Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Мосин, Олег Викторович

• Мосин, Олег Викторович
• кандидат химических наук
• 1996

Оглавление диссертации кандидат химических наук Мосин, Олег Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Использование БАС, меченных стабильными изотопами 2H(D), 13С, l5N (обзор литературы).

1.1. Использование БАС, меченных стабильными изотопами 2H(D), 13С, 15N.

1.1.1. Использование БАС в биохимических исследованиях

1.1.2. Использование меченных БАС в химических синтезах и в диагностике

1.1.3. Использование меченных БАС в структурно - функциональных исследованиях

1.2. Методы получения изотопно-меченных БАС

1.2.1. Химические синтезы изотопно-меченных БАС

1.2.2. Изотопный обмен (H-D) в молекулах БАС

1.2.3. Биотехнологический метод получения изотопно-меченных БАС

1.2.4. Использование микроводорослей для получения изотопно-меченных БАС

1.2.5. Использование гетеротрофных бактерий для получения изотопно-меченных БАС

1.2.6. Использование метилотрофных бактерий для получения изотопно-меченных БАС

1.2.7. Сериновый путь ассимиляции Ci-соединений

1.2.8. Рибулёзо-5-монофосфатный путь ассимиляции Ci-соединений

1.2.9. Получение изотопно-меченных БАС за счёт биоконверсии |3СНзОН или CD3OD в метилотрофах

1.2.9.1. Получение дейтерий-меченных БАС

1.2.9.2. Методы получения |3С-БАС

1.2.9.3. Использование ауксотрофных мутантов бактерий для получения изотопно-меченных БАС

1.2.9.4. Генно-инженерные методы получения изотопно-меченных БАС

1.3. Выделение изотопно-меченных БАС из гидролизатов бактериальной биомассы.

1.3.1. Ионнообменная хроматография изотопно-меченных БАС

1.3.2. Выделение изотопно-меченных БАС методами обращённо-фазовой ВЭЖХ

1.4. Химико-ферментативный метод получения изотопно-меченных БАС.

1.4.1. Использование ферментативных систем для получения стабильно-меченных аминокислот

1.4.2. Получение дейтерий-меченных аминокислот за счёт изотопного обмена (Н-D) в ферментативных системах

1.4.3. Использование а-аминокислот в качестве интермедиантов при получении дейтерий-меченных аминокислот

1.4.4. Получение дейтерий-меченных аминокислот из их низкомолекулярных предшественников

1.4.5. Получение изотопно-меченных ароматических аминокислот

1.4.6. Получение 15Н-аминокислот

1.5. Исследование биосинтеза БАС в гетеротрофных бактериях.

1.5.1. Исследование биосинтеза аминокислот, Сахаров, липидов и нуклеозидов

1.5.2. Биосинтез аминокислот

1.5.3. Биосинтез Сахаров

1.5.4. Биосинтез липидов

1.5.5. Биосинтез нуклеозидов

1.6. Методы исследования БАС, меченных стабильными изотопами 2H(D), 13С, !5N

1.6.1. Исследование структуры БАС методами ЯМР

1.6.2. Спектроскопия ЯМР твёрдого тела

1.6.3. Исследование пространственной структуры белка методом дифракции рентгеновских лучей

1.6.4. Исследование пространственной структуры белка методом дифракции нейтронов

1.6.5. Исследование изотопно-меченных БАС методом спектроскопии комбинационного рассеяния

1.6.6. Исследование изотопно-меченных БАС методом масс-спектрометрии

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение.

2.1. Получение штаммов-продуцентов БАС, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с максимальными концентрациями экзогенной D2O.

2.1.1. Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum

2.1.2. Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum

2.1.3. Адаптация бацилл В. subtilis и В. amyloliquefaciens

2.1.4. Адаптация галофильных бактерий Н. halobium ЕТ

2.2. Изучение роста и биосинтеза БАС полученными штаммами.

2.2.1. Изучение ростовых характеристик М. flagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD/13СНзОН и DzO

2.2.2. Получение штамма В. methylicum, продуцента L-Phe

2.2.3. Исследование биосинтеза L-Phe метилотрофными бактериями В. methylicum

2.2.4. Изучение влияния D2O на ростовые и биосинтетические характеристики В. methylicum

2.2.5. Исследование роста адаптированного штамма В. methylicum и биосинтеза L-Phe в максимально дейтерированной среде

2.2.6. Изучение качественного и количественного состав аминокислот суммарных белков биомассы В. methylicum

2.2.7. Сравнительный анализ состава белков при росте В. methylicum в максимально дейтерированной среде

2.2.8. Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. subtilis на средах, содержащих D2O и гидролизаты метилотрофных бактерий

2.2.9. Изучение состава внутриклеточных Сахаров В. subtilis

2.2.9.1. Изучение липидных профилей В. subtilis

2.3. Анализ природы адаптационных процессов к D2O в клетке.

2.3.1. Теоретический анализ процессов адаптации клетки к D2O

2.4. Изучение уровней включения дейтерия и 13С в молекулы секретируемых аминокислот В. methylicum и М. flagellatum.

2.4.1. Получение препаратов культуральных жидкостей, содержащих секретируемые дейтерий и 13С-аминокислоты

2.4.2. Получение метиловых эфиров Dns-аминокислот и Z-производных аминокислот

2.4.3. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот В. methylicum

2.4.4. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот В. methylicum на D2O-coдержащих средах

2.4.5. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот В. methylicum на средах, содержащих максимальные концентрации D2O

2.4.6. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислоты за счёт конверсии CD3OD

2.4.7. Исследование степеней включения 13С в секретируемые аминокислоты М. flagellatum за счёт конверсии 13СНзОН

2.5. Изучение уровней включения дейтерия и 13С в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы В. methylicum и М. flagellatum

2.5.1. Выделение дейтерий и 13С-аминокислот из белковых гидролизатов

2.5.2. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков В. methylicum на ЭгО-содержащих средах

2.5.3. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков В. methylicum на средах, содержащих максимальные концентрации D

2.5.4. Исследование степеней включения 13С в аминокислоты М. flagellatum за счёт биоконверсии 13СНзОН

2.6. Исследование возможности использования гидролизатов дейтерий-меченной биомассы В. methylicum в качестве субстратов для получения [Г,3',4',2,8 -Оз]-инозина.

2.6.1. Получение [l',3',4',2,8-Dsj-инозина

2.6.2. Исследование степени дейтерированности инозина

2.7. Разработка способов получения дейтерий-меченного бактериородопсина.

2.7.1. Получение дейтерий-меченного бактериородопсина

2.7.2. Гидролиз дейтерий-меченного bR

2.7.3. Исследование степени дейтерированности L-Phe, L-Tyr и L-Trp в бактериородопсине

2.7.4. Исследование степени дейтерированности L-Phe, выделенного из гидролизата bR

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы

3.2. Бактериальные штаммы

3.3. Условия адаптации

3.4. Питательные среды

3.5. Методы

3.6. Очистка полученных соединений

3.7. Идентификация полученных соединений

3.8. Методы анализа полученных БАС 95 ВЫВОДЫ 98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения»

В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами 2H(D), 13С, 15N, |80(|70), которые необходимы для разнопрофильных биохимических и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС). Тенденции к предпочтительному применению стабильно-меченных соединений по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией (МС). Развитие этих методов анализа позволило за последние годы значительно усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Комплексная реализация методов биосинтетического введения изотопной метки в организм за счет ассимиляции меченных субстратов и ее последующей детекцией в компонентах биомассы и секретируемых БАС (аминокислоты, белки, сахара, нуклеозиды), позволяет осуществлять систему биологического мониторинга стабильно-меченных соединений в организме. Зачастую, для данных исследований необходимо, чтобы синтезируемые БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС, меченных стабильными изотопами с высокими степенями изотопного обогащения является актуальной задачей для современной биотехнологии. Стоимость биосинтетически полученных изотопно-меченных природных соединений значительно ниже, чем химически синтезированных, что представляет интерес для поиска новых промышленных штаммов - продуцентов БАС.

С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность получать разнообразные стабильно-меченные соединения за счёт биологической конверсии CD3OD/D2O в генетически сконструированных штаммах бактерий. Это позволило расширить круг применяемых для этих целей штаммов- продуцентов БАС за счёт использования новых перспективных микробных объектов, прежде всего метилотрофных бактерий, способных ассимилировать метанол и другие одноуглеродные субстраты. В последнее время эти бактерии привлекают внимание исследователей, как источники дешёвых микробного белка и аминокислот. Однако микробиологические процессы редко применяются в биотехнологии, вследствие наличия ряда трудностей, связанных с адаптацией и культивированием клеток на средах с максимальными концентрациями экзогенной D2O. Поэтому целый ряд вопросов, которые касаются принципиальной возможности использования различных штаммов-продуцентов БАС для роста и биосинтеза на средах, содержащих экзогенную D2O, решение которых необходимо для целенаправленного культивирования организмов, остаются до конца невыясненными.

Самостоятельной проблемой, требующей скорейшего разрешения является изучение процессов физиологической адаптации клетки к дейтерию при росте организма на средах, содержащих максимальные концентрации D2O. Это связано с тем, что метаболизм организма на D2O может существенно отличаться от такового на обычной воде. Явление адаптации к D2O интересно не только само по себе, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии. Эти данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium methylicum, облигатные метилотрофные бактерии MethylobacUlus flagellatum, галофильные бактерии Halobacterium methylicum ЕТ 1001 и бациллы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Целью настоящей работы была разработка методов биотехнологического получения аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных 2Н (D) и |3С, с высокими степенями изотопного обогащения.

Этапы исследования включали:

4. Исследование процессов адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту и биосинтезу на средах с максимальными концентрациями D2O.

2. Изучение уровней включения дейтерия и 13С в молекулы экзогенных аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий, полученных за счёт биологической конверсии СБзСЮ/13СНзОН и D2O.

3. Исследование принципиальной возможности использования суммы химических компонентов дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий, полученных в ходе многоступенчатой адаптации к D2O, в качестве субстратов для синтеза высокообогащённых дейтерием бактериородопсина и инозина.

Поскольку биотехнологический потенциал исследуемых штаммов при росте на тяжёлой воде к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах, содержащим максимальные концентрации D2O для синтеза дейтерий-меченных аминокислот, белков и нуклеозидов. С этой целью было необходимо применить специальные биотехнологические подходы для получения меченных БАС, что позволило подойти к решению комплексного использования суммарных химических компонентов меченной биомассы полученных штаммов-продуцентов и к созданию новых безотходных биотехнологических процессов.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Мосин, Олег Викторович

ВЫВОДЫ:

1. Подобраны условия для проведения адаптации штаммов В. methylicum, Н. halobium, В. subtilis и В. amyloliquefaciens к росту на ЭгО-средах. Селекционно отобраны штаммы, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические характеристики на средах с максимальными концентрациями экзогенной D2O.

2. Показана принципиальная возможность использования суммы химических компонентов дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum в качестве источников ростовых субстратов для синтеза дейтерий-меченных БАС.

3. Изучено влияние меченных субстратов - D20, CD3OD и 13СНзОН на ростовые и биосинтетические параметры различных штаммов -продуцентов БАС. Показано, что униформные уровни включения дейтерия в молекулы синтезируемых БАС можно получить, используя высокообогащённые дейтерием среды (D20 и СНзОН), а в случае с 13С-мечением того же результата можно достичь за счёт использования 13СНзОН.

4. Предложена дансильная модификация препаратов культуральной жидкости для изучения степеней изотопного обогащения аминокислот методом масс-спектрометрии электронного удара. Метод позволяет проводить анализ изотопного состава мультикомпонентных смесей аминокислот, как свободных аминокислот из культуральной жидкости, так и аминокислот в составе гидролизатов суммарных белков биомассы.

5. Проведено сравнительное изучение степеней включения дейтерия и 13С в молекулы секретируемых аминокислот, так и в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы штаммов метилотрофных бактерий в условиях их роста на средах, содержащих ступенчато увеличивающие концентрации D20. Определена чёткая корреляция между уровнем включения изотопной метки в молекулы аминокислот и концентрации D20 в ростовых средах.

6. Разработана схема получения дейтерий-меченных БАС с высокими степенями изотопного обогащения, основанная на использовании гетеротрофных микроорганизмов -продуцентов соответствующих БАС. Данная схема проверена на примере получения дейтерий-меченных инозина и бактериородопсина.

7. Исследованы методы сайт-специфического и униформного введения дейтериевой метки в бактериородопсин. Показано, что включение отдельных дейтерий-меченных аминокислот в молекулу бактериородопсина носит селективный характер, а использование адаптированного к D20 Н. halobium ЕТ 1001 на средах с меченными субстратами и 99,9% D20 позволяет получать униформно меченный бактериородопсин.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Мосин, Олег Викторович, 1996 год

1. LeMaster D. Deuterium labeling in NMR structural analysis of larger proteins. II Quartely Rev. Biophys., 1990, V. 23, No. 2, pp. 133-174.

2. LeMaster D. Uniform and selective deuteration in two-dimentional NMR of proteins. // Annu. Rev. Biophys., 1990, V. 19, pp. 243-246.

3. Bax A. & Weiss M. A. Simplification of two-dimensional NOE spectra of proteins by 13C labelling. Hi. Magn. Reson., 1987, V. 71, pp. 571-575.

4. Motil K. J., Montandon С. M., Thotathuchery M., and Garza C. Dietary protein and nitrogen balance in lactating and nonlactating women. II Am. J. Clin. Nutr., 1990. V. 51, pp. 378-384.

5. Hruby V. J. Synthesis and use of specific isotopically labelled peptide hormons for studying of conformation dynamics and hormon-protein interactions. // Synth, and Appl. Isot. Label. Compounds, 1985, V. 4, pp. 287-292.

6. Nelson J. E., Ruo Т. I. Assay of stable isotope labeled urea in biological fluids by selected ion monitoring. II Clinica Chemica Acta, 1988, V. 175, pp. 59-65.

7. Gregory R. B, and Rosenberg A. Protein conformation dinamics measured by hydrogen isotope exchange techniques // Methods in Enzymol, 1986, V. 131, pp. 448-508.

8. Murphy R. C., Anderson F. S., Clay K. L. In vitro and in vivo studies of amino acids labeled with 180 at the carboxyl moiety. // in Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference, Ed by Klein E. R., Academic Press, New York, 1979, pp. 139-146.

9. Samuel D. Methodology of oxyden isotopes. In oxygenases, M. Hayaishi, Ed., Academic Press, New York, 1972, pp. 31-86.

10. Kaptein R., Boelens R., Scheek R. M., and van Gunsteren W. F. Protein Structures from NMR. // Biochemistry, 1988, V. 27, No. 15, pp. 5389-5395.

11. Rothschild, K. J., Braiman, M. S., He, Yi-Wu., Marti, Т., and Khorana, H. G. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants. // J. of Biol. Chem., 1990, V. 28, pp. 16985-16991.

12. Argade, P. V., Rothschild, K. J., Kawamoto, A. H„ Herzfeld, J., and Herlihy, W. C. Resonance Raman spectroscopy of specifically s-l5N.Iysine-labeled bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, V. 78, No. 3, pp. 1643-1646.

13. Vetter, W. in: Biochemical Applications of mass-spectrometry (Walles G.R., and Dormor O.C.). 1980, First supplementary volume, Wiley Interscience, New York, USA, p. 439.

14. Daub, G. H. Syntheses with stable isotopes. II in Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference, Ed by Klein, E. R., Academic Press, New York, 1979, pp. 3-10.

15. Варшавскийб Я. М. О распределении изотопа углерода 13С в биологических системах. // Биофизика, 1988, V. 33, № 2, pp. 351-355.

16. Dhara К. P., Yamamoto Е., Bokelman G. Н., Wooten J. В. Incorporation of 2-13C.-ferulic acid, a lignin precursor in L. leucocephala etc. // J. C. S. Chem. Commun., 1988, pp. 1626-1628.

17. Wright A. D., Sampson M. В., Michalczuk L., Slovin J. P., Cohen J. D. Indole-3-acetic acid biosynthesis in the mutant maize orange pericarp, a tryptophan auxotroph. II Science-Washington, 1991, V. 254, No 5034, pp. 998-1000.

18. Michalczuk L., Ribnicky D. M., Cooke T. J., Cohen J. D. Regulation of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures. // Plant-Physiology, 1992, V. 100, No 3, pp. 1346-1353.

19. Kliender R. Studies on the incorporation of (2S, 3R)-4,4,4-2H3. valine and (2S, 3S)-[4,4,4-2Нз] valine into p-lactam antibiotics. //J. Am. Chem. Soc., 1974, V. 96, No 12, pp. 4054-4056.

20. Cardillo R. Pattern of incorporation of leucine samples asymmetrically labelled with 13C inthe Cs- isopropyl unit of Echiruline and flavoglaucine. // J. of Chem. Soc. D., 1977, pp. 474-476.

21. Griffiths, D. V., Feeney, J., Roberts, G. С. K., and Burgen, A. S. V. Preparation of selectively deuterated aromatic amino acids for use in NMR studies of proteins. II Biochim. et Biophys. Acta, 1976, V. 446, pp. 479-485.

22. Kinsey, R. A., Kintanar, A., and Oldfield, E. Dynamics of amino acid side chains in membrane proteins by high field solid state deuterium nuclear magnetic resonance spectroscopy. //J. Biol. Chem., 1981, У. 256, No. 17, pp. 9028-9036.

23. Mcintosh, L. P., and Dahlquist, F. W. Biosynthetic incorporation of 15N and 13C for assignment and interpretation of nuclear magnetic resonance spectra of proteins. // Quarterly Reviews of Biophysics, 1990, V. 23, pp. 1-38.

24. LeMaster, D. M., and Cronan, J. E. Biosynthetic production of 13C-labeled amino acids with site-specific enrichment. //J. of Biological Chemistry, 1982, V. 257, No. 3, pp. 1224-1230.

25. Cox, J., Kyli, D., Radmer, R. Stable isotope labeled biochemicals from microalgae. // Trends

26. Biotechnol., 1988, V. 6, pp. 279-282.

27. Patel, G. В., Sprott, G. D., and Ekiel, I. Production of specifically labeled compounds by Methanobacterium espanolae grown on H2-CO2 plus 13C.acetate. // Appl. and Environ. Microbiol., 1993, V. 59, pp. 1099-1103.

28. Fukuzaki, S., Nishio, N., and Nagai, S. Kinetics of the methanogenic fermentation of acetate. //Appll. Environ. Microbiol., 1990, V. 56, pp. 3158-3163.

29. Daniels, L., Sparling, R., and Sprott, G. D. The bioenergetics of methanogenesis. // Biochim. Biophys. Acta, 1984, V. 768, pp. 113-163.

30. Patel., G. В., Sprott, G. D., and Fein, J. E. Isolation and characterization of Methanobacterium espanolae sp. nov., a mesophilic, moderately acidiphilic methanogen. II Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, V. 40, pp. 79-82.

31. McFadden, В. A. Assimilation of One-Carbon Compounds, in: The Bacteria, a Treatise on Structure and Function, Ed., Ornston, L. N., and Sokatch, Academic Press, New York, 1978, V. 4, pp. 219-290.

32. Colby, J., Dalton, H., and Whittenbury, R. Biological and biochemical aspects of microbial growth on Ci compounds. //Ann. Rev. Microbiol., 1979, V. 33, pp. 481-517.

33. Anthony, C. Bacterial oxidation of methane and methanol, in: Advances inMicrobial Physiology, Academic Press, New York, USA, 1986, V. 27, pp. 113-203.

34. Karnaukhova, E. N., Reshetova, O. S., Semenov, S. Y., Skladnev, D. A., and Tsygankov, Y. D. 2H-and 13C-labeled amino acids generated by obligate mthylotrophs Biosynthesis and MS monitoring.//Amino Acids, 1994, V. 6, pp. 165-176.

35. Brown-Mason, A., Dobson, M., and Woodworth, R. C. Efficient incorporation of deuterated amino acids into quail egg white proteins for nuclear magnetic resonance studies. // J. of Biolog. Chem., 1981, V. 256, No. 4, pp. 1506-1509.

36. Crespi, H. L. Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins, in: Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd., Ed., Muccino, R. R., 1986, Elsevier, Amsterdam, pp. 111-112.

37. Skladnev, D. A., and Tsygankov, Y. D. Conversion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass, 6 th Eur. Conf. on Biomass for Energy, 22-26 April 1991, Athens, Greece, p. 234.

38. Daboll, H. F., Crespi, H. L., and Katz, J. J. Mass cultivation of algae in pure heavy water. // Biotechnology and Bioengineering, 1962, V. 4, pp. 281-297.

39. Crespy, H. L. Stable Isotopes in the Life Sciences, International atomic energy agency, Vienna, 1977, pp. 111-121.

40. Oh, В. H., Westler, W. M., Darba, P & Markley, J. L. Protein carbon-13 spin systems by a single two-dimentional nuclear magnetic resonance experiment. // Science, 1988, V. 240, pp. 908-911.

41. Stockman, B. J., Reily, M. D., Westler, W. M., Ulrich, E. L. & Markley, J. L. Concerted two-dimentional NMR approaches to hydrogen-1, carbon-13, and nitrogen-15 resonance assignments in proteins. // Biochemistry, 1989, V. 28, pp. 230-236.

42. Yu, L. P., Smith, G. M. 15N and 'H NMR studies of Rhodospirillum rubrum cytochrome сг.Н Biochemistry, 1988, V. 27, pp. 1949-1956.

43. Sprott, G. D., Ekiel, I, and Patel, G. B. Metabolic pathways in Methanococcus jannaschii and other methanogenic bacteria. // Appl. and Environ. Microbiol., 1993, V. 59, No. 4, pp. 1092-1098.

44. Umbarger, H. E. Amino acid biosynthesis and its regulation. // Ann. Rev. Biochem., 1978, V. 47, pp. 533-606.

45. Bachmann, B. J. Linkage map of Eschericia coli K-12. // Microbiol. Rev., Edition 7, 1983, V.47. pp. 180-230.

46. Griffey, R. H„ Redfield, A. G., Loomis, R. E. & Dahlquist, F. W. // Nuclear magnetic resonance observation and dynamics of specific amide protons in T4 lysozyme. // Biochemistry, 1985, V. 24, pp. 817-822.

47. Muchmore, D. C., Mcintosh, L. P., Russel, С. В., Anderson, E. E. & Dahlquist, F. W. // Meth. Enzymol., 1990, V. 77, pp. 346-354.

48. Torchia, D. A., Sparks, S. W. and Bax, A. Staphylococcal nuclease: sequential assignments and solution structure. // Biochemistry, 1989, V. 28, pp. 5509-5524.

49. Marion, D., Kay, L. E., Sparks, S. W., Torchia, D. A. & Bax. Three-dimensional heteronuclear NMR of 15N-labeled proteins. II J. Am. Chem. Soc., 1989, V. 3, pp. 1515-1517.

50. Senn, H., Euguster, A., Otting, G., Suter, F. & Wuthrich, K. Nitrogen- 15-labeled P22C2 repressor for nuclear magnetic resonance studies of protein DNA interactions. II Eur. Biophys. J., 1987, V. 14, pp. 301-313.

51. LeMaster, D. M. & Richards, F. M. 'H-15N heteronuclear NMR studies of Escherichia coli thioredoxyn in samples isotopically labeled by residue type. // Biochemistry, 1985, V. 24, pp. 7263-7268.

52. Lapidot, A. & Irving, C. S. 15N nuclear magnetic resonance as a probe of residual structure in the backbone of unfolded hemoglobin. // J. Am. Chem. Soc., 1977, V. 99, pp. 5488-5493.

53. Leighton, P & Lu, P. X cro repressor complex with Огз DNA: 15N NMR observations. // Biochemistry, 1987, V. 26, pp. 7262-7271.

54. Campbell, B. S., Papastavros, M. Z., McCormick, F. & Redfield, A. G. Identification of resonances from an oncogenic activating locus of human N-ras P21 protein using isotope edited NMR. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, V. 86, pp. 817-820.

55. Gelfand, D. H. & Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. // J. Bacteriol., 1977, V. 130, pp. 429-440.

56. Cronan, J. E., and Batchelor, J. G. Studies of lipid biosynthesis by E. coli K-12 mutant. // Chem. Phys. Lipids., 1973,11, pp. 196-202.

57. LeMaster, D. L. & Richards, F. M. Preparative-scale isolation of 13C-labeled amino acids with site-specific enrichment. // J. Biol. Chem., 1982, V. 257, pp. 1224-1230.

58. Cohen, J. S., and Putter, I. The isolation of deuterated amino acids. II Biochim. et Biophys. Acta, 1970, V. 222, pp. 515-520.

59. Jensen R. A. & Calhoun D. H. Intracellular roles of microbial aminotransferases: Overlap enzymes across diffrent biochemical pathways. II Crit. Rev. Nicrobiol., 1981, Vol. 8, pp. 229-238.

60. Kanana, Z. E., and Lapidot, A. Biosynthesis of L-I5N. aspartic acid and L-[I5N] alanine by immobilized bacteria, 1982, V. 126, pp. 389-393.

61. Пшеничникова А. Б., Карнаухова E. H., Звонкова E. H., В. И. Швец. Методы получения дейтерированных аминокислот. // Биоорганическая химия, 1995, Т. 21, No 3, сс. 163-178.

62. Lee К. М., Ramalingam К., Son J. К., Woodard R. W. // J. Org. Chem., 1989, V. 54, No 13, pp. 3195-3198.

63. Faleev N. G., Ruvinov S. В., Saporovskaya M. В., Belikov V. M., Zakomyrdina L. N. Preparation of a-deuterated amino acids by E. coli cells containing tryptophanase. // Izv. Akad. Nauk USSR, Ser. Khim., 1989, V. 10, pp. 2341-2343.

64. Darmaun D., Robert J. J., Bier D. M., Mathews D. E., Young V. R. Study in vivo of the metabolism of non-essential amino acids using stable isotopes. // Annales-d' Endocrinologie., 1985, V. 46, No 4/5, pp. 355-356.

65. Jordan P. M., Akhtar M. // Biochem. J., 1970, V. 116, pp. 277-286.

66. Wong С. H., Whitesides G. M. Enzyme-catalyzed organic synthesis: regeneration of deuterated nicotinamide cofactors for use in large-scale enzymatic synthesis of deuterated substrates. //J. Amer. Chem. Soc., 1983, V. 105, No 15, pp. 5012-5014

67. Field S. J., Young D. W. // J. Chem. Soc. Chem. Communs. 1979, pp. 1163-1165.

68. Fuganti, C., Ghiringhelli, D., Giangrasso, D., Grasselli, P. II J. Chem. Soc. Comm., 1974, pp. 726-730.

69. Busujima U. K., Shimiba S., Narita K., Okada S. Biosynthesis with deuterated microorganisms. //Chem. Pharm. Bull., 1988, V. 36, pp. 1828-1832.

70. Moore, A. C., Ph. D. Dissertation, University of California USA, Berkeley, 1976, pp. 13-38.

71. Enei, H., Matsui, H., Nakazawa, H., Okumura, S., Yamada, H. Culture conditions for the preparation of cells containing high tyrosine phenol lyase activity // Agric. Biol. Chem., 1973, V. 37, No 3, pp. 493-498.

72. Kumagai H., Kashima N., Torii H., Yamada H., Enei H., Okumura S. //Agric. Biol. Chem., 1972, V 36, pp. 472-475.

73. Walker, Т. E., and Matheny, C. An efficient cmemomicrobiological synthesis of stable isotope-labeled L-Tyrosine and L-Phenylalanine. // J. Org. Chem., 1986, V. 51, pp. 1175-1179.

74. Nagasawa Т., Utagawa Т., Goto J., Kim C., Tani Y., Kumagai H., Yamada H. // Eur. J. Biochem., 1981, V. 117, pp. 33-40.

75. Hadener A., Tamm C. // J. Labelled Compounds and Radiopharm. 1987. V. 24, pp. 1291-1306.

76. Bogusky, M. J., Schiksnis, R. A., Leo, G. C. & Opella, S. J. Protein backbone dynamics by solid-state and solution ,5N NMR spectroscopy. //J. Magn. Res., 1987, V. 72, pp. 186-190.

77. Kahana, Z. E., and Lapidot, A. Adaptation of biotechnological processes for preparation of compounds labeled with stable isotopes, in: Synthesis and Applications of Isot. Label. Compounds, ed. Muccino, R. R., Elsevier, 1986, pp. 511-512

78. Kahana, Z. E., and Lapidot. Microbial production of L-15N.glutamic acid and its gas chromatography-mass spectrometry analysis. // Analyt. Biochem., 1983, V. 132, pp. 160-164.

79. Ekiel, I., Smith, I. C. P., and Sprott, G. D. Biosynthetic pathways in Methanospirillum hungatei as determined by 13C nuclear magnetic resonance. // J. Bacterid., 1983, V. 156, pp. 316-326.

80. Ekiel, I., Smith, I. C. P., and Sprott, G. D. Biosynthesis of isoleucine in methanogenic bacteria: a 13C NMR study. // Biochemistry, 1984, V. 23, pp. 1683-1687.

81. Bender, D. A. Amino Acid Metabolism, 2nd edn., New York: John Wiley & Sons., 1985, pp. 34-52.

82. Fuchs, G., and Stupperich, E. Acetyl CoA, a central intermediate of autotrophic CO2 fixation pathway in Methanobacterium thermoautotrophicum. /I Arch. Microbiol., 1980, V. 127, pp. 267-272.

83. Weimer, P. J., and Zeikus, J. G. Acetate assimilation pathway of Methanosarcina barkeri. II J. Bacteriol., 1979, V. 137, pp. 332-339.

84. Jansen, K., Stupperich, E., and Fuchs, G. Carbohydrate synthesis from acetyl CoA in the autotroph Methanobacterium thermoautotrophicum. I/ Arch. Microbiol., 1980, V. 132, pp. 355-364.

85. Charon, N. W., Johnson, R. C., and Peterson, D. Amino acid biosynthesis in the spirochete leptospira: evidence for a novel pathway of isoleucine biosynthesis. // J. Bacteriol., 1974, V. 117, pp. 203-211.

86. Kisumi, M., Komatsubara, S., and Chibata, I. Pathway for isoleucine formation from piruvate by leucine biosynthetic enzymes in leucine-accumulating isoleucine revertants of Serratia marcescens. II J. Biochem., 1977, V. 82, pp. 95-103.

87. Vollbrecht, D. Three pathways of isoleucine biosynthesis in mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. II Biochim. Biophys. Acta., 1974, V. 362, pp. 382-389.

88. De Rosa, M., De Rosa, S., and Gambacorta, A. 13C NMR assignments and biosynthetic data for the ether lipids of Calderiella. II Phytochemistry, 1977, V. 16, pp. 1909-1912.

89. Henderson, R. The structure of purple membrane from Halobacterium halobium analysis of the X-ray diffraction patterns. // J. Mol. Biology, 1975, V. 93, No. 2, pp. 123-132.

90. Michel, H., & Oesterhelt, D. Three-dimentional crystals of membrane proteins: bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, V. 77, No. 3, pp. 1283-1285.

91. Clore, G. M. & Gronenborn, A. M. Determination of three-dimentional structures of proteines in solution by nuclear magnetic resonance spectroskopy. // Protein Eng., 1987, V. 1, pp. 275-288.

92. Stenart, P. L., Valentine, K. G., Opella, S. J. Structural analysis of solid-state NMR measurements of peptides and proteins //J. Magn. Reson., 1987, V. 71, No. 1, pp. 45-61.

93. Griesinger, C., Sorensen, O. W. & Ernst, R. R. Three-dimentional Fourier spectroscopy. Application to high-resolution NMR. // J. Magn. Res., 1989, V. 84, pp. 14-63.

94. Griesinger, C., Sorensen, O. W. & Ernst, R. R. Novel three-dimentional NMR techniques for studies of peptides and biological macromolecules. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 7227-7228.

95. Randall, M., Kathleen, S. M., Stanley, J. O. Selectively deuterated amino acid analoques. Synthesis, incorporation into protein and NMR properties. // Biochim. Biophys Acta., 1977, V. 497, pp. 1-5.

96. Griesinger С., Sorensen О. W. & Ernst R. R. Novel three-dimentional NMR techniques for studies of peptides and biological macromolecules. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 7227-7228

97. Kaptein R., Boelens R., Scheek R. M., and van Gunsteren W. F. Protein structures from NMR. // Biochemistry, V. 27, No 15, pp. 5389-5400.

98. Stuhermann, H. B. Methods of isotopic and spin contrast variation in biology. // Physica В., 1989, V. 156, pp. 444-451.

99. Лакович, Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986. с. 15-19.

100. Fesik, S. W., Luly, J. R., Erickson, J. W. 7 Abad-Zapatero, C. Isotope-edited proton NMR study on the structure of a pepsin/inhibitor complex. // Biochemistry, 1988, V. 27, pp. 8297-8301.

101. Fesik, S. W., and Zuderweg, E. R. P. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy of isotopically labeled biological macromolecules. // Quarterly Rev. Biophys., 1990, V. 23, No. 2, pp. 97-131.

102. Smith, R. L. Dynamic structure of membranes by deuterium NMR. // Science, 1984, V. 225, No. 4559, pp. 280-288.

103. Senn, H., Otting, G. & Wuthrich, K. Protein structure and interactions by combined use of sequential NMR assignments and isotope labeling. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 1090-1092.

104. Davis, J. H. Deuterium nuclear magnetic resonance of exchange-labeled gramicidin in an orinted lyotrophic nematic phase. // Biochem., 1988, У. 27, No. 1, pp. 428-436.

105. Oas, T. G„ Hartzell, C. J., Dahlquist, F. W. & Drobny, G. P. The amide l5N chemical shift tensors of four peptides determined from 13C dipole-coupled chemical shirt powder patterns. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 5962-5967.

106. Gronenborn, A. M., Bax, A., Wingfield, P. T. & Clore, G. M. A powerful method of sequential proton resonance assignment in proteins using relayed l5N-'H multiple quantum coherence spectroscopy. II FEBS Lett., 1989, V. 243, pp. 93-98.

107. Bolton, H. P. Heteronuclear relay transfer spectroscopy with proton detection. // J. Magn. Reson., 1985, V. 62, pp. 143-146.

108. Weber, P. L. & Muller, L. Use of 15N labeling for automated three-dimentional sorting of cross peaks in protwin 2D NMR spectra. // J. Magn. Res., 1989, V. 81, pp. 430-434.

109. Roux, M., Seigneuret, M., and Rigaud, J. L. 31P NMR study of the interaction of cations with purple membrane and of the purple-blue transition. // Biochemistry, 1988, V. 27, pp. 7009-7015.

110. Keniry M. A., Gutowsky H. S., Oldfield E. Surface dynamics of the integral membrane protein bacteriorhodopsin. // Nature, 1984, V. 307, No 5949, pp. 383-386.

111. Harbison G. S., Smith S. 0., Pardoen J. A., Mulder P. P. J., Lugtenburg J. Solid-state 13C NMR studies of retinal in bacteriorhodopsin. // Biochemistry, 1984, V. 23, No. 12, pp. 2662-2667.

112. Widnell С. C., and Pfenninger К. H. in: Essential Cell Biology, Williams & Wilkins, Baltimore, 1990, pp. 32-33.

113. King G. I., Schoenborn B. P. Neutron scattering of bacteriorhodopsin. // Methods Enzym., 1982, V. 88, pp. 241-248.

114. Jubb J. S., Worcester D. L., Crespi H. L., Zaccai G. Retinal location in purple membrane of Halobacierium halobium'. a neutron diffraction study of membranes labeled in vivo with deuterated retinal. // EMBO J., 1984, V. 3, No. 7, pp. 1455-1461.

115. Seift F., Wallat I., Ermann P., Heyn M. P. A neutron diffraction study on the location of the polyene chain of retinal in bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985, V. 82, No. 10, pp. 3227-3231.

116. Juong Y., and Lewis A. Determination of the absolute orientation of the retinylidene chromophore in purple membrane by a second-harmonic interference technique. // Biophys. J., 1989, V. 55, pp. 835-842.

117. Fesik S. W., Gampe R. T. & Zuiderweg E. R. P. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy. Natural abundance 13C chemical editing of 'H-'H COSY spectra. // J. Am. Chem. Soc., 1989, V. Ill, pp. 770-772.

118. Vuister G. W., Boelens R. & Kaptein R. Nonselective three-dimentional NMR spectroscopy. The 3D NOE-HOHAHA experiment. // J. Magn. Reson., 1988, V. 80, pp. 176-185.

119. Fesik S. W., Gampe R. Т., Xuiderweg E. R. P., Kohlbrenner W. E. & Weigl D. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy applied to CMP-KDO synthetase (27,5 kD). // Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, V. 159, pp. 842-845.

120. Montelione G. Т., Wionkler M. E., Rauenbuehler P. & Wagner G. Accurate measurements of long-range heteronuclear coupling constants from homonuclear 2D NMR spectra of isotope-enriched proteins. //J. Magn. Reson., 1989, V. 82, pp. 198-204.

121. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. J1. Биосинтетическое получение дейтерий-меченного L-фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum li Биотехнология. 1993. № 9. С. 16-20.

122. Karnaukhova Е. N, Mosin О. V., and Reshetova О. S. Biosynthetic production of stable isotope labeled amino acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum // Amino Acids. 1993. V. 5. № l.p. 125.

123. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Ерёмин С. В., Швец В. И. Метилотрофные бактерии источники изотопно-меченных D- и 13С-аминокислот. // Биотехнология. № 4. 1996. (в печати).

124. Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Препаративное разделение аминокислот белковых гидролизатов в виде бензилоксикарбонильных производных // Биотехнология. 1993. №8. сс. 21-25.

125. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Д., Цыганков Д. Ю. Штамм Brevibacterium methylicum продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.

126. Мосин О. В., Складнее Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. // Биотехнология. № 3. 1996. сс. 3-12.

127. Казаринова Л. А., Королькова Н. В., Миронов А. С., Мосин О. В., Складнее Д. А., Юркевич А. М. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.

128. Shvets V. I., Yurkevich А. М., Mosin О. V., Skladnev D. A. Preparation of deuterated inosine suitable for biomedical application // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V. 8. №4. pp. 231-232.

129. Мосин О. В, Казаринова Л. А., Преображенская Е. С., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высоко дейтерированной среде. // Биотехнология. № 4. 1996 (в печати).

130. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Получение бактериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана // Биотехнология. № 3. 1996. сс. 14-20.

131. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. Из-во Мир, М.: 1965, сс. 392-403.

132. Полюдек-Фабини Р., БейрихТ. Органический анализ. Л. Химия.: 1981, сс. 515-516.