Получение и культурно-морфологическая характеристика кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Фридман, Михаил Львович

• Фридман, Михаил Львович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фридман, Михаил Львович

Список условных сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Культуры клеток кожи млекопитающих и история их получения.

2.2. Гистологическое строение и эмбриогенез кожи млекопитающих.

2.3. Методы получения и культивирования кератиноцитов млекопитающих

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы исследований.

3.1.1. Питательные среды и растворы.

3.1.2. Постоянные линии и диплоидные штаммы клеток.

3.1.3. Штаммы вирусов.

3.2. Методы исследований.

3.2.1. Получение первичной культуры клеток кожи.

3.2.2. Подсчет концентрации клеток в суспензии.

3.2.3. Определение доли жизнеспособных клеток и подсчет индекса пролиферации.

3.2.4. Цитологические методы исследования.

3.2.5. Кариологическое исследование.

3.2.6. Электронно-микроскопическое исследование.

3.2.7. Вирусологические исследования.

3.2.8. Криоконсервирование и создание банка культур клеток.

3.3. Результаты исследований.

3.3.1. Разработка оптимальных условий ферментативного разделения эпидермального и дермального слоев кожи плодов кролика, кошки, собаки.

3.3.2. Разработка оптимальных условий ферментативной дезагрегации ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.3. Разработка оптимальных условий культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.4. Определение эффективности ростовых свойств питательных сред для культивирования первичных культур ЭСКП кролика, кошки, собаки

3.3.5. Субкультивирование клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.6. Сравнительное изучение культурально-морфологических свойств полученных культур с постоянной линией RSK и диплоидным штаммом КЭК.

3.3.7. Изучение динамики митотической активности в процессе длительного культивирования клеток ЭСКП кролика.

3.3.8. Сравнительный кариологический анализ культуры клеток ЭСКП кролика и постоянной линии RSK.

3.3.9. Ультраструктурная характеристика состава клеточной культуры ЭСКП кролика.

3.3.10. Изучение влияния глубокого замораживания на жизнеспособность клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки.

3.3.11. Изучение чувствительности культуры клеток ЭСКП кролика к вирусам.

4. Обсуждение результатов исследований.

5. Выводы.

Практические предложения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и культурно-морфологическая характеристика кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки»

Кожа образует внешний покров организма и является одним из наиболее крупных органов. Физиологическую значимость кожи трудно переоценить. Пограничное расположение кожи обусловливает ее непосредственное взаимодействие с внешней средой и ее повреждающими факторами. Поврежденная кожа не способна выполнять возложенные на нее функции, а обширные и долго не заживающие повреждения могут привести к летальному исходу.

Таким образом, кожа представляет собой важный объект для фундаментальных и прикладных исследований в биотехнологии, ветеринарии и гуманитарной медицине.

Первыми практический интерес к культурам клеток кожи проявили врачи-комбустиологи, т.к. одной из главных проблем лечения больных с обширной ожоговой травмой (30-40% поверхности тела) является закрытие раневых поверхностей. Однако закрыть все ожоговые раны при помощи одних лишь аутодермотрансплантатов часто бывает невозможно из-за дефицита донорских ресурсов.

Принципиальная возможность использования для заживления ран аутоклеток кожи, выращенных in vitro, была показана ещё в сороковых годах XX века в работах профессора зоологии Лондонского университета Р.В. Medawar (1948). Тогда же были предприняты первые попытки получения кератиноцитов.

В то же время группа ученых (Robbins F.C., Enders J.F., Weller Т.Н., 1949) в процессе изучения вируса полиомиелита показали возможность использования различных клеточных культур и, в частности, культур клеток кожи в качестве моделей для изучения и накопления вирусов.

Первичные и органные культуры клеток кожи нашли широкое применение в исследованиях дермотропных вирусов, а также в производстве вакцин против них (Рысмендева К.К., 1992; Животная клетка в культуре, 2000; Wurster D.H., Benirschke К., 1970).

Развитие методической базы для получения и культивирования кератиноцитов произошло благодаря изучению биологии дерматофитов и патогенеза дерматофитозов, т.к. жизнедеятельность этих грибов тесно связана с кератином эпидермиса (Ни F., Livingood C.S. et al., 1954; Alteras I., Gavrilescu M., 1965).

Культуры кератиноцитов хорошо зарекомендовали себя не только как основной компонент для создания трансплантационного материала, но также как чувствительная модель для вирусологических исследований, ценный инструмент в биотехнологическом производстве и фармакологии (Prunieras М., 1984; Livingood C.S., Ни F., 1954), доступный источник стволовых клеток (Papini S., Cecchetti D., Campani D. et al., 2003, Radu E., Simionescu O., Regalia Т., 2003; Спичкина О.Г., Калмыкова H.B., Кухарева JI.B. и др., 2006) и генетического материала (De Luca М., Pellegrini G., 1997).

К 1975 г. были достигнуты определенные успехи в культивировании трипсинизированных кератиноцитов (Rheinwald J.G., Green Н., 1975). Преимуществом данного метода является предварительное разделение кожи по базальной пластинке на дерму и эпидермальный слой с последующей дезагрегацией отделенного эпидермиса.

Использование фидерных слоев клеток и питательных сред с физиологически высоким содержанием кальция позволило решить техническую задачу получения эпидермальных пластов с целью их трансплантации.

Но разработанные еще в 1975 году методики выделения и последующего субкультивирования кератиноцитов сопряжены с рядом трудностей, а именно использование специфических, дорогостоящих реактивов, применение сложных и длительных приемов культивирования, ряд которых накладывает ограничения на возможности дальнейшего применения полученных культур.

У большинства известных перевиваемых линий клеток эпидермального слоя кожи при длительном пассировании снижается чувствительность к вирусам, ухудшается пролиферативный потенциал, меняются культурально-морфологические свойства. Всегда может возникнуть потребность оперативного получения новых перевиваемых линий кератиноцитов от различных видов животных.

Поэтому, представляется актуальной в научном и практическом отношениях разработка легко воспроизводимых, оперативных и унифицированных для различных видов животных методик получения культур кератиноцитов с их детальной культурально-морфологической, кариологической и ультраструктурной характеристикой.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в получении культур кератиноцитов кожи плодов кролика, собаки, кошки, изучение их культурально-морфологических свойств и чувствительности к вирусам.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: получить первичные культуры клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки; получить субкультуры клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки с преобладанием в составе монослоя клеток эпителиоподобной морфологии; провести сравнительное изучение культурально-морфологических свойств полученных культур со стабильной клеточной линией RSK и диплоидным штаммом КЭК; провести сравнительный кариологический анализ полученных культур со стабильной клеточной линией RSK; провести ультраструктурное исследование полученных культур клеток; изучить чувствительность полученных культур к различным вирусам; отработать метод глубокого замораживания (-196°С) полученных культур; депонировать полученные культуры клеток в криобанк ВИЭВ; на основе проведенных исследований разработать методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки.

Научная новизна. Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки с использованием различных диспергирующих агентов.

Получен диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККГЖр. Изучены их культурально-морфологические и кариологические свойства. Представлена ультраструктурная характеристика полученных клеточных культур.

Показано, что субкультуры клеток ЭСКП кролика на 20 и 38 пассажах, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика на 45 пассаже, а также ЭККПКр обладают высокой чувствительностью к вирусу ВД-БС и слабой чувствительностью к вирусу ИРТ.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы методы получения первичных культур и субкультур клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получены и заложены в криобанк ВИЭВ субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки. Получен и заложен в криобанк ВИЭВ диплоидный штамм кератиноцитов кожи плода кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр и показана возможность их использования в вирусологических исследованиях.

Разработаны и опубликованы методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки.

Апробация. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (Москва, ВИЭВ, 2006 г.);

3-ем Всемирном конгрессе регенеративной медицины (Лейпциг, 2007

Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2008 г.).

Секции «Ветеринарной биотехнологии» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2008

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, 1 работа находится в печати.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 135 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 63 рисунками. Список литературы включает 105 публикаций, в том числе 67 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Фридман, Михаил Львович

120 5. Выводы

1. Отработаны методы выделения и культивирования клеток ЭСКП кролика, кошки и собаки. Установлено, что наиболее эффективным способом разделения эпидермального и дермального слоев кожи является применение 0,4% раствора диспазы, а также применение смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1. Для ферментативной дезагрегации клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки рекомендуется применение смеси из 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7:1. Клетки ЭСКП кролика, кошки, собаки активно пролиферируют в средах Игла ДМЕМ и Игла MEM с двойным набором аминокислот и удовлетворительно пролиферируют на средах Игла MEM, 199, а также смеси сред 199 и 0,5% ГЛА в соотношении 9:1. Питательные среды следует дополнять 5-7% фетальной сыворотки КРС.

2. Получены первичные культуры и субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки, изучены их культурально-морфологические свойства. Впервые получены диплоидный штамм ЭСКП кролика и постоянная линия клеток (ЭККПКр) и дана их культурально-морфологическая характеристика.

3. Дана ультраструктурная характеристика субкультур клеток и диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр. Субкультура, диплоидный штамм клеток ЭСКП кролика и ЭККПКр представлены различными типами клеток, которые по ультраструктурной организации могут быть идентифицированы как кератиноциты, меланоциты и клетки Лангерганса на различных стадиях дифференциации.

4. Для полученных культур оптимизированы условия глубокого замораживания и последующего восстановления. Для глубокого замораживания субкультур клеток ЭСКП кролика, собаки, кошки, а также для глубокого замораживания диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр применима криозащитная среда, состоящая на 50% из питательной среды Игла MEM, на 40% - из фетальной сыворотки КРС и на 10% - из ДМСО. Жизнеспособность восстановленных клеток ЭСКП кролика не зависела от пассажа и составляла 75-80%. Жизнеспособность клеток ЭСКП собаки и кошки на 4 пассаже была несколько ниже и составляла 65% и 5055% соответственно. Все полученные культуры депонированы в криобанке ВИЭВ.

5. Установлена высокая чувствительность клеток субкультуры, диплоидного штамма ЭСКП кролика и ЭККПКр к вирусу ВД-БС (титр вируса достигает 6,0-6,5 1§ТЦД50/мл) и слабая чувствительность к вирусу ИРТ. Цитоморфологические изменения, вызываемые вирусом ВД-БС в культурах клеток ЭСКП кролика и ЭККПКр сходны с изменениями, развивающимися в культурах клеток КСТ и ПЭК.

6. Показана возможность применения ЭККПКр в качестве демонстративной модели для постановки реакции нейтрализации на ВД-БС.

Практические предложения

1. Отработанные методы получения культур клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки рекомендуются для научных учреждений и диагностических лабораторий.

2. Субкультуры клеток ЭСКП кролика, кошки, собаки могут быть использованы в научных исследованиях.

3. Диплоидный штамм ЭСКП кролика и постоянная клеточная линия ЭККПКр, высокочувствительные к вирусам ВД-БС, рекомендуются для вирусологических исследований и в качестве демонстративной модели для постановки реакции нейтрализации на ВД-БС.

4. «Методические рекомендации по получению и культивированию кератиноцитов кожи плодов кролика, кошки, собаки», РАСХН, М., 2008-12 с.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фридман, Михаил Львович, 2009 год

1. Анджапаридзе, О.Г. Получение и характеристика культур диплоидных клеток из тканей животных / Анджапаридзе О.Г., Осидзе Д.Ф., Витина С.А. // Вопросы вирусологии. 1973. - №1. - С.102-108.

2. Быков, B.JI. Частная гистология человека (краткий обзорный курс) / B.JI. Быков. — 2-е изд. перераб и доп. — СПб.: Сотис, 1999. 301 с.

3. Васильев, А.В. Роль фидерных клеток в прикреплении и росте кератиноцитов человека и крысы / Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В. // Цитология. 1991. - №33 (12). - С. 84-89.

4. Гаврилюк, Б.К. Культура клеток и реконструкция ткани (На прим. кожи) / Б.К. Гаврилюк, Ю.А. Рочев, Т.И. Николаева // АН СССР, Науч. центр биол. исслед., Ин-т биол. физики Пущино : ОНТИ НЦБИ АН СССР. -1988.- 121 с.

5. Гистология, цитология и эмбриология: Учеб. лит. для студ. мед. вузов. / Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина, Е.Ф. Котовский и др.; Под ред. Ю.И. Афанасьев, Н.А. Юрина. 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002 - 744 с.

6. Гистология: Учеб. для вузов / Н.В. Бойчук, P.P. Исламов, C.JL Кузнецов, Э.Г. Улумбеков, Ю.А. Челышев. М.: «Гэотар-Мед», 2001. - 672 с.

7. Горелик, Ю.В. Влияние компонентов внеклеточного матрикса на распластывание кератиноцитов крысы на субстрате при культивировании в низкокальциевой среде / Горелик Ю.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. // Цитология. 1994.-№36 (12).-С. 1209-1212.

8. Гуков, Ф.Д. Практикум по цитологии гистологии и эмбриологии сельскохозяйственных животных / Ф.Д. Гуков, В.И. Соколов, Е.В. Гусева. -Владимир.: ООО «Фолиант», 2002. 178 с.

9. Данишевский, Д.А. Цитопатогенное действие вирусов инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и парагриппа-3 в культуре клеток :

10. Дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / Д.А. Данишевский ; ВИЭВ. — Москва, 1981.-147 с.

11. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / под ред. проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова // М.: Компания Спутник+, 2000. 400 с.

12. Жидков, С.А. Вирусная диарея болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота : Дис. . докт. вет. наук: 16.00.03 / С.А. Жидков; ВИЭВ. -Москва, 1994.-352 с.

13. Колокольцова, Т.Д. Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения : Дис. . докт. биол. наук: 03.00.23 / Т.Д. Колокольцова; ГИСК. Москва, 2007. - 272с.

14. Кузнецов, С.Л. Атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии / С.Л. Кузнецов, Н.Н. Мушкамбаров, В.Л. Горячкина. М.: Медицинское информационное агентство, 2002. - 374 с.

15. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний / под. ред. проф. Э. Леннета, Н. Шмидт, перев. с англ. проф. С.Г. Дроздова // М.: Медицина, 1974. 776 с.

16. Миронова, Л.Л. Выделение штамма перевиваемых клеток из тканей эмбриона человека. / Л.Л. Миронова, Н.Е. Гольдфрин, О.Ф. Сарычева // Кн.: Полиомиелит и другие энтеровирусные инфекции. М. - 1963. - С. 231-232.

17. Миронова, Л.Л. Новые линии диплоидных клеток человека / Миронова Л.Л., Стобецкий И.В., Крючкова Г.П., Кудинова С.И., Кармышева В .Я., Малыгина И.Г., Попова В.Д., Ральф Н.М., Алпатова Г.А. // Вопросы вирусологии. 1987. - №5.

18. Полянская Г.Г. Влияние иммобилизованного фибронектина на кариотипическую изменчивость в клеточной сублинии фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Горячая Т.С., Пинаев Г.П. // Цитология. 2005. - Том 47, №10. - С. 925-932.

19. Полянская, Г.Г. Влияние внеклеточного белка теплового шока на хромосомную изменчивость в клеточной культуре фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Кинев А.В., Сакута Г.А., Асеева Е.В. // Цитология. 1997. - Том 39, №11.- С. 1070-1082.

20. Полянская, Г.Г. Влияние криоконсервации на цитогенетические характеристики клеточной сублинии фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Семенова Е.Г., Шубин Н.А. // Цитология. -1990. Том 32, №3. - С. 256-265.

21. Полянская, Г.Г. Влияние ламинина на кариотипическую изменчивость в клеточной линии фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Горячая Т.С., Пинаев Г.П. // Цитология. 2002. - Том 44, №5. - С. 491-498.

22. Полянская, Г.Г. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую структуру клеточной линии индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. // Цитология. 1992. - Том 34, №3. - С. 82-88.

23. Полянская, Г.Г. Влияние условий культивирования на кариотипическую структуру двух клеточных сублиний фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г. // Цитология. 1989. - Том 31, №7. - С. 807817.

24. Полянская, Г.Г. Закономерности кариотипической изменчивости в клеточных культурах при длительном культивировании в разных условиях (Обзор) / Полянская Г.Г. // Успехи совр. биол. 2000. - Том 120, №6.-С. 529-539.

25. Полянская, Г.Г. Исследование генотоксического влияния ципрофлоксацина на культивируемые клетки почки кенгуровой крысы и фибробласты кожи индийского мунтжака /. Полянская Г.Г., Сизова JI.C. // Цитология. 1996. - Том 38, №9. - С. 958-973.

26. Полянская, Г.Г. Кариотипическая характеристика клеточных сублиний почки кенгуровой крысы и фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г. // Цитология. 1988. - Том 30, №6. - С. 732-738.

27. Полянская, Г.Г. Кариотипическая характеристика линии фибробластов кожи индийского мунтжака при культивировании с разными сыворотками / Полянская Г.Г., Сизова JI.C., Николаенко Н.С. // Цитология. 1993. - Том 35, №2. - С. 86-96.

28. Полянская, Г.Г. Особенности количественной изменчивости кариотипа в клеточных сублиниях фибробластов кожи индийского мунтжака / Полянская Г.Г., Самокиш В.А. // Цитология. 1999. - Том 41, №9. - С. 747-751.

29. Рысмендеева, К.К. Сравнительное изучение чувствительности культур клеток кожи плода овцы и плода крольчихи к вирусу контагиозной эктимы овец и коз : Дис. канд. биол. наук: 03.00.06 / К.К. Рысмендеева ; ВИЭВ. Москва, 1992. -172 с.'

30. Сандомирский, Б.П. Жизнеспособность кожи при криоконсервировании / Б.П. Сандомирский, Н.А. Волкова // Киев.: Наукова думка, 1985. 88 с.

31. Терских, В.В., Эпидермальные кератиноциты человека и животных: Проблемы культивирования и трансплантации / В.В. Терских, А.В. Васильев // М.: Наука, 1995. 104 с.

32. Токин, Б.П. Общая эмбриология: Учеб. для биол. спец. ун-тов. / Б.П. Токин. 4-е изд. перераб и доп. - М.: Высш. шк., 1987. - 480 с.

33. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию: Учеб. для вузов / Ю.С. Ченцов. 4-е изд. перераб и доп. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2004. - 495 с.

34. Юшканцева, С.И. Гистология, цитология и эмбриология. Краткий атлас: Учеб. пособие / С.И. Юшканцева, В.Л. Быков. СПб.: ЗАО «П-2», 2006. -96 с.

35. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер // М.: Библионика, 2007. 524 с.

36. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина // М.: ВНИТИБП, 1998. 928 с.

37. Adams, J.C. Changes in keratinocyte adhesion during terminal differentiation: reduction in fibronectin binding precedes alpha 5 beta 1 integrin loss from the cell surface / Adams J.C., Watt F.M. // Cell. 1990. - Vol. 63, №2. - P. 425435.

38. Alteras I., Gavrilescu M. Considerations on the parabiosis of dermatophytes in tissue culture, preliminary research // Mycopathol Mycol Appl., 1965 Mar 25; №25.-P. 61-72.

39. Bertolero F. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes / Bertolero F., Kaighn M.E., Camalier R.F., Saffiotti U. // In Vitro Cell Dev Biol. 1986. - Vol. 22, №7. - P. 423428.

40. Boyce S.T. Cultivation, frozen storage, and clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in serum-free media / Boyce S.T., Ham R.G. // J. Tissue Cult. Meth. 1985. - Vol. 9, №2. - P. 83-93.

41. Briggaman R.A. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryo human epidermal cells / Briggaman R.A., Abele D.C., Harris S.R., Wheeler C.E. // J Invest Dermatol. 1967. - Vol. 48. - P. 159-168.

42. Carpenter G. Vanadate, epidermal growth factor and the stimulation of DNA synthesis / Carpenter G. // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1981. -Vol. 102, №4.-P. 1115-1121.

43. Chen J.D. Human keratinocytes make uniguely liner phagokinetic tracks / Chen J.D., Helmod M., Kim J.P. // Dermatology. 1994. - Vol. 188. - P. 612.

44. Coria M.F. Cell cultures of bovine embryonic skin: growth and characterization / Coria M.F. // Am. J. Vet. Res. 1969. - Mar; Vol. 30, №3. -P. 369-375.

45. De Luca M. The importance of epidermal stem cells in keratinocyte-mediated gene therapy / De Luca M., Pellegrini G. // Gene Ther. 1997. - Vol.4, №5. -P. 381-383.

46. Freshney R.I. Culture of Animal Cells. A manual of basic technique / R.I. Freshney // N-Y.: Alan R. Liss, Inc., 1987. P. 117

47. Furukawa F. Characterization and practical benefits of keratinocytes cultured in strontium-containing serum-free medium / Furukawa F., Huff J.C, Lyons M.B., Weston W.L., Norris D.A. // J. Invest. Dermatol. 1988. - Vol. 90, №5. - P. 690-696.

48. Fusenig N.E. Mouse epidermal cell cultures. 2. Isolation, characterization and cultivation of epidermal cells from perinatal mouse skin / Fusenig N.E., Worst P.K. // ExP. Cell Res. 1975. - Vol. 93, №2. - P. 443-157.

49. Germain L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin / Germain L., Rouabhia M., Guignard R., Carrier L., Bouvard V., Auger F.A. // Burns. 1993. - Vol. 19, №2. - P. 99-104.

50. Gilchrest B.A. Growth of human keratinocytes on fibronectin-coated plates / Gilchrest B.A., Nemore R.E., Maciag T. // Cell Biol. Int. Rep. 1980. - Vol 4, №11.-P. 1009-1016.

51. Gilchrest В.A. In vitro assessment of keratinocyte aging / Gilchrest B.A. // J Invest Dermatol. 1983. - Vol. 81 (1 Suppl). - P. 184s-189s.

52. Gilchrest B.A. Attachment and growth of human keratinocytes in serum-free environment / Gilchrest B.A., Calhoun J.K., Maciag T. //J. Cell Physiol. -1982.-Vol. 112, №2.-P. 197-206.

53. Gragnani A. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation / Gragnani A., Sobral C.S., Ferreira L.M. // Braz J Biol. 2007. - Vol. 67, №1. - P. 105109.

54. Guo M. Activation of human keratinocyte migration on type I collagen and fibronectin / Guo M., Toda K.I., Grinnell F. // J. Cell Sci. 1990. - Vol. 96 (Pt.2). — P. 197-205.

55. Hawley-Nelson P. Optimized conditions for the growth of human epidermal cells in culture / Hawley-Nelson P., Sullivan I.E., Kung M. Hennings H., Yuspa S.H. // J. Invest. Dermatol. 1980. - Vol. 75, №2. - P. 176-182.

56. Hayflick L. The serial cultivation of human diploid cell strains / Hayflick L., Moorhead P.S.//Exp. Cell Res. 1961, - V.25, №3.-P. 585-621.

57. Hennings H. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture / Hennings H., Michael D., Cheng C., Steinert P., Holbrook K., Yuspa S.H. // Cell. 1980. - Vol. 19, №1. - P. 245-254.

58. Hodges G.M. The localization of trypsin in cultured mammalian cells / Hodges G.M., Livingston D.C., Franks L.M. // J. Cell Sci. 1973. - Vol. 12. - P. 887902.

59. Holbrook H. Phenotypic expression of epidermal cells in vitro / Holbrook H., Hennings H. // J Invest Dermatol. 1983. - Vol. 81. - P. 1 ls-24s.

60. Horikoshi Т. Effect of oxygen on the growth of human epidermal keratinocytes / Horikoshi Т., Balin A.K., Carter D.M. // J. Invest. Dermatol. 1986. - Vol. 86, №4. - P. 424-427.

61. Hsu T.C. Primary cultivation and continuous propagation in vitro of tissues from small biopsy specimens / Hsu T.C, Kellogg D.S Jr. // J. Natl. Cancer Inst.- 1960, Vol. 25. P. 221-235.

62. Huang Y. Effects of thrombin peptides on wound healing and proliferation and migration of normal human epidermal keratinocyte (NHEK) / Huang Y., Yang Z., Carney D. // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2000. - Vol. 16, №1. - P. 2629.

63. Islam M.S. Isolation and characterization of putative epidermal stem cells derived from Cashmere goat fetus / Islam M.S., Zhou H.M. // Eur J Dermatol.- 2007. Vol. 17, №4. - P. 302-308a.

64. Islam M.S. Isolation and propagation of keratinocytes derived from Cashmere goat fetus / Islam M.S., Zhou H.M. // Tissue Cell. 2007. - Vol. 39, №6. - P. 377-385b.

65. Izumi K. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells / Izumi K., Tobita Т., Feinberg S.E. // J Dent Res. 2007. - Vol. 86, №4. - P.341-346.

66. Jakic-Razumovic J. Organotypic skin cultures: a human model for basic studies / Jakic-Razumovic J., Zekusic M., Vladovic-Relja Т., Boranic M. // Croat Med J. 1998. - Vol.39, №4. - P. 401-403

67. Jensen P.K. Low Ca2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vitro model of epidermal regeneration / Jensen P.K., Bolund L. // Exp Cell Res. 1988. - Vol. 175, №1. - p. 63-73.

68. Karasek M.A. Growth of postembryonic skin epithelial cells on collagen gels / Karasek M.A., Charlton E. // J Invest Dermatol. 1971. - Vol. 56. - P. 205210.

69. Khammo N. Development of an innervated model of human skin / Khammo N. Ogilvie J., Clothier R.H. // Altern Lab Anim. 2007. - Vol.35, №5. - P. 487-491.

70. Kurita T. Apoptotic cell death induced by serum and its prevention by thiols / Kurita Т., Namiki H. // J. Cell Physiol. 1994. - Vol. 161, №1. - P. 63-70.

71. Limat A. Postmitotic human dermal fibroblasts preserve intact feeder properties for epithelial cell growth after long-term cryopreservation / Limat A., Hunziker Т., Boillat C, Noser F., Wiesmann U. // In Vitro. 1990. - Vol. 26,№7.-P. 709-712.

72. Ljungren C.A. Von der Fahigkeit des Hautepitels, auBerhalb des Organismus sein Leben zu behalten, Mit Beriicksichtingung der Transplantation / Ljungren C.A. // Deutsch Zschr Chir. 1898. - Vol. 47. - P. 608-628

73. Maciag T. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes / Maciag Т., Nemore R.E., Weinstein R., Gilchrest B.A. // Science. 1981. - Vol. 211, №4489. - P. 1452-1454.

74. Marcelo C.L. Cyclic AMP, glucocorticoid and retinoid modulation of in vitro keratinocyte growth / Marcelo C.L., Tomich J. // J. Invest. Dermatol. 1983. -Vol. 81, №1 suppl. - P. 64s-68s.

75. Medawar P.B. The cultivation of adult mammalian skin epithelium in vitro / Medawar P.B. // Quart. J. Microsc. Sci. 1948. - Vol. 89. - P. 187-196.

76. Mochizuki R. Expression of desmosomal proteins in rat keratinocytes during in vitro differentiation / Mochizuki R, Kamiyama M, Arai KY, Arai K, Uehara K. // J Vet Med Sci. 2002. - Vol. 64, №2. - P. 123-127.

77. Moorhead P.S. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood / Moorhead P.S., Nowell P.C., Mellman W.J., Battips D.M., Hungerford D.A. // Exp Cell Res. -1960. №20. - P. 613-616.

78. Morhenn V.B. Separation of human skin cells by velocity sedimentation into functionally distinct fractions / Morhenn V.B., Starr E.D., Terrell C., Cox A.J., Engleman E.G. // J. Invest. Dermatol. -1982. Vol. 78, №4. - P. 319-322.

79. Murray J.C. Epidermal cells adhere preferentially to type IV (basement membrane) collagen / Murray J.C., Stingl G., Kleinman H.K., Martin G.R., Katz S.I. // J. Cell Biol. 1979. - Vol. 80. - P 197-202.

80. Patrick C.W. Dermal fibroblasts genetically engineered to release nerve growth factor / Patrick C.W, Zheng В., Schmidt M., Herman P.S., Chauvin B.P., Fan Z., Stark В., Evans G.R. // Ann Plast Surg. 2001. Vol. 47, №6. - P. 660-665.

81. Pentland A.P. Effects of gas tension on epidermal keratinocyte DNA synthesis and prostaglandin production / Pentland A.P., Marcelo C.L., Jordan M.A., Voorhees J.J. // J. Invest. Dermatol. 1986. - Vol. 86, №2. - P. 177-180.

82. Pittelkow M.R. New techniques for the in vitro culture of human skin keratinocytes and perspectives on their use for grafting of patients with extensive bums / Pittelkow M.R., Scott R.E. // Mayo Clinic Proc. 1986. -Vol. 61.-P. 771-777.

83. Praeger F.C. Use of strontium to separate calcium-dependent pathways for proliferation and differentiation in human keratinocytes / Praeger F.C., Stanulis-Praeger B.M., Gilchrest B.A. // J. Cell. Physiol. 1987. - Vol. 132, №1. - P. 81-89.

84. Price F.M. Approaches to enhance proliferation of human epidermal keratinocytes in mass culture / Price F.M., Taylor W.G., Camalier R.F., Sanford K.K. // J. Natl. Cancer Inst. 1983. - Vol. 70, №5. - P. 853-861.

85. Prunieras M. Epidermal cell culture systems in skin pharmacology / Prunieras M, Delescluse C. // Br J Dermatol. 1984. - Vol. 111 Suppl 27. - P. 43-57.

86. Puck T.T. Genetics of somatic mammalian cells III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects / Puck T.T., Cieciura, S.J., Robinson A. // J. Exp. Med. 1958 - Vol. 108, №6. - P. 945-956.

87. Radu E. Stem cells (p63(+)) in keratinocyte cultures from human adult skin / Radu E., Simionescu O., Regalia Т., Dumitrescu D., Popescu L.M. // J. Cell. Mol. Med. 2002. - Vol. 6, №4. - P. 593-598.

88. Rheinwald J.G. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizating colonies from single cells / Rheinwald J.G., Green H. // Cell. 1975. - Vol. 6. - P. 331-344.

89. Robbins F.C. Cultivation of the Lansing Strain of Poliomyelitis Virus in Cultures of Various Human Embrionic Tissues / Robbins F.C., Enders J.F., Weller Т.Н. // Science. 1949. -vol.109. - P. 85-87.

90. Thompson C.H. Optimised growth of human epidermal cells in vitro without the use of a feeder layer or collagen substrate / Thompson C.H., Rose B.R., Cossart Y.E. // Austr. J. ExP. Biol, and Med. Sci. 1985. - Vol. 63 (Pt 2). - P. 147-156.

91. Tsukahara K. Inhibitory effect of an extract of Sanguisorba officinalis L. on ultraviolet-B-induced photodamage of rat skin / Tsukahara K, Moriwaki S, Fujimura T, Takema Y. // Biol Pharm Bull. 2001. - Vol. 24, №9. - P. 9981003.

92. Tsukahara K. Ovariectomy accelerates photoaging of rat skin / Tsukahara K, Moriwaki S, Ohuchi A, Fujimura T, Takema Y. // Photochem Photobiol. -2001. Vol. 73, №5. - P. 525-531.

93. Watt F.M. Epidermal stem cells in culture / Watt F.M. // J. Cell Sci. Suppl. -1988.-Vol. 10.-P. 85-94.

94. Waymouth C. Construction and use of synthetic media and tissue in culture / Waymouth C. // N.Y. Acad. Press. - 1965. - Vol. 1. - P. 546-587Л

95. Witte M.B. Upregulation of arginase expression in wound-derived fibroblasts / Witte M.B., Barbul A., Schick M.A., Vogt N., Becker H.D. // J Surg Res. -2002.-Vol. 105, №1.-P. 35-42.

96. Wurster D.H. Indian muntjac, Muntiacus muntjak: a deer with a low diploid chromosome number / Wurster D.H., Benirschke K. // Science. 1970. -Vol. 168, №937.-P. 1364-1366.

97. Zhu Z. Expression of P450 enzymes in rat whole skin and cultured epidermal keratinocytes / Zhu Z., Hotchkiss S.A., Boobis A.R., Edwards RJ. // Biochem Biophys Res Commun. 2002. - Vol. 297, №1. - P. 65-70.