Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Градобоева, Анастасия Евгеньевна

• Градобоева, Анастасия Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Градобоева, Анастасия Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ПРОДУКЦИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ.

1. ИНТЕРФЕРОНЫ.

1.1. Классификация интерферонов.

1.2. Интерферон-гамма и его роль в системе интерферонов.

1.3. Механизм действия интерферонов.

1.3.1. МК-БТАТ путь передачи сигнала в ядро.

1.3.2. Структура рецепторов интерферонов.

1.3.3. Пути проникновения комплекса интерферон/рецептор в клетку. 19 1.3.4 Транспорт интерферонов в ядро, сигналы ядерной локализаци.

1.4.Применение интерферонов.

2. СОЗДАНИЕ ВЕКТОРОВ И ШТАММОВ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ.

2.1. Клонирование чужеродных генов в микроорганизмах.

2.2. Гетерологичная экспрессия в дрожжах.

2.2.1. Особенности роста дрожжей Б. сегеу1Б1ае и Р. раяЮггя.

2.2.2. Промоторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии.

2.2.3. Векторы для экспрессии чужеродных генов в дрожжах.

2.2.4. Особенности секреции, гликозилирования и протеолиза белков у дрожжей.

3. ВЛИЯНИЕ ПРОДУКЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ НА КЛЕТКИ ДРОЖЖЕЙ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

1.1 Штаммы.

1.2 Плазмиды.

1.3 Условия культивирования штаммов.

2. МЕТОДЫ.

2.1 Трансформация бактерий Е. соН.

2.2 Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.

2.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. соН.

2.5 Электрофорез ДНК.

2.7 Выделение хромосомной ДНК из дрожжей.

2.8 Полимеразная цепная реакция.

2.9 Количественное определение активности кислых фосфатаз.

2.10 Определение концентрации белка.

2.11 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

2.12 Электроперенос белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу

2.13 Иммуноблот со специфическими антителами.

2.14 Гель-фильтрация на сефакриле 8-200.

2.15 Определение биологической активности.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. СОЗДАНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ СЕКЕУШАЕ -ПРОДУЦЕНТА ИФН-у БЫКА.

1.1 Характеристики штаммов-реципиентов.

1.2 Измерение активности кислых фосфатаз у штаммов-реципиентов.

1.3 Получение штаммов-продуцентов ИФН-у.

1.3.1 Трансформация штаммов плазмидойрУаВ.

1.3.2 Оценка митотической стабильности плазмиды рУОШ.

1.3.3 Тестирование продукции ИФН-у.

2. СОЗДАНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ Р1СН1А РАБТОШЗ -ПРОДУЦЕНТА ИФН-у БЫКА.

2.1. Получение рекомбинантной плазмиды рВЮ.

2.2 Получение штамма дрожжей Р. раБЮпБ - продуцента ИФН-у быка.

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРОДУКЦИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО БЕЛКА НА КЛЕТКИ ДРОЖЖЕЙ З.СЕЯЕУШАЕ И Р. РА8ТОШ8.

3.1 Культивирование штаммов-продуцентов ИФН-у.

3.2 Идентификация ИФН-у в клетках дрожжей.

3.3 Исследование адаптивной способности дрожжей cerevisiae и Р. раБ^пБ к стрессорным воздействиям.

3.3.1. Изучение уровня карбонильных групп в клеточных белках исходных штаммов и штаммов-продуцентов.

3.3.2. Изучение реакции исходных штаммов и штаммов-продуцентов на присутствие в среде перекиси водорода.

4.ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА ДРОЖЖЕЙ Р.РАЗТОМЗ, СЕКРЕТИРУЮЩЕГО УКОРОЧЕННЫЙ ИФН-у БЫКА.

4.1. Создание вектора экспрессии модифицированного ИФН-у быка в клетках дрожжей Р.разШпз.

4.2 Сравнение уровня продукции и биологической активности нативного и модифицированного иммунных интерферонов быка.

5. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИГНАЛЬНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ.

5.1 Получение модифицированного гена б/^Жг.

5.2. Создание плазмид, обеспечивающих экспрессию нативного и укороченного генов ИФН-у быка совместно с геном С?/7/5 в клетках дрожжей Р.разЮш.

5.3. Определение локализации нативного и укороченного рекомбинантных ИФН-у быка, сшитых с флюоресцентным белком вБР в клетках дрожжей

P.pastoris.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия нативного и модифицированного генов иммунного интерферона быка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris»

Актуальность проблемы. За последнее десятилетие иммунология претерпела глубокие изменения в связи с доказательством того, что иммунная система регулируется пептидными гормонами — цитокинами, действия которых подчиняются тем же закономерностям, что и процессы с участием классических гормонов и их рецепторов. На данный момент известна первичная структура нескольких десятков цитокинов, обеспечивающих дистанционное взаимодействие иммунокомпетентных клеток между собой. Среди них наиболее изучены к настоящему времени интерлейкины, колониестимулирующие факторы и интерфероны.

Интерфероны (ИНФ), представляющие собой естественную систему противовирусной защиты организма, помимо этого, оказывают иммуностимулирующее, противовоспалительное, противоопухолевое и антимитотическое действие. ИФН-у, иммунный, синтезируется Т-лимфоцитами после стимуляции их митогенами, антителами, интерлейкином-2 . Он оказывает, главным образом, антипролиферативное и иммуномодулирующее действие.

Иммунные интерфероны млекопитающих повышают бактерицидную и фунгицидную активность макрофагов и являются эффективными препаратами для лечения различных заболеваний животных. Использование интерферонов для лечения заболеваний различной этиологии имеет существенные преимущества по сравнению с традиционными антибиотиками и химиотерапевтическими препаратами за счет широкого спектра действия, обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов. Есть данные, что использование гамма-интерферона цыпленка в качестве адъюванта усиливает иммунный ответ организма на вакцины (ТакеЬага К. а1., 2003). Это позволяет предположить, что бычий ИФН-у можно использовать при вакцинации крупного рогатого скота.

В связи с широким спектром действия цитокинов в терапии многих заболеваний, естественно встала проблема получения значительных количеств этих биологически активных соединений. Эта проблема не могла быть решена традиционным способом - выделением из крови — ввиду ограниченности ресурсов донорской крови, а также опасности распространения вирусов.

С разработкой методов работы с ДНК in vitro появилась возможность клонировать и экспрессировать чужеродные гены в различных прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах. Впервые препараты рекомбинантных цитокинов были получены из бактерий Escherichia coli. Однако E.coli являются условно патогенными микроорганизмами, и получаемый белок не удается полностью очистить от продуктов жизнедеятельности бактерий, поэтому препарат в той или иной степени является токсичным, что значительно усложняет применение его в медицине. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов рекомбинантного иммунного интерферона быка позволяет использовать этот белок в ветеринарии.

В настоящее время ген иммунного интерферона быка клонирован в составе векторов, обеспечивающих продукцию рекомбинантного белка клетками дрожжей Pichia pastoris и секрецию синтезированного белка в культуральную жидкость. Однако не менее перспективным представляется использование в ветеринарии, штаммов дрожжей, накапливающих рекомбинантный гамма-интерферон быка внутри клетки. Дрожжи, содержащие белок, можно добавлять непосредственно в пищу животным, что позволит исключить стадию очистки и повысит биологическую ценность других кормов.

Достижения в области генной инженерии позволили получать продуцентов биологически активных веществ на основе разных видов микроорганизмов. Используя различные системы экспрессии, а также подбирая условия культивирования, можно добиться достаточно высокого уровня выхода рекомбинантного белка. Однако следует отметить, что целью подобных экспериментов является, в основном, повышение подукции гетерологичных белков. При этом мало внимания уделяется самим продуцентам и процессам, происходящим в клетках микроорганизмов во время продукции чужеродных белков, хотя такие исследования также могли бы помочь в решении основной задачи биотехнологии - получении достаточных количеств необходимого вещества.

Целью данной работы является получение с помощью методов генной инженерии штаммов дрожжей Засскаготусев сеге\>1з1ае и Р1сЫа разизпБ — продуцентов биологически активного ИФН-у быка и изучение особенностей продукции гетерологичного белка клетками двух видов дрожжей. В задачи исследования входит:

- получение вектора экспрессии, обеспечивающего синтез рекомбинантного нативного и модифицированного у-интерферона быка в клетках дрожжей Р. разЮНз; получение штаммов-продуцентов биологически активного у-интерферона быка на основе дрожжей cerevisiae и Р. раз Юг ¿я; изучение протеолитической стабильности нативного и модифицированного белков;

- сравнение эффективности дрожжей 51. сегеушае и Р. раяШпБ в качестве систем экспрессии гетерологичных генов;

- изучение влияния экспрессии гетерологичного гена бТ/^А^г на клетку-хозяина выявление возможного наличия сигнала ядерной локализации в молекуле бычьего ИФН-у Научная новизна исследования. Впервые получен штамм дрожжей Р. раБ^пБ — продуцент биологически активного ИФН-у быка. Впервые показано, что продукция рекомбинантного ИФН-у быка приводит к повышению количества карбонилированных белков в клетках дрожжей и, следовательно, является для них стрессорным фактором. Впервые показано, что дрожжи Р. рахЮпБ являются более устойчивыми к стрессовым воздействиям. Показано, что в клетках дрожжей Р. раБ^пз синтезированный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае 5*. сегеушяе он образует так называемые «тельца включения». Впервые показано, что сигнал ядерной локализации у-интерферона млекопитающих и обеспечивает транспорт гетерологичного белка в ядро дрожжевой клетки, что свидетельствует о его консервативности.

Практическая ценность. Штаммы дрожжей 5". сегел>1$гае и Р. раБ^пБ, синтезирующие и аккумулирующие рекомбинантный ИФН-у быка внутри клеток, могут быть использованы в качестве иммунопробиотической кормовой добавки для профилактики различных заболеваний животных. Штамм - продуцент модифицированного ИФН-у может быть использован для получения препарата и изучения спектра его действия. Систематические исследования спектра биологического действия ИФН-у, как и его применение в качестве лекарственного препарата затруднены, так как в настоящее время в России не существует препаратов гамма-интерферона быка.

ПРОДУКЦИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В КЛЕТКАХ

ДРОЖЖЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1. ИНТЕРФЕРОНЫ

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Градобоева, Анастасия Евгеньевна

ВЫВОДЫ.

1. Синтез рекомбинантного ИФН-у быка и накопление его в клетках подавляет рост штамма дрожжей 5. cerevisiae (2Р4-1-01Ш8/рУ01В). У дрожжей Р. рсиНогк ВКПМ У-2990 (08115/рВЮ) подавления роста не происходит, несмотря на более высокий уровень продукции.

2. В клетках дрожжей Р. раБЮпя гетерологичный белок находится в растворимом виде в цитоплазме, тогда как в случае & сегетъ'ше он образует «тельца включения» и экстрагируется из клеток только в присутствии детергента.

3. Продукция гетерологичного ИФН-у сопровождается повышением уровня карбонилированных белков является стрессорным фактором у обоих видов дрожжей.

4. Штаммы-продуценты обоих видов дрожжей более устойчивы к оксидативному стрессу, чем исходные штаммы. При этом дрожжи Р. раяШпБ оказались более адаптированными к стрессорным воздействиям, в том числе к синтезу гетерологичного белка, что обусловлено особенностями метаболизма.

5. Получен модифицированный ИФН-у быка, лишенный десяти С-концевых аминокислот, содержащих участок расщепления трипсиноподобными протеазами. Показано, что модифицированный белок, секретируемый штаммом дрожжей Р. раБ^пБ 08115(рР1С9/ВЮс110), не подвергается протеолизу в течение 72 часов культивирования и сохраняет биологическую активность.

6. Установлено наличие сигнала ядерной локализации в молекуле ИФН-у быка. Показано, что сигнал ядерной локализации млекопитающих выполняет свою функцию в клетках дрожжей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Градобоева, Анастасия Евгеньевна, 2010 год

1. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г. и др. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии // Биотехнология.- 2001.- №2.- С.48-56.

2. Градобоева А.Е., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris — продуцента у-интерферона быка // III Московский международный конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития». 2005. - С.75-76.

3. Градобоева А.Е., Падкина М.В. Изучение влияния продукции гетерологичного белка на физиологическое состояние дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris II Вестн. С.-Петерб. Ун-та. -2008. Сер.З, Вып.2. - С.58-63.

4. Градобоева А.Е., Падкина М.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н. Штамм дрожжей Pichia pastoris PS 106 (pHIG), являющийся продуцентом иммунного интерферона человека, рекомбинантная плазмидная ДНК pHIG и способ ее конструирования // Патент РФ №2315806. С1. 2006.

5. Дебабов В.Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // М.: Высшая школа. -1988.

6. Егорова О.Н., Балабанова P.M. Система интерферона при ревматических заболеваниях // Клиническая ревматология.- 1993. -. № 2. С.51-54.

7. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при паталогии // М.: Медицина. 1996

8. Ершов Ф.И., Новохатский A.C. Интерферон и его индукторы // М.: Медицина. 1980.

9. Ю.Завьялов В.П. Структурно-функциональная классификация и эволюция цитокинов // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. 1993. - Т.2. - С.8-9.

10. Карпищенко А.И., Пастушенков В. Л., Михалева Н.П. и др. Стресс, белки теплового шока и апоптоз // В кн.: Программированная клеточная гибель. С-Пб.: Наука. 1996. - С. 149-156.

11. Кетлинский С. А., Белов Д. А. Фактор некроза опухоли и лимфотоксин-эндогенные противоопухолевые антибиотики // Успехи современной биологии. 1989. - Т.107. - С.78-91.

12. Кетлинский С. А., Симбирцев A.C., Воробьев Ф.Ф. Эндогенные иммуно-модуляторы // Ст.-Петербург.: Гиппократ. 1992.

13. Н.Кольман Я., Рём К. Наглядная биохимия. // М., «Мир». 2000

14. Лабас Ю.А., Гордеева A.B., Фрадков А.Ф. Флюоресцирующие и цветные белки // Природа. 2002. - №3. — С.33-43.

15. Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование // М.: Мир. 1984.

16. Марстон Ф. А.О. Выделение эукароитических полипептидов, продуцируемых в клетках Е. coli II В кн.: Новое в клонировании ДНК. М.: Мир. 1989. - С. 95-137.

17. Мирошников П.Н., Лебедев Л.Р., Терещенко Т.А. Получение интерферона-гамма и его аналога дельтаферона // Биотехнология. -2005.-№1.-С.11-18.

18. Мюльберг A.A. Фолдинг белков // Издат. С.-Петербургского университета. 2004.

19. Николаев Я.В., Парфенова JI.B., Падкина М.В. и др. Использование дрожжей Pichia pastoris в качестве продуцента рекомбинантного у-интерферона быка // Цитокины и воспаление. 2002. - Т.1. - С.28-29.

20. Парфенова JI.B., Самбук Е.В., Смирнов М.Н., Падкина М.В. Продукция ß-интерферона человека в дрожжах Saccharomyces cecevisiae ведет кснижению активности цитохром с-оксидазы // Биотехнология. — 2002. -№6. С.3-10.

21. Ройт А. Основы иммунологии // М.: Мир. 1991.

22. Савельева Н.В. Получение трансгенных растений продуцентов бычьего гамма-интерферона // Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук. - СПбГУ. - Санкт-Петербург. - 2009.

23. Смит К.Ф. Регуляция функций Т- и В-клеток лимфокинами // В кн.: Иммунология. М.: Мир. 1988. - Т.2. - С.396-425.

24. Соколовский В.Ю., Белозерская Т.А. Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развития Neurospora crassa II Успехи биол. Химии. 2000. - Т.40. - С.85-152.

25. Татьков С.И., Смирнова О.Ю., Цивковский Р.Ю. и др. Мутантные гамма-интерфероны человека с измененным С-концом и их свойства // Молекуляр. биол. -1995. NT 29. - №.5. - С. 1095-1101.

26. Тотолян Н.А. Диагностика и лечение рассеянного склероза с позиций доказательной медицины // Мир медицины.- 2000.- №5-6.

27. Чередеев А.Н., Ковальчук JI.B. Клеточные и молекулярные аспекты иммунных процессов // В кн.: Итоги науки и техники. Иммунология. ВИНИТИ. М. -1989. - Т. 19. - С. 239.

28. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия // Сибирское университетское издательство, Новосибирск. 2004.

29. Adams D.O., Hamilton Т.А. Molecular transductional mechanisms by which IFN gamma and other signals regulate macrophage development // Immunol.Rev. 1987. - V.97. - P.5-27.

30. Aggarwal B.B., Eessalu Т.Е. Induction of receptors for tumor necrosis factor-alfa by interferons is not a major mechanism for their synergistic cytotoxxic response // J.Biol.Chem. 1987. - Y.262. - P. 10000-10007.

31. Aguet M., Dembic Z., Merlin G. Molecular cloning and expression of the human interferon-y receptor // Cell. 1988. - V.55. - P.273-280.

32. Arrigo A.P. Investigation of the function of the heat shock proteins in Drosophila melanogaster tissue culture cells // Mol. Gen. Genet. — 1980. — V. 178(3). -P. 517-524.

33. Attfield P.V. Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker's yeast//Nat. Biotechnol. 1997. -V. 15. - P. 1351-1357.

34. Austin A.J., Jones C.E., Heeke G.V. Production of human tissue factor using the Pichiapastoris expression system // Protein Exprès. Purif. 1998.- V.13. - P.136-142.

35. Ballou C.E. A study of the immunogenicity of three yeast mannans // J.Biol.Chem. 1970. - V.245. - P. 1197-1203.

36. Bazan J.F. Structural disign and molecular evolution of cytokine receptor superfamily // Proc. nat. Acad. sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 6934-6938.

37. Beggs J.D. Transformation of yeast by a replicating hibrid plasmid // Nature. 1978. - V. 275. - P. 104-109.

38. Bidwai A.P., Hanna D.E., Glover C.V.C. Purification and characterization of casein kinase II (CK II) from AckalAcka2 S.cerevisiae rescued by Drosophila CK II subunits // J.Biol.Chem. 1992. - V.267. - P.790-796.

39. Birnboim H.C., Doly L.J. A rapid alkalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucleic Acids Res. 1970.-V. 7. -P. 1513.

40. Bitter G.A., Egan K.M., Koski R.A. et al. Expression and secretion vectors for yeast // Methods Enzymol. 1987. - V.153. - P.516-544.

41. Bitter G.A., Egan K.M. Expression of interferon-gamma from hybrid yeast GPD promoters containing upstream regulatory sequences from the GAL1-GAL10 intergenic region // Gene. 1988.- V.69. - P. 193-207.

42. Bradford M.A. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding // Academic press. Virginia. — 1976.- P.10.

43. Broach J.R. Construction of high copi yeast vectors using 2- circle sequence//Methods Enzimol. 1983. - V.101. - P. 307-325.

44. Bustelo X.R., Otro A. et al. Expression of the rat protimosin alfa gene during T-limphocyte proliferation and liver regeneration // J. biol. Chem. -1991.-V.266.-P. 1443-1448.

45. Cabiscol E., Piulats E., Echave P. et al. Oxidative stress promotes specific protein damage in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 2000. -V.275. - P.27393-27398.

46. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity // Ann. Rev. Biochem. 1989. -V.58. - P.79-110.

47. Cereghino J.L., Cregg J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris II FEMS Microbiol.Rev. 2000. -V.24. - P.45-66.

48. Cerretti D.P., McKereghan K., Larsen A. et al. Cloning, sequence, and expression of bovine interferon-gamma // J. Immunol.- 1986.- V.136.-P.4561-4564.

49. Cinatl J., Morgenstern B., Bauer G. et al. Treatment of SARS with human interferons // Lancet. 2003.- V.362.- P.293-294.

50. Clare J.J., Romanos M.A., Rayment F.B. et al. Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies // Gene. 1991. - V.105. - P.205-212.

51. Couderc R., Baratti J. Oxidation of methanol by yeast Pichia pastoris. Purification and properties of alcohol oxidase // Agric.BioI.Chem. 1980. -V.44. - P.2279-2289.

52. Cousens L.S., Shuster J.R., Gallegos C. et al. High level expression of proinsulin in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Gene.- 1987. V.61. -P.265-275.

53. Cregg J.M., Madden K.R. Development of the methylotrophic yeast, Pichia pastoris, as a host system for the production of foreign proteins // Dev. Ind. Microbiol. (J. Ind. Microbiol.- Suppl.3). 1988. - V.29. - P.33-41.

54. Cregg J.M., Vedvick T.S., Raschke W.C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris II Bio/Technol. 1993. - V.l 1.- P.905-910.

55. Czarniecki C.W., Fennie C.W., Powers D.B., Estell D.A. Synergistic antiviral and antiproliferative activities of Escherichia coli-derived human alpha, beta and gamma interferons // J.Virology. 1984. - V.49. - P.490-496.

56. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustrini D. et al. Actin carbonilation from a simple marker of protein oxidation to relevant signs of severe functional impairment // Free Radic.Biol.Med. 2001. - V.31 (9). - P. 1075-1083.

57. Darnell J.E.,Jr., Kerr I.M., Stark G.R. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signalling proteins II Science. 1994. - V.264. - P.1415-1421.

58. Doherty G.J., McMahon N.T. Mechanisms of endocytosis // Annu. Rev. Biochem. 2009. - V. 78. - P. 857-902.

59. Dul J.L., Argon Y. A single amino acid substitution in the variable region of the light chain specifically blocks immunoglobulin secretion // Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P.8135-8139.

60. Duman J.G., Miele R.G., Liang H. et al. O-mannosylation of Pichia pastoris cellular and recombinant proteins // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. -V.28. - P.39-45.

61. Ealick S.E., Cook W.J., Vijay-Kumar S. et al. Three-dimentional structure of recombinant human interferon-y // Science. 1991. - V.252. - P.698-702.

62. Ellis R.J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated // Trends Biochem. Sci. 2001. -V.26. - P.597-604.

63. Estruch F. Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes and stress tolerance in budding yeast // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V.24. -P.469-486.

64. Fischer J.S., Priore R.L., Jacobs L.D. et al. Neuropsychological effects of interferon beta-la in relapsing multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Collaborative Research Group // Ann. Neurol. 2000. - V48. - P.885-892.

65. Fischer R., Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins // Transgenic Res. 2000. - V9. - P.279-299.

66. Fujimura H., Sakuma Y. Simplified isolation of chromosomal and plasmid DNA from yeast // Biotechniques. 1997. - V.14. - P.538-539.

67. Furlan R., Bergami A., Lang R. et al. Interferon-beta treatment in multiple sclerosis patients decreases the number of circulating T cells producing interferon-gamma and interleukin-4 // J. Neuroimmunol.- 2000.- V.lll. -P.86-92.

68. Galilov E.E., Smirnov O.Yu. Nucleotide sequence of Yersinia pestis gene encoding F1 antigen and the primary structure of the protein (putative T and B epitopes) // FeBS Lett. 1990. - V.277. - P.230-323.

69. Gasch A.P., Werner-Washburne M. The genomics of yeast responses to environmental stress and starvation // Funct. Integr. Genomics. 2002. -V.2.-P. 181-192.

70. Gemmil T.R., Trimble R.B. Overview of N- and O-linked oligosaccaride structures found in various yeast species // BBA. 1999. — V.1426. - P. 27237.

71. Godon C., Lagniel G., Lee J. et al. The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 1998. - V.273. - P.22480-22489.

72. Gorlich D., Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport // Science. 1996. -V.271. - P. 1513-1518.

73. Gray P.W., Goeddel D.V. Structure of the human immune interferon gene // Nature. 1982. - V.298. - P.859-563.

74. Greenlund A.C., Morales M.O., Viviano B.L. et al. Stat recruitment by tyrosine-phosphoiylated cytokine receptors: an ordered reversible affinity-driven process // Immunity 1995. — V.2. - P.677-687.

75. Grossberg S.E., Taylor J.L., Kurshnaryov V.M. Interferon receptors and their role in interferon action // Experientia. 1989. - V.45. - P.508-518.

76. Hagenson M.J., Holden K.A., Parker K.A. et al. Expression of streptokinase in Pichia pastoris yeast // Enzyme Microb. Technol. 1989. — V.ll. -P.650-656.

77. Halliwell B. Free radicals and antioxidants: a personal view // Nutr. Rev. -1994. V.52. - P.253-265.

78. Hannigan G.E., Fish E.N., Williams B.R.G. Modulation of human interferon-a receptor expression by human interferon-y // J.Biol.Chem. -1984. V.259. - P.8084-8086.

79. Heim J., Takabayashi K., Meyhack B. et al. C-terminal proteolytic degradation of recombinant desulfato-hirudin and its mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Eur. J. Biochem.- 1994.- V.226.- P.341-353.

80. Hitzeman R.A., Chen C.Y., Hagie F.E. et al. Expression of hepatitis B virus surface antigen in yeast // Nucl. Acid Res. 1983. - V. 11.- P.2746-2763.

81. Hitzeman R.A., Hagie F.E., Levine H.L. et al. Expression of a human gene for interferon in yeast // Nature. 1981. - V.293. - P.717-722.

82. Ito H., Fucuda Y., Murata K. et al. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations // J. Bacteriol. 1983. - V153. - P.163-168.

83. Itoh Y., Hayakawa T., Fujisawa Y. Expression of hepatitis B virus surface antigen P31 gene in yeast // Bioch. and Bioph.Res.Commun. 1986. -V.138.-P. 268-274.

84. Iyer V., Struhl K. Mechanism of differential utilization of the his3 T-R and T-C TATA elements II Mol. Cell. Biol.-1995b.- V. 15.- P.7059-7066.

85. Iyer V., Struhl K. Poly(dA-dT), a ubiquitous promoter element that stimulates transcription via its intrinsic DNA structure // EMBO J.- 1995a.-V.14.- P.2570-2579.

86. Johnson H.M., Szente B.E. C-terminal peptides of interferon-y // United State Patent № 6.120.762. 2000.

87. Jurgen B., Lin H.Y., Riemschneider S. et al. Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations // Biotechnol. Bioeng. 2000. - V.70. - P.217-224.

88. Kalderon D., Roberts B.L., Richardson W.D., Smith A.E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location // Cell. — 1984. — V.39. — P.499-509.

89. Kanaya E., Higashizaki T., Ozawa F. et al. Synthesis and secretion of human growth factor by Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1989. - V.83. -P.65-74.

90. Kang H.A., Kim S.J., Choi E.S. et al. Efficient production of intact human parathyroid hormone in a Saccharomyces cerevisiae mutant deficient in yeast aspartic protease 3 (YAP3) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998.-V.50. - P.187-192.

91. Karpusas M., Nolte M., Benton C.B. et al. The crystal structure of human interferon P at 2.2-A resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997,-V.94.- P. 11813-11818.

92. Kerry-Williams S.M., Gilbert S.C., Evans L.R. et al. Disruption of the Saccharomyces cerevisiae YAP3 gene reduces the proteolytic degradation of secreted recombinant human albumin // Yeast. — 1998. V.14. - P.161-169.

93. Kingsman S.M., Kingsman A.J., Mellor J. The production of mammalian proteins in Saccharomyces cerevisiae // Trends Biotechnol. -1987. V.5.-P.53-57.

94. Kishko I.H., Vasilenko M.I. Properties of natural animal gamma-interferons and peculiarity of their action // Mikrobiol. Z. 1998. - V.60.-P.65-70.

95. Koch K.A., Thiele D.J. Functional analysis of a homopolymeric (dA-dT) element that provides nucleosomal access to yeast and mammalian transcription factors // J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.- P.23752-23760.

96. Kotenko S.V., Izotova L.S., Pollack B.P. et al. Interaction between the components of the interferon-receptor complex // JBC 1995. - V.270(36).-P.20915-20921.

97. Krause C.D., He W., Kotenko S. et al. Modulation of the activation of Statl by the interferon-gamma receptor complex // Cell Res. 2006. -V.16(l). —P.113-123.

98. Krause C.D., Lavnikova N., Xie J. et al. Preassembly and ligand-induced restructuring of the chains of the IFN-gamma receptor complex: the roles of Jak kinases, Statl and the receptor chains // Cell Res. 2006. - V.16(l). -P.55-69.

99. Kukurusinska M.A., Bergh M.L., Jackson B.L. Protein glycosylation in yeast // Ann.Rev.Biochem. 1987. - V.56. - P.915-944.

100. Larkin J. 3rd, Subramaniam P.S., Torres B.A. et al. Differential properties of two putative nuclear lokalization sequences found in the carboxyl-terminus of human IFN-gamma // J.Interferon Cytokine Res. -2001.-V.21(6).-P.341-348.

101. Lee S.H., Aggarwal B.B., Rinderknecht E., Assisi F., Chiu H. The synergistic anti-proliferative effect of gamma-interferon and human lymphotoxin// J.Immunol. 1984. - V.133. - P.1083-1086.

102. Legrain M., Portetelle D., Dumont J. et al. Biochemical and immunological characterization of the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein (gp51) produced in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1989. - V.79. - P.227-237.

103. Legrain M., Portetelle D., Dumont J. et al. Biochemical and immunological characterization of the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein (gp51) produced in Saccharomyces cerevisiae II Gene. 1989. - V.79. - P.227-237.

104. Li W.Z., Sherman F. Two types of TATA elements for the CYC1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol.- 1991.- V.ll.-P.666-676.

105. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. Advances in refolding of proteins prodused in E. coli II Curr. Opin. Biotechnol. 1998. - V.9. - P. 497-501.

106. Littman S.J., Faltynek C.R., Baglioni C. Binding of human1 0 ^recombinant ~ I-interferon-y to receptors on human cells // J.Biol.Chem. -1985. V.260. - P.l 191-1195.

107. Lou J., Gasche Y., Zheng L. et al. Interferon-beta inhibits activated leukocyte migration through human brain microvascular endothelial cell monolayer//Lab. Invest.- 1999.- V.79.- P.1015-1025.

108. Lowenthal J.W., O'Neil T.E., David A. et al. Cytokine therapy: a natural alternative for disease control II Vet. Immun. Immunopathol.- 1999.- N .12-P.183-188.

109. Lucht J.M., Bremer E. Adaptation of Escherichia coli to high osmolarity environments: osmoregulation of the high affinity glycine betaine transport system ProUIIFEMS Microbiol. Rev. 1994. - V.14. - P.3-20.

110. Lussier M., Sdicu A.M., Bussereau F. The KTR and MNNJ mannosyltransferase families of Saccharomyces cerevisiae II Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V.1426. - P.323-334.

111. Maris A.F., Kern A.L., Picada J.N. et al. Glutathione, but not transcription factor Yaplp, is required for carbon source-dependent resistance to oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. -2000. V.37. -P.175-182.

112. Moir D.T., Davidow L.S. Production of proteins by secretion from Yeast//Meth. Enzymol. 1991. - V. 194. - P.491.

113. Nagatani T., Okazawa H., Kambara T. et al. Effect of natural interferonbeta on the growth of melanoma cell lines // Melanoma Res. 1998. - V.8. -P.295-299.

114. Nichols D.J., Lippincott-Schwartz J. Endocytosis without clathrin coats // Trends in Cell Biol. 2001. - V.l 1(10). - P.406-412.

115. Novick D., Cohen B., Rubinstein M. The human interferon alpha/beta receptor: characterization and molecular cloning // Cell. 1994. - V.77. -P.391-400.

116. Novick D., Orchansky P., Revel M., Rubinstein M. The human interferon-y receptor: purification, characterization ,and preparation of antibodies //J.Biol.Chem. 1987. - V.262. - P.8483-8487.

117. Ohi H., Ohtani W., Okazaki N. et al. Cloning and characterization of the Pichia pastoris PRC1 gene encoding carboxypeptidase Y // Yeast. -1996.-Y.12.-P.31-40.

118. Oshima Y. Regulatory circuits for gene expression: the metabolism of galactose and phosphate // In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae: metabolism and gene expression.- CSHL.- N.Y.- 1982.- P.159-180.

119. Patarca R., Schartz J. et al. Rpt-1, an intracellular protein from helper/inducer T-cells that regulates gene expression of interleukin-2 receptor and human immunodificiency virus type 1 // Proc. nat. Acad. sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 2733-2737.

120. Paty D.W., Li D.K.B. Interferon beta-lb is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis. II MRI analysis results of multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial // Neurology. 1993. -V.43. - P.662-667.

121. Pestka S., Krause.C.D. Walter M.R. Interferons, interferon-like cytokines and their receptors// Immunol.Rev. 2004. - V.202. - P.8-32.

122. Pestka S., Langer J.A., Zoon K.C., Samuel C.E. Interferons and their actions // Ann.Rev.Biochem. 1987. - V.56. - P.727-777.

123. Phadke A.P., Mehrad B. Cytokines in host defense against Aspergillus: recent advances // Medical Mycology Supplement I. 2005. - V. 43. -P.173-176.

124. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W. et al. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Gene. — 1992. V.lll. — P.229-233.

125. Primrose S.B. The application of geneticalli engineered microorganisms in the production of drugs // J. Appl. Bacterid. 1986. - V. 61. -P. 99-116.

126. Pristie J.P., Schar H.-P. et al. Crystal structure of the cytokine interleukine-1 beta // EMBO J. 1988. - V. 7. - P. 339-349.

127. Radhakrishnan R., Walter L.J., Hruza A. et al. Zinc mediated dimmer of human interferon-alpha 2b revealed by X-ray crystallography // Structure.- 1996,- V.4.- P. 1453-1463.

128. Ramana C.V., Chaterjee-Kishore M., Nguyen H. et al. Complex roles of Statl in regulating gene expression // Oncogene — 2000. — V.19. P.2619-2627.

129. Ramana C.V., Gil M.P., Schreiber R.D. et al Statl-dependent and -independent pathways in IFN-y-dependent signaling // Trends in Immunol. — 2002. V.23(2). - P.96-101.

130. Ramana V.C., Gill M.P., Ransohoff R.M. et al. Statl-independent regulation of gene expression in response to IFN-y // PNAS — 2001. -V.98(12). -P.6674-6679.

131. Ramos J.L., Duque E., Rodriguez-Herva J.J. et al. Mechanisms for solvent tolerance in bacteria // J. Biol. Chem. 1997. - V.272. - P. 38873890.

132. Remaut E., Stansser P., Simons G. Et al. Use of the phage lambda Pi promoter for high-level expression of human interferons in Escherichia coli // Methods in enzymology. 1986.- v.l 19.- p.366-375.

133. Rinderknecht E., O'Conner B.H., Rodriguez H. Natural human interferon-gamma. Complete amino acid sequence and determination of sites of glycosylation // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P.6790-6797.

134. Romanos M.A., Scorer C.A., Clare J.A. Foreign gene expression: a review // Yeast. 1992. - V.8. - P.423-488.

135. Rusconi S., Agarossi A., Ravasi L. et al. Serum 2'5'-oligoadenylate synthase levels and clinical response to interferon-beta therapy in women with genital human papillomavirus infection // J. Infect. Dis. 1994. - V.l69. - P.l 112-1115.

136. Sadir R., Lambert A., Lortat-Jacob H. et al. Caveolae and clathrin-coated vesicles: two possible internalization pathways for Ifn-gamma and IFN-gamma receptor // Cytokine. 2001. - V.l4(1). - P. 19-26.

137. Schaber M.D., Dechiara T.M., Kramer R.A. Yeast vectors for production of interferon // Methods in enzymology. 1986. - V.l 19. - P.183-192.

138. Schindler C., Darnell J.E.,Jr. Transcriptional responses to polypeptide ligands: the JAK-STAT pathway //Annu.Rev.Biochem. 1995. - V.64. -P.621-651.

139. Schindler C., Shaai K., Presioso V.R. et al. Interferon-dependent tyrosine phosphorylation of a latent cytoplasmic transcription factor // Science — 1992. V.257. — P.809-813.

140. Schneider J.C., Guarente L. Vectors for expression of cloned genes in Yeast: Regulation, Overproduction and Underproduction // Meth. Enzymol. 1991. - V.194. - P.373-387.

141. Schultz L.D., Tanner J., Hofmann K.J. et al. Expression and secretion in yeast of a 400-kDa envelope glycoprotein derived from Epstein-Barr virus // Gene. 1987.- V.54.-P.113-123.

142. Sedlacek H.-H., Moroy T. Immune reactions: headlines, overviews, tables and graphics // Springer. 1995.

143. Sekimoto T., Imamoto N., Nakajima K.et al. Extracellular signal-dependent nuclear import of Statl is mediated by nuclear pore-targeting complex formation with NPI-1, but not Rchl // EMBO J. 1997. - V.16. -P.7067-7077.

144. Sekimoto T., Nakajima K., Tachibana T. et al. Interferon-y-dependent nuclear import of Statl is mediated by the GTPase activity of Ran/TC4 // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P.31017-31020.

145. Sentsui H., Murakami K., Inoshima Y. et al. Anti-viral effect of recombinant bovine interferon gamma on bovine leukaemia virus // Cytokine. 2001. - V.16.- P.227-231

146. Shen S., Suiter G., Jeffries T.W. et al. A strong nitrogen source-regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris II Gene. 1998. - V.216. - P.93-102.

147. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from luminous hydromedusan, Aequorea II J.Cell.Comp.Physiol. 1962. - V.59. - P. 223239.

148. Sigurdson D.C., Gaarder M.E., Livingston D.M. Characterization of the transmission during cytoductant formation of the 2 DNA plasmid from Saccharomyces // Mol. Gen. Genet. 1981. - V. 183. - P. 59-65.

149. Silvennoinen O., Ihle J.N., Schlessinger J., Levy D.E. Interferon-induced nuclear signalling by Jak protein tyrosine kinases // Nature. 1993. -V.366. - P.583-585.

150. Sonnleitner B. Dinamic adaptation of microbes // J. Biotechnol. -1998.-V.65.-P. 47-60.

151. Sreekrishna K.5 Potenz R.H.B., Craze J.A. et al. High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeast Pichia pastoris II J. Basic. Microbiol. 1988. - V.28. - P.265-278.

152. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R. et al. How cells respond to interferons // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V.67. - P.227-264.

153. Strahl K. Yeast transcriptional regulatory mechanisms // Annu. Rev. Genet.- 1995.- V.29.- P.651-674.

154. Subramaniam P.S., Mujtaba M.G., Paddy M.R. et al. The carboxyl terminus of interferon-y contains a functional polybasic nuclear localization sequence //J. Biol. Chem. 1998. - V.274(l). -P.403-407.

155. Sugarman B.J., Aggarwal B.B., Hass P.E., Figari I.S., Palladino M.A.,Jr., Shepard M.M. Recombinant human tumor necrosis factor-a: effects on proliferation of normal and transformed cells in vitro // Science. -1985. V230.- P.943-945.

156. Svedersky L.P., Shepard H.M., Spencer S.A., Shalaby M.R., Palladino M.A. Augmentation of human natural cell-mediated cytotoxicity by recombinant interleukin-2 // J.Immunol. 1984. - V.133. - P.714-718.

157. Tak P.P., Hart B.A., Kraan M.C. et al. The effects of interferon beta treatment on arthritis // Rheumatology. 1999. - V.38. - P.362-369.

158. Takehara K., Kobayashi K., Ruttanapumma R. et al. Adjuvant effect of chicken interferon-gamma for inactivated Salmonella Enteritidis antigen //J. Vet. Med. Sei. 2003. - V.65(12). - P. 1337-1341.

159. Taniguchi T., Ohno S., Fujii-Kriyana Y. Construction and «identification of a bacterial plasmid containing the human fibroblast interferon gene sequence // Proc. Japan. Acad. — V.55. — P.464-469.

160. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E. coli to fold or to refold // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1997. - V.66. - P.197-238.

161. Tovey M.G. Expression of the genes of interferons and other cytokines in normal and diseased tissues of man // Experientia. 1989. - V.45. - P.526-534.

162. Trent J.M., Olson S., Lawn R.M. Chromosomal localization of human leukocyte, fibroblast, and immune interferon genes by means of in situ hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79. - P.7809-7813.

163. Trimble R.B., Atkinson P.H., Tschopp J.F. et al. Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris II J. Biol. Chem. r 1991. V.266. -P.22807-22817.

164. Uecer U., Bartsch M., Scheurich P., Berkovic D., Ertel C., Pfizenmaier K. Quantitation and characterization of y-interferon receptors on human tumor cells // Cancer Res. 1986. - V.46. - P.5339-5343.

165. Veenhuis M., van Dijken J.P., Harder W. The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeasts // Adv. Microbiol. Physiol. 1983. - V.24. - P. 1-82.

166. Wang B.-D., Kuo T.-T. Induction of a mitosis delay and cell lysis by high-level secretion of mouse a-amylase from Saccharomyces cerevisiae II Appl. Envir. Microbiol. 2001. - V. 67(8). - P. 3693-3701.

167. Waschutza G., Li V., Otto B. Thermostable variants of human interferon-y (IFN-y) // United State Patent № 6.046.034. 2000.

168. Waterham H.R., Digan M.E., Koutz PJ. et al. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter // Gene. 1997. - V.186. - P.37-44.

169. Werten M.W., de Wolf F.A. Reduced proteolysis of secreted gelatin and Ypsl-mediated alfa-factor leader processing in a Pichia pastoris kex2 disruptant// Appl.Environ.Microbiol. 2005. - Y.71. - P.2310-2317.

170. Williams B.R.G. Transcriptional regulation of interferon-stimulated genes//Eur.J.Biochem. 1991. - V.200. -P.l-11.

171. Woolford C.A., Daniels L.B., Park F.J. et al. The PEP4 gene encodes an aspartyl protease implicated in the posttranslational regulation of Saccharomyces cerevisiae vacuolar hydrolases // Mol. Cell Biol. 1986. -V.6. -P.2500-2510.

172. Yano T., Takigami E., Yurimoto H., Sakai Y. Yap 1-regulated glutation redox system curtail accumulation of formaldehyde and reactive oxygen species in methanol metabolism of Pichia pastoris // Eucariotic Cell. 2009. - V.8(4). - P. 540-549.

173. Zabriskie D.W., Arcuri E.J. Factors influencing productivity of fermentation employing recombinant microorganisms // Enzyme Microb. Technol. 1986. - V. 8. - P. 706-717.

174. Zakian V.A., Brewer B.J., Fangman W.L. Replication of each copy of yeast 2 micron DNA plasmid occurs during the S phase // Cell. 1979. -V. 17.-P.923-934.

175. Zhang Z., Tong K.-T., Belew M., Pettersson T., Janson J.-C. Production, purification and characterization of recombinant human interferon-y//J. Chromatography. 1992. - V.604. - P.143-155.

176. Zhang Z.D., Hutching G., Kitching P. et al. The effects of gamma interferon on replication of foot-and-mouth disease virus in persistently infected bovine cells // Arch. Virol. 2002. - V.147. - P.2157-2167.

177. Zurbriggen B., Bohlen E., Sanglad D. et al. Controlled expression of heterologous cytochrome P450e cDNA in Saccharomyces cerevisiae. Construction and expression of a complete rat cytochrome P450e cDNA // J. Biotechnol.- 1989. V.9. - P.255-272.

178. Zwart K., Veenhuis M., van Dijken J.P. et al. Development of amine oxidase-containing peroxisomes in yeast during growth on glucose in the presence of methylamine as the sole source of nitrogen // Arch. Microbiol. -1980.-V.126.-P.117-126.