Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Копеина, Гелина Сергеевна

• Копеина, Гелина Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Копеина, Гелина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бесклеточные системы синтеза белка.

1.1.1. История создания бесклеточных систем синтеза белка.

1.1.2. Развитие технологии бесклеточных систем синтеза белка.

1.1.3. Эффективность синтеза белка в прокариотических и эукариотических бесклеточных системах.

1.2. Формирование нативной структуры белка.

1.3.Способы решения проблемы агрегации белка в БСС.

1.3.1. Использование шаперонов для решения проблемы агрегации синтезированного белка.

1.3.2. Подбор условий для правильного замыкания дисульфидных связей.

1.3.3. Бесклеточная продукция рекомбинантных белков в виде гибридных полипептидов.

1.3.4. Бесклеточный синтез белков в присутствии специфичных лигандов.

1.3.5. Бесклеточный синтез белков в присутствии мицелл детергентов.

1.3.6. Использование липидсодержащих частиц для бесклеточного синтеза мембранных белков

1.4. Ренатурация белков.

1.5. Структурные и функциональные особенности объектов исследования.

1.5.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

1.5.2. Бактериородопсин.

1.5.3. Потенциалозависимый К+ канала KvAP из Aeropyriimpernix.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы и ферменты.

2.1.2. Штаммы.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур.

2.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

2.2. Методы.

2.2.1. Общие молекулярно-генетические методы.

2.2.2. Получение генетических конструкций.

2.2.3. Синтез белка в бесклеточной системе на основе фракции S30 Е. coli.

2.2.3.1. Выделение экстракта S30 из Escherichia coli.

2.2.3.2. Синтез белка в сопряженной бесклеточной системе на основе экстракта S30 из Е. coli.

2.2.4. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН.

2.2.5. Иммуноблотинг.

2.2.6. Гель-фильтрация.

2.2.7. Анализ белковых препаратов методом КД-спектроскопии.

2.2.8. Ренатурация мутантного варианта внеклеточного домена нАХР (a7B,Z]/DTES) из осадка ТС

2.2.9. Исследование биологической активности a7B,D/DTES.

2.2.10. Выделение белка, ассоциированного с липид-белковыми нанодисками.

2.2.11. Выделение ВСД-KvAP из трансляционной смеси.

2.2.12. Ренатурация ВСД-KvAP из осадка ТС.

2.2.13. Получение ЯМР-спектров ВСД-KvAP.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Продукция внеклеточного домена а7нАХР в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из Е. coli.

3.1.1. Мутагенез внеклеточного домена нАХР а7 типа.

3.1.2. Оптимизация бесклеточной системы для продукции a7B,D/DTES.

3.1.3. Синтез a7B,H/DTES в растворимой форме.

3.1.4. Ренатурация a7B/VDTES из осадка трансляционной смеси.

3.1.5. Исследование биологической активности a7Bfl/DTES.

3.2. Получение бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из Е. coli.

3.2.1. Синтез БР-ES в растворимой форме в присутствии детергентов.

3.2.1. Синтез БР-Е8 в присутствии липид-белковых нанодисков.

3.3. Получение вольт-сенсорного домена К+канала КуАР из Аегоругитрегтх в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта БЗО из Е. соИ.

3.3.1. Получение селективно меченого аналога ВСД-КуАР.

3.3.2. Синтез ВСД-КуАР в растворимой форме в присутствии детергентов.

3.3.2. Синтез ВСД-КуАР в присутствии липид-белковых нанодисков.

3.3.3. Ренатурация ВСД-КуАР из осадка трансляционной смеси.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков»

Актуальность темы. Мембранные белки (МБ) составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Эти белки играют основную роль в процессах передачи сигналов, как на уровне отдельной клетки, так и на уровне целого организма. МБ обеспечивают функционирование нервной, иммунной и эндокринной систем в качестве различных рецепторов, передающих сигналы через клеточную мембрану, а также в качестве ионных каналов, ответственных за распространение импульсов вдоль нервных волокон. С прикладной точки зрения МБ представляют огромный интерес как мишени для создания новых фармакологических препаратов и в качестве объектов для биотехнологических разработок. В отличие от глобулярных водорастворимых белков, МБ остаются малоизученными, а примеры их удачного использования в области фармакологии и биотехнологии чрезвычайно редки. Основные трудности в исследовании и применении МБ обусловлены особенностями их пространственной организации. Большинство МБ содержит несколько трансмембранных (ТМ) спиралей. Так как ТМ спирали гидрофобны, МБ может иметь нативную структуру только в присутствии биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды. Это значительно затрудняет как получение достаточных количеств препаратов МБ в функционально-активной форме, так и их дальнейшие структурно-функциональные исследования и биотехнологическое применение.

В последнее время для продукции мембранных белков все большую популярность приобретают сопряженные бесклеточные системы синтеза (БСС) транскрипции-трансляции. На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра трансляционной смеси (ТС), что дает возможность получать белковые препараты в количествах, необходимых для биологических, биохимических и биофизических исследований. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется в основном целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать синтезируемый полипептид в нативной конформации. Для продукции МБ в трансляционную смесь добавляют мембраномоделирующие компоненты, поддерживающие МБ в растворимой форме, такие как мицеллы детергентов, липосомы, или липопротеиновые частицы (липид-белковые нанодиски, ЛБН). Кроме того, БСС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований белков методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Таким образом, разработка новых методов эффективной бесклеточной продукции МБ является актуальной задачей молекулярной биологии, биотехнологии и биофизики и открывает широкие перспективы для структурно-функциональных исследований и практического применения этих белков.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось исследование возможности применения БСС на основе экстракта S30 из Е. coli для продукции МБ и их доменов в нативной конформации для дальнейшего изучения их структурных и функциональных свойств. В качестве объектов исследования были выбраны: внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека а7 типа (а7ВД) - ß-структурный белок, содержащий лиганд-связывающий участок; бактериородопсин из Exigiiobacterium sibiricum (БР-ES) - фотоактивируемый протонный насос психротолерантной бактерии, состоящий из семи ТМ спиралей, структурный аналог мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками (рецепторов семейства GPCR); и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+ канала KvAP из археи Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) - структурный гомолог вольтсенсорных доменов потенциалозависимых Na+-, K+-, Са2+- и ЬГ^-каналов млекопитающих, состоящий из четырех ТМ спиралей.

Данная цель подразумевает решение следующих задач:

1. Оптимизация бесклеточной системы синтеза на основе клеточного экстракта S30 из Е. coli для максимального увеличения выхода целевых белков;

2. Разработка эффективной системы бесклеточной продукции а7ВД, подбор условий выделения и очистки рекомбинантного белка в нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;

3. Исследование физико-химических свойств и биологической активности полученного препарата а7ВД;

4. Разработка эффективной системы бесклеточной продукции БР-ES, подбор условий получения белка в функционально-активной форме в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;

5. Разработка эффективной системы бесклеточной продукции ВСД-KvAP в нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;

6. Исследование возможности получения селективно меченых мембранных белков в бактериальной бесклеточной системе для структурных исследований методом ЯМР-спектроскопии на примере ВСД-KvAP.

Научная новизна и значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые.

1. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза а7ВД в виде осадка ТС. Подобраны условия ренатурации этого белка из осадка ТС.

2. Проведен анализ физико-химических и биологических свойств а7ВД. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что белок, ренатурированный из осадка ТС, демонстрирует селективность по отношению к а-нейротоксинам яда змей длинного и короткого типов, что свидетельствует о наличии у домена структуры, близкой к нативной.

3. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза БР-Е8 в растворимой форме с использованием липид-белковых нанодисков в качестве мембраномоделирующего компонента ТС. Наличие функциональной активности у МБ, встроенного в ЛБН, свидетельствует о наличии структуры БР-ЕБ, близкой к нативной.

4. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза ВСД-КуАР в виде осадка ТС. Подобраны условия синтеза селективно меченого белка, а также условия его ренатурации из осадка ТС. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что ренатурированный 1А1а-В С Д- К у АР имеет пространственную структуру, близкую к нативной.

В ходе данного исследования были разработаны и успешно применены эффективные методы бесклеточного синтеза для продукции ряда мембранных белков и их доменов. Методами ЯМР-спектроскопии и с помощью функциональных тестов для всех исследуемых белков было показано наличие пространственной структуры, близкой к нативной, что указывает на универсальность выбранного подхода. Таким образом, разработка систем бесклеточного синтеза открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований не только никотинового ацетилхолинового рецептора, потен циалозависимого К+ канала КуАР и бактериородопсина из Ехг^оЬаМепит яШпсит, но может найти широкое применение в исследованиях и других мембранных белков.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Копеина, Гелина Сергеевна

выводы

1. Разработана эффективная система бесклеточной продукции внеклеточного домена нАХР человека а7 типа с выходом 0,6 мг с 1 мл трансляционной смеси. Показано, что применение детергента додецилфосфохолина в процессе ренатурации домена из осадка трансляционной смеси способствует стабилизации домена в растворе и сохраняет его вторичную структуру. Показано, что ренатурированный внеклеточный домен нАХР обладает биологическими свойствами природного рецептора, а именно селективностью по отношению к а-нейротоксинам змей короткого и длинного типов.

2. Разработана эффективная система бесклеточной продукции бактериородопсина из Ех1^оЬаМепит яйтсит в растворимой форме. Показано, что использование липид-белковых нанодисков, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ, позволяет получить препараты БР-Е8/ЛБН, содержащие бактериородопсин в функционально-активной форме с выходом до 0,4 мг с 1 мл трансляционной смеси.

3. Разработана эффективная система бесклеточной продукции вольт-сенсорного домена К+-канала КуАР в виде осадка трансляционной смеси. Показана возможность синтеза селективно меченого препарата вольт-сенсорного домена. Селективное включение изотопной метки подтверждено методами гетероядерной спектроскопии ЯМР.

4. Разработана эффективная система ренатурации вольт-сенсорного домена из осадка трансляционной смеси. Применение детергента додецилфосфохолина в процессе ренатурации позволило получить домен в мономерной растворимой форме со структурой, близкой к нативной, что было подтверждено методами ЯМР-спектроскопии. Показано, что эффективность разработанного метода ренатурации составляет ~ 70%.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу выразить глубокую благодарность и искреннюю признательность своему научному руководителю к.б.н., с.н.с. лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Екатерине Назымовне Люкмановой. Хочу поблагодарить заведующего лабораторией инженерии белка ИБХ РАН д.б.н. Дмитрия Александровича Долгих, а также заведующего отделом биоинженерии и декана Биологического факультета МГУ, академика Михаила Петровича Кирпичникова за обеспечение возможности выполнения настоящей диссертационной работы, всевозможную помощь и внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Выражаю свою глубокую благодарность сотрудникам лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН к.ф-м.н. Захару Олеговичу Шенкареву и к.ф-м.н. Александру Сергеевичу Парамонову, а также руководителю лаборатории профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву за неоценимую помощь в исследовании полученных белков методами ЯМР-спектроскопии и за предоставление препаратов липид-белковых нано дисков.

Выражаю свою искреннюю признательность за помощь и ценные советы к.б.н., с.н.с. инженерии белка ИБХ РАН Ладе Евгеньевне Петровской и к.х.н., с.н.с. инженерии белка ИБХ РАН Людмиле Николаевне Шингаровой. Также хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории инженерии белка ИБХ РАН за внимание и поддержку.

Выражаю свою искреннюю благодарность к.б.н., с.н.с. лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН Владимиру Анатольевичу Широкову за неоценимую помощь и советы при выполнении работы, а также хочу поблагодарить заведующего лабораторией механизмов биосинтеза белка, академика Александра Сергеевича Спирина за предоставленную возможность выделять экстракт S30 из Е. coli на базе его лаборатории.

Отдельную благодарность хочу выразить сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ее руководителю д.ф-м.н. Константину Вольдемаровичу Шайтану за своевременную помощь и внимание, оказанное во время выполнения диссертационной работы.

Хочу поблагодарить своих родных и друзей за участие, поддержку и сопереживание, без которых мне трудно было бы выполнить эту работу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты диссертационной работы демонстрируют возможность получения различных белковых объектов с применением сопряженной бесклеточной системы синтеза. В ходе исследования были разработаны системы экспрессии генов таких белков, как внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека тип а7, бактериородопсин из ЕхщиоЬас1гпит $1Ьтсит и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+ канала. На примере ВСД-КуАР была исследована возможность бесклеточного синтеза селективно изотопно-меченых вариантов мембранных белков. Высокая эффективность этого метода была подтверждена с помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии. В случае а7ВД и ВСД-КуАР была разработана эффективная процедура ренатурации из осадка трансляционной смеси с использованием детергента додецилфосфохолина в качестве мембраномоделирующей среды. Методами спектроскопии ЯМР было показано, что ренатурированный внеклеточный домен нАХР обладает биологическими свойствами природного рецептора, а именно селективностью по отношению к а-нейротоксинам из яда змей короткого и длинного типов. Эффективность ренатурации вольт-сенсорного домена оценивали по наличию в -спектрах 1М-А1а-ВСД-КуАР сигналов, характерных для правильно свернутой формы белка. Также в качестве мембраномоделирующего компонента ТС были опробованы липид-белковые нанодиски, использование которых обеспечило необходимые условия для правильного сворачивания молекулы БР-Е8 в процессе синтеза, что позволило получить белок в растворимой функционально-активной форме.

Таким образом, было показано, что бесклеточная система синтеза является перспективной технологией получения мембранных белков и их отдельных доменов (в том числе и их селективно меченых аналогов) для дальнейших структурных и функциональных исследований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Копеина, Гелина Сергеевна, 2010 год

1. Borsook H., Deasy C.L., Haagensmit A.J., Keighley G., Lowy P.H. Incorporation in vitro of labeled amino acids into rat diaphragm proteins. J. Biol. Chem., 1950. 186(1): 309-315.

2. Keller E.B., Zamechnik P.C., Loftfield R.B. The role of microsomes in the incorporation of amino acids into proteins. J. Histochem. Cytochem., 1954. 2(5): 378-386.

3. Winnick T. Studies on the mechanism of protein synthesis in embryonic and tumor tissues. I. Evidence relating to the incorporation of labeled amino acids into protein structure in homogenates. Arch. Biochem., 1950. 27(1): 65-74.

4. Lamborg M.R., Zamechnik P.C. Amino acid incorporation into protein by extracts ofE. coli. Biochim. Biophys. Acta, 1960. 42206-211.

5. Tissieres A., Schlessinger D., Gros F. Amino acid incorparated into proteins by E. coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1960. 46(11): 14501463.

6. Nirenberg M.W., Matthaei J.H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1961. 471588-1602.

7. Marcus A., Efron D., Weeks D.P. The wheat embryo cell-free system. Methods Enzymol., 1974. 30(0): 749-754.

8. Pelham H.R., Jackson R.J. An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem., 1976. 67(1): 247-256.

9. Efron D., Marcus A. Efficient synthesis of rabbit globin in a cell-free system from wheat embryo. FEBS Lett., 1973. 33(1): 23-27.

10. Shimizu Y., Kuruma Y., Ying B.W., Umekage S., Ueda T. Cell-free translation systems for protein engineering. FEBS J., 2006. 273(18): 41334140.

11. Fischer I., Moldave K. Preparation and characterization of a cell-free system from Chinese hamster ovary cells that translates natural messenger ribonucleic acid and analysis of intermediary reactions. Anal. Biochem., 1981. 113(1): 13-26.

12. De Vries J.K., Zubay G. DNA-directedpeptide synthesis. II. The synthesis of the alpha-fragment of the enzyme beta-galactosidase. Proc. Natl. Acad. Sci., 1967. 57(4): 1010-1012.

13. Schweiger M., Gold L.M. DNA-dependent in vitro synthesis of bacteriophage enzymes. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1969. 34763-766.

14. Zubay G., Lederman M., De Vries J.K. DNA-directed peptide synthesis. 3. Repression of beta-galactosidase synthesis and inhibition of repressor by inducer in a cell-free system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1967. 58(4): 16691675.

15. Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet., 1973. 7267-287.

16. Gold L.M., Schweiger M. Synthesis of phage-specific alpha- and beta-glucosyl transferases directed by T-even DNA in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1969. 62(3): 892-898.

17. Spirin A.S. Cell-Free Translation System. Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2002.

18. Baranov V.I., Morozov I.Y., Ortlepp S.A., Spirin A.S. Gene expression in a cell-free system on the preparative scale. Gene, 1989. 84(2): 463-466.

19. Craig D., Howell M.T., Gibbs C.L., Hunt Т., Jackson R.J. Plasmid cDNA-directed protein synthesis in a coupled eukaryotic in vitro transcriptiontranslation system. Nucleic Acids Res., 1992. 20(19): 4987-4995.

20. Scheele G., Blackburn P. Role of mammalian RNase inhibitor in cell-free protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979. 76(10): 4898-4902.

21. Chekulayeva M.N., Kurnasov O.V., Skirokov V.A., Spirin A.S. Continuous-exchange cell-free protein-synthesizing system: synthesis of HIV-l antigen Nef Biochem. Biophys. Res. Coramun, 2001. 280(3): 914-917.

22. Kigawa T., Yokoyama S. A continuous cell-free protein synthesis system for coupled transcription-translation. J. Biochem., 1991. 110(2): 166-168.

23. Spirin A.S. High-throughput cell-free systems for synthesis of functionally active proteins. Trends Biotechnol., 2004. 22(10): 538-545.

24. Spirin A.S., Baranov V.I., Ryabova L.A., Ovodov S.Y., Alakhov Y.B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science, 1988. 242(4882): 1162-1164.

25. Endo Y., Oka T., Ogata K., Natori Y. Production of dihydrofolate reductase by an improved continuous flow cell-free translation system using wheat germ extract. Tokushima J. Exp. Med., 1993. 40(1-2): 13-17.

26. Kim D.M., Kigawa T., Choi C.Y., Yokoyama S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 1996. 239(3): 881-886.

27. Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., Berahard F. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. Eur. J. Biochem., 2004. 271(3): 568-580. '

28. Klammt C., Schwarz D., Lohr F., Schneider B., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. FEBS J., 2006. 273(18): 4141-4153.

29. Vinarov D.A., Lytle B.L., Peterson F.C., Tyler E.M., Volkman B.F., Markley J.L. Cell-free protein production and labeling protocol for NMR-basedstructuralproteomics. Nat. Methods, 2004. 1(2): 149-153.

30. Yokoyama S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol., 2003. 7(1): 39-43.

31. Kim D.M., Swartz J.R. Prolonging cell-free protein synthesis by selective reagent additions. Biotechnol. Prog., 2000. 16(3): 385-390.

32. Nakano H., Tanaka T., Kawarasaki Y., Yamane T. An increased rate of cellfree protein synthesis by condensing wheat-germ extract with ultrafiltration membranes. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1994. 58(4): 631-634.

33. Kozak M. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene, 1999. 234(2): 187-208."

34. McCarthy J.E., Brimacombe R. Prokaryotic translation: the interactive pathway leading to initiation. Trends Genet., 1994. 10(11): 402-407.

35. De Boer H.A., Comstock L.J., Hui A., Wong E., Vasser M. Portable Shine-Dalgarno regions; nucleotides between the Shine-Dalgarno sequence and the start codon affect the translation efficiency. Gene Amplif. Anal., 1983. 3103-116.

36. Olins P.O., Rangwala S.H. A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1989. 264(29): 16973-16976.

37. De Smit M.H., van Duin J. Secondary structure of the ribosome binding site determines translational efficiency: a quantitative analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990. 87(19): 7668-7672.

38. Hatfield G.W., Roth D.A. Optimizing scaleup yield for protein production: Computationally Optimized DNA Assembly (CODA) and Translation Engineering. Biotechnol. Annu. Rev., 2007. 1327-42.

39. Marintchev A., Wagner G. Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Q. Rev. Biophys., 2004. 37(3-4): 197-284.

40. Kaminski A., Hunt S.L., Gibbs C.L., Jackson R.J. Internal initiation of mRNA translation in eukaryotes. Genet. Eng (NY), 1994. 16115-155.

41. Jackson R.J., Hunt S.L., Gibbs C.L., Kaminski A. Internal initiation of translation of picornavirus RNAs. Mol. Biol. Rep., 1994. 19(3): 147-159.

42. Jang S.K. Internal initiation: IRES elements of picornaviruses and hepatitis с virus. Virus Res., 2006. 119(1): 2-15.

43. Danthinne X., Seurinck J., Meulewaeter F., Van M.M., Cornelissen M. The 3' untranslated region of satellite tobacco necrosis virus RNA stimulates translation in vitro. Mol. Cell Biol., 1993. 13(6): 3340-3349.

44. Fletcher L., Corbin S.D., Browning K.S., Ravel J.M. The absence of a m7G cap on beta-glob in mRNA and alfalfa mosaic virus RNA 4 increases the amounts of initiation factor 4F required for translation. J. Biol. Chem., 1990. 265(32): 19582-19587.

45. Rospert S. Rib о some function: governing the fate of a nascent polypeptide. Curr. Biol., 2004. 14(10): R386-R388.

46. А.Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка. Книжный Дом Университет: Москва, 2002.

47. А.Колб В.А. Котрансляциоиное сворачивание белков. Молекулярная биология, 2001. 35(4): 682-690.

48. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. C.o-translational folding of an eukaryotic midtidomain protein in a prokaryotic translation system. J. Biol. Chem., 2000. 275(22): 16597-16601.

49. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. Cotranslational folding of glob in. J. Biol. Chem., 1997. 272(16): 10646-10651.

50. А.Рубин А.Б. Биофизика. Изд-во МГУ: Москва, 2004.

51. Haber Е., Anfmsen С.В. Regeneration of enzyme activity by air oxidation of reduced subtilisin-modified ribonuclease. J. Biol. Chem., 1961. 236422-424.

52. А.Спирин А.С. Молекулярная биология: структура рибосомы и биосинтез белка. Высшая школа: Москва, 1986.

53. Frydman J., Nimmesgern Е., Olitsuka К., Hartl F.U. Folding of nascent polypeptide chains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones. Nature, 1994. 370(6485): 111-117.

54. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. To fold or to refold. Appl. Biochem. Biotechnol., 1997. 66(3): 197-238.

55. Macario A.J., Conway de M.E. Molecular chaperones: multiple functions, pathologies, and potential applications. Front Biosci., 2007. 122588-2600.

56. Reckel S., Sobhanifar S., Durst F., Lohr F., Shirokov V.A., Dotsch V., Bernhard F. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods Mol. Biol., 20i0. 607187-212.

57. Traviglia S Expression of soluble murine endostatin with the RTS system. In Cell-Free Translation System (ed. Spirin A. S.). Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2002. p: 149-156.

58. Nishihara K., Kanemori M., Yanagi H., Yura T. Overexpression of trigger factor prevents aggregation of recombinant proteins in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 2000. 66(3): 884-889.

59. Ryabova L.A., Desplancq D., Spirin A.S., Pluckthun A. Functional antibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nat. Biotechnol., 1997. 15(1): 79-84.

60. Kim D.M., Swartz J.R. Efficient production of a bioactive, multiple disulfide-bonded protein using modified extracts of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 2004. 85(2): 122-129.

61. Frey S., Haslbeck M., Hainzl O., Buchner J. Synthesis and characterization of a functional intact IgG in a prokaryotic cell-free expression system. Biol. Chem., 2008. 389(1): 37-45.

62. Nemetz C., Wessner S., Krupka S., Watzele M., Mutter W. Cell-free expression of soluble human erythropoietin. In Cell-Free Translation System (ed. Spirin S. A.). Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2002. p: 157-163.

63. Schraml M., Ambrosius D., Stracke J., Lanzendorfer M. Sequence specific biotinylation and purification of proteins expressed in the RTS 500 system.

64. Cell-Free Translation System (ed. Spirin A. S.). Springer Veglar: Berlin, Heidelberg, New York., 2002. p: 227-234.

65. Mouat M.F. Dihydrofolate influences the activity of Escherichia coli dihydrofolate reductase synthesised de novo. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2000. 32(3): 327-337.

66. Lehmann D, Wedekind F Optimization of cell-free of FAD-dependent D-amino acid oxidase. In Cell- Free Protein Expression (ed. Swartz J. R.). Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2003. p: 159-164.

67. А.Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. Химия: Москва, 1975.

68. Klammt С., Schwarz D., Eifler N., Engel A., Piehler J., Haase W., Halm S., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free production of G protein-coupled receptors for functional and structural studies. J. Struct. Biol., 2007. 158(3): 482-493.

69. Wuu J.J., Swartz J.R. High yield cell-free production of integral membrane proteins without refolding or detergents. Biochim. Biophys. Acta, 2008. 1778(5): 1237-1250.

70. Hovijitra N.T., Wuu J.J., Peaker В., Swartz J.R. Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes. Biotechnol. Bioeng., 2009. 104(1): 40-49.

71. Bayburt Т.Н., Grinkova Y.V., Sligar S.G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters, 2002. 853-856.

72. Civjan N.R., Bayburt Т.Н., Schuler M.A., Sligar S.G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques, 2003. 35(3): 556-3.

73. Leitz A.J., Bayburt Т.Н., Barnakov A.N., Springer B.A., Sligar S.G. Functional reconstitution of Beta2-adrenergic receptors utilizing self-assembling Nanodisc technology. Biotechniques, 2006. 40(5): 601-2, 604, 606, passim.

74. Wright P.E., Dyson H.J., Lerner R.A. Conformation ofpeptide fragments of proteins in aqueous solution: implications for initiation of protein folding. Biochemistry, 1988. 27(19): 7167-7175.

75. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Curr. Opin. Biotechnol., 1998. 9(5): 497-501.

76. Burgess R.R. Purification of overproduced Escherichia coli RNA polymerase sigma factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from Sarkosyl. Methods Enzymol., 1996. 273145-149.

77. Stockel J., Doring K., Malotka J., Jahnig F., Dornmair K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC.) molecules. Eur. J. Biochem., 1997. 248(3): 684-691.

78. De Bernárdez C.E., Schwarz E., Rudolph R. Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding. Methods Enzymol., 1999. 309217236.

79. Singh S.M., Panda A.K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J. Biosci. Bioeng., 2005. 99(4): 303-310.

80. Singh S.M., Eshwari A.N., Garg L.C., Panda A.K. Isolation, solubilization, refolding, and chromatographic purification of human growth hormonefrom inclusion bodies of Escherichia coli cells: a case study. Methods Mol. Biol., 2005. 308163-176.

81. Buchner J., Pastan I., Brinkmann U. A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins: single-chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies. Anal. Biochem., 1992. 205(2): 263-270.

82. Fischer B., Perry B., Sumner I., Goodenough P. A novel sequential procedure to enhance the renaturation of recombinant protein from Escherichia coli inclusion bodies. Protein Eng, 1992. 5(6): 593-596.

83. Maeda Y., Koga H., Yamada H., Ueda T., Imoto T. Effective renaturation of reduced lysozyme by gentle removal of urea. Protein Eng., 1995. 8(2): 201205.

84. West S.M., Chaudhuri J.B., Howell J.A. Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis. Biotechnol. Bioeng., 1998. 57(5): 590-599.

85. Muller C., Rinas U. Renaturation of heterodimeric platelet-derived growth factor from inclusion bodies of recombinant Escherichia coli using size-exclusion chromatography. J. Chromatogr. A, 1999. 855(1): 203-213.

86. Fahey E.M., Chaudhuri J.B., Binding P. Refolding and purification of a urokinase plasminogen activator fragment by chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sei. Appl., 2000. 737(1-2): 225-235.

87. Werner M.H., Clore G.M., Gronenborn A.M., Kondoh A., Fisher R.J. Refolding proteins by gel filtration chromatography. FEBS Lett., 1994. 345(2-3): 125-130.

88. Wang S.S., Chang C.K., Liu H.S. Effect of sample loop dimension on lysozyme refolding in size-exclusion chromatography. J. Chromatogr. A., 2007. 1161(1-2): 56-63.

89. Suttnar J., Dyr J.E., Hamsikova E., Novak J., Vonka V. Procedure for refolding and purification of recombinant proteins from Escherichia coli inclusion bodies using a strong anion exchanger. J. Chromatogr. B Biomed. Appl., 1994. 656(1): 123-126.

90. Negro A., Onisto M., Grassato L., Caenazzo C., Garbisa S. Recombinant human TIMP-3 from Escherichia coli: synthesis, refolding, physico-chemical and functional insights. Protein Eng, 1997. 10(5): 593-599.

91. Zouhar J., Nanak E., Brzobohaty B. Expression, single-step purification, and matrix-assisted refolding of a maize cytokinin glucoside-specific beta-glucosidase. Protein Expr. Purif., 1999. 17(1): 153-162.

92. Cho T.H., Alm S.J., Lee E.K. Refolding of protein inclusion bodies directly from E. coli homogenate using expanded bed adsorption chromatography. Bioseparation., 2001. 10(4-5): 189-196.

93. Vuillard L., Rabilloud T., Goldberg M.E. Interactions of non-detergent sulfobetaines with early folding intermediates facilitate in vitro protein renaturation. Eur. J. Biochem., 1998. 256(1): 128-135.

94. Vuillard L., Braun-Breton C., Rabilloud T. Non-detergent sulphobetaines: a new class of mild solubilization agents for protein purification. Biochem. J., 1995. 305 (Pt 1)337-343.

95. Hucho F., Weise C. Ligand-Gated Ion Channels. Angew. Chem., 2001. 403100-3116.

96. Decker M.W., Brioni J.D., Bannon A.W., Arneric S.P. Diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors: lessons from behavior and implications for CNS therapeutics. Life Sei., 1995. 56(8): 545-570.

97. Levin E.D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J. Neurobiol., 2002. 53(4): 633-640.

98. Newhouse P., Singh A., Potter A. Nicotine and nicotinic receptor involvement in neuropsychiatrie disorders. Curr. Top. Med. Chem., 2004. 4(3): 267-282.

99. Paterson D., Nordberg A. Neuronal nicotinic receptors in the human brain. Prog. Neurobiol., 2000. 61(1): 75-111.

100. Ripoll N., Bronnec M., Bourin M. Nicotinic receptors and schizophrenia. Curr. Med. Res. Opin., 2004. 20(7): 1057-1074.

101. Shytle R.D., Silver A.A., Lukas R.J., Newman M.B., Sheehan D.V., Sanberg P.R. Nicotinic acetylcholine receptors as targets for antidepressants. Mol. Psychiatry, 2002. 7(6): 525-535.

102. Egleton R.D., Brown K.C., Dasgupta P. Angiogenic activity of nicotinic acetylcholine receptors: implications in tobacco-related vascular diseases. Pharmacol. Tlier., 2009. 121(2): 205-223.

103. А.Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Мир: Москва, 1994.

104. Eisenman G., Dani J.A. An introduction to molecular architecture and permeability of ion channels. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1987. 16205-226.

105. Wilson G., Karlin A. Acetylcholine receptor channel structure in the resting, open, and desensitized states probed with the substituted-cysteine-accessibility method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001. 98(3): 1241-1248.

106. Tsetlin V.I., Hucho F. Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications. FEBS Lett., 2004. 557(1-3): 9-13.

107. Albuquerque E.X., Pereira E.F., Alkondon M., Rogers S.W. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function. Physiol Rev., 2009. 89(1): 73-120.

108. Tank D.W., Huganir R.L., Greengard P., Webb W.W. Patch-recorded single-channel currents of the purified and reconstituted Torpedo acetylcholine receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1983. 80(16): 51295133.

109. Hille B. Ion channels of Excitable Membranes, 3rd ed. Sinauer Associates Inc: Sunderland, MA, 2001.

110. Le Novere N., Corringer P.J., Changeux J.P. The diversity of subunit composition in nAChRs: evolutionary origins, physiologic and pharmacologic consequences. J. Neurobiol., 2002. 53(4): 447-456.

111. Hogg R.C., Raggenbass M., Bertrand D. Nicotinic acetylcholine receptors: from structure to brain function. Rev. Physiol Biochem. Pharmacol., 2003. 1471-46.

112. Jensen A.A., Frolund B., Liljefors T., Krogsgaard-Larsen P. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: structural revelations, target identifications, and therapeutic inspirations. J. Med. Chem., 2005. 48(15): 4705-4745.

113. Galzi J.L., Changeux J.P. Neuronal nicotinic receptors: molecular organization and regulations. Neuropharmacology, 1995. 34(6): 563-582.

114. Unwin N. Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A resolution. J. Mol. Biol., 2005. 346(4): 967-989.

115. Millar N.S. A review of experimental techniques used for the heterologous expression of nicotinic acetylcholine receptors. Biochem. Pharmacol., 2009. 78(7): 766-776.

116. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. Nat. New Biol., 1971. 233(39): 149152.

117. Khorana H.G. Bacteriorhodopsin, a membrane protein that uses light to translocate protons. J. Biol. Chem., 1988. 263(16): 7439-7442.

118. Lanyi J.K. X-ray crystallography of bacteriorhodopsin and its photointermediates: insights into the mechanism of proton transport. Biochemistry (Mosc.), 2001. 66(11): 1192-1196.

119. Edmonds B.W., Luecke H. Atomic resolution structures and the mechanism of ion pumping in bacteriorhodopsin. Front Biosci., 2004. 91556-1566.

120. De la Torre Jr., Christianson L.M., Beja O., Suzuki M.T., Karl D.M., Heidelberg J., DeLong E.F. Proteorhodopsin genes are distributed among divergent marine bacterial taxa. Proc. Natl. Acad. Sci., 2003. 100(22): 12830-12835.

121. Gomez-Consaraau L., Gonzalez J.M., Coll-Llado M., Gourdon P., Pascher T., Neutze R., Pedros-Alio C., Pinhassi J. Light stimulates growth of proteorhodopsin-containing marine Flavobacteria. Nature, 2007. 445(7124): 210-213.

122. Sabehi G., Massana R., Bielawski J.P., Rosenberg M., DeLong E.F., Beja O. Novel Proteorhodopsin variants from the Mediterranean and Red Seas. Environ. Microbiol., 2003. 5(10): 842-849.

123. Kouyama T., Kanada S., Takeguchi Y., Narusawa A., Murakami M., Ihara K. Crystal structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin from Natronomonas pharaonis. J. Mol. Biol., 2010. 396(3): 564-579.

124. Sasaki J., Spudich J.L. Signal transfer in haloarchaeal sensory rhodopsin-transducer complexes. Photochem. Photobiol., 2008. 84(4): 863-868.

125. Hampp N. Bacteriorhodopsin as a Photochromic Retinal Protein for Optical Memories. Chem. Rev., 2000. 100(5): 1755-1776.

126. Ballesteros J., Palczewski K. G protein-coupled receptor drug discovery: implications from the crystal structure of rhodopsin. Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2001. 4(5): 561-574.

127. Mizobe T., Maze M., Lam V., Suryanarayana S., Kobilka B.K. Arrangement of transmembrane domains in adrenergic receptors. Similarity to bacteriorhodopsin. J. Biol. Chem., 1996. 271(5): 2387-2389.

128. Filmore D. It's a GPC.R world. Modern Drug Discovery, 2004. p: 24-28.

129. Borjesson S.I., Elinder F. Structure, function, and modification of the voltage sensor in voltage-gated ion channels. Cell Biochem. Biophys., 2008. 52(3): 149-174.

130. Alabi A.A., Bakamonde M.I., Jung H.J., Kim J.I., Swartz K.J. Portability of paddle motif function and pharmacology in voltage sensors. Nature, 2007. 450(7168): 370-375.

131. Bosmans F., Martin-Eauclaire M.F., Swartz K.J. Deconstructing voltage sensor function and pharmacology in sodium channels. Nature, 2008. 456(7219): 202-208.

132. Zhang M.M., Han T.S., Olivera B.M., Bulaj G., Yoshikami D. Mu-conotoxin KIIIA derivatives with divergent affinities versus efficacies in blocking voltage-gated sodium channels. Biochemistry, 2010. 49(23): 4804-4812.

133. Ashcroft F.M. Ion channels and disease. Academic Press: San Diego, CA, 2000.

134. Long S.B., Campbell E.B., MacKinnon R. Crystal structure of a mammalian voltage-dependent Shaker family K+ channel. Science, 2005. 309(5736): 897-903.

135. Long S.B., Tao X., Campbell E.B., MacKinnon R. Atomic structure of a voltage-dependent K+ channel in a lipid membrane-like environment. Nature, 2007. 450(7168): 376-382.

136. Doyle D.A., Morais C.J., Pfiietzner R.A., Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science, 1998. 280(5360): 69-77.

137. Heginbotham L., Lu Z., Abramson T., MacKinnon R. Mutations in the K+ channel signature sequence. Biophys. J., 1994. 66(4): 1061-1067.

138. Long S.B., Campbell E.B., MacKinnon R. Voltage sensor of KvJ.2: structural basis of electromechanical coupling. Science, 2005. 309(5736): 903-908.

139. Jiang Y., Lee A., Chen J., Ruta V., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature, 2003. 423(6935): 33-41. '

140. Ruta V., Jiang Y., Lee A., Chen J., MacKinnon R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature, 2003. 422(6928): 180-185.

141. Li-Smerin Y., Hackos D.H., Swartz K.J. alpha-helical structural elements within the voltage-sensing domains of a K(+) channel. J. Gen. Physiol, 2000. 115(1): 33-50.

142. Lee S.Y., Lee A., Chen J., MacKinnon R. Structure of the KvAP voltage-dependent K+ channel and its dependence on the lipid membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005. 102(43): 15441-15446.

143. Seoh S.A., Sigg D., Papazian D.M., Bezanilla F. Voltage-sensing residues in the S2 and S4 segments of the Shaker K+ channel. Neuron, 1996. 16(6): 1159-1167.

144. Ruta V., MacKinnon R. Localization of the voltage-sensor toxin receptor on KvAP. Biochemistry, 2004. 43(31): 10071-10079.

145. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 1983. 166(4): 557-580.

146. Spirin S.A. and Swartz J.R. Cell-free Protein Synthesis. Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2003.

147. Schagger H., von Jagow G. Tri cine-sodium dodecyl sulfate-po ly aery lam ide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 1987. 166(2): 368-379.

148. Keller R Optimizing the process of nuclear magnetic resonance spectrum analysis and computer aided resonance assignment. PhD thesis ETH Zurich Switzerland (ETH Nr. 15947), http://www. nmr. ch, 2005.

149. Brejc K., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van der Oost J., Smit A.B., Sixma Т.К. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. Nature, 2001. 411(6835): 269-276.

150. Wells G.B., Anand R., Wang F., Lindstrom J. Water-soluble nicotinic acetylcholine receptor formed by alpha7 subunit extracellular domains. J. Biol. Chem., 1998. 273(2): 964-973.