Тканеспецифические мембранотропные биорегуляторы, выделенные из печени и легкого млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Мальцев, Дмитрий Игоревич

• Мальцев, Дмитрий Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мальцев, Дмитрий Игоревич

Оглавление

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Строение печени, легкого позвоночных: анатомия, клеточный состав

1.1.1 Строение печени позвоночных

1.1.2 Строение легкого позвоночных

1.2 Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические 27 биорегуляторы

1.3 Биологическая активность МГТБ

1.4 Физико-химические свойства и строение МГТБ 51 Глава 2 Материалы и методы 5

2.1 Получение тканевых экстрактов

2.2 Получение супернатантов тканевых экстрактов

2.3 Определение концентрации белка

2.4 Определение мембранотропной активности при кратковременном 60 органном культивировании печени и легкого мыши in vitro

2.5 Электрофорез белковых фракций в полиакриламидном геле

2.6 Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле

2.7 Определение вторичной структуры с помощью метода кругового 64 дихроизма

2.8 Определение размеров частиц методом динамического лазерного 65 светорассеяния

2.9 Обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

2.10 Роллерное органотипическое культивирование печени тритона in 66 vitro

2.11 Приготовление гистологических срезов

2.12 Методы иммунохимического анализа

2.13 Окрашивание на клеточную гибель методом TUNEL

2.14 Морфометрическая оценка гистологических срезов

2.15 MALDI —TOF масс-спектрометрический анализ 69 Глава 3 Результаты и их обсуждение

3.1 Получение тканевых экстрактов, содержащих биорегуляторы, 70 отдельных их фракций; исследование мембранотропной активности.

3.2 Исследование биологической активности образцов "фракция 95 осадка+супернатант экстракта ткани"

3.3 Изучение состава и структуры биорегуляторов, выделенных из 98 тканей млекопитающих.

3.4 Исследование биологической активности экстрактов и отдельных их 115 фракций на модели роллерной органотипической культуры печени

тритона in vitro

Заключение

Выводы

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тканеспецифические мембранотропные биорегуляторы, выделенные из печени и легкого млекопитающих»

Введение

Актуальность работы

Изучение различных биорегуляторов является чрезвычайно важной задачей современной биологии, в том числе биофизики. Большой интерес для исследователей представляют так называемые мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы (МГТБ), обнаруженные в животных, растительных тканях, в микроскопических грибах. МГТБ в сверхмалых дозах (СМД) влияют на важнейшие биологические процессы (адгезия, миграция, пролиферация, дифференцировка клеток, биосинтез и тд.) и по сути должны обеспечивать состояние органо-тканевого гомеостаза. На их основе разработаны фармакологические препараты нового поколения.

Ранее было показано, что МГТБ присутствуют в различных тканях млекопитающих, в том числе, в тканях печени и легкого. Показано, что биорегуляторы данной группы локализованы в межклеточном пространстве и проявляют мембранотропное действие - изменяют вязкоупругие свойства и проницаемость плазматической мембраны клеток. Биорегуляторы были объединены в отдельную группу на основании сходства их физико-химических свойств и характера биологического действия. МГТБ присутствуют в растворах в виде наноразмерных частиц, содержащих белки, углеводы, липиды. Показано, что белковая компонента ответственна за проявление МГТБ биологической активности, причем основную роль в этом играют небольшие пептиды молекулярной массой не более 6 кДа. Было показано, что действие данных биорегуляторов носит тканеспецифический характер: биорегуляторы влияют на биологические процессы только в ткани - источнике их выделения. Однако молекулярные основы тканевой специфичности до сих пор остаются мало изученными.

Цель работы

Целью данного исследования являлось изучение тканевой специфичности действия биорегуляторов, выделенных из тканей печени и легкого млекопитающих.

В отдельные задачи исследования входило:

• получить фракции, содержащие биорегуляторы тканей печени и легкого млекопитающих;

• изучить тканевую специфичность биологического действия отдельных фракций биорегуляторов, выделенных печени и легкого, на двух экспериментальных моделях in vitro: определения мембранотропной активности и роллерного органотипического культивирования печени тритона Pleurodeles waltl;

• изучить методами электрофореза, обращенно-фазовой ВЭЖХ и масс-спектрометрии состав отдельных фракций МГТБ;

• исследовать белки-модуляторы, входящие в состав МГТБ, выделенных из тканей печени и легкого крыс;

• изучить методами иммуногистохимии состояние печени тритона до и после действия биорегуляторов;

• изучить влияние лекарственных веществ, проявляющих гепатопротекторные свойства, на модели роллерного органотипического культивирования печени тритона Pleurodeles waltl in vitro.

Научная новизна

Показано, что в тканях печени, легкого млекопитающих присутствуют биорегуляторы, белковой природы, имеющие сложное строение, биологическое действие которых проявляется в СМД и характеризуется наличием тканевой, но не видовой специфичности. Биорегуляторы могут быть выделены как из свежеприготовленной ткани, так и из ткани, предварительно подвергшейся замораживанию. Показана тканевая специфичность мембранотропной активности фракций биорегуляторов, выделенных из печени, легкого и тонкого кишечника. Впервые показано, что

в осадках тканевых экстрактов, полученных после высаливания белков сернокислым аммонием, присутствуют белки, влияющие на характер биологической активности низкомолекулярных пептидов - модуляторы. Методами масс-спектрометрии установлено, что данные биорегуляторы относятся к семейству сывороточных альбуминов. Впервые продемонстрировано отсутствие корреляции в биологическом действии МГТБ на модели мембранотропной активности и на модели роллерного органотипического культивирования. Продемонстрирована тканевая специфичность действия биорегуляторов на модели роллерного органотипического культивирования. Впервые методами иммуногистохимии проведена оценка состояния ткани тритона после роллерного органотипического культивирования. Впервые продемонстрирована локализация макрофагального антигена человека на поверхности клеток печени тритона.

Практическая значимость работы.

Изученные МГТБ могут быть использованы в качестве основы для создания фармакологических и профилактических препаратов нового поколения для нормализации функций печени и легкого. Полученные данные указывают на возможность применения модели роллерного органотипического культивирования печени тритона in vitro для поиска новых гепатопротекторных веществ. Результаты данного исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии и клеточных технологиях.

Структура и объем диссертации

Работа имеет традиционную структуру, она состоит из:

Введения, в котором представлены актуальность, научная новизна, практическая значимость работы; главы «Литературный обзор», в которой содержатся данные по строению печени, легкого млекопитающих, представлен обзор литературы, включающий описание физико-химических свойств МГТБ, характера их биологической активности; главы

«Экспериментальная часть», в которой содержится описание примененных методов исследования; главы «Результаты и их обсуждение», в которой представлены результаты исследования и их обсуждение, а также заключения и выводов.

Диссертационная работа содержит 169 страниц, 46 рисунков, 21 таблицу, 220 литературных ссылок. Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 6 в сборниках научных трудов, 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Список сокращений

МГТБ - мембранотропные гомеостатические тканеспецифические

биорегуляторы

ВКМ- внеклеточный матрикс

СМД- сверхмалые дозы

пм- плазматическая мембрана

мк- межклеточные контакты

ИЭФ- изоэлектрофокусирование

вэжх- высокоэффективная жидкостная хроматография

щ- круговой дихроизм

ЭДТА - этилендиаминотетрауксусная кислота

ПАЛГ- полиакриламидный гель

ЯМР- ядерно-магнитный резонанс

MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight

НГПП— клетки- небольшие гепатоцитоподобные прогениторные клетки

КК- клетки Купфера

BADJ- bronchioloalveolar duct junction

АБ- адгезивные белки

ТЭМ- Трансмиссионная электронная микроскопия

ПЭ- пигментный эпителий

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Строение печени, легкого позвоночных: анатомия, клеточный состав

Печень и легкое, а также кишечник, позвоночных имеют общее энтодермальное происхождение - они являются производными первичной кишки.

В настоящем разделе будут рассмотрены основные данные, касающиеся анатомического, клеточного строения печени и легкого млекопитающих. Будут представлены результаты современных исследований о клеточных источниках регенерации в этих органах, а так же строения межклеточного пространства [Афанасьев, 1999; Хем, 1983; Kmiec, 2001]. Отдельно будет рассмотрено строение печени амфибий. 1.1.1 Строение печени позвоночных

У всех позвоночных животных печень является крупной железой пищеварительного тракта, осуществляющей различные биохимические реакции, определяющие жизнедеятельность организма.

Функции печени чрезвычайно разнообразны: в ней осуществляются процессы детоксикации, синтеза многих сывороточных белков, инактивируются гормоны, биогенные амины. Печень участвует в защитных реакциях организма против микробов и чужеродных веществ в случае проникновения их извне [Хем, Кормак, 1983]. Здесь метаболизируется железо и образуется желчь, необходимая для пищеварения. В печени накапливаются необходимые для организма жирорастворимые витамины — А, D, Е, К и др. Кроме того, в эмбриональном периоде у млекопитающих, а у амфибий во взрослом состоянии, печень является местом активного кроветворения [Sichel et al., 2002]. Печень - регенерирующий орган, например при частичной гепактэктомии (до 2/3 частей ткани), этот орган восстанавливается полностью.

Развитие.

Считается, что предшественники гепатоцитов у млекопитающих выселяются в мезенхиму поперечной перегородки из эпителия двенадцатиперстной кишки эмбриона. Из эпителиальных клеток образуются гепатобласты/гепатоциты и холангиоциты, а из клеток мезенхимы дифференцируются синусоидные клетки [Tremblay, Zar et, 2005]. Зачаток печени образуется в конце 3-й недели эмбриогенеза и имеет вид мешковидного выпячивания вентральной стенки туловищной кишки (печеночная бухта), врастающего в брыжейку. На определенных этапах развития часть гепатобластов, расположенных вокруг сосудов, образуют так называемую протоковую пластинку, из клеток которой формируются внутрипеченочные желчные протоки [Chistiakov, 2012]. Дифференцировка клеток печени у млекопитающих заканчивается в раннем постнатальном периоде.

Развитие печени амфибий, как у остальных позвоночных, начинается с выпячивания центральной стенки двенадцатиперстной кишки [Воронцова и др., 1952]. Передняя часть этого выпячивания образует печеночную паренхиму, а задняя - желчный пузырь и его выводной проток. Печеночная паренхима развивается сначала по типу ветвящейся трубчатой железы: из стенки выпячивания вырастают многочисленные трубки, которые, местами срастаясь, превращаются в сплетение железистых канальцев. Одновременно между ними развивается сеть кровеносных сосудов. Паренхима печени у амфибий довольно долго сохраняет трубчатую структуру и только на предшествующих метаморфозу стадиях приобретает присущее печени взрослых амфибий компактное строение [Chalmers, Slack, 2000] . Строение печени млекопитающих

Поверхность печени покрыта соединительнотканной капсулой, которая плотно срастается с висцеральным листком брюшины.

В последнее время в науке появилось представление о гистофункциональных единицах печени, отличных от классических печеночных долек. В качестве

таковых рассматриваются портальные печеночные дольки и печеночные ацинусы. Портальная печеночная долька включает сегменты трех соседних классических печеночных долек, окружающих триаду. Поэтому она имеет треугольную форму, в ее центре лежит триада, а на периферии, т.е. по углам, — вены (центральные). В связи с этим в портальной дольке кровоток по кровеносным капиллярам направлен от центра к периферии. Печеночный ацинус образован сегментами двух рядом расположенных классических долек, благодаря чему имеет форму ромба. У острых его углов проходят вены, а у тупого угла — триада, от которой внутрь ацинуса идут ее ветви. От этих ветвей к венам направляются гемокапилляры. Таким образом, в ацинусе, так же как и в портальной дольке, кровоснабжение осуществляется от его центральных участков к периферическим [Афанасьев, 2002]. Печеночные клетки, или гепатоциты, составляют 60% всех клеточных элементов печени. Они выполняют большую часть функций, присущих печени. Гепатоциты имеют неправильную многоугольную форму. Диаметр их достигает 20—25 мкм. Многие из них (до 20 % в печени человека) содержат два ядра и больше. Ядра гепатоцитов круглой формы, величина их колеблется от 7 до 16 мкм. [MacPhee, 1995].

К другим клетками печени относятся: эндотелиоциты, клетки Купфера или звездчатые ретикулоциты, липоциты или клетки Ито и pit-клетки [Щеголев, Миилнев, 1991; Gendrault et al., 1982].

Синусоиды сформированы эндотелиоцитами [Yee, Revel, 1975]. Здесь обеспечивается постоянная фильтрация и отбор частиц и веществ, поступающих из русла крови, в перисинусоидальное пространство [Henriksen et al., 1984].

Клетки Купфера (КК) являются макрофагами, происходящими от циркулирующих в крови предшественников макрофагов - моноцитов [Xем, Кормак, 1983]. Кроме способности поглощать различные клетки, бактерии, вирусы, мультимолекулярные комплексы, макромолекулы и продукты их распада, токсины и др. КК, как это и свойственно макрофагам, участвуют в

секреции большого количества важнейших белков, в том числе ряда цитокинов, факторов гемопоэза, фибронектина, эритропоэтина, компонентов комплемента [Щеголев, Мишнев, 1991; Gendrault et al., 1982]. КК осуществляют активацию гормонов (инсулина, кортикостероидов), оказывают влияние на рост и регенерацию гепатоцитов, а также на регуляцию структурного гомеостаза печени. Форма КК вариабельная, амебовидная или звездчатая, на поверхности этих клеток имеются выросты. В синусоиде каждая отдельная клетка заключена в эндотелиальную выстилку [Sicheletal., 2002].

К звездчатым макрофагам и эндотелиальным клеткам со стороны просвета синусоидов прикрепляются с помощью псевдоподии ямочные клетки (pit-клетки). В их цитоплазме, кроме органелл, присутствуют секреторные гранулы. Эти клетки относятся к большим гранулярным лимфоцитам, которые обладают естественной киллерной активностью и одновременно эндокринной функцией. Основная часть ямочных клеток находятся в зонах, окружающих сосуды портального тракта. Благодаря этому ямочные клетки в зависимости от условий могут осуществлять противоположные эффекты: например, при заболеваниях печени они, как киллеры, уничтожают поврежденные гепатоциты, а в период выздоровления, подобно эндокриноцитам (апудоцитам), стимулируют пролиферацию печеночных клеток [Kmiec, 2003].

Холангиоциты образуют эпителий желчных протоков. Просвет холангиол образован не более чем 2-3 клетками, а стенка желчного протока -всегда большим количеством холангиоцитов, которые по своей морфологии являются типичным эпителием, имеют базальную мембрану. Аналогично строению протоков различных желез, в печени клетки мелких желчных протоков представлены низким кубическим эпителием; стенки более крупных протоков, входящих в состав портальных трактов, образованы кубическим эпителием, а стенки еще более крупных протоков -цилиндрическим. Между кровеносными и желчными капиллярами нигде нет

непосредственной связи, так как их отделяют друг от друга печеночные и эндотелиальные клетки. Только при заболеваниях (паренхиматозная желтуха и др.), связанных с повреждением и гибелью части печеночных клеток, желчь может поступать в кровеносные капилляры.

Перисинусоидалъные липоциты (лшоциты, клетки Ито). Это клетки небольшого размера 7—10 мкм, располагаются между соседними гепатоцитами. Они постоянно содержат не сливающиеся между собой мелкие капли жира, имеют много рибосом и единичные митохондрии. Количество перисинусоидальных липоцитов может резко возрастать при ряде хронических заболеваний печени. Данные клетки являются основными продуцентами компонентов ВКМ печени, осуществляя синтез и секрецию коллагенов I, III и IV типов, фибронектина, ламинина и протеогликанов [Clement et al., 1988]. Строение печени тритона

Печень тритона имеет удлиненную форму и расположена между желудком и стенкой брюшины [Воронцова и др., 1952]. На обращенном к хвосту крае, имеется пальцеобразный отросток, который, представляет собой задний отдел левой доли печени. У тритона левая и правая доли разделяются бороздкой на брюшной поверхности, где прикрепляется серповидная связка. Задний край правой доли печени разделен вырезкой, за которой располагается желчный пузырь. От спинной поверхности печени отходит длинный шиловидный отросток, выходящий около желчного пузыря, из под заднего края печени и продолжающийся в хвостовом направлении. Часть задней поверхности печени срастается с поджелудочной железой в области, где проходят выводные протоки печени - печеночные и пузырный, несущие желчь в желчный проток, который проходит через массу поджелудочной железы и открывается в двенадцатиперстную кишку. Гистологическое строение печени тритона характеризуется наличием специфических клеток печеночной паренхимы, которая пронизана сетью кровеносных и желчных капилляров, а снаружи покрыта глиссоновой капсулой, состоящей из

фиброзных волокон и перитонеального эпителия. К железистым клеткам печени доставляется венозная кровь, содержащая пищевые вещества из кишечника и продукты распада красных кровяных телец из селезенки. Железистые клетки паренхимы печени, наряду с другими секретами, продуцируют желчь, которая через тончайшие желчные капилляры, проходящие между клетками, изливается в желчные протоки. Клетки печеночной паренхимы имеют неправильно многоугольную форму, иногда округленные края и очень большие размеры. Протоплазма содержит включения в форме капель и гранул - главным образом жир и гликоген. Обычно расположение печеночных клеток в виде балок и радиальное расхождение последних от центра дольки у тритона заметно, хоть и не так отчетливо, как у млекопитающих. Вообще же паренхима печени у тритона отличается большой компактностью и довольно сильно отклоняется от исходного трубчатого типа строения, приближаясь в этом отношении больше, чем у других амфибий к характеру строения печени млекопитающих. Снаружи печень тритонов под глиссоновой капсулой содержит довольно толстый кортикальный слой в 5-10 клеточных диаметров, называемый иногда краевой зоной и состоящий из соединительно-тканных клеток, расположенных на поверхности печеночной паренхимы. Клетки кортикального слоя бедны протоплазмой, имеют довольно крупные ядра разнообразной формы, которые часто сегментированы. В общем, по своему строению эти клетки близки к элементам белой крови, что связано с кроветворной функцией кортикального слоя. Среди них нередко встречаются митозы, особенно у личинок. Прилегающая к паренхиме поверхность кортикального слоя имеет неровный контур, так как группы кортикальных клеток погружаются в виде зубцов между клетками паренхимы: они обычно окружаются скопления пигментных клеток, которыми так богата строма печени тритона. Пигментные клетки расположены и в кортикальном слое и в паренхиме печени группами в виде темно-бурых или черных масс, окруженных, как уже упомянуто, соединительно-тканными клетками,

идентичными кортикальным. Количество пигмента в печени значительно уменьшается ко второй половине зимы и увеличивается весной и летом [Barni, 1999]. Кроме того, в конце лета в печени тритонов накапливается много жира, который заполняет почти целиком многие клетки и изменяет характер окраски печени в целом, а также ее гистологических срезов, растворяясь при обычной их обработке. Предполагается, что пигментированные клетки печени амфибий, за исключением синтеза меланина являются аналогом ЮС млекопитающих [Sichel, 2002].

Далее в обзоре будут рассмотрены функции меланомакрофагов печени амфибий, так как они являются объектом изучения в данной работе. Макрофаги печени амфибий

В 1972 году была разработана концепция существования мононуклеарно-фагоцитарной системы, согласно которой КК можно отнести к макрофагам печени [van Furth, 1972]. В отличие от тщательно изученных КК млекопитающих, КК амфибий исследованы недостаточно. Для КК печени млекопитающих было установлено, что они локализованы в эндотелиальных стенках печеночных синусоидов, будучи закрепленными на эндотелиальных клетках, иногда выступают в просвет синусоида. Пигментированные КК амфибий накапливаются в большом количестве в портальной области, где они образуют крупные, а зачастую и очень крупные кластеры [Cicero et al., 1982].

Основными характеристиками, отличающими КК от других синусоидальных клеток, является наличие определенных ферментов, таких как неспецифическая эстераза и эндогенная пероксидаза, а также проявление фагоцитарной и пиноцитарной активности [Sichel, 2002]. Пигментированные клетки печени амфибий могут быть разделены на две группы - большие и маленькие. Ключевым отличием двух групп клеток является наличие телец включения, которые существуют только в крупных КК [Sichel et al., 1991]. Однако ультраструктура КК печени амфибий недостаточно изучена: как правило, внимание исследователей было

сконцентрировано на вопросах, связанных с их фагоцитарной активностью

[Fey, 1967; Turner, 1969; Campbell, 1970; Curtis et al. 1979; Zapata et al. 1982; Sichel et al 1997; Guida et al 1998].

Было показано, что пигментация КК амфибий обусловлена присутствием меланосом, синтезирующих меланин. Кроме того, КК амфибий могут фагоцитировать фрагменты эритроцитов, за счет этого в них присутствуют окрашенные железо-содержащие комплексы [Sichel et al, 1991]. В этом аспекте интересно будет отметить, что если объектом фагоцитоза являются не живые клетки, а частицы неорганических веществ, фагоциты предварительно делают объект «приемлемым» для осуществления процесса поглощения, обволакивая его компонентами межклеточного матрикса, который они продуцируют. Хотя фагоциты способны поглощать разного рода «неподготовленные» объекты, наибольшей интенсивности фагоцитарный процесс достигает при условии опсонизации — фиксации на поверхности объектов таких молекул, для которых у фагоцитов имеются специфические рецепторы [Ярилин, 1999].

На основании этих характеристик КК амфибий были разделены на две группы - большие и малые клетки. Малые КК распространены в эндотелии и имеют размер 13.5*4.5 мкм, большие КК расположены в портальных зонах и имеют размер 18*11 мкм.

При культивировании для малых КК показано, что на открытой мембране расположены различные структуры, например, немногочисленные микровилли, ламелоподии и филоподии. Напротив, для больших КК показано большое количество микровиллей на мембране и немного филоподий и ламелоподий. Для обоих клеточных типов показано наличие впячиваний на поверхности мембран. В периферийной цитоплазме обнаружены везикулы и вакуоли, содёржащие электроноплотный материал, а так же показано присутствие пустых вакуолей во всей цитоплазме. В малых и больших КК органеллы имеют разное распределение. В малых КК митохондтрии равномерно распределены, но в больших КК они в

большинстве своем расположены вокруг телец включения (например липофусциновые гранулы). В малых КК большое количество сплющенных или небольших вакуолей равномерно распределенных по цитоплазме, а в больших КК - они сосредоточены возле ядра. Комплекс Гольджи, хорошо развитый в малых КК, не так часто встречается в цитоплазме больших КК. Также известно, что червеобразные структуры, описанные для КК млекопитающих, отсутствуют в КК печени амфибий [Sichel et al., 1991]. Оба типа клеток содержат одно ядро. В малых КК оно находится почти в центре клетки, а в больших КК печени амфибий, оно расположено почти у клеточной мембраны. Оба типа клеток проявляют активность кислой фосфатазы, которая локализована главным образом на мембранах лизосом, а так же на мембранах меланосом, рассматриваемых как специализированные лизосомы [Orlow, 1995, 1967; Robinson and Karnowsky, 1983; Schraermeyer and Stieve, 1991].

Пиноцитоз и фагоцитоз КК амфибий

Пиноцитоз - это процесс, с помощью которого клетки поглощают вещества, находящиеся в растворе. Ранее для изучения клеток in vivo вводили такие красители как трипановый синий, кармин, с целью выявления способности клеток усваивать их.

Макрофаги печени являются важными участниками иммунной системы, так как они выполняют очистку циркулирующей жидкости от различных частиц, бактерий, паразитов и старых эритроцитов. Фагоцитоз КК амфибий, изученный с помощью ТЭМ (трансмиссионная электронная микроскопия), оказывается похожим на фагозитоз КК млекопитающих по ряду ультраструктурных признаков. Ламелоподии и псевдоподии часто видны в контакте с интернализируемой частицой с последующим образованием вакуолей и формированием фагосом.

В пигментированных клетках печени амфибий были описаны железосодержащие частицы [David, Fraytag, 1963]. Считается, что они содержат гидрофосфат железа [Van Eijk and De Yong, 1992]. Кроме того, в

пигментированных клетках печени амфибий показано наличие гемосидерина [Iancu, 1992]. В отличие от КК млекопитающих, для которых присутствие железа можно наблюдать только при патологиях, в КК амфибий обнаруживается значительное количество железа при нормальном развитии. Известно, что меланин защищает клетки от избыточного окисления липидов - процесса, сопровождающего развитие любой патологии [Corsaro, 1995].

Регенерация печени.

Печень обладает большими возможностями для регенерации, необходимой при хирургических вмешательствах или при возникновении некроза ткани. Было установлено, что при регенерации после частичной гепатоэктомии, а так же при интоксикации четырехлористым углеродом, и заболеваниях печени и вирусных гепатитах, плоидность гепатоцитов значительно увеличивается, кроме того в оставшейся неповрежденной ткани наблюдается значительная гипертрофия [Бродский, Урываева, 1981, Seglen, 1997]. Длительное время полагали, что эти процессы являются основными в регенерации печени млекопитающих.

Однако было установлено, что в зависимости от повреждений печени в ней может быть активирован целый ряд различных клеточных типов [Coleman ,2002.]. Это, очевидно, означает, что клеточными источниками регенерации в печени могут быть как малодифференцированные клетки, которые способны к дальнейшей дифференцировке в различные фенотипы клеток печени, так и дифференцированные клетки (гепатоциты), которые после дедифференцировки способны пролиферировать [Ямскова и др., 2008].

Результаты научных исследований позволяют квалифицировать гепатоциты как унипотентную коммитированную популяцию стволовых клеток, способных поддерживать постоянство структуры и функции печени при повреждении любой этиологии. Факторы, продуцируемые как самой печенью, так и внепеченочными тканями, взаимодействуя между собой и со специфическими рецепторами клеточных мембран, регулируют этот компенсаторный механизм [Гарбузенко, 2008].

В случае тяжелых форм повреждения ткани печени для пролиферации гепатоцитов активируется стволовой прогениторный компартмент [Monga, 2011а]. Недавние исследования показали, что существует, по меньшей мере, две клеточные популяции, которые могут быть активированы с целью образования новых гепатоцитов и\или холангиоцитов. Поврежденная ткань печени содержит популяции нормальных, находящихся в покое и недифференцированных стволовых прогениторных клеток, которые располагаются в/или вокруг желчных протоков портальных участков, и которые могут быть активированы при определенных патологических повреждениях [Tatematsu, 1985]. Кроме того, печень взрослых животных содержит популяцию неполностью дифференцированных небольших гепатоцит-подобных прогениторных клеток, которые могут быть активированы для восстановления утерянных гепатоцитов при некоторых формах повреждения ткани печени [Gordon, 2000]. Эти наблюдения позволили утверждать, что в печени взрослых крыс существует,, по меньшей мере, три популяции клеток, обладающие возможностями стволовых клеток. Возможно, что все эти три популяции стволовых прогениторных клеток печени взрослых животных происходят из одной уже существующей клеточной популяции развивающейся печени. Далее будут рассмотрены доказательства существования каждой из этих популяции стволовых прогениторных клеток печени.

Дифференцированные гепатоциты и эпителиальные клетки печени Активация недифференцированных прогениторных клеток после потери определенного числа клеток не происходит в случае, если зрелые гепатоциты и эпителиальные клетки печени способны пролиферировать для восстановления нормальной массы ткани печени и ее структуры [Klinman , 1963; Dabeva, et al, 1993]. Например, у крыс, у которых хирургически частично была удалена печень, наблюдалось быстрое увеличение числа гепатоцитов, что способствовало восстановлению их нормального числа [Tatematsu, et al., 1984; Grisham, 1969; Fabrikant, 1968]. Аналогично, после

частичного удаления печени также наблюдали увеличение пролиферативной активности эпителиальных клеток печени с образованием внутрипеченочной системы протоков [Grisham, 1962, 1993; Polimeno, Zeng et al., 1995]. Независимо от их расположения (перипортальное, перицентральное) все гепатоциты пролиферилировали в ходе восстановления нормального их числа. [Fabrikant, 1969; Stocker, 1971]. Способность покоящихся гепатоцитов являться источником пролиферативного пула в ответ на повреждение ткани печени всегда вызывала у исследователей много дискуссий. Наблюдения показали, что при последовательном пятикратном частичном удалении ткани печени у крыс гепатоциты пролиферировали, по меньшей мере, 8-12 раз на протяжении всего периода восстановления ткани печени [Simpson, 1963]. В других исследованиях было показано, что трансплантированные гепатоциты также пролиферируют в процессе восстановления ткани печени животного [Overturf, 1996]. Таким образом, многие исследователи полагают, что дифференцированные гепатоциты и эпителиальные клетки печени проявляют невероятно высокую пролиферативную активность, что позволяет отнести их стволовым прогениторным клеткам печени [Monga, 2011]. Небольшие гепатоцит-подобные прогениторные клетки

Существует достаточно большое число экспериментальных моделей, позволяющих изучить пролиферативную активность гепатоцитов. Рассмотрим модель частичной гепатоэктемии у крыс с ретрорзин инициированным повреждением печени [Gordon, 2000]. Аналогично другим моделям воздействия химических веществ на ткань печени [Coleman, 1998; Grisham, 1997], системное воздействие ретрорзина, члена ряда пирролизидиновых алкалоидов, приводит к мощнейшему ингибированию репликативной способности зрелых гепатоцитов [Gordon, 2000; Laconi Е, 1998; Oren, 1999]. При частичном удалении ткани печени [Gordon, 2000; Laconi et al., 1998; Dabeva et al., 1998] или некрозе [Jago, 1969] ретрорзин-инициированные гепатоциты синтезируют ДНК, но не способны завершить митоз и превращаются в гигантские клетки не способные пролиферировать

(мегалоциты). В этой модели ни зрелые гепатоциты, ни овальные клетки не в состоянии пролиферировать так, чтобы полностью восстановить ткань печени. Однако восстановление ткани печени все же происходит. Регенерация ткани осуществляется благодаря быстрому увеличению популяции небольших гепатоцит-подобных прогениторных клеток (НГ1111-клетки). После частичного удаления участка ткани НГПП-клетки появляются во всех областях долек печени (околопортальной, перицентральной и в средней части печени) и являются производными небольших овальных клеток, образующихся в перипортальных областях печени. Авторы исследования предполагают, что НГПП-клетки представляют собой новую клеточную популяцию [Gordon, 2000]. НГПП-клетки морфологически больше похожи на дифференцированные (но небольшие) гепатоциты на ранних этапах после проведения гепатоэктемии. Данный факт позволяет предположить, что НГПП-клетки являются субпопуляцией ретрорзин устойчивых гепатоцитов и не являются новой популяцией прогениторных клеток. Однако, фенотип НГПП-клеток указывает на то, что они фактически отличаются от полностью дифференцированных гепатоцитов [Gordon 2000]. Проведенные исследования показали, что НГПП-клетки не являются полностью дифференцированными, и что эти клетки проявляют фенотип схожий с тем, что ожидается для клеточного типа при переходе клеток от бипотенциального гепатобласта (El4) к плотным гепатоцитам (Е18-Е20).

Ряд проведенных исследований [Gordon, 2000а; 20006] показали, что НГПП-клетки представляют собой уникальную популяцию паренхимных прогениторных клеток, присутствующую в разрушающейся печени взрослых животных. Тема, касающаяся происхождения НГПП-клеткок, до сих пор вызывает множество споров. Некоторые исследователи предполагают, что эти клетки представляют собой промежуточный класс клеток между овальными клетками и зрелыми гепатоцитами [Fausto, 2004; Vig, 2006]; другие исследователи утверждают, что НГПП-клетки происходят из зрелых гепатоцитов [Avril, 2004; Pichará, 2008, 2009]; третьи же, утверждают, что

НГПП-клетки представляют собой независимую популяцию прогениторных клеток [Gordon, 2000; Best, 2008; Coleman, 2005J.

Для выяснения связи между овальными клетками и НГПП-клетками был поставлен эксперимент на крысах Fischer 344, в котором была продемонстрирована пролиферация овальных клеток, образования НГПП-клеткок при этом не наблюдали [Best, 2007]. Однако при пролиферации овальных клеток происходило образование «небольших гепатоцитов» [Best, 2007]. Последующие исследования показали, что «небольшие гепатоциты» не являются НГПП-клетками [Pichard, 2009]. Более того, последующий эксперимент [Best, 2007] показал, что в ткани печени крыс происходило образование НГПП-клеток, в то время как овальные клетки отсутствовали. Таким образом, существуют доказательства того, что овальные клетки не являются источником образования НГПП-клеткок. Ряд исследований позволили говорить, что источник образования данных клеток находится в паренхиме. Однако, точный тип клеток, дающий рост НГПП-клеткам остается неизвестным по сей день. Авторы данной статьи предполагают, что НГПП-клетки происходят из клеточной популяции, которая гистологически похожа на зрелые гепатоциты, но фенотипически от них отличается [Best, 2008; Coleman, 2005]. Овальные клетки

Овальные клетки, которые пролиферируют в некоторых моделях гепатокарциногегенеза и некоторых формах некарциногенного повреждения ткани печени, можно отнести к стволовым прогениторным клеткам печени. Ряд различных экспериментальных моделей демонстрирует пролиферацию овальных клеток [Coleman, 1998; Alison, 2003; Dabeva, 1993; Brill, 1993]. Все эти модели характеризуются одновременной стимуляцией роста ткани печени и ингибированием механизмов регенерации ткани печени (блокировка пролиферации гепатоцитов). Стимуляция роста печени может быть достигнута несколькими путями - хирургическая резекция, пищевой стресс и химически инициированный некроз. Блокировка гепатоцитов

обычно достигается при использовании химических реагентов (2-ацетиламинофлуорин), которые препятствуют или предотвращают митотическое деление гепатоцитов [Tatematsu, 1984,1985]. В качестве клеточного ответа во всех применяемых моделях происходит пролиферация небольших клеток с ограниченной цитоплазмой и яйцевидным ядром, которые морфологически описываются как овальные клетки [Farber, 1956]. Все применяемые модели отличаются между собой временем происхождения различных клеточных процессов [Coleman, 1998]. Однако большинство моделей пролиферации овальных клеток включают в себя последовательность следующих событий: пролиферация овальных клеток в или вокруг портальной области печени, пролиферация овальных клеток в паренхиму долек печени, появление переходных клеточных типов и незрелых гепатоцитов, созревание гепатоцитов и восстановление нормальной морфологии ткани печени. Овальные клетки первоначально появляются в портальной зоне дольки печени в области терминальных желчных канальцев или холангиолов [Sell, 1994]. Было показано, что пролиферирующие овальные клетки представляют собой популяцию фенотипически отличных от других клеток, которые образуют гетерогенную клеточную популяцию или «компартмент» [Fausto, 1994, 1984, 1992]. Морфологически типичная овальная клетка обладает клеточными характеристиками сходными с характеристиками клеток терминальных желчных канальцев [Grisham, 1961; Lenzi, 1992; Sarraf, 1994;]. Однако, компартмент овальных клеток также содержит переходные клетки, которые обладают морфологическими особенностями между овальными клетками и гепатоцитами [Sarraf, 1994; Inaoka, 1967]. Пролиферирующие овальные клетки образуют иррегулярные проток-подобные структуры, которые связаны с уже существующими желчными протоками [Sarraf, 1994; Dunsford, 1985; Makino, 1988]. По мере пролиферации овальные клетки мигрируют из портальной области в паренхиму долек, иногда занимая большой процент массы печени. Среди овальных клеток появляются группы небольших базофильных гепатоцитов и

эти незрелые гепатоциты пролифирируют и дифференицируют по мере исчезновения овальных клеток, что способствует восстановлению нормальной структуры печени [Evarts, 1987, 1989; Dabeva, 1993; Lemire, 1991]. Некоторое время изучался вопрос о том, обладают ли овальные клетки свойствами стволовых клеток и могут ли способствовать росту гепатоцитов и\или эпителиальных клеток печени [Price Wilson, 1958; Farber, 1956]. Некоторые исследования показывают, что при использовании различных моделей гепатокарциногенеза и моделей некарциногенного поражения печени получены доказательства того, что овальные клетки являются предшественниками гепатоцитов [Evarts, 1987, 1989; Dabeva, 1993; Lemire, 1991; Golding, 1995]. Так же было показано, что овальные клетки меченые 3Н-тимидином определенно точно способствовали росту базофильных гепатоцитов [Evarts, 1987].

Другие клеточные источники регенерации печени

В настоящее время установлено, что мезенхимальные стромальные стволовые клетки, выделенные из костного мозга, пуповинной крови, жировой ткани, способны дифференцироваться во многие клеточные типы, в том числе, гепатоциты [например Baddour et al., 2012; Zhang et al., 2012; Lagasse et al., 2000.]. Механизмы, лежащие в основе этих процессов активно изучаются. Например, было показано, на дифференцировку МСК клеток влияют различные эффекторные молекулы, в том числе различные факторы роста, а также, ряд синтетических органических соединений. Кроме того, установлено, что при данном процессе происходит изменение работы генома, например, при дифференцировке МСК костного мозга крыс в гепатоцит-подобные клетки печени уменьшается экспрессия гена FoxHl (Fast 1/2) [Ouyang et al., 2012]. Регенерация печени амфибий

В отличие от регенерации печени млекопитающих данный процесс у амфибий малоизучен. Для хвостатых амфибий было показано, что после частичной гепатоэктомии также наблюдается гипертрофия оставшейся доли,

усиление митотической активности клеток [Лиознер, Сидорова, 1950 ]. Было отмечено также, что у амфибий регенерация печени характеризуется вялым течением раневых процессов на поверхности печени. Клеточная реакция клеток печени после частичной гепатоэктомии характеризуется активацией синтеза ДНК в гепатоцитах, о чем свидетельствует увеличение митотического индекса и данные цитофотометрии об увеличении содержания ДНК в ядрах [Карапетян, Дживанян, 2006]. Кроме того, наблюдали увеличение плоидности гепатоцитов, которое выражалось в увеличении доли двухядерных клеток. Следует отметить, что авторы этого исследования наблюдали увеличение количества пигментированных клеток в печени амфибии после частичной гепатоэктомии [Карапетян, Дживанян, 2006]. Клеточные источники регенерации в печени амфибий остаются малоизученными. 1.1.2 Строение легкого

Легкие занимают большую часть грудной клетки и постоянно изменяют свою форму в зависимости от фазы дыхания. Поверхность легкого покрыта серозной оболочкой — висцеральной плеврой.

Легкое состоит из системы воздухоносных путей — бронхов (бронхиальное дерево) и системы легочных пузырьков, или альвеол, выполняющих роль собственно респираторных отделов дыхательной системы. Бронхиальное дерево

Бронхиальное дерево включает главные бронхи, которые подразделяются на внелегочные долевые бронхи (крупные бронхи 1-го порядка), разветвляющиеся затем на крупные зональные внелегочные (по 4 в каждом легком) бронхи (бронхи 2-го порядка). Внутрилегочные бронхи сегментарные (по 10 в каждом легком) подразделяются на бронхи 3—5-го порядка (субсегментарные), которые по своему диаметру относятся к средним бронхам В—5 мм диаметром. Средние бронхи, разветвляясь, переходят в мелкие (диаметром 1—2 мм) бронхи и затем в терминальные бронхиолы. За ними начинаются респираторные отделы легкого,

выполняющие газообменную функцию. Всего в легком у взрослого человека насчитывается до 23 генераций ветвлений бронхов и альвеолярных ходов. Конечные бронхиолы соответствуют 16-й генерации [Horsfield and Cumming, 1968]. Строение бронхов, хотя и неодинаково на протяжении бронхиального дерева, имеет общие черты. Внутренняя оболочка бронхов слизистая выстлана, подобно трахее, многорядным реснитчатым эпителием, толщина которого постепенно уменьшается за счет изменения формы клеток от высоких призматических до низких кубических. Среди эпителиальных клеток, помимо реснитчатых, бокаловидных, эндокринных и базальных, в дистальных отделах бронхиального дерева встречаются секреторные клетки Клара, а также каемчатые. Собственная пластинка слизистой оболочки бронхов богата продольно направленными эластическими волокнами, которые обеспечивают растяжение бронхов при вдохе и возвращение их в исходное положение при выдохе. Слизистая оболочка бронхов имеет продольные складки, обусловленные сокращением косоциркулярных пучков гладких мышечных клеток (мышечная пластинка слизистой оболочки), отделяющих слизистую оболочку от подслизистой соединительнотканной основы. Чем меньше диаметр бронха, тем относительно сильнее развита мышечная пластинка слизистой оболочки. На всем протяжении воздухоносных путей в слизистой оболочке встречаются лимфоидные узелки и скопления лимфоцитов. У животных — это бронхоассоциированная лимфоидная ткань, принимающая участие в образовании иммуноглобулинов. В эпителии бронхов, а также в межальвеолярной соединительной ткани встречаются отросчатые дендритные клетки, как предшественники клеток Лангерганса, так и их дифференцированные формы, принадлежащие к макрофагической системе. Клетки Лангерганса имеют отростчатую форму, дольчатое ядро, содержат в цитоплазме специфические гранулы в виде теннисной ракетки (гранулы Бирбека). Они играют роль антигенпредставляющих клеток, синтезируют интерлейкины и фактор

некроза опухоли, обладают способностью стимулировать предшественники Т-лимфоцитов. Респираторный отдел

Структурно-функциональной единицей респираторного отдела легкого является ацинус. Он представляет собой систему альвеол, расположенных а стенках респираторных бронхиол, альвеолярных ходов и мешочков, которые осуществляют газообмен между кровью и воздухом альвеол [Collet, 1975]. Общее количество ацинусов в легких человека достигает 150 ООО. Ацинусы отделены друг от друга тонкими соединительнотканными прослойками; 12— 18 ацинусов образуют легочную дольку.

Альвеолы - это самые мелкие структурно-функциональные единицы легких. Альвеолы имеют вид открытого пузырька диаметром около 120—140 мкм и разделены тонкими соединительнотканными перегородками (6—8 мкм). Перегородки одновременно являются стенками двух или нескольких соседних альвеол. Альвеолы имеют округлый вход, который окружают пучки гладких мышечных клеток, в которых проходят кровеносные капилляры, занимающие около 75 % площади перегородки. Внутренняя поверхность их выстлана двумя основными видами клеток: респираторными и секреторными альвеолоцитами.

Респираторные альвеолоциты, занимающие около 95 % поверхности альвеол, имеют неправильную уплощенную вытянутую форму. Они являются высокоспециализированными клетками, которые не способны вступать в митоз [Bertalanffy, 1976]. Респираторные альвеолоциты прилежат к базальным участкам эндотелиальных клеток кровеносных капилляров. В этих участках базальная мембрана эндотелия кровеносного капилляра может вплотную приближаться к базальной мембране эпителия, благодаря чему барьер между кровью и воздухом оказывается чрезвычайно тонким — в среднем 0,5 мкм.

Секреторные альвеолоциты получили свое название из-за участия в образовании сурфактантного альвеолярного комплекса, состоящего из

белков, фосфолипидов, углеводов, образующих поверхностно активные вещества. Данный комплекс включает в себя три компонента: мембранный компонент, гипофазу (жидкий компонент) и резервный сурфактант — миелиноподобные структуры. [Collet, Chevalier, 1977].

Кроме описанных видов клеток, в стенке альвеол и на их поверхности обнаруживаются макрофаги, которые имеют костномозговое происхождение. Макрофаги проникают в просвет альвеолы из межальвеолярных соединительнотканных перегородок [Sorokin, 1984] и поглощают пылевые частицы, фрагменты клеток, микробы, частицы сурфактанта и др. В легком, ткань которого содержит различные типы эпителиев, межклеточные взаимодействия представлены классическими ультраструктурами контактов - плотное, щелевое, десмосомы, простое соединение, а также внеклеточным матриксов и другими макромолекулярными структурами клеточной адгезии. Васкуляризация.

Кровоснабжение в легком осуществляется по двум системам сосудов. Легкие получают венозную кровь из легочных артерий, т.е. из малого круга кровообращения. Ветви легочной артерии, сопровождая бронхиальное дерево, доходят до основания альвеол, где они образуют узкопетлистую капиллярную сеть альвеол [Elliott and Reid 1965]. В альвеолярных капиллярах, диаметр которых колеблется в пределах 5—7 мкм, эритроциты располагаются в один ряд, что создает оптимальное условие для осуществления газообмена между гемоглобином эритроцитов и альвеолярным воздухом. Альвеолярные капилляры собираются в посткапилярные венулы, формирующие систему легочной вены, по которой обогащенная кислородом кровь возвращается в сердце. Бронхиальные артерии, составляющие вторую, истинно артериальную систему, отходят непосредственно от аорты, питают бронхи и легочную паренхиму артериальной кровью. Проникая в стенку бронхов, они разветвляются и образуют артериальные сплетения в их подслизистой основе и слизистой

оболочке. Посткапиллярные венулы, отходящие главным образом от бронхов, объединяются в мелкие вены, которые дают начало передним и задним бронхиальным венам. На уровне мелких бронхов располагаются артериоловенулярные анастомозы между бронхиальными и легочными артериальными системами [Афанасьев,2002].

Лимфатическая система легкого состоит из поверхностной и глубокой сетей лимфатических капилляров и сосудов. Поверхностная сеть располагается в висцеральной плевре. Глубокая сеть находится внутри легочных долек, в междольковых перегородках, залегая вокруг кровеносных сосудов и бронхов легкого [Ротенберг, 1957]. Иннервация осуществляется главным образом симпатическими и парасимпатическими, а также спинномозговыми нервами. Регенерация.

Физиологическая регенерация органов дыхания наиболее интенсивно протекает в пределах слизистой оболочки за счет малоспециализированных клеток. В отличие от печени, ткань легкого не восстанавливается после частичного удаления. После частичной пульмонэктомии в эксперименте в оставшемся легком наблюдали компенсаторную гипертрофию с увеличением объема альвеол и последующим размножением структурных компонентов альвеолярных перегородок. Одновременно расширяются сосуды микроциркуляторного русла, обеспечивающие трофику и дыхание. Однако клеточные источники регенерации в легком присутствуют [Kim 2005]. Согласно современным представлениям стволовые и прогениторные клетки легкого обнаружены в области контакта терминальной бронхиолы с альвеолой - бронхиолоальвеолярный контакт (bronchioloalveolar duct junction, BADJ). В качестве кандидатов на стволовые клетки легкого авторы этих исследований предполагают овальные клетки, расположенные в данной области, пролиферация которых была иммунохимически зарегистрирована при автономном росте.

Кроме того, исследователи этого вопроса отмечают возможность участия в процессах регенерации клеток костного мозга - гемопоэтических и

мезенхимальных стволовых клеток, которые могут осуществлять дифференцировку в различные фенотипы [Kim, 2005].

1.2 Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы

Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические

биорегуляторы (МГТБ) были обнаружены практически во всех тканях животных, причём не только млекопитающих, но и в тканях птиц, амфибий, а также и в растениях [Ямскова и др. 19776; Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003]. Эти биологически активные вещества были выделены в отдельную группу на основании общности проявляемых физико-химических свойств и характера биологического действия. Было установлено, МГТБ локализованы в межклеточном пространстве тканей, в СМД влияют на важные биологические процессы (адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку клеток), стимулируют восстановительные и репаративные процессы в патологически изменённых тканях. Активность МГТБ характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности [Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Краснов, Григорян, Ямскова, 2003; Краснов и др., 2005; Маргасюк, Григорян, Ямскова, 2005; Борисенко, 2005]. Их исследование оказалось возможным благодаря разработке нового экспериментального подхода, сочетающего в себе методы выделения, очистки, изучение физико-химических свойств, а также метод их биотестирования и изучения специфической биологической активности [Borisenko et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Nazarova et al., 2007].

Впервые МГТБ стали изучать как молекулы адгезии тканей млекопитающих. Были разработаны оригинальные адгезиометрические методы, с помощью которых возможно было провести сравнительную оценку изменения состояния клеточной адгезии при воздействии некоторых физико-химических факторов [Маленков, Чуич, 1978]. Эти адгезиометрические методы явились основанием для разработки метода

биотестирования МГТБ, который способствовал формированию нового экспериментального подхода для исследования данных биорегуляторов, в том числе способа их выделения из тканевых экстрактов, изучения биологического действия и физико-химических свойств.

В следующем разделе литературного обзора будут представлены данные литературы по развитию представлений о молекулярных основах клеточной адгезии, особенно о результатах исследований, которые предшествовали изучению МГТБ.

Состояние клеточной адгезии - важнейший фактор регуляции в живых системах

Поиск и исследование молекул адгезии.

Первыми объектами для изучения адгезии и межклеточных взаимодействий, явились морские губки [Wilson, 1907], на которых исследовали реагрегацию отдельных клеток, полученных после нарушения адгезионных взаимодействий в губке. Было показано, что в процессе реагрегации смеси клеток, принадлежащих к разным видам губок, происходила видоспецифическая агрегация [Galtsoff, 1925].

Позже для эмбриональных тканей теплокровных было показано, что обработкой трипсином можно получить суспензии клеток, способных к агрегации [Moscona, 1961, 1963, 1968]. При изучении реагрегации этих клеток было установлено, что она носит тканеспецифический, но не видоспецифический характер [Moscona, 1957]. Агрегация эмбриональных клеток - тканевоспецифический процесс, но клетки гомологичных тканей эмбрионов разных видов образуют совместные агрегаты - «химеры». Стимулом для изучения механизмов клеточной адгезии явились результаты исследования межклеточных взаимодействий в опухолевых тканях. В этом аспекте следует отметить исследования, проведенные Coman, которым был разработан специальный адгезиометрический метод, позволяющий оценивать клеточную адгезию между двумя клетками. В 1944 г. при исследовании клинического материала им было установлено, что адгезивность клеток в

опухолях значительно меньше, чем в соответствующих нормально функционирующих тканях [Coman, 1944]. В 70-е годы эти исследования были продолжены с помощью данного адгезиометрического метода. Электронномикроскопическое исследование перевиваемых гепатом показало, что во всех гепатомах обнаруживается нарушение клеточной адгезии в области простого соединения при сохранении плотного соединения [Ольшевская, 1971]. В самих же гепатомах наблюдается два типа изменения адгезионных взаимодействий. Первый характерен для медленно растущих гепатом и сила сцепления клеток существенно не отличается от таковой для клеток нормальной печени [Модянова, 1982]. В быстрорастущих гепатомах были обнаружены наибольшие расхождения клеточных поверхностей в зоне простого соединения, утрата специализированных ультраструктур МК. Было высказано предположение, что эти нарушения связаны с автономным ростом опухолевых клеток, значительные же нарушения адгезионных взаимодействий не связаны с темпом роста, а отражают независимую прогрессию признаков злокачественности. Следует отметить, что нарушение МК в медленно растущих гепатомах напоминают ранние изменения МК, наблюдаемые в нормальной печени при перфузии раствором, не содержащим ионы Са [Ольшевская, Модянова, 1971]. Кроме того, в отличие от гепатоцитов нормальной ткани печени, не способных образовывать суспензию в среде, содержащей ионы Са+2, клетки всех исследованных штаммов гепатом переходят в аконтактное состояние в присутствии ионов Са+2, что также свидетельствует о весьма значительных нарушениях в механизмах клеточной адгезии.

Особый интерес вызывают исследования адгезионных свойств гепатоцитов при индукции опухолей печени гепатоканцерогеном [Архипенко, 1975]. Уменьшение сцепленности гепатоцитов у экспериментальных животных, подвергшихся воздействию гепатоканцерогена, наблюдали дважды: первый раз - в раннем латентном периоде, до появления морфологических признаков

опухолевой трансформации, второй - на поздних этапах индуцированного бластомогенеза, в период формирования бластом.

Данные, полученные с помощью биофизических методов исследования, были подтверждены электронномикроскопическими исследованиями: в зоне простого соединения гепатоцитов экспериментальных животных на разных этапах индуцированного канцерогеном гепатобластомогенеза происходило расширение межклеточного пространства [Архипенко 1975]. По мнению авторов этой работы, уменьшение адгезивности гепатоцитов в раннем латентном периоде указывает на то, что изменение свойств их поверхности, очевидно, связанное с нарушением молекулярных механизмов клеточной адгезии, наступает значительно раньше морфологических изменений в ткани. Авторы полагали, что именно на данном этапе бластомогенеза происходит расселение трансформированных клеток с лимфо - и кровопотоком, и этот процесс является началом реализации программы метастазирования опухоли.

Результаты дальнейших исследований, проводимых в сравнительном аспекте с культурами нормальных и опухолевых клеток, показали, что все изменения морфогенетического поведения трансформированных клеток (движение, деление, формообразование) обусловлены дефектом в определенной группе нормальных морфологических реакций - их адгезии с субстратом и между собой [Васильев, Маленков, 1968; Маленков, 1976; Abercrombie, 1970; Coman, 1944; Thiery et al., 1990; Vasiliev, Gelfand, 1976]. Корреляцию между отдельными этапами бластомогенеза и изменением адгезивных свойств клеток обнаружили и другиё исследователи [Fentiman, Taylor-Papadimitrou, 1977; Weinstein et al., 1976].

Таким образом, результаты проведенных исследований способствовали формированию предположения о том, что на начальном этапе бластомогенеза происходит нарушение адгезионных взаимодействий клеток, связанных с изменением свойств клеточной поверхности и ПМ, обусловливающих адаптацию трансформированных клеток к новым условиям существования, а именно, уклонению этих клеток от действия

контролирующих факторов [Васильев, Маленков, 1968; Маленков, 1976]. Действительно, экспериментально было показано увеличение прочности ПМ трансформированных и опухолевых клеток к действию повреждающих агентов (деформационное воздействие, протеолитические ферменты, дефицит ионов Ca ) [Маленков, Модянова, 1968; Маленков, 1976; Modjanova, Malenkov, 1973].

В это же время, среди исследователей формируется предположение о том, что в адгезии клеток участвуют некоторые молекулы, преимущественно белкового происхождения, которые находятся в межклеточном пространстве и на поверхности клеток. Действительно, из разных тканей выделяют адгезионные белки (АБ), которые стимулируют клеточную агрегацию или увеличивают клеточную адгезию. Было показано, что адгезивные молекулы, выделенные из морских губок, представляли собой углеводсодержащие

п

биополимеры с молекулярной массой

2*10 Да, относящиеся к гликопротеинам [Muller et al., 1974]. В результате исследования химического состава этих гликопротеинов было установлено, что молекула состоит на 50% из аминокислот и на 50% из углеводов. Отмечено характерное для гликопротеинов высокое содержание дикарбоновых аминокислот -аспарагиновой и глутаминовой. Углеводная компонента АБ представляет собой гетерополисахарид, состоящий, в основном, из нейтральных Сахаров и небольшого количества уроновых кислот и гексозаминов. Инактивация АБ происходила при нагревании или при действии ЭДТА. Инактивация АБ под действием ЭДТА сопровождалась деструкцией молекулы, что указывает на то, что ионы Ca являются составной частью АБ. Обработка неионными детергентами удалось разделить АБ на кольцеобразную структуру и пептиды с молекулярным весом около 16 кДа. Если эти пептиды ковалентно связать с Сефарозой, то гранулы Сефарозы приобретают способность к агрегации [Muller et al., 1974].

Так же был выделен и изучен рецептор АБ, локализованный на клеточной поверхности морских губок [Muller et al., 1976]. По мнению авторов, он

представлял собой протеогликан с молекулярным весом около 18 кДа. Исследования показали, что он содержит около 80% нейтральных Сахаров и 7,5 % аминокислот. Обработка рецептора периодатом или нагреванием -инактивировали его.

АБ были обнаружены при изучении реагрегации различных тканей позвоночных, но наиболее изучаемым объектом стала сетчатка глаза эмбриона цыпленка [Moscona, 1963а, 1963b, 1966, 1975]. Daday и Creaser (1970), выделили и очистили АБ сетчатки глаза эмбриона цыпленка. В процессе исследования было установлено, что существует зависимость между концентрацией АБ и средним диаметром образовавшихся агрегатов. Максимальный размер агрегатов возникал при концентрации АБ 30-100 мкг/мл. При большей концентрации белка наблюдалось ингибирование агрегации. По данным гель-фильтрации на Сефадексе G-200, АБ представлял собой пептид с молекулярным весом около 6000.

АБ выделяли и из других животных тканей. Oppenheiner (1971) охарактеризовал АБ мышиной тератомы. Интересное исследование агрегации эмбриональных клеток печени провел Kur oda (1968). Было показано, что в смешанной суспензии клеток эмбрионов разных возрастов образовавшиеся агрегаты содержали клетки эмбрионов одного возраста. Экстракты, полученные при помещении ткани в бескальциевую среду, проявляли агрегационную активность, причем активность обладала свойством «возрастной» специфичности. Так, экстракт, полученный из печени 7-дневного эмбриона, был активен в отношении клеток 7-дневного эмбриона, но не 18-дневного. Однако экстракт из печени 18-дневного эмбриона не проявлял активности в отношении клеток 18-дневного эмбриона, а также 7-дневного.

Выявление АБ тканей взрослых животных имеет существенные особенности. Они определяются тем, что клетки взрослых особей трудно культивировать in vitro и они слабо агрегируют. Некоторые исследователи [Henkart, Humphrey, 1973] указывали на невозможность выделения АБ из тканей

взрослых особей. Рассмотрение проблем, возникших при разработке методов, позволяющих оценивать клеточную адгезию, будет представлено в следующем разделе.

Новый подход в исследовании адгезии клеток тканей млекопитающих был осуществлен Маленковым и Модяновой (1970, 1973). Ими были подобраны условия выделения АБ из ткани печени мыши. Для этого было предложено проводить перфузию печени бескальциевым раствором при 2037 °С, что приводило к расхождению контактирующих клеточных поверхностей и разрушению специализированных структур контакта клеток [Маленков, Модянова, 1970, 1973]. С помощью модифицированного метода Coman, было показано, что сцепление клеток при этом уменьшалось в несколько раз и из ткани легко выделялись отдельные клетки. Добавление ионов кальция в перфузионный раствор препятствовало ослаблению сцепления и расхождению клеток. Поддержание прочности сцепления клеток является специфическим свойством ионов кальция [Модянова, 1974]. Было установлено, что при длительном перфузировании печени бескальциевым раствором, происходит вымывание высокомолекулярного вещества, которое наравне с ионами кальция оказывало влияние на межклеточные взаимодействия [Modjanova, Malenkov,1973]. Изучение веществ, присутствующих в перфузате, показало, что они тканеспецифично влияют на адгезию клеток. В дальнейшем, полученные результаты позволили разработать новый экспериментальный подход к изучению биологических и физико-химических свойств веществ, участвующих в клеточной адгезии. [Ямскова, Модянова. 1977]. Процедура получения адгезивных белков, посредством перфузии органа была заменена экстракцией ткани физиологическим раствором. Полученный экстракт далее фракционировали с помощью различных биохимических методов. Изоэлектрофокусированием в градиенте сахарозы удалось получить адгезионный белок, активный в СМД [Ямскова В.П., Модянова Е.А. и др., 1977]. Данный белок печени характеризовался значением изоэлектрической точки в области рН 6,8-7,2.

Он представлял собой гликопротеин, содержащий остатки маннозы, галактозы и Ы-ацетилглюкозамина, причем соотношение аминокислот к

углеводам было оценено как 1:3. Предположено, что в состав данного белка

2+

входят остатки минеральных кислот и ионы Са [Ямскова, 1978]. Молекулярная масса исследуемого белка была определена методом электрофореза в ПААГ, она составляла 70 кДа [Ямскова, 1977]. Данный адгезионный белок полностью утрачивал активность и часто выпадал в осадок после воздействия таких физико-химических факторов как «замораживание-оттаивание», Са -хелатирующие агенты (ЭДТА, ЭГТА), а также дефицит ионов Са (деминерализованная вода), нагревание до 100°С в течение 3 минут [Ямскова, 1979].Было установлено, что адгезионный белок, выделенный из печени крыс, увеличивал устойчивость клеток печени крыс к механическому воздействию и способствовал образованию многоклеточных ассоциатов в суспензии гепатоцитов [Ямскова, 1977]. В СМД он ингибировал синтез ДНК в органных культурах печени мышей, причем было показано, что его действие на адгезию клеток печени опережало по времени ингибирование синтеза ДНК [Маленков, Чуич, 1979]. Позже методом авторадиографии было показано, что данный адгезионный белок, выделенный из печени крыс \Vistar, а также мышей линии С57В1 и СВА, в СМД ингибировал пролиферативную активность эмбриональных гепатоцитов мышей обеих линий [Туманова 1996]. В аналогичных условиях выделения и очистки был получен адгезионный белок из ткани легкого крыс [Ямскова, 1977, 1979]. Было экспериментально установлено, что выделенный из ткани легкого адгезионный белок представляет собой также гликопротеин с молекулярной массой около 70 кДа. Соотношение аминокислот и углеводов в данном белке составляло 1:3. Этот белок также характеризовался значением изоэлектрической точки в области рН 6,8-7,2, из углеводов были определены остатки маннозы, ТчГ-ацетилглюкозамина в соотношении 4-5:2. Так же, как и гликопротеин печени, гликопротеин легкого утрачивал биологическую активность после воздействия таких физико-химических

факторов как нагревание, процедура «замораживание-оттаивание», дефицит ионов Са2+. Выделенный из ткани легкого крыс адгезионный белок в СМД проявлял тканеспецифичное мембранотропное действие в отношении клеток ткани легкого in vitro. Он увеличивал механическую сцепленность клеток в ткани, тканеспецифично ингибировал синтез ДНК в органных культурах легкого мышей. В ходе этого исследования было установлено, что гликопротеин оказывал биологическое действие только на клетки альвеолярного эпителия. Его действие на адгезию клеток легкого опережало по времени воздействие на клеточную пролиферацию [Маленков, 1978]. Сравнение аминокислотных составов адгезионных гликопротеинов печени и легкого показало, что они содержали большое количество остатков окси- и дикарбоновых аминокислот, но не содержали остатки серосодержащих и ароматических аминокислот [Ямскова, Резникова, 1979].

Таким образом, обнаруженные в экстрактах ткани печени и легкого крыс адгезионноактивные белки проявляли биологическую активность в СМД, которая характеризовалась наличием тканевой специфичности биологического действия на клеточную адгезию и пролиферацию in vitro. Необходимо отметить, что действие гликопротеинов на клеточную адгезию опережало их влияние на клеточную пролиферацию in vitro.

Сравнительное исследование адгезионных свойств экстрактов, полученных из печени мышей двух инбредных линий - СВА, генетически предрасположенной к спонтанному бластемогенезу, и линии С57В1, устойчивой по этому признаку, показало, что задолго до образования бластом в ткани печени мышей СВА обнаруживается нарушение молекулярных механизмов клеточной адгезии, которое выражается в изменении адгезионных характеристик гепатоцитов, обусловленных искажением биосинтеза компонентов межклеточного пространства. В ткани печени мышей С57В1, присутствуют адгезивные белки, проявляющие биологическую активность в сверхмалых концентрациях, соответствующих ' мг белка/мл. Однако эти адгезивные белки оказались неактивными

по отношению к ткани печени мышей СВА [Ямскова и др., 1990]. Методом

электронной микроскопии было показано, что как при пониженной

температуре, так и при дефиците ионов Са2+, во внеклеточной среде

наблюдается быстрое расхождение плазмолемм контактирующих

гепатоцитов в области простого контакта [Ольшевская, Модянова, 1971;

Ушаков, Черненко, 1978]. На основании этих данных были выбраны условия

экстрагирования адгезионных белков: физиологический раствор и

пониженная температура [Ямское и др., 1999]. Применение данного способа

экстракции показало, что во всех тканях млекопитающих, в том числе в

тканях глаза, присутствуют адгезивные белки данной группы, которые

характеризуются проявлением биологической активности в низких дозах,

8 12

соответствующих 10" -10" мг белка [Краснов, 2005; Назарова, 2006; Маргасюк, 2005; Рыбакова,2009]. Разработка метода очистки этих адгезивных белков показало, что наиболее эффективное фракционирование тканевых экстрактов осуществляется с помощью высаливания белков сульфатом аммония в условиях создания насыщенного раствора соли. При этом наблюдается разделение тканевого экстракта на надосадочную жидкость, проявляющую адгезивную активность, и биологически неактивную фракцию осадка [Ямскова, Резникова, 1991; Ямское и др., 1999]. Авторы этого исследования полагали, что при высаливании белков тканевого экстракта в осадок переходит значительная часть примесных белков, а в надосадочной жидкости остаются практически только адгезивные молекулы, для фракционирования которых применяли изоэлектрофокусирование. Исключение составляли адгезионные белки, выделенные из тканей заднего отдела глаза. В этом случае адгезионные белки присутстствовали как в надосадочной жидкости, так и во фракции осадка [Ямскова, 2008].

В результате разделения методом изоэлектрофокусирования супернатантов экстрактов различных тканей млекопитающих всегда в качестве наиболее количественно представленной фракции получали фракции кислых белков (рН<3,0), которые проявляли биологическую

активность. Исследование качественного состава этих фракций показало, что они содержали остатки аминокислот, маннозы и Ы-ацетилглюкозамина [Ямское и др. 2001; Ямское и др. 1999]. В экстракте печени крыс были обнаружены 4 фракции, проявляющие биологическую активность в СМД, -фракции кислых, слабокислых, нейтральных и основных белков [Ямскова и др., 2007]. Все эти фракции содержали небольшие пептиды (менее бкДа). Следует отметить, что и в биологически активных ИЭФ-фракциях, выделенных из других тканевых экстрактов, так же обнаруживались небольшие пептиды [Вошепко, 2007; Иагагоуа, 2007; Маг^а8уик, 2007]. Для ИЭФ-фракций, выделенных из сыворотки крови и экстракта пигментного эпителия глаза быка, методом МАЬЭЬТОР было определено значение молекулярной массы биологически активных в СМД пептидов - 1,222 кДа и 4,372 кДа соответственно [Ямскоеа и др., 2008; Ямское и др. 2001]. При исследовании осадков экстрактов этих тканей было показано, что в них присутствуют белки, которые оказывают влияние на активность пептидов -белки-модуляторы. Они представляли собой малоизученные изоформы сывороточного альбумина быка [Ямскова и др., 2004, 2008]. В этом исследовании также было установлено, что взаимодействие пептидов с белками-модуляторами происходит по механизму углевод-белкового «узнавания», причем в качестве лектина выступает изоформа сывороточного альбумина, которая специфически связывается с маннозо-содержащей компонентой пептидов. Адгезиометрические методы исследования.

Адгезия - технический термин, буквально означающий "силу сцепления поверхностей разнородных тел". В биологию этот термин привнесен в связи с исследованием феномена межклеточных контактных взаимодействий в тканях, поскольку клетки могут взаимодействовать с поверхностям других соседних клеток, а также с естественными субстратами, к последним относится внеклеточный матрикс. Поверхность эпителиальной клетки неоднородна как по составу, так и по силе и характеру адгезивных и

контактных взаимодействий, которые реализуются между отдельными участками поверхностей соседних клеток. В связи с этим задача определения силы адгезии некоторой конкретной клетки в ткани является практически невыполнимой, даже если клеточную адгезию воспринимать как суммарную силу взаимодействий, в которые вступает данная клетка. Тем не менее, попытку оценить величину адгезионных взаимодействий между клетками предпринималась неоднократно различными исследователями. К решению этой задачи наиболее приблизился Коман, который разработал метод оценки силы сцепления между клетками с помощью специального, созданного им манипулятора [Coman, 1944]. Метод был применен для определения силы адгезии между клетками эпителия мочевого пузыря жабы. Значительные размеры и монослойное культивирование этих клеток позволили произвести оценку силы их сцепления под микроскопическим контролем. Позже Coman модифицировал свой метод для исследования трехмерных фрагментов ткани и применил его при изучении биопсийного материала онкологических больных. В этом случае было проведено измерение усилия, необходимого для отрыва группы клеток от основной массы тканевого фрагмента [Coman, 1954; 1961]. В результате этого исследования было установлено, что малигнизированные клетки характеризуются значительно меньшей силой сцепленности, по сравнению с нормально функционирующими клетками, и был сделан вывод о том, что при злокачественном росте происходит нарушение контактных межклеточных взаимодействий [Coman, 1954].

Длительное время для оценки состояния клеточной адгезии использовали экспериментальную модель агрегации клеток в суспензионных культурах in vitro [Moscona, 1963; Kuroda, 1968]. Поиск и исследование белков, участвующих в адгезионном процессе, способствовали разработке этого метода, основанного на способности изолированных клеток образовывать при культивировании многоклеточные агрегаты [Moscona, 1963; 1974; Creaser, Russell, 1971]. Адгезионную активность исследуемых белков в этой

модели оценивали, подсчитывая количество одиночных клеток в суспензии или определяя размер образовавшихся клеточных агрегатов. Метод был с успехом применен при изучении адгезивных белков, выделенных из морских губок, а также сетчатки куриных эмбрионов [Hausman, Moscona, 1975; Muller et al, 1974; 1973; 1976]. С помощью метода клеточной агрегации удалось не только обнаружить адгезивные белки, но и изучить влияние других физико-химических факторов на агрегацию клеток in vitro [Долъникова и др., 1985а; 19856; 1986; 1987].

Метод агрегации обладает рядом принципиальных недостатков. Наиболее значительным из них является тотальное повреждение поверхности клеток в процессе приготовления суспензионных культур (обработка тканей ферментами, хелатирующими ионы металлов соединениями, механическая дезинтеграция и т.д.). Однако вскоре было установлено, что высокодифференцированные клетки взрослых особей не могут восстановить нарушенные макромолекулярные структуры поверхности или межклеточного пространства, а потому способны только к неспецифическому взаимодействию и образованию достаточно рыхлых межклеточных ассоциатов. Это обстоятельство стало решающим фактором в перспективах использования данного метода.

Другие адгезиометрические методы, разработанные для оценки состояния межклеточной адгезии в тканях основывались также на определении величины параметров, характеризующих механическую сцепленность клеток в момент отрыва их друг от друга, который осуществлялся, например, с помощью фиксированных микроигл или потоков жидкости, или же при механическом диспергировании ткани [Маленков, Модянова, 1968; Модянова, 1968; Маленков, Чуич, 1979]. Так же

применялся метод электронной микроскопии, с помощью которого можно оценить состояние ПМ клетки и специализированных ультраструктур МК [Goodenough, Gilula, 1974; Ушаков, Черненко, 1978; Ушаков, 1980; 1982].

В это время начинает развиваться иммунохимический метод для исследования белков, связанных с поверхностью клеток, трансмембранных белков и ВКМ [Damsky et al., 1983; Gallin et al., 1983; Ogou et al., 1983; Thiery et al., 1984; Hatta et al., 1985]. В настоящее время практически все известные белки межклеточного пространства были идентифицированы этим методом [Anderson, 1990; Turner, 1992; Riechardt, 1993]. В основе данного метода лежит изучение участвующих в клеточной адгезии поверхностных антигенов. Успех исследований, выполненных с помощью такой методической стратегии, в основном, определяет способность изучаемых белков эффективно проявлять антигенные свойства. В ином случае, т.е. когда белки являются слабыми антигенами, их идентификация с помощью указанного методического подхода оказывается трудно выполнимой. Необходимо отметить, что к настоящему моменту в литературе отсутствуют экспериментальные данные, которые бы отрицали присутствие среди компонентов клеточного микроокружения белков - слабых антигенов, а в таком случае они могли быть не идентифицированны с помощью иммунохимических методов исследования.

Таким образом, современный методический подход, применяемый для исследования молекул адгезии, позволил выявить белки, которые характеризуются высокими значениями молекулярной массы, структурной сложностью и проявляют выраженные антигенные свойства [Anderson, 1990; Turner, 1992].

Исследование клеточной адгезии с помощью оценки вязкоупругих свойств ткани

Результаты исследований, проведенных с помощью биофизических методов, свидетельствуют о том, что отдельные макромолекулярные структуры межклеточных контактов и ПМ клетки могут быть рассмотрены как вязкоупругие системы, а их свойства описаны в соответствующих терминах [Маленков, Чуич, 1979; Мальцева и др. 1991; Ушаков и др. 1990]. Например, при кратковременном деформационном воздействии,

оказываемом на ткань печени, эти макромолекулярные структуры клетки проявляют свойства квазиупругого тела, а при значительных деформациях -разрушаются, обнаруживая при этом определенную иерархичность [Маленков, Чуич, 1979; Ушаков, Черненко, 1978; Ушаков 1980, 1982].

Для изучения параметра, характеризующего вязкоупругие свойства ткани в условиях стандартного деформационного воздействия, был разработан новый метод. Деформационное воздействие на ткань осуществляли с помощью специального дезинтегратора, представляющего собой стеклянный гомогенизатор с зазором 50 мкм и объемом около 100 мкл. Величина зазора обусловливает при дезинтеграции фрагмента ткани (1-2 мг) сохранение целостности клеток и даже таких крупных как гепатоциты. В условиях деформационного воздействия на ткань печени часть клеток может остаться целыми, а часть - разрушиться с выделением клеточных ядер. Очевидно, что количество как выделившихся целых клеток, так и клеточных ядер будут определяться вязкоупругими свойствами ПМ клетки, ВКМ, специализированных межклеточных контактов, а также цитоплазмы, свойства которой, в свою очередь, в значительной степени, зависят от состояния цитоскелета. Если в условиях сдвиговой деформации значительному количеству клеток удается, подобно упругим шарикам, "проскользнуть" в пространство зазора дезинтегратора без разрыва ПМ, то можно предположить, что вязкоупругие свойства ткани увеличились. Это наблюдается при действии адгезивных белков. И, наоборот, при уменьшении вязкоупругих свойств ткани, после дезинтергации фрагмента ткани целых клеток будет существенно меньше, поскольку они будут разрушаться подобно шарикам с жесткими оболочками, и количество выделившихся клеточных ядер значительно увеличится. Так, например, при диспергировании нативной ткани печени наблюдается выделение практически только клеточных ядер. При нарушении целостности ультраструктур межклеточных контактов и нарушении межклеточных адгезионных взаимодействий, которое возникает при дефиците ионов

кальция, в условиях деформации сдвига выделяются, в основном, целые клетки [Туманова и др. 1995].

Экспериментально полученные данные явились основой при разработке метода биотестирования адгезивных молекул [Ямскова и др. 1978]. Ранее было показано, что в ткани печени с помощью длительная перфузия бескальциевым раствором можно значительно нарушить межклеточные адгезионные взаимодействия. Это подтверждалось электрономикроскопическим исследованием - было обнаружено нарушение ряда ультраструктур МК, в том числе простого соединения [Ушаков, 1979], а так же демонстрацией восстановления механической сцепленности клеток модифицированным методом Coman [Маленков, Модянова, 1968]. Если такую ткань печени, с предварительно ослабленными адгезионными взаимодействиями, культивировать в питательной среде с добавлением жидкости, полученной после перфузии печени бескальциевым раствором, и ионов кальция, то механическая сцепленность клеток восстанавливалась и приближалась к таковой в нативной печени. Кроме того, было показано, что добавление перфузата и ионов кальция способствуют выделению в два раза меньшего количества клеток из ткани печени с предварительно ослабленными адгезионными взаимодействия в условиях сдвиговой деформации [Ямскова и др., 1977, 1978]. Таким образом, на этом этапе исследования был разработан метод биотестирования адгезивных белков, который основывался на восстановлении адгезионных взаимодействий в ткани за счет добавления ионов кальция и молекул адгезии. Позже этот метод был модифицирован и в таком виде он используется в настоящее время для биотестирования МГТБ.

В данном методе используется нативная ткань печени, без предварительных воздействий. Фрагменты ткани печени, культивируют в питательной среде, в присутствии изучаемых молекул адгезии; контролем являются органные культуры, инкубируемые в питательной среде. Используется ткань одного экспериментального животного, обычно это

печень мышей (20-22г) С57В1/СВА. После инкубации органных культур, каждая из них подвергается деформационному воздействию в специальном дезинтеграторе и оценивается количество выделившихся клеточных ядер. При воздействии адгезивных молекул или других веществ, способных взаимодействовать с ПМ, количество выделившихся ядер статистически достоверно отличается от контрольного значения.

Авторы данного исследования объясняют механизм, который лежит в основе метода биотестирования, следующим образом. Метод основан на экспериментальной оценке параметра, который характеризует вязкоупругие свойства ткани и зависит от состояния макромолекулярных структур, окружающих клетку. К ним относятся ультраструктуры межклеточных контактов, ВКМ и другие молекулы, присутствующие в межклеточном пространстве, с которым взаимодействует ПМ клетки. Таким образом, создается впечатление, что ПМ является структурой, вязкоупругие свойства которой изменяются за счет непрерывно протекающих лигандно-рецепторных взаимодействий, в результате которых образуются макромолекулярные комплексы, включающие как молекулы межклеточного пространства, так и трансмембранные рецепторы (например, интегрины). Такие мембранные комплексы имеют латеральную подвижность, в результате которой, меняются физические свойства ПМ. В пользу этого предположения свидетельствуют результаты исследования, показавшего, что при воздействии молекул адгезии изменяется проницаемость ПМ для меченых аминокислот [Ямскова и др., 1994].

В условиях стандартного деформационного воздействия на ткань печени часть клеток может остаться целыми, а часть - разрушиться с выделением клеточных ядер. Очевидно, что количество выделившихся целых клеток и клеточных ядер будет определяться вязкоупругими свойствами ПМ, макромолекулярных структур межклеточного пространства, состоянием цитоплазмы и цитоскелета клетки. При увеличении вязкоупругих свойств ПМ, которое достигается, например, при воздействии молекул адгезии, в

условиях сдвиговой деформации значительное количество клеток, подобно упругим шарикам, может «проскользнуть» в пространстве зазора дезинтегратора без разрыва ПМ клетки. Напротив, при уменьшении вязкоупругих свойств ПМ, после дезинтеграции фрагмента ткани количество целых клеток значительно снижается из-за их разрушения как шариков с жесткими оболочками, а количество выделившихся клеточных ядер соответственно увеличивается [Маленков, Модянова, Ямскова, 1977;

Ямскова, Резникова, 1991]. Таким образом, данный метод позволяет

/

исследовать мембранотропное действие веществ, которые взаимодействуют с ПМ, в результате чего меняются ее вязко-упругие свойства. Одними из таких веществ являются МГТБ, которые имеют внеклеточную локализацию [Ямскова и др., 2008; Краснов и др., 2005; Борисенко и др., 2006], поэтому этот метод используется для определения присутствия этих биорегуляторов в исследуемых образцах, например, в процессе очистки.

Для мембранотропной активности биорегуляторов данной группы характерен полимодальный тип дозовой зависимости: причем всегда отмечается присутствие экстремумов в области СМД [Ямскова, Резникова, 1991; Ямскова и др., 2009].

Из-за нелинейного характера дозовой зависимости МГТБ не представляется возможным применить понятие единицы активности. В данном случае представляется более удобным оценивать интервал разбавлений изучаемой фракции биорегулятора, при котором проявляется ее мембранотропная активность: чем более «сдвигается» интервал концентраций, в которых проявляется активность препарата, в область СМД, тем более она активна, тем выше концентрация в ней МГТБ. Однако, в этом аспекте, следует отметить следующее: активность биологически активных пептидов, входящих в МГТБ, по мере очистки могла увеличиваться, а в отдельных случаях, наоборот, - уменьшаться. Как показали результаты исследования МГТБ, выделенных из тканей глаза, на активность пептидов оказывают

влияние другие белки, входящие в состав биорегуляторов - белки-модуляторы [Скрипникова и др., 2008; Ямскова и др., 2008].

При исследованиях, проведённых с помощью метода биотестирования, было установлено, что мембранотропная активность МГТБ проявлялась только в условиях сохранения целостности структуры межклеточного пространства ткани [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Ямскова и д., 1994]. Например, было показано полное отсутствие мембранотропного действия биорегуляторов на моделях суспензионных культур гепатоцитов, а также органной культуры печени млекопитающих, предварительно перфузированной физиологическим раствором [Ямскова и др., 1990; Ямскова и др., 1994]. Эти результаты исследований были использованы при разработке экспериментальных моделей для изучения специфической активности МГТБ. Биологическая активность МГТБ

Первые эксперименты, в которых изучали специфическую активность МГТБ, были проведены с биорегулятором, выделенным из сыворотки крови крупного рогатого скота (KPQ [Буеверова и др., 1985]. Авторы изучали влияние данного биорегулятора на рост и клонирование трансформированных клеток млекопитающих (фибробластов) при культивировании in vitro. Было показано, что биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, в СМД стимулировал пролиферацию, адгезию, усиливал клоногенность этих клеток. Однако долгое время для остальных МГТБ не удавалось подобрать соответствующие экспериментальные модели клеточных культур. Поэтому были предприняты попытки изучить действие биорегуляторов данной группы в экспериментах in vivo.

В экспериментах, проведённых в условиях in vivo, удалось продемонстрировать специфическую активность некоторых биорегуляторов группы МГТБ [Казанский и др., 2000; Гримов, Ямскова, Ямское, 2005; Борисенко и др., 2006; Неверкович, 2000]. При использовании экспериментальных моделей in vivo были выявлены условия, при которых

проявлялась специфическая активность МГТБ, а именно: сохранение в ткани адгезионных взаимодействий между клетками, а также целостности ультраструктур межклеточных контактов [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Ямскова и др., 1994; Туманова, Попова, Ямскова, 1996]. Стало понятным, что наиболее адекватными экспериментальными моделями являются органотипические культуры ткани, в которых сохранена структура ткани данного органа, а также межклеточного пространства. Одной из таких моделей явилась культура заднего отдела глаза позвоночных животных, разработанная для изучения МГТБ, выделенных из тканей сетчатки и пигментного эпителия глаза [Григорян, 2003]. Для исследования МГТБ, выделенного из хрусталика глаза, позже была разработана культура целых хрусталиков позвоночных животных [Краснов, Гурмизов, 2005]. На этих моделях было установлено, что МГТБ оказывают влияние на дифференцировку, увеличивают жизнеспособность клеток при культивировании, способствуют сохранению структуры ткани и поддерживают в ней межклеточные адгезионные взаимодействия. Следует отметить, что в этих исследованиях была продемонстрирована тканеспецифичность биологического действия МГТБ, а так же отсутствие видовой специфичности. Так, например, биорегулятор, выделенный из хрусталика глаза быка поддерживал прозрачность хрусталиков как глаз быка, так и лягушки, крысы, человека [Ямскова и др., 2009]. Биорегуляторы, выделенные из нейральной сетчатки и пигментного эпителия глаза быка, на модели заднего отдела глаза тритона in vitro проявляли тканеспецифическое протекторное действие. В этих исследованиях была продемонстрирована роль МГТБ как «тонких настройщиков органо-тканевого гомеостаза» [Краснов, Григорян, 2003].В результате дальнейшего длительного поиска было обнаружено, что оптимальной моделью для изучения биологического действия МГТБ в условиях in vitro является роллерное органотипическое культивирование тканей позвоночных животных. В связи с этим, были разработаны органотипические культуры таких тканей как печень,

предстательная железа, кожа, регенерат хвоста тритона и даже культивирование целого глаза [Скрипникова и др., 2007; Рыбакова и др., 2009]. Поскольку активность МГТБ характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности [Ямскова, Резникова, 1991; Краснов, Григорян, Ямскова, 2003; Маргасюк, Григорян, Ямскова, 2005; Назарова и др., 2005; Борисенко, 2005], эксперименты были проведены, в основном, на органных культурах тканей хвостатых амфибий (тритон Pleurodeles waltl). Используя роллерный способ культивирования, было изучено действие в СМД биорегуляторов данной группы, выделенных из различных тканей млекопитающих, в том числе тканей глаза, а также некоторых желез и их секретов [Краснов и др., 2003; Назарова, 2006; Борисенко и др., 2006]. Эти исследования были проведены на органотипических культурах соответствующих тканей тритона, крысы и мыши. Большое исследование было проведено на роллерной органотипической культуре роговицы глаза тритона. В этой работе было показано, что в условиях отсутствия адгезионного сигнала активируются клеточные источники регенерации, а в присутствии биорегулятора, в СМД, выделенного из роговицы глаза быка, наблюдается дополнительная активация клеточных источников регенерации -стволовых клеток лимба и стромы [Маргасюк, и др., 2008]. В другом исследовании - на модели экспериментальной раны у мышей in vivo , было установлено, что сывороточный биорегулятор данной группы, в СМД, способствует восстановлению структуры кожи, в том числе волосяных фолликулов - стволового отдела кожи. Таким образом, способность МГТБ стимулировать процессы восстановления и регенерации в патологически измененных тканях является важнейшим свойством данной группы биорегуляторов.

Следует отметить, что метод роллерного органотипического культивирования тканей менее распространен по сравнению с методом роллерного клеточного культивирования. Впервые роллерное клеточное культивирование было предпринято в 50-60-е годы XX века на клетках

сетчатки глаза куриных эмбрионов [Moscona, 1961; Moscona, 1963; Moscona, 1968]. Значительно позже метод роллерного органотипического культивирования тканей был впервые применен при исследовании ткани эмбриональной сетчатки млекопитающих для биотестирования ряда цитокинов [Victorov, 2001]. Позже данный экспериментальный подход был использован при культивировании сетчатки взрослых тритонов с целью исследования ее регенераторных потенций [Григорян и др., 2005]. Было показано, что в данных условиях культивирования происходит накопление малодифференцированных клеток, которые активно пролиферируют и могут быть отнесены к клеточным источникам регенерации в этой ткани.

Для роллерного органного культивирования часто используются ткани амфибий. Это связано с тем, что ткани взрослых особей млекопитающих плохо переживают условия культивирования in vitro, и для поддержания их жизнеспособности необходимо внесение в культуральную среду дополнительных биологически активных веществ, которые могут повлиять на специфическое действие МГТБ.

В заключении данного раздела можно суммировать следующее - активность МГТБ проявляется в поддержании жизнеспособности клеток и структуры ткани. Кроме того, была продемонстрирована способность МГТБ стимулировать восстановительные и репаративные процессы в тканях, из которых были выделены изучаемые биорегуляторы. Было показано, что это связано с дополнительной активацией МГТБ клеточных источников регенерации в ткани. Следует также отметить, что своё специфическое действие эти биорегуляторы проявляют в СМД, что указывает на существование в тканях позвоночных животных ранее не изученного механизма проведения регуляторного сигнала, в котором важнейшая роль отводится биологическим жидкостям, а вода является матрицей для передачи информации [Ямскова, Ямское, 1999].

Важным моментом при разработке экспериментального подхода к исследованию МГТБ явилось установление локализации данных

биорегуляторов в тканях позвоночных животных, т.к. это исследование позволило бы понять механизм действия МГТБ.

Локализация МГТБ в тканях позвоночных животных и растений.

Исследование локализации МГТБ в ткани проводили с помощью методов иммуногистохимии. Поликлональные антисыворотки получали по методу Гослинга путем иммунизации кроликов фракциями биорегуляторов, очищенных после изоэлектрофокусирования [Gosling, 2000]. Молодых кроликов иммунизировали многократно и часто небольшими объемами концентрированных растворов соответствующих фракций биорегуляторов. Только при таком способе иммунизации удалось получить поликлональные сыворотки к ряду биорегуляторов данной группы. Локализацию МГТБ изучали в тканях крысы и тритона, используя иммуногистохимическую реакцию с использованием вторичных FITC-конъюгированных антител.

При исследовании локализации биорегулятора, выделенного из печени крысы, было показано, что он локализуется в области синусоида печени [Borisenko et al., 2007]. Биорегулятор, выделенный из роговицы был обнаружен в межклеточном пространстве эпителия и эндотелия роговицы. [Margasyuk et al., 2007].

Результаты проведенных исследований показывают, что МГТБ локализованы в межклеточном пространстве тканей, которые являлись источником их выделения. Эти результаты согласуются с данными, свидетельствующими о проявлении биорегуляторами данной группы мембранотропной и адгезионной активности [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Borisenko et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Nazarova et al., 2007].

Физико-химические свойства и строение МГТБ

Полученные в настоящее время данные указывают на сложный состав МГТБ. Белковая компонента ответственна за проявление активности биорегуляторов данной группы [Ямскова и др., 2009]. В свою очередь в состав белковой компоненты входят небольшие мембранотропно активные

51

пептиды (мол. масса не более 10 кДа), и белки, модулирующие их активность (белки-модуляторы) [Скрипникова и др., 2008; Ямскова и др., 2008].

Методом кругового дихроизма (КД) было показано, что вторичная структура пептидно-белковой компоненты МГТБ характеризуется преимущественным содержанием (3-структур и статистического клубка и малым содержанием а-спиралей [Ямскова и др., 2009]. Методами динамического лазерного светорассеяния и атомно-силовой микроскопии (АСМ) было установлено, что МГТБ в водных растворах присутствуют в виде наноразмерных частиц [Borisenko et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; N azar ova et al., 2007].

Как известно, при высоких концентрациях в растворе все белки могут образовывать наноразмерные частицы, но обычно этот размер соответствует приблизительно 10 нм [Armstrong et al., 2004; Cui et al., 2004]. Результаты этих исследований показали также отсутствие корреляционной зависимости между значением молекулярного веса, концентрацией белка в растворе и его тенденцией к образованию межмолекулярных ассоциатов и их размерами. В случае же МГТБ в растворах низких концентраций (100 мкг/мл) наблюдалось образование достаточно больших частиц (-50-200 нм) [Borisenko et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. При исследовании МГТБ, выделенного из пигментного эпителия глаза быка, было показано, что наноразмерное состояние биорегулятора определяло его свойство проявлять активность в СМД [Ямскова и др., 2009]. Аминокислотный анализ пептидно-белковой компоненты биорегуляторов данной группы показал, что помимо значительного количества остатков глицина, они содержат также остатки серина и дикарбоновых аминокислот, и практически не содержат остатков ароматических аминокислот [Ямскова, Резникова, 1991]. Подобный аминокислотный состав характерен для углеводсодержащих белков -гликопротеинов [Kreis, Vale, 1993; Степанов, 1996].

Данные углеводного анализа показали, что в состав МГТБ входят остатки маннозы и Ы-ацетилглюкозамина [Ямскова и др., 2009]. Тем не менее, в настоящее время углеводная компонента МГТБ остаётся малоизученной. Следует отметить, что в состав биорегуляторов данной группы входят ионы Са [Краснов и др., 2003а]. Методом афинной хроматографии было показано, что в основе образования пептидно-белковой части МГТБ лежит углевод-белковое взаимодействие, причем в качестве лектина выступает белок - модулятор, который «узнает» остатки маннозы гликопептидов [Скрипникова, Ямскова 2009]. Для пептида, входящего в состав сывороточного МГТБ , ближайшими гомологами оказались адреномодулины - белки, продуцируемые эндотелием сосудов [Ямскова и др. 2004]. Белки модуляторы были идентифицированы для сывороточного МГТБ и для пигментного эпителия глаза как две малоизученные изоформы сывороточного альбумина [Ямскова и др., 2009]. Восстановление комплекса пептидной компоненты с белком-модулятором для изученных МГТБ приводило к изменению проявляемых биологических свойств. В случае сывороточного МГТБ наблюдали полное ингибирование активности пептида; для МГТБ пигментного эпителия - выраженное восстановление протекторного действия на ткань пигментного эпителия в СМД [Скрипникова и др., 2009].

Заключение по литературному обзору

Результаты исследования МГТБ показывают, что эти биологически активные вещества внеклеточно локализованные, имеют сложный состав. Белковая компонента определяет биологическое действие МГТБ. Пептиды, отвественные за проявление мембранотропной активности и в отдельных случаях специфической биологической активности. Белки-модуляторы, которые оказывают влияние на биологическую активность пептидов, взаимодействуют с последними по механизму лектин-углеводного взаимодействия. Ионы кальция участвуют в этом механизме и, возможно, в поддержании конструкции этого комплекса. МГТБ оказывают влияние в

СМД на важные биологические процессы - адгезию, миграцию, дифференцировку и пролиферацию клеток. Они стимулируют восстановительные процессы в тканях за счет дополнительной активации клеточных источников регенерации в тканях. МГТБ являются тонкими настройщиками органотканевого гомеостаза и представляют собой малоизученную группу эндогенных биорегуляторов.

Глава 2. Материалы и методы

Используемые реактивы и приборы

СаС12 - Serva, Германия; NaCl - Реахим, хч, Россия;, Германия; бычий сывороточный альбумин (БСА) - Serva, Германия, Sigma, США; Na2C03 -Реахим, хч, Россия; NaOH - Реахим, хч, Россия; NaHC03 - Реахим, хч, Россия; CuS04*5H20 - Реахим, хч, Россия; ацетонитрил - Реахим, хч, Россия; Tris -Serva, Германия; додецилсульфат натрия - Serva, Германия; дитиотреитол -Serva, Германия; акриламид - Sigma, США; бис-акриламид - Sigma, США; персульфат аммония - Sigma, США; ТЭМЭД (тетраметилэтилендиамин) -Sigma, США; изопропанол - Реахим, хч, Россия;Трипсин - Promega; уксусная кислота - Реахим, хч, Россия; глицин - Serva, Германия; метиловый спирт -Реахим, хч, Россия; трифторуксусная кислота - Реахим, хч, Россия; меркаптоэтанол - Реахим, хч, Россия; кумасси G-250-Eastman, США; соляная кислота - Реахим, хч, Россия; трипановый синий - Serva, Германия; этиловый спирт - Реахим, хч, Россия; ацетон - Реахим, хч, Россия; п-ксилол - Реахим, хч, Россия; KCl - Реахим, хч, Россия; КН2РО4 - Реахим, хч, Россия; NaH2P04 -Sigma, США; Na2HP04 - Sigma, США; сульфат аммония - Реахим, хч, Россия; твин-20 - Sigma, США; сульфат меди - Merk, Германия; США; бицинхониновая кислота - Sigma, США; Sigma, США,; мембранные фильтры типа "CA" - Nalgene, США с размером пор 0,22 мкм; среда 199 - Институт полиомиелита, Россия.

В работе использовали следующих животных: крысы линии Wistar (120 штук, самцы), мыши поколения Fl С57В1/СВА (90 шт., самцы), взрослые тритоны Pleurodeles waltl (Urodela) (9-12 мес., длина 10-12 см, 35шт., самцы), полученные из аквариальной ИБР РАН.

Были использованы следующие приборы: источник тока для электрофореза - PowerPac Basic (BioRad), США; прибор для вертикального электрофореза Mini vertical gel system EC 120 (BioRad), США; спектрофотометр - Ultrospec 1100 pro, (Biochrom Ltd.), Англия;

микроскоп световой - Jenaval (Carl Zeiss, JENA), Германия; роллер - Assistant

RM5 (Karl Hecht KG), Германия; световой микроскоп - Olympus Vanox АНВТЗ, Япония; цифровая камера - Olympus U-PMTVC, Япония; КД-спектрометр - Jasco 720, Япония; Microplate reader MR700 (Dynatech Laboratories), Great Britain; рН-метр Oakton 2100 series (EUTECH Instruments), Сингапур; Ультразвуковая баня - Transsonic Digital (Elma), Швейцария. MALDI-времяпролетный масс-спектрометр Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенный УФ лазером (Nd).

2.1 Получение тканевых экстрактов

В работе исследовали экстракты тканей органов, выделенных из 120 крыс. Крыс декапитировали под эфирным наркозом, печень перфузировали через портальную вену 10 мл раствора Рингера (0,15 М NaCl; 1 мМ СаС12; 5 мМ KCl; 1 мМ HEPES), удаляя основную массу крови. Печень извлекали,

л

разрезали на фрагменты размером приблизительно 1,5-2,0 см и помещали на 2-2,5 ч при 4-8°С в раствор Рингера. Затем извлекали легкие и разрезали их на фрагменты размером 0,5-1,0 см3 и тонкий кишечник, который промывали раствором Рингера, а затем разрезали на кусочки 1-1,5 см и получали тканевые экстракты в таких же условиях, как экстракт печени.

Экстракты печени и легкого быка получали из предварительно замороженной ткани, после доведения ее до температуры +4 - +7 °С. Для этого ткань оставляли при +4 - +7 °С до полного размораживания, образовавшуюся жидкость сливали, ткань нарезали фрагментами размером 2,5 — 3,0 см и получали тканевые экстракты в таких же условиях, как экстракты тканей крыс.

Тканевые экстракты фильтровали через несколько слоев марли, далее центрифугировали (2000g, 30 мин), и далее исследовали или же хранили при -25 °С в течение длительного времени.

2.2 Получение супернатантов тканевых экстрактов

К экстракту ткани при перемешивании при комнатной температуре добавляли сульфат аммония до образования насыщенного раствора соли (78 г сухой соли на 100 гр. воды). Высаливание белков проводили в течение 72

часов при t +4°С, после чего осажденные белки отделяли центрифугированием в течение 30 мин на скорости 15000 g при t +4°С. Далее их растворяли в фосфатно-солевом буфере (0.01 М PBS, pH 7.4) и диализовали против 0.01 М PBS. Супернатанты экстрактов диализовали против дистиллированной воды (с добавлением азида натрия) для удаления низкомолекулярных примесей и сульфата аммония в течение 10 дней при t +4°С с многократной сменой воды (в соотношении 1:50). В течение последних 48 часов перед снятием диализных мешков азид натрия в дистиллированную воду не добавляли. Повторно высаливали и диализовали. Полученные бессолевые супернатанты экстрактов концентрировали, используя вакуумный роторный испаритель (37 °С) и сохраняли при t -70°С. 2.3 Определение концентрации белка

Количественное определение белка в исследуемых фракциях осуществляли с помощью колориметрического метода с использованием бицинхонината меди при 562 нм [Smith и др., 1985].

Для этого готовили два раствора:

Раствор А - 1 г бицинхониновой кислоты, 2 г Na2C03, 0,16 г тартрата натрия, 1 г NaOH, 0,95 г NaHC03 в 100 мл дистиллированной воды (рН=11,25);

Раствор Б - 0.4 г CuS04*5H20 в 10 мл дистиллированной воды.

Непосредственно перед проведением опыта готовили третий раствор В, смешивая 50 мл раствора А с 1мл раствора Б. Для определения концентрации белка к 50 мкл исследуемого раствора прибавляли 1мл раствора В, инкубировали пробы 30 минут при 60 °С, затем охлаждали до комнатной температуры. Поглощение измеряли при 562 нм. Для построения калибровочной кривой вначале готовили растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрациях: 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 250, 500, 750, 1000 мкг/мл. К 50 мкл раствора БСА известной концентрации добавляли 1 мл раствора В, полученные пробы инкубировали, измеряли поглощение по описанной выше методике и строили калибровочную кривую согласно

результатам измерений. По построенной калибровочной кривой определяли концентрацию белков в исследуемых растворах.

2.4 Определение мембранотропной активности при кратковременном

органном культивировании печени и легкого мыши in vitro

Адгезиометрический метод определения мембранотропной активности № 1. Тестирование биорегуляторов во фракциях, получаемых в процессе очистки, проводили с помощью адгезиометрического метода, специально разработанного для идентификации биологически активных в СМД биорегуляторов данной группы. Интервал активных концентраций для соответствующего биорегулятора определяли, исследуя биологическое действие его растворов, полученных при последовательном разведении исследуемой фракции в 10, 100, 1000 и более раз. Эксперименты проводили на мышах-гибридах F1 С57В1/СВА, самцах весом 18-22 г., содержащихся в виварии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. После декапитации животного, из печени или из легкого вырезали фрагменты весом 0,5-1,0 мг, помещали по пять фрагментов ткани в пенициллиновые флаконы, содержащие 0,9 мл питательной среды 199 и 0,1 мл исследуемого раствора препарата биорегулятора, полученного при 10-кратном последовательном разбавлении изучаемой исходной фракции. В качестве контроля были исследованы органотипические культуры, которые инкубировали в 1,0 мл питательной среды 199, не содержащей биорегулятор. Культуры инкубировали в течение 2 ч при 37 °С. Далее, каждый фрагмент ткани вынимали, быстро осушали на фильтровальной бумаге, взвешивали и подвергали диспергированию в специальном дезинтеграторе с зазором 50 мкм в 0,1 мл 0,1%-ного раствора трипанового синего, приготовленного на 199-й среде. Полученную суспензию клеток и клеточных ядер исследовали микроскопически в камере Горяева, проводя подсчет клеточных ядер в определенном объеме камеры (0,02 мм3).

В каждом опыте на одну экспериментальную точку (раствор исследуемого биорегулятора в определенной концентрации, а также и в

контроле) просчитывали не менее 5 фрагментов ткани. Для определения биологической активности каждого препарата проводили не менее 3-4 опытов. При этом мембранотропную активность рассчитывали по формуле [1]:

Ma=200%-[(Non./NK.) х 100%],

где Ma - мембранотропная активность;

Non. и NK - количество клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани, соответственно, в опыте (тканевые культуры в присутствии исследуемого белкового биорегулятора) и в контроле (тканевые культуры без добавления исследуемого биорегулятора). Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.

Адгезиометрический метод определения мембранотропной активности №2.

Эксперименты проводили на мышах-гибридах Fl С57В1/СВА, самцах весом 18-22 г., содержащихся в виварии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. После декапитации животного, из печени вырезали фрагменты весом 0,5-1,0 мг, помещали по пять фрагментов ткани печени в пенициллиновые флаконы, содержащие 0,9 мл питательной среды 199 и 0,1 мл исследуемого раствора препарата биорегулятора в активной концентрации. В качестве контроля были исследованы органные культуры печени, которые инкубировали в 0,9 мл питательной среды, содержащей 0,1 мл физиологического раствора.

Органные культуры инкубировали в течение 20 мин. при 37 °С. Далее в течение интервала - 2,5 минуты приготавливали суспензии клеток и клеточных ядер путем диспергирования в специальном дезинтеграторе с зазором 50 мкм в 0,1 мл 0,1%-ного раствора трипанового синего, приготовленного на 199-й среде. Из двух фрагментов ткани: один фрагмент брали из опытной серии, а второй фрагмент из контрольной. Таким образом приготавливали не менее 10 экспериментальных пар, состоящих из фрагментов ткани опытной и контрольной серии. Затем полученные

суспензии клеток и клеточных ядер исследовали микроскопически в камере Горяева, проводя подсчет клеточных ядер в определенном объеме камеры (0,02 мм3). Подсчет ядер проводили не позже чем 60-85 мин. от начала инкубации. Эксперименты повторяли не менее 3-х раз, используя разных животных.

Мембранотропную активность рассчитывали для каждой пары (контроль - опыт) по вышеуказанной формуле [1].

2.5 Электрофорез белковых фракций в полиакриламидном геле

Электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле проводили в денатурирующих условиях по методу Лэмли (толщина геля - 0,75 мм, размер 8x10 см) [Laemmli, 1970]. Окрашивание гелей проводили с помощью красителя Кумасси G-250 [Wilson, 1983].

Состав 15%-ного разделяющего полиакриламидного геля: мономерный раствор (массовые доли акриламида 30,8 %, бис-акриламида 2,7 %) - 7,5 мл, Трис - буфер (1,5М Трис- HCl, pH 8,8) - 3,8 мл, 10% -ный раствор додецилсульфата натрия - 0,15 мл, бидистиллированная вода - 3,6 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 75 мкл, ТЕМЭД (тетраметилэтилендиамин)- 5 мкл. Состав концентрирующего 4%-го полиакриламидного геля: мономерный раствор - 0,44 мл, раствор буфера (0,5 М Трис - HCl, pH 6,8) - 0,83 мл, 10%-ный раствор додецилсульфата натрия -33 мкл, бидистиллированную воду - 2,03 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 16,7 мкл, ТЕМЭД - 1,7 мкл. Электродный буфер содержал: 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1% додецилсульфат натрия (pH 8,3).

Для получения электрофоретически чистого белка проводили электрофорез в нативных условиях, без использования при приготовлении гелей и буферов додецилсульфат натрия [Harnes, 1990]. Маркеры (апротинин из легкого быка - 6,5 кДа, а-лактальбумин - 14,2 кДа, соевый ингибитор трипсина - 20,0 кДа, трипсиноген из поджелудочной железы быка - 24,0 кДа, карбоангидраза - 29,0 кДа, глицеральдегид - 3 - фосфатгидрогеназа - 36,0 кДа, овальбумин - 45,0 кДа, альбумин - 66, 0 кДа.) При окрашивании гелей

красителем Кумасси G-250, их сначала помещали на 10-15 мин в фиксирующий раствор (25% изопропанол, 10% уксусная кислота), а затем в раствор Кумасси (10% уксусная кислота, 0,06% Кумасси G-250) до появления окраски. Для снятия фонового окрашивания использовали фиксирующий раствор (5% метанол, 7% уксусная кислота).

Для получения форетически чистой фракции исследуемого образца из геля вырезали окрашенные полосы, элюировали деионизированной водой MilliQ с добавлением азида натрия, затем диализовали против деионизированной воды. Далее полученный раствор белка концентрировали до небольших объемов. Для исследования биологической активности и проведения биологических экспериментов использовали только белковую фракцию, полученную в не денатурирующих (нативных) условиях. Для этого электрофорез в ПААГ проводили без добавления додецилсульфата натрия. 2.6 Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле.

Проводили следующим образом: кусочек геля размером около 2x2 мм, дважды промывали для удаления красителя в 100 мкл 40 % раствора ацетонитрила в 0.1 М NH4HCO3 в течение 20 мин при комнатной температуре. После удаления раствора для дегидратации геля добавляли 100 мкл ацетонитрила. Удалив ацетонитрил и высушив кусочек геля, прибавляли к нему 4 мкл раствора модифицированного трипсина (Promega) в 0.05 М NH4HCO3 с концентрацией 15 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 18 ч при 37 °С, затем к раствору добавляли 7 мкл 0.5 % ТФУ в 10 % растворе ацетонитрила в воде и тщательно перемешивали. Надгелевый раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров.

Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводился в базе данных NCBI среди белков всех организмов с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом. Кандидатные белки, имеющие параметр

достоверности score >83 в базе данных NCBI считали определенными надежно (р<0.05).

2.7 Определение вторичной структуры с помощью метода кругового дихроизма

В основе метода кругового дихроизма лежит анализ отклонений плоскости поляризованного света, вызванных различными формами конформации полипептидной цепи. Мерой такого отклонения является угол эллиптичности, определение которого позволяет оценить долю а-спиралей, [3-структур и статистического клубка в молекуле изучаемого белка или пептида. Спектры кругового дихроизма в УФ-области (195-260 нм) снимали на КД-спектрометре Jasco 720 (Япония) при 20°С в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 мм. Скорость сканирования составила 50 нм/мин, шаг - 1 нм, накопление каждого шага - 2 сек. Концентрация исследуемого белка в водном растворе составляла 100 мкг/мл. Итоговый спектр получали по результатам усреднения данных трех сканирований и вычитания спектра базовой линии (контроля). Содержание элементов вторичной структуры оценивали с помощью программы CDNN

(http://bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn).

2.8 Определение размеров частиц методом динамического лазерного светорассеяния

Эксперименты по определению гидродинамического радиуса частиц в растворах фракций выполняли методом динамического рассеивания света на приборе "PhotoCor Complex" (фирма "ФотоКор", Россия), снабженном автоматическим гониометром, мульти-временным коррелятором реального времени "PhotoCor-FC" и гелий-неоновым лазером "Uniphase 1135Р" мощностью 20 мВт (А,=633нм) в качестве источника света. Измерения проводили при угле рассеяния 90 °С и температуре 25 °С. Пыль из растворов удаляли путем фильтрования через мембраны "Durapore" с диаметром пор 0,22 мкм ("Millipore"). Определяли гомодинную корреляционную функцию интенсивности G (t) в интервале времен задержки от 2x10" до 10 с.

Распределение по временам корреляции получено методом обратного преобразования Лапласа с использованием программы CONTIN. Для перехода от времен корреляции (т) к гидродинамическому радиусу (Rh) использовали следующие соотношения D=l/q т и D=kT/67rr/Rh, где rj-вязкость растворителя, к - константа Больцмана, D - коэффициент диффузии, q- волновой вектор.

2.9 Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

Фракцию исследуемого супернатанта, объемом 20 мкл наносили на колонку С8-4,6x250 (Биохиммак) на хроматографе Agilent 1100 (США) при t=20°C в растворе ацетонитрил/0,1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ) (1:1). Элюцию проводили со скоростью 1 мл/мин, 70 мин, элюент: ТФУ-ацетонитрил (0% - 70%). Детекцию белковых фракций проводили при 280 нм. Полученные после ВЭЖХ фракции подвергали биотестированию и при наличии биологической активности далее исследовали их физико-химические свойства.

2.10 Роллерное органотипическое культивирование печени тритона in vitro

Объектом исследования были взрослые тритоны Pleurodeles waltl (Urodela) (9-12 мес, длина 10-12 см, 35 шт.), полученные из аквариальной МБР РАН.

Тритоны были наркотизированы в 0,1%-ном растворе MS-222. После наркотизации животных декапитировали. Изолированную печень помещали в стерильные чашки Петри (3,5 см) в бессывороточную среду для амфибий. С помощью бинокуляра, оснащенного источником холодного света, печень разрезали на фрагменты размером 3x3 мм, каждый фрагмент включал как паренхиму, так и соединительную ткань капсулы.

Органотипическое роллерное культивирование ткани печени тритонов проводили в следующих условиях. Среда культивирования состояла из среды 199 (70%), дистиллированной воды (30%), буфера HEPES (30 мкл на 100 мл

среды), гентамицин сульфата (200 мкл на 100 мл среды) и 10%-ной эмбриональной бычьей сыворотки (10 мл на 100 мл среды). Перед внесением в пузырьки среда проходила холодную стерилизацию через мембранные фильтры типа " МШех-СУ" фирмы МПНроге (Ирландия) с размером пор 0,2 мкм. Полученные фрагменты печени помещали в культуральные флаконы из темного стекла объемом 10 мл. В каждый разливали по 5 мл среды. Во

флаконы опытных серий в среду однократно добавляли исследуемую

10

белковую фракцию (0,1 мл) в конечной концентрации, соответствующей 10" мг/мл, которую получали последовательным десятикратным разбавлением исходного препарата в питательной среде 199. Все флаконы закрывали стерильными крышками, затем пленкой РагаШт М и ставили в термостат. Культивирование печени тритона проводили в темноте при температуре 19±1°С при скорости вращения 35 об/мин в течение 3 суток. Содержание кислорода в пробирках составляло 9.1 мг/дм . Культуральную среду в течение всего срока культивирования не меняли, при этом показатели рН оставались практически неизменными.

В экспериментальной серии при исследовании лекарственных средств изучали дозы, которые рассчитывали исходя из инструкции по применению каждого препарата. Учитывали соотношение массы печени человека и массы печени тритона при расчете. Полученные растворы лекарственых средств добавляли в питательную среду как описано выше. Далее эксперимент проводили аналогично тому как и при исследовании биорегуляторов. 2.11 Приготовление гистологических срезов.

Для приготовления парафиновых срезов фрагменты ткани печени помещали в фиксатор Буэна, фиксировали в течение 4 часов и затем в течение 12 часов трижды отмывали 70%-ным этанолом. После этого фрагменты ткани печени дегидратировали и заливали в парафин. Парафиновые блоки резали на серии срезов толщиной 4-5 мкм, которые после депарафинирования и гидратирования окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в канадский бальзам под покровное стекло. Для

иммуногистохимических исследований в качестве фиксатора использовали 4% раствор формалина в фосфатном буфере (0.01 M PBS, рН 7.4), срезы размещали на желатинизированных стерильных стеклах и не окрашивали. 2.12 Методы иммунохимического анализа

Для выявления экспрессии белков-маркеров основных клеточных типов использовали метод непрямого иммуноокрашивания с применением различных специфических первых и вторых антител. После культивирования фрагменты печени погружали в 4%-ный раствор формалина, приготовленный на фосфатном буфере (0.01 M PBS, рН 7.4) и фиксировали в течение 6 ч. После фиксации материал отмывали в 0.01 M PBS 2 раза по 24 ч при 4°С, дегидратировали, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 6-7 мкм, которые наклеивали в растворе спирта на тонкие предметные стекла.

Перед инкубацией с первичными антителами срезы освобождали от парафина, проводя их через ксилолы и спирты, и затем тщательно отмывали в фосфатном буфере (PBS, рН = 7.4). После этого срезы обрабатывали (30 мин) в 0.1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma) на PBS, вновь отмывали и инкубировали в растворе, увеличивающем проницаемость антител (0.25% Triton Х-100 (Sigma, США) на 0.1%-ном растворе Tween/PBS (Sigma, США)). Затем проводили обработку первичными антителами (t = 20°С, в течение ночи).

Растворы первых антител включали 5-10% готового раствора BSA для устранения неспецифического связывания и 0.3% Triton Х-100 - для улучшения проницаемости первичных антител.

После инкубации с первичными антителами срезы отмывали в PB S и наносили вторичные антитела Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, CUTA). Рабочая концентрация вторичных антител составляла 1:50. В ряде случаев в качестве вторичных применяли антитела, связанные с пероксидазой хрена (HRP), и реакцию проявления окраски с DAB (Sigma). После отмывания срезы заключали под покровные стекла в смесь глицерина с буфером (1:10) с добавлением DABCO (Sigma).

2.13 Окрашивание на клеточную гибель методом TUNEL.

Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) маркирует клетки с ДНК, деградирующей в результате активации Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы. Окрашивали компонентами кита DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega Corporation, США) в соответствии с протоколом производителя. Окрашенные срезы заключали в смесь глицерин-PBS (1:9) с добавлением DABCO (Sigma) под покровные стекла.

Изучение локализации и интенсивности иммунохимического окрашивания проводили с помощью микроскопа Olympus АН-3. При анализе рассматривалась флуоресценция как в зелёном канале (канал в котором дают свечение FITC метка), так и в красном (для исключения неспецифического окрашивания), а также и в синем канале (для изучения окраски Hoechst).

2.14 Морфометрическая оценка гистологических срезов

Оценку площади, занимаемой пигментированными клетками в печени тритона, проводили с помощью инструмента анализа изображений -«счетчик» программы Adobe Photoshop CS5.1. Все фотографии срезов были получены на микроскопе Olympus АН-3 с цифровой камерой. Разрешение срезов составляло 4080x3072. Площадь пигментированных клеток оценивали в процентах от общей площади среза ткани. Для этого вычисляли количество пикселей на фотографии, которую занимает гистологический срез печени тритона и сравнивали с количеством пикселей, которое занимали на данном срезе пигментированные клетки.

2.15 MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ

Подготовка образцов для масс-спектрометрии проводилась следующим образом: на мишени смешивали по 0.5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich, 20 мг/мл в 20 % ацетонитриле в воде с 0.5 % ТФУ), полученную смесь высушивали на воздухе.

Масс-спектры были получены на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ лазером (Nd)

в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона и в тандемном режиме (MS/MS); точность измеренных масс после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.005% (50ррм), точность измеренных моноизотопных масс фрагментов была в пределах 2 Да.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Мальцев, Дмитрий Игоревич

Выводы

1. Показано, что в тканях печени, легкого млекопитающих присутствуют биорегуляторы, белковой природы, имеющие сложное строение, биологическое действие которых проявляется в СМД и характеризуется наличием тканевой, но не видовой специфичности. Биорегуляторы могут быть выделены как из свежеприготовленной ткани, так и из ткани, предварительно подвергшейся замораживанию.

2. Показано, что при высаливании тканевых экстрактов, в условиях насыщенного раствора сульфата аммония образуется биологически активная фракция надосадочной жидкости, содержащая пептиды с молекулярной массой от 1000 до 9000 Да и осадок белков с мол. массой от 10000 до 160000 Да, в состав которого входят модуляторы биологической активности пептидов.

3. Показано, что одними из компонентов фракции белков - модуляторов, входящих в состав биорегуляторов печени и легкого крыс, являются изоформы сывороточного альбумина.

4. Сравнительный анализ результатов оценки биологического действия МГТБ, выделенных из печени и легкого крыс, полученных на двух экспериментальных моделях, а именно определения мембранотропной активности, определяемой на модели органотипического культивирования ткани печени или легкого мыши с одной стороны, и роллерного органотипического культивирования печени тритона Р1еигос1е1е$ \valtl с другой, показал, что за тканевую специфичность биологического действия биорегуляторов ответственны как пептидная часть, так и белки -модуляторы.

5. Показано, что фракции биорегуляторов, выделенные из печени, легкого и тонкого кишечника крыс различались по характеру биологического действия: тканеспецифическое мембранотропное действие проявляли только тканевые экстракты; мембранотропная активность супернатантов, ВЭЖХ- и ИЭФ-фракций характеризовалась отсутствием тканевой специфичности.

Было установлено, что тканевые экстракты не проявляли биологического действия на модели органотипического роллерного культивирования печени тритона, в то время как фракции супернатантов оказывали тканеспецифическое действие, а ВЭЖХ - и ИЭФ - фракции биорегулятора печени крыс по своему действию от фракции супернатанта тканевого экстракта не отличались.

6. Впервые показана локализация цитоплазматического макрофагального антигена человека LN-5 на поверхности паренхиматозных клеток печени тритона, что свидетельствует о сходстве антигенных детерминант молекул поверхности клеток печени тритона, а также белков цитоскелета макрофагов человека.

7. Впервые иммуногистохимическими методами было показано, что при роллерном органотипическом культивировании in vitro воздействие фракции супернатанта тканевого экстракта печени крысы способствует увеличению жизнеспособности клеток печени тритона.

8. Показано, что после травмирования у тритона в печени увеличивается площадь пигментированных клеток.

9. Показано, что лекарственные вещества, проявляющие гепатопротекторное свойство, оказывают влияние на состояние печени тритона при культивировании, что выражается в изменении площади, занимаемой пигментированными клетками печени.

Заключение

Рассмотрим предполагаемое строение и функцию МГТБ на основании результатов, полученных при исследовании МГТБ, выделенных из печени и легкого млекопитающих, а также на основании литературных источников,

Изучение МГТБ начиналось с исследования их как молекул адгезии [Мойуапоуа, Мсйепкоу, 1973; Ямскова и др., 1977]. В этих и последующих работах было показано эффективное действие МГТБ на клеточную адгезию [Ямскова и др., 1977, 1978]. В связи с этим было высказано предположение, что МГТБ как молекулы адгезии, взаимодействуют с ПМ двух контактирующих клеток [Ямскова, Резникова, 1979]. В настоящее время показано, что биорегуляторы данной группы, в том числе, выделенные из тканей печени и легкого млекопитающих, имеют сложный состав. Биологически активная компонента представляет собой небольшие пептиды, которые остаются растворимыми в условиях насыщенного раствора сульфата аммония. Данные настоящего исследования, а также исследования МГТБ, выделенных из сыворотки и ПЭ глаза быка, указывают на то, что белки-модуляторы представляют собой малоизученные изоформы сывороточных альбуминов [Ямскова и др., 2004, 2009]. В этих работах была показана модуляция активности пептидов МГТБ этими формами сывороточных альбуминов. В настоящей работе также удалось восстановить тканеспецифическую мембранотропную активность биорегулятора, выделенного из печени, после взаимодействия электрофоретически очищенного белка-модулятора (сывороточного альбумина) и пептидов в виде суммарной ВЭЖХ-фракции. Возможно, именно это взаимодействие лежит в основе «самосборки» МГТБ на поверхности клетки или в межклеточном пространстве.

Следует отметить, что в процессе фракционирования тканевых экстрактов происходит не только очистка МГТБ от примесных белков, но и нарушение их структуры: в осадок переходит основная часть белков-модуляторов, а в супернатантах остаются низкомолекулярные пептиды - биологически активная компонента МГТБ, и некоторое количество их пептидно-белкового комплекса. Как было показано в этой работе и при исследовании МГТБ, выделенных из различных тканей, супернатанты тканевых экстрактов проявляют мембранотропную активность всегда, и она характеризуется отсутствием тканевой специфичности. Можно предположить, что пептиды, входящие в состав МГТБ, являются продуктами протеолиза белков межклеточного пространства, в том числе, адгезивных белков. Они могут сохранять способность к взаимодействию с соответствующими сайтами ПМ клетки, а белки-модуляторы, являющиеся членами семейства сывороточных альбуминов, способны собирать и ориентировать в межклеточном пространстве эти небольшие пептиды. Известно, что сывороточный альбумин имеет ряд сайтов связывания как гидрофильных, так и гидрофобных веществ, а кроме того, может функционировать как внеклеточный шаперон [БаБапо е? а1, 2005; 1¥уай а1, 2013]. На рис. 45 представлена схема, отражающая наши представления о структуре МГТБ, локализованных в межклеточных пространствах тканей. Такая локализация МГТБ в межклеточном пространстве была показана имунногистохимически для многих биорегуляторов данной группы, в том числе, была продемонстрирована локализация биорегулятора, выделенного из печени крыс в синусоидальном пространстве [Ямскова и др. 2012].

Мы предполагаем, что МГТБ участвует в гетерофилическом молекулярном механизме клеточной адгезии, а биологически активные пептиды, входящие в состав МГТБ, являются продуктами протеолиза компонентов межклеточного пространства, в том числе адгезивных белков, компонентов ВКМ, которые постоянно обновляются за счет постоянной работы ферментов межклеточного пространства, например, матричных металлопротеаз [например, ЬетаЫге, О'АгтгеШо, 2006]. При этом образовавшиеся в результате протеолиза пептиды сохраняют специфическое связывание с соответствующими рецепторами ПМ. Сывороточный альбумин (изоформа, индивидуальная для каждого органа), действуя как внеклеточный шаперон, организует пептиды в качестве таких лигандов [МагШ а1., 2005, ¡>УуаМ а1, 2013]. Согласно таким представления, сывороточный альбумин является компонентом межлеточного пространства тканей и участвует в процессах клеточной адгезии. Мы предполагаем, что С-конец сывороточного альбумина может быть связан с системой фосфатидилинозитольного якоря, который имеет сложное строение и включает олигосахаридный кор, содержащий маннозид, глюкозамин, фосфоэтаноламин а также собственно инозитольный якорь с жирными кислотами.

Н7С—СИ -СИ, кшонте модификации олигоспарадного кора

И,- Мша\2 (?.= фосфоэтаноламин фосфоэтаноламин

К-бМф (?.= 0а1Ыас&1,4 Я Жирные кислоты

Рис. 45 Гипотетическая схема взаимодействия альбумина (изоформа) с фосфатидилинозитольным якорем на ПМ клетки;

1. - С-конец альбумина;

2. - фосфоэтаноламин;

3. - сложноэфирные связи, которые могут гидролизоваться при экстракции МГТБ из ткани;

4. - инозитол;

5. - жирные кислоты.

Данная структура также содержит остатки фосфорной кислоты [например, Ferguson et al., 1999J. На наш взгляд, предложенная схема наиболее полно объясняет свойства и характер биологической активности тканевых экстрактов и их отдельных фракций, например, получение мембранотропно-активных фракций при ИЭФ супернатантов в области рН менее 3,0.

Рис. 46 Предполагаемая схема локализации в межклеточном пространстве и участия МГТБ в клеточной адгезии. Показаны ПМ двух контактирующих клеток:

1. - альбумин (изоформа), функционирует как шаперон;

2. - пептиды, которые являются продуктами протеолиза адгезивных белков и сохраняют способность взаимодействия с рецепторами;

3. - рецепторы адгезивных белков, которые подверглись протеолитическому гидролизу;

4. - фосфатидилинозитольный якорь с олигосахаридным кором, к которому через С-концевой домен присоединен сывороточный альбумин (изоформа).

В процессе получения тканевых экстрактов при пониженной температуре, происходит фазовый переход ПМ клеток, в результате чего, встроенные в мембрану структуры могут высвобождаться и переходить в экстрагируемый раствор. Кроме того, некоторые связи, например сложноэфирные связи (рис. 45) могут гидролизоваться и в таком случае уже отдельные фрагменты олигосахаридного кора, инозитольного якоря и МГТБ могут оказаться в виде

Альбумин I , отдельных компонентов в экстрагируемом растворе. В данном случае мембранотропной активностью могут обладать пептиды, которые взаимодействуют с сайтами адгезивных белков, так и присутствующие в экстракте отдельные фрагменты олигосахаридного кора, которые имеют сайты связывания маннозы и галактозы на клетках печени [Weigel, 1980]. На это указывают результаты, ранее полученые при исследовании мембранотропной активности ряда олигосахаридных структур разного строения, содержащих остатки маннозы, галактозы и N-ацетилглюкозамина. Было показано, что мембранотропную активность, определяемую методом биотестирования МГТБ, проявляют только структуры, содержащие такие терминальные остатки как Man (а 1-2), Gal (pi-4), N-ацетилглюкозамин [Рыбакова, 2004]. Результаты этого исследования показали, что на поверхности клеток печени млекопитающих имеются специфические сайты связывания для таких олигосахаридов. Поэтому олигосахаридные фрагменты фосфатидилинозитольного якоря могут быть ответственны за проявление мембранотропной активности тканевыми экстрактами, и, особенно, фракциями их супернатантов. Таким образом, можно предположить, что при высаливании сернокислым аммонием тканевых экстрактов структура МГТБ разрушается из-за осаждения альбумина, а в растворенном виде остаются пептиды и фрагменты инозитольного якоря и олигосахаридного кора. Такой состав супернатантов тканевых экстрактов всегда будет обусловливать проявление этими фракциями мембранотропной активности, определяемой данным адгезиометрическим методом. При этом в результате удаления альбумина, выполняющего функцию шаперона, утрачивается тканеспецифическая мембранотропная активность. Оставшиеся пептиды и компоненты олигосахаридного кора способны образовывать устойчивые наноразмерные частицы, в которых разделение компонентов происходит только в жестких условия обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте ацетонитрил-вода или изоэлектрофокусирования. Таким образом, анализ полученных результатов показывает, что мембранотропную активность, проявляемую супернатантами, обусловливают, с одной стороны, пептиды, которые могут взаимодействовать с рецепторами ПМ клеток, а с другой, -отдельные углеводные компоненты олигосахаридного кора. Именно последние придают соответствующей фракции неспецифический характер данного вида активности (рис. 45, 46). После восстановления структуры комплекса «пептиды-альбумин» мембранотропная активность приобретает тканеспецифический характер.

Следует отметить, что в работе [ЖуаМ е/ а1, 2013] рассмотрено нарушение функции внеклеточных шаперонов как одна из основных причин развития тяжелых заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, макулодистрофия, дистрофия роговицы, диабет второго рода и др. Рассматривается также нарушение работы ряда наиболее изученых внеклеточных шаперонов, однако данные по исследованию в этом аспекте альбумина недостаточны. Тем не менее, можно предположить, что нарушение функций МГТБ, связанное с действием альбумина как шаперона, способно вызвать развитие многих заболеваний, обусловленых нарушением процессов биорегуляции, потому что важнейшим фактором обеспечивающим ход и направленность основных биологических процессов, является состояние клеточной адгезии.

Предложенная схема объясняет различную активность тканевых экстрактов и их отдельных фракций на модели оценки мембранотропной активности и исследования специфической активности. По нашим представлениям, в условиях 3-х дневного роллерного культивирования может происходить восстановление комплекса МГТБ из пептидов, экзогенно добавленых в виде исследуемой фракции, и альбумина печени тритона. При исследовании тканевого экстракта наблюдаемое отсутствие его биологического действия можно объяснить наличием в нем белков млекопитающих, например, иммуноглобулинов, которые могут препятствовать образованию новых комплексов МГТБ на поверхности клеток печени тритона [Обухова и др., 2011]. Следует отметить, что для

МГТБ, выделенных из других тканей, также на моделях роллерного органного культивирования наблюдали выраженное протекторное действие на ткань.

При исследовании влияния МГТБ, выделенного из печени млекопитающих, основным параметром оценки состояния ткани было определение площади пигментированных клеток - аналогов Купферовских клеток. Нами было показано, что в печени тритона существует несколько фенотипов клеток с функциями макрофагов. Не исключено, что это связано с сохранением процессов кроветворения в печени взрослых амфибий. Здесь уместно еще раз напомнить о том, что локализация МГТБ, выделенного из печени крыс, была показана в области синусоида печени. Совокупность этих данных позволяет сделать предположение о том, что МГТБ, выделенные из печени млекопитающих, оказывает влияние на клетки синусоидального пространства. К таковым относятся - эндотелиоциты, звездчатые ретикулоциты (клетки Купфера), Pit-клетки, но наиболее, на наш взгляд, вероятно, что мишенью для МГТБ, выделенного из печени, являются именно купферовские клетки. Которые, как и все другие клетки печени, взаимодействуют с гепатоцитами, и поэтому способны передавать регуляторный сигнал опосредованно гепатоцитам [Kmiec, 2001]. Например, ранее было показано, что МГТБ, выделенный из печени, стимулирует работу ферментов Р-450 в микросомах печени крыс in vitro [Котелевцев и др., 2000]. Таким образом, можно предположить, что в основе протекторного действия МГТБ, выделенного из печени млекопитающих, лежит его способность к активации гепатоцитов, которая опосредуется через влияние на пигментированные клетки печени.

Высказанные выше предположения о структуре и функции МГТБ в тканях основывались на современных представлениях о механизмах процессов клеточной адгезии, строения и функций ПМ, и межклеточного пространства. Однако во всех экспериментах по исследованию биологической активности МГТБ, в том числе и проведенных в настоящей работе, были изучены тканевые экстракты и их отдельные фракции в СМД. На наш взгляд, это не изменяет высказанных выше предположений о механизмах, лежащих в основе биологического действия МГТБ и представленных в виде молекулярных схем. Еще в 1999 году нами была сформулирована гипотеза о «малом матриксе» как структуре межклеточного пространства, которая участвует в передача информационного сигнала в ткани. «Малый матрикс» состоит из МГТБ и воды, образующих биконтинуальную систему, в которой вода выполняет функцию «информационной матрицы», а МГТБ способствует переходу воды в состояние, обеспечивающее эту ее функцию [Ямскова, Ямское, 1999]. В настоящее время для объяснения феномена СМД предложена концепция, основанная на изменениях структуры воды в организмах при воздействии биологически активных веществ [Бурлакова и др., 2004; Ямскова, Ямское, 1999]. Мы полагаем, что в основе этого явления лежит способность практических всех веществ вызывать образование структур воды, которые сохраняют биологическую активность этих веществ. Функция МГТБ в таком случае заключается, во-первых, в участии в адгезионных процессах, а во-вторых - в поддержании воды в межклеточном пространстве, в состоянии, способном обеспечить передачу информационного сигнала.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мальцев, Дмитрий Игоревич, 2013 год

Список литературы

1. Афанасьев Ю.И., Юрина H.A., Котовский Е.Ф. и др. // Гистология: Учебник II- М.: Медицина, 1999. - 744 с.

2. Архипенко В.И., Гербильский JI.B., Черненко Ю.П., Чуич Г.А. Структура и функции межклеточных контактов // В кн.: Структура и функции биологических мембран. М. Наука. 1975. С.77-95.

3. Борисенко A.B., Ямскова В. П., Благодатских И.В., Березин Б.Б., Краюхина М.А., Ямсков И.А. Идентификация регуляторных белков, биологически активных в сверхмалых дозах, и исследование их физико-химических свойств // Биологические мембраны. 2007. Т. 24. №3. С. 227233.

4. Борисенко A.B., Благодатских И.В., Березин Б.Б., Краюхина М.А., Липницкий Е.М., Лычников Д.С., Рубашникова Е.В., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные пептиды, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих // Сборник тезисов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб. 2006. С. 70.

5. Бочарова O.A., Модянова Е.А. Изменение межклеточных контактов гепатоцитов в онтогенезе у мышей инбредных линий с высокой (СВА) и низкой (С57В1) частотой спонтанных гепатом // Онтогенез. 1982. Т. 13. №4. С.427-429.

6. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия, пролиферация и дифференцировка. 1981. М : Наука, 259 С.

7. Буеверова Э.И., Брагина Е.В., Резникова М.М., Ямскова В.П., Хрущов Н.Г. Действие адгезионного фактора сыворотки крови на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro // ДАН СССР. 1985. Т. 281. №1. С. 158-160

8. Бурлакова Е.Б., Конрадов A.A., Мальцева Е.Л. // «Сверхслабые взаимодействия химических соединений и физических факторов на биосистемы». Биофизика. 2004. Т. 49. №. 3. С. 551-564.

9. Васильев Ю.М., Маленков А.Г. Клеточная поверхность и реакции клеток // Л. Медицина. 1968. 294С.

10. Воронцова М. А., Лиознер Л. Д., Маркелова И. В, Пухельская Е. Ч. Тритон и аксолотль. М., 1952. Советская наука, 1952 - Всего страниц: 294

И. Гарбузенко Д.В. Механизмы компенсации структуры и функции печени при ее повреждении и их практическое значение // РЖ! 1 К, 2008, Т. 18, №6, С.14-21.

12. Григорян Э.Н., Краснов М.С., Алейникова К.С., Поплинская В.А., Миташов В.И. Ротационное культивирование изолированной сетчатки тритона как способ получения малодифференцированных, пролиферирующих клеток in vitro // ДАН. 2005. Т. 405. № 4. С. 566-570.

13. Гримов Д.С., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Идентификация биологически активных в сверхмалых дозах регуляторных белков, выделенных их щитовидной и поджелудочной желез млекопитающих // В кн.: труды V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗЫ. Москва. 2005. С. 77-83.

14. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб A.A., Строева О.Г. Биохимическая характеристика адгезионных факторов клеток сетчатки куриных зародышей // Онтогенез. 1985. Т. 16. N 5. С.497-506.

15. Дольникова А.Э., Ямскова В.П., Сологуб A.A., Строева О.Г. Исследования специфической и неспецифической адгезии в процессе агрегации клеток сетчатки куриных зародышей // Онтогенез. 1986. Т. 17. N6. С.620-626.

16. Дольникова А.Э., Сологуб A.A., Строева О.Г., Ямскова В.П. Роль кальций-зависимого и кальций-независимого механизмов в адгезии клеток сетчатки и пигментного эпителия куриных зародышей // Онтогенез. 1985. Т.16. N2.C.149-155.

17. Дольникова А.Э., Ямскова В.П. Молекулярные факторы адгезии клеток нейральных тканей, Ca -независимая система адгезии. // Онтогенез. 1990. T.21.N4. С.358-367.

18. Казанский Д.Б., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Силаева Ю.Ю., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Регуляция иммунитета Т-лимфоцитами: роль низкомолекулярных адгезивных гликопротеинов тимуса // Онтогенез. 2000. Т. 31. №4. С. 276-278.

19. Карапетян А.Ф., Дживанян К.А. О регенераторном потенциале печени озерной лягушки Rana ridibunda после частичной гепатэктомии // Цитология. 2006. Т 48., С. 346-354.

20. C.B. Котелевцев, В.П. Ямскова, И.А. Ямсков, Ф.Ф. Нагдалиев, В.Труаре. Влияние гепалона и адгелона на перекисное окисление липидов и на монооксигеназное окисление в эндоплазматическом ретикулуме печени крыс // 2000. Онтогенез, т.31. N4. с.274-276.

21. Краснов М.С., Григорян Э.Н, Ямскова В.П. Модель органотипического культивирования сетчатки вместе с тканями заднего сектора глаза тритона для изучения действия адгезивных гликопротеинов // Изв. Акад. наук, серия биологическая. 2003. N1. С. 22-36.

22. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Ямскова В.П., Гундорова P.A., Ямсков И.А. Исследование влияния регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез у крыс in vitro // Вестник офтальмологии. 2005. т. 121. №1. С. 37-39.

23. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П., Богуславский Д.В., Ямсков И.А. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных // Радиционная биология и радиоэкология. 2003. №3. С. 265-268.

24. Краснов М.С, Э.Н. Григорян, В.П. Ямскова и др. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных // Радиционная биология и радиоэкология. 2003. N3. с.265-268.

25. Лелекова Т.В. Богданова Н.Г. Пальмина Н.П. Жерновков В.Е. Структурные изменения в мембранах эндоплазматического ретикулума при действии сверхмалых доз тиролебирина in vitro // Радиационная биология.Радиоэкология 2003.N 3. С.ЗЗ 1-333.

26. Лиознер Л.Д., Сидорова В.Ф. Регенерация печени у личинок и взрослых тритонов // 1950, ДАН СССР, Т 12, С. 18-21.

27. Маленков А.Г., Модянова Е.А., Ямскова В.П. Тканевоспецифические адгезионные факторы - кейлоны // Биофизика. 1977. Т. 22. С. 156-157.

28. Маленков А.Г., Модянова Е.А., Ушаков В.Ф. Влияние адгезионного фактора печени-контактина на механические свойства ультраструктурных элементов контакта гепатоцитов // Биофизика. 1979. Т.24. N6. С.1054-1058.

29. Маленков А.Г. Ионный гомеостаз и автономное поведение опухоли // М. Наука. 1976. 171 С.

30. Маленков А.Г., Модянова Е.А. Прочность межклеточных контактов и пролиферативный пул в мышиных гепатомах // Цитология. 1968. N9. С.1087-1093.

31. Маленков А.Г.. Чуич Г.А. Межклеточные контакты и реакция ткани // М. Медицина. 1979. 135С.

32. Маленков А.Г., Штамм Е.В. Изменение величины силы сцепления клеток в ряду: нормальная печень-солидная гепатома-асцитная гепатома // Цитология. 1965. Т.7. N3. С.414-416.

33. Мальцева Е.П., Белоконева О.С., Зайцев С.В., Варфаламеев С.Д. Роль изменения микровязкости синаптических мембран в процессе инактивации связывания лигандов с опиоидными рецепторами мембран головного мозга крыс // Биол. мембраны. 1991. Т.8. N8. С.830-834.

34. Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямскова В.П., Григорян Э.Н., Ямсков И.А. Исследование регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка: выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность// Офтальмология. 2005. Т. 2. №3. С. 81-87.

35. Назарова П.А. Изучение регуляторных белков, выделенных из тканей желез млекопитающих и их секретов (предстательная, молочная железы, молоко): физико-химические свойства и локализация в ткани. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН // Онтогенез. 2006. Т. 37. №4. С. 235-236.

36. Назарова П.А., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Регуляторный белок, выделенный из молока крупного рогатого скота // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №5. С. 529-533.

37. Назарова П.А., Ямскова В.П., Краснов М.С., Ямсков И.А. Исследование регуляторного белка, выделенного из предстательной железы быка // ДАН. 2005. Т. 405. №5. С. 708-710.

38. Неверкович A.C. Оценка препарата адгелона при лечении повреждений суставного хряща // Онтогенез. 2000. Т. 31. № 4. С. 282-283.

39. Ольшевская JI.B., Модянова Е.А. Влияние ионов кальция и магния на ультраструктуру контактов клеток печени // Цитология. 1971. T.XIII. N.1. С.37-42.

40. Обухова Л.М., Дерюгина A.B., Никифорова О.Н. Видовые различия структурного макропортрета сыворотки крови позвоночных животных // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2011. №2 С.287-293.

41. Пальмина Н.П. Жерновков В.Е. Сравнительное изучение структурного состояния плазматических мембрано головного мозга и печени мышей под действием тиролиберина in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2007.N 8.С.151-154.

42. Ротенберг, А.П. Внутриорганная лимфатическая система легкого// Труды Ленинградского сан. гиг. мединститута, т. XVII, Л., 1952. - С. 14-46.

43. Рыбакова Е.Ю., Краснов М.С., Ямскова В.П., Маргасюк Д.В., Битко С.А., Ямсков И.А. Новый биорегулятор, выделенный из костной ткани крыс: физико-химические свойства, влияние на хрящевую ткань in vitro // ДАН. 2009. т. 427. №1. С. 136-138.

44. Рыбакова Е.Ю. «О возможном механизме, лежащем в основе метода биотестирования in vitro регуляторных белков, проявляющих биологическую активность в сверхмалых дозах» // Онтогенез. 2005 т.36. № 3. С.234. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. 8 декабря 2004 г. Москва.

45. Степанов В.М.// Молекулярная биология. Структура и функции белков // Степанов В.М. - М.: Высшая школа, 1996. - 335 с.

46. Скрипникова B.C., Краснов М.С., Березин Б.Б., Бабушкина Т.А., Борисенко A.B., Измайлов Б.А., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Биологически активный в сверхмалых дозах низкомолекулярный белок склеры // ДАН 2007. Т. 417. № 5. С. 697-699.

47. Туманова Н.Б., Попова Н.В., Ямскова В.П. Влияние макромолекулярных адгезионных факторов на пролиферацию гепатоцитов в органных культурах эмбриональной печени мышей // Известия Акад. наук, серия биол. 1996. N.6. С.653-657.

48. Туманова Н.Б., Ямскова В.П. Нарушение молекулярных механизмов клеточной адгезии в печени мышей при генетической предрасположенности к спонтанному бластомогенезу // Известия Акад. наук, серия биол. 1995. N.3. С.261-265.

49. Ушаков В.Ф. Механическая модель контакта гепатоцитов // Биофизика. 1980. T.25.N3. С.491-493.

50. Ушаков В.Ф. Механические свойства межклеточных контактов // Киев. Здоров'я. 1982. С.33-53.

51. Ушаков В.Ф., Палиенко JI.A., Лившиц К.И., Гриша Н.П., Крамарь С.Д., Филимонова Л.А. Состояние клеточной поверхности гепатоцитов при действии четыреххлористого углерода // Архив анат., гистол. и эмбриол. 1990. N12. С.44-48.

52. Ушаков В.Ф., Черненко Ю.П. Адгезионная прочность ультраструктурных элементов контактов гепатоцитов // Биофизика. 1978. Т.23. N3. С.558-559.

53. Хем А., Кормак Д. Гистология // Мир. 1983. Т.4. С. 647-589.

54. Щеголев А., Мишев М. Структурно-метаболитическая характеристика синусоидальных клеток печени // Успехи современной биологии. 1991. Т.111. С.73-82.

55. Ярилин A.A. Основы иммунолоии: Учебник // М.: Медицина, 1999.

56. Ямскова В.П., Скрипникова В. С., Молявка А. А., Ильина А. П., Краснов М. С., Маргасюк Д. В., Борисенко А. В., Березин Б. Б., Ямсков И. А.. Структурно-функциональные особенности нового биорегулятора, выделенного из ткани пигментного эпителия глаза // Биохимия, 2009, т. 74, №9, С. 1195-1203.

57. Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Виноградов A.A., Вечеркин В.В., Ямсков И.А. Исследование белка-инактиватора адгезивного гликопротеина из сыворотки крови млекопитающих.// Прикладная биохимия и микробиология. 2004, Т.40, №4, С.407-413.

58. Ямскова В.П., Краснов М.С., Ямсков И.А. Наноразмерные биорегуляторы тканей глаза млекопитающих как основа для фармакологических препаратов нового поколения // М.: МАКС Пресс, 2009, С.84.

59. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию // Журнал общей биологии. 1991. Т. 52, № 2, С. 181-191.

60. Ямскова В.П., Резникова М.М. Роль макромолекулярных компонентов клеточной поверхности в специфической адгезии клеток. // Успехи биологической химии. 1979. т.20, с.95-112.

61. Ямскова В.П., Скрипникова B.C., Краснов М.С, Битко С.А., Березин Б.Б., Ямсков И.А. Модуляторы активности регуляторных белков, действующих в микродозах // Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». - Алушта, 2008. - Т. 5. С. 473478.

62. Ямскова В.П., Скрипникова B.C., Краснов М.С., Молявка A.A., Маргасюк Д.В., Борисенко A.B., Ямсков И.А. Новая функция альбуминов сыворотки крови // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск: «Арта», 2008. - С.

63. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Логинов А.С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. №3. С. 303-306

64. Ямскова В.П., Ямсков И.А. Механизм биологического действия физико-химических факторов в сверхмалых дозах // Российский химический журнал ЖРХО им. Д.И. Менделеева. 1999. Т. 43. №2. С. 74-79

65. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Решетняк В.И. Роль клеточной адгезии в возникновении патологических состояний печени // Вестник РАМН. 1994. N.5. С.18-20.

66. Ямскова В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс // Биофизика. 1978. Т.23. С.428-432.

67. Ямскова В.П., Модянова Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионные факторы печени и легкого // Молекулярная биология. 1977. Т. 11. № 5. С. 1147-1154

68. Ямсков И.А., Виноградов А.А., Даниленко А.Н., Маслова Л.А., Рыбакова Е.Ю., Ямскова В.П. Низкомолекулярный гликопротеин из сыворотки крови крупного рогатого скота: структура и свойства // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т.37. N1. С.36-42.

69. Abercrombie М. Contact inhibition in tissue culture // In vitro. 1970, V.6, P.128-142.

70. Anderson H. Adhesion molecules and animal development // Experientia. 1990, V.46, P.2-13.

71. Avril A., Pichard V., Bralet M., et al. Mature hepatocytes are the source of small hepatocyte-like progenitor cells in the retrorsine model of liver injury.// J Hepatol. 2004. V. 41. P.737^13.

72. Alison M.R. Characterization of the differentiation capacity of rat-derived hepatic stem cells. // Semin Liver Dis. 2003. V.23. P. 325-36.

73. Armstrong J.K., Wenby R.B., Meiselman H.J., Fisher T.C., The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation // Biophysical Journal. 2004. V.87, P. 4259-4270

74. Barni S., Bertone V., Croce A.C., Bottiroli G., Bernini F., Gerzeli G. Increase in liver pigmentation during natural hibernation in some amphibians // J. Anat.. 1999. V.195. P. 19-25.

75. Baddour A., Sousounis K., Tsonis P. A. Organ repair and regeneration: an overview // Birth Defects Research. 2012. V. 96. P. 1-29

76. Best D., Coleman W. Cells of origin of small hepatocyte-like progenitor cells in the retrorsine model of rat liver injury and regeneration // J Hepatol. 2008, V.48, P.369-71.

77. Best D.H., Coleman W.B., Treatment with 2-AAF blocks the small hepatocyte-like progenitor cell response in retrorsine-exposed rats. // J Hepatol, 2007. V.46. P.1055-63.

78. Best D.H., Coleman W.B., Bile duct destruction by 4, 4'-diaminodiphenylmethane does not block the small hepatocyte-like progenitor cell response in retrorsine-exposed rats. // Hepatology. 2007. V. 46(5). P. 16119.

79. Brill S., Hoist P., Sigal S., et al. Hepatic progenitor populations in embryonic, neonatal, and adult liver. Proc Soc Exp Biol Med. 1993. V. 204. P. 261-9.

80. Bertalanffy F.D., Dynamics of cellular populations in the lung // In: The Lung. Int. Acad. Pathol. Monograph №8. Baltimore. Williams and Wilkins. 1967. P.19-30.

81. Bhoopat L., Turner R.R., Stathopoulos E., Meyer P.R., Taylor C.R., Marder R.J., Epstein A.L. // Immunohistochemical characterization of two new monoclonal antibodies (LN-4, LN-5) reactive with human macrophage subsets and derived malignancies in B5-fixed, paraffin-embedded tissues. Blood. 1988 V. 71(4). P. 1079-85.

82. Borisenko A.V., Yamskova V.P., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V., Vecherkin V.V., Yamskov I.A. "Regulatory proteins from the mammalian liver that display biological activity at ultra low doses" pp. 35-45 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research", Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova

E.B., Popov A.A. and Zaikov G.E., Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. p. 160. 2007.

83. Chalmers, A.D., Slack M.W. The Xenopus tadpole gut: fate maps and morphogenetic movements // Development 2000V. 127 P. 381-392.

84. Chistiakov D. Liver Regenerative Medicine:Advances and Challenges Cells Tissues Organs 2012 V.196. P. 291-312.

85. Clement B., Rescan P.Y., Baffet G., Loreal O., Lehry D., Compion J.P., Guillouzo A. Hepatocytes may produce laminin in fibrotic liver and inprimary culture // Hepatology. 1988. V.8. P.794-803.

86. Cicero R, Sciuto S, Chillemi R, Sichel G. Melanosynthesis in the Kupffer cells of Amphibia // Comp Biochem Physiol. 1982. V.73A. P.477-479.

87. Corsaro C., Scalia M., Blanco A.R., Aiello I., Sichel G. Melanins in physiological conditions protect against lipoperoxidation // A study on albino and pigmented Xenopus. Pigment. Cell Res. 1995. V.8. P.279-282.

88. Coleman W.B., Grisham J.W. Epithelial stem-like cells of the rodent liver. In: Strain AJ, Diehl AM, editors. Liver growth and repair. London: Chapman and Hall; 1998. P. 50-99.

89. Coleman WB, Best DH. Cellular responses in experimental liver injury: Possible cellular origins of regenerative stem-like progenitor cells. Hepatology. 2005. V. 41. P. 1173-6.

90. Collet A.J., Des Biens G. Fine structure of myogenesis and elastogenesis in the developing rat lung // Anat. Rec. 1974. V.179. P.343.

91. Collet A.J. Evolution of mesenchymal cell in fetal rat lung // Anat. Embryol. 1975. V.147. P.273.

92. Coman D.R. Decreased mutual adhesiveness, a property of cell from squamous-cell carcinomas // Cancer res. 1944. V.4. P.625-629.

93. Coman D.R. Cellular adhesiveness in relation to invasioness of cancer: electron microscopy of liver perfused with a chelating agent // Cancer res. 1954. V.14. N7. P.519-521.

94. Coman D.R. Adhesiveness and stickiness: two independent properties of the cell surface // Cancer res. 1961. V.21. P. 1436-143 8.

95. Carolien W., Barkauskas C., Jason R., M. Hogan. Cell Stem cells of the adult lung: their development and role in homeostasis, regeneration, and disease

96. Cui S., Arosio D., Doherty K.M., Brosh R.M., Falaschi A., Vindigni A. Analysis of the unwinding activity of the dimeric RecQl helicase in the presence of human replication protein A // Nucleic Acids Researches. 2004.

97. Creaser E.H., Russell L.M. Further characterization of a protein promoting aggregation of retina cells // Biochem. J. 1971. V.123(l). P.127-8.

98. Dorrell C, Grompe M. Liver repair by intra- and extrahepatic progenitors // Stem Cell Rev. 2005. V.l. P.61-4.

99. David H., Freytag G.H. Submikropische Befunde an der Urodelenleber // Acta Biol. Med. Germ. 1963. V.10. P.663-672.

100. Daday H., Creaser E.H. Isolation of a protein responsible for aggregation of avian embryonic cells // Nature. 1970. V. 226 P. 970-1.

101. Dabeva M.D., Alpini G., Hurston E. Models for hepatic progenitor cell activation // Proc Soc Exp Biol Med. 1993V. 204. P.242-52.

102. Dabeva M.D., Laconi E., Oren R. Liver regeneration and alpha-fetoprotein messenger RNA expression in the retrorsine model for hepatocyte transplantation // Cancer Res. 1998. V.58. P. 5825-34.

103. Dabeva MD, Shafritz DA. Activation, proliferation, and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the d-galactosamine model of liver regeneration // Am J Pathol. 1993. V.l43 P. 1606-20.

104. Dunsford H.A., Maset R., Salman J. Connection of ductlike structures induced by a chemical hepatocarcinogen to portal bile ducts in the rat liver detected by injection of bile ducts with a pigmented barium gelatin medium // Am J Pathol. 1985. V.l 18. P.218-24.

105. Damsky C., Richa J., Solter D., Knudsen K., Buck C. Identification and purification of a cell surface glycoprotein mediating intercellular adhesion in embryonic and adult tissue // Cell. 1983. V.34. P.455-456.

106. D'Amour K.A., Gage F.H. Are somatic stem cells pluripotent or lineage-restricted? // Nat Med. 2002. V.8. P. 213-4.

107. Elliott FM, Reid L Some new facts about the pulmonary artery and its branching pattern // Clin Radiol. 1965. V. 16 P.193-198.

108. Evarts RP, Nagy P, Marsden E, et al. A precursor-product relationship exists between oval cells and hepatocytes in rat liver // Carcinogenesis. 1987. V.8. P. 1737-40.

109. Evarts R.P., Nagy P., Nakatsukasa H. In vivo differentiation of rat liver oval cells into hepatocytes // Cancer Res. 1989. V. 49. P. 1541-7.

110. Fausto N. Liver regeneration and repair: hepatocytes, progenitor cells, and stem cells. Hepatology. 2004. V.39. P. 1477-87.

111. Fabrikant J.I. Rate of cell proliferation in the regenerating liver // Br J Radiol. 1968. V.41.P.71-9

112. Fabrikant J.I. Size of proliferating pools in regenerating liver // Exp Cell Res. 1969. V. 55 P. 277-9.

113. Fasano M., Curry S., Terreno E., Galliano M., Fanali G., Narciso P., Notari S. Ascenzi P. The Extraordinary Ligand Binding Properties of Human Serum Albumin // Life. 2005. V. 57. P. 787 - 796.

114. Fausto N. Liver regeneration and repair: hepatocytes, progenitor cells, and stem cells // Hepatology. 2004. V. 39 P. 1477-87.

115. Farber E. Similarities in the sequence of early histological changes induced in the liver of the rat by ethionine, 2-acetylamino-fluorene, and 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene. Cancer Res. 1956. V. 16 P. 142-8.

116. Fausto N. Liver stem cells. In: Arias IM et al., editors. The liver: biology and pathobiology. New York: Raven Press; 1994. P. 1501-18.

117. Fausto N, Lemire JM, Shiojri N. Oval cells in liver carcinogenesis: cell lineages in hepatic development and the identification of faculative stem cells in normal liver. In: Sirica AE, editor. The role of cell types in carcinogenesis. Boca Raton: CRC Press; 1992. P. 89-108.

118. Fentiman J., Taylor-Paradimitrou Y. Cuitured human breast cancer cells lose selectivity in direct intercellular communication // Nature. 1977. V.269. P.156-158.

119. Ferguson M.A. The structure, biosynthesis, and functions of glycosylphosphatidylinositol anchors and the contributions of trypanosome research // J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 2799-2809.

120. Galtsoff P.S., Pertzoff V. J Gen Physiol. Some physicochemical properties of dissociated sponge cells. // Cell. 1926. V.10. P.239-55.

121. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation // J Cell Biol. 1992. V. 119(3). P. 493-501.

122. Gendrault J.L., Montecino-Rodrigues E., Cinqualbre J. Sinusoidal liver cells // Eds. Knock D.L., Wisse E. Amsterdam: Elsevier Bioched. Press. 1982. P. 137.

123. Gucuen-Guillouzo C. Role of homotypic and heterotypic cell interactions in expression of specific functions by cultured hepatocytes, Research in Isolated and cultured hepatocytes. Guillouzo& C. Gucuen-Guillouzo eds. // INSERM. 1986. P.259-284.

124. Grompe M.J. Inherit Principles of therapeutic liver repopulation // Metab Dis. 2006 V. 29. P. 421-5.

125. Gordon G.J., Coleman W.B., Hixson D.C. Liver regeneration in rats with retrorsine-induced hepatocellular injury proceeds through a novel cellular response. Am J Pathol. 2000. V. 156. P. 607-19.

126. Grisham J.W. Cellular proliferation in the liver // Recent Results Cancer Res. 1969. V.17P. 28^3.

127. Grisham J.W. A morphologic study of deoxyribonucleic acid synthesis and cell proliferation in regenerating rat liver; autoradiography with thymidine-H3 // Cancer Res. 1962. V. 22. P. 842-9.

128. Grisham JW, Thorgeirsson SS. Liver stem cells // In: Potten CS, editor. Stem cells. London: Academic Press; 1993. P. 233-82.

129. Golding M., Sarraf C.E., Lalani E.N. Oval cell differentiation into hepatocytes in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver // Hepatology. 1995. V. 22. P. 1243-53.

130. Giangreco A., Reynolds S.D., Stripp B.R. Terminal bronchioles harbor a unique airway stem cell population thatlocalizes to the bronchoalveolar duct junction // Am J Pathol. 2002. V. 161 P. 173-182.

131. Gosling J. P. Ed. In: "Immunoassaays: a practical approach" // 2000. Oxford University Press, P. 19-36.

132. Gallin W., Edelman G., Cunningham B. Characterisation of L-CAM, a major cell adhesion molecule from embryonic liver cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. V.80. P.1038-1042.

133. Goodenough D., Gilula N. The aplitting of hepatocyte gap junctions and zonula occludentes with hypertonic disaccharides // J. Cell Biol. 1974. V.61. P.575-590.

134. Henriksen J., Horn T., Christoffersen P. The blood-lymph barrier in the liver. A review based onmorphological and functional concepts of normal and cirrhotic liver // Liver. 1984. V.4. P.221-232.

135. Horsfield K, Cumming G Morphology of the bronchial tree in man // J Appl Physiol 1968. V. 24 P. 373-383

136. Hausman R., Moscona A. Purification and characterization of the retina specific cell-aggregating factor// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. V.72. P.916-919.

137. Hatta K., Okada T., Takeichi M. A monoclonal antibody disrupting calcium-dependent cell-cell adhesionof brain tissues: possible role of its target antigen in animal pattern formation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P.2789-2793.

138. Henkart P., Humphreys S., Humphreys T. Characterization of sponge aggregation factor. A unique proteoglycan complex // Biochemistry. 1973. P. 3045-50.

139. Iancu T.C. Ferritin and haemosiderin in pathological tissues // Electron Microsc Rev. 1992. V.5. P.209-229.

140. Inaoka Y. Significance of the so-called oval cell proliferation during azo-dye hepatocarcinogenesis // Gann. 1967. V.58 P. 355-66.

141. Inan M.S., Tolmacheva V., Wang Q.S., Rosenberg D.W., Giardina C. Transcription factor NF-kappaB participates in regulation of epithelial cell turnover in the colon. // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000. V. 279(6). P. 1282-91.

142. Jago MV. The development of the hepatic megalocytosis of chronic pyrrolizidine alkaloid poisoning // Am J Pathol. 1969. V. 56 P.405-21.

143. Kmiec Z. Cooperation of liver cells in health and disease // Adv Anat Embryol Cell Biol. 2001. V. 161. P. 1-151.

144. Kim C.F., Jackson E.L., Woolfenden A.E., Lawrence S., Babar I., Vogel S. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer // Cell. 2005. V. 121. P. 823-35.

145. Kreis T., Vale R. Eds. In: Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins // Oxford University Press. 1993. P. 176.

146. Krasnov M.S., Gurmizov E.P., Yamskova V.P., Yamskov I.A. "Analysis of a Regulatory Peptide from the Bovine Eye Lens: Physicochemical Properties and Effect on Cataract Development in vitro and in vivo" pp. 21-33 //In the book "Biochemical Physics Frontal Research". Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. P. 160. 2007.

147. Klinman N.R., Erslev A.J. Cellular response to partial hepatectomy // Proc Soc Exp Biol Med. 1963. V.l 12. P. 338-40.

148. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V.227. P. 680-685.

149. Laconi E., Oren R., Mukhopadhyay D.K. Long-term, near-total liver replacement by transplantation of isolated hepatocytes in rats treated with retrorsine // Am J Pathol. 1998. V.l53. P.319-29.

150. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M., Reitsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold M., L. Weissman , Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo// Nature Medicine 2000. V. 6. P. 1229- 1234.

151. Latt S.A., Stetten G., Juergens L.A., Willard H.F., Scher C.D. Recent developments in the detection of deoxyribonucleic acid synthesis by 33258 Hoechst fluorescence // The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 1975. V. 23 (7). P. 493-505.

152. Lemire J.M., Shiojiri N, Fausto N. Oval cell proliferation and the origin of small hepatocytes in liver injury induced by d-galactosamine // Am J Pathol. 1991. V. 139 P. 535-52.

153. LemaAre V., D'Armiento J. Matrix Metalloproteinases in Development and Disease // Birth Defects Research. 2006. V. 78. P. 1-10.

154. LaFlamme S., Kowalczyk A. P. Cell Junctions // WILEY-VCH. 2008.

155. MacPhee P.J., Schmidt E.E., Groom A.C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy // Am J Physiol. 1995. V. 269. P. 692-8.

156. Marini I., Moschini R., Del Corso A., Mura U. Chaperone-like features of bovine serum albumin: a comparison with a-crystallin // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 3092-3099.

157. Marucci L., Baroni G.S., Mancini R. Cell proliferation following extrahepatic biliary obstruction. Evaluation by immunohistochemical methods // J Hepatol. 1993. V. 17. P. 163-9.

158. Makino Y, Yamamoto K, Tsuji T. Three-dimensional arrangement of ductular structures formed by oval cells during hepatocarcinogenesis // Acta Med Okayama. 1988. V.42. P. 143-50.

159. Monga S.P. Role of Wnt/(3-catenin signaling in liver metabolism and cancer // Int J Biochem Cell Biol. 201 la. V. 43. P. 1021-9.

160. Monga S.P. Molecular pathology of liver diseases // Springer Sciense. USA. 2011b. 93 IP.

161. Moscona A. Studies of cell aggregation: demonstration of material with selective cell-binding activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1963. V.49. P.743-748.

162. Moscona A. A. Cell agrégation: properties of specific cell-ligands and their role in the formation of multicellular systems // Develop. Biol. 1968. V.18. P.250-277.

163. Moscona A. Rotation - mediated histogenetic aggregation of dissociated cells // Exp. Cell Res. 1961. V.22. P.455-458.

164. Margasyuk D.V., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V., Grigoryan E.N., Yamskova V.P., Yamskov I.A. "Regulatory Protein from Bovine Cornea: Localization and Biological Activity" P. 47-59.

165. Moscona A. The development in vitro of chimeric aggegates of dissociated embryonic chick and mouse cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1957. V.43. P. 184-94.

166. Moscona A. Studies of cell aggregation: demonstration of material with selective cell-binding activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1963. V.49. P.743-748.

167. Moscona A. Cell agrégation: properties of specific cell-ligands and their role in the formation of multicellular systems // Develop. Biol. 1968. V.18. P.250-277.

168. Modjanova E., Malenkov A. Alteration of properties of cell contacts during progression ofhepatomes //Exp. Cell. Res. 1973. V.76. P.305-314.

169. Muller W., Muller I., Zahn R. Species-specific aggragation factor in sponges. IV. Inactivation of the aggregation factor by mucoid cells from another species // Exp. Cell Res. 1976. V.98. P.31-40.

170. Muller W., Muller I., Zahn R. Two different aggregation principles in aggregation process of dissociated sponge cell (Geodia cydonium) // Experrientia. 1974. V.30. P.899-901.

171. Muller W., Zahn R. Purification and characterization of a species-specific aggregation factor in sponges // Exp. Cell Res. 1973. V.80. P.95-104.

172. Nazarova P.A., Yamskova V.P., Krasnov M.S., Filatova A.G., Yamskov I.A. "Regulatory proteins biologically active in ultralow doses from mammalian glands and their secretions" pp. 73-82 // In the book "New Trends in Biochemical Physics Research", Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A. and Zaikov G.E., Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc, 143 p., 2007.

173. Neubauer K., Knittel T., Armbrust T., Ramadori G. Accumulation and cellular localization of fibrinogen/fibrin during short-term and long-term rat liver injury // Gastroenterology. 1995. V. 108. P. 1124-1135.

174. Ouyang J., Shao J., Zou H., Lou Y., Yu Y. Hepatic Differentiation of Rat Mesenchymal Stem Cells by a Small Molecule // ChemMedChem. 2012. V 7.1 8. P. 1447-1452.

175. Oppenheimer S.B., Humphreys T. Isolation of specific macromolecules required for adhesion of mouse tumour cells // Nature. 1971. V. 232.1. 5306. P. 125-7.

176. Ogou S.-I. Yoshida-Noro C., Takeichi M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules common to hepatocytes and teratocarcinoma stem cells // J.Cell Biol. 1983. V.97. P.944-948.

177. Overturf K., Al-Dhalimy M., Tanguay R. Hepatocytes corrected by gene therapy are selected in vivo in a murine model of hereditary tyrosinaemia type I // Nat Genet. 1996. V.12. P.266-73.

178. Oren R., Dabeva M.D., Karnezis A.N. Role of thyroid hormone in stimulating liver repopulation in the rat by transplanted hepatocytes // Hepatology. 1999. V.30. P.903-13.

179. Orlow S.J., Melanosomes are specialized members of the lysosomal lineage of organelles // J Invest Dermatol. 1995. V. 105. P.3-7.

180. Polimeno L., Azzarone A., Zeng Q.H. Cell proliferation and oncogene expression after bile duct ligation in the rat: evidence of a specific growth effect on bile duct cells // Hepatology. 1995. V. 21. P. 1070-8.

181. Pichará V, Ferry N. Origin of small hepatocyte-like progenitor in retrorsine-treated rats. J Hepatol. 2008. V. 48. P. 368-9.

182. Pichard V., Aubert D., Ferry N. Direct in vivo cell lineage analysis in the retrorsine and 2AAF models of liver injury after genetic labeling in adult and newborn rats // PLoS One. 2009. V.4. P.67-72.

183. Price J.M., Harman J.W., Miller E.C., Progressive microscopic alterations in the livers of rats fed the hepatic carcinogens 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene and 4'-fluoro-4-dimethylaminoazobenzene // Cancer Res. 1952. V. 12. P. 192-200

184. Riechardt L. Extracellular matrix molecules and their receptors // In: "Guidebook to the extracellular matrix and adhesion proteins". Eds. Kreis T., Vale R. 1993. Oxford University Press. P. 3-12.

185. Robinson J.M, Karnowsky M.J. Ultrastructural organization of several phosphatases with cerium // J Histochem Cytochem. 1983. V. 31. P. 1197-1208

186. Sarraf C, Lalani EN, Golding M, et al. Cell behavior in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver. Light and electron microscopic observations // Am J Pathol. 1994. V. 145. P. 1114-26.

187. Seglen P.O. DNA ploidy and autophagic protein degradation as determinants of heparocellular growth and survival // Cell Biol. Toxicol. 1997. V 13. P 301315.

188. Sell S. Liver stem cells // Mod Pathol. 1994. V. 7. P. 105-12.

189. Sell S., Salman J. Light- and electron-microscopic autoradiographic analysis of proliferating cells during the early stages of chemical hepatocarcinogenesis in the rat induced by feeding N-2-fluorenylacetamide in a choline-deficient diet // Am J Pathol. 1984. V.114. P. 287-300.

190. Sorokin S. Phagocytes in the lung; incidence, general behavior and phylogeny // In: Brain J.D., Proctor D.F., Reid L. (eds.). Respiratory Defence Mechanisms. Monograph №3 of Series Lung Biology in Health and Disease. New York. Marcel Dekker. 1984. P. 47.

191. Simpson G., Finckh E. The pattern of regeneration of rat liver after repeated partial hepatectomies // J Pathol Bacteriol. 1963. V. 86. P. 361-70.

192. Schraermeyer U., Stieve H. Peroxidase and tyrosinase are present in secondary lysosomes that degrade photosensory membranes of the crayfish photoreceptor: possible role in pigment granule formation // Pigment Cell Res 1991. V. 4. P. 163-171.

193. Sichel G., Scalia M., Corsaro C. Amphibia Kupffer cells // Microsc. Res. Tech. 2002. V.57. P. 477-490.

194. Strain A., Hill D. Changes in sensitivity of hepatocytes isolated from regenerating rat liver to the growth inhibitory action of transforming growth factor beta // Liver. 1990. V.5 P. 282-90.

195. Sell S. Is there a liver stem cell? // Cancer Res. 1990. V. 50. P. 3811-5

196. Sichel G., Scalia M., Corsaro C. Amphibia Kupffer cells // Microsc. Res. Tech. 2002. V.57. P.477-490.

197. Tremblay KD, Zaret KS Distinct populations of endoderm cells converge to generate the embryonic liver bud and ventral foregut tissues // Dev Biol. 2005. V.l. P. 87-99.

198. Thorgeirsoon S. Hepatic stem cells // Am J Pathol. 1993. V.l42 P. 1331-3.

199. Tatematsu M, Ho RH, Kaku T, et al. Studies on the proliferation and fate of oval cells in the liver of rats treated with 2-acetylaminofluorene and partial hepatectomy // Am J Pathol. 1984 V.l 14. P. 418-30.

200. Tatematsu M., Kaku T., Medline A. Intestinal metaplasia as a common option of oval cells in relation to cholangiofibrosis in liver of rats exposed to 2-acetylaminofluorene // Lab Invest. 1985. V.52 P.354-62.

201. Tatematsu M., Ho R., Kaku T. Studies on the proliferation and fate of oval cells in the liver of rats treated with 2-acetylaminofluorene and partial hepatectomy// Am J Pathol. 1984. V. 114. P. 418-30.

202. Turner M.L. Cell adhesion molecules: a unifying approach to topographic biology // Biol. Rev. 1992. V.67. P.359-377.

203. Thiery J., Delouvee A., Gallin W., Cunningham B., Edelman G. Ontogenetic expression of cell adhesion molecules: L-CAM is found in epithelia derived from the three primary germ layers // Dev. Biol. 1984. V.102. P.61-78.

204. Thiery J., Duband J., Dofour S., Bouer B., Tucker G., Valles A., Gaurilovich J., Moens G., Jonanneou J. Adhesion and motility of embryonic and cancer cells // Proceeding of the 6th International conference on the différenciation of normal and neoplastic cells. 1990.

205. Vasiliev J., Gelfand I. Morphogenetic reactions and locomotory behaviour of trasformed cells in culture // In: "Fundamental aspects of metastasis". Ed. L.Weiss. Amsterdam. 1976. P. 71.

206. Van Furth R., Cohn Z.A., Hirsch J.G., Humphrey J.H., Spector W.G., Langevoort H.L. The mononuclear phagocyte system: a new classification of macrophages, monocytes, and their precursor cells // Bull World Health Org. 1972. V.46. P.845-852.

207. Van Eijk H.G., De Yong G. The physiology of iron, transferrin, and ferritin // Biol. Trace Elem. Res. 1992. V.35. P. 13-24.

208. Vig P., Russo F., Edwards R. The sources of parenchymal regeneration after chronic hepatocellular liver injury in mice. // Hepatology. 2006. V. 43. P. 316— 24.

209. Victorov I.V., Lyjin A.A., Aleksandrova O.P. // Brain Res. Prot. 2001. V. 7. P. 30-37.

210. Wilson JW, Leduc EH. Role of cholangioles in restoration of the liver of the mouse after dietary injury // J Pathol Bacteriol. 1958. V. 76. P. 441-9

211. Wilson H. A new method by which sponges may be artificially reared // Science. 1907. V.25. P. 912-5.

212. Weigel P.H. Rat hepatocytes bind to synthetic galactoside surfaces via a patch of asialoglycoprotein receptors // J. Cell. Biol. 1980. V. 87. P. 855-61.

213. Weinstein R.S., Merk F.B., Alroy J. The structure and function of intercellular junctions in cancer// Advan. Cancer Res. 1976. V.23. P.23-89.

214. Wyatt A. R., Yerbury J., Ecroyd H., Wilson M. R. Extracellular Chaperones and Proteostasis // Annu. Rev. Biochem. 2013.V. 82. P. 1-2.28

215. Yaswen P., Hayner N., Fausto N. Isolation of oval cells by centrifugal elutriation and comparison with other cell types purified from normal and preneoplastic livers // Cancer Res. 1984. V.44. P.324-31.

216. Yee A., Revl J. Loss and reappearance of gap junctions in regenerating liver // J. Cell Biol. 1978. V.78. P.554-564.

217. Zander D.S., Popper H.H., Jagirdar J. Molecular Pathology of Lung Diseases // 2008. Springer Science.

218. Zhang L., Ye J., Decot V., Stoltz J., Isla N. Research on stem cells as candidates to be differentiated into hepatocytes // Bio-Medical Materials and Engineering. 2012 V. 22. P. 105-111.

219. Zhou P., Wirthlin L., McGee J., Annett G., Nolta J. Contribution of human hematopoietic stem cells to liver repair // Semin Immunopathol. 2009. V. 31.1. 3 P. 411-429.