связывания с ДНК (Lee et al., 1996). Первый белок-белковый домен - предполагаемый мотив лейциновой молнии находится между 101 и 122 а. к. усеченной транспозазы (Rio, 1990; Andrews and Gloor, 1995). Второй белок-белковый домен находится на С-конце усеченной транспозазы, т.е. в интактной части Р-элемента (Lee et al., 1996). Все выше перечисленные домены присутствуют в белке, кодируемом 1.2-т.п.н. Р-элементом. Усеченная транспозаза связывается с множественными сайтами на концах Р-элемента с более высокой аффинностью, чем полноразмерная транспозаза (Lee et al., 1996). К сайтам связывания усеченной транспозазы относятся высокоаффинные сайты связывания транспозазы, 11-п.н. энхансер транспозиции и 31-п.н. концевые инвертированные повторы. Оба белок-белковых домена важны для связывания с ДНК. В 5ие-мутации 1.15-т.п.н. Р-элемент (Roiha et al., 1988; Engels, 1989) встроен в одинаковой ориентации, как и Р-элемент в snePI с разницей в 13 п.н. Белковый продукт 1.15-т.п.н. Р-элемента содержит ДНК-связывающий домен и мотив - лейциновую молнию, а не второй белок-белковый домен (Roiha et al., 1988; Lee et al., 1996), необходимый для высокоаффинного связывания с ДНК. Это объясняет причину отсутствия супрессии в мутации srf. Следовательно, дефектная транспозаза с ДНК-связывающим доменом и двумя белок-белковыми доменами является наиболее эффективной для реализации супрессирующего эффекта. Таким образом, супрессия мутации phpi является результатом конкуренции за участки связывания на Р-элементе между усеченной формой транспозазы и белком P-Ph. выводы

1. Впервые показано, что инсерция Р-элемента в транскрибируемую, но нетранслируемую область гена polyhomeotic (р/г^-мутация) может привести к образованию химерного белка, содержащего ДНК-связывающий домен транспозазы Р-элемента и все функциональные домены белка Ph. Такой химерный белок может вызывать репрессию транскрипции в у-аллелях, индуцированных инсерциями Р-элемента.

2. Продемонстрировано, что химерный белок P-Ph, связываясь с последовательностями Р-элемента, способен рекрутировать по меньшей мере два других белка, Psc и Рс, которые относятся к Рс-группе.

3. Выявлено, что степень репрессии гена-мишени мутацией phF1 напрямую зависит от количества концевых последовательностей Р-элемента, с которыми связывается транспозаза и, следовательно, химерный белок P-Ph.

4. Показано, что центральный район Р-элемента, для которого ранее не было выявлено связывания с белком транспозазы, усиливает репрессию индуцированную pff1-мутацией, что предполагает связывания с этим районом химерного белка P-Ph.

5. Продемонстрировано, что репрессия, индуцированная -мутацией, может быть супрессирована сильным энхансером.

6. Показано, что транспозаза Р-элемента может конкурировать за сайты связывания с белком P-Ph и, в результате этого, супрессировать образования комплекса, ингибирующего транскрипцию rem yellow.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Георгиев П.Г., Елагин В. А., Буфф Е.М., Колягин Н.П. Свойства супернестабильных мутаций в локусе yellow у Drosophila melcmogaster. Генетика. 1992. Т.28. С.98-104.

2. Клонирование ДНК. Методы, под ред. Гловера Д Москва. Изд. Мир. 1998.

3. Alkema М., Bronk М., Verhoeven Е., Otten A., van't Veer L., Berns A., van Lohuizen M. Identification of Bmil-interacting proteins of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1997. V. 11. P.226-240.

4. Altschul S., Gish W., Myers E., Lipman D. Basic local aligment search tool. J Moll Biol. 1991. V.215. P.403-410.

5. Andrews J.D. and Gloor G.B. A role for the KP leucine zipper in regulating P element transposition. Genetics. 1995. V.141. P.587-594.

6. Ashburner M. Drosophila. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N Y. 1989k.

7. Bienz M. and Muller J. Transcriptional silensing of homeotic genes in Drosophila. Bioessays. 1995. V.17. P. 775-784.

8. Black D M., Jackson M S., Kidwell M.G. and Dover G.A. KP elements repress P-induced hybrid dysgenesis in D. melanogaster. EMBO J. 1987. V.6. P.4125-4135.

9. Borneman D., Miller E., Simon J. The Drosophila Polycomb group gene Sex comb on midleg (Scm) encodes a zinc finger protein with similarity to polyhomeotic protein. Development. 1996. V.122. P. 1621-1630

10. Breen T. and Dungan I. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complexes of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 1986. V.18. P.442-456.

11. Brown J., Mucci D., Whiteley M., Dirksen M., Kassis J. The Drosophila polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with gomology to the transcription factor YY. Moll Cell. 1998. V.l. P. 1057-1064.

12. Brunk B P., Martin E.G., Adler P.N. Molecular genetics of the Posterior sex combs/Suppressor 2 of zeste region of Drosophila. aberrant expression of the Suppressor 2 of zeste gene results in abnormal bristle development. Genetics. 1991. V. 128. P. 119-132.

13. Bunker C.A., Kingston R.E. Transcriptional repression by Drosophila and mammalian Polycomb group proteins in transfected mammalian cells. Mol. Cell Biol. 1994. V.14. P. 1721-1732.

14. Burke T.W., and J. T. Kadonaga, Drosophila TF1ID binds to a conserved down steam basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev. 1996. V.10. P.711-724.

15. Busturia A., Bienz M. Silencers in abdominal-B, a homeotic Drosophila gene. EMBO J. 1993. V. 12. P. 1415-1425.

16. Cavalli G. and Paro R. Chromo-domain proteins: linking chromatin structure to epigenetic regulation. Curr Opin Cell Biol. 1998. V.10. P. 354-360.

17. Cavalli G. and Paro R. The Drosophila Fab-7 chromosomal element conveys epigenetic inheretance during mitosis and meiosis. Cell. 1998. V.93. P.505-518.

18. Chan C.S., Rastelli L., Pirrotta V. A Polycomb response element in the Ubx gene that determins an epigenetically inherited state of repression. EMBO J. 1994. V. 13. P. 2553-2564.

19. Chang M., Jaehning J.A. A multiplicity of mediators: alternative forms of transcription complexes communicate with transcriptional regulators. Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4861-4865.

20. Chiang A., Connor M., Paro R., Simon J., Bender W. Discrete Polycomb-binding sites in each parasegmental domain of the bithorax complex. Dev. Suppl. 1995. V.21. P. 1681-1689.

21. Core N., Bel S.,Gaunt, Aurrandlions M.,Pearce J., Fischer A., Djabali M. Altered cellular prolifarion and mesoderm pattering in Policomb M33 deficient mice. Development. 1997. V. 24. P.721-729.

22. Deatrick J., Daly N., Randsholt N., Brock H. The complex genetic locus polyhomeotic in Drosophila melanogaster potentially encodes two homolougs zinkfinger proteins. Gene. 1991. V.105. P. 185-195.

23. DeCamillis M., Cheng N.S., Pierre D., Brock H.W. The polyhomeotic gene of Drosophila encodes a chromatin protein that shares polytene chromosome-binding sites with Polycomb. Genes Dev. 1992. V.6. P.223-232.

24. Deng X., Matsui M., Wei N., Wagner D. et al. COP1, an Arabidopsis regulatory gene, encodes a protein with both a zink-binding motif and a G{5 homolooous domain. Cell. 1992. V.711. P.791-801.

25. Dura J.-M., H. W. Brock and P. Santamaria. A polyhomeotic. a gene of Drosophila melanogaster required for correct expression of segment identity. Mol. Gen. Genet. 1985. V.198. P.213-220.

26. Dura J., Randsholt N., Deatrick J., Erk I. et al. A coplex genetic locus, polyhomeotic, is required for segmental specification and epidermal development in D. Melanogaster. Cell. 1987. V.5. P.829-839.

27. Dura J.M., Ingham P. Tissue- and stage-specific control of homeotic and segmentation gene expression in Drosophila embryos by the polyhomeotic gene. Development. 1988. V. 103. P. 733-741.

28. Dychlacht B., Weinzierl R., Boguski M. The dTAFn80 subunit of Drosophila TFnD contains P-transducin repeats. Nature. 1993. V.363. P.176-1179.

29. Engels W.R. P elements in Drosophila: in Mobile DNA, edited by D. Berg and M. Howe. American Society of Microbiology. Washington. D.C. 1989. P.437-484.

30. Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., Karch F. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor. Nature. 1994. V.371. P.806-808.

31. Fauvarque M O., Dura J.-M. Polymeotic regulatory sequences induse developmental regulator-dependent variegation and targeted P-element insertions in Drosophila. Genes. Dev. 1993. V.7. P.1508-1520.

32. Franke A., DeCamillis M., Zink D, Cheng N., Brock H.W., Paro R. Polycomb and polyhomeotic are constituents of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster. EMBO J. 1992. V.ll. P.2941-2950.

33. Franke A., Messmer S., Paro R. Mapping functional domains of the polycomb protein of Drosophila melanogaster. Chromosome Res. 1995. V.3 P.351-360.

34. Frei E., Baumgartner S., Edstrom J., Noll M. Cloning of the extra sex combs gene of Drosophila and its identification by P-element-mediated gene transfer. EMBO J. 1985a. Y.4. P. 979-987.

35. Frei E., Bopp D., Baumgartner S., Edstrom J., Noll M. Isolation and structural analysis of the Cloning of the extra sex combs gene of extra sex combs gene of Drosophila. Cold Spring Habor Symp.Quant.Biol. 1985b. V.50. P.127-134.

36. Fritsch CBrown J., Kassis J., Muller J. The DNA-binding polycomb group protein pleihomeotic mediates silensing of a Drosophila homeotic gene. Development. 1999. V. 126(17). P.3906-3913.

37. Gaunt S. and Singh P. Homeogene expression patterns and chromosomal impriting. Trends Genet. 1990. V.6. P. 208-212.

38. Georgiev P., M. Kozycina. Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gy/wj-induced mutations. Genetics. 1996 V. 142.P.425-436.

39. Georgiev P.G., Tikhomirova T., Yelagin V.,Belenkaya T., Gracheva E., Parshikov A., Evgen ev M B., Samarina O P. and Corces V.G. Insertions of hybryd P-elements in the yellow gene of Drosophila cause a large variety of mutant phenotypes. Genetics. 1997. V.146. P.595-594.

40. Geyer P. K., C. Spana and V. G. Corces. On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J. 1986. V.5. P.2657-2662.

41. Geyer P. K., V. G. Corces. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes and Dev. 1987.V.1. P.996-1004.

42. Geyer PK, Green MM, Corces VG. Reversion of a gypsy-induced mutation at the yellow (y) locus of Drosophila melanogaster is associated with the insertion of a newly defined transposable element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V.85. P.3938-3942.

43. Gindhart J.G., Kaufman T.C. Identification of Polycomb and trithorax group responsive elements in the regulatory region of the Drosophila homeotic gene Sex combs reduced. Genetics. 1995. V.39. P. 797-814.

44. Goodrich J., Puangsomlee P., Martin M., Long D., Meyerowitz E., Coupland G. A Polycomb-group gene regulates homeotic gene expression in Arabidopsis. Nature. 1997. V.386. P.44-51.

45. Grossniklaus U., Vielle-Calzada J., Hoeppner M., Galliano. Maternal control of embriogenesis by MEDEA, Polycomb group gene in Arabidopsis. Science. 1998. V.280. P.446-450.

46. Gutjahr T., Frei E., Spicer C., Baumgartner S., White R., Noll M. The polycomb-group protein, extra sex combs, encodes a nuclear member of the WD-40 repeat family. EMBO J. 1995. V.14. N.17. P. 4296-4306.

47. Hartley D., Preiss A., Artavanis-Tsakonas S. A deduced gene product from Drosophila neurogenic locus, Enhanser of split, shows homology to mammalian G-protein (3 subunit. Cell. 1988. V.55. P.785-795.

48. Hawley R. S., R. A. Steuber, G. H. Marcus, R. Sohn, D. M. Baronas, et al., Molecular analysis of an unstable P element insertion at the singed locus of Drosophila melanogaster: evidence for intracistronic transposition of a P element. Genetics. 1988. V.119 P.85-94.

49. Hodgson J., Cheng N., Sinclair D., Kyba M., Randsholt N., Brock H. The polyhomeotic locus of Drosophila melanogaster is transcriptionally and post-transcriptionally regulated during embriogenesis. Mech. Dev. 1997. V.66. P.69-81.

50. Holdeman R., Nehrt S., Strome S. MES-2, maternalprotein essential for viability of the germline in Caenorhabditis elegans, is homolog to Drosophila a Polycomb group protein. Development. 1998. V.125. P.2457-2467.

51. Jones R.S., Gelbart W.M. The Drosophila Polycomb-group gene Enhancer of zeste contains a region with sequence similarity to trithorax. Mol. Cell Biol. 1993. V.13. P.6357-6366.

52. Jones C., Peterson A., Morgan K., Simon J., Jones R. The Drosophila esc and E(z) proteins are direct paretners in polycomb group-medieted repression. Moll Cell Biol. 1998. V.18. P.2825-2834.

53. Jurgens G, A group of genes controlling the spatial expression of the bithorax complex in Drosophila. Nature. 1985. V.316. P.153-155.

54. Kanno M., Hasegava M., Ishida A., Isono K., Taniguchi M. Mel-18, a Polycomb group-related mammalian gene, encodes a transcriptional negativ regulator with tumor supressiv activiy. EMBO J. 1995. V.14. P.5672-5678.

55. Kares R.E. and Rubin G.M. Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell. 1984. V.38. P. 135-146.

56. Kasis J. A. Unusial properties of regulatory DNA from the Drosophila engrailad gene: three "pairing-sensitive" sites within a 1.6 kb region. Genetics. 1994. V.136. P.1025-1038.

57. Kawasaki E. PCR protocols: A guide to methods and aplication; by Academic press, 1990.

58. Kehle J., Beuchle D., Treuheit S., Christen B., Kennison J., Bienz M., Muller J. dMi-2, hunchback-interacting protein that functions in polycomb repression. Science. 1998. V.282. P. 1897-1900.

59. Komachi K., Redd M., Schultz J., Carlson M., Johnson A. The WD repeats of Tupl interact with homeo domain protein a2. Genes Dev. 1994. V.8. P.2857-2867.

60. Korf I., Fan Y., Strome S. The Polycomb group in Caenorhabditis elegans and meternal control of germline development. Development. 1998. V.125. P.2469-2478.

61. Kyba M. and Brock H. The Drosophila polycomb group protein Psc contacts ph and Pc through specific conserved domains. Moll Cell Biol. 1998. V. 18. P.27112-2720.

62. Laherty C., Yang W., Sun J., Davie J., Seto E., Eisenman R. Histone deacetilases associated with the mSin3 corepressor mediated mad transcriptional repression. Cell. 1997. V.89. P.349-356.

63. LaJeuness D., Shearn A. E(z): a polycomb group gene or a trithorax group gene? Development. 1996. V.22. P.2189-2197.

64. Lee C.C., Mul Y.M. and Rio D C. The Drosophila P-element KP repressor protein dimerizes and interacts with multiple sites on P-element DNA Mol. Cell. Biol. 1996. V.16. P.5616-5622.

65. Lewis E. A gene complex controlling segmentation in Drosophila. Nature. 1978. V.276. P.565-570.

66. Lindsley D. LG. G. Zimm. The Genome of Drosophila melanogaster. Academic Press. New York. 1992

67. Locke J., Kotarski M.A., Tartof K.D. Dosage-dependent modifiers of position effect variegation in Drosophila and a mass action model that explains their effect. Genetics. 1988. V.120. P.181-198.

68. Lonie A., D'Andrea R., Paro R, Saint R. Molecular characterisation of the polycomblike gene of Drosophila melanogaster, a trans-acting negative regulator of homeotic gene expression. Development. 1994. V.1120. P.2629-2636.

69. Martin C., Adler P.N. The Polycomb group gene Posterior Sex Combs encodes a chromosomal protein. Development. 1993. V.117. P.641-655.

70. McCall K., and Bender W. Probes of chromatin accessibility in the Drosophila bithorax complex respond differently to Polycomb-mediated repression. EMBO J. 1996. V.15. P.569-580.

71. Messmer S., Franke A., Paro R. Analysis of the functional role of the Polycomb chromo domain in Drosophila melanogaster. Genes. Dev. 1992. V.6. P. 1241-1254.

72. Mihaly J., Hogga I., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. In situ dissection of the Fab-7 region of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Polycomb-response element. Development. 1997. V.124. P. 1809-1820.

73. Mhaly J., Mishra R., Karch F. A conserved sequence motif in Polycomb-response elelent. Moll Cell. 1998. V.l. P. 1065-1066.

74. Muller J., and M. Bienz. Long range repression conferring boundaries of Ultrabithorax expression in the Drosophila embryo. EMBO J. 1991. V.10. P.3147-3155.

75. Muller J., Gaunt S., Lawrence P. Function of the Polycomb protein is conserved in mice and flies. Development. 1995. V.121. P.2847-2852.

76. Muller J. Transcriptional silensing by the Polycomb protein in Drosophila embrios. EMBO J. 1995. V.14. P. 1209-1220.

77. Mullis K. B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987. V.155. P.335-350.

78. O'Brien T., Wilkins R.C., Giardina C , Lis J.T. Distribution of GAGA protein on Drosophila genes in vivo. Genes Dev. 1995. V.9. P.1098-1110.

79. O'Hare and Rubin G.M. Structure of P transposable elements and their sites of insertion and excision in the Drosophila melanogaster genome. Cell. 1983. V.34. P.25-35.

80. Orlando V., Paro R. Mapping Polycomb-repressed domains in the bithorax complex using in vivo formaldehyde cross-linked chromatin. Cell. 1993. V.75. P. 1187-1198.

81. Pal-Bhadra M., Bhadra U., Birchler J.A. Cosuppression in Drosophila: gene silencing of Alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is Polycomb dependent. Cell. 1997. V.90. P.479-490.

82. Parkhust S., Corces V.G. Interactions among the gypsy element and the yellow and suppressor of Hairy-wing loci in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 1986. V.6. P.47-53.

83. Paro R. and Harte P. The role of Polycomb group and tritorax group chromatin complexes in the maintenance of determined cells rates. In V.E.ARusso, RAMartienssen and AD.Riggs (ed.). 1996. P.507-528.

84. Paro R., Hogness D.S. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.263-267.

85. Paterson K. and O'Hare. Structure and transcription of the singed locus of Drosophila melanogaster. Genetics. 1991. V.129. P.1073-1084.

86. Peterson A.J., Kyba ML, Bornemann D., Morgan K., Brock H.W., Simon J. A domain shared by the Polycomb group proteins Scm and ph mediates heterotypic and homotypic interactions. Mol. Cel. Biol. 1997. V.17. P.6683-6692.

87. Pirrotta V. PcG complexes and chromatin silencing. Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V.7. P.249-258.

88. Pirrotta and Rastelli V., Rastelli L. White gene expression, repressive chromatin domains and homeotic gene regulation in Drosophila. Bioessays. 1994. V.16. P.549-556.

89. Platero J.S., Hartnett T., Eissenberg J.C. Functional analysis of the chromo domain of HP1. EMBO J. 1995. V. 15. №. 14(16). P.3977-3986.

90. Platero J., Sharp E.J., Adler P.N., Eissenberg J.C., In vivo assey for protein-protein interactions using Drosophila chromosomes. Chromosoma. 1996. V.104. P.393-404.

91. Poux S., Kostic C., Pirrotta V. Hunchback-independent silencing of late Ubx enhancers by a Polycomb Group Response Element. EMBO J. 1996. V.15. P.4713

92. Rastelli L., Chan C.S., Pirrotta V. Related chromosome binding sites for zeste, suppressors of zeste and Polycomb group proteins in Drosophila and their dependence on Enhancer of zeste function. EMBO J. 1993. V.12. P.1513-1522.

93. Reijnen K., Hamer K., den Blaauwe J., Lambrechts C., Schneveld J., van Driel R., Otten A. Polycomb and bmi-1 homologs are expressed in overlapping patterns in Xenopus embryos and are able to interact with each other. Mech.Dev. 1995. V. 51(1). P.35-36.

94. Rio D.C. Molecular mechanisms regulating Drosophila P element transposition Annu. Rev. Genet. 1990. V.24. P.543-578.

95. Robertson H.M., Preston R.W., Phillis D M., Johnson-Schlits D., Benz W.K. and Engels W.R. A stable genomic sourse of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 1988. V.118. P.461-470.

96. Roiha H , Rubin G.M. and O'Hare. P element insertions and rearrangements at the singed locus of Drosophila melanogaster. Genetics. 1988. V.119. P.75-83.

97. Rubin G.M and Sprandling A.C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 1982. V.218. P.348-353

98. Saiki R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn et al., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985. V.230. P. 1350-1354.

99. Sambrook J., E. F. Fritsch and T. Maniatis. Molecular cloning: a Laboratory Manual. Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N.Y. 1989

100. Sanger F., S. Nicklen and A. R. Coulson. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977 .V.74. P.5463-5467.

101. SchlossherrJ., Eggert H., Paro R., Cremer S., Jack R. Gene inactivation in Drosophila mediated by the Polycomb gene product or by position-effect variiegation does not involve major changes in the accessibility of the chromatin fibre. Moll Gen Genet. 1994. V.243. P.453-462.

102. Schumacher A. and Magnuson T. Murine Polycomb- and tritorax-group genes regulate homeotic pathways and beyond. Trends Genet. 1997. V.13. P. 167-170.

103. Sewalt R, van der Vlag J., Gunster M., Hamer K., den Blaauwen J., Satijn D , Hendrix T., van Driel R., Otten A. Characterization of interaction between the mammalian polycomb-group proteins Enx/EZH2 and EED suggests the existence of different mammalian polycomb-group protein complexes. Moll Cell Biol. 1998. V.18. P.3586-3595.

104. Shao Z., Raible F., Mollaaghababa R, Guyon J., Wu C., Bender W , Kingston R. Stabilization of chromatin structure by the PCR1, a Polycomb complex. Cell. 1999. V.98. P.37-46.

105. Sigrist C.JPirrotta V. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics. 1997. V.147. P.209-221.

106. Simon J., Chang A., Bender W. Ten different Polycomb group genes are required for spatial control of the AbdA and AbdB homeotic products. Development. 1992. V.14. P.493-505.

107. Simon J., Chiang A., Bender W., Shimell M.J., O'Connor M. Elements of the Drosophila bithorax complex that mediate repression by Polycomb group products. Dev. Biol .1993. V.158. P.131-144.

108. Spradling A.C., Mahowald A.P. Identification and genetic localization of mRNA from ovarian follicle cells of Drosophila melanogaster. Cell. 1979. V.16. P.589-598.

109. Sprandling A. and G. M. Rubin. Transposition of cloned P elements into germline chromosomes. Science. 1982. V.218. P.341-347.

110. Strouboulis J., Damjanovski S., Vermaak DMeric F. Transcriptional repression by Xpcl, a new Polycomb gomolog in Xenopus laevis, is independent of histon deacetylase. Mollecular and cellular biology. 1999. V.19. N.6. P.3958-3968

111. Struhl G. and Brower D. Early role of the esc+ gene product in the determination of segments in Drosophila. Cell. 1982. V.3. P.285-292.

112. Struhl G. A gene product required for correct initiation of segmental determination in Drosophila. Nature. 1981. V.293. P.36-41.

113. Struhl G. and Akam M. Altered distribution of the Ultrabithorax transcripts in extra sex combs mutant embryos of Drosophila. EMBO J. 1985. V.4. P.3259-3264.

114. Strutt H., Paro R. The polycomb group protein complex of Drosophila melanogaster has different compositions at different target genes. Mol Cell Biol. 1997. V.17. P.6773-6783.

115. Tillib S., Petruk S., Sedkov Y., Kuzin A., Pujioka M., Goto T., Mazo A. Trithorax-and Polycomb group resposible elements within an Ultrabitorax transcriptional maitenance unit consist of closely situatetd but separable sequences. Moll Cell Biol. 1999. V.19(7). P.5189-5202.

116. van Lohuizen M., Frasch M., Wientjens E., Berns A. Sequence similarity between the mammalian bmi-1 proto-oncogene and the Drosophila regulatory genes Psc and Su(z)2. Nature. 1991. V.353. P.353-355.

117. van Lohuizen M., Tijms M., Voncken J., Schumacher A., Magnuson T., Wientjens E. Interaction of mouse polycomb group protein Enxl and Enx2 with Eed: indication for separete Pc-G coplexes. Mol Cell Biol. 1998. V.18. P.3572-3579.

118. van Lohuizen M. The trithorax-group and polycomb-group chromatin modifiers:implications for disease. Curr Opin Genet Dev. 1999. V.9. P.355-361.

119. Vazquez J., et al. Genetic and molecular analysis of chromatin structure. Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 1993. V.58. P.45-54.

120. Wade P., Jones P., Vermaak D., Wollfe A. A multiple subunit Mi-2 histon deacetylase from Xenopus laevis cofractionates with an associeted Sn£2 superfamily ATPase. CurrBiol. 1998. V.8. P.843-846.

121. Wall G., Yarga-Weisz P.D., Sandaltzopoulos R, Becker P.B. Chromatin remodeling by GAGA factor and heat shock factor at the hypersensitive Drosophila hsp26 promoter in vitro. EMBO J. 1995. V.14. P.1727-1736.

122. Wu C-T, Goldberg M.L. The Drosophila zeste gene and transvection. Trends Genet. 1989. V.5. P. 189-194.

123. Yamaguchi K., Hidema S., Mizuno S. Chicken chromobox protein: cDNA of CHCB-1, -2,-3 and their relation to W-heterochromatin. Exp.Cell.Res. 1998. V.242(l). P.303-314.

124. Yamamoto Y., Girard F., Bello B., Affolter M., Gehring W. The cramped gene of Drosophila is a member of the Polycomb-group, and interaction with mus2Q9, the gene encoding proliferating cell nuclear antigen. Development. 1997. V.124. P.3385-3394.

125. Zhang C.-C. and Bienz M. Segmental determinatin in Drosophila conferred by hunchback (fib) a repressor of the homeotic gene Ultrabithorax (Ubx). Proc Natl Acad Sci. 1992. V.89. P.7511-7515.

126. Zink B. and Paro R. In vivo binding pattern of a trans-regulator of homeotic genes in Drosophila melanogaster. Nature. 1989. V.337. P.468-471.

127. Zink B., Engstrom Y., Gehring W., Paro R. Direct interaction of the Polycomb protein with Antennapedia regulatory sequences in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster. EMBO J. 1991. V.10. P.53-162.