Цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и их чувствительность к некоторым вирусам тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Завьялова, Елена Александровна

• Завьялова, Елена Александровна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Завьялова, Елена Александровна

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы

2.1. Культуры клеток и тканей рыб

2.1.1., Первичные культуры. Ю

2.1.2. Перевиваемые клеточные линии.

2.2. Вирусные заболевания рыб

2.2.1. Инфекционный некроз поджелудочной железы лососевых lf. (IPN).

2.2.2. Весенняя виремия карпов (SVC).

Собственные исследования

3. Материалы и методы

3.1. Рыбы.

3.2. Культуры клеток.

3.3. Вирусы.

4. Результаты исследований

4.1. Разработка методов получения первичных и субкультур из тканей лососевых рыб (Salmo irideus Gibbons) и их цитоморфологическая характеристика. ^

4.1.1. Культура клеток из ткани сердца радужной форели.

4.1.2. Культура клеток из ткани почек радужной форели.

4.1.3. Культура клеток из ткани селезенки радужной форели.

4.1.4. Культура клеток из ткани гонад радужной форели.

4.2. Разработка методов получения первичных и субкультур из тканей гонад серебряного карася (Carassius carassius L.) и их ^ морфологические свойства.

4.3. Разработка методов получения первичных и субкультур из тканей эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи (Lebistes ^^ reticulates L.) и их морфологические свойства.

4.4. Изучение чувствительности к вирусам первичных и субкультур из тканей рыб

4.4.1. Чувствительность первичных культур клеток из тканей внутренних органов и субкультуры из ткани гонад радужной форели к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых IPN.

4.4.2. Чувствительность первичных и субкультур из ткани гонад серебряного карася к вирусу весенней виремии карпов SVC . ^

4.4.3. Чувствительность субкультур из ткани эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи к вирусам промышленноразводимых ^ рыб.

4.5. Изучение цитопатогенного действия штаммов вируса IPN и SVC на перевиваемые культуры клеток лососевых и карповых рыб

4.5.1. Размножение и титрование референтного и полевого штаммов вируса IPN в перевиваемых культурах клеток СНН-1 ^ и CHSE-214.

4.5.2. Морфологические изменения перевиваемых культур клеток СНН-1 и CHSE-214, инфицированных полевым и ^ референтным штаммами вируса IPN.

4.5.3. Размножение и титрование полевого штамма IPN в перевиваемой культуре клеток эпителиальной папилломы gj карпа ЕРС.

4.5.4. Сравнительное изучение цитопатогенного действия в перевиваемых культурах клеток сердца кеты СНН-1 и эпителиальной папилломы карпа ЕРС референтного и полевого штаммов вируса IPN и SVC.

5. Обсуждение результатов исследований.

6. Выводы.

Практические предложения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и их чувствительность к некоторым вирусам»

Актуальность проблемы

Метод культивирования клеток вне организма является большим достижением биологической науки, так как позволяет получать наиболее объективные и надежные данные при диагностике вирусных инфекций, использовать их в биотехнологических процессах при производстве вакцин, для получения интерферона, а также при синтезе моноклональных антител. (Wolf К. et.al., 1980; Sasson А., 1987; Животная клетка в культуре, 2000).

Культуры клеток рыб также являются объектом биотехнологии и вирусологии. Наибольшую потенцию роста in vitro имеют клетки гонад неполовозрелых рыб и их эмбрионы (Dannevig В.Н. et.al., 1997), культуры, приготовленные из зрелых тканей, обладают слабой потенцией роста (Miller N.W. et.al., 1994а; Rode М. et. al., 1997; Wergeland H.I. et.al., 2001). В некоторых случаях перевиваемые культуры клеток получены из новообразований: саркомы, лимфосаркомы, гепатомы, нефробластомы и оспенной эпителиомы (Soustegard R.A. & Soustegard K.S., 1973; Fijan N., Sulimanovic D. et. al., 1983).

Благодаря получению однослойных культур клеток гонад карпа в нашей стране впервые в 1970 году был выделен вирус от больных карпов, а при изучении свойств и роли вируса в патологии рыб установили, что этот агент вызывает заболевание названное весенняя вирусная болезнь карпа (Рудиков Н.И., 1986). В 2001 году впервые в России от мальков семги, полученных из оплодотворенной икры, завезенной из Норвегии, в культуре клеток сердца кеты был выделен вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых, представитель семейства Birnaviridae (Пичугина Т.Д. с соавт., 2005а).

Таким образом, с возникновением острых вирусных эпизоотии среди карповых и лососевых рыб, появилась необходимость в совершенствовании методов диагностики, основанных на использовании как первичных, так и перевиваемых культур клеток.

В практической вирусологической работе наиболее важным является изучение спектра чувствительности культур клеток к различным вирусам (Kelly R.K. et.al., 1978; Kielian М. et.al., 1990). Не все линии клеток изучены достаточно полно в этом отношении. Так, в культуре клеток FHM реплицируются, по крайней мере, четыре вируса рыб - IPNV, SVCV, VHSV, IHN и два вируса теплокровных животных (Gravell М. et.al., 1965). Культура клеток CHSE - 214, из эмбрионов чавычи, чувствительна к вирусам герпеса лососевых, IHN, IPN и VHS (Kibenge F.S.B. et.al., 2000). Культура клеток из оспенных поражений карпа ЕРС также имеет широкий спектр чувствительности и в ней реплицируются вирусы SVC, VHS, а также вирусы европейского угря. Особый интерес представляет линия клеток радужной форели RTG-2, чувствительная к шести вирусам рыб, а также к вирусам венесуэльского и восточного энцефаломиелитов лошадей, и отека головастиков (Hjalmarsson A. et.al., 1999).

Однако, несмотря на существование большого количества перевиваемых клеточных линий рыб не все из них могут быть использованы в диагностике. Для областных и районных диагностических лабораторий зачастую не представляется возможным и экономически оправданным приобретение из-за рубежа или исследовательских институтов необходимых линий клеток. Более того, работа с зарубежными культурами клеток рыб сопряжена с определенными трудностями при культивировании. В качестве альтернативы при диагностических исследованиях для выделения и накопления вируса возможно использование первичных культур и субкультур клеток, полученных из тканей восприимчивых к данному вирусу рыб (Office International des Epizooties, 2000).

Таким образом, расширение исследований по получению первичных культур клеток и субкультур, чувствительных к определенным вирусам рыб, и создание в дальнейшем отечественных постоянных линий является актуальной научной проблемой.

Цель работы: изучить культурально-морфологические свойства первичных культур клеток, субкультур и клеток перевиваемых линий из тканей различных видов рыб и определить чувствительность к вирусам-возбудителям инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC). Основные задачи исследований:

• Получить первичиые культуры и субкультуры клеток из тканей внутренних органов и гонад лососевых, карповых и аквариумных рыб и дать цитоморфологическую характеристику.

• Изучить чувствительность культур клеток из тканей лососевых рыб к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы (IPN) лососевых и культур клеток из гонад карася к вирусу весенней виремии карпов (SVC).

• Определить чувствительность и возможность адаптации культуры клеток из эмбрионов аквариумных рыб к вирусам рыб, разводимых в аквакультуре.

• Изучить морфологические изменения в клетках перевиваемых линий СНН-1 и CHSE-214, инфицированных полевым и референтным штаммами вируса IPN.

• Разработать схему преодоления непермиссивности клеток перевиваемой линии эпителиальной папилломы карпа (ЕРС) к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN).

• Изучить в сравнительном аспекте цитопатогенное действие полевого штамма ВС-1, референтных штаммов вируса IPN и SVC на перевиваемые культуры клеток сердца кеты СНН-1 и эпителиальной папилломы карпа ЕРС.

Научная новизна

Получены субкультуры клеток из первичных культур клеток гонад радужной форели и серебряного карася, дана их цитоморфологическая характеристика и определена чувствительность к вирусам инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN) и весенней виремии карпов (SVC) соответственно.

Получена и адаптирована для размножения вируса весенней виремии карпов (SVC) субкультура из клеток эмбрионов аквариумной рыбы-гуппи.

Отработана схема перевода непермиссивных клеток эпителиальной паппиломы карпа в состояние пермиссивности по отношению к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPN).

Практическая ценность работы заключается в том, что в результате проведенных исследований отработаны методы получения первичных культур и субкультур из внутренних органов и гонад радужной форели, гонад карася и эмбрионов гуппи, чувствительных к вирусам лососевых и карповых рыб и показана возможность использования их в вирусологических исследованиях.

Апробация

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

Заседании научно-консультативного Совета по болезням рыб Межведомственной Ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2003г.);

Конференции «Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине» (ВИЭВ, 2003г.);

Second Bilateral Conference «Aquatic & marine animal health» (USA, 2003);

Совещании, посвященном научно-практическим проблемам инфекционной патологии и охраны здоровья рыб, (ВИЭВ, 2004г.);

Международной конференции «Сохранение генетических ресурсов». (Санкт-Петербург, 2004г.);

Конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии» (ВИЭВ, 2005г.);

Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005г.);

Межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2006г.)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 131 страницах и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 14 таблицами, 25 рисунками. Список литературы включает 178 публикаций, в том числе 147 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Завьялова, Елена Александровна

6. Выводы

1. Отработаны методы получения первичных культур клеток из ткани селезенки, сердца и гонад радужной форели (Salmo irideus Gibbons), изучены их культурально-морфологические свойства и чувствительность к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых (IPNV). Титр вируса в культуре сердца форели 104'6-4'8ТЦД50/мл, селезенки - Ю^ТЦДзо/ид, гонад - Ю5'2-5'3ТЦД50/М„.

2. Субкультура клеток гонад радужной форели представлена клетками эпителиоподобного типа с 1-3 ядрышками, одной или несколькими мелкими вакуолями по периферии клетки. Без изменения морфологии культура клеток прошла пять пассажей, коэффициент пересева 1:2, 1:3. Культура обладает высокой чувствительностью к вирусу инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых

IPNV), титр Ю5'5-5'8ТЦД50/мл.

3. Получена первичная и субкультура клеток гонад серебряного карася (Carassuis carassius L.), представленная клетками смешанного типа (эпителиоподобными и небольшим количеством фибробластопобных), ядра крупные с 1-2 разнородными ядрышками. Коэффициент пересева 1:2, проведено пять пассажей. Первичная культура клеток может использоваться для культивирования вируса весенней виремии карпов (SVCV) (титр 106'°ТЦД5о/мл), при субкультивировании на 1-2 пассажах титр вируса составил

105'8"6'°ТЦД5о/мл, с увеличением числа пассажей титр увеличивается до

106,2-6,5ТЦД5о/мл

4. Субкультура клеток эмбрионов аквариумной рыбки - гуппи (Lebistes reticulates L.) на уровне первых четырех пассажей представлена фибробластоподобными и эпителиоподобными клетками с преобладанием последних, к 6-7 пассажу происходит увеличение числа фибробластоподобных клеток. Первичная культура клеток гуппи не чувствительна к вирусу весенней виремии карпов (SVC). В субкультуре на втором пассаже отмечено цитопатогенное действие вируса и разрушение монослоя на 4-5 день, в третьем пассаже - на 2-3 день. Субкультура клеток эмбрионов гуппи может использоваться для диагностики и накопления SVCV.

5. Референтный штамм вируса 1PN и полевой штамм ВС-1 реплицируются быстрее в постоянной линии клеток СНН-1 и накапливаются в культуральной жидкости в большем титре, чем в культуре CHSE-214. При заражении культуры клеток СНН-1 ЦПД наступает обычно на 3 день, титр 107'2 - 108'5 ТЦД50/мл, в культуре CHSE-214 в среднем на два дня позже, титр 102'62 -102'8 ТЦД50/мл.

6. Цитопатологические изменения в культурах СНН-1 и CHSE-214, выражались в изменении морфологии клеток, которые становились более вытянутыми, вакуолизации, увеличении ядер и симпластообразовании.

7. Отработана схема, при которой возможно использование культуры клеток эпителиальной паппиломы карпа (ЕРС) для размножения вируса IPN. Культуру выращивают при 20-23°С, после заражения инкубируют при температуре, оптимальной для вируса лососевых - 15°С. Цитопатогенное действие вируса IPN наблюдается на 5-7 день, титр -106'18 ТЦД50/мл.

Практические предложения

В результате проведенных исследований отработаны методы получения первичных культур и субкультур клеток из внутренних органов радужной форели (Salmo irideus Gibbons), гонад карася (Carassuis carassius L.) и эмбрионов гуппи (Lebistes reticulates L.). Полученные культуры чувствительны к вирусам лососевых и карповых рыб и рекомендуются для вирусологических исследований. Разработанные методы включены в «Методические рекомендации по культивированию клеток для диагностики вирусных болезней рыб» и утверждены на секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины РАСХН 14.02.2006, протокол №

98

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Завьялова, Елена Александровна, 2006 год

1. Архангельский Д.С., Полякова О.В. Получение первичных культур клеток из гонад судака для вирусологических исследований. // Биол. Основы рыб.хоз-ва водоемов Сред.Азии и Казахстана, Фрунзе, 1978, с.244-245

2. Архангельский Д.С., Полякова О.В. Получение первичных культур клеток из гонад судака. //Рыб. хоз-во, 1979, №1 с.26-28

3. Биология клетки в культуре. Отв. редактор А.С.Трошин, // Ленинград, «Наука»., 1984 г.

4. Борисова М.Н., Пичугина Т.Д., Завьялова Е.А. Здоровье рыб и безопасность рыбоводных хозяйств // Ветеринарная жизнь, 7 (7) апрель 2004, стр.4

5. Гончаров Г.Д., Зубкова Л.А., Степанова М.А. Однослойная клеточная культура почечной ткани леща. // Биол. внутр. вод. Информ. бюллетень, 1970, №6, с.60-64

6. Животная клетка в культуре. Под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. М. // 2000, с. 148-159.

7. Завьялова Е.А., Пичугина Т.Д., Дьяконов Л.П., Борисова М.Н. Культура клеток гуппи и ее применение в вирусологических исследованиях //Ветеринарная патология, М., 2003(a), 1(5) с.50-52

8. Завьялова Е.А., Дрошнев А.Е., Пичугина Т.Д. Мониторинг в рыбоводстве // Ветеринарная жизнь, (15) август 2004, стр.2

9. Завьялова Е.А., Пичугина Т.Д., Дьяконов Л.П., Борисова М.Н. Культуры клеток рыб для вирусологических исследований идиагностики вирусных болезней // Информационный бюллетень «Клеточные культуры» вып.20, Санкт-Петербург, 2005 стр. 53-57

10. Лакин Г.Ф. Биометрия, М., Высшая школа, 1990

11. Ларцева Л.И., Зубкова Л.А. Культивирование однослойных клеточных культур из кожи и плавников карпа и судака. // Сб. научн.трудов ВНИИПРХ, 1981, вып. 32, с. 25-32

12. Наконечная М.Г. К методике получения первичной однослойной клеточной культуры из гонад форели. // Труды ВНИИПРХ, 1978, вып.27, с.94-98

13. Никольский В.В., Осадчая Е.Ф. О методике получения первичной культуры почечных клеток карпов. // Материалы Всесоюзной конференции по вопросам ветеринарной вирусологии (1822 февраля 1964 г.) с.66-67

14. Осадчая Е.Ф. Методика культивирования однослойных клеточных культур из недозрелых гонад самок карпов. // Рыбное хозяйство. Респ. Межвед. темат. научн. сб., Киев, 1969, вып. 9, с. 88-92

15. Осадчая Е.Ф., Лигоцкая В.Н. Вирусологические исследования при изучении этиологии краснухи карпов. // I Всес.симпозиум по инф. Бол. Рыб. (16-19 мая 1972г.) Тезисы докладов. 1972, с. 35-37

16. Осадчая Е.Ф. Применение однослойных клеточных культур из почек и гонад карпа в ихтиопатологии. // Паразаты и болезни рыб и водных беспозвоночных /«Наука» 19726, с.64-69

17. Пичугина Т.Д., Мочалкин В.П., Анисимов М.К., Однослойные культуры клеток эмбрионов гуппи. // Бюллетень ВИЭВ, 1976, вып. 26., с. 32.

18. Пичугина Т.Д. Сравнительное изучение изолятов возбудителя весенней вирусной болезни рыб в реакции нейтрализации // Проблемы ветеринарной иммунологии / Тр. ВИЭВ, 1983, т.57, с. 141-143

19. Пичугина Т.Д., Борисова М.Н., Завьялова Е.А., Щелкунов И.С., Щелкунова Т.И. Весенняя виремия карпов // Ветеринария, 2004, 5, стр.2В 30.

20. Пичугина Т.Д., Завьялова Е.А., Борисова М.Н., Дьяконов Л.П., Надточей Г.А., Шуляк А.Ф. Выделение вируса инфекционного некроза поджелудочной железы // Ветеринария 2005(a), 1, стр. 31-32.

21. Пичугина Т.Д., Завьялова Е.А. Влияние вирусных инфекций на развитие аквакультуры в России // Межведомственный тематический научный сборник «Ветеринарная медицина-85», Харьков, 2005 (б), том 2., стр.906-911.

22. Рабкин Е.М., Куденцова Р.А. Приготовление однослойной культуры тканей из гонад карася и карпа. // Ветеринария, 1969, №12, с.91-92

23. Рудиков Н.И. О клеточных культурах из эмбрионов и личинок пресноводных рыб. // «Рыбоводство и болезни рыб». Научн. Труды отделение животноводства и ветеринарии ВАСХНИЛ. М., 1969, с. 221224

24. Рудиков Н.И. Весенняя вирусная болезнь карпа. Автореф. докт. дисс. М. 1986

25. Сергеев В.А., Хижинская В.П. — «С.-х.биология» 1967, №2, с. 18

26. Сергеев В.А., Репродукция и выращивание вирусов животных -М. «Колос», 1976

27. Тец В.И., Яковлева Г.С. Получение культуры тканей карпа и ее применение при изучении этиологии краснухи рыб. // Научно-технический бюллетень ГосНИОРХ, 1962, №15, с.73-77

28. Щелкунов И.С., Купннская О.А. Продолжительное субкультивирование in vitro клеток ткани хвостового плавника карпа Cyprinus carpio L. // Паразиты и болезни рыб. Сборник научных трудов ВНИРО, М., 2000, с.90-94

29. Щелкунова Т.И., Купинская О.А., Мащенко Н.А., Щелкунов И.С. Клеточные линии их тканей сибирского осетра. // Первый конгресс ихтиопатологов России. Астрахань, сентябрь 1997 г., Тезисы докладов. 1997, с.302-303

30. Agius С., Mangunwiryo Н., Johnson R.H. & Smail D.A.A more sensitive technique for isolating infectious pancreatic necrosis virus from asymptomatic carrier rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. // J. Fish Diseases. 1982, 5, 285-292.

31. Ahne W. Persistent infection in CHSE-214 cell with IPN virus isolated from pike (Exos lucius). // Bull. Off. Int. Epizoot. 1977, 87, 415417

32. Ahne W. Isolation and characterisation of infectious pancreatic necrosis virus from pike (Esox lucius). // Arch. Virol, 1978, 58, 65-69.

33. Ahne W. & Negele R.D, Studies on transmission of infectious pancreatic necrosis virus viaeyed eggs and sexual products of salmonid fish. /In: Fish and Shellfish Pathology, Ellis A.E., ed. Academic Press, London, UK, 1985, 261-269.

34. Ahne W. Studies on the use of fish tissue cultures for toxicity tests in order to reduce and replace the fish tests. // Zbl. Bact. Hyg. Abt. Orig. -1985.-b. 180. -s. 480-504

35. Ahne W. Argulus foliaceus L. and Philometra geometra L. as mechanical vectors of spring viraemia of carp virus (SVCV).J. Fish Dis., 1985a, 8, 241-242.

36. Ahne W. Viral infection cycles in pike (Esox lurius L). Z. Angew. Ichthyol., 1985b, 2, 90-95.

37. Ahne W. Jorgensen P.E.V., Olesen N.J., Fischer-Scherl T. & Hoffman R. Aquatic Birnaviruses: virus of the serogroup II isolated from an IPN outbreak in brook trout (Salvelinus fontinalis). // Bull. Eur. Ass. Pish Pathol., 1989, 9, 14-16.

38. Alonso M., Rodrigues S., Peres-Prieto S.I. (1999) Viral coinfection in salmonids: infectious pancreatic necrosis virus interferes with infectious hematopoietic necrosis virus. Arch/ Virol. 144: 657-673

39. Altman P.L. & Dittmer D.S. Biology Data Book, 2nd ed, Vol.1, Fed. Of Am. Soc. For Exp. Biol., Bethesda, Maryland, 1972, p. 519

40. Animal cell culture. A practical approach, edited by R.I.Freshney, Cancer Research Campaign, Department of Oncology, University of Glasgow, 1 Horselethill Road, Glasgow, G 12 9LX, UK, 1989

41. Bernard J., Lecocq-Xhonneux F., Rossius M., Thiry M.E., de Kinkelin J. Clonning and sequencing the messenger RNA of the N gene of viral hemorrhagic septicemia virus // Gen. Virology 1990, v. 71, p. 16691674

42. Bootland L. M., Dobos P. & Stevenson R. M. W. Fry age and size effects on immersion immunization of brook trout, -Salvelinus fontinalis Mitchell, against infectious pancreatic necrosis virus. // Journal of Fish Diseases 1990, 13, 113-125.

43. Bullock G.L., Rucker R.R., Amend D., Wold K. & Stuckey H.M. Infectious pancreatic necrosis: transmission with iodine-treated and non-treated eggs of brook trout (Salvelinus fontinatis). // J. Fish. Res. Board Can., 1976, 33, 1197-1198.

44. Castric J., Baudin-Laurencin F., Coustans M.F. & Auffret M. Isolation of infectious pancreatic necrosis virus, Ab serotype, from an epizootic in farmed turbot, Scophtbalmus maximus. // J. Aquaculture, 1987, 67, 117-126.

45. Castric J. Viral diseases in fish mariculture. // Bull. Eur. Ass. Fish. Pathol. 1997, 17: 197-200

46. Catalogue of cell lines & hybridomas, 7lh edition, 1992

47. Chiou H.Y., Lo C.F., Tung M.C., Wang C.H., Fukuda H. & Sano T. The general characteristics of a birnavirus isolated from cultured loach (Missurnus anguiilicaudatus) in Taiwan, // Fish Pathol. 1993, 28, 1-7.

48. Chou H.Y., Li H.J. & Lo C.F. Patogenicity of a birnavirus to hard clam (Meretrix lusoris) and effect of temperature stress on its virulence // J. Fish Patology, 1994, 29, 171-175

49. Chou H.Y., Chang S.J., Lee H.Y. & ChiouY.C. Preliminary evidence for the effect of heavy metal cation on the susceptibility of hard clam (Meretrix lusoris) to clam birnavirus infection. // J. Fish Patology, 1998, 33,213-219

50. Christie К. E., Havarstein L. S., Djupvik H.O., Ness S. & Endresen C. Characterization of a new serotype of infectious pancreatic necrosis virus isolated from Atlantic salmon. //Archives of Virology 1988, 103, 167-177.

51. Clem L.W., Moewus L., Sigel M.N. Studies with cell from marine fish in tissue culture. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med, 1965, V.108, №3, p.762-766

52. Damsgard В., Mortensen A., Sommer A.- I. Effects of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) on appetite and growth in Atlantic salmon, Salmo salarL. //Aquaculture 1998, 163:185-193

53. Dannevig B.H., Falk K. & Namork E. Isolation of the causal virus of infectious salmon anemia (ISA) in a long-term cell line from Atlantic salmon head kidney.//J. Gen. Virol, 1995a, 76, 1353-1359.

54. Dannevig B.H., Falk K. & Press C.McL. Propagation of infectious salmon anaemia (ISA) virus in cell culture. // Vet. Res. 1995b, 26, 438-442.

55. Dannevig B.H., Brudeseth B.E., Gjoen Т., Rode M., Wergeland H.I,

56. Evensen 0. & Press C.McL. Characterisation of a long term cell line (SHK-1) developed from the head kidney of Atlantic salmon (Salmo salar L). // Fish Shellfish Immunol. 1997, 7, 213—226.

57. De Sena J., Rio G.J. Partial purification and characterization of RTG-2 fish cell interferon. //Infect. Immun. 1975, 11: 815-822

58. Dixon P.F. & Hill B.J. Rapid detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) by the enzyme-linked immunosorbent assay. // J. Gen. Virol, 1983, 64, 321-330.

59. Dobos P., Virus-specific protein synthesis in cell infected by infectious pancreatic necrosis virus.// J. Virology 1977, 21, 242-258

60. Dobos P., Hill B.J., Hallet R., Kells D.T.C., Becht H., Tenings D., Biophysical and biochemical characterization of five animal viruses with bisegmented double-stranded RNA genomes. // J. Virology 1979, 32, 593605

61. Dobos P. & Roberts Т.Е. The molecular biology of infectious pancreatic necrosis virus: a review. // Can. J. Gen. Microbiol. 1983, 29, 377-384.

62. Dobos P., The molecular biology of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). // Ann. Rev. Fish. Dis. 1995, 5: 25-54

63. Dorson M. & Torchy C. The influence of fish age and water temperature on mortalities of rainbow trout, gairdneri Richardson, caused by a European strain of infectious pancreatic necrosis virus. // Journal of Fish Diseases 1981, 4, 213-221.

64. Dorson M. & Torchy C. Experimental transmission of infectious pancreatic necrosis virus via the sexual products. / In: Fish and Shellfish Pathology, Ellis A.E., ed. Academic Press, London, UK, 1985, 251-260.

65. Dorson M., de Kinkelin R & Torchy C. Interferon synthesis in rainbow trout following infection with infectious pancreatic necrosis virus. // Fish and Shellfish Immunology 1992, 2, 311-313.

66. Elazhary M. A. S. Y., Lagace A., Cousineau G. & Roy R. S. Outbreak of infectious pancreatic necrosis in yearling brook trout (Salvelinus fontinalis). //Journal of the Fisheries 1976, 33, 2621-2625.

67. Evensen O. & Rimstad E. Immunohistochemical identification of infectious pancreatic virus in paraffin-embedded tissues of Atlantic salmon (Salmo salar). //J. Vet. Diagn. Invest. 1990, 2, 288-293.

68. Faisal M. & Ahne W. Spring viraemia of carp virus (SVCV): comparison of immunoperoxidase, fluorescent antibody and cell culture isolation techniques for detection of antigen. J. Fish Dis., 1984, 7, 57-64.

69. Falk K., Namork E.,Rimstad E., Mjaaland S. & Dannevig B.H. Characterization of infectious salmon anaemia virus, an orthomyxo-like virus isolated from Atlantic salmon (Salmo salar L).J. Virol., 1997, 71, 9016-9023.

70. Fendrick J.L., Groberg W.J.Jr., Leong J.C. Comparative sensitivity of five fish cell lines to wild type infectious haematopoietic necrosis virus from two Oregon sources. // J. Fish Diseases, 1982, 5, №2, 87-95

71. Fijan N., Petrinec Z., Sulimanovic D. & Zwillenberg L.O. Isolation of the causative agent from the acute form of infectious dropsy of carp. Vet. Arch. Zagreb, 1971, 41, 125—138.

72. Fijan N. Infectious dropsy in carp — a disease complex. In: Diseases of Fish, Mawdesley Т., ed. Symposia of the Zoological Society of London. Academic Press, London, UK, 1972, 39—51.

73. Fijan N., Sulimanovic D., Some properties of the epithelioma papulosum cyprini (EPC) cell line from carp Cyprinus carpio., // Ann.Virol.(Inst. Pasteur), 1983, 134 E. 207-220

74. Fryer J.L., Yusha A., Pilcher K.S. The in vitro cultivation of tissue and cells of Pacific salmon and steelhead trout. // Ann. N. Y. Acad. Sci., 1965 , 126, №1, p. 566-586

75. Fryer J.L., Lannan C.N. Three decades of fish cell culture: A current listing of cell lines derived from fishes. // J. of Tissue Culture Methods. 1994, V.16. p. 87-94

76. Gahlawat S.K., Munro E.S. & Ellis A.E. A non-destructuve test for detection of IPNV-carriers in Atlantic Halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.) // J. Fish. Dis. 2004, 27.233-239

77. Ghittino P., Fijan N., Kinkelin P // Bull. Office int. epizoot. 1980, 92, №9-10. p.955-966

78. Granzow H., Wieland F., Fichtner D., Enzmann P.J. Studies of the ultrastructure and morphogenesis of fish pathogenic viruses grown in cell culture. // J. Fish Dis. 1997, 20: 1-10

79. Gravell M., Malsberger R.G. A permanent cell line from the fathead minnow (Pimephales promelas). // Ann. N.Y. Acad. Sci., 1965, v. 126, № 1, p. 555-565

80. Grutzner L. In vitroZuchtung des Leber- und Nierengewebes Von Tinea vulgaris Cuv. (Schleie) in trypsinierten Einschichtgewebekulturen. // Zbl. Bakteriol., Parasitenk., Infektionskrankh. Und Hygiene, 1958, 173, №3-4, s. 195-202

81. Hedrick R.P., Leong J.C., Fryer J.L., Persistent infection in salmonid fish cell with infectious pancreatic necrosis (IPNV). // J. Fish Dis. 1978, 1, 279-301

82. Hedrick R.P., Fryer J.L. Persistent infections of salmonid cell lines with infectious pancreatic necrosis virus (IPNV): a model for the carrier state in trout. // Fish Pathol. 1982, 16: 163-172

83. Hedrick R.P., Fruer J.L., Chen S.N., Kou G.H. // Ibid., 1983, 18, №2, p. 91-97

84. Heppell J., Berthiaume L., Tarrab E., Lecomte J., Arella M., Evidence of genomic variations between infectious pancreatic necrosis virus strains by restriction fragment profiles. // J. Gen. Virology, 1992, 73. 28632870

85. Hill B.J. Infectious pancreatic necrosis and its virulence. / In: Microbial Diseases of Fish (Special Publication of the Society for General Microbiology), Roberts R.J., ed. Academic Press, London, UK, 1982, 91114.

86. Hill B.J. Impact of viral diseases of salmonid fish in the European Community. / In: Salmonid Diseases, Kimura Т., ed. Hokkaido University Press, Sapporo, Japan, 1992, 48—59.

87. Hill B.J. & Way K. Serological classification of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and other aquatic birnaviruses. // Ann. Rev. Fish Dis., 1995, 5, 55—77.

88. Hjalmarsson A., Everitt E., Identification of IPNV-specified components released from productively infected RTG-2 cells following massive cytopatic effect. //Arch. Virol. 1999, 144: 1487-1501

89. Isa K., Shima A. Transfection and stable expression of a dominant selective marker Ecogpt in a culture cell line of the fish, Carassius auratus //J. of cell Science. 1987, V.88. p. 219-224

90. Jarp J., Gjevre A.G., Olsen A.B., Bruheim T. Risk factors for furunculosis, infectious pancreatic necrosis and mortality in post-smolt of Atlantic salmon, Salmo salar L. // J. Fish Dis. 1994, 18:67-78

91. Jensen M.N. Preparation of fish tissue culture for virus research. Bull. Off.Int.Epiz. 1963, 131-134

92. Jorgensen P.E. Vestergard, Kehlet N.P. Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus in Danish rainbow trout. Their serological and pathogenic properties // Nord. Vet. Med, 1971, 23, N11, 56-575

93. Kelly R.K., Souter B.W., Miller H.R. Fish cell lines: comparisons of CHSE-214, FHM and RTG-2 in assaying IHN and IPN viruses. // J. Fish Res. Board Can., 1978, 35. №7, 1009-1011

94. Kibenge F.S.B., Lyaku J.R. Rainnie D., Hammell K.L. Growth of infectious salmon anaemia virus in CHSE-214 cell and evidence for phenotypic differences between virus strains. // J. Gen. Virology 2000, 81: 143-150

95. Kielian M., & S. Jungerwirth. Mechanisms of enveloped virus entry into cells. // Mol. Biol. Med. 1990, 7:17-31.

96. Kocylowski B. Wplyw czynnikow szodowiskowuch na zapalenie zgorzelinowe skrzeli karpia. // Gosp. Rubna, 1972, V.24, №1, s.9-11

97. Kolbl O., Die Schwimmblasenentzndung des Karpfens: Nachweis eines intrazytoplasmatisch wachsenden Einzelers mittels Gewebekultur. // Zsterreichs Fischerei. 1989, b.42. s.54-60

98. Krogsrud J., Hastein Т., Ranningen K. Infectious pancreatic necrosis virus in Norwegian fish farms. / In: Ahne W, Kurstak E (eds) Viruses of lower vertebrates. Springer Verlag, Berlin, 1989, p 284-291

99. Kudo S., Kurosava D., Kunimine I., Nobusawa K. a.o. // Jap. J. Ichtiology, 1975, 21, №4, p. 203-212

100. Kunst Lj. Kultura bubresnih stanica sarana. // Vet. Arhiv., 1962, V.32, №5-6, s.121-126

101. Kunst Lj., Fijan N., Preparation of primary monolayer cell cultures of carp ovary. // Vet. Arhiv., 1966, V.36, №7-8, s.235-238

102. Kurath G., Higman K.N., Bjorklund N.V. The NV genes of fish rhabdoviruses: development of RNase protection assays for rapid assessment of genetic variation // Vet. Res. 1995, v. 26, p. 477-485

103. Lannan C.N., Fryer J.L. Recommended methods for inspection of fish for the salmonid rickettsia. // Bull. Eur. Ass. Fish Patol. 1991, V.ll, №4,-p. 135-136

104. Li M.F., Stewart J.E. A quantitative study of the effects of naturally occurring supplements of the growth of rainbow trout (Salmo gairdneri) gonadal cells. // Can. J. Microbiol., 1965, v.ll, p. 9-14

105. Lorensen N., Olesen N.J., Jorgensen P.E. Neutralization of Egtved virus pathogenicity to cell cultures and fish by monoclonal antibodies to the viral G protein // J. Gen. Virology. 1990, v. 71, p. 561-567

106. Lorensen N. Affinity purification of the structural proteins of a fish rhabdovirus by the use of monoclonal antibodies // J. Virol. Methods. -1992, v. 38, p. 297-303

107. MacDonald R.D., Ringed plaque formation in infectious pancreatic necrosis correlates with defective interfering particle production. //J.Gen. Virol. 1978, 41, 523-528

108. MacDonald R.D., Kennedy J.C., Infectious pancreatic necrosis persistently infect Chinook salmon embryo cells independent of interferon. // Virology 1979, 95, 260-264

109. MacDonald R.D., Dobos P., Identification of the proteins encoded by each genome segment of IPNV. // Virology 1981, 114, 414-422

110. Malsberger R.G., Cerini C.P., Characteristics of infectious necrosis virus. //J. Bacteriology 1963, 86, 1283-1287

111. Malsberger R.G. Multiplication of infectious pancreatic necrosis virus. // Ann. New York Acad. Sci. 1965, 126, 320-327

112. McAllister P.E., Reyes X. // J. Fish Diseases, 1984, 7, № 4, p. 319-322

113. McAllister P.E. & Owens W.J. Assessment of the virulence of fish and molluscan isolates of infectious pancreatic necrosis virus for salmonid fish by challenge of brook trout, Salvelinus fontinalis (Mitchill). // J. Fish. Dis. 1995, 18, 97-103.

114. McKnight I. J. & Roberts R.J. The pathology of infectious pancreatic necrosis. I. The sequential histoparhology of the naturally occurring condition. // Br. Vet. J., 1976, 132, 76-85.

115. Melby H.P., Caswell-Reno P. & Falk K. Antigenic analysis of Norwegian aquatic birnavirus isolates using monoclonal antibodies with special reference to fish species, age and health status. // J. Fish Dis. 1994, 17, 85-91.

116. Miller N.W., Chinchar V.G., Clem L.W. Development of leukocyte cell line from the channel catfish (Ictalurus punctatus). // J. Tissue Culture Methods. 1994a V. 16. - p. 117-123

117. Miller N.W., Rycyzyn M.A., Wilson M.R., Warr G.W., Naftel J.P., Clem L.M. Development and characterization of cannel catfish long-term В cell lines. //J. Immunology. 1994b V. 152. - p. 2180-2189

118. Muller H.C., Scholtissek C., Becht H., The genome of infectious bursal diseases virus consist of two segments of double-stranded RNA. // J, Virology 1979, 31, 584-589

119. Nakajima K., Maeno Y., Arimoto M., Inouye K. & Sorimachi M. Viral deformity of yellowtail fingerlings. // Fish Pathol. 1993, 28, 125129.

120. Nims L., Fryer J.L. Pilcher K.S. Studies of replication of four selected viruses in two cell lines derived from salmonid fish. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1970, v. 135. p. 6-12

121. Novoa A., Figueras A., Puentes C.F., Ledo A. & Toranso A.E. Characterization of a birnavirus isolated from diseased turbot cultured in Spain. //Dis. Aquat. Org, 1993, 15, 163-169.

122. Office International des Epizootics, Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases, 3rd edition, Paris; The office 2000

123. Okamoto N., Sano Т., Hedrick R.P. & Fryer J.L. Antigenic relationships of selected strains of infectious pancreatic necrosis virus and European eel virus. // J. Fish Dis., 1983, 6, 19-25

124. Okamoto N., Tanigughi N., Seno Y. & Sano T. The relation between the change of quantities of infectious pancreatic necrosis virus in infected rainbow trout fry and the disease process.//Fish PathoL, 1984, 19, 1-4.

125. Okamoto N., Shirakura, Т., Nagakura Y., Sano T. The mechanism of interferon with fish viral infection in the RTG-2 cell line. // Fish Pathol. 1993, 18: 7-12

126. Olesen N. J., Jorgensen P.E.V., Bloch B. & Mellergaard S. Isolation of an IPN-like virus belonging to the serogroup II of the aquatic birnaviruses from dab (Limanda limanda). // J. Fish dis. 1998, 11, 449-451.

127. Pfitzner I., Grutzner L. In vitro-zuchtung des Canaden und Schwimmblasengewebes von Tinea vulgaris Cuv. (Schleie) in trypsinierten Einschichtgewebekulturen. // Zbl. Bakteriol., Parasitenk., Infektionskrankh. Und Hygiene, 1963, 191, №4, s. 474-485

128. Pfitzner I. Cell and tissue culture of fresh water fish in virus research. //Ann. N. Y. Acad. Sci., 1965, V.126, №1, p. 547-554

129. Pichugina T.D., Borisova M.N., Shcelkunova T.I., Shcelkunov I.S., Zavyalova E.A. First Report Of Spring Viremia Of Carp Virus At A

130. Fish Farm In Moscow Province, Russia // Second bilateral conference. Aquatic and Marine animal health. 2003, p. 20 (thesis)

131. Piper D., Nicholson B.L., Dunn J. Immunofluorescent study of the replication of infectious pancreatic necrosis virus in trout and atlantic salmon cell cultures. // Infection and Immunity, 1973, 8, №2, 249-254

132. Pudovkin D., Wahli T. Evaluation of requirements for successful in vitro maintenance of Ichthyophthirius multifiliis. / 10-th Intern. EAFP Conference «Diseases of Fish and Shellfish», Dublin, Ireland, 9-14 Sept. 2001. Abs. 85

133. Rachlin J.W. Perlmutter A., Seeley R.J. Monolayer culture of gonadal tissue of the Zebra danio, Brachydanio rerio. // Progr. Fish-Cult., 1967, V.29, №4 p.232-234

134. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. // Amer. J. Hyg. 1938, V.27., №3, p. 493-497

135. Regenmonel V., Fauquet M.H.V., Bishop C.M., Carstens D.H.L., Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses Seventh Report of the Internetional Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, CA. - 2000

136. Reno P. W. Infectious pancreatic necrosis virus and its virulence. / In: Fish Diseases and Disorders. Vol. 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections, Woo P.T.K. & Bruno D. W., eds. CABI Publishing, Wallingford, UK, 1999, 1-55.

137. Roberts F.L. Fibroblast culture of gonads of Clupea harengus. // Nature, 1966, v.212, №5070, p.1592-1593

138. Roberts R.J., McKnight I.J. The pathology of infectious pancreatic necrosis virus. II. Stress-mediated recurrence. // Br. Vet. J. 1976, 132:209-213

139. Rode M., T. Berg and T. Gjeen. Effect of temperature on endocytosis and intracellular transport in the cell line SHK-1 derived from salmon head kidney. //Сотр. Biochem. Physiol. 1997, 117:531-537.

140. Rodger H.D. & Frerichs G.N. Clinical infectious pancreatic necrosis virus infection in farmed halibut in the United Kingdom. // Vet. Rec. 1997, 140, 401-402.

141. Rodriguez S., Vilas M.P., Alonso M., Perez S.I. Study of a viral-dual infection in rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) by seroneutralization, western blot and polymerase chain reaction assay. // Microbiologia SEM 1995, 11: 461-470

142. Sasson A. Biotechnologies: challenges and promises, 2nd edition, Unesco, 1987

143. Shcelkunov I.S., Popova A.G., Shcelkunova T.I., Oreshkova S.F., Pichugina T.D., Zavyalova E.A., Borisova M.N. First Report Of Spring Viremia Of Carp Virus In Moscow Province, Russia // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 25 (5) 2005, p. 203-211

144. Shutse H., Mundt E., Mettenleiter T.C. Complete genomic seguence of viral hemorrhagic septicemia virus, a fish rhabdovirus // Virus Genes. 1999. - v. 19, p. 59-65

145. Scherrer R., Bic E., Cohen J. Le virus de la necrose pancreatique infectieuse: etude de la replication et de l'introduction de la synthese d'interferon en fonction de l'hote et de la temperature. // Ann. Microbiol. 1974, 125:455-467

146. Sigel M.N., Beasley A.R., Trypsin C. Marine teleost fish tissues. // Tissue Cult. Meth. And Appl., New York, 1973, p. 12-14

147. Silim A., Etazhary M. A. S. Y. & Lagace A. Susceptibility of trouts of different origin to various isolations of infectious transformation in Atlantic salmon (Salmo salar L.) and subsequent performance in seawater. //Aquaculture 1982, 121, 13-27.

148. Smail D.A, Bruno D.W., Dear G., McFarlane L.A., Ross K. Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus Sp serotype in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L., post-smolls associated with mortality and clinical disease. //J. Fish Dis. 1992, 15:77-83

149. Snow M., Gunningham С.О., Melvin W.T., Kurath G. Analysis of the nueleoprotein gene identifies distinct lineages of viral hemorrhagic septicemia virus within the European marine environment. //Vims Res. 1999, v. 63, p. 35-44

150. Sommer A.-I., Mennen S. Multiplication and haemadsorbing activity of infectious salmon anaemia virus in the established Atlantic salmon cell line. // J. Gen. Virology 1997, 78: 1891-1895

151. Soriamachi M., Sako H. // J. Fish Patology, 1982, 17, №2 p. 115118

152. Soustegard R.A. & Soustegard K.S. Establishment of a cell line from lymphosarcoma of the muskellunge (Exos masquinougy). // In Vitro 1973, 8: 410

153. Stangeland K., Hoie S., Taksdal T. Experimental induction of infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmon, Salmo salar L. post-smolts. //J. FishDis. 1996, 19:323-327

154. Suzuki S., Nakata Т., Kamakura M., Yoshimoto M., Furucawa., Yamashita Y., & Kusuda R., Isolation of birnavirus from agemaki (jack knife clam) Sinonovacura contricta and survey of the virus using PCR technique. //J. Fisheries Science, 1997, 63, 563-566

155. Suzuki S., Kamakura M. & Kusuda R. Isolation of birnavirus from Japanise pearl oyster Pinctada fucata // J. Fisheries Science, 1998a, 64, 3941

156. Suzuki S. & Nojima M. Detection of marine birnavivirus in wild molluscan shellfish species from Japan. // J. Fish Patology, 1999, 34, 121125

157. Teninges D., Ohanessian A., Richard-Molard C., Contamine D., Isolation and biological properties of Drosophila X virus. // J. Gen. Virology 1979, 42, 214-254

158. Townsley P.M. Wight H.C., Scott M.A. Marine fish tissue culture. // J. Fish. Res. Board Can. 1963, V.20, №3, p. 679-684

159. Underwood В.О., Smale C.J. & Brown F. Relationship of a virus from Tellina tenuis to infectious pancreatic necrosis virus. // J. Gen. Virol. 1977, 36, 93—109.

160. Vilas M.P., Rodriguez S., Perez S. A case of coinfection of IPN and IHN virus in farmed rainbow trout in Spain. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1994, 14: 1-4

161. Wakabayashi N., Egusa S. Primary monolayer culture of cells derived from kidney tissue of the Japanise eel. // Bull. Japan. Soc. Scient. Fish. 1969, V.35, № 4, p.358-361

162. Way K. Rapid detection of SVC virus antigen in infected cell cultures and clinically diseased carp by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).J. Appl. Ichthyol., 1991, 7, 95—107.

163. Wergeland H.I., Jakobsen R.A., A salmonid cell line (TO) for production of infectious salmon anaemia virus (ISAV). // Diseases of Aquatic Organisms 2001, 44: 183-190

164. Wolf K., Dunbar C.E. Cultivation of adult teleost tissue in vitro. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1957, V.95, №3, p.455-457

165. Wolf K., Dunbar C.E., Snieszko S.F., // Progr. Fish Cult., 1960(a), 22, №2, p.64-68

166. Wolf K., Snieszko S.F., Dunbar C.E. & Pyle E. Virus nature of infectious pancreatic necrosis virus in trout. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1960(b), 104, 105-108.

167. Wolf K., Quimby M.C., Pyle E.A., Dexter R.P.// Science, 1960(c) 32, №3443. p. 1890-1891

168. Wolf К., Quimby M.C. Established eurythermic line of fish cells in vitro. // Science, 1964, v. 135, №3508, p. 1065-1066

169. Wolf K., Vestergard-Jorgensen P.E. Salmonid viruses: double infection of RTG-2 cells with Egtved and infectious pancreatic necrosis viruses. //Arch Ges. Virusforsch 1970, 29:337-342

170. Wolf K., Mann J. A. Poikilotherm vertebrate cell line and viruses: a current listing for fishes. // In Vitro, 1980 , 16, №2 p. 168-179.

171. Wolf K. Fish Viruses and Fish Viral Diseases. Cornell University Press, Ithaca, NY, USA, 1988, 476 pp.

172. Wood E.M., Snieszko S.F., Yasutake W.T. // A.M.A. Arch. Patol., 1955, 60, №1, p. 26-28