Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор биологических наук Ильинская, Ольга Николаевна

• Ильинская, Ольга Николаевна
• доктор биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук Ильинская, Ольга Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Рецепторные взаимодействия в сигнальной системе живой

клетки

1. Рецепторы клеток высших эукариот

2. Передача сигналов в клетках прокариот

И. Современные подходы к оценке генотоксичности соединений

1. Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах

2. Тестирование на генотоксичность in vivo

3. Тестирование на генотоксичность в системе клеточных культур

III. Разнонаправленные эффекты биологически активных веществ

1. Зависимость типа проявляемых эффектов от дозы эффектора

2. Регуляция функциональной активности клетки низкомолекулярными продуктами деградации естественных полимеров

3. Экзогенные рибонуклеазы как модуляторы клеточных функций

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Материалы

2. Методы определения жизнеспособности и функциональной

активности

2.1. Параметры роста микроорганизмов

2.2. Дыхание целых клеток и изолированных митохондрий

2.3. Цитотоксичность в культуре клеток

2.4. Нефротоксичность в системе изолированно перфузированой

почки

3. Методы определения генотоксичности

3.1. Тест на повреждение ДНК

3.2. Тест Эймса

3.3.Ага-тес т

3.4. Тест на индукцию профага

3.5. SOS-хромотест

3.6. Тест на соматические мутации и рекомбинацию у Drosophila

3.7. Микроядерный тест

3.8. Тест на внеплановый синтез ДНК

3.9. Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем поле (PFGE)

4. Аналитические методы

4.1. Содержание белка

4.2. Содержание глюкозы

4.3. Активность ферментов

4.4. Выход нуклеотидов из клеток бактерий

4.5. Электрофоретическая подвижность микробных клеток

4.6. Электропроводность суспензии микробных клеток

4.7. Мембранный ток целой клетки и отдельных каналов (метод "patch clamp")

5. Математическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ

I. Биологические эффекты малых доз РНКаз

1 .Активирующее процессы жизнедеятельности влияние

рибонуклеаз

1.1 .Бактериальная РНКаза как стимулятор роста эукариотических

микроорганизмов

1.2. Действие биназы на ряд секретируемых ферментов низших эукариот

1.3.Ростостимулирующее действие нативной и мутантных РНКаз по отношению к прокариотам

1.4. Выход нуклеотидов под действием ферментов из клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий

2. Антимутагенное действие РНКазы

3. Изменение электрофизиологических характеристик микробных

клеток

3.1. Влияние биназы на электрофоретическую подвижность дрожжевых клеток

3.2. Влияние биназы на выход ионов из клеток микроорганизмов

II. Токсическое действие высоких доз РНКаз

1. Нефротоксические эффекты бактериальных рибонуклеаз

2. Цитотоксичность биназы в культуре клеток животных и

человека

3. Изменение мембранного тока под действием биназы в нормальных

и трансформированных фибробластах

III. Генотоксические свойства бактериальных РНКаз

1. Эффект биназы в бактериальных тест-системах

2. SOS-индуцирующая активность экзогенных рибонуклеаз

3. Влияние РНКазы на геном дрозофилы

4. Действие биназы на генетический материал клеток крови млекопитающих

5. Индукция биназой двойных разрывов ДНК в культуре клеток

человека

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Молекулярно-биохимические механизмы активационных эффектов экзогенных бактериальных РНКаз

2. Переключение типа клеточного ответа при повышении концентрации экзогенных РНКаз

3. Некоторые аспекты практического применения рибонуклеаз

4. Секретируемая РНКаза бацилл как природный регулятор состояния микробного биоценоза

ВЫВОДЫ

Литература

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Биологически активные вещества эндогенного и экзогенного происхождения, не вовлекаясь непосредственно в основной метаболизм клеток, могут оказывать разнообразное влияние на функции клеток, тканей и целого организма. Изучение действия эффекторов на организмы различного эволюционного уровня является классической задачей биологии.

К настоящему времени обнаружено огромное количество факторов, которые подразделяют на активирующие биологические процессы и ингибирующие их, исходя из типа установленного эффекта. Знаменитое высказывание Парацельса "доза разграничивает яд и лекарство" датируют началом XVI века. Однако биологически активные вещества в сегодняшней практике применяют в области конкретного эффекта, не всегда учитывая последствия их альтернативного действия. Противоположная область и регуляция переключения клеточного ответа с одного типа на другой остаются неизученными. Тем не менее накоплена масса данных о разнонаправленном действии ряда факторов в зависимости от концентрации: стимулирующем влиянии малых доз мутагенов [Раппопорт с соавт., 1980], афлатоксина [Halt, Sutic, 1989], озона [Мельникова с соавт., 1989], мутагенной активности стимуляторов роста растений [Конобеева, 1987]; интерфероногенной и антимитогенной активности 2'-5' олигоаденилатов [Мацука с соавт., 1998]; активирующем и ингибирующем рост действии нуклеаз [Folkman, Klagsbrun, 1987; Куприянова- Ашина, 1989, 1992; Nitta et al., 1996], продуктов жизнедеятельности микроорганизмов [Филимонова, 1985], фитогормонов [Ковалев, 1983], антиоксидантов [Горбатенко, 1997].

Работами школы микробиологов Казанского университета впервые установлен ряд закономерностей регуляции синтеза нуклеаз бактерий и указано на неоднозначность проявления биологических эффектов экзогенных ферментов [Куприянова-Ашина, 1989, 1992; Лещинская с соавт., 1991]. Поскольку рибонуклеазы, как новый класс цитотоксических агентов, считают, с одной стороны, вызывающими торможение роста опухолей и размножения вирусов [Karpetsky, Levy, 1981; Алексеева с соавт., 1981; Куриненко с соавт., 1988; Youle et al., 1993; Nitta et al., 1996; Prior et al., 1996], а с другой - стимуляторами роста растений и микроорганизмов [Колпаков и Куприянова, 1992; Егоров с соавт., 1994; Наумова с соавт., 1997], возникает насущная необходимость комплексного изучения разнонаправленных биологических эффектов бактериальных РНКаз на объектах различного эволюционного уровня. Известно, что изменение направленности эффекта при переходе от низких доз к высоким, достаточно индивидуальном для конкретного вещества и организма, осуществляется с помощью некого триггерного механизма, ответственного за проявление условных "положительных" и "отрицательных" эффектов. Вместе с тем "отрицательный" с позиций отдельного организма эффект на уровне популяции может быть рассмотрен как благоприятный, способствующий ее выживанию и адаптации. Вышеизложенное обусловливает актуальность исследования биохимических механизмов проявления того или иного типа клеточного ответа под действием биологически активных соединений, каковыми являются бактериальные рибонуклеазы.*

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось установление биохимических механизмов разнообразия клеточных

* В работе использованы общепринятые тривиальные названия гомологичных РНКаз Bacillus intermedius (биназа) и Bacillus amyloliquefaciens (барназа).

ответов под действием экзогенного эффектора - бактериальной рибонуклеазы - на организмах различного эволюционного уровня.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

1. Выявить спектр условно положительных эффектов микроконцентраций и охарактеризовать комплекс условно отрицательных эффектов макроконцентраций рибонуклеазы по отношению к грамположительной и грамотрицательной прокариотической клетке.

2. Оценить закономерности проявляемых биназой воздействий на клетках низших эукариот - дрожжей и микромицетов.

3. Изучить действие широкого диапазона концентраций РНКазы in vivo на многоклеточных организмах различного эволюционного уровня (насекомые, млекопитающие).

4. Охарактеризовать биологическую активность рибонуклеаз in vitro в системе изолированных органов (почка грызунов).

5. Сравнить влияние экзогенной рибонуклеазы на культуры нормальных и трансформированных онкогенами клеток животных.

6. Исследовать влияние экзогенной биназы на первичную (лимфоциты) и перевиваемую (эпителиальноподобные клетки карциномы легких) культуры клеток человека.

7. Используя мутантные производные бактериальной рибонуклеазы, полученные методом сайт-специфического мутагенеза, оценить вклад специфического и неспецифического взаимодействия эффектора с клеткой в регистрируемый эффект.

8. Установить ключевые этапы взаимодействия рибонуклеазы с клеткой, необходимые и достаточные для проявления определенного типа клеточного ответа, и провести сравнительный анализ их вовлеченности в универсальную цепь передачи сигналов.

Научная новизна. С позиций системного эволюционного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных биологических эффектов, вызываемых экзогенной бактериальной рибонуклеазой при действии ее на клетки прокариот, низших эукариот и многоклеточных животных, включая человека. Получен ряд приоритетных данных, пополняющих фундаментальные знания биологии регуляторных систем живой клетки. Работа такого масштаба, с полным валидным набором тестерных систем различного эволюционного уровня, с оригинальным применением нового уникального инструментария для оценки вклада специфических и неспецифических взаимодействий эффектора с клеткой - нативного и ряда мутантных ферментов с направленно измененной каталитической активностью - проведена впервые. Это позволило выявить общие закономерности функционирования клеток различной архитектоники и уровня организации в ответ на действие ауторегулятора первого эшелона значимости, влияющего на нуклеиновые кислоты, и сформулировать гипотезу общности в проявлении клеточного ответа. В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие научные положения, в полной мере отражающие новизну проделанной работы.

Основные защищаемые положения диссертации

■ Малые концентрации РНКазы в среде культивирования (10"7 -10"4 мг/мл) обладают стимулирующим рост и деление действием по отношению к клеткам бактерий и эукариот, причем стимулирующее действие сопряжено с активацией процессов дыхания целых клеток и изолированных митохондрий, а также с повышением активности ключевых ферментов метаболизма, в частности, сукцинатдегидрогеназы. Дестабилизация мембран поверхностно-активным веществом приводит к увеличению стимулирующего

г о

эффекта РНКаз. В области стимулирующих доз (10° - 10 мг/мл) бииаза обладает также антимутагенным действием, активируя работу репарациионных систем клетки.

■ Высокие концентрации биназы (0.1 - 10 мг/мл) обладают токсическим и генотоксическим действием по отношению к микроорганизмам и высшим животным, а также в системе изолированных органов и в культурах клеток животных и человека. Между активирующими и подавляющими концентрациями лежит интервал "нейтральных" доз, характеризующийся сбалансированной настройкой стимулирующих и ингибирующих сигнальных путей, приводящих к отсутствию фенотипического эффекта.

■ Основной вклад в стимуляцию жизнедеятельности микроорганизмов, так же, как и в проявление токсических и генотоксических эффектов на всех тестерных системах клеток и организмов различного эволюционного уровня, вносит каталитическая активность рибонуклеаз. Обнаруженная тенденция к проявлению стимулирующего эффекта малоактивными рибонуклеазами связана с наличием независимых от каталитической функции аффинных взаимодействий фермента с клеточной поверхностью.

■ Цитоплазматическая мембрана является ключевым звеном в эффекторном пути, активируемом рибонуклеазой. Каталитически активные ферменты воздействуют на мембраносвязанную РНК, вызывая увеличение содержания нуклеотидов в среде инкубации. Проявление тонкой специфики действия биназы, а именно изменение секреции ферментов целлюлазного комплекса, блокирование Са -зависимого калиевого тока ионных каналов гаБ-трансформированных клеток, увеличение выхода из клеток микроорганизмов ионов электролитов, - обусловлено изменением свойств клеточных мембран.

■ Повреждения ДНК, вызываемые в клетках под влиянием каталитически активной РНКазы, являются следствием нарушения внутриклеточного гомеостаза при индуцированном изменении свойств мембраны и запуске ряда эндогенных процессов, в частности,

о i

активации белка RecA у низших организмов и Са -зависимых эндонуклеаз у высших, приводящих к индукции мутаций в ходе ошибочной репарации и фрагментации ядерной ДНК соответственно.

Теоретическая и практическая значимость. Создана принципиальная теоретическая схема универсального переключения типа клеточного ответа под действием экзогенного белкового эффектора, обладающего ферментативной активностью, на модельных системах про-и эукариотических клеток. Выявлены фундаментальные закономерности включения сигнальных систем живой клетки при их активации экзогенной рибонуклеазой в широком диапазоне концентраций. Определен вклад аффинных взаимодействий и специфическая роль собственно рибонуклеолитической активности в реализацию индуцируемых эффектором функций клетки. Проведенное глубокое теоретическое обоснование механизмов действия РНКазы in vitro и in vivo позволяет выработать корректные рекомендации для практического применения фермента в биотехнологии и медицине.

Практическое использование фермента в малых дозах возможно не только в качестве известного стимулятора роста, но и для направленного увеличения выхода определенных ферментов, что несомненно важно учитывать при разработке новых промышленных биотехнологий. Выявленное антимутагенное действие биназы предполагает новый аспект ее применения в качестве репарационного биоантимутагена. Дальнейшее углубленное изучение тонких аспектов проблемы апоптических

изменений клеток и блокирования биназой Са -зависимого калиевого тока ионных каналов, специфичных для онкотрансформированных клеток, может стать основой создания противоопухолевых препаратов нового поколения. Несомненную практическую значимость имеет полная и всесторонняя оценка генотоксических свойств биназы в макродозах, необходимая для любого практического использования фермента. Выделение, характеристика и разработанный способ культивирования целлюлолитического микромицета, защищенные двумя патентами РФ, найдут применение в промышленном получении ферментов целлюлазного комплекса.

Связь работы с базовыми научными программами. Работа в течение 1988-1998гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ госрегистрации 01910049994). Исследования в рамках тематики работы были поддержаны грантами Санкт-Петербургского университета (1992-1993гг., № 2-101-30-53, направление "Биология: молекулярные механизмы стабильности живых систем"; 1997г., "Исследования в области фундаментального естествознания" № 97-0-10.190), грантом Академии Наук Республики Татарстан (1997г.); финансировались как составная часть программы "Университеты России" (1992-1996гг., проект "Ферменты микроорганизмов"; 1997г., №532 "Фундаментальные исследования"), В 1992-1993г. инициативный исследовательский проект получал поддержку фонда Восточной Европы Объединенной высшей технической школы и университета Цюриха (Швейцария), в 1993-1994гг., 1996г, 1997г. -поддержку Немецкой Службы Академических Обменов (ФРГ). Автор использовал опыт анализа представленного в работе экспериментального материала для активного персонального участия в разработке

государственной программы "Генетическая безопасность населения Республики Татарстан", получившей одобрение Кабинета Министров РТ в 1998г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных конференциях, школах, симпозиумах: школе-семинаре "Молекулярные механизмы мутагенеза и канцерогенеза" (Хаддинг, Швеция, 1994), симпозиуме "К столетию Бейеринка" (Гаага, Нидерланды, 1995), 7-ом европейском конгрессе по биотехнологии (Ницца, Франция, 1995), 14-ом съезде "Технологии животных клеток: от вакцин до генетической медицины" (Алгавре, Португалия, 1996), 4-ой конференции "Рибонуклеазы: химия, биология, биотехнология" (Гронинген, Нидерланды, 1996), ежегодном съезде Общества Токсикологов (Рестон, США, 1998), Форуме прикладной биотехнологии (Брюгге, Бельгия, 1998). Основные положения работы были представлены также на конференциях "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), "Нуклеазы микроорганизмов" (Рига, 1989; Казань, 1989, 1991, 1998) и вошли в отчетные доклады по темам полученных грантов и НИР КГУ.

Публикации. Основной материал диссертационной работы нашел отражение в 42 печатных работах, из которых 21 статья в ведущих отечественных и зарубежных журналах, 2 патента РФ, 19 тезисов и материалов докладов на Российских и Международных конференциях. Методические разработки и некоторые теоретические аспекты диссертации вошли в 2 учебно-методических пособия для студентов, обучающихся по специальности 2041 -"микробиология".

Место выполнения работы. Экспериментальные данные получены автором за время работы на кафедре микробиологи Казанского

государственного университета в период с 1988 по 1998гг. Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала, базируются на результатах собственных исследований автора.

Исследования были начаты в кафедральной лаборатории генетической токсикологии КГУ под руководством к.б.н. И.Е.Черепневой и д.б.н. И.Б.Лещинской. Работа по определению биомассы целлюлолитического гриба на нерастворимых субстратах выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г.Пущино) при участии к.б.н. Н.Б.Горкиной. Промышленное испытание способа культивирования целлюлолитического гриба проведено на химическом заводе под руководством нач.цеха Ф.К.Бадгиева (г. Менделеевск). Мутагенные и антимутагенные свойства биназы в бактериальных тест-системах исследованы в рамках кандидатских работ аспирантов, к.б.н. О.Б.Иванченко и к.б.н. Н.С.Карамовой, выполненных под руководством О.Н.Ильинской. Выделение и очистка мутантных рибонуклеаз, полученных методом сайт-специфического мутагенеза, проведена аспирантом автора к.б.н. Л.В.Кипенской в лаборатории д.х.н. Г.И.Яковлева (Институт молекулярной биологии, г. Москва). Исследования в тесте SMART с дрозофилой выполнены автором в Институте токсикологии в лаборатории проф. Ф.Вюрглера под руководством др-а Х.Фрая (гг.Шверценбах-Цюрих, Швейцария). Анализ двойных разрывов ДНК методом гель-электрофореза в пульсирующем поле и эксперименты в системе изолированно перфузированной почки автор осуществил в Институте токсикологии (г.Вюрцбург, ФРГ) в научной группе др-а Э.Вок и др-а С.Вамвакаса. Измерения мембранного тока клеток и отдельных каналов проведены автором совместно с немецкими коллегами в Институте фармакологии г.Гиссена (директор проф.

Ф.Драйер). Электрофоретическую подвижность клеток автор исследовал в Казанском технологическом университете при участии к.х.н. Ю.Л.Ишханяна, электропроводность клеточных суспензий - на кафедре физиологии растений КГУ при участии к.б.н. А..И.Колпакова и к.б.н. Е.В.Асафовой.

Автор выражает искреннюю благодарность названным сотрудникам и коллективам. Особо автор благодарит ученых, работа под руководством которых сформировала его научное мировоззрение - чл.-корр. РАН, д.б.н. профессора И.С.Кулаева и профессора Дитриха Хеншлера.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Текст иллюстрирован 47 рисунками и 16 таблицами. Список литературы содержит 292 наименования, из них 87 работ отечественных авторов и 205 зарубежных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Рецепторные взаимодействия в сигнальной системе живой клетки

Внутриклеточная система регуляции, включающая метаболическую, генетическую и мембранную системы регуляции, эволюционно более древняя, чем межклеточная, появившаяся в связи с развитием многоклеточных организмов и включающая трофическую, гормональную и электрическую системы. Основной регуляторный принцип можно назвать рецепторно-конформационным. Во всех случаях рецепторная молекула "узнает" специфический для нее фактор и, взаимодействуя с ним, изменяет свою конфигурацию [Полевой, 1986].

Понятия "действие" и "эффект" в принципе различаются: вначале вещество взаимодействуют с мембранами клеток или другими компонентами, что обозначается термином "действие", а затем изменяется функция мембран, клеточных ферментов и развивается эффект вещества. Эффект пропорционален фракции рецепторов и максимален тогда, когда критическая часть рецепторов связана лигандом. Химические группы, участвующие в комбинации вещество-рецептор, и прилегающие к ним структуры, облегчающие связывание лиганда с рецептором, известны как рецепторные области. Определенные рецепторы связывают лиганд, не вызывая эффекта, - их в факмакокинетике называют молчащими рецепторами. Примером таких рецепторных взаимодействий на уровне организма служит связывание лекарственных препаратов белком плазмы крови - альбумином, либо связь вещества с ферментами биотрансформации. Такого рода взаимодействия правильнее относить к неспецифическому связыванию. Все рецепторы делятся на поверхностные (мембранные), первыми воспринимающими экзогенный сигнал, и внутриклеточные

(цитоплазматические), передающие сигнал от клеточной поверхности к ядерным (и митохондриальным) факторам транскрипции, изменяющим экспрессию генов [Feder et al., 1994].

В связи с тематикой работы представлялось особенно важным рассмотреть процесс поверхностной рецепции лигандов белковой природы.

1. Рецепторы клеток высших эукариот

Интенсивное изучение проблем взаимодействия биологически активных веществ с поверхностью животных клеток привело к заключению о белковой природе рецепторов. Поверхностные рецепторы подразделяются на регулируемые трансмиттерами рецепторы ионных каналов, каталитические рецепторы - тирозинкиназы, и рецепторы, связанные с G-белками. Имеются данные, что рецепторы составляют 0.1% от общей массы мембранных белков [Levitski, 1984]. Рецепторные области включают также мембранные фосфолипиды и полисахаридные структуры на поверхности клеток. Возможно также неспецифическое взаимодействие между лигандом и акцептирующей его поверхностью, хотя и в этом случае какие-либо идентифицированные молекулярные структуры, связывающие лиганд, часто называют областью рецепции.

Среди лигандов, передающих сигналы в животных клетках, много белков. Например, к локальным химическим медиаторам, вырабатываемым для паракринной регуляции, относится фактор роста нервов - белок из двух идентичных цепей по 118 аминокислот. Энкефалин, короткий пептид из 5-и аминокислот, действует в паракринной регуляции, и как нейротрансмиттер. В эндокринной передаче сигналов гормонами спектр белковых регуляторов весьма широк: от высокомолекулярных белков, как то соматотропин (191 аминокислота), паратгормон (84 аминокислоты), эпидермальный фактор роста (53 аминокислоты), инсулин (a+ß цепи = 21+30 аминокислот), до

стимулятора образования предшественника тиреоид-стимулирующего гормона из 3-х аминокислот [Alberts et al., 1989].

Гидрофильные сигнальные молекулы (белки и все нейротрансмиттеры), в отличии от стероидных и тиреоидных гормонов, активируют рецепторы, находящиеся не внутри, а на поверхности клетки.

Среди фитогормонов и регуляторов роста растений негормональной природы пептидов не обнаружено [Кефели, 1981]. Предполагают, что белки-рецепторы сигнальных молекул растений, вероятно, сходны с расположенными на поверхности животных клеток рецепторами ионных каналов, либо рецепторами инозитолфосфатного пути. Другой тип так же, как и у животных, представлен внутриклеточными рецепторами, регулирующими передачу сигнала к ядру [Theologis, 1986]. В мембранах растительных клеток обнаружены рецепторные области связывания биологически активных олигосахаридов [McDougall, Fry, 1988; Тарчевский, 1992].

Обобщенная и упрощенная схема рецепции и преобразования сигналов внешней среды принципиально одинакова у растений и животных и заключается в следующей последовательности событий.

Сигнальная молекула связывается с а-субъединицей белка-рецептора, в результате возрастает активность рецепторной протеинкиназы и происходит аутофосфорилирование (3-субъединицы рецептора, переводящее ее в конформационно активное состояние. Это состояние дает возможность рецептору взаимодействовать с G - белком, который, связывая ГТФ, активирует ферменты-эффекторы - аденилатциклазу, гуанилатциклазу, фосфолипазу С. Эти ферменты индуцируют образование вторичных мессенджеров - цАМФ, цГМФ, диацилглицерола, инозитол-3-фосфата, ионов Са2+ - активирующих специфические сериновые и треониновые протеинкиназы, которые, в свою очередь фосфорилируя и этим изменяя

функциональную активность белков, приводят к адекватному ответу на внешний сигнал [Полевой, 1986]. Рецепторные тирозинкиназы активируются при образовании лиганд-рецепторного комплекса и без участия вторичных мессенджеров запускают каскад активирующего фосфорилирования цитозольных протеинкиназ. Передача сигнала в митохондрии связана с

л.

непосредственным действием Ca на митохондриальные ферменты и либо с протеинкиназой А, либо с активацией рецептора цАМФ на внешней стороны внутренней мембраны митохондрий. У дрожжей, в отличии от прокариот, также имеется этот митохондриальный рецептор, однако система транспорта

2*4*

Ca в мембране митохондрий развита только у позвоночных. Несомненно наличие в клетке еще не изученных сигнальных систем, связанных с открытыми в 90-е годы новыми вторичными мессенджерами (церамид, фосфатидная кислота, цАДФ, 5'-АМФ) [Кулинский, 1994; Ulrich, Simon, 1995, Hannun, Obeid, 1995; Ашмарин, Стукалов, 1996].

Важно подчеркнуть, что одна и та же сигнальная молекула может вызывать как возрастание, так и убыль внутриклеточной концентрации цАМФ, в зависимости от типа связующего рецептора. Это различие в действии обусловлено особенностью структуры ингибирующего (Gi) и стимулирующего (Gs) G - белков, имеющих разные а-субъединицы [Gilman, 1984]. С другой стороны, один и тот же эффект - высокий уровень цАМФ, -может поддерживаться АДФ-рибозилированием а-субъединицы Gi, что не дает возможности G-белку взаимодействовать с рецептором и мешает инактивации аденилатциклазы в ответ на возбуждение ингибирующего рецептора, либо АДФ-рибозилированием а-субъединицы Gs, приводящим к инактивации ГТФазы и, следовательно, постоянной генерации активирующего сигнала. Первый путь характерен для действия токсина Bordetella pertussis, взаимодействующего с Gi„ второй - для токсина Vibrio cholerae, действующего на Gs [Lai, 1980].

Отмечено, что среди многообразия белковых токсинов микробного происхождения, наряду с протеолитическими и пороформирующими, многие обладают АДФ-рибозилирующей активностью. Однако для ее проявления необходима интернализация экзогенного белка клеткой. В частности, токсин А Pseudomonas, белок массой ббкд, поглощается эукариотической клеткой, имеющей специфические рецепторы на поверхности, путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и катализирует необратимое АДФ-рибозилирование фактора элонгации 2 [FitzGerald et al., 1980; Iglewski, Kabat, 1975].

Действие дифтерийного и некоторых пептидных растительных токсинов (абрин, рицин) также реализуется путем рецептор-опосредованного пиноцитоза [Янопольская, Деборин, 1983]. Рицин связывается своей В-цепью (ЗЗкда) с терминальными галактозными остатками клеточной мембраны и внедряет внутрь клетки А-цепь (ЗОкда), инактивирующую 60S-субъединицу рибосом [Tahirov etal., 1994].

Токсин Corynebacterium diphtheriae подавляет синтез белка, катализируя перенос АДФ-рибозного остатка НАД на трансферазу II [Стейниер с соавт., 1979]. Хорошо изучено АДФ-рибозилирование актина бутулином С2. Несколько иной механизм действия, связанный с блокированием освобождения трансмиттеров из нервных окончаний, характерен для клостридиальных токсинов - столбнячного и бутулинов A-G. Установлено, что хромаффинные клетки надпочечников не чувствительны к этим токсинам вследствие отсутствия способности их связывать [Dreyer et al., 1990]. Фосфолипаза Аг змеиного яда изначально действует не на фосфолипидные домены мембраны, а на рецепторные белки наружной поверхности плазматической мембраны [Kini, Evans, 1989]. Якорем для фосфолипазы С Bacillus thuringiensis служат связанные с гликозил-

фосфатидилинозитом белки на поверхности клеток LLC-PK1 [Itami et al., 1997].

Таким образом, ключевым этапом взаимодействия экзогенного эффекторного белка с клеткой является его связь с клеточной поверхностью, которая может эффективно осуществиться только в компетентных клетках, имеющих специфические рецепторы для данного лиганда. В процессе связывания с "молчащим" рецептором активации системы передачи сигнала не происходит.

Особым классом G-белков можно считать клеточные протоонкогены семейства ras, которые являются сопрягающим звеном между рецепторами факторов роста и клеточными белками-эффекторами, активируемыми вероятнее всего по инозитол-фосфолипидному и тирозинкиназному пути. Однако Ras - протеины не идентичны рецепторным белкам инозитол-фосфолипидного пути Gp: в отличие от классических гомологичных гетеротримерных G-белков, Ras - белки представляют собой мономеры массой 21кд [Barbacid, 1987].

Участие Ras - белков в передаче сигнала к делению клетки обусловливает и тот факт, что мутации в генах ras, приводя к неконтролируемому делению, встречаются в 25% случаев любого рака человека; при этом более чем в 90% случаев рака печени, более чем в 50% случаев рака прямой кишки [Parker et al, 1997].

В последнее время обнаружено, что H-Ras и две другие ГТФазы, а-субъединица Gi, и RhoGap (регулирующая изменение функций актина), представляют собой пример конвергентной эволюции - три структурно различных белковых машины используют идентичный механизм, облегчающий гидролиз ГТФ, - аргининовые "пальцы", стабилизирующие переходное состояние ГТФазной реакции. Потеря этих "пальцев" приводит к ослаблению процесса гидролиза и невозможности "выключения" сигнальной

цепи. Клинические исследования подтверждают, что при эндокринном типе рака мутации в а-субъединице Gi приводят к избыточному синтезу цАМФ [Bourne, 1997].

Интересно, что Ras онкопротеин синтезируется как цитоплазматический предшественник, требующий посттрансляционной модификации для для приобретения биологической активности. Активация предшественника Ras-белка включает в себя фарнезилирование цистеинового остатка в СААХ-мотиве на карбоксильном конце всех Ras белков, осуществляемого фарнезилтрансферазой. Затем следует протеолитическое отщепление протеазой ras трех последних аминокислот и соответствующая карбокиметил-этерификация оставшегося пренилцистеина. В таком виде Ras локализуется в клеточной мембране, где инициирует вместе с другими белками сигнальные пути, ведущие к росту клеток [Lowy, Willumsen, 1993]. Ингибиторы фарнезилтрансферазы, исследованные фармацевтическим отделением фирмы Merck (США) на роль терапевтических агентов, подавляющих функцию ras, оказались не действенными [Gibbs et al., 1994; Kobbe, 1997].

Поскольку блокирование рецепторов, чья активация лигандами имеет следствием постоянную генерацию митотического сигнала, представляет огромный интерес в терапии рака, в настоящее время изучению возможности прерывания стимулирующих сигналов уделяется пристальное внимание. В частности, представляет интерес функция фосфатаз, регулирующих уровень активации белков отщеплением ранее присоединенного протеинкиназой фосфата [Васильев, 1997]. Проводятся исследования по обнаружению специфических для опухолевой клетки ионных каналов и возможности избирательного ингибирования связанных с ними рецепторов [Repp et al., 1993; Draheim et al., 1994, 1995]. Остается по-прежнему значимым классическое направление медицинской токсикологии, применяющее в

терапевтических целях вещества-антагонисты, в частности, использование в эндокринной терапии опухолей "анти-гормонов", блокирующих соответствующие рецепторы [Degen, 1992]. Индукция апоптоза, как средство элиминации клона опухолевых клеток, является одним из перспективных направлений терапии рака [Mashima et al, 1997; Torii et al, 1997]. Модуляция экспрессии генов комплекса пролиферативного/антипролиферативного контроля клетки также представляет собой важнейшую область исследований [Matsuda et al, 1996; Ozaki et al, 1997].

Необходимо подчеркнуть, что индукция направленных изменений сигнальной системы клетки любыми экзогенными факторами всегда вплотную зависит от адекватного применения индуктора, что подразумевает высокую степень изученности рецепторного этапа взаимодействия эффектора с клеточной поверхностью.

2. Передача сигнала в клетках прокариот

Механизм передачи сигнала в бактериальных клетках в ответ на флуктуации их окружения включает поток информации с сенсорного рецептора в систему регуляторных белков, которые переносят высокоэнергетические фосфорильные группы от гистидина на аспартат, сопрягая сигналы извне с эффекторными элементами внутри клетки. Таких белков обнаружено два типа: первый - это гомологи, соответствующие внеклеточному сигнальному домену мембранного рецепторного белка, а второй - цитоплазматические белки, передающие сигнал от рецепторов к соответствующим элементам адаптивного ответа. Первый элемент в этой паре - киназа, использующая АТФ для самофосфорилирования по остатку гистидина. От нее фосфорильная группа переносится на боковую цепь аспартата внутри консервативного домена второго компонента пары, регулятора ответа. Последний управляет широким спектром функций,

включая подвижность и экспрессию генов. Уровень фосфорилирования регулятора ответа контролирует ассоциированная с ним фосфатаза.

В частности, во внешней мембране E.coli имеется рецепторный белок EnvZ, являющийся гистидиновой протеинкиназой и передающий сигнал на регулятор ответа, белок OmpR, контролирующий транскрипцию генов определенных поринов в ответ на изменения осмолярности среды. При низкой осмотической силе внешней среды среди белков, определяющих проницаемость внешней мембраны, преобладает синтез мембранного порина OmpF. Белок ОтрС доминирует при высоком осмотическом давлении среды. Аналогичные пары обнаружены для регуляции транспорта дикарбоновых кислот (пара DctB - DctD), хемотаксиса (протеинкиназа CheA и регуляторы ответа CheY, CheB), ассимиляции азота (NRn-NRi), фосфора (PhoR-PhoB), вирулентности (VirA), поглощения гексозофосфатов (UhpB-UhpA) и др. как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. При этом имеются различные вариации компонентов сигнальных систем: например, VirA совмещает домены рецепторной и регуляторной протеинкиназ, CheA и NRn являются растворимыми цитоплазматическими рецепторными компонентами [Stock et al., 1988, 1990]. В функциональном отношении данные бактериальные протеинкиназы аналогичны тирозинкиназам эукариотических регуляторных систем.

Рецепторы бактериальных мембран еще недостаточно изучены. Как упоминалось выше, рецепторы бактерий представляют собой внешнюю часть мембраносвязанных белков - гистидиновых протеинкиназ. В то же время у E.coli и S.typhimurium обнаружено семейство мембранных рецепторов: Таг - рецептор аспартата, Tsr - серина, Trg, - рибозы и галактозы, Тар - пептидов. Эта группа рецепторов регулируется метилированием/деметилированием остатков глутамата и связана с гистидиновой протеинкиназой CheA через белок CheW.

Фосфорилированный регулятор ответа CheY взаимодействует с компонентами флагеллярного мотора, инициируя движение бактерий, а фосфорилированный регулятор CheB (метилэстераза) отщеплением метальной группы "отключает" сигнал [Stock et al, 1990].

Возможно, что уменьшение подвижности энтеробактерий за счет снижения экспрессии генов fthD и hag под влиянием увеличения концентрации глюкозы также осуществляется посредством рецепторно-активируемых протеинкиназ [Lai et al, 1997]. Выявлен рецепторный липопротеин цитоплазматической мембраны цианобактерии Synechococcus sp., участвующий в связывании и транспорте нитратов и нитритов [Maeda et al, 1997]. Во внешней мембране грамотрицательных бактерий выявлен белок ТопВ, образующий регулируемые поры, связывающие и поглощающие хелаторы железа; у E.coli обнаружен рецептор FepA, участвующий в транспорте комплекса железа и энтеробактерина через пориновые каналы [Jiang et al, 1997].

Огромные адаптационные способности представителей микробного мира дают возможность индуцибельного синтеза новых специфических рецепторных белков и модификации имеющихся в ответ на изменение условий окружающей среды. Эволюционно выработанные механизмы специфического взаимодействия веществ и клеток требуют участия белковых рецепторных молекул. С этой точки зрения процесс взаимодействия липополисахаридных О-антигенных детерминант внешней мембраны грамотрицательных бактерий с антителами (опсонизацию) можно рассматривать как процесс "насильственного" пришивания к бактериям белковых иммуноглобулиновых рецепторов, через Fc-регион обусловливающих дальнейшее взаимодействие микробных клеток с макрофагами или нейтрофилами [Morgan, Weigle, 1987].

Аналогично поверхностным липополисахаридам грамотрицательных бактерий, рибиттейхоевые кислоты на поверхности грамположительных бактерий выполняют функцию "антенн", связывающих поступающие извне белки - автолизины [Кулаев с соавт., 1984]. Традиционно в реакциях углеводузнающих белков - лектинов - с клеткой (например, гемагглютинин вируса гриппа и эритроцит) для моно- и олигосахаридов на определенном участке клеточной поверхности также применяют термин "рецептор" [Королев, 1984], хотя в принципе саму молекулу лектина возможно рассматривать как белковый рецептор, специфичный к определенным углеводным лигандам.

Обнаружено, что микроорганизмы обладают рецепторами к инсулиноподобным соединениям. Моноклональные антитела против аир субъединиц инсулина связывались с поверхностью клеток Neurospora crassa [Dietz et al., 1989]. Для секретируемой РНКазы B.intermedius методом электронной микроскопии с использованием антител, меченых золотом, было установлено наличие связывания РНКазы с мембраной дрожжевых клеток и грамотрицательных бактерий [Егоров с соавт., 1996; 1997]. Однако наличие связывания еще не является доказательством существования рецептора, поскольку современная биология вкладывает в понятие "рецептор" более узкий смысл, подразумевающий специфическую белковую структуру, которая в комплексе с лигандом инициирует каскад определенных ответных реакций.

Ответные реакции микробных клеток на действие экзогенных белков изучены недостаточно. Например, для объяснения действия лизоцима (N-мурамидаза, расщепляющая гликозидную связь в муреине), была предложена гипотеза проникновения через наружную бактериальную мембрану грамотрицательных бактерий путем образования липопротеидных каналов, имеющих внутри отрицательный заряд, способствующий внедрению

положительно заряженного белка. Более реальным механизмом связи с грамотрицательной клеткой представляется неспецифическая сорбция экзогенного фермента липидной частью внешней мембраны, конформационное изменение в молекуле белка и ее последующее проникновение через толщу липида к месту гидролиза своего субстрата -муреина [Янопольская, Деборин, 1983]. Исходя из вышеизложенного можно заключить, что необходимо разграничивать истинную рецепцию (связь лиганда с рецепторным белком) и неспецифическую сорбцию вещества на клеточной поверхности, учитывая, что оба этих процесса могут вызывать клеточный ответ.

Белки, как известно, принимают компактную конформацию с наименьшей площадью поверхности, чему при условии достаточного количества гидрофильных остатков, располагающихся на поверхности, будет соответствовать сфера. Если число гидрофильных остатков больше минимально необходимого, глобула принимает форму эллипсоида. Если гидрофильных радикалов не хватает, чтобы защитить гидрофобное ядро молекулы от водной атаки, в ней остаются незащищенные участки. Такие молекулы имеют тенденцию образовывать надмолекулярные ассоциаты. Изменение вязкости микроокружения белковых молекул управляет взаимодействием между белками в олигомерных комплексах и регулирует активность мембранных ассоциатов [Болдырев, 1997]. Это означает, что вспомогательные компоненты рецепторной области могут в значительной степени модифицировать процесс рецепции.

Белковый лиганд в большинстве случаев имеет гидрофильную поверхность. Его взаимодействие с участком специфического рецептора (карбоксильная группа белка, аминогруппы, сульфгидрильные группы, остатки фосфорной кислоты) происходит при помощи ионной, водородной, ван-дер-ваальсовых и ковалентных связей. Однако связывание может

происходить и с помощью неспецифических электростатических взаимодействий участков отрицательно заряженной поверхности клеток с белками, являющимися при физиологических значениях pH поликатионами. Данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют о преобладающем вкладе диссоциированных фосфатных групп (в меньшей степени карбоксильных) в суммарный отрицательный заряд клеточной поверхности. Фракция протонированного азота частично уравновешивает отрицательно заряженные фосфатные группы, так что величину заряда поверхности клетки можно охарактеризовать отношением N/P [Amory, Rouxhet, 1988]. И пептидогликан поверхности грамположительных микроорганизмов, и наружный гликолипидный слой грамотрицательных бактерий имеют преобладающий отрицательный заряд [Иванов, Фомченков, 1989].

Действительно, для подавляющего большинства микроорганизмов изоэлектрическая точка лежит в области рН=2-3.5, что свидетельствует о преобладании диссоциированных кислотных групп на их поверхности при физиологических значениях pH, причем принципиальных отличий между грамотрицательными и грамположительными бактериями не выявлено [Harden, Harris, 1953]. Однако нельзя не учитывать, что поверхностный заряд клеток будет уравновешиваться ионами среды, меняться в зависимости от внешних условий и от физиологического состояния клетки [Krekler et al, 1989]. Тем не менее адсорбция белковых эффекторов с преобладающим положительным зарядом на поверхность микробной клетки имеет место в действительности. В частности, выявлено снижение отрицательного поверхностного заряда клеток E.coli при действии на них экзогенной РНКазы, что авторы объясняют неспецифической сорбцией молекул фермента [Улахович с соавт, 1997]. Модель функционирования ферментного комплекса лизоамидазы также включает "переход" положительно заряженных бактериолитических ферментов с доставившего

их полисахарида на отрицательно заряженные клеточные стенки бактерий-мишеней [Скрябин, Кулаев, 1990].

Показатель, величина которого прямо пропорциональна отношению N/P -гидрофобность клеток - увеличивается во время логарифмического роста и резко снижается в стационарной фазе. Грамположительные организмы обычно являются несколько более гидрофобными, чем грамотрицательные [Loosdrecht, 1987]. Таким образом нельзя однозначно предсказать, насколько активен будет процесс неспецифического связывания с клеточной поверхностью даже для хорошо охарактеризованного лиганда. Еще сложнее судить о том, будет ли такое связывание индуцировать клеточный ответ. Пробелы в этой области знаний еще предстоит заполнить.

♦ Краткое заключение, которое можно сделать на базе имеющихся на сегодня данных литературы по вопросу взаимодействия белковых лигандов с поверхностью живой клетки, сводится к констатации нескольких принципиальных положений. Прежде всего, узкоспецифическое узнавание лиганда "своим" рецептором - это белок-белковое взаимодействие, обязательно активирующее сигнальную систему клетки. Неспецифическая связь лиганда может осуществляться через "антенные" структуры клеточной поверхности - гликолипиды, полисахариды и пр.; при этом не исключена возможность случайного воздействия на "чужой" белковый рецептор. В этом случае трудно предвидеть, будет ли индуцирована передача сигнала вообще и каков будет ответ клетки. Возможность интернализации определенного лиганда и осуществление им внутриклеточных эффекторных реакций, приводящих к индукции нового или модификации первичного сигнала, зависит от типа клеток, их возраста и условий среды.

II. Современные подходы к оценке генотоксичности соединений

Законодательно закрепленные батареи тестов для оценки генотоксического действия веществ по стандартным схемам [МЗ СССР, 1982, 1991; UESPA, 1986] безусловно необходимы, однако в настоящее время в связи с накоплением новых знаний требуют определенного обновления. Принципиальные тесты генетической токсикологии разделены на две группы: в первую входят "ведущие" (pivotal) тесты, а именно проба на генные мутации в тесте Эймса Salmonella!микросомы и выявление хромосомных аберраций in vivo у млекопитающих, а именно метафазный анализ или микроядерный тест, а во вторую - другие тесты, открывающие перспективные базы данных или имеющие уникальную мишень генотоксического действия [Klaassen et al, 1995].

Для регистрации потенциальной карциногенной активности обсуждается использование тестов для выявления эффектов не только на стадии инициации, но и на стадии промоции: определение индуцированной гиперплазии, уровня экспрессии онкогенов, индукция клеточной пролиферации [Тарасов, 1994]. Подвергается сомнению стандартный протокол тестирования на карциногенность с использованием экспериментальных животных [Худолей, Белицкий, 1989; Худолей, 1994]. Тем не менее для оценки генотоксического действия соединения испытание последнего в ведущих тестах принципиально важно, а обнаружение эффектов в дополнительных экспериментальных тест-системах вносит свой вклад в понимание механизмов его действия.

Ниже кратко рассматриваются тесты, выбранные для оценки повреждающего геном действия исследуемого соединения, - системы, не использованные автором в экспериментальной работе, упоминаются в сравнительном аспекте.

2.1.Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах

Тесты на мутагенность обычно используются для предсказания канцерогенных свойств химических веществ. Чувствительность теста отражает ту часть канцерогенов, которые позитивны в пробе на мутагенность, а специфичность - содержание некарциногенов, которые дают отрицательный ответ при проверке на мутагенность. Наиболее часто для выявления генных мутаций используются следующие бактериальные тест-системы: тест Эймса по реверсии ауксотрофных по гистидину штаммов Salmonella typhimuriym к прототрофности [Marón, Ames, 1983], тест по реверсии ауксотрофных по триптофану штаммов E.coli WP2 к прототрофности (оба регистрируют обратные мутации) и тест на устойчивость к арабинозе у Salmonella (прямые мутации) [Jurado et al., 1994]. В качестве иных показателей генетических нарушений при действии мутагенов на бактерии применяют пробу на избирательную гибель дефектных по различным путям репарации штаммов Bacillus subtilis в сравнении с диким типом (гес-тест) [Hamasaki et al., 1992] и пробу на индукцию SOS-функций клетки при повреждении ДНК у E.coli [Quillardet, Hofnung, 1985, 1993].

Тест Эймса Salmonella/мш^осомы является бесспорным лидером по частоте использования вследствие высокой чувствительности. Если учесть известные факты плохой регистрации в тесте Эймса эффектов карциногенных металлов [Barret, 1993], неактивных галогенированных соединений, как то диоксинов, полибромированных бифенилов, хлордана (так называемые негенотоксичные или эпигенетические канцерогены), и не включать соединения такого рода в статистический анализ, то чувствительность теста составит 93% для канцерогенных по отношению к одному виду животных - либо к мышам, либо к крысам - соединений, и

100% для канцерогенов, выявляемых в обоих видах [Ashby, Tennant, 1991]. Хотя прогностические возможности проб на генотоксичность определяют обычно сравнением с пробами на канцерогенность в грызунах, само установление канцерогенных свойств варьирует между опытами с мышами и крысами на 67% [Tennant et all, 1987]. Принимая во внимание известные недостатки тестирования на канцерогенность с животными, а именно недостаточную статистическую достоверность, высокий спонтанный уровень опухолеобразования у грызунов, отсутствие повторностей в дорогостоящих биопробах, трудности с режимом дозирования и пр. [Privai, Dunkel, 1989], можно считать тест Эймса абсолютно необходимым для выявления мутагенных свойств соединений, которые с большой вероятностью можно считать канцерогенными. Есть и другие факты, подтверждающие значимость теста Salmonella/микросомы. Например, результаты этого теста на 87% коррелировали с регистрацией структурных изменений ДНК, а те вещества, которые некорректно регистрируются в тесте как канцерогены или некарциногены, практически не удается классифицировать и в других краткосрочных тестах [Ashby, Tennant, 1991]. Анализ крупной базы данных, включающей 351 канцероген, испытанный также в тесте Эймса, показал 81% корреляции между мутагенностью и индукцией опухолеобразования [Gold et al, 1993].

Определенным ограничением применения теста Эймса является невозможность тестирования образцов, содержащих свободный гистидин. Показано, что для удвоения числа ревертантов необходимо присутствие минимального количества гистидина, составляющего 150нмоль/чашку [Nylund, Einistö 1993]. Поэтому в пробах, содержащих данное или большее количество гистидина, невозможно отнести обнаруженную мутагенность к какому-либо иному фактору смеси. В таких случаях

постановка аналогичного теста, исключающего мешающий фактор (например, Ara-тест), может помочь получить однозначный ответ.

Таким образом, на сегодняшний день представляется оптимальным применять не батарею разнообразных тестов, а какой-либо чувствительный тест на генные мутации (тест Эймса), сопровождая его пробой на кластогенный эффект у млекопитающих для выявления генотоксичности исследуемого вещества. Было показано, что комбинация теста Эймса и проба на хромосомные аберрации в костном мозге мышей или выявление микроядер позволили идентифицировать все из 21 канцерогенов человека [Ashby, Patón, 1993]. Считается, что негенотоксичные канцерогены - гормоны, металлы и микроволокна - в тестах на генотоксичность учтены быть не могут, однако возможность выявления в тесте Salmonella!микросомы негенотоксичных канцерогенов промоторного действия по достоверному усилению ответа на стандартный промутаген была установлена [Dertinger et al., 1993].

Хотя традиционно естественным критерием бластомогенности является возникновение опухоли у экспериментальных животных, последнее - лишь один из показателей, с которым коррелирует или не коррелирует бластомогенный эффект испытуемого агента у человека. Невозможность индукции опухолей у бактерий не может быть преградой для выявления канцерогенов человека, поскольку определяющим фактором выступает не сходство морфологических процессов, а корреляция предсказывающего и предсказуемого событий [Худолей, 1994].

В плане разнообразия конечных точек приложения действия генотоксикантов бактериальные пробы позволяют прояснить многие биохимические и молекулярные механизмы генотоксического действия веществ. Например, подавление роста бактериального штамма с тем или

иным дефектом в генах, ответственных за определенный путь репарации, по сравнению со штаммом дикого типа, позволяет судить об участии определенных компонентов репарационных путей в исправлении повреждений ДНК, вызываемых исследуемым соединением. Индукция SOS-функций клетки в ответ на действие генотоксикантов, измеряемая практически по активности фермента ß-галактозидазы, ген которого {lac Z) введен под контороль sfi А гена, входящего в SOS-оперон E.coli, позволяет судить о включении SOS-ответа в клетках тестерных бактерий [Quillardet, Hofnung, 1993]. Поскольку известно, что блокирование репликации вызывает определенный сигнал (вероятно, им является образование одноцепочечной ДНК), индуцирующий включение более чем 15 генов, многие из которых участвуют в репарации, можно предполагать, что индуцирующий SOS-ответ генотоксикант так или иначе приводит к образованию одноцепочечной ДНК. Превращение белка Ree А в протеазу, расщепляющую репрессор гена lex А и запускающую каскад реакций репарационного синтеза на поврежденной матрице, приводит к увеличению выживаемости клеток и повышению частоты мутаций, что дает возможность усилить генетическую вариабельность бактериальной популяции [Alberts et al, 1989]. В случае использования данной тест-системы не совсем корректно говорить об индукции генотоксикантом точковых мутаций, хотя, вероятнее всего, именно их накопление приводит к остановке репликации.

Известно, что выход профага из лизогенной культуры также находится под контролем гес А гена, поскольку протеаза Ree А действует на репрессоры отдельных профагов. В частности, протеазная активность Ree А была открыта на примере репрессора фага лямбда [Ptashne, 1986]. Поэтому система оценки мутагенного действия веществ, основанная на принципе фагоиндукции, также подразумевает индикацию включения

SOS-функций клетки [Heinemann, 1971]. Хотя регистрируемое при SOS-ответе увеличение экспрессии Ree А необходимо и для выполнения его роли в рекомбинационной репарации, две активности белка Ree А, как было показано методами генетического анализа различных мутаций в гес А гене, проявляются относительно независимо [Льюин, 1987].

2.2. Тестирование на генотоксичность in vivo

Нельзя не признать, что фактически бактериальные тест-системы также представляют собой систему in vivo, но особенности метаболизма одноклеточных организмов настолько отличны от высших многоклеточных, что такая терминология к ним не применяется. Тестирование на уровне целого организма учитывает метаболические превращения соединений, репарацию ДНК и фармакодинамику, но сопряжено с трудностью выбора доз, способа обработки и установлением контрольных параметров. Тесты in vivo должны заранее учитывать факт, что мутации происходят с низкой частотой, и если скрининг маркерного показателя у миллиона бактерий или в культуре клеток реален, то процедура обнаружения маркера у миллиона дрозофилл весьма проблематична [Klaassen et al, 1995].

Традиционным является метод обнаружения генотоксичности в тесте сцепленных с полом рецессивных деталей Drosophila (SLRL), сильными сторонами которого является возможность детекции рецессивных летальных мутаций в 600-800 различных локусах Х-хромосомы по обнаружению самцов дикого типа в потомстве от специальных скрещиваний и информация о мутагенезе в половых клетках, отсутствующая в микробных тест-системах [Mason et al, 1987].

Разработанная методика выявления генных мутаций и увеличения частоты митотической рекомбинации в соматических клетках Drosophila

melanogaster (SMART) [Graf et al., 1984] представляет интерес в связи с возможностью выявления не только мутагенной, но и рекомбинагенной активности веществ по подсчету и классификации мутантных клонов волосков на крыльях Drosophila, а также привлекает простотой перманентного хранения препаратов крыльев с целью верификации результатов. Кроме того, в эксперименте действию подвергаются личинки мух (трансгетерозиготные по генам mwh и flr), обладающие метаболической активностью для трансформации широкого спектра ксенобиотиков, а мишенью регистрируемого впоследствии действия служат тысячи клеток имагинального диска [Vogel, 1992].

Доминирующим фактором отбора клеток целого организма для цитогенетического анализа обычно выступает доступность получения большого количества делящихся клеток, при этом необходимо найти адекватное время экспозиции, правильные интервалы между обработкой и сбором клеток, и определить достаточное количество животных. Наиболее часто в анализе метафазных ядер используют клетки костного мозга крыс, мышей, китайского хомячка. Цитогенетика подтверждает прямую связь между тестами на мутагенность в экспериментальных организмах и действием на человека, являясь наиболее общим способом установления мутагенных эффектов на человеке. В частности, хромосомные аберрации, включая разрывы хромосом, обмен хроматид, ацентрические фрагменты, дицентрические и двойные хромосомы, некоторые инверсии и транслокации могут быть подсчитаны в лимфоцитах периферической крови человека.

Однако подсчет хромосомных аберраций - длительный процесс, причем достаточно субъективный. Более удобным маркером генотоксического действия является образование микроядер в эритроцитах костного мозга или периферической крови мышей [Heddle et

al, 1991; Hayashi et al, 1994]. Микроядерный тест используют как аналог метафазного анализа в мониторинге мутагенов на уровне человека [Sorsa et al, 1992]. Микроядра представляют собой хроматин-содержащие тельца, образованные из хромосомных фрагментов, не включенных в ядро в процессе митоза. Микроядра остаются в клетке, когда в процессе созревания эритроцитов само ядро элиминируется, и могут служить индикатором повреждения хромосом. Хотя увеличение частоты микроядер говорит о повреждении генетического материала и характеризует опасность мутагенного воздействия, включая канцерогенез, для популяции или определенной группы, интерпретация риска на уровне индивида довольно сложна. Тем не менее когортный анализ людей с повышенной частотой аберраций в интервал с 1970 по 1988 гг. показал, что риск возникновения рака у этих людей в 2,5 раза выше по сравнению с людьми, имеющими среднюю частоту хромосомных аберраций [Hagmar et al, 1994].

Обнаружение мутаций в бактериальных генах, входящих в состав генома трансгенных животных (мутации в гене lacZ у мышей, так называемый MutaMouse тест; мутации по lacl гену у мышей и крыс в тесте "Big Blue"), представляет собой один из современных подходов к решению проблемы специфичности воздействия генотоксикантов на органы и ткани и позволяет комбинировать простую методику детекции генных мутаций у микроорганизмов с метаболизмом и фармакодинамикой in vivo [Mirsalis et al, 1994]. На сегодняшний день остается открытым вопрос о том, насколько распределение мутаций в трансгенных системах соответствует таковой в эндогенных генах бактерий и животных, а также насколько корректна интерпретация мутагенного действия, определенного в мертвых тканях трансгенных животных [Burkhart, Mailing, 1994].

2.3. Тестирование на генотоксичность в системе клеточных культур

Для анализа на генотоксичность используют как первичные культуры, приготовленные непосредственно из клеток, выделенных из тканей организма, так и вторичные, полученные многократным пересевом клеток первичных культур. Вторичные культуры можно поддерживать в течение недель и даже месяцев с сохранением дифференциальных видовых свойств входящих в них клеток. Именно благодаря этой особенности на клеточных культурах можно проводить исследования, недоступные методически в интактных тканях. Кроме того, использование клеточных линий раковых клеток, либо трансформированных опухолеиндуцирующими вирусами или химическими соединениями, позволяет получать дополнительную информацию[А1Ьейз et al., 1989]. Традиционно в культуре клеток млекопитающих - фибробластах мышей (например, линии NIT3T3) или сирийского хомячка (СНО), гепетоцитах крыс, лимфоцитах человека - определяют внеплановый синтез ДНК (ВСД) под действием мутагена, отражающий индукцию репарационного синтеза в ответ на повреждения генетического материала при блокированном репликационном синтезе [Madie et al., 1994]. Сестринский хроматидный обмен (СХО) в клетках костного мозга грызунов и лимфоцитах человека, в том числе и в опытах in vivo, видимо, менее информативен, чем метафазный анализ, поскольку механизм, с помощью которого повреждение ДНК стимулирует СХО, не совсем ясен. Однако показано, что СХО чувствителен к малым дозам мутагенов [Sorsa et al., 1992], а подсчет СХО менее субъективен, чем подсчет хромосомных аберраций [Klaassen et al., 1989]. Тем не менее в последнее время делают основной упор на методы, позволяющие выявить конкретные повреждения ДНК как в первичной или вторичной культурах клеток, подвергшихся действию

исследуемого мутагена, так и в клетках, непосредственно выделенных из экспонированного организма.

Разработанные тесты на выявление одиночных и двойных разрывов цепей ДНК, а именно метод щелочной и нейтральной элюции, гель-электрофорез единичной клетки (SCGE или "кометная проба") и гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) позволяют непосредственно подтвердить наличие повреждений ДНК в клетках под влиянием генотоксического агента. [Storer et al, 1996]. Дифференциация однонитевых и двунитевых разрывов представляется весьма важной, поскольку среди индуцированных a-частицами, у-лучами разнообразных повреждений ДНК: одно- и двунитевых разрывов, химических изменений оснований и Сахаров, сшивок ДНК-ДНК и ДНК-белок, только степень образования двунитевых разрывов показала ту же самую зависимость от величины ионизирующего излучения, как цитотоксичность, хромосомные аберрации и клеточная трансформация [Hei et al, 1988].

Хотя метод щелочной элюции ДНК с фильтра применяют для определения одиночных разрывов, фактически он регистрирует и одиночные, и двойные разрывы, поскольку элюция ДНК является простой обратной функцией ее молекулярного веса. Кометная проба, поскольку ее обычно проводят в щелочных условиях [Tice et al, 1992], также не дает возможности разграничивать одно- и двунитевые разрывы, а использование нейтральной кометной пробы ограничено техническими трудностями. Метод PFGE демонстрирует в несколько раз большую чувствительность, чем метод нейтральной элюции в неденатурирующих условиях вследствие более точной калибровки числа двойных разрывов. Калибруют разрывы, полученные либо путем облучения, либо при разложении 1251 в условиях, исключающих реперацию, причем показано, что разложение одного атома 1251 образует примерно один двойной разрыв

в 1251-меченной ДНК [Vamvakas et al., 1997]. Этот метод был успешно применен для анализа ДНК-фрагментирующей активности радиации, ингибиторов топоизомераз, противоопухолевых антибиотиков и хемиотерапевтических средств, ндуцирующих образование радикалов [Wang et al., 1995]. С его помощью также возможно изучать зависимую от времени репарацию двойных разрывов в ДНК, вместе с ошибочной репарацией ведущих к сайт-специфическому мутагенезу сайтов узнавания ферментов рестрикции. Все эти факты свидетельствуют о потенциальной значимости метода PFGE также и для мониторинга двуцепочечных разрывов ДНК в человеческой популяции [Vamvakas et al., 1997].

♦ Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что тесты на генотоксичность представляют собой хорошо отработанную систему слежения за повреждающим геном действием веществ, причем как прямых мутагенов, так и промутагенов, нуждающихся для проявления эффекта в биоактивации. Вполе реальным представляется применение существующих краткосрочных тест-систем для оценки канцерогенного потенциала, модификация известных и разработка новых систем скрининга для выявления эффектов негенотоксических канцерогенов. Несомненно также, что широкий спектр тестов с известными биохимическими и молекулярными мишенями действия при адекватной интерпретации может внести решающий вклад в установление конкретных механизмов действия исследуемых соединений.

III. РАЗНОНАПРАВЛЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

1. Зависимость типа проявляемого эффекта от дозы эффектора

Принципы регуляции жизнедеятельности организмов относятся к числу кардинальных проблем биологии. Организм любого эволюционного уровня можно рассматривать как функционально организованную систему, развитие которой определяется факторами внешней среды и вырабатываемыми самим организмом. Число открытых эндогенных регуляторов в клетках про- и эукариот постоянно растет. Исследования 90-х годов расширили спектр вторичных мессенджеров у высших организмов, к числу известных присоединились церамид, фосфатидная кислота, цАДФ, 5'-АМФ [Esteva et al., 1995; Ulrich, Simon, 1995; Anderson et al., 1996]. На уровне межклеточных, a в определенных условиях внутриклеточных регуляторов животных организмов были открыты неорганические соединения - N0*, СО, *ОН [Korsmeger et al., 1995; Ашмарин, Стукалов, 1996; Suzuki et al., 1996; Yamamoto et al., 1997]. Установлены регуляторные функции ряда продуктов естественной деградации биополимеров растений [Тарчевский, 1992]. Подробно охарактеризованы микробные метаболиты, играющие роль специфических ауторегуляторов [Эль-Регистан с соавт., 1980; Хохлов, 1988].

В то же время растет список работ, посвященных поиску, выделению, характеристике и изучению механизмов действия экзогенных регуляторов, способных направленно изменять ряд функциональных процессов клетки [Куприянова-Ашина, 1989; Narisawa et al., 1996; Okabe et al., 1997; Kefeli et al., 1997; Фоменко с соавт., 1998; Лямин с соавт., 1998]. Экзогенные регуляторы могут быть как природными, так и синтетическими соединениями. К сожалению, в подавляющем большинстве случаев при

рассмотрении эффектов веществ-регуляторов ограничиваются областью концентраций, относящейся к диапазону желаемых результатов, без учета иных возможных проявлений биологической активности. В связи с этим представляется особо важным обратить внимание на исследования, связанные с разнонаправленным действием отдельных регуляторов. Такие примеры есть среди регуляторов роста и развития человека, животных, растений и микроорганизмов.

Известно, что многие микроорганизмы способны синтезировать фитогормоны. Культуры некоторых бактерий и грибов вырабатывают ауксины, гибберелины, цитокины, этилен и некоторые другие вещества, способные вызывать специфические реакции тканей высших растений. При этом количество фитогормонов, синтезируемых клетками микроорганизмов, превышает таковое для клеток высших растений, хотя и не выполняет той регуляторной роли, которая характерна для растений. Гормоны патогенов растений ответственны за опухолевый рост, образование галлов древесных пород, за развитие симптомов бактериального увядания, - то есть, являются составной частью комплекса веществ, с помощью которого паразиты преодолевают защитные механизмы хозяина и получают возможность развиваться в инфицированных тканях. Однако представление о регуляторах роста бактериального или грибного происхождения как о своеобразных токсинах вызывает возражения. При контакте хозяина и патогена последний индуцирует изменение гормонального баланса пораженных тканей. Следствием этого может быть как развитие патогена, так и угнетение его роста. Предполагается, что в совместимых сочетаниях фитогормоны обеспечивают согласованную активность функционально комплиментарных генов обоих организмов [Ковалев, 1983].

Широко известны как активирующие, так и ингибирующие эффекты фенольных регуляторов роста растений, относящихся к двум группам -

имитаторам стимулирующего эффекта фитогормонов и ингибиторам функций последних [Кефели, 1981]. Однако и для одного и того же биологически активного соединения показаны разнонаправленные эффекты: например, кверцитин (растительный пигмент группы флавонолов), аскорбиновая кислота, чай, кофе и кофеин-содержащие продукты проявляют мутагенный эффект в высоких дозах и антимутагенный - в низких [Порошенко, Абилев, 1988; Дурнев, Серед енин, 1994]. Обладает мутагенной активностью в клетках млекопитающих и ряд синтетических стимуляторов роста растений [Конобеева, 1987]. Экстракты лекарственных растений, действующие как ингибиторы передачи сигналов в центральной нервной системе, в то же время обладают антиоксидантными свойствами [Большакова с соавт., 1997].

Огромное значение поддержания определенной концентрации гормонов в организме животных не нуждается в доказательствах. Стимулирующие и тормозящие гормональные сигналы должны быть строго сбалансированы не только правильным отношением активатор/ингибитор, но и необходимым уровнем отдельного эффектора. На примере синтетического эстрогена диэтилстилбестрола было показано, как митотическая стимуляция малыми дозами сменяется генотоксическим эффектом при высоких концентрациях в культуре фибробластов человека, лимфомы мышей, на клетках дрожжей в условиях экзогенной активации микросомной фракцией печени крыс. Предполагают, что высокие концентрации гормонов реализуют свое действие не только на уровне специфического связывания с соответствующими рецепторами, но и посредством не зависимых от рецепторов взаимодействий [Miller, O'Neill, 1990; McPherson, Doll, 1990; Degen, 1992]. To. что в механизме передачи сигнала играют роль не только рецепторные взаимодействия, подтверждено в эксперименте по индукции гена erg-1 под действием

инсулина в клетках СНО. Связь инсулина с нормальным рецептором вызывает его аутофосфорилирование по тирозину и каскад дальнейших реакций фосфорилирования. Мутантный рецептор не осуществляет связывание инсулина и фосфорилирование, но и ген, и тРНК индуцируются [Нагаёа е! а1, 1995].

При исследовании изменений клеточного цикла в предопухолевых состояниях отмечено, что нормальные обновляющиеся ткани с высокой митотической активностью имеют минимальный резерв для ее дальнейшего увеличения. Поэтому стимулы, направленные на дальнейшую интенсификацию деления, ведут к срыву компенсаторного резерва в процессе канцерогенеза и уменьшению скорости деления к концу канцерогенеза [Акоев, 1988]. Еще в 1974г. была отмечена некоторая общность проявлений радиационной и возрастной патологии. В ответ на падение способности клеток отвечать адекватной реакцией на эффекторы в начальный период старения (облучения) развивается компенсаторный адаптивный ответ, связанный с возрастанием чувствительности некоторых клеток к гормонам и ростом содержания в них АТФ, а затем число белковых рецепторов на мембране уменьшается, и происходит инициация цепи патологических изменений [Дильман, 1974; Фролькис, 1982].

Данные примеры можно рассматривать как разнонаправленные ответные реакции организмов на эффекторное воздействие: малые дозы начального воздействия вызывают, как правило, активационный ответ, а их повышение через определенный интервал "нейтральных" доз приводит к подавлению функциональной активности.

Множество экспериментальных данных подтверждают это положение.

В частности, противоположно направленные эффекты стероидных гормонов (гидроэпиандростерона, синтетических производных эстрадиола) и антибиотиков (стрептомицина) в различных тест-системах

выражаются в смене антимутагенных свойств на мутагенные при переходе от низких доз к высоким [Порошенко, Абилев, 1988].

Пентапептид метэнкефалин в концентрации 10"9М в 1.5 раза усиливал,

5 7

а при концентрациях 10" - 10" M снижал синтез белков в листьях редиса [Тарчевский, 1992].

Показано стимулирующее влияние известного мутагена - афлатоксина В1, - в низких концентрациях (до 0.8(1г/мл) на вегетативный рост дрожжей Saccharomyces cerevisiae [Halt, Sutic, 1989].

Установлено, что в различных диапазонах действующих доз озон способен как стимулировать, так и ингибировать функциональную активности дрожжевых клеток Candida utilis. Низкие дозы (108 молекулОз/клетку) стимулируют активность дыхания и репродуктивную способность дрожжей, тогда как высокие дозы (109 молекул/клетку оказывают противоположное действие, причем наблюдаемые эффекты сохраняются в течение нескольких часов после озонирования. Авторы связывают разнонаправленность действия озона с конформационными перестройками клеточных мембран [Мельникова с соавт., 1989].

На интервал доз, лежащий между эффективными малыми и большими дозами, обращается обычно мало внимания вследствие отсутствия каких-либо выраженных фенотипических проявлений действия экзогенного лиганда в данном диапазоне. В обзоре Порошенко и Абилева [1988] рассматривается ряд исследований по антимутагенности/мутагенности, указывающих на то, что малые и нейтральные дозы вызывают адаптацию организма к последующему действию высоких доз. Предварительная обработка проростков Vicia faba низкими дозами алкилирующих агентов повышала их устойчивость к кластогенному действию последующих высоких доз тех же веществ. Работала и перекрестная адаптация: например, обработка корешков Vicia faba триэтиленметиламином в

концентрации 10"5М (ЗОмин) снижала частоту хроматидных аберраций, вызванных метилнитрозомочевиной в дозе 10"3М. Предположение о том, что в основе адаптации к мутагенам лежат процессы репарации ДНК в фазе G2, было подтверждено специальными исследованиями, показавшими снятие адаптивного действия низких доз малеинового гидразида и метилнитрозомочевины в присутствии ингибиторов репарации ДНК (гидроксимочевины, 5-фтордезоксиуредина и 2-дезоксиаденозина). Обработка мутагеном в дозе, на порядок или более меньшей, чем следующая через 2ч доза мутагена, в большинстве случаев приводила к существенному снижению частоты мутаций [Дубинина с соавт, 1986; Серебрякова с соавт, 1992]. Однако конечный результат предобработки малыми дозами зависел от фазы клеточного цикла, разброса величин стимулирующей и мутагенной доз, временного интервала между ними и пр, причем могло быть вызвано и адаптивное, защитное, и сенсибилизирующее действие.

Достаточно распространенное у бактерий включение адаптационного ответа под влиянием малых доз метилнитрозомочевины показано на примере индукции экспрессии генов ada, alkA, alkB, aidB у E.coli и S.typhimurium, которая приводила к повышению устойчивости бактерий к летальному и мутагенному действию данного соединения [Bacun-Druzina et al, 1994].

Таким образом, на схеме дозозависимого проявления летальных эффектов, представленной на рис.1, наиболее изученной является область Б, отражающая негативные эффекты недостатка питательных субстратов и избытка токсикантов. Квадрат В, к которому относится область клеточного гомеостаза, включает в себя лишь отчасти исследованные реакции, изменяющие гомеостаз без летальных последствий. Однако именно в этой области лежат различные активационные и адаптационные эффекты, важные не только с практической точки зрения, но и для

понимания взаимосвязи с последующими эффектами больших доз в едином механизме клеточного ответа.

Рис.1 Схема дозо-зависимого ответа отдельного организма на действие непитательных (1) и питательных (2) веществ. А -область отсутствия эффекта, Б - область токсических эффектов, В - область гомео-стаза (по К1аазеп е1 а1., 1996; модифицировано).

2. Регуляция функциональной активности клетки низкомолекулярными продуктами деградации естественных полимеров

Множественная роль процессов катаболизма не вызывает сомнений. Продукция мономерных низкомолекулярных блоков для синтеза высокомолекулярных биополимеров, вовлечение образующихся низкомолекулярных субстратов в энергодающие аэробные и анаэробные реакции, устранение соединений с функциональными и структурными нарушениями - этот перечень важнейших функций системы реакций катаболизма дополняет сигнальная функция, реализуемая путем воздействия на транскрипцию, трансляцию и ферментативную активность ранее синтезированных молекул олигомерными промежуточными продуктами метаболизма. Накапливается все больше информации о том, что некоторые олигонуклеотиды, олигопептиды и олигосахариды,

Смертность

являющиеся продуктами деградации соответствующих полимеров, а также промежуточные продукты деградации липидов обладают регуляторно-сигнальными функциями [Тарчевский, 1992].

Известно, что процессы распада биополимеров усиливаются при старении и при целом ряде неблагоприятных воздействий, вызывающих стресс. Интересны факты, демонстрирующие возможность индукции апоптоза в изолированных ядрах цитозольной фракцией Раз-активированных клеток, причем если к нормальным растущим клеткам добавить каспазу (протеазу, вовлеченную в процесс апоптоза, блокируемый онкогенным продуктом Вс1-2/Сес1-9), то такой клеточный экстракт также будет индуцировать апоптоз. Эти данные подтверждают роль протеолитической деградации белков каспсзами в апоптозе [Ъ^а1а, 1997]. Возможно, что регуляторная роль в данном процессе принадлежит продуктам ферментативного гидролиза - олигопептидам.

Особенно важной проблемой представляется регуляция клеточных функций продуктами деградации нуклеиновых кислот - олиго- и мононуклеотидами, поскольку она связана с особенностями сохранения и реализации генетической информации.

Время жизни матричной РНК составляет всего несколько часов, что определяет количество белка, которое будет синтезировано. Синтез мРНК регулируется путем индукции и репрессии (в частности, катаболитной), синтез стабильных форм РНК ингибируется не только при недостатке предшественников, но и при накоплении в клетках высокофосфорилированных нуклеотидов [Шлегель, 1987]. Образующиеся при деградации РНК нуклеотиды служат строительным материалом для новых РНК, используется в синтезе коферментов и для активации различных соединений, а также составляют пул свободных нуклеотидов, изменяющийся в зависимости от возраста клетки и внешних условий [Астапович, 1979]. Увеличивающийся фонд свободных нуклеотидов у

микроорганизмов служит показателем голодания культуры и образуется за счет деградации РНК [Choen, Kaplan, 1977]. Многие ферментативные реакции зависят от АТФ, ГТФ, УТФ и ЦТФ в качестве источников высокоэнергетического фосфата или группировок с высоким потенциалом переноса группы (например, АДФ в АДФ-глюкозе). Нуклеозидмонофосфаты служат субстратами фосфорилирования с помощью фермента аденилатциклазы за счет АТФ. Рибонуклеотиды, являясь предшественниками дезоксирибонуклеотидов, служат субстратами в синтезе как РНК, так и ДНК [Готтшалк, 1982]. Считается, что образование коротких одноцепочечных фрагментов ДНК является сигналом включения SOS-ответа клетки, разрешающем синтез на поврежденной матрице [Devoret, 1992].

Деградация РНК и выход нуклеотидов из клеток микроорганизмов являются показателями действия на клетки многих неблагоприятных факторов - действия антибиотиков, поверхностно-активных веществ, облучения, голодания и т.п. [Астапович, 1979]. Выход нуклеотидов из клеток дрожжей Torula utilis индуцировали также белки, в частности, панкреатическая РНКаза и бычий сывороточный альбумин, что, по мнению автора, опосредовано генерализованными конформационными перестройками мембран [Конев, 1985].

Увеличение соотношения циклических нуклеотидов цГМФ/цАМФ считают выраженной тенденцией при дисдифференциации и интенсивной пролиферации животных клеток. При этом отмечено снижение активности деполимераз нуклеиновых кислот в быстро пролиферирующих тканях и опухолях [Акоев, 1988]. Образование особых кратных 180-200 Ьр олигонуклеосомных фрагментов ДНК эндонуклеазами, индуцируемыми повышением внутриклеточной концентрации Са2+ (ДНКаза I), снижением внутриклеточного pH (ДНКаза II), а также эндонуклеазами,

активируемыми при поли(АДФ)-рибозилировании, отличает апоптоз от некроза [Manning, Patierno, 1996].

В клетках эукариот обнаружены быстро метаболизирующиеся олигорибонуклеотиды, которые могут регулировать клеточный метаболизм, переходя от одной клетки к другой. Предполагают, что такая роль короткоцепочечной внеклеточной РНК аналогична роли вторичных мессенджеров [Benner, 1988; D'Alessio, 1993].

В целом значение конкретных реакций расщепления нуклеиновых кислот и роль образующихся при этом определенных олигонуклеотидов выяснены далеко не полностью. Например, в печени крыс идентифицировано 5 различных белков, каждый из которых обладает РНКазной активностью, приводящей к инактивации рибосом [Chen et al, 1996]. Для клеток E.coli известно 8 отдельных 3'-5' экзорибонуклеаз, имеющих in vivo отчасти перекрывающиеся функции. Одного из ферментов деградации мРНК, РНКазы II или полинуклеотидфосфорилазы, достаточно для поддержания жизнеспособности, но инактивация обеих РНКаз приводит к смерти клетки [Deutscher et al, 1996].

Синтез из АМФ олигоаденилатов с помощью 2-5 олигоаденилатсинтазы, приводящий к образованию олигомеров адениловой кислоты, соединенной 2' - 5' межнуклеотидными связями, является новым примером регуляторных функций нуклеотидов. Эти соединения обладают противовирусной и антимитогенной активностью, участвуют в механизме действия интерферона [Мацука с соавт, 1998]. В клетках высших позвоночных 2'-5' аденилатная система функционирует не только как обеспечивающая антивирусную активность, но и как система общего контроля деградации РНК. Индукция 2'-5' олигоаденилатами, как аллостерическими эффекторами, активности РНКазы L (741 аминокислота) и образование ее активной димерной формы ведет к расщеплению РНК [Silverman et al, 1996]. Установлено, что

сходные процессы деградации РНК имеют место при противодействии вирусной инфекции и в апоптозе, что связано с экспрессией РНКазы L. Оригинально доказано, что РНКаза L индуцирует апоптоз инфицированных вирусом клеток: если блокировать экспрессию гена этого фермента, то клетки NIH3T3 не отвечают на экзогенный индуктор апоптоза, в то же время такое блокирование не влияет на некроз, индуцированный перекисью водорода [Castelli et al., 1996].

Возможность регуляции уровня экспрессии генов, определяемая тремя основными факторами - скоростью транскрипции, эффективностью трансляции и стабильностью мРНК - вызывает развитие новых направлений биологии, связанных с направленным ингибированием определенных генов. Тонким инструментом в такого рода исследованиях служат синтетические антисмысловые олигодезоксинуклеотиды, связывающие и расщепляющие комплиментарную РНК, что позволяет рассматривать их как синтетические РНКазы [Власов с соавт., 1998]. Описаны принципы эффективного синтеза коньюгатов олигодезоксинуклеотидов с ядерными сигнальными пептидами; показано, что эндогенная ядерная РНКаза Н является важным компонентом, детерминирующим эффективность действия коньюгатов [Reed et al., 1995].

Таким образом, регуляторные функции продуктов деградации нуклеиновых кислот опосредованы ферментами, осуществляющими эту деградацию, в связи с чем во всем мире проводятся интенсивные исследования закономерностей функционирования и выявления разнообразных биологических эффектов данных ферментов.

3. Экзогенные рибонуклеазы как модуляторы клеточных функций

Возобновление интереса к миру РНК в последние годы связано с открытием ряда фундаментальных общебиологических закономерностей. Основополагающая роль РНК как соединения, в процессе эволюции

передавшего белкам свою функцию ферментативного катализа и ДНК -собственную функцию хранения генетической информации, подтверждена экспериментально обнаружением РНКовых вирусных геномов и каталитической функции РНК, а именно спосбности молекул РНК к сайт-специфическому автокаталитическому расщеплению при нейтральных рН и вырезанию интронов из пре-тРНК в физиологических условиях [Guerrier-Tacada et al., 1983; Beaudry, Joyce, 1992; Altman et al., 1995; Liu, Altman, 1995]. Многообразие свойств молекул различных РНК и продуктов их частичной деградации привело к усилению исследовательской активности в области изучения рибонуклеаз. Учитывая также факты необходимости наличия 2'3'-циклофосфата на конце полирибонуклеотидов, являющихся субстратами РНК-лигазы, можно предположить, что истинные (циклизующие) РНКазы участвуют в значительно большем разнообразии биохимических процессов, чем считали раньше [Клесов, 1989; Безбородова, 1991].

Особенно интенсивно изучаются рибонуклеазы, чье действие не ограничивается функциями внутри клетки-продуцента. К наиболее известным ферментам такого рода, влияющим на процессы роста и дифференциации в клетках млекопитающих, относятся ангиогенин человека, ускоряющий образование и рост кровеносных сосудов [Fett et al., 1985; Raines et al., 1995], онконаза ооцитов лягушки Ranapipiens [Ardelt et al., 1991; Mikulski et al, 1995], РНКаза семенников быка [Laccetti et al., 1992; Di Donato et al., 1995], панкреатическая РНКаза человека [D'Alessio, 1993; Ribo et al., 1996].

Полагают, что все РНКазы являются продуктами родственных генов, возникших за счет ряда последовательных дупликаций одного предшествующего гена. Условно, первая дупликация произошла в древнем предшественнике позвоночных. Несекретируемые РНКазы очевидно являются продуктами ветви одного из этих генов. Позднее

дуплицировался второй ген. Одна его ветвь ведет к секретируемым РНКазам млекопитающих, а другая - к панкреатическим рибонуклеазам рептилий и ангиогенину [Beintema et al, 1988].

Изучаемые сегодня биологические эффекты экзогенных рибонуклеаз можно подразделить на несколько основных групп: (1)-противоопухолевые, (2) - антивирусные, (3) -цитотоксические, (4) -стимулирующие.

Лидирующие позиции в первой и второй группах занимает онконаза, пиримидин-специфичная эндорибонуклеаза ооцитов лягушки (предпочтение поли U над поли С, масса около 12кДа, pl=9.4, оптимум рН на РНК 7.0-7.5), прошедшая полностью I и II фазы клинических испытаний как самостоятельный терапевтический агент для пациентов с различными солидными опухолями и проходящая III фазу клинических испытаний против рака печени в комбинации с тамоксифеном [Mikulski et al, 1995; Boque, Wlodawer, 1996]. Вероятно, рибонуклеазы играют немаловажную физиологическую роль в защите хозяина от канцерогенеза и вирусов. Онконаза ингибирует репликацию вируса в клетках, хронически инфицированных HIV-1, без снижения жизнеспособности зараженных клеток. Механизм такого избирательного действия обусловлен деградацией РНК ШУ-1, но не рибосомной или клеточной мРНК. По сравнению с гомологичной панкреатической РНКазой А (РНКаза 1) человека, не обладающей антивирусной активностью и токсичностью, онконаза не чувствительна к белковому ингибитору РНКаз, имеет более низкую ферментативную активность и цитотоксична по отношению к опухолевым клеткам и животным. Каталитическая активность, цитотоксичность и антивирусные свойства онконазы связаны с уникальным N-концом молекулы, несущим пироглутамиловый остаток [Saxena et al, 1991, 1996].

Вторая известная РНКаза с противоопухолевым действием - это рибонуклеаза семенников быка, или BS-РНКаза, единственный естественный димер в семействе РНКаз панкреатического типа [Di Donato et al., 1994]. Для проявления ее биологических эффектов, а именно противоопухолевого, иммуносупрессивного, эмбриотоксического и асперматогенного действия абсолютно необходимой является каталитическая активность, а также обмен N-терминальными доменами между мономерами в димере [Kim et al., 1995(a); Di Donato et al., 1995; Cafaro et al., 1995].

Что касается цитотоксичности, то и онконаза, и BS-РНКаза гораздо более токсичны, чем РНКаза А и мономерная форма BS-РНКазы, поскольку последние легко могут взаимодействовать с цитозольным белком-ингибитором [Kim et al., 1995(6)]. Особо известны в плане токсичности нейротоксины эозинофильных гранул человека: катионные белки ЕСР (pl=ll, молекулярная масса 16-19 кда), являющиеся одновременно гельминтотоксинами и нейротоксинами, и нейротоксины EDN (масса 18-19 кда). Все они обладают рибонуклеазной активностью (часто обозначаются как РНКаза 2 или РНКаза В), являются гликопротеинами и имеют сходные с панкреатическими РНКазами последовательности аминокислот с 3-ей по 65-ую [Безбородова, 1991]. Риботоксины микробного происхождения - митогиллин, а-сарцин и рестриктоцин из Aspergillus энзиматически расщепляют 28S РНК большой субъединицы рибосомы эукариот по единственной фосфодиэфирной связи в последовательности из 14 оснований, универсальной для всех живых организмов [Као, Davis, 1996].

Необычная рибонуклеаза со способностью стимулировать образование кровеносных сосудов - ангиогенин - является щелочным белком с pl=9.5 (масса 14 кДа), гидролизующим 25S и 18S РНК до фрагментов в 100-500

нуклеотидов и проявляющая специфичность к пиримидинам в 5S РНК S.serevisiae и E.coli [Moroianu, Riordan, 1994]. Несмотря на то, что каталитическая активность ангиогенина на 4-6 порядков ниже, чем панкреатической РНКазы А, она существенна для индукции роста кровеносных сосудов [Acharya, 1996; Russo et al, 1996]. Ангиогенин сильнее, чем РНКаза А, связывается с белковым ингибитором РНКаз из плаценты человека, что свидетельствует о критической роли ингибитора в физиологическом контроле действия ангиогенина [Lee, Vallee, 1993]. Ангиогенин - первая мономерная РНКаза, проявляющая иммуносупрессивные свойства так же, как и димерная РНКаза BS. Он подавляет пролиферацию стимулированных фитоагглютинином или конканвалином А лимфоцитов человека, но не влияет на рост линий опухолевых клеток человека, развитие эмбрионов мыши и сперматогенез [Matousek et al, 1995].

Среди белков-лектинов, являющихся известными эффекторами, взаимодействующими с углеводными антеннами клеточной поверхности, обнаружены сиалосвязывающие лектины икры лягушек Rana castesbeiana и Rana japónica, обладающие РНКазной активностью. Этим соединениям, названным лекзимами, присуща заметная гомология с панкреатическими рибонуклеазами, при этом они характеризуются специфичностью в связывании углеводов (присоединяются к сиаловой кислоте) и субстратной специфичностью фермента. Установлено, что лекзимы ингибируют рост ряда опухолей in vitro и in vivo, вызывая функциональные изменения сигнальной системы. После интернализации лекзима клеткой регистрируется возрастание уровня деградации не только РНК, но и ДНК, что служит индуктором апоптоза [Nitta et al, 1996].

Необходимо обратить внимание на тот факт, что внеклеточные рибонуклеазы микробного происхождения, объединенные Хартли [Hartley, 1980] в один обширный класс, также обладают широким спектром

биологической активности. При экспрессии рибонуклеаз Aspergillus orysae (РНКаза Tl), Bacillus amyloliquefaciens (РНКаза Ва, или барназа), Streptomyces aureofaciens (РНКаза Sa) в E.coli все они проявляют токсичность из-за отсутствия в клетках E.coli природного белкового ингибитора, разрешающего синтез рибонуклеазы в клетке продуцента без проявления ее токсического действия [Herbert et al., 1997].

Для РНКазы Bacillus intermedins (РНКаза Bi, или биназа) показано, что ее токсический эффект in vivo был выше, чем у РНКазы А [Алексеева с соавт., 1981; Куриненко с соавт., 1989(a)]. Исходя из установленных данных по антивирусному эффекту панкреатических РНКаз в отношении вируса гриппа и клещевого энцефалита [Салганик с соавт., 1972], было экспериментально подтверждено противовирусное действие бактериальных рибонуклеаз в отношении возбудителей гриппа, бешенства, чумы птиц и пр. [Индулен с соавт., 1989; Лещинская с соавт.,

1991]. В отличии от токсического и противовирусного действия, ряд стимулирующих эффектов биназы не зависел впрямую от каталитической активности фермента. Активация реакций клеточного и гуморального иммунитета, факторов неспецифической резистентности, стимуляция элементов лимфо- и гемопоэза вызывались фотоинактивированной биназой, утратившей каталитическую активность [Нехорошкова с соавт.,

1992]. Аналогичные закономерности были выявлены и при карцинолитическом и карциностатическом действии фермента в отношении асцитной формы карциномы Эрлиха и лимфолейкоза NKLy [Куриненко с соавт., 1988]. Стимулирующее рост и размножение дрожжей влияние экзогенных биназы и барназы также отчасти сохранялось и при использовании инактивированных ферментов [Колпаков, Куприянова, 1992]. Однако, эффект расщепления рРНК и подавления белкового синтеза в малигнезированных клетках под действием РНКазы BS не проявлялся

при использовании каталитически неактивного фермента [Mastronicola et al, 1995].

Открытием последних лет стало обнаружение рибонуклеазной активности ЕО, структурного гликопротеина оболочки вируса лихорадки свиней. Установлено, что антитела, эффективно блокирующие заражение клеток, подавляли и активность РНКазы ЕО. что свидетельствует о ее роли в жизненном цикле вируса [Schneider, 1996]. Белок оболочки вируса бычьей диарреи и лихорадки свиней E-rns оказался РНКазой, проявляющей иммуносупрессивные свойства, блокирующей синтез белка в лимфоцитах различных видов без нарушения целостности мембран и индуцировавшей апоптоз [Bruschke et al, 1997].

Исходя из вышеизложенного, представляется особенно важным определить ключевые этапы взаимодействия экзогенной РНКазы с клеткой-мишенью. Ряд авторов отмечают различную чувствительность клеток-мишеней к действию РНКаз, что подразумевает наличие индивидуальных особенностей в процессах взаимодействия клетки с РНКазой [Куриненко с соавт, 1988; Nitta et al, 1996]. В частности, РНКаза В (13кда), содержащая единственный гликан с высоким содержанием маннозы, не поглощается гепатоцитами, но быстро поглощается непаренхимными клетками печени [Tolleshaug et al, 1984]. Сильно варьирует способность РНКаз связываться с определенными клетками организма: ангиогенин предпочтительно действует на эндотелиальные клетки, онконаза - на клетки почек [Vasandani et al, 1996]. В то же время рибонуклеазы не проявляют выраженной геномной специфичности в отношении РНК- и ДНК-геномных вирусов. Предполагается, что в основе такого действия возможно лежат неспецифические механизмы, обусловленные подавлением адсорбции, либо пенетрации вирусов в клетку [Лещинская с соавт, 1991].

Несомненна ведущая роль клеточной оболочки как фактора, определяющего общие и частные позиции во взаимоотношениях рибонуклеазы-эффектора и клетки-мишени. Например, искусственно введенная внутрь клетки РНКаза А в тысячу раз более токсична, чем данная вне клетки, что говорит о доминирующей роли этапа интернализации в проявлении цитотоксичности [Wu et al., 1995]. РНКаза BS связывается с большим количеством участков экстрацеллюлярного матрикса раковых клеток-мишеней, растущих в монослое, тогда как другие гомологичные рибонуклеазы, включая мономерную форму РНКазы BS, не обладают этим свойством. Гораздо хуже происходит связывание и димера РНКазы BS в случае, если опухолевые клетки растут в суспензии. Фермент также взаимодействует с нормальными клетками, но не влияет в них на стабильность РНК и синтез белка [Mastronicola et al., 1995]. Интернализация РНКазы BS, вероятно, происходит адсорбционным путем, а не рецептор-опосредованным эндоцитозом [Kim et al., 1995(6)]. Однако для проникновения РНКазы А в лизосомы требуется некий чувствительный к протеазе компонент (белок-рецептор) в мембране лизосом [Cuervo et al., 1994]. Транспорт РНКазы А в лизосомы активируется АТФ и белком теплового шока массой 73кда [Olson et al., 1991].

Активирующее рост и размножение действие рибонуклеаз было неизбирательно для различных групп микроорганизмов - дрожжей, клубеньковых бактерий, олиготрофных микроорганизмов [Колпаков, Куприянова, 1992; Егоров с соавт., 1994; Наумова с соавт., 1997]. При взаимодействии бактериальной рибонуклеазы с клетками микроорганизмов установлено, что она связывается с определенными зонами внешней мембраны грамотрицательных бактерий и проходит клеточную стенку дрожжей, сорбируясь на цитоплазматической мембране [Егоров, 1996, 1997].

Известно, что РНК присутствует в мембране как интегральный компонент и как структурная часть мембраносвязанных рибосом. В обзоре Мойер [1979] указано, что связывание рибосом посредством ассоциации мембраносвязанной и рРНК, стабилизация мРНК мембраной, трансляция мРНК на мембраносвязанных рибосомах, связывание с мембраной РНК-праймера для синтеза ДНК, компартментализация матричной РНК для РНК-зависимого синтеза ДНК или РНК, и мембраносвязанные функции тРНК - это процессы, где необходимым условием является присутствие РНК в мембране. Многие процессы, связанные с клеточной дифференциацией, могут касаться мембраноассоциированной РНК. РНК на внешней мембране может играть роль в процессах узнавания клеток, информационного обмена, биосинтеза клеточной стенки. Возможно, взаимодействие фермента со своим субстратом в мембране вносит свой вклад во взаимодействие лиганда - РНКазы - с поверхностью клетки, придавая ему определенную специфику.

Широкий спектр данных литературы, свидетельствующий о значительном интересе к проблемам эффекторного действия рибонуклеаз, позволяет сделать следующее резюме.

♦ Один и тот же эффектор в зависимости от концентрации и условий аппликации вызывает различные типы клеточного ответа. Активирующие дозы экзогенных эффекторов обычно ниже, чем токсические. В промежуточном интервале доз происходят изменения гомеостаза клетки, зачастую не проявляющиеся фенотипически. В механизме действия экзогенных эффекторов - рибонуклеаз - имеют место неспецифические адсорбционные взаимодействия с клеточной поверхностью и мембраной наряду со специфическим связыванием как с белковыми рецепторами, так и с углеводными компонентами внешней оболочки (экстрацеллюлярного матрикса). Следующим

этапом является интернализация РНКаз клетками животных и человека, сопровождающаяся ферментативным действием по отношению к субстрату - клеточной либо вирусной РНК, и приводящая к токсическим эффектам. Интернализация РНКаз различными клетками животных, а также поглощение их клетками микроорганизмов определяются индивидуальными особенностями клеток. Процесс действия рибонуклеаз на клетку может ограничиваться первым этапом, что также будет вызывать определенные эффекты за счет индукции изменений сигнальной системы клетки. Оценка роли каталитических/некаталитических взаимодействий в индукции клеточного ответа требует дополнительных экспериментальных исследований, как и выяснение регуляторных возможностей образующихся при ферментативном гидролизе олиго- и мононуклеотидов. Несмотря на высокую гомологию и консервативность внеклеточных РНКаз, им присущи тонкие индивидуальные различия в механизмах действия и особенности проявления индуцированных эффектов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Материалы

В работе использованы нативная и мутантные рибонуклеазы семейства микробных гуанилспецифичных РНКаз, катализирующих эндонуклеолитическое расщепление одноцепочечной РНК в двустадийной реакции, включающей трансэтерификацию с образованием 2'3'-циклофосфата и его последующий гидролиз с образованием 3'-фосфата. Секретируемая рибонуклеаза Bacillus intermedius - биназа - (молекулярная масса 12300 Да; pl=9,5; максимальная активность 14 106 Ед/мг при рН=8,5) изолирована из культуральной жидкости и очищена до гомогенного состояния по методу, описанному Макаровым [Makarov et al., 1993]. Энзиматические и физико-химические свойства фермента описаны Голубенко [Голубенко с соавт., 1979] и Балабан [Balaban et al., 1989]. Мутантные формы фермента, полученные методом сайт-специфического мутагенеза [Jones, Howard, 1990], выделены Л.В.Кипенской (Казанский государственный университет) и очищены в лаборатории Г.И.Яковлева (Институт молекулярной биологии, Москва) [Yakovlev et al., 1994]. Аналогично была выделена РНКаза Bacillus amyloliquefaciens (барназа), имеющая 84% гомологии с биназой в первичной структуре, идентичную вторичную и третичную структуры и примерно одинаковое количество заряженных остатков [Hartley, 1989]. Биназа и барназа - одноцепочечные глобулярные белки без дисульфидных связей, состоящие соответственно из 109 и 110 аминокислотных остатков [Aphanasenko et al., 1979; Hartley and Barker, 1972]. Инактивированная фотоокислением His101 в активном центре биназа [Куриненко с соавт., 1986] была предоставлена Б.М.Куриненко (Казанский государственный университет). Для инактивации биназы также

использовали естественный белковый ингибитор барназы - барстар (89 аминокислотных остатков) [Guillet et al, 1993], предоставленный Г.И.Яковлевым. Реакцию инактивации проводили в дистиллированой воде в течение 12ч при соотношении белков 1:1. Использованные рибонуклеазы представлены в табл. 1.

2. Методы определения жизнеспособности и функциональной активности

2.1. Параметры роста микроорганизмов

Измеряя оптическую плотность растущей микробной культуры, или число колоний на твердой питательной среде, либо подсчитывая под микроскопом количество жизнеспособных клеток, окрашенных метиленовым синим, рассчитывали выживаемость (%) обработанных исследуемым веществом микроорганизмов по сравнению с контрольным вариантом без обработки. Общую биомассу микромицетов определяли по весу сухого материала, а при росте на среде с нерастворимым субстратом (целлюлозой) - учитывая разницу в удельном содержании общего азота в субстрате и микробной биомассе [Горкина с соавт, 1982] Удельную скорость роста и время удвоения клеток рассчитывали стандартными методами. Для приготовления сред использовали отечественные реактивы высокой степени очистки. Для дестабилизации мембран использовали неионогенное поверхностно активное вещество - синтанол, продукт оксиэтилирования 1моля синтетических жирных спиртов фракции Сю-С^ 10 молями окиси этилена, производства АО "Оргсинтез", г.Казань.

2.2. Дыхание целых клеток и изолированных митохондрий

Скорость дыхания клеток дрожжей Candida valida BKMY-2328 и митохондрий целлюлолитического гриба Aspergillus fumigatus - F316

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Ильинская, Ольга Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Экзогенная рибонуклеаза в малых дозах порядка 10"6 - 10"4 мг/мл вызывает стимуляцию процессов жизнедеятельности грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, а также низших эукариот, проявляющуюся в увеличении количества клеточной биомассы, скорости роста, процесса дыхания целых клеток и изолированных митохондрий, а также активности сукцинатдегидрогеназы.

2. Рибонуклеаза в микроконцентрациях обладает свойствами репарационного биоантимутагена в бактериальных тест-ситемах, снижая число индуцированных ревертантов Salmonella thyphimurium в тесте Эймса и уменьшая величину фактора индукции стандартного мутагена в SOS-хромотесте после предварительной инкубации клеток тестерных штаммов с рибонуклеазой.

3. РНКаза изменяет свойства клеточной поверхности, в стимулирующих дозах повышая электрофоретическую подвижность микроорганизмов, индуцируя выход из клеток ионов электролитов, изменяя секрецию протеолитических ферментов и ферментов целлюлазного комплекса.

4. Основной вклад в активацию жизнедеятельности микробных клеток вносит каталитическая активность экзогенных РНКаз, связанная с расщеплением мембраноассоциированного субстрата - РНК - и освобождением продуктов гидролиза - олигонуклеотидов, выполняющих регуляторную функцию.

5. В области высоких концентраций (0.1 - 10 мг/мл) бактериальная рибонуклеаза проявляет токсическое действие, угнетая рост микроорганизмов, уменьшая выживаемость и вызывая морфологические изменения глаз плодовой мушки дрозофилы, ингибируя рост культур клеток фибробластов мыши, куриного эмбриона и эпителиальноподобных клеток карциномы легких человека. РНКаза демонстрирует возможность избирательного подавления роста клеточных культур, экспрессирующих гаэ-онкоген, за счет блокирования специфического Са -зависимого калиевого тока. В системе изолированно перфузированной почки крыс РНКаза обладает нефротоксическим эффектом.

6. Рибонуклеаза в высоких концентрациях является мутагеном, инициирующим повреждения ДНК, включение 808-ответа и повышение числа ревертантов в тестах с использованием микроорганизмов. На уровне эукариотического организма рибонуклеаза вызывает индукцию генных мутаций у йгозоркИа, образование микроядер в эритроцитах периферической крови мышей, усиление репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах крови человека. В культуре клеток человека РНКаза продуцирует характерную микрофрагментацию ДНК, являющуюся ранним маркером апоптоза.

7. Токсические и генотоксические свойства РНКазы прямо коррелируют с величиной каталитической активности фермента.

8. Механизмы полифункциональных эффектов экзогенной бактериальной рибонуклеазы нашли отражение в принципиальной схеме, включающей следующие ключевые этапы: ассоциация экзогенной РНКазы с условным рецепторным участком клеточной поверхности; образование регуляторных метаболитов - продуктов ферментативного гидролиза мембраноассоциированной РНК; активация стимулирующего сигнала к изменению экспрессии генов; клеточный ответ. Переключение клеточного ответа с активационного на ингибиторный обусловлено триггерным механизмом, чувствительным к повреждению ДНК.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Ильинская, Ольга Николаевна, 1998 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Акоев И.Г. Биофизика познает рак. М.: Наука, 1988. - 160с.

2. Алексеева И.И., Куриненко Б.М., Пензикова Г.А. и др. Сравнительное изучение противовирусной активности панкреатической и микробной РНКаз // Антибиот. и мед. технол., 1981. - Т.26,№7. - С.527-532

3. Астапович Н.И. Нуклеотидный фонд и метаболизм микробной клетки. Минск: Наука и техника, 1979. - 152с.

4. Ашмарин И.П., Стукалов П.В. (ред.) Нейрохимия. М.:НИИ биомед. хим. РАМН, 1996. - С.244-371

5. Безбородова С.И. Рибонуклеазы и родственные им белки, а также ингибиторы рибонуклеаз белковой природы // Прикл. биохим. микробиол., 1991. - Т.27, №3. - С.308-329

6. Беляева М.И., Куприянова Ф.Г., Ульянова М.Н. Влияние нуклеазы Serratia marcescens на размножение Candida tropicalis II Микробиология, 1977.-Т.46, №2.-С.300-304

7. Большакова И.В., Лозовская Е.Л., Сапетинский И.И. Антиоксидантные свойства ряда экстрактов лекарственных растений // Биофизика, 1997.-Т.42,№2. - С.480-483

8. Болдырев A.A. Регуляция активности мембранных ферментов // СОЖ, 1997. - №6. - С.21-27.

9. Васильев Ю.М. Социальное поведение нормальных клеток // СОЖ, 1997. - №4.-С. 17-22.

10. Власов В.В., Сальников В.Н., Зенкова М.А. Химические рибонуклеазы // Молк, биол., 1998.-Т.32,№1.-С.61-70

П.Герхардт Ф., Мюррей Р.Г.Е., Костилов Р.Н. и др. Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1984.-Т.З.-С.124-125

12. Голубенко И.А, Балабан Н.П, Лещинская И.Б. и др. Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р: очистка хромотографией на фосфоцеллюлозе и некоторые свойства гомогенного фермента // Биохимия, 1979.-Т.44.-С.640-648

13. Горбатенко И.Ю. Сверхмалые дозы биологически активных веществ и перспективы их использования // Изв. РАН, сер. Биол, 1997.-№1.-107-110

14. Горкина Н.Б, Гуревич Г.А, Фихте Б.А. Количественное определение биомассы целлюлолитического гриба Aspergillus terreus 17Р в смеси с нерастворимым целлюлолзосодержащим субстратом // Прикл. биохим. микробиол, 1982.-Т.28,№.4.-С.567-572

15. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М, Мир, 1982. - 310с.

16. Дильман В.М. Эндокринологическая онкология. Л.: Медицина, 1974. -399с.

17. Дубатолова Т.Д., Дужак А.Б, Костомаха А.Н и др. Целесообразность оценки мутагенной активности природных индукторов интерферона на основе дсРНК //Биотехнология, 1989. - Т.5,№3. - С.381-383

18. Дубинина Л.Г, Курашова З.И, Сергиевская С.П. Влияние предобработки немутагенными дозами этиленамина на мутагенез в клетках Crepis capillaris //Генетика, 1986. - Т.22,№12. - С.2805-2812

19. Дурнев А.Д, Середенин С.Б. Фармакологические аспекты антимутагенеза / Докл.межд.симпоз."Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека", Москва, 18-21 окт.1994.-С.147--178

20. Егоров С.Ю, Куприянова-Ашина Ф.Г, Никитин Д.И. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на размножение олиготрофных микроорганизмов // Микробиология, 1994. - Т.64,№1. -С.38-42

21. Егоров С.Ю, Дмитриев В.В, Наумова Э.С, Куприянова-Ашина Ф.Г. Иммуноцитохимическое исследование проникновения рибонуклеазы

Bacillus intermedius в клетки Candida utilis и влияния фермента на рост дрожжей // Цитология, 1996. - Т.38,№1. - С.66-69

22. Егоров С.Ю., Улахович С.В., Куприянова-Ашина Ф.Г. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на рост Escherichia coli / Тез. Докл. 2 съезд. Биохим. об-ва.РАН, М., 1997. - С.96

23. Засухина Г.Д. Мутагенез и репарация в системе вирус-клетка. М.: Наука, 1983.-С.7-14

24. Иванов А.Ю., Фомченков В.М. Зависимость повреждающего действия ПАВ на клетку Escherichia coli в зависимости от фазы роста культуры // Микробиология, 1989. - Т.58,№6. - С.969-975

25. Индулен М.К., Дзегузе Д.Р., Замятина Н.А. Изучение противовирусной активности бактериальной рибонуклеазы.В сб.: Нуклеазы.Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова думка, 1989. - С.42-46

26. Кефели В.Н. Витамины и некоторые другие представители негормональных регуляторов роста растений (обзор) // Прикл. биохим. микробиол., 1981. - Т.17б,№1. - С.5-22

27. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназ // Прикл. биохим. микробиол., 1971. -Т.17,№>2. - С.225-228

28. Клесов А.А. Какие новые направления биохимиии энзимологии представляются наиболее иноересными // Журнал всесоюз. хим. общ. им. Менделеева, 1989.-Т.34, №1.-С.90-105

29. Клесов А.А., Рабинович M.JL, Синицын А.П. и др. Ферментативный гидролиз целлюлозы // Биоорг. Хим., 1980. -Т.6,№8. - С. 1225-1234

30. Ковалев В.А. Роль фитогормонов во взаимоотношениях высших растений и микроорганизмов // Изв. АН Молд.ССР, сер. Биол., 1983. -№2. -С.13-18

31. Колпаков А.И. влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей рода Candida. Дисс. канд.биол.наук. Казань, КГУ, 1993. - 167с.

32. Колпаков А.И, Куприянова Ф.Г. Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей Candida tropicalis II Микробиология, 1992.-Т.61, №6.-С.969-974

33. Колпаков А.И, Куприянова-Ашина Ф.Г, Горская Е.М. Изменение некоторых свойств лактобацилл под действием рибонуклеазы // Антибиот. хемотерап, 1996. - Т.41,№10. - С.16-18

34. Конев С.В. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы. Минск.: Наука и техника, 1985. - 345с.

35. Конобеева Г.И. Мутагенная активность оегуляторов роста растений в соматических клетках млекопитающих // Биол. ж. Армении, 1987. -Т.40,№7.- С.600-602

36. Королев Н.П. Функции лектинов в клетках // Итоги науки и техники. Общие проблемы физ-хим. биол, М, 1984. - Т.1. - С.23-114

37. Кривченкова P.C. Определение активности сукцианатдегидрогеназы в суспензии митохондрий. В кн.:"Современные методы в биохимии" ред. Орехович В.Н, М.: Медицина, 1987.-С.44-46

38. Кулаев И.С, Северин А.И, Абрамочкин Г.В. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине //Вестник АМН СССР, 1984. - №8. - С.64-69

39. Кулинский В.И. Лекционные таблицы по биохимии. Иркутск: Иркут. мед. инст, 1994. - №4: Биохимия регуляций. - 94с.

40. Куприянов-Ашин Э.Г, Куриненко Б.М, Поцелуева Л.А, Заиконникова И.В. Фармакокинетика панкреатической и микробной РНКаз // Хим.-фармац. жур, 1988.- Т.10.-С. 1165-1171

41. Куприянова-Ашина Ф.Г. Нуклеазы как стимуляторы размножения микроорганизмов / Матер.итог.науч.конф.Казан.ун-та за 1987г. Естеств.и точн.науки. -Казань, 1989.-С.105-108

42. Куприянова-Ашина Ф.Г. Влияние дезоксирибонуклеаз на синтез ДНК, рост и деление колеток микроорганизмов. Изд.КГУ, Казань, 1992. - 150с.

43. Куприянова-Ашина Ф.Г., Колпаков А.И., Егоров С,Ю. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на размножение дрожжей Candida tropicalis II Биол. Науки, 1992. - №4. - С.90-99

44. Куриненко Б.М., Голубенко И.А., Булгакова Р.Ш и др. Фотоокисление рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р и получение фотоокисленного препарата фермента // Биоорг. хим., 1986.-Т.12.-С.457-465

45. Куриненко Б.М., Собчук Л.И., Хайбуллина С.А., Карпова С.И. Противоопухолевая активность рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р II Эксперимент, онкология, 1988.-Т.6.-С.54-57

46. Куриненко Б.М., Сергеева Е.В., Собчук Л.И. и др. (а). Изучение токсичности РНКазы Bacillus intermedius in vitro и in vivo // Антибиот. хемиотерап., 1989.-Т.34.-С.266-270

47. Куриненко Б.М., Давыдов Р.Э., Собчук Л.И. и др. (б). Влияние производных бактериальной рибонуклеазы на выход ионов калия из клеток саркомы 37 / Тез. Докл. Межреспубл. Совещ. "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование", Рига, 29.11.-1.12. 1989. - С.74

48. Куриненко Б.М., Чертищев В.В. Исследование взаимодействия РНКазы В.intermedius с бислойными липидными мембранами / Тез. Докл. Межреспубл. Совещ. "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование", Рига, 29.11.-1.12. 1989. - С.23

49. Лещинская И.Б. Нуклеодеполимеразы сапрофитных бактерий. Изд-во Казанского государственного университета, 1975.-180с.

50. Лещинская И.Б, Варламов В.П, Куриненко Б.М. Нуклеазы бактерий. Ред.Румянцева О.Н. Изд.КГУ, Казань, 1991.- 271с.

51.Лукаткин A.C., ШаркееваЭ.Ш, Заурелов O.A. Динамика изменений экзоосмоса электролитов из листьев кукурузы при различной интенсивности холодового стресса // Физиол. Раст, 1993. - Т.40,№5. - С. 770-775

52. Льюин Б. Гены. М.:Мир, 1987. - 544с.

53. Лямин М.Я, Соловьев A.A., Зайцев С.И. и др. Новая крупномасштабная биотехнология в производстве пищевой добавки СПЛАТ; концепция здорового образа жизни / Докл. VIII конф. "Новые направления биотехнологии", Москва, 27-29 апр. 1998г. - С.83

54. Мацука Г.Х, Ткачук З.Ю, Козлов A.B., Михайлопуло H.A. Возможности использования 2-5 олигоаденилатов как потенциальных фармакологических препаратов / Докл. VIII конф. "Новые направления биотехнологии", Москва, 27-29апр. 1998г. - С.84-85

55. Мезинова Л.Г. Влияние детергентов на панкреатическую рибонуклеазу // Укр. биохим. ж, 1979.-Т.51 ,№3 .-С.259-262

56. Мельникова A.M., Калер Г.В, Бабич Г.В. и др. Разнонаправленное действие низких и высоких доз озона на репродуктивную способность и активность дыхания дрожжевых клеток Candida utilis II Ж. общ. биол, 1989.-Т.50,№6.-С.815-818

57. МЗ СССР. Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому испытанию новых лекарственных средств, М, 1982. - С.21-59

58. МЗ СССР. Оценка мутагенной активности новых лекарственных средств (Методические рекомендации), М.,1991. - 88с.

59. Наумова Э.С., Козлова О.В., Егоров С.Ю. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на жизнедеятельность Rizobium meliloti В сб.: Проблемы общей биологии и прикладной экологии, Саратов, 1997. - С.51-56

60. НехорошковаЗ.М., Цыплаков Д.Э., Цыплакова A.B., Куриненко Б.М. Гистологическая оценка влияния РНКазы Bacillus intermedius на органы иммуногенеза лабораторных животных // Биол.науки, 1992, -№.4. - С.80-86

61.0притов В.А., Пятыгин С.С., Ретивин В.Г. Биоэлектрогенез у высших растений. М.: Наука, 1991.- 214с.

62. Плутахин Г.А., Новиков Б.Н., Бибишев В.А., Плотников В.К. К вопросу о роли рибонуклеаз в регуляции активности генов / Тез.докл.2 Всесоюз. совещ. "Генетика развития", Ташкент, 29-31 авг. 1990. - С. 138-139.

63. Полевой В.В. Роль ауксина в системах регуляции у растений. 44-е Тимирязевское чтение. JL: Наука, 1986. - 80с.

64. Порошенко Г.Г., Абилев С.К. Антропогенные мутагены и природные антимутагены // Итоги науки и техники ВИНИТИ, общ.генетика. 1988. -Т.12. - С.5-208

65. Раппопорт и.А., Шигаева М.Х., Ахматуллина Н.Б. Химический мутагенез (проблемы и перспективы). Алма-Ата: Наука КазССР, 1980. - 320с.

66. Русина О.Ю., Андреева И.В., Тиганова И.Т. и др. Зависимость УФ-индукции точечного исключения транспозонов от функций генов umuDC, lexA, гесА и плазмиды pKMIOl //Генетика, 1997.-№1.-С.З-7

67. Салганик Р.И., Трухачев А.А„ Баталина Т.А. Противовирусное действие дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы. В сб.: Ингибиторы вирусной активности, Рига, 1972. - С. 147-152

68. Серебрякова И.В., Фомина М.М., Порошенко Г.Г. К вопросу об адаптации к химическим мутагенам // Изв.РАН, сер.Биол., 1992. - №5. -С.778-783

69. Скрябин Г.К, Кулаев И.С. Лизоамидаза - вызов микробам // Наука в СССР, 1990. -№2.-С.52-53

70. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989. -564с.

71. Соттоказа Д. Выделение митохондрий и митохондриальных мембран. В кн. ¡"Биохимическое исследование мембран" ред. Мэдди Д, М, Мир, 1979.-С.55-74

72. Стейниер Р, Эдельберг Э, Ингрэм Д. Мир микробов. М.: Мир, 1979. -Т.З. - С.365-378

73. Тарасов В.А. Принципы качественной и количественной оценки генетической опасности химических веществ / Докл. межд. симпоз. "Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека", Москва, 18-21 окт.1994. - С.3-66

74. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов // Физиология растений, 1992. - Т.39, №6. - С. 1235-1223

75. Улахович С.В, Егоров С.Ю, Куприянова-Ашина Ф.Г. Влияние рибонуклеаз микробного происхождения на клетки Escherichia coli. В сб.: Проблемы общей биологии и прикладной экологии, изд. Саратовск. унта, Саратов, 1997. - С.56-61

76. Филимонова М.В. Биологически активные вещества рода ботридис // Прикл. биохим. микробиол, 1985.-Т.21,№6.-С.707-713

77. Фоменко Д.Э, Метлицкая А.З, Катруха Г.С. и др. Новые пептидные антибиотики - микроцины: структура, генетические детерминанты синтеза, перспективы применения / Докл. VIII конф. "Новые направления биотехнологии", Москва, 27-29 апр. 1998г. - С.69

78. Фролькис В.В. Физиологические механизмы старения. Л.: Наука, 1982. -С. 187-227

79. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М.:Наука, 1988.-269с.

80. Худолей В.В. Методы регистрации и процедура тестирования загрязнителей среды на канцерогенность в хронических экспериментах на лабораторных животных: протокол, возможности, ограничения, перспективы / Докл. межд. симпоз. "Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека", Москва, 18-21 окт.1994. - С.67-86

81. Худолей В.В., Белицкий Г.И. Еще раз о проблемах скрининга канцерогенов для человека: ответ оппонентам // Вопросы онкологии, 1988. - Т.34,№8. - С.955-959

82. Чеботарев А.Н., Нуштаева Т.И. Стимуляция роста Saccharomyces carlsbergensis в присутствии мелкодисперсного металлического железа // Микробиология, 1990. - Т.59,№1. - С.59-62

83. Шлегель Г. Микробиология. М.:Мир, 1987.-566с.

84. Эль-Регистан Г.И., Цышнатий Г.В., Дуда В.И. и др. Регуляция роста и развития Pseudomonas carboxydoflava специфическими эндогенными факторами // Микробиология, 1980. - Т.49,№4. - С.561-565

85. Ющенко Ю.А., Колонцев A.A., Шубина Н.Т. и др. Активация протеиназ и кислой фосфатазы в лейкоцитах свиньи, инфицированных вирусом классический чумы свиней // Молек. генет. микробиол. вирусол., 1997.-№3.-С.20-28

86. Янопольская Н.Д., Деборин Г.А. Проницаемость биологических и модельных мембран для белков // Успехи биол. хим., 1983. - Т.23. - С.24-38

87. Яковлева Е.П., АлексееваЛ.Е., Кузнецова О.С. и др. Природа стимулирующих веществ, содержащихся в продуктах жизнедеятельности дрожжеподобных грибов // Микробиология, 1986.-Т.55, №2.-С. 198-204

th

88. Acharya R.K. X-ray structure of angiogenin / Absr. 4 Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S6L1

89. Alberts B, Bray D. Lewis J, Raff M. et al. (Eds.) Molecular biology of the cell. 2nd ed. Garland Publishing, Inc., 1989. - 1218p.

90. Altman S, Kirsenbom L, Talbot S. Recent studies of RNase P. In: tRNA: Structure, Biosynthesis and Function, eds. Soll D. and Rajbhandary U, 1995.

- P.67-78

91. Amory D.E., Rouxhet P.G. Surface properties of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces carlbergensis: chemical composition, electrostatic charge and hydrophobicity // Biochem. Biophys. Acta, 1988. - V.938. - P.61-70

92. Amory D.E., Mozes N, Hermesse M.P. et al. Chemical analysis of the surface of microorganisms by x-ray photoelectron spectroscopy // FEMS Microbiol. Lett, 1988. -V.49. - P.107-110

93. Anderson R.D, Berger N.A. Mutagenicity and cancerogenicity of topoisomerase-interactive agents // Mut. Res, 1994. - V.309. - P.109-114

94. Anderson G.M, Hall L.M, Hörne W.C, Yang J.X. Adenosine diphosphate inhibits the serotonin transporter // Biochem. Biophys. Acta. Biomembranes, 1996. - V.1283,N1. - P.14-20

95. Anfinsen C.B, Reofield R.P, Choate W.L. et al. (1954) Studies of the gross structure, cross-linkages and terminal sequences in ribonuclease // J. Biol. Chem, 1954. - V.207. - P.201-210

96. Aphanasenko G.A, Dudkin S.M, Kaminir L.B. et al. Primary structure of ribonuclease from Bacillus intermedius II FEBS Letters, 1979. - V.97. - P.77-79

97. Ardelt W, Mikulski S.M, Shogen K. Amino acid sequence of an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos // J. Biol. Chem, 1991.

- V.266. -P.245-251

98. Ashby J., Paton D. The influence of chemical structure on the extent and sites of cancerogenesis for 522 rodent carcinogens and 55 different human carcinogen exposures // Mut. Res., 1993. - V.286. - P.3-74

99. Ashby J., Tennant R.W. Definitive relationships among chemical structure, carcinogenicity and mutagenisity for 301 chemicals tested by the US NTP // Mut. Res., 1991. - V.257. - P.229-306

100.Bacun-Druzina V., Babic K., Franckic J., Alacevic M. Indukcia gena aidB b bacteriji Salmonella thyphimurium pod djelovanijem monofunkcionalnog metilirajaceg sredstva / Zb.sazet.priopcen.5 Kongr.biol.Hrv., Pula, 3-7 okt.1994. - Zagreb, 1994.- P.71-72

101.Bailleul B., Brown K., Ramsden M. Chemical induction of oncogene mutation and growth factor activity in mouse skin cancerogenesis // Environ. Heals Perspect, 1989. - V.81. - P.23-27

102.Balaban N.P., Scharipova F.R., Golubenko I.A.. et al. Physico-chemical characteristics of ribonuclease Bacillus intermedius. / Proceedings of the first International Meeting "Structure and chemistry of ribonucleases", Moscow, 28 Nov.-2 Dec. 1988. M., 1989. - P.349-352

103.Bandziulis R., Swanson M., Dreyfuss G. RNA-binding proteins as developmental regulators // Genes and Dev., 1989. - V.3,N4. - P.431-437

104.Barbacid M. Ras genes //Annu.Rev.Biochem., 1987. - V.56. - P.779-827

105.Barret J.C. Mechanisms of multistep cancerogenesis and carcinogen risk assessment // Environ. Heals Perspect., 1993. - V.100. - P.9-20

106.Barry M.A., Eastman A. Identification of deoxyribomuclease II as an endonuclease involved in apoptosis // Arch. Biochem. Biophys., 1993. -V.300. - P.440-450

107.Baskaran R., Wood L.D., Whitaker L.L. et al. Ataxia teleagiectasia mutant protein activates c-Abl tyrosine kinase in response to ionizing radiation // Natur, 1997. - V.387. - P.516-519

108.Baudet S, Janin J. The crystal structure of a barnase-d(GpC) complex at 1..9A resolution // J. Molec. Biol, 1991. - V.219. - P.123-132

109.Beaudry A.A, Joyce G.F. Directed evolution of an RNA enzyme // Science, 1992. - Y.257. - P.635-638

110.Beintema J J, Schuller C, Irie M, Carsana A. Molecular evolution of the ribonuclease superfamily // Progr. Biophys. Mol. Biol, 1988. - V.51. - P.647-806

111 .Bekersky I. Use of the isolated perfused kidney as a tool in drug disposition studies // Drug Metab. Rev, 1983. - V. 14. - P.931-960

112.Benner S.A. Extracellular 'communicator RNA' // FEBS Lett, 1988. - V.233. - P.225-228

113.Booth I.R, Kroll R.G. Regulation of cytoplasmic pH (pHi) in bacteria and its relationship to metabolism // Biochem. Soc. Transactions, 1983. - V.11,N1. -P.70-72

114.Borenfreund E, Babich h, Martin-Alguacil N. Comparison of two in vitro cytotoxicity assays - the neutral red and tetrazolium MTT test // Toxic, in vitro, 1988. - V.2,Nl.-P.l-6

115.Boque L, Wlodawer A. Of frogs and men: attempts to humanize onkonase / Absr. 4th Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S3L5

116.Bourne H.R. The arginine finger strikes again // Nature, 1997. - V.389. - P. 673-674

117.Boym A. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review // Lymphology, 1977. - V.10. - P.71-76

118.Brown L, McCarthy N. A sense-abl response? // Nature, 1997. - V.387. -P.450-451

119.Bruschke C.J.M, Hulst M.M, Moormann R.J.M. et al. Glycoprotein E-rns of pestiviruses induces apoptosis in lymphocytes of several species // J. Virol, 1997. -V.71.-P. 6692-6696

120.Burkhart J.G., Mailing H.V. Mutations among the living and the undead // Mut. Res., 1994. - V.304. - P.315-320

121.Cafaro V., Delorenzo C., Piccoli R. et al. The antitumor action of seminal ribonuclease and its quaternary conformations // FEBS Lett., 1995. - V.359, N1. - P.31-34

122.Castelli J.C., Hassel B.A., Katherine A.W. et al. Role of 2'-5' oligoadenilate-activated RNase L in apoptosis / Absr. 4th Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996- S3L7

123.Chen H., Hua L., Wang V. et al. РНКазная активность однонитевых рибосома-инактивирующих белков // Progr.Biochem.Biophys.(KHT.), 1996. - V.23,N5. - Р.453-456

124.Cohen L., Kaplan R. Accumulation of nucleotides by starved Escherichia coli cells as a probe for the involvement of ribonucleases in ribonucleic acid degradation // J. Bacteriol., 1977. - V.2. - P.651-657

125.Cuervo A.M., Terlecky S.R., Dice J.F., Knecht E. Selective binding and uptake of ribonuclease A and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by isolated rat liver lysosomes // J. Biol. Chem., 1994. - V.269,N42. - P.26374-26380

126.D'Alessio G. New and cryptic biological messages from RNases // Trends Cell Biol., 1993. - V.3. - P. 106-109

127.Degen G. Hormone und Krebs . In: Toxicologische Grundlagen der Risikobeurteilung kanzerogener und mutagener Stoffe.- Wuerzburg, Inst. Pharm. Toxicol., 1992. -S. 180-190

128.Dertinger S.D., Torous D.k., Tometsko A.M. In vitro system for detecting nongenotoxic carcinogens // Environ. Mol. Mutagen., 1993. - V.21. - P.332-338

129.Deutscher M.P., Callahan C., Li N. et al. E.coli ribonucleases and their role in

xL

RNA metabolism / Absr. 4 Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S6L1

130.Devoret R. Les fonctions SOS on comment les bactéries survivent aux lésions de leur AND // Ann. Inst. Paseur, 1992. - V. 1. - P. 11 -20

131.Di Donato A, Cafaro V, D'Alessio G. Ribonuclease A can be transformed into dimeric ribonuclease with antitumor activity // J. Biol. Chem, 1994. -V.269. - P.17394-17396

132.Di Donato A, Cafaro V, Romeo I, D'Alessio G. Hints on the evolutionary design of dimeric RNase with special bioactions // Protein Sci, 1995. - V.4, N8. - P.1470-1477

133.Dietz E, Uhlenbruck G, Lùttiken R. An insulun receptor in microorganisms: fact of fiction? //Naturwissenschaften, 1989. - V.76,N6. - P.269-270

134.Ding R, Smuison M. Depletion of nuclear poly(ADP-ribose)polymerase by antisense RNA expression: influences on genom stability, chromatin organization, and carcinogen cytotoxicity // Cancer Res., 1994. - V.54. -P.4627-4634

135.Dorado G, Pueyo C. L-arabinose resistance test with salmonella typhimurium as a primary tool for cancerogen screening // Cancer Res, 1988. - V.48. -P.907-912

136.Draheim H, Repp H, Malettke N, Dreyer F. Potassium single-channel properties in normal and Rous sarcoma virus-transformed chicken embryo fibroblasts. // Pfluegers Arch, 1994. - V.427. - P. 17-23

137.Draheim H.J, Repp H, Dreyer F. Scr-transformation of mouse fibriblasts induses a Ca2+"activated K+ current without changing the T-type Ca2+ current // Biochim. Biophys. Acta, 1995. - V.1269. - P.57-63

138.Dreyer F, Marie K, Lutz F. The use of patch clamp technique for the study of the mode of action of bacterial toxins. In: Rappuoli et al. (Eds.), Bacterila Protein Toxins, G.Fischer, Stuttgart, New York, 1990. - P.227-233

139.Ebina Y, Ekida M, Hashimoto H. Origin of changes in electrical impedance during the growth and fermentation process of yeast in batch culture // Biotechnol andBioeng, 1989.-V.33,N10.-P.1290-1295

140.Elia M.C., Storer R., McKelvey T.W. et al. Rapid DNA degradation in primary rat hepatocytes treated with diverse cytotoxic chemicals: analysis by puis gel electrophoresis and implications for alcaline elution assays // Environ. Mol. Mutagaen, 1994. - Y.24. - P. 181-191

141.Esteva P., del Paso L., Laccal J.C. Induction of apoptosis by rho in NIH3N3 cells requires two complementary signals. Ceramides function as a progression factor for apoptosis // Onkogene, 1995.-V.11,N12. - P.2657-2665

142.Feder J., Gil-Falgon S., Lamaze C. Cell receptors: definition, mechanisms and regulaton of receptor-mediated endocytosis // Cell Molec. Biol., 1994. -V.40,N8. - P.1039-1061

143.Fett J.M., Strydom D.J., Lobb R.R. et al. Isolation and characterization of angiogenin, an angiogenic protin from human carcinoma cells // Biochemistry, 1985.-V.24.-P.5480-5486

144.Fitzgerald P.C., Hartley R.W. Polyethanoadenosine phosphate as a fluprogenic substrate for barnase // Annal. Biochem, 1995. - V.214. - P.544-547

145.FitzGerald D., Morris R.E., Saelinger C.B. Receptor-mediated internalization of Pseudomonas toxin by mouse fibroblasts // Cell, 1980. - V.21. - P.867-873

146.Folkman J, Klagsbrun M. Angiogenic factors // Science, 1987. - V.235. -P.442-447

147.Frei H., .Wurgler F.E. Statistical methods to decide whether mutagenicity test data from Drosophila assays indicate a positive, negative or inconclusive result // Mut. Res., 1988. - V.203. - P.297-308

148.Frisch S.M. Reversal of malignancy by the adenovirus Ela gene // Mut. Res. Fundam. Mol. Biol., 1996. - V.350.N1. - P.261-266

149.Frishein W. Role of the DNA/membrane complex in procartotic DNA replication // Annu. Rev. Microbiol., 1989. - V.41. - P.89-120

150.Gibbs J.B., Oliff A., Kohl N.E. Farnesyltransferase inhibitors: ras research yields a potential cancer therapeutic // Cell, 1994. - V.77. - P. 175-178

151.Gilman A.G. G proteins and dual control of adenylat cyclase // Cell, 1984. -V.36. - P.577-579

152.Gold L.S, Slone T.H, Stern B.R, Bernstein L. Comparison of target organs of carcinogenicity for mutagenic and non-mutagenic chemicals // Mut. Res, 1993.- V.286. -P.75-100

153.Graf U, Wiirgler F.E, Katz A.J. Somatic mutation and recombination test in Drosophila melanogaster // Environ. Mutagen, 1984. - V.6. - P.153-188

154.Guillet V, Lapthorn A, Hartley R.W, Mauguen Y. Recognition between a bacterial ribonuclease, barnase, and its natural inhibitor, barstar // Structure, 1993.-V.1,N3.-P.165-177

155.Guerrier-Takada C, Gardiner K, Marsch T. et al. The RNA moiety of RNase P is the catalytic subunit of the enzyme // Cell, 1983. - V.35. - P.849-857

156.Hagmar L, Brogger A, Hansteen I. et al. Cancer rise in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes :nordic study group on the health risk of chromosome damage // Cancer Res, 1994. - V.54. -P.2919-2922

157.Halt M, Sutic M. Uticaj aflatoxina B na vegetativno razmnozavanije pekarskog kvasca Saccharomuces cerevisiae SCM // Hrana i ishrana, 1989. -V.30N1. - P. 9-14

158.Hamasaki T, Sato N, Nagase H, Kito H. The genotoxicity og organotin compounds in SOS chromotest and rec-assay // Mut. Res, 1992. - V.280. -P. 195-203

159.Hannun Y.A, Obeid L.M. Ceramide: an intracellular signal for apoptosis // Trnds Biochem. Sci, 1995. - V.20. - P.73-77

160.Harada S, Smith R, Smith J. et al. Insulin-induced erg-1 expression in CHO cells is insulin receptor and insulin reseptor substrat-1 phosporylation independent. Evidence of alternetive signal transduction // J. Biol. Chem, 1995. - V.270,N44. - P.26632-26638

161.Harden V.P., Harris J.O. The isoelectric points of bacterial cells // J. Bacteriol., 1953. - V.65. - P.198-202

162.Hartley R.W. Homology between procaryotic and eucaryotic ribonucleases // J. Mol. Biol., 1980. - V.15. - P.355-358

163 .Hartley R.W. Barnase and barstar: two small proteins to fold and fit together // Trends Bioshem. Sei., 1989. - V.14. - P.450-454

164.Hartley R.W. Directed mutagenesis and barnase-barstar recognition // Biochemistry, 1993. - V.32. - P.5978-5984

165.Hartley R.W., Barker E.A. Amino-acid sequence of extracellular ribonuclease (barnase) of Bacillus amyloliquefaciens //Nature New Biol., 1972. - V.235. -P. 15-16

166.Hayashi M., Tice R.R., MacGregor J.T. et al. In vivo rodent erythrocyte micronucleus assay // Mut. Res., 1994. - V.312. - P.293-304

167.Heddle J.A., Cimino M.C., Hayashi M. et al. Micronuceli as an index of cytogenetic damage: past, present and future // Environ. Mol. Mutagen., 1991. -V.18.-P.277-291

168.Hei T.K., Komatsu K., Hall E.J., Zaider M. Oncogenic transformation by charged particles of defined LET // Carcinogenetis, 1988. - V.9. - P.747-751

169.Heinemann B. Prophage induction in lysogenic bacteria as a method of detecting potencial mutagenic, carcinogenic, carcinostatic and teratogenic agents // Chem. Mutagens, 1971. - V.l. - P.235-238

170.Herbert E.J., Grimsley G.R., Hartley R.W. et al. Purification of ribonucleases Sa, Sa2 and Sa3 after expression in E.coli II Prot. Expres.and Purific., 1997. -VI1.-P. 162-168

171.Hesketh T.R., Moore J.P., Morris J.D.H. et al. A common sequence of calcium and pH signals in the mitogenic stimulation of eukariotic cells // Nature, 1985. - V.313. - P.481-484

172.Hill C, Dodson G, Heinemann U, Saenger W. The structural and sequence homology of a family of microbial ribonucleases // Trends Biochem. Sci, 1983. - V.8. - P.364-369

173 .Hopkins R.L, Goodman M.F. Deoxiribonucleotide pools, base pairing and sequence configuration affecting bromodeoxyuredine and 2-aminopurine-induced mutagenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980. - V.77. - P. 18011805

174.1glevski B.H, Kabat D. NAD-dependent inhibition of protein synthesis by Pseudomonas aeruginosa toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - V.72. -P.2284-2288

175.Ioannou Y.A, Chen F.W. Quantitation of DNA fragmentation in apoptosis // Nucleic Acids Res, 1996. - V.24,N5. - P.992-993

176.1tami C, Kimura Y, Tagach R et al. Growth inhibition morphological change and ectoenzyme release of LLC-PK1 cells by phosphatidylinositol-specific phospolipase C of Bacillus thuringiensis II Biosci. Biotechnol. and Biochem, 1997. - V.61, N5. - P.776-781

177 Jiang X, Payne M.A, Can Z. et al. Ligand-specific opening of a gated-porin channel in the outher membrane of living bacteria // Science, 1997. -V.276,N5316. - P. 1261-1264

178 Johannes C, Obe G. Induction of chromosomal aberretions with benzon nuclease in Chinesen hamster ovary (CHO) cells // Mut. Res, 1994. - V.325. -P.113-116

179 Jones, D.H, Howard, B.H. Exponential amplification of nucleic acids: new diagnostics using DNA polimerases and RNA replicases // BioTechniques, 1990.-V.8.-P.178-183

180.Jurado J, Alejandre-Duran E, Pueyo C. Mutagenicity testing in Salmonella thyphimurium strains posessing both the His reversion and Ara forward mutation systems and different levels of classical nitroreductase or

acetyltransferase activities // Environ. Mol. Mutagen., 1994. - V.23. - P.286-293

181.Kao R., Davis J. Mutatuional studies of mitogillin, a ribonucleolytic toxin /

th

Absr. 4 Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996.- S1P19

182.Kapetsky T.R., Levy C.C. Human ribonucleases. In: Holcenberg, S., Roberts J. (Eds) Enzymes as Drugs, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, 1981. -P.103-166

183.Kefeli Y.L., Kalevitch A.E., Filimonova M.V. Plants sourse of botanic herbicides / Abstr. Plant. Biol.'97 Annu. Meet. Vacouwer, Aug.2-6, 1997. -Plant Phys. 1997. - V. 114,N3. - P. 135

184.Kim J.S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. (a). Catalytic actitity of bovine seminal ribonuclease is essential for its immunosuppressive and other biological activities // Biochem. J., 1995. - V.308, N2. - P.547-550

185.Kim J.S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. (6). Mechanism of ribonuclease cytotoxicity // J. Biol. Chem., 1995. - V.270,N52. - P.31097-31102

186.Kini R.M., Evans H.J. A model to explain the pharmacological sffects of snake venom phospholipases A2 // Toxicon, 1989.-V.27,N6. -P.613-635

187.Klaassen C.D., Admur M.O., Doull J. (Eds) Casarett and Doull's toxicolody: the basic science of poisons, 5th ed. McGraw-Hill, Heals Professions Division,

1996. - 111 lp.

188.Kobbe B. Cancer genes remain puzzling // Genetic Engineering News, Dec.

1997. - P.1,8,37

189.Korsmeger S., Yin X.M., Oltvai Z.N. et al. Peactive oxygen species and the regulation of cell death by Bcl-2 gene family (Nobel Symp.90: Mitochondrial deseases, Saltjobaden, 2-6 July 1994) // Biochem. Biophys. Acta. Mol. Basis Desease, 1995.-V.1271,N1. - P.63-66

190.Kreckler C, Zieher H, Klein J. Physical methods for characterization of microbial cell surfaces //Experienta, 1989.-V.45,N11-12.-P. 1047-1055

191.Kunz B.A. Genetic effects of deoxyribonucleotide pool imbalances // Environ. Mutagenesis, 1982. - V.4. - P. 695-725

192.Laccetti P, Portella G., Mastronicola M.R. et al. In vivo and in vitro growth-inhibitory effect of bovine seminal ribonuclease on a system of rat thyroid epithelial transformed cells and tumors // Cancer Res, 1992. - V.52. - P.4582-4586

193 .Lai C.Y. The chemistry and biology of cholera toxin // CRC Crit. Rev. Biochem, 1980. - V.56. - P.615-649

194.Lai H.C, Shu J.C, Ang S. et al. Effect of glucose concentration of swimming motility in enterobacteria // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1997. -V.231,N3. - P.692-695

195.Lee W.R, Abrahamson S, Valencia R. The sex-linked resessive lethal test for mutagenesis in Drosophila melanogaster: Gene-Tox report // Mut. Res, 1983.-V.123.-P.183-279

196.Lee F.S, Vallee B.L. Structure and action of mammalian ribonuclease (angiogenin) inhibitor // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol, 1993. - V.44. -P.l-30

197.Levitski A. Receptors: a quantitative approach. Melno Park, CA: Bengamin Gummings Press, 1984. - P.25-30

198.Liu F, Altman S. Inhibition of viral gene exptession by the catalytic subunit of RNasa P from Eshcerichia coli II Genes and Development, 1995. - V.9. -P.471-480

199.Lock E.A. Responses of the kidney to toxic compounds. In: Ballantyne B, Mars T, Turner P. (Eds) General and applied toxicology. Macmillan Press, New York, 1993. - P.507-536

200.Loosdrecht M., Norde W., Zehnder A. Influence of cell surface characteristics

tii

on bacterial adhesion to solid supports / Proc.4 Eur.Congr.Biotechnol., Amsterdam, June 14-19, 1987.-V.4. - P.575-580

201. Lowy D.R., Willumsen B.M. Function and regulation of ras // Ann. Rev. Biochem., 1993. - Y.62. - P.851-891

202.Madle S., Dean S.W., Andrae U. et al. Recomendations for the performance of UDS tests in vitro and in vivo // Mut. Res., 1994. - V.312. - P.263-285

203.Maeda S., Omata T. Substrate-binding lipoprotein of the cyanobacteria Synechcoccus sp. strain PCC 7942 involved in the transport of nitrate and nitrite // J. Biol. Chem, 1997. - V.272,N5. - P.3036-3041

204.Makarov A.A., Protasevich I.I., Kuznetsova N.V. et al. Comparative study of thermostability and structure of close homogenes - Barnase and Binase // J. Biomol. Struct. Dinamics, 1993. - V. 10. - P. 1047-1065

205.Manning F.C.R., Patierno S.R. Apoptosis: inhibitor or instigator of carcinogenesis? // Cancer Invest., 1996. - V.14,N5. - P.455-465

206.Maron .M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test //Mut. Res., 1983. - V.l 13. - P.173-215

207.Mashima T., Naito M., Noguchi K. et al. Actin-cleavage by CPP-32/apopain during the development of apoptosis // Oncogene, 1997.-V.14.- P. 1007-1012

208.Mason J.M., Aaron C.S., Lee W.R. A guide for performing germ cell mutagenesis assay using Drosophila melanogaster II Mut. Res., 1987. -V.189. - P.93-102

209.Mastronicola M.R., Piccoli R., D'Alessio G. Key extracellular and intracellular steps in the antitumor action of seminal ribonuclease // Europ. J. Biochem., 1995. - V.230,N1. - P.242-249

210.Matsuda S., Kawamura-Tsuzuku J., Ohsugi M. et al. Tob, a novel protein that interacts with pl85erB2, is associated with anti-proliferative activity // Onkogene, 1996. - V.l2. - P.705-713

211.Matousek J, Soucek J, Riha J. et al. Immunosupressive activity of angiogenin in comparison with bovine seminal ribonuclease and pankreatic ribonuclease // Compar. Biochem. Physiol.: Biochem and Mol. Biol, 1995. -V.112,N2. -P.23 5-241

212.Mazon M.J, Behrens M.M, Portillo F, Pinon R. // J. Gener. Microbiol, 1989. - V.135,N6. - P.1453-1460

213.McCarol N.E, Piper C.E, Keech B.H. An Escherichia coli microsuspension assay for the detection of DNA damage induced by direct-acting agents and promutagens // Environ. Mutagen, 1981. - V.3. - P.607-616

214.McDougall G.J, Fry S.C. Inhibition of auxin-stimulated growth of pea stem segments by a specific monosaccharide of xyloglucan // Planta, 1988. -V.175. - P.412-416

215.McPerson K, Doll H. Oesrogens and breast cancer: exogenous hormones // Brit. Med. Bulletin, 1990. - V.47. - P.484-492

216.Meiering E.M, Bycroft M, Ferst A.R. Characterization of phosphate binding site of barnase by site directed mutagenesis and NMR // Biochemistry, 1991. -V.32. - P.5145-5150

217.Mersch-Sundermann V, Kern S, Winterman F. Genotoxicity of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons and related structures on Escherichia coli PQ37 (SOS chromotest) // Environ, and Molec. Mutagen, 1991. - V.18. -P.41-50

218.Mikulski S.M, Chun H.G, Mittelman A. et al. Relationship between response rate and median survival in patients with advanced non-small cell lung cancer: comparison of onconase with other anticancer agents // Int. J. Oncol, 1995. - V.6. - P.889-897

219.Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1972. - 45 lp.

220.Miller W.R, O'Neill J.S. The significance of steroid metabolism in human cancer // J. Steroid Biochem, 1990. - V.37. - P.317-325

221.Mirsalis J.C., Monforte J.A., Winegar R.A. Transgenic animal models for measuring mutations in vivo II Crit. Rev. Toxicol., 1994. - V.255-280

222.Morgan E.L., Weigle W.O. Biological activities residing in Fs region of immunoglobulin // Adv. Immunol., 1987. - V.40. - P.61-134

223.Moroianu J., Riordan J.F. Nuclear translocation of angiogenic proteins in endothelial cells: an essential step in angiogenesis // Biochemistry, 1994. -V.33. - P.12535-12539

224.Mossakowska D.E., Nyberg K., Fersht A.R. Kinetics characterization of the recombinant ribonuclease from Bacillus amyloliquefaciens (barnase) and investigation of key residues in catalysis by site-directed mutagenesis // Biochemistry, 1989. - V.28. - P.3843-3850

225.Moyer M.P. The association of DNA and RNA with membranes // Intern. Rev. Cytol., 1979. - V.61. - P. 1-48

226.Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell., 1997. - V.88. - P.355-365

227.Narisawa T., Fukaura Y., Hasebe M. et al. Inhibitory effects of natural carotenoids, a-carotene, (3-carotene, lycopene and lutein, on colonic aberrant crypt foci formation in rats // Cancer Lett., 1996. - V.107. - P.137-142

228.Negri C., Bernardi R., Braghetti A et al. The effect of chemotherapeutic drug VP-16 on poly(ADP)ribosylation in apoptotic HeLa cells // Cancerogenesis, 1993. - V.14. - P.2559-2564

229.Newton J.F., Hook J.B. Isolated perfused rat kidney. In: Jakoby W.D.(Ed.), Methods in Enzymology. Academic Press, New York, 1981. - P.94-105

230.Nitta K., Ogawa Y., Hosono M., Takayangi Y. Leczyme (catalytic lectin)-induced cell death / Absr. 4th Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S3P7

231.Nylund 1., Einisto P. Mutagenicity testing of protein-contained and biological samples using Ames/Salmonella plate incorporation test and fluctuation test // Mut. Res, 1993. - V.272. - P.205-214

232.0kabe S, Suganuma M, Hayashi M. et al. Mechanisms of growth inhibition of human lung cancer line, PC-9 by tea polyphenols // Jap. J. Cancer Res, 1997.-V.88.-P.639-643

233.Olson t.S, Terlecky S.R, Dice J.F. Targeting specific proteins for lysosomal proteolysis //Biomed. Biochem. Acta, 1991. - V.50, N4-6. - P.393-397

234,Omura T, Sato R. The carbon-monoxid-binding pigment of liver microsomes //J. Biol. Chem, 1964.-V.239.-2370-2378

235.0rrenius S, McCabe M.J, Nicotera P. Ca2+-dependent mechanisms of cytototxcity and programmed cell death // Toxicol. Lett, 1992. - V.64/65. -P.357-361

236.0zaki T, Hishiki T, Toyama Y. et al. Identification of new cellular protein that can interact specifically with DAN // DNA and Cell Biol, 1997.- V.16. -P.985-991

237.Padan E, Schuldiner S. Intracellular pH and membrane potential as regulators in the procariotic cell // J. Membran. Biol, 1987. - V.95. - P.189-198

238.Parker S.L, Tong T, Bolden S, Wingo P.A. Cancer statistic // CA Cancer Clin, 1997.-V.47.-P.5-27

239.Peitsch M.C, Polzar B, Stephan H. et al. Characterization of the endogenous deoxyribonuclease involved in nuclear DNA degradation during apoptosis (programmed cell death) // EMBO J, 1993. - V.12. - P.373-377

240.Prior T.I, Kunwar S, Pastan I. Studies on the activity of barnase toxins in vitro and in vivo // Bioconjugate Chem, 1996. -V.7. - P.23-29

241.Privai M.J, Dunkel V.C. Réévaluation of the mutagenicity and carcinogenicity of chemicals previously identified as "false positives" in the Salmonella typhimurium mutagenicity assay // Environ. Mol. Mutagen, 1989. -V.13.-P.1-24

242.Ptashne M. Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance // Nature, 1986. - V.322. - P.698-701

243.Qillardet P, Hoftiung M. The SOS chromotest; a review // Mut. Res, 1993. -V.297. - P.235-279

244.Quillardet P, Hofnung, M. The SOS-chromotest, a colorimetric bacterial assay for genotoxins: procedures // Mut. Res. 1985. - V.147. - P.65-78

245.Raines R.T, Toscano M.P, Nierengarten D.M. et al. Replacing a surface loop endows ribonuclease A with angiogenic activity // J. Biol. Chem, 1995. -V.270. - P.17180-17184

246.Reed M.W, Fraga D, Schwartz D.E. et al. Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-antisense oligodeoxynucleotide conjugates // Bioconjug. Chem, 1995. - V6, N1. - P.101-108

247.Repp H, Draheim H, Ruland J. et al. Profound differeces in potassium properties of normal and Rous sarcoma virus-transformed chicken embrio fibroblasts // Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1993. - V.90. - P.3403-3407

248.Repp H, Matzek A, Draheim H. et al. Epidermal growth factor, platelet-derived growth factor AB, insulin, lysophosphatidic acid and serum modulate K+ channel properties in chicken embryo fibroblasts // Cell Physiol. Biochem, 1995. - V.5. - P.145-154

249.Ribo M, del Cardayre S, Raines R.T. et al. Production of human pancreatic ribonuclease in Saccharomyces serevisiae and Escherichia coli II Protein Expression and purification, 1996. - V.7. - P.253-261

250.Roberts J.W, Roberts C.W, Mount D.W. Inactivation and proteolytic cleavage of phage X repressorin vitro in ATP-dependent reaction // Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1977. - V.74. - P.2283-2287

251.Russo N, Nobile V, Di Donato A. et al. The C-terminal region of human angiogenin has a dual role in enzymatic acticity // Proceed. Nation. Acad. Sei. USA, 1996. - V.93,N8. - P.3243-3247

252.Sato T, Ose Y, Nagase H. et al. Mechanism of antimutagenicity of aquatic plant extracts against benzo(a)pyrene in the Salmonella assay // Mut. Res, 1990. - V.241. - P.283-290

253.Sauer R.T, Ross M.J, Ptashne M. Cleavage of the X and P22 repressors by

recA protein // J.Biol.Chem, 1982.-V.257.-4458-4462 254.Saxena S.K, Rybak S.M, Winkler G et al. Comparison of RNases and troxins upon injection into Xenopus oocytes // J. Biol. Chem, 1991. - V.266. -P.21208-21214

255.Saxena S.K, Vasandary V.M., Ardelt W. et al. The mechanism of onconase toxicity and antiviral activity / Absr. 4th Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S3P4A 256. Schneider R. Characterization of a ribonuclease from a pestivirus / Absr. 4th Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S2L5 257.Schrenk D, Dekant W, Wuensh P.H, Henschler D. Role of metabolic activation in the toxicity of S-(pentachlorobutadienyl)-glutatione and S-pentachlorobutadienyl)-L-cysteine in the isolated perfused rat kidney // Toxicol. In Vitro, 1988. - V.2. - P.283-290 258.Serrano R. In vivo glucose activation of the yeast plasma membrane ATPase

// FEBS Let, 1983. - V.156. - P.l 1-14 259.Silverman R.H, Dong B, Maitra R. et al. Signaling RNA decay in interferon

tVi

treated cells by the 2-5A system / Absr. 4 Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S3L6 260.Sirdeshmukh R, Vijayarangam D, Murthy B.S.N. Protein RNase inhibitor and its cellular role? / Absr. 4th Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S3L3 261. Schneider R. Characterization of a ribonuclease from pestivirus / Absr. 4th Inter. Meet. "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology" Groningen, 14-18 July, 1996. - S2L5 262.Shafman T, Khanna K.K, Kedar P. et al. Interaction between ATM protein and c-Abl in respose to DNA damage //Nature, 1997. - V.387. - P.520-523

263.Sommer S, Leitao A, Berandi A. et al. Introduction of a UV-damaged replicon into a recipient cell is not suuficient condition to produce an SOS-inducing signal // Mut. Res. DNA Rep, 1991. - V.254. - P. 107-117 264.Sorsa M, Wilbourn j, Vainio H. Human cytogenetic damage as a prediction of cancer risk. In: Vaninio et al. (eds): Mechanisms of carcinogenesis in risk identification. Lyons, IARC, 1992. - P. 543-554 265.Stock J.B, Stock A.M., Mottonen J.M. Signal transduction in bacteria //

Nature, 1990. - V.344, N6265.-P.395-400 266.Stock J.B, Wylie D.C, Mottonen J.M. et al. Signal transduction in bacteria //

Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 1988. - V.53, N1. - P.49-57 267.Storer R.D, McKelvey T.W, Kraynak A.R. et al. Revalidation of the in vitro alcaline elution/rat hepatocyte assay for DNA damage: inproved criteria for assessment of cytotoxicity and genotoxicity and results for 81 compounds // Mut. Res, 1996. - V.368. - P.59-101 268.Suzuki H, Wildhirt S.M, Dudek R.R. et al. Induction of apoptosis in myocardial infarction and its possible relationship to NO-synthases in macrophages II Tissue and Cell, 1996. - V.28,N1. - P.89-97

269.Tahirov T.H.O, Lu T.H, Liaw Y.C. et al. A new crystal form of abrin-a from the seeds of Abrusprecatorius II J. Mol. Biol, 1994. - V.235. - P.l 152-1153

270.Tennant R.W, Margolin B.H, Shelby M.D. et al. Prediction of chemical carcinogenicity in rodents from in vitro genetic toxicity assays // Science, 1987.-V.236. -P.933-941

271.Thonart P, Custinne M, Paquot M. Zeta potential of yeast cells: application in cell mobilisation // Enzyme Microb. Technol, 1982. - V.4. - P.191-194

272.Tice R.R, Strauss G.H, Peters W.P. High-dose combinaton alkylating agents with analogous bone-marrow support in patients with breast cancer: preliminary assessment of DNA damage in individual perepheral blood lymphocytes using singl gel electrophoresis assay // Mut. Res, 1992. - V.271. - P.101-109

273.Tollershaug H, Berg T, Blomhoff R. Uptake of mannose-terminated glycoproteins in isolated rat liver cells. Evidence for receptor-mediated endocytosis in hepatocytes // Biochem. J, 1984. - V.223, N1. - P.151-60

274.Torii S, Naito M, Tshuro T. A novel apoptosis-inducing factor with L-amino acid oxidase activity purified from western diamondback rattlesnake venom // J. Biol. Chem, 1997.- V.272, - P.9539-9542

275.Ulrich A, Simon M. Cell regulation. Editoral overview // Curr. Opinion Cell Biol, 1995. - V.7,N2. - P.145-147

276.USEPA, 1986. Guidelines for mutagenicity risk assessment // Fed. Reg, 1986. - V.51. - P.340006-34012

277.Vamvakas S, Vock E, Lutz W.K. On the role of DNA Double-strand breaks in toxicity and carcinogenesis // Crit. Rev. Toxicol, 1997. - V.27,N2. - P. 155174

278.Vasandani V.M, Mikulski S.M, Youle R.J, Sung C. Molecular determinants in plasma clearens and tissue distribution of ribonucleases of the ribonuclease A superfamily // Cancer Res, 1996. - V.56,N18. - P.4180-4186

279.Vogel E.W. Cenetical relationship between resistance to incsecticides and procarcinogens in two Drosophila populations // Arch. Toxicol, 1980. - V.43. - P.201-211

280.Vogel E.W. Tests for recombinagens in somatic cells of Drosophila II Mut. Res, 1992. - V.284. - P.159-175

281.Walker G.C. Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli II Microbiol. Rev, 1984.-V.48.-P.60-93

282.Wang J. Cellular responses to DNA damage // Curr. Opinion Cell. Biol, 1998. - V.10,N2. - P.240-246

283.Wang J, Delgado D.A, Deen D.F. Use of pulsed-field gel electrophoresis to investigate factors influencing the measurment of DNA double-strand breaks in human brain tumor specimens // Int. J. Radiat. Biol, 1995. - V.67. - P.153-157

284.Wang T.V, Smith K.C. Postreplication repair in ultraviolet-irradiated human fibroblasts: formation and repair of DNA-double-strand breaks // Cancerogenesis, 1986. - V.7. - P.389-394

285.Willinger C.C, Moschen I, Kulmer S, Pfaller W. (a) The effect of sodium fluoride at prophylactic and toxic doses on renal sructure and function in the isolated perfused rat kidney // Toxicology, 1995. - V.95,Nl-3. - P.55-71

286.Willinger C.C, Thamaree S, Schramek H, Gstraunthaler G, Pfaller W. (6) In vitro nephrotoxicity of Russel's viper venom // Kidney Int., 1995. - V.47, N2. - P.518-528

287.Witkin E.M. Ultraviolet mutagenesis and inducible responses to DNA damage in Escherichia colill Bacteriol. Rev, 1976.-V.40.-P.869-907

288.Wu Y.N, Saxena S.K, Ardelt W. et al. A study of the intracellular routing of cytotoxic ribonucleases // J. Biol. Chem, 1995. - V.270,N29. - P. 17476-17481

289.Yakovlev G.I, Moiseyev G.P, Struminskaya N.K. Mutational analysis of the active site of RNase of Bacillus intermedius (BINASE) // FEBS Letters, 1994. - V.354.-P.305-306

290.Yamamoto R, Wad A, Asada Y. et al. Nitric oxide-dependent and independent norepinerphin release in rat mesenteric arteries // Amer. J. Physiol. Heart and Circ. Physiol, 1997. - V.41,N1. - P.207-210

291.Youle RJ, Newton D, Wu Y.N. et al. Cytotoxic ribonucleases and chimeras in cancer therapy // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst, 1993. - V.10. - P. 1-28

292.Zhivotovsky B, Wade D, Gahm A. et al. Formation of 50 kbp chromatin fragments in isolated liver nuceli is mediated by protease and endonuclease activation // FEBS Lett, 1994. - V.351. - P.150-154