Показатели обмена гликопротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат медицинских наук Зворыгин, Игорь Анатольевич

• Зворыгин, Игорь Анатольевич
• кандидат медицинских наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Зворыгин, Игорь Анатольевич

Список принятых сокращений.

Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Основные сведения о хроническом миелоидном лейкозе.

1.1 Современные представления о заболевании.

1.2 Характеристика фазовых изменений при XMJI.

1.3 Вопросы дифференциальной диагностики.

Глава 2. Углеводсодержащие соединения и их компоненты

2.1 Основные сведения о структуре, свойствах и функциях 29 гликопротеинов и других углеводсодержащих соединениях.

2.2 Строение, свойства и роль сиаловых кислот.

2.3 Вопросы обмена гликопротеинов и сиаловых кислот.

2.4 Изменения показателей обмена сиалосодержащих соединений при различных заболеваниях.

Собственные исследования

Глава 3. Материал и методы исследования.

3.1 Общая характеристика наблюдаемых больных.

3.2 Объективные методы оценки изменений в системе кроветворения и обмена веществ в соответствии с фазами заболевания.

3.3 Специальные методы исследования.

3.4 Методы статистического анализа.

Глава 4. Результаты объективных методов исследования системы гемопоэза в соответствии с фазами патологического процесса

Глава 5. Состояние обмена сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов в соответствии с фазами хронического миелолейкоза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Показатели обмена гликопротеинов у больных хроническим миелоидным лейкозом»

Актуальность проблемы:

Гликопротеины - группа сложных соединений, содержащих олигосаха-ридные цепи, ковалентно связанные с белковой основой. К числу таких соединений относится большая часть белков плазмы крови, секретов, а также многие белки внешней стороны клеточных мембран (Е. Koiw, A. Gronwall, 1952; Р. Хьюз, 1985; J. Koolman, К.-Н. Rohm, 1997).

Количество и состав олигосахаридных цепей оказывают влияние на кон-формацию белковой части гликопротеинов и определяют их антигенную специфичность. Одним из наиболее значимых компонентов гликопротеинов являются сиаловые кислоты - N-ацетилнейраминовая кислота и ее производные (L. Warren, 1959; R. Murrey et al., 1993). CK занимают концевые участки цепей и могут составлять до 20% молекулярного веса гликопротеина, придавая молекуле гидрофильные свойства и общий отрицательный заряд (A. Gottschalk, 1969; Г.Я. Видершайн, 1980). Терминальное положение также может занимать L-фукоза, создавая в молекуле, в отличие от СК, гидрофобные участки (Z. Dische, L. Shettles, 1948; А.Ц. Анасашвили, 1968; Р. Хьюз, 1985).

Неопластическая трансформация при заболеваниях системы крови сопровождается нарушениями дифференцировки клеток гемопоэза, их функций и межклеточных взаимодействий (А.И. Воробьев 1976, 2002; Ф.Д. Шиффман, 2000). Во всех этих процессах важную роль играют гликопротеины (J.T. Gallagher, I.N. Hampson, 1984). Известно, что профиль состава поверхностных гликопротеинов при различных формах лейкозов соответствует происхождению и степени зрелости бластной клетки (L.C. Anderson, C.D. Gahmberg, 1982; Г.И. Козинец, В.А. Макаров, 1998). Тем не менее, такой важный компонент биохимического фенотипа, как количественный и качественный состав гликопротеинов сыворотки крови к настоящему времени мало изучен у больных с опухолями кроветворной ткани, что приводит к необходимости исследовать возможность использования показателей обмена гликопротеинов в онкогематологии.

В качестве модели этой группы заболеваний был выбран хронический миелоидный лейкоз (XMJI) - широко распространенный вариант лейкоза, развивающийся из клеток - предшественников миелопоэза, которые сохраняют способность дифференцироваться до зрелых форм. (А.И. Воробьев, М.Д. Бриллиант, 1985). По современным представлениям XMJI является злокачественным клональным заболеванием системы крови, характеризующимся гепатос-пленомегалией, нейтрофильным лейкоцитозом со сдвигом влево в лейкоцитарной формуле, наличием характерных изменений клеточного ядра, а также стадийностью течения. (К.М. Абдулкадыров и соавт., 1998; М.А. Волкова, 2002). Заболеваемость XMJI приблизительно одинакова во всем мире - 1-1,5 на 100 ООО человек в год, что составляет 7 - 15 % среди всех лейкозов взрослых и 1,5 - 3% всех детских лейкозов. (А.Г. Туркина, 2001).

Неопластическая трансформация при XMJI связана с поражением поли-потентной стволовой клетки (R. Kurzrock et al., 1994). В системе гемопоэза у больных XMJI происходит чрезмерное неконтролируемое нарастание количества миелоидных клеток - предшественников, протекающее с вовлечением клеток миелоидного, эритроидного, мегакариоцитарного и В-лимфоидного рядов (R. Silver, 1990). Клональная природа XMJI доказана путем проведения цитоге-нетических (обнаружение Ph-хромосомы), молекулярно-генетических (детекция химерного гена bcr-abl) и биохимических (выявление моноклонального типа экспрессии глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы) исследований (P. Fialkow et al., 1977; Е. Canaani et al., 1984; J. Rowley, 1988). Заболевание в своем развитии последовательно проходит три фазы: хроническую, прогрессирующую (accelerated) и бластную или бластный криз (Н. Kantarjian, 1988; J. Goldman, 1996).

Типичными клинико-лабораторными признаками хронической фазы XMJI являются гепатоспленомегалия и нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом в лейкоцитарной формуле влево до миелоцитов и промиелоцитов, реже - единичных бластных клеток (А.И. Воробьев, М.Д. Бриллиант, 1976; М.А. Волкова, 1993; А.Г. Туркина, 1998). По мере прогрессирования лейкозного процесса наблюдаются изменения как со стороны клеточного ядра (появление дополнительных злокачественных клонов), так и клинико-гематологических признаков: усиливается и становится рефрактерной к монотерапии цитостатиками гепа-тоспленомегалия, быстро нарастает лейкоцитоз, в лейкоцитарной формуле появляется большое количество бластных клеток, а также эозинофильных и ба-зофильных гранулоцитов (P. Canellos, 1990; G. Bergamaschi, V. Rosti, 1994).

Несмотря на изученность заболевания, сохраняются проблемы в определении фазы процесса и дифференциальной диагностики с рядом других нозологических форм, в частности - с сублейкемическим миелозом (СМ). Гистологическое исследование костного мозга имеет важное значение в дифференциальной диагностике XMJI и СМ, основным морфологическим проявлением которого является остеомиелофиброз (ОМФ), хотя критерии распознавания двух рассматриваемых нозологических форм также являются недостаточно разработанными. (О.А. Рукавицын, 1997; А.В. Давыдова, 2001).

Диагностика прогрессирующей и бластной фаз XMJI в настоящее время проводится с использованием конкретных клинико-лабораторных критериев (J.Reiffers, J. Goldman, 1996), но прогрессирование XMJI не у всех больных сопровождается увеличением количества определенных типов клеток периферической крови или костного мозга (бласты, промиелоциты, эозинофилы, базо-филы) (К.М. Абдулкадыров и соавт., 1998). Нередки ситуации, когда в случае нерезко выраженных клинико-лабораторных признаков заболевания возникают сложности в дифференциальной диагностике и принятии решения о назначении адекватной схемы лечения (О.А. Рукавицын, 1997).

Не всегда существует возможность провести цитогенетическое и моле-кулярно-генетическое исследования костного мозга для завершения диагностического процесса у большинства пациентов, хотя даже в этом случае необходимо иметь ввиду наличие вариантов течения заболевания без филадельфийской хромосомы, что встречается у 5-15% больных (Р.Н. Fitsgerald, М.Е. Beard, et al., 1987; JI.И. Яворковский, 1989).

Таким образом, можно считать очевидным фактом недостаточность использования только классических клинико-гематологических критериев при постановке диагноза, дифференциальной диагностике и определении фазы заболевания. С научной и практической точек зрения оправданным является поиск дополнительных диагностических критериев фазы XMJI. В связи с этим, вызывает определенный интерес использование доступных практическому здравоохранению методов исследования показателей обмена гликопротеинов.

Исследования гликопротеинов при различных формах лейкозов показали, что профиль их состава находится в прямой зависимости от происхождения и степени зрелости лейкозной клетки. Лейкозная трансформация сопровождается изменением экспрессии или утратой тех или иных гликопротеинов (L.C. Anderson, C.D. Gahmberg, 1982). Прогрессия патологического процесса при XMJI - переход от хронической фазы в прогрессирующую и в бластный криз -сопровождается углублением нарушений программ клеточной дифференци-ровки, становлением блока дифференциации на более ранней стадии, усилением базофильной пролиферации. Следствием вышеперечисленного должны быть биохимические сдвиги, отражающие изменения в популяции гемопоэти-ческих клеток и появление особенностей, характерных для незрелых опухолевых клеток (Н. Kantarjian, 1988; Т. Ikeda, 1990).

Представленные литературные данные позволяют утверждать, что биохимический фенотип лейкозной клетки, важной составляющей которого являются углеводсодержащие соединения, отражает процессы неопластической трансформации, происходящие в клеточном ядре. При этом прогрессирование лейкозного процесса должно сопровождаться закономерными сдвигами в содержании и составе сиалогликопротеинов. В связи с этим можно считать обоснованными исследования обмена сиало- и фукозогликопротеинов в организме больных с опухолями кроветворной ткани для определения возможности их использования в качестве маркера фаз опухолевого процесса.

Следует отметить, что исследование обмена гликопротеинов у больных XMJI представляет особенный интерес. Клональный характер и достаточно четкая стадийность патологического процесса позволяют рассматривать это заболевание в качестве своеобразной модели опухолей гемопоэтической ткани.

Комплексная оценка содержания и состава гликопротеинов у больных XMJI может быть полезна для понимания патогенетических особенностей заболевания, а также использоваться при разработке практических вопросов мониторинга и прогнозирования в онкогематологии.

Цель исследования: изучить показатели обмена сиало- и фукозосодер-жащих гликопротеинов и серомукоидов в сыворотке крови больных XMJI в различные фазы заболевания и сопоставить с клиническими и общепринятыми лабораторными данными.

Задачи исследования:

1. Исследовать показатели обмена сиалогликопротеинов (свободные, оли-госвязанные и белоксвязанные сиаловые кислоты, активность сиалидазы) в сыворотке крови больных ХМЛ и СМ.

2. Исследовать показатели обмена фукозогликопротеинов (белоксвязанная и олигомерсвязанная фукоза, активность a-L-фукозидазы) и серомукоидов (по содержанию белков, тирозина и гексозаминов) в сыворотке крови больных ХМЛ.

3. Сравнить результаты различных методов количественного анализа сиа-ло-гликопротеинов и серомукоидов, модифицировать известные методы анализа показателей обмена сиало- и фукозосодержащих соединений для применения в клинической практике.

4. Провести корреляционный анализ результатов исследования показателей обмена гликопротеинов и общепринятых для миелопролиферативных заболеваний лабораторных тестов, сравнить их информативность.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное исследование показателей обмена сиало- и фукозгликопротеинов в сыворотке крови больных ХМЛ и СМ с определением содержания ССК, ОССК, БССК, БСФ, ОСФ, а также активности сиалидазы и фукозидазы. Доказана фазовость изменений этих показателей в соответствии с развитием патологического процесса и возможность их использования в качестве маркера обострения заболевания.

Впервые выявлены различия в отклонениях отдельных показателей обмена гликопротеинов и их соотношений при прогрессировании заболевания. Показано, что, после периода повышенного биосинтеза гликопротеинов в хроническую фазу XMJI, в поздние периоды заболевания отмечается рост содержания продуктов распада указанных соединений (ССК, ОССК, ОСФ), что объясняется низкой устойчивостью к повреждающим факторам атипичных белков и нарастающей активностью гликозидаз. Установлена тенденция к преобладанию в обмене указанных полимеров катаболических процессов с нарастанием концентрации продуктов гидролиза при переходе заболевания из моноклоно-вой (доброкачественной) в поликлоновую (злокачественную) фазу XMJI.

Представлены результаты корреляционного анализа полученных данных с важнейшими гематологическими и биохимическими тестами, используемыми при лейкозах, установлено самостоятельное диагностическое и прогностическое значение показателей обмена сиало- и фукозосодержащих соединений. Показана целесообразность включения этих тестов в стандартные схемы диагностики и мониторинга заболеваний системы крови.

Практическая значимость.

Результаты исследования расширяют имеющиеся представления о пато-химии сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов при XMJI и СМ и возможностях их использования в диагностике и мониторинге указанных заболеваний. Установлено, что показатели обмена гликопротеинов являются маркерами активизации патологического процесса при трансформации в злокачественную поликлоновую стадию. В связи с этим показатели фракционного состава сиаловых кислот, фукозы и серомукоидов могут быть рекомендованы для включения в протоколы регулярного планового обследования больных XMJI и СМ в качестве дополнительного биохимического критерия для диагностики фазы заболевания и своевременной коррекции схемы медикаментозного лечения.

В ходе исследований ряд методов анализа показателей обмена гликопротеинов были модифицированы в целях экономии времени на исследования и уменьшения расхода реактивов. Модификации методов изложены в информационном письме Минздрава Удмуртской Республики для внедрения в лабораторную практику лечебно-профилактических учреждений. Показана возможность использования наборов реактивов «Сиалотест» («Реахим», Ижевск) и «Мукопротеины» (Hospitex diagnostics, Швейцария) в качестве скрининга с последующим применением развернутых методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В сыворотке крови больных XMJI обнаруживаются изменения в обмене сиало- и фукозосодержащих гликопротеинов, что проявляется изменением содержания и (или) соотношения отдельных компонентов этих соединений с преимущественным ростом содержания продуктов катаболизма, а также повышением активности ферментов нейраминидазы и a-L-фукозидазы.

2. Несмотря на выявленную умеренную положительную корреляцию с отдельными гематологическими показателями (количество лейкоцитов, % бласт-ных клеток, СОЭ) и содержанием острофазовых белков крови (фибриноген, альфа-глобулины) показатели обмена гликопротеинов обладают собственной диагностической и прогностической значимостью.

3. Содержание отдельных компонентов обмена сиало- и фукозогликопро-теинов и серомукоидов закономерно изменяется в соответствии с фазами заболевания, что может быть использовано в качестве дополнительного биохимического критерия при лабораторном мониторинге XMJI.

Внедрение в практику.

В лечебно-профилактических учреждениях Удмуртской Республики внедрено информационное письмо «Методы исследования показателей обмена сиаловых кислот в биологических жидкостях». Модифицированные лабораторные методы исследования сиалогликопротеинов используются в качестве дополнительного теста в оценке состояния больных, а также в учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПК и ГШ Ижевской государственной медицинской академии.

Разработанная и собранная в ходе работы компьютерная система визуализации и анализа микроизображений крови и костного мозга успешно используется в практической деятельности Республиканского гематологического центра и Республиканского патологоанатомического бюро МЗ УР, кафедры патологической анатомии Ижевской государственной медицинской академии.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены на симпозиуме «Клиническая лаборатория на пороге XXI века» (Москва, 1999), научно-практической конференции «Молодые ученые на рубеже веков» (Ижевск, 2000), II(VI) конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2000), конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири (Ижевск, 2001), научно-практическом симпозиуме «Принципы лабораторного обеспечения внебольничной помощи» (Москва, 2001).

Окончательный вариант работы обсужден на межкафедральном заседании ИГМА (Ижевск, 2003).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 139 отечественных и 129 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 24 рисунками и 10 фотографиями.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зворыгин, Игорь Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Среднее содержание сиаловых кислот у больных XMJI составило 954,5 ± 18,2 мг/л, разность средних с контролем достоверна (Р < 0,001), распределение значений соответствует закономерностям нормального распределения случайных величин. Регрессионный анализ подтверждает удовлетворительное соответствие результатов, полученных с использованием реактива Эр-лиха, тиобарбитуровому методу.

2. В хроническую фазу XMJI отмечается достоверное повышение БССК и ОССК (Р < 0,001), уровень ССК изменяется незначительно. В фазу акселерации наряду с повышением БССК наблюдается выраженный рост ССК, а относительная концентрация ОССК становится наибольшей. Максимальные уровни ССК и ОССК отмечены в бластную фазу, БССК при этом изменяются незначительно (Р > 0,05), что говорит о преобладании в обмене сиалогликопро-теинов катаболических процессов.

3. Активность сиалидазы в хроническую фазу XMJI сохраняется на низких уровнях (1,34 ± 0,28 мкг/мл/час), у 19% больных определялись только следы сиалидазной активности. Значительное повышение активности отмечается в прогрессирующую и бластную фазы (3,06 ± 0,37 и 4,92 ± 0,46 мкг/мл/час), что является важным прогностическим признаком. Повышение активности фермента и параллельный рост ССК предполагают высокую вероятность прогрессирования XMJI.

4. Уровни сиаловых кислот у больных СМ в развернутую фазу характеризуются минимальными отличиями от контрольной группы, что связано с длительным доброкачественным течением заболевания. Лейкемизация процесса в терминальную фазу СМ приводит к повышению ССК и ОССК, но, по результатам применения методов множественного сравнения, статистически значимых отличий с фазой акселерации и бластной фазой ХМЛ не выявлено.

5. В хроническую фазу ХМЛ среднее значение БСФ на 16% выше (Р = 0,05) среднего контрольной группы, содержание ОСФ в эту фазу практически не изменяется. В фазу акселерации, напротив, отмечен статистически значимый рост содержания ОСФ, в бластную фазу существенного роста концентрации обоих компонентов не происходит. Отмечается также повышение в поздние стадии ХМЛ активности фукозидазы, но достоверных изменений в соответствии с фазами не выявлено.

6. В фазу акселерации отмечается достоверное повышение содержания серомукоидов (Р < 0,001) и отношения белки/гексозамины до 9,93 (8,44 в группе здоровых лиц, 8,95 в хроническую фазу), что свидетельствует об устойчивом снижении содержания гексозаминов в составе серомукоидов. Регрессионный анализ показал хорошее соответствие результатов определения серомукоидов по содержанию тирозина.

7. Корреляционный анализ обнаружил умеренную прямую связь уровня СК с а г и (3-глобулинами и СОЭ, слабую прямую связь - с количеством лейкоцитов, бластов, базофилов периферической крови и а2-глобулинами, умеренную обратную связь - с общим белком и альбуминами (все результаты достоверны). Сильных связей с ни с одним из показателей не выявлено, что подчеркивает самостоятельное значение сиаловых кислот в диагностике и мониторинге заболеваний системы крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Изменения фракционного состава СК, фукозы и серомукоидов могут быть рекомендованы для использования в качестве дополнительного биохимического маркера активизации патологического процесса и перехода заболевания в фазу акселерации. Тенденция к повышению активности сиалидазы и параллельный рост содержания ССК предполагают высокую вероятность про-грессирования патологического процесса и позволяют ставить вопрос о корректировке схемы цитостатической терапии.

Можно считать целесообразным включение этих исследований в схемы лабораторного мониторинга ХМЛ и СМ. В качестве скрининга могут быть использованы наборы реактивов «Сиалотест» и «Мукопротеины» с последующим (при необходимости) применением развернутых методов исследования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Зворыгин, Игорь Анатольевич, 2004 год

1. Абдулкадыров К.М. Всегда ли обязательна цитогенетическая верификация хронического миелолейкоза?/ К.М. Абдулкадыров, О.А. Рукавицын, С.С. Бессмельцев// Тер. арх,- 1996.- №7. - С. 27-31.

2. Абдулкадыров К.М. Хронический миелолейкоз./ К.М. Абдулкадыров, О.А. Рукавицын, С.С. Бессмельцев// СПб: «Специальная литература», 1998. -464 с.

3. Аврова Н.Ф. Выделение и очистка ганглиозидов мозга./ Н.Ф. Аврова, Е.Л. Обухова //Вопр.мед.химии.- 1973, Т.19, N 3, С.259-260.

4. Алексеев Н.А. Лейкозы у детей./ Н.А. Алексеев, И.М. Воронцов Л.: «Медицина», 1988. - 248 с.

5. Анасашвили А.Ц. Гликопротеиды сыворотки крови и мочи./ А.Ц. Анаса-швили// М., «Медицина», 1968, - 228 с.

6. Афанасьев Б.В. Родоначальные кроветворные клетки человека./ Б.В. Афанасьев, В.А. Алмазов// Л.: «Наука», 1985.- 204 с.

7. Балаба Т.Я. Нарушение обмена нейраминовой кислоты при острой травме/ Т.Я. Балаба, И.В. Каплан //Хирургия 1977, N 1. - С.79-85.

8. Барштейн Ю.И. Значение сиаловых кислот и изменений неклеточных структур сосудистых стенок в развитии отека мозга при менингоэнцефа-лите./ Ю.И. Барштейн, О.А. Ярош, Ш.В. Персидский //Врач, дело 1989, N 10. С.118-122.

9. Барышников А.Ю. Иммунологический фенотип бластных клеток у больных хроническим миелоидным лейкозом и его клиническое значение.// А.Ю. Барышников, Л.Ф. Морозова, И.В. Фриновская// Тер. арх.- 1984.- N 6. С. 50-53.

10. Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны. Факты и гипотезы./ Л.Д. Бергельсон//- М.: Наука, 1975, 183 с.

11. Болезни системы крови./Ф.Э. Файнштейн, Г.И. Козинец, С.М. Бахрамова, М.П. Хохлова// Ташкент: «Медицина», - 1987, - 670 с.

12. Бычков С.М. Новые данные о гликозаминогликанах и протеогликанах./ С.М. Бычков, М.М. Захарова//- Вопр. мед. химии 1979, Т.25, N 3, С.227-237.

13. Варазашвили Л.М. Сиалосодержащие гликоконъюгаты при раке яичников: Автореферат дис. . .канд.биол.наук/ Л.М. Варазашвили, Тбилиси, 1991.

14. Вейнберг А.Я. Функция ганглиозидов и родственных соединений на по15