Структурно-функциональные исследования белка рековерина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Щульга-Морской, Сергей Владиславович

• Щульга-Морской, Сергей Владиславович
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Щульга-Морской, Сергей Владиславович

4.2.4Кальциевый блот

4.2.5Изучение связывания кальция рековерином и его

мутантами флуоресцентным методом

4.2.6 Определение протеолитической активности делеционньгх

мутантов рековерина

4.2.7Выделение наружных сегментов палочек сетчатки (НСП)

66

4.2.8Получение сетчаточного рековерина

4.2.9Получение родопсинкиназы и отмытых мочевиной мембран НСП68

4.2.10 Получение родопсинкиназы с использованием рековериновой колонки

4.2.11 Фосфорилирование родопсина в суспензии НСП

4.2.12 Определение активности родопсинкиназы в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП и очищенную родопсинкиназу

4.2.13 Аналитические процедуры

5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5.1 Получение миристоилиров анной и

немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина и сравнение их функциональной активности с сетчаточным рековерином

5.2 Получение, выделение и структурно-функциональные свойства делеционных мутантов рековерина

5.2.1 Протеолитические свойства мутанта рековерина р2бА29

5.3 Получение, выделение и структурно-фуьжциональные

свойства точечных мутантов рековерина

5.3.1 Выделение мутантных форм рековерина

5.3.2 Проверка способности мутантных форм рековерина связывать Са2+

5.3.3 Исследования вторичной структуры точечных мутантов рековерина в зависимости от концентрации кальция

6 ВЫВОДЫ

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Список использованных сокращений.

НСП - наружные сегменты палочки ТМС - трансмембранные столбы

ПААГ - ДсЫа - полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия

[Ca2+]f - концентрация свободного Са2+

АТ - антитела

ДТТ - дитиотреит

ПКА - протеинкиназа А

ПКС - протеинкиназа С

Та, Тр, Ту - а-, Р-, у- субъединицы трансдуцина, соответственно ФДЭ - фосфодиэстераза циклического 3',5'-гуанозинмоно-фосфата ФДЭа, ФДЭР и ФДЭу - а-, Р-, у-субъединицы фосфодиэстеразы, соответственно

цГМФ - циклический 3', 5'-гуанозинмонофосфат

ЭГТА - бис-(2-аминоэтиловый) эфир этиленгликоль-^К,К,1Ч'-

тетрауксусной кислоты

IgG - иммуноглобулины G

Mw - молекулярная масса

Rho - "темновой" родопсин

Rho* - фотовозбужденный родопсин

Rho-P - фосфорилированный "темновой" родопсин

Rho*-P - фосфорилированный светоактивированный родопсин

TEMED - 1Ч,М,ТчГ,1чР-тетраметилэтилендиамин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные исследования белка рековерина»

2 Введение

Наиболее распространенными мессенджерами в клетках являются ионы Са2+ и процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования белков, которые используются для передачи и регуляции самых разнообразных внешних и внутриклеточных сигналов, управляющих такими основными биологическими функциями, как клеточное деление и дифференцировка, иммунитет, транспорт и гормональная регуляция. Поскольку наиболее высокое содержание сигнальных белков обнаружено в фоторецепторных клетках, то зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с О-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - трансдуцин - сОМР-фосфодиэстераза послужили моделями для огромного числа работ по системам рецептор - О-белок - эффекторный белок, функционирующим в клетках других типов.

Действие Са2+ на системы клеточной сигнализации зачастую опосредовано Са2+-связывающими белками, мишенями для которых

/•у

очень часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Са -связывающим белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилирования/дефосфорилирования посвящено огромное число работ; фоторецепторная клетка в этом отношении -исключение. К настоящему времени ясны общая картина и многие детали зрительной трансдукции у позвоночных животных, в частности доказана важность фосфорилирования родопсина для аттеньюации сигнала в зрительном каскаде и для световой адаптации фоторецепторной клетки. Однако систематическое и

интенсивное исследование роли Са2+-связывающих белков в регуляции фототрансдукции у позвоночных животных, в том числе -в регуляции фосфорилирования зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей протеинкиназы (родопсинкиназы), было начато лишь недавно, во многом благодаря обнаружению в 1991 году Са2+-связывающего белка рековерина, функция которого по видимому является предотвращение нежелательного фосфорилирования темноадаптированного родопсина.

С момента открытия рековерина было обнаружено еще около 20 белков со сходной структурой в самых различных тканях, как позвоночных так и беспозвоночных. Это позволило ввести понятия рековериноподобного белка и семейства рековериноподобных белков. Однако структурно-функциональные исследования рековерина не проводились и было неясно, как кальцийсвязывающие участки влияют на функцию белка.

Изучение влияния кальцийсвязывающих участков рековерина на его функцию является темой этой работы.

3 Обзор литературы

Сенсорную функцию в сетчатке выполняют фоторецепторные клетки: палочки и колбочки, представляющие собой высокоспециализированные нейроны. Палочек в сетчатке млекопитающих, в том числе человека, примерно 120 миллионов на одну сетчатку, причем расположены они преимущественно по периферии ее зрительной части; колбочки - их около 7 миллионов на сетчатку - концентрируются в центральной ее зоне. Палочки отвечают за сумеречное зрение при низкой освещенности, которое имеет малую разрешающую способность, и преобладают у животных, ведущих ночной образ жизни. Колбочки эффективно работают при достаточно ярком освещении и обеспечивают цветное зрение; соответственно, их больше у животных, активных преимущественно днем [1,2].

Оба типа фоторецепторов - это длинные, узкие клетки, свое название они получили из-за формы их наружных сегментов, которые у палочек тонкие, цилиндрические, у колбочек -значительно более утолщенные (рис. 1). Наружный сегмент - часть фоторецепторной клетки, которая своим окончанием обращена к наружи глаза. В наружном сегменте присутствуют зрительный пигмент и катаболические ферменты необходимые этой структуре для выполнения функции световой антенны [3]. Наружный сегмент палочки (НСП) в онтогенезе развивается из цилии и представляет собой стопку из сотен или даже тысяч так называемых фоторецепторных дисков. Фоторецепторные диски образуются у основания НСП как впячивание плазматической мембраны, причем внутреннее пространство вновь образованных дисков еще

Палочка

" в о

А. Б.

СВЕТ

Внутренний сегмент

Колбочка

Наружный сегмент

Биполярные нейроны

Ганглии

Нервные волокна к мозгу

ю. <

Диски

Рисунок 1. Схема строения сетчатки позвоночных (А) и отдельной палочки (Б) [1].

сообщается с внеклеточным пространством. Позднее диски как бы отпочковываются от плазматической мембраны, превращаясь в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от нее, так и друг от друга. Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет ведет свое происхождение от внеклеточного пространства

[3].

Наружные сегменты колбочек имеют принципиально отличаются от НСП тем, что колбочковые диски представляют

собой складки плазматической мембраны и их внутриклеточное пространство сообщается с внеклеточной средой.

На диски приходится подавляющая часть массы НСП, в то время как на плазматическую мембрану всего - 1-5% [4, 5]. Около 70% общего белка НСП составляет интегральный мембранный белок - родопсин [6]. Только два белка присутствуют в количестве, превышающем 1 копию на 100 молекул родопсина, - это трансдуцин и аррестин. Еще 16 белков, включая свМР-фосфодиэстеразу (ФДЭ), представлены 1-10 копиями на 1000 молекул родопсина. Молярное соотношение ФДЭ : трансдуцин : родопсин выглядит как 1 : 10 : 100

[7].

3.1 Молекулярные механизмы передачи сигнала в фоторецепторной клетке

Фосфодиэстеразный каскад опосредует передачу сигнала от фотовозбужденного родопсина (Rho*) к cGMP-завиеимым ионным каналам путем светозависимой активации системы гидролиза cGMP [8, 9]. Последовательность событий в этом каскаде имеет следующий вид: светозависимая активация родопсина —> катализ фотовозбужденным родопсином GDP/GTP-обмена на трансдуцине —> активация ФДЭ —> гидролиз cGMP —> закрывание катионных каналов в плазматической мембране НСП и ее гиперполяризация.

3.1.1 Родопсин Первый шаг процесса фототрансдукции - поглощение кванта

света родопсином и переход этого белка в фотоактивированное

состояние. Согласно имеющимся данным молекула родопсина-

гликопротеид с молекулярной массой около 40 кДа, состоящий из

348 аминокислотных остатков [10] и хромофорной группы - 11-цис-

ретиналя [11]. Белковая часть родопсина, опсин, как и более чем 100

других членов семейства сопряженных с G-белками рецепторов,

характеризуется наличием 7 гидрофобных участков из 20-25

аминокислотных остатков каждый, которые образуют 7

трансмембранных а-цепей [12]. Во внутридисковое пространство

экспонирован N-концевой фрагмент молекулы родопсина, к

которому присоединены две углеводные цепи, ковалентно

связанные с боковой группой Asp-2 и Asp-15; при этом

модификация по Asp-15 необходима для правильной организации

Рисунок 2. Общая схема фоторецепторного каскада [9].

Рисунок 3. Родопсин в липидном бислое [39].

пространственной конформации молекулы, ее транспорта в мембрану. Сюда же обращены три относительно гидрофильные петли, соединяющие II - III, IV - V и VI - VII гидрофобные

трансмембранные ос-цепи. Участки полипептидной цепи родопсина, выходящие из мембраны в цитоплазму НСП, имеют много гидрофильных аминокислот и представлены тремя петлями, соединяющими I - II, III - IV и V - VI трансмембранные а-цепи, и С-концевым фрагментом, состоящим приблизительно из 40 аминокислотных остатков. Исследования мутантных форм родопсина позволили приписать следующие функции доменам этого белка: внутридисковая часть - поддержание общей структуры, трансмембранный домен - прием сигнала; цитоплазматические петли и С-конец - передача сигнала к трансдуцину [13, 14, 15, 16]. С использованием мутантов родопсина с удаленными первыми 1, 1.5, 2, 3, или 5 трансмембранными участками показано, что для поддержания пространственной структуры родопсина в мембране необходимо минимум 5 трансмембранных столбов, для правильной интеграции в эндоплазматический ретикулум в процессе синтеза 2 ТМС; синтез же последующих 5 обязателен для выхода из ретикулума [17].

Кроме гликозилирования по остаткам Азр-2 и Азр-15 родопсин подвергается ряду других важных посттрансляционных модификаций [13,18]. Так Су 8-110 и Суз-187 образуют единственную в молекуле родопсина дисульфидную связь, необходимую для стабилизации активного состояния белка [18]; СуБ-322 и Суэ-323 пальмитоилированы, что приводит к "заякориванию" С-концевого участка родопсина в мембране [12].

Молекула родопсина содержит в своем составе 11-цис-ретиналь, ковалентно связанный протонированным основанием Шиффа с е-аминогруппой боковой цепи ЬуБ-296 (в седьмой трансмембранной а-цепи). Методами направленного мутагенеза и

фотоафинного мечения [19, 20] были установлены 7 аминокислот, образующих ретиналь-связывающий "карман" - это Phe-115, Ala-117, Glu-122, Trp-126, Ser-127, Trp-265 и Tyr-268. В структурном и функциональном отношениях важно, что протонированное основание Шиффа, через которое хромофор связан с белком, стабилизируется за счет взаимодействия с противоионом -карбоксильной группой Glu-113 в третьей трансмембранной а-цепи [21,22]. Сближение III-й и VII-й трансмембранных а-цепей стабилизирует неактивное состояние родопсина [23, 24].

Поглощение родопсином кванта света приводит к ряду его фотохимических превращений - фотолизу, продуктами которого являются полностью-транс-ретиналь и опсин. Собственно фотохимический процесс - 11-цис—>11-транс-изомеризация ретиналя, является единственным светозависимым процессом, приводящим к светоактивации родопсина; все остальные стадии фотолиза - светонезависимые, они сопряжены с конформационными перестройками в молекуле родопсина и реакциями протонирования - депротонирования основания Шиффа между ретиналем и s-аминогруппой Lys-296 [13]. Наибольшую важность для биохимических реакций, приводящих к возникновению фоторецепторного ответа, представляет один из интермедиатов фотолиза родопсина - метародопсин II, появление которого при комнатной температуре наблюдается примерно через 10"3 сек после поглощения родопсином кванта света и сопровождается значительными конформационными перестройками в молекуле белка, связанными, в том числе с разрушением солевого мостика между III и VII-ой трансмембранными а-цепями родопсина [25].

Рисунок 4. Изменение взаимного положения трансмембранных столбов родопсина при переходе в светоактивированное состояние [26].

С использованием методов направленного мутагенеза и ядерного магнитного резонанса удалось выяснить, что для активации трансдуцина необходимо изменение взаимного положения ТМС III и VI, при связывании спиралей между собой активация не наступает [26].

Метародопсин II выступает в роли катализатора в процессе активации следующего белка фосфодиэстеразного каскада -трансдуцина. Во взаимодействии с трансдуцином и его активации принимают участие П-я (остатки 141 - 153) и Ш-я (остатки 230 -252) цитоплазматические петли и остатки 310 - 321 между УП-ой трансмембранной а-цепью и жирнокислотным "якорем": соответствующие пептиды конкурируют с метародопсином II за связывание с трансдуцином [27].

3.1.2 Трансдуцин

Молекула трансдуцина состоит из трех полипептидов: альфа,

бета и гамма (Та, Т(3 и Ту) с молекулярной массой 39, 36 и 8 кДа соответственно [28,29]. В а-субъединице локализован нуклеотид-связывающий центр, способный при взаимодействии трансдуцина с метародопсином II обменивать связанный GDP на GTP и играющий ключевую роль в активации трансдуцина [1]. Та обладает собственной GTP-азной активностью, благодаря которой происходит гидролиз GTP до GDP [30]. Тр и Ту прочно связаны друг с другом и функционируют как единая тру-субъединица [31]. Исходно Ta-GDP находится в комплексе с ТРу; метародопсин II катализирует обмен GDP на GTP с образованием Ta-GTP, которая в результате диссоциирует от ТРу и активирует эффекторный фермент - ФДЭ. Насколько известно, роль ТРу в НСП быка состоит в обеспечении взаимодействия Та с метародопсином II [32]; кроме этого, есть указания, что ТРу-димер способен активировать фосфолипазу А2 [33].

Та из НСП быка содержит сигнальную последовательность, которая распознается N-миристоилтрансферазой и ацилируется ею по N-концу остатками жирных кислот С14:0, С14:1, С14:2 и С12:0 [34]; С-концевая последовательность Ту содержит мотив Cys-Val-Ile-Ser, выступающий в роли сигнала для фарнезилирования по остатку цистеина [35]. В то время как Ту за счет гидрофобной модификации прочно связана с мембраной, роль ацильного остатка в Та, видимо, важна для поддержания пространственной структуры белка [36]. Предполагалось также, что гидрофобные

Рисунок 5. Пространственная структура Тофу (А) и модель взаимодействия Тару с родопсином (Б) [39].

модифицирующие группы Та и Ту могут взаимодействовать друг с другом и участвовать в ассоциировании субъединиц трансдуцина

[37]. Однако последующие исследования показали, что модификация не оказывает никакого влияния на взаимодействие Та и Ту и лишь незначительно воздействует на связывание с мишенями

[38]. Был сделан вывод о том, что гидрофобные модификации субъединиц трансдуцина не принимают непосредственного участия в процессе передачи сигнала и лишь увеличивают их сродство к мембране.

Исследования последних лет позволили получить кристалл Та|3у и изучить его пространственные характеристики [39]. Полученные данные свидетельствуют о том, что обмен GDP на GTP вызывает значительные конформационные перестройки в Та, связанном с Тру в двух сайтах и его (Та) освобождение. Напротив Т(3у практически не изменяет свою конформацию во время актов ассоциации-диссоциации с Та. Предложена модель взаимодействия ТаРу с родопсином и локализованы участки этого взаимодействия (рис 5).

3.1.3 сОМР-фосфодиэстераза ФДЭ - периферический мембранный белок с молекулярной

массой около 210 кДа, состоящий из трех субъединиц - альфа, бета и

гамма; общий состав молекулы ФДЭ - офу2 [1,40,41]. Недавно было

показано существование 8 - субъединицы фосфодиэстеразы [42], но

ее функция и стехиометрия связывания с офу2 белком пока неясна.

Молекулярная масса а- и (3-субъединиц ФДЭ составляет,

соответственно, 89 и 87 кДа, у-субъединица значительно меньше - ее

молекулярная масса равна 10 кДа, молекулярный вес 8-

субъединицы равен 17 кДа [29,42]. С-концевое изопренилирование

и карбоксиметилирование а- и (3-субъединиц ФДЭ важно для ее

взаимодействия с фоторецепторными мембранами [31]. Уже в одной

из первых работ, посвященных выделению ФДЭ, было обнаружено

[43], что активность фермента резко возрастает после

кратковременной инкубации в присутствии трипсина.

Сопоставление изменения активности фермента в процессе

протеолиза с изменением электрофоретического поведения его

субъединиц показало, что при кратковременном протеолизе,

достаточном для полной активации ФДЭ, избирательно

разрушаются ее у-субъединицы, а оф-димер практически не

затрагивается, разрушается лишь область присоединения

изопренильного остатка. Полученный таким образом оф-димер

теряет способность связываться с фоторецепторными мембранами.

Если очищенную у-субъединицу ФДЭ добавить к активированному

оф-димеру, полученному с помощью предварительной

трипсинизации, то фосфодиэстеразная активность снижается до

уровня, соответствующего базальной активности необработанного трипсином тетрамера. Таким образом, каталитический центр ФДЭ образован оф-димером, а ее у-субъединица представляет собой ингибитор ферментативной активности оф-димера, кроме того у-субъединица может выступать в виде шаперона для оф-субъединиц [44]. Показано, что 5-субъединица фосфодиэстеразы вызывает переход офу2 комплекса из мембранно-связанного состояния в раствор [42].

В условиях in vivo светозависимая активация ФДЭ является результатом взаимодействия Ta-GTP с ФДЭу и удаления последней из комплекса с ФДЭсф [45,46]. ФДЭу имеет два участка для взаимодействия с Та: С-конец и поликатионный участок, причем последний расположен между Arg-24 и Lys-5, в котором содержится 3 остатка аргинина, 7 остатков лизина и нет ни одного остатка дикарбоновых кислот; за ингибирование ФДЭа|3 отвечает С-концевой участок ФДЭу [47].

ФДЭ может подвергаться фосфорилированию протеинкиназой С (ПКС), при этом модифицируется как ФДЭа (аминокислотные остатки 30-44), так и участок между 31-45 остатками ФДЭу [48]. Кроме того, ФДЭу фосфорилируется по Thr-22 киназой с молекулярной массой 70кДа, которая ингибируется cGMP [49]. Фосфорилирование этой киназой происходит, когда ФДЭу находится в комплексе с Ta-GTP, в результате чего резко падает сродство ФДЭу к Та, и они диссоциируют до того, как произойдет гидролиз GTP на Та; тем самым происходит независимое от ГТФазы транс дуцина выключение ФДЭ [50]. В случае фосфорилирования ФДЭу под действием ПКС у модифицированной

субъединицы существенно возрастает сродство к ФДЭоф, что также может оказывать влияние на взаимодействие Ta-GTP с ФДЭу [51].

ФДЭ содержит три участка связывания cGMP: два некаталитических с Kd, равными 160 и 830 нМ, и один каталитический с Kd=600 мкМ [51,52]. В высокоафинных участках связывается до 50-60 мкм cGMP в НСП [53], причем в результате активации ФДЭ трансдуцином, содержащим негидролизуемый аналог GTP, или путем трипсинолиза происходит 10-кратное уменьшение связывания cGMP с некаталитическими участками, ингибирование ФДЭ изобутилметилксантином, напротив, увеличивает связывание cGMP с ФДЭ [8].

Таким образом, существует обратная связь между прочностью связывания cGMP с некаталитическими участками ФДЭ и активностью фермента, что позволяет регулировать активность ФДЭ в зависимости от уровня cGMP в фоторецепторной клетке. Также активация ФДЭ приводит к высвобождению связанного с ферментом cGMP, что способствует восстановлению "темнового" уровня циклического нуклеотида [54, 55].

Является интересным тот факт, что так называемый темновой шум (спонтанная активация палочек или колбочек) сейчас связывается с самопроизвольной активацией фосфодиэстеразы без участия трансдуцина [56].

3.1.4 cGMP -зависимый катионный канал cGMP-завиеимый катионный канал локализован

исключительно в плазматической мембране НСП и обладает низкой

селективностью по отношению к одновалентным щелочным

катионам [8]. Аминокислотная последовательность основного

компонента сОМР-зависимого канала (молекулярный вес 63 кДа) предполагает существование шести гидрофобных фрагментов, которые могут выступать в роли трансмембранных участков, таким образом, что в цитоплазму обращены 14- и С-концевая области полипептида, содержащие нуклеотидсвязывающий домен [57, 58]. Еще одна субъединица канала, представленная белком с молекулярным весом 240 кДа, не функциональна, но прочно ассоциирована с каналом и при коэкспрессии с 63 кД-субъединицей канала придает ей чувствительность к Са2+ [59].

При физиологических концентрациях М§2+ и Са2+ во внеклеточной среде (100, 1 и 1.6 мМ, соответственно), темновой ток каждого из этих катионов составляет 70%, 15% и 5%, соответственно. Таким образом, несмотря на то, что большая часть темнового тока в НСП приходиться на на самом деле сОМР-зависимый канал обладает наибольшей селективностью по отношению к Са [60].

В 1985 г. было показано [61], что при удалении циклического нуклеотида сОМР-зависимый канал теряет свою способность пропускать ионы металлов через плазматическую мембрану, что приводит к появлению электрофизиологического ответа фоторецепторной клетки. Благодаря этой работе последовательность событий, лежащих в основе фототрансдукции у позвоночных животных, приобрела завершенный вид (рис. 2).

3.2 Механизмы выключения сигнала в фоторецепторной клетке и восстановление темпового состояния

Электрофизиологический ответ фоторецепторной клетки на световой стимул длится в течение сотен миллисекунд, а затем прекращается благодаря существованию в НСП механизмов, ответственных за выключение фосфодиэстеразного каскада и восстановление "темнового" уровня свМР в цитоплазме НСП [1].

3.2.1 Выключение родопсина.

Способность родопсина к инактивации заложена уже в самом

механизме фотолиза, поскольку образующийся в процессе фотолиза активатор фосфодиэстеразного каскада - метародопсин II - через определенное время распадается на "неактивный" опсин и полностью-транс-ретиналь; однако для этого требуется несколько десятков секунд, что на несколько порядков больше времени, необходимого для прекращения электрофизиологического ответа фоторецепторной клетки.

Намного более быстрая инактивация фосфодиэстеразного каскада происходит благодаря фосфорилированию светоактивированного родопсина по остаткам серина и треонина в его С-концевой области, что приводит к резкому уменьшению эффективности родопсина как активатора трансдуцина [62]. За фосфорилирование Шю* в НСП отвечает родопсинкиназа [63] -белок с Млу = 67 кДа. С-конец родопсинкиназы содержит СААХ-мотив, который служит сигналом для присоединения к остатку цистеина фарнезильной группы через тиоэфирную связь, затем отщепляются три С-концевых остатка (ААХ) и происходит карбоксиметилирование уже фарнезилированного цистеинового

остатка [64]. Именно фарнезильная группа позволяет родопсинкиназе взаимодействовать с фоторецепторными мембранами светозависимым образом: предполагается, что

*-* к к

родопсинкиназа не взаимодействует с темновыми фоторецепторными мембранами, содержащими родопсин, и только после светоактивации последнего прочность связывания родопсинкиназы с мембраной увеличивается, благодаря взаимодействию с Шю*. В отсутствие изопренилирования активность родопсинкиназы значительно снижается; введение геранилгеранильного (С2о) остатка вместо фарнезильного (С 15) не влияет на активность родопсинкиназы, но делает ее способной взаимодействовать как с освещенными, так и "темновыми" фоторецепторными мембранами. Способность фарнезилированной (но не геранилгеранилированой) родопсинкиназы взаимодействовать с фоторецепторными мембранами светозависимым образом представляет собой уникальный механизм, предполагающий непосредственное взаимодействие между протеинкиназой и субстратом только строго после светоактивации последнего [65].

При помощи синтетических пептидов были проверены несколько гипотез о локализации участков связывания и фосфорилирования. Показано, что наилучшим образом фосфорилируется участок родопсина 318-348 [66]. При этом выяснилось, что взаимодействие родопсинкиназы с родопсином включает больше, чем просто связывание с С-концевым участком родопсина и что субстрат для родопсинкиназы должен состоять в основном из кислых аминокислот. Последующие исследования показали, что для связывания и активации родопсинкиназы

критичны У-У1 цитоплазматические петли родопсина [67]. Взаимодействие же со стороны родопсинкиназы опосредуется ее 14-концом [68].

Механизм диссоциации родопсинкиназы из комплекса с фосфорилированным Шю* также представляется уникальным: аутофосфорилированная форма родопсинкиназы имеет значительно меньшее сродство к фосфорилированному Шю*, чем к нефосфорилированному. Таким образом, аутофосфорилирование служит механизмом для регуляции прочности связывания родопсинкиназы с субстратом [69]. Участки аутофосфорилирования были индентифицированы как Бег488 и ТЬг489, и гораздо менее фосфорилируемый 8ег21 [70].

Как указывалось выше, фосфорилирование Шю* значительно уменьшает, но не предотвращает полностью способность пигмента к активации трансдуцина, для окончательного выключения фосфодиэстеразного каскада необходимо не только множественное фосфорилирование Шю* (с образованием фосфорилированного светоактивированного родопсина (Шю*-Р)), но и связывание с ним еще одного белка - аррестина (8-антигена).

Аррестин - цитоплазматический белок с М,\у = 48 кДа, способен высокоафинно взаимодействовать только с Шю*-Р, но не с "темновым" фосфорилированным родопсином [71]. Такая высокая избирательность аррестина связана с присутствием в его молекуле двух функционально важных доменов, один из которых отвечает за распознавание светоактивированного состояния пигмента, а второй - за распознавание фосфатных остатков в Шю*-Р, причем взаимодействие происходит главным образом за счет фрагментов

аррестина между аминокислотными остатками 2-12, 140-170, 230240 и 270-300 [72].

Таким образом, процесс выключения Rho* с участием родопсинкиназы и аррестина можно представить следующим образом [71,73]: (1) образовавшийся Rho* взаимодействует с родопсинкиназой и подвергается фосфорилированию каталитическая эффективность Rho* снижается; (2) аутофосфорилирование родопсинкиназы приводит к уменьшению ее сродства к пигменту, что приводит к диссоциации фермента из комплекса с Rho*-P; (3) с Rho*-P связывается аррестин, причем места связывания аррестина и Та перекываются - активация трансдуцина, катализируемая светоактивированным пигментом, полностью прекращается.

3.2.2 Выключение трансдуцина и фосфодиэстеразы Для полной инактивации фосфодиэстеразного каскада

необходимо, чтобы в дополнение к выключению Rho* произошел

гидролиз GTP до GDP на Та с последующей диссоциацией ее из

комплекса с ФДЭу.

Та обладает собственной ГТФазной активностью, однако

измерения скорости ГТФазной реакции на Та in vitro дают

основания сомневаться в способности Та достаточно быстро (в

пределах секунды) гидролизовать GTP и, следовательно, выключать

фосфодиэстеразный каскад [1].

Механизмы регуляции ГТФазной активности Та в НСП,

приводящие к многократному увеличению скорости гидролиза GTP

на трансдуцине, были детально исследованы в работе [74]. Авторы

наблюдали две составляющие реакции гидролиза нуклеотида на трансдуцине со скоростями, различающимися в 10 раз, причем доля быстрой компоненты коррелировала с количеством ФДЭ в системе, а точнее, как было показано позднее, - с количеством ФДЭу [75]. На основании этих результатов было предположено, что связывание Та-ОТР с ФДЭу приводит к 10-кратному ускорению гидролиза вТР на Та. Кроме того, был предложен еще один механизм регуляции ГТФазы трансдуцина, согласно которому быстрая компонента гидролиза ОТР на трансдуцине подавляется в присутствии 5 мкМ сОМР (что примерно соответствует уровню сОМР в темноадаптированном НСП); так что здесь в качестве сигнала обратной связи выступает уровень сОМР: в результате падения уровня сОМР в НСП на свету, скорость ГТФазной реакции на трансдуцине возрастает, что в свою очередь приводит к понижению активности ФДЭ. Еще один фактор, как предполагается, влияющий на активность трансдуцина связан с ковалентной модификацией Ту, которая участвует во взаимодействии Та с Шю*: показано, что фарнезилирование Ту значительно увеличивает скорость активации трансдуцина светоактивированным родопсином [35]. Наконец, возможным регулятором выключения фосфодиэстеразного каскада является фосдуцин [76] - белок, фосфорилируемый светозависимым образом сАМР-зависимой протеинкиназой (см. раздел 3.2.3.) [77]. В последние месяцы появилось два независимых сообщения об открытии в зрительной системе так называемого БЮ8 - белка, который, взаимодействуя с Та приводит к резкому увеличению скорости гидролиза ГТФ[78, 79]. Увеличение скорости гидролиза ГТФ опосредуемое 1Ю8-белками значительно превосходит увеличение скорости гидролиза опосредуемое ФДЭу.

3.2.3 Светозависимое изменение [Ca2+]f в фоторецепторной

клетке

Уровень кальция в цитоплазме НСП зависит главным образом от: (1) входа в НСП Са через сОМР-зависимые катионные каналы и (2) откачивания Са2+ из НСП специфическим Ыа+/К+,Са2+-обменником. Подобный механизм Ыа+/К+,Са2+-обмена встречается, видимо, только в фоторецепторных клетках в связи с тем, что в этих деполяризованных клетках градиента недостаточно для

поддержания достаточно низкой [Са2+]^ поэтому дополнительно используется еще и градиент К+ [80,81,82].

Молекула Ш+/К+,Са2+-обменника состоит из единственной полипептидной цепи с = 220 кДа; он был получен в очищенном виде и функционально реконструирован в фосфолипидные везикулы [80,83]. Цитоиммунохимически установлено, что этот полипептид

локализован исключительно в плазматической мембране НСП [83].

2+

Предполагается, что в темноте отток Са из НСП с помощью обменника уравновешивается входом этого катиона через свМР-зависимые катионные каналы; уровень [Са У в НСП саламандры в темноте оценивается как 600 нМ по данным определения с аквеорином [84] и около 250 нМ - при определении с помощью индикатора фура-2 [85]. В ходе фоторецепторного ответа вход Са через сОМР-зависимые каналы уменьшается, но продолжающаяся работа обменника приводит к падению [Са ]{ в цитоплазме НСП. Теоретический нижний предел, до которого обменник может снизить [Са2+]й приблизительно равен 2x10"10 М [86], однако реально изменения на свету дают значения около 140 нМ [85], что, по-видимому, связано с высвобождением связанных со структурами

НСП ионов Са2+ по мере откачивания катиона из цитоплазмы НСП. Считается, что связанного кальция намного больше, чем свободного: общее содержание Са в НСП оценивается как 0.1-1.5 моль Са2+/моль родопсина [84], причем большая часть Са2+

локализована во внутридисковом пространстве. Так что менее чем

2+

1/10 всего Са в НСП может перейти в свободное состояние, однако этой, относительно небольшой части кальция принадлежит весьма важная физиологическая роль.

2-н

В цитоплазме НСП основными Са -связывающими

/у,

компонентами являются фосфолипиды мембран (при [Са ]г = 300 нМ фосфолипиды связывают

0.4 мкМ Са2+), аррестин (27 мкМ),

рековерин (25 мкМ) и кальмодулин (0.4 мкМ). Таким образом,

2+

общее количество связанного в цитоплазме НСП Са соответствует примерно 100 мкМ [86].

3.2.4 Гуанилатциклаза Снижение уровня свободного кальция в цитоплазме НСП,

вызванное освещением, приводит к активации гуанилатциклазы -

фермента, ответственного за восстановление "темнового" уровня

сОМР. Так, уменьшение [Са2+]г от 200 до 20 нМ в 5-20 раз

активирует гуанилатциклазу. Регуляция гуанилатциклазы кальцием

носит кооперативный характер (коэффициент Хилла равен 3.9), при

этом практически весь эффект Са2+ проявляется в очень узком

диапазоне концентраций вблизи 100 нМ [87]. Однако даже в

темноадаптированных НСП Са2+-зависимая компонента активности

гуанилатциклазы подавлена не полностью, и экспериментальное

повышение [Са2+^ приводит к дальнейшему ингибированию синтеза

свМР [88].

Действие Са2+ на гуанилатциклазу в фоторецепторах опосредовано регуляторным белком (или белками), который детектирует изменения [Са ^ в субмикромолярном диапазоне (см. разделы 3.4. и 3.5.) [31]. Первоначальные сообщения о роли рековерина как активатора гуанилатциклазы [89, 90] впоследствии не были подтверждены [91, 92]. Затем, были идентифицированы белки с молекулярными массами 20 [93] и 24 кДа [94], которые были способны восстанавливать чувствительность гуанилатциклазы к ионам Са2+ в реконструированной системе.

Было показано, что в фоторецепторной клетке присутствуют две Са -чувствительных гуанилатциклазы (гуанилатциклаза 1 и 2). Одна из них, названная гуанилатциклазой 1, найдена в наружном и внутреннем сегментах фоторецепторной клетки, причем присутствует она в большем количестве в колбочках, чем в палочках. Гуанилатциклаза 2 присутствует, видимо, исключительно в палочках [136].

Получены данные, что гуанилатциклаза 1 состоит из внеклеточного и внутриклеточного домена, связанных трансмембранным участком. Активатор гуанилатциклазы 2 - белок регулирующий активность ГЦ Са -зависимым образом взаимодействует с внутриклеточным доменом [95].

Таким образом, стало возможным изобразить схему фоторецепторного каскада, включающую как возбуждение рецептора, так и переход его в исходное состояние (рисунок 2).

5.5 Са -связывающие белки НСП, принимающие участие в

фототрансдукции

В предыдущей главе уже говорилось о том, что в процессе ответа на световой стимул в фоторецепторной клетке изменяется уровень [Са2+]^ Это влечет за собой изменение активности ряда ферментов, среди них: родопсинкиназа, гуанилатциклаза и аденилатциклаза. Все перечисленные ферменты в очищенном виде не чувствительны к изменению [Са но приобретают способность изменять свою активность Са -зависимым образом благодаря присутствию в клетке высокоспециализированных Са2+-связывающих белков, которые и опосредуют эффект Са2+ на эти ферменты [96]. В НСП быка обнаружены четыре Са -связывающих белка: кальмодулин [97], рековерин [98], активатор гуанилатциклазы 1 (АГЦ1) [93] и 2 (АГЦ2) [94], которые отвечают за Са2+-зависимую регуляцию аденилатциклазы и сСМР-зависимого канала (кальмодулин) [97], родопсинкиназы (рековерин) [99,100,101], и гуанилатциклазы (АГЦ1 и 2) [102], причем все перечисленные белки содержат в своем составе специальную структуру, обеспечивающую высокоафинное и высокоспецифичное связывание ионов Са ; эта структура получила название "ЕР-ИапсГ-мотив [103].

5.5.1 Общая характеристика Са2+-связывающих белков, содержащих структуру типа "ЕР-капс1".

Кальмодулин, тропонин С, парвальбумин, рековерин, 8100 и

л I

многие другие Са -связывающие белки содержат специфический структурный мотив, получивший название "ЕР-ИапсГ, благодаря которому происходит высокоафинное и селективное связывание

А.

4J

\

• /«''Л

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Щульга-Морской, Сергей Владиславович

6 ВЫВОДЫ

1. Разработан метод получения в гомогенном виде мутантных форм рекомбинантного рековерина с мутациями во втором, третьем и четвертом ЕР-Ьапс! доменах, а также с делециями 29-ти и 101-го аминокислотных С-концевых остатков.

2. Установлено, что пространственная структура мутантов с мутациями в Са2+-связывающих участках (р26ЕЕ2-, р26ЕЖЗ-, р26ЕЕ2,3-) сходна с таковой у рековерина дикого типа, у мутанта р26ЕЕ4+ более "рыхлая" по сравнению с рековерином дикого типа; пространственная структура этих мутантов изменяется при связывании ионов кальция.

3. Пространственная структура делеционных мутантов рековерина значительно отличается от структуры рековерина дикого типа и не изменяется при связывании ионов кальция.

4. Мутант рековерина р26А29 проявляет протеолитические свойства в свободной от ионов кальция форме при высокой концентрации соли в среде.

5. С помощью флуоресцентного метода установлено, что молекула рековерина связывает ион кальция сначала ЕЖЗ участком, и лишь затем ЕЕ2.

6. Восстановление способности связывать кальций у мутанта р26ЕЖ4+ не влияет на способность связывать ионы кальция ЕЖ2 и ЕЕЗ участками, но влияет на его пространственную структуру.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Щульга-Морской, Сергей Владиславович, 1998 год

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Lodish, Н., Baltimore, D., Berk, A., Zipursky St., L., Matsudaira, P., Darnell, J. Molecular Cell Biology 3d ed. 1995.

2. Филиппов П.П., Аршавский В.Ю., Дижур A.M. (1987). Биохимия зрительной рецепции. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, т.26.

3. Schwartz, Е.А. (1981). First events in vision: the generation of responses in vertebrate rods. J. Cell Biol. 90, 271-278.

4. Chabre, M. (1985). Trigger and amplification mechanisms in visual phototransduction. Ann. Rev. Biophys. Chem. 14, 331-60.

5. Абдулаев, Н.Г. и Артамонов, И.Д. (1984). Биоорганическая химия зрительного процесса. Биол. мембраны. 1, 775-793.

6. Dratz, Е.А. and Hargrave, P.А. (1983). The structure of rhodopsin and the rod outer segment disk membrane. Trends Biochem. Sci. 8, 128-131.

7. Hamm, H.E. and Bownds, M.D. (1986). Protein complement of rod outer segments of frog retina. Biochemistry 25, 4512-4525.

8. Stryer, L. (1986). Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci. 9, 87-119.

9. Липкин B.M., Обухов A.H. (1998) Биологические мембраны. В печати.

10. Ovchinnikov, Y.A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure function relationships. FEBS Lett. 148, 179-191.

11. Mullen, E. and Akhtar, M. (1982). Topographic and activesite studies on bovine rhodopsin. FEBS Lett. 132, 261-264.

12. Ovchinnikov, Y. A., Abdulaev, N. G. and Bogachuk, A. S. (1988). Two adjacent cysteine residues in the C-terminal cytoplasmic fragment of bovine rhodopsin are palmitylated. FEBS Lett. 230, 1-5.

13. Khorana, H.G. (1992). Rhodopsin, photoreceptor of the rod cell. J. Biol. Chem. 267, 1-4.

14. Hargrave, P. A. and Hofmann, K. P. (1989). Three cytoplasmic loops of rhodopsin interact with transducin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6878-6882.

15. Anukanth, A. and Khorana, H.G. (1994). Structure and function in rhodopsin: requirement of a specific structure for the intradiscal domain. J. Biol. Chem. 269, 19738-19744.

16. Hargrave, P. A. and McDowell, J. H. (1993). Rhodopsin and Phototransduction. Int. Rev. Cytology 137B, 49-97.

17. Jurgen, A.W., Heymann and Sriram Subramaniam (1997). Expression, stability, and membrane integration of truncation mutants of bovine rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 4966-4971.

18. Nathans, J. (1992). Rhodopsin: Structure, function, and genetics. Biochemistry 31, 4923-4931.

19. Oprian, D.D. (1992). The ligand-binding domain of rhodopsin and other G protein-linked receptors. J. Bioenerg. Biomem. 24, 211-217.

20. Strader, C.D., Fong, T.M., Tota, M.R., Underwood, D. and Dixon, R.A.F. (1984). Structure and function of G protein-coupled receptor. Annu. Rev. Biochem. 63, 101-132.

21 Sakmar, T. P., Franke, R. R. and Khorana, H. G. (1989). Glutamic acid-113 serves as the retinylidine schiff base counterion in bovine rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8309-8313.

22 Zhukovsky, E. A. and Oprian, D. D. (1989). Effect of carboxylic acid side chains on the absorption maximum of visual pigments. Science 245, 928-930.

23. Rao, V.P., Cohen, G.B. and Oprian, D.D. (1994). Rhodopsin mutation G90D and a molecular mechanism for congenital night blindness. Nature. 367, 639-642.

24. Ridge, K. D., Bhattacharya, S., Nakayama, T. A. and Khorana, H.G. (1992). Light-Stable Rhodopsin. 2. An Opsin Mutant (Trp-265-Phe) and a Retinal Analog with a Nonisomerizable 11-Cis Configuration Form a Photostable Chromophore. J. Biol. Chem. 267, 6770-6775.

25. Applebury, M. A. (1991). Molecular determinants of visual pigment function. Curr. Opin. Neurobiol. 1, 263-269.

26. Farrens, D.L., Altenbach, C., Ke Yang, Hubbel, W.L., Khorana, H.G. (1997) Requirement of Rigid - Body Motion of Transmembrane Helices for Light Activation of Rhodopsin. Science. 274. 768-770.

27. Kinig, B., Arendt, A., McDowell, J. H., Kahlert, M., Hargrave, P. A. and Hofmann, K. P. (1989). Three cytoplasmic loops of rhodopsin interact with transducin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6878-6882.

28. Kuhn, H. (1980). Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature 283, 587-589.

29. Ovchinnikov, Y.A., Lipkin, V.M., Kumarev, V.P., Gubanov, V.V., Khramtsov, N.V., Akhmedov, N.B., Zagranichny, V.E. and Muradov, K.G. (1986). Cyclic GMP phosphodiesterase from cattle retina. Amino acid sequence of the gamma-subunit and nucleotide sequence of the corresponding cDNA. FEBS Lett. 204, 288-292.

30. Stryer, L., Hurley, J.B. and Fung, B.K.K. (1981). First stage of amplification in the cyclic nucleotide cascade of vision. Trends Biochem. Sci. 6, 245-247.

31. Hurley, J.B. (1992). Signal Transduction Enzymes of Vertebrate Photoreceptors. J. Bioenerg. and Biomemb. 24, 219-226.

32. Arshavsky, V.Y., Dizhoor, A.M., Shestakova, I.K. and Philippov, P.P. (1985). The effect of rhodopsin phosphorylation on the light-dependent activation of phosphodiesterase from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 181,264-266.

33. Clapharm, D.E. (1996). The G-protein nanomashine. Nature 379, 297-299.

34. Johnson, R.S., Ohguro, H., Palczewski, K., Hurley, J.B., Walsh, K.A. and Neubert, T.A. (1994). Heterogeneous N-acylation is a tissue- and species-specific posttranslational modification. J. Biol. Chem. 269, 21067-21071.

35. Fukada, Y., Takao, T., Ohguor, H., Yoshizawa, T., Akino, T. and Shimonishi, Y. (1990) Farnesylated gamma subunit of photoreceptor G protein indispensable for GTP-binding. Nature 346, 658-660.

36. Justice, J.M., Bliziotes, M.M., Stevens, L.A. and Vaughan, M.M. (1995). Involvement of N-myristoylatiom in monoclonal antibody recognition sites on chimeric G protein alpha subunits. J. Biol. Chem. 270, 6436-6439.

37. Bigay, J., Faurobert, E., Franco, M. and Chabre, M. (1994). Roles of lipid modifications of transducin subunits in their GDP-dependent association and membrane binding. Biochemistry 33,14081-14090.

38. Parish, C.A., Smrcka, A.V., Rando, R.R., (1996) The role of G-protein methylation in the function of a geranylgeranylated beta gamma isoform. Biochemistry. 35(23). 7499-7505.

39. Lambright, D.G., Sondek, J., Bohm, A., Skiba, N.P., Hamm, H.E., Sigler, P.B. (1996). The 2.0 crystal structure of a heterotrimeric G protein. Nature. 379, 311-319.

40. Baehr, W., Delvin, M.J. and Applebury, M.L. (1979). Isolation and characterization of cGMP phosphodiesterase from bovine ROS. J. Biol. Chem. 254, 11669-11677.

41. Hurley, J.B. and Stryer, L. (1982). Purification and characterization of the gamma regulatory subunit of the cGMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 257, 11094-11099.

42. Florio, S.K., Prusti, R.K and Beavo J.A. (1996). Solubilization of membrane-bound phosphodiesterase by the rod phosphodiesterase recombinant 5 subunit. J. Biol. Chem. 271, 24036-24047.

43. Yamazaki, A., Stein, P.I., Chernoff, N. and Bitensky, M.W. (1983). Activation mechanism of rod outer segment cyclic GMP phosphodiesterase. R inhibitor by the GTP/GDP-binding protein. J. Biol. Chem. 258,8188-8194.

44. Palczewski, K., Saari, J.C. (1997). Activation and inactivation steps in the visual transduction pathway. Curr. Opin. Neurobiol., 7(4): 500504.

45. Yamazaki, A., Hayashi, F., Tatsumi, M., Bitensky, M.W. and George, J.S. (1990). Interactions between the subunits of transducin and cyclic GMP phosphodiesterase in Rana catesbiana rod photoreceptors. J. Biol. Chem. 265, 11539-11548.

46. Lipkin, V.M., Dumler, I.L., Muradov, K.G., Artemyev, N.O. and Etingof, R.N. (1988). Active sites of the cyclic GMP phosphodiesterase gamma-subunit of retinal rod outer segment. FEBS Lett. 234, 287-290.

47. Udovichenko, I.P., Cunnick, J., Gonzales, K. and Takemoto, D.J.

(1993). Phosphorylation of bovine rod photoreceptor cyclic GMP phosphodiesterase. Biochem. J. 295, 49-55.

48. Tsuboi, S. Matsumoto, H. and Jackson, M. (1994) Phosphorylation of an inhibitory subunit of cGMP phosphodiesterase in Rana catesbiana rod photoreceptors. I. Characterization of the phosphorylation. J. Biol. Chem. 269, 15016-15023.

49. Tsuboi, S. Matsumoto, H. and Yamazaki, A. (1994). Phosphorylation of an inhibitory subunit of cGMP phosphodiesterase in Rana catesbiana rod photoreceptors. II. A possible mechanism for the turnoff of cGMP phosphodiesterase without GTP hydrolysis. J. Biol. Chem. 269, 1502415029.

50. Udovichenko, I.P., Cunnick, J., Gonzalez, K. and Takemoto, D.J.

(1994). Functional effect of phosphorylation of the photoreceptor phosphodiesterase inhibitory subunit by protein kinase C. J. Biol. Chem. 269, 9850-9856.

51. Yamazaki, A., Sen, I., Bitenski, M.W., Casnellie, J.E. and Greengard, P. (1980). Cyclic GMP-specific, high-affmity, noncatalytic binding sites on light-activated phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 255, 11619-11624.

52. Yuen, P.S.T., Walseth, T.F., Panter, S.S., Sundby, S.R. and Goldberg, N.D. (1986). Identification of rod outer segment cGMP binding proteins by direct photoaffinity labeling. Biophys. J. 49, 248a.

53. Kaupp, U.B. and Koch, K.-W. (1992). Role of cGMP and Ca2+ in vertebrate photoreceptor excitation and adaptation. Annu. Rev. Physiol.

54. 153-175.

54. Cote, R.H., Bownds, M.D. and Arshavsky, V.Y. (1994). cGMP binding sites on photoreceptor phosphodiesterase: role in feedback

regulation of visual transdaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 48454849.

55. Yamazaki, A., Bondarenko, V.A., Dua, S., Yamazaki, M., Usukura, J., Hayashi, F. (1996). Possible stimulation of retinal rod recovery to dark state by cGMP release from a cGMP phosphodiesterase non catalytic site. J. Biol. Chem, 51, 32495-32498.

56. Rieke, F., Baylor, D.A., (1996). Molecular origin of continuous dark noise in rod photoreceptors. Biophys. J., 71, 2553-2572.

57. Cook, N.J., Hanke, W. and Kaupp, U.B. (1987). Identification, purification and functional reconstitution of the cyclic GMP-dependent channel from rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 585589.

58. Molday, R.S., Molday, L.L., Dose, A., Clark-Lewis, I., Illing, M., Cook, N.J., Eismann, E. and Kaupp, U.B. (1991). The cGMP-gated channel of the rod photoreceptor cell. Characterization and orientation of the amino terminus. J.Biol. Chem. 266, 2197-21922.

59. Molday, L.L., Cook, N.J, Kaupp, U.B. and Molday, R.S. (1990). The cGMP-gated cation channel of bovine rod photoreceptor cells is associated with a 240 kDa protein exhibiting immunochemical cross-reactivity with spectrin. J. Biol. Chem. 265, 18690-18695.

60. Yau, K.-W. and Baylor, D.A. (1989). Cyclic GMP-activated conductance of retinal photoreceptor cells. Annu. Rev. Neurosci. 12, 289-327.

61 Fesenko, E.E., Kolesnikov, S.S. and Lyubarsky, A.L. (1985). Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segments. Nature 313, 310-313.

62. Дижур, А.М., Аршавский, В.Ю., Шестакова, И.К. и Филиппов, П.П. (1984). Влияние фосфорилирования родопсина на светозависимую активацию фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов из наружных сегментов палочек сетчатки быка. Биологич. мембраны 10, 1051-1056.

63 . Kuhn, Н. and Dreyer, W.J. (1972). Light dependent phosphorylation of rhodopsin by ATP. FEBS Lett. 20, 1-6.

64 Lefkowitz, R.J. (1993). G protein-coupled receptor kinase. Cell. 74, 409-412.

65. Inglese, J., Koch, W.J., Caron, M.G. and Lefkowitz, R.J. (1992). Isoprenilation in regulation of signal transduction by G protein-coupled receptor kinases. Nature. 359, 147-150.

66. Palczewski, K., Arendt, A., McDowell, J.H.,Hargrave, P.A. (1989). Substrate recognition determinants for rhodopsin kinase: studies with syntetic peptides, polyanions, and polycations. Biochemistry 28, 87648770.

67. Palczewski, K, Buczylko, J., Kaplan, M.W., Polans, A.S., Crabb, J.W. (1991). Mechanism of rhodopsin kinase activation. J. Biol. Chem. 266, 12949-12955.

68. Palczewski, K., Biczylko, J., Lebioda, L., Crabb, J.W., Polans, A.S. (1993). Identification of the N-terminal region in rhodopsin kinase involved in its interactions with rhodopsin. J. Biol. Chem. 268, 60046013.

69. Buczylko, J., Gutmann, C. and Palczewski, K. (1991). Regulation of rhodopsin kinase by autophosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2568-2572.

70 Palczewski, K., Buczylko, J., Van Hooser, P.Carr, S.A., Huddleston, M.J., Crabb, J.W. (1992). Identification of the autophosphorylation sites in rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 267. 18991-18998.

71. Kuhn, H. and Wilden, U. (1987). Deactivation of photoactivated rhodopsin by rhodopsin kinase and arrestin. J. Recept. Res. 7, 283-298.

72. Gurevich, V.V. and Benovic, J.L. (1992). Cell-free expression of visual arrestin. Truncation mutagenesis identifies multiples domains involved in rhodopsin interaction. J. Biol. Chem. 267, 21919-21923.

73. Hargrave, P.A. and McDowell, J.H. (1992). Rhodopsin and phototransduction: A model system for G protein-linked receptors. FASEB Journal 6, 2323-2331.

74. Arshavsky, V.Y., Gray-Keller, M.P. and Bownds, M.D. (1991). cGMP suppresses GTPase activity of a portion of transducin equimolar to phosphodiesterase in frog rod outer segments. Light-induced cGMP decreases as a putative feedback mechanism of the photoresponse. J. Biol. Chem. 266, 18530-18537.

75. Arshavsky, V.Y. and Bownds, M.D. (1992). Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP. Nature 357, 416-417.

76. Lee, R.H., Lieberman, B.S. and Lolley, R.N. (1987). A novel complex from bovine visual cells of a 33,000-dalton phosphoprotein with beta and gamma transducin: purification and subunit structure. Biochemistry 28, 3983-3990.

77. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W. (1996). Regulation of phosducin phosphorylation in retinas rods by Ca2+/calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1475-1479.

78. Faurobert, E., Hurley, J.B. (1997). The core domain of new retina specific RGS protein stimulates the GTPase activity of transducin in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2945-2950.

79. Chen, C.-K., Wieland, T., Simon, M.I. (1996). RGS-r, a retinal specific RGS protein, binds an intermediate conformational of transducin and enchances recycling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 12885-12889.

80. Schnetkamp, P.P.M. (1989). Na+ -Ca2+ orNa+ -Ca2+-K+ exchange in rod photoreceptors. Progr. Biophys. Mol. Biol. 54, 1-29.

81. Schnetkamp, P.P.M., Basu, D.K. and Szerencsei, R.T. (1989). Na+ -Ca2+ exchanger in bovine rod outer segment requires and transports. Am. J. Physiol. 257, C153-157.

82. Schnetkamp, P.P.M., Szerencsei, R.T. and Basu, D.K. (1991). Unidirectional Na+, Ca2+ and K+ fluxes through the bovine rod outer segment Na+ -Ca2+-K+-exchanger. J. Biol. Chem. 266, 198-206.

83. Cook, N.J. and Kaupp, U.B. (1988). Solubilisation, purification and reconstitution of the sodium-calcium exchanger from bovine retinal rod outer segment. J. Biol. Chem. 263, 11382-11388.

84. McNaughton, P.A., Cervetto, L. and Nunn, B.J. (1986). Measurement of the intracellular free calcium concentration in salamander rods. Nature. 322, 261-263.

85 . Ratto, G.M., Payne, R., Owen, W.G. and Tsien, R.Y. (1988). The concentration of cytosolic free calcium in vertebrate rod outer segments measured with Fura-2. J. Neurosci. 8, 3240-3246.

86. Kaupp, U.B. and Koch, K.-W. (1992). Role of cGMP and Ca2+ in vertebrate photoreceptor excitation and adaptation. Annu. Rev. Physiol. 54, 153-175.

87. Koch, K.-W. and Stryer, L. (1988). Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions. Nature 334, 6466.

88 . Koch, K.-W. (1991). Purification and identification of photoreceptor guanylate cyclase. J. Biol. Chem. 266, 8634-8637.

89. Lambrecht, H.-G. and Koch, K.-W. (1991). A 26 kd calcium binding protein from bovine rod outer segments as modulator of photoreceptor guanylate cyclase. EMBO J. 10, 793-798.

90. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1991). Recoverin: A calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science 251,915-918.

91. Gorodovikova, E.N. and Philippov, P.P. (1993). The presense of a calcium-sensitive p26-containing complex in bovine retina rod cell. FEBS Lett. 335, 277-279.

92. Hurley, J.B., Dizhoor, A.M., Ray, S. and Stiyer, L. (1993). Recoverin's role: Conclusion withdrawn. Science 260, 740.

93 . Palczewski, K., Subbaraya, I., Gorczyca, W.A., Helekar, B.S., Ruiz, C.C., Ohguro, H., Huang, J., Zhao, X., Crabb, J.W., Johnson, R.S., Waish, K.A., Gray-Keller, M.P., Detwiler, P.B. and Baehr, W. (1994). Molecular cloning and characterization of retinal photoreceptor gyanylyl cyclase-activating protein. Neuron. 13, 395-404. 94. Dizhoor, A.M., Lowe, D.G., Olshevskaya, E.V., Laura, R.P. and Hurley, J.B. (1994). The human photoreceptor membrane guanylyl

cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium

and a soluble activator. Neuron. 12,1345-1352.

95. Duda, T., Goraczniak, R., Surgucheva, I., Rudnicka-Nawrot, M.,

Gorczyca, W.A., Palczewski, K., Sitaramayya, A., Baehr, W., Sharma,

R.K. (1996). Calcium modulation of bovine photoreceptor guanylate

cyclase. Biochemistry. 35(26), 8478-8482.

96 . Nakanishi, S. (1996). Second-order neurones and receptor

mechanisms in visual- and olfactory-information processing. Trends

Neurosci. 18, 359-364.

97. Hsu, Y.-T. and Molday, R.S. (1993). Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cell by calmodulin. Nature. 361, 76-79.

98. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1991). Recoverin: A calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science. 251,915-918.

99. Gorodovikova E.N., Gimelbrant A.A., Senin I.I. and Philippov P.P. (1994). Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells. FEB S Lett. 349, 187-190.

100 . Gorodovikova E.N., Senin I.I. and Philippov P.P. (1994). Calcium-sensitive control of rhodopsin phosphorylation in the reconstituted system consisting of photoreceptor membranes, rhodopsin kinase and recoverin. FEBS Lett. 353, 171-172. 85.

101. Kawamura, S. (1993). Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin. Nature 362, 855-857.

102 . Gorczyca, W.A., Polans, A.S., Surgucheva, I.G., Subbaraya, I., Baehr, W. and Palczewski, K. (1995). Guanylyl cyclase activation protein. J.Biol.Chem. 270, 22029-22036. 103. Kretsinger, R.H. (1980). Structure and evolution of calcium-modulated proteins. CRC Crit. Rev. Biochem. 8, 119-174.

104 . Crivici, A. and Ikura, M. (1995). Molecular and structural basis of target recognition by calmodulin. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24, 85-116.

105 . Boguta, G., Stepkowski, D. and Bierzynski, A. (1988). Theoretical estimation of the calcium-binding constants for proteins from troponin C superfamily based on a secondary structure prediction method. I. Estimation procedure. J. Theor. Biol. 135, 41-61.

106. Boguta, G. and Bierzynski, A. (1989). Conformational properties of Ca2+-binding segments of proteins from the troponin C superfamily. Biophys. Chem. 31, 133-137.

107 . Baimbridge, K.G., Celio, M.R. and Greenberg, M.E. (1992). Calcium-binding protein in the neuros system. Trends Neurosci. 15, 303308.

108 . Szebenya, D.M.E., Obendorf, S.K. and Moffat, K. (1981). Structure of vitamin D-dependent calcium binding protein from bovine intestine. Nature. 294, 327-332.

109 . Forsen, S. andLinse, S. (1995). Cooperativity: over the Hill. Trends Biochem. Sci. 20, 495-497.

110. Heizmann, C.W. and Hunziker, W. (1991). Intracellular calcium-binding proteins: more sites than insight. Trends Biochem. Sci. 16, 98103.

111. Ikura, M. (1996). Calcium binding and conformational response in EF-hand proteins. Trends Biochem. Sci. 21,14-17. 112 . Ames, J.B., Porumb, T., Tanaka, T., Ikura, M. and Stryer, L. (1995). Ammo-terminal myristoylation induces cooperative calcium binding to recoverin. J.Biol.Chem. 270, 4526-4533.

113. Chazin, W.J. (1995). Releasing the calcium trigger. Nature struct. Biol. 2, 707-710.

114. Herzberg, O. and James, M.N.G. (1988). Refined crystal structure of troponin C from turkey skeletal muscle at 2. OA resolution. J. molec. Biol. 203, 761-779.

115. Skelton, N.J., Korder, J., Akke, M., Forsen, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal transduction versus buffering activity in Ca2+-binding proteins. Nature struct. Biol. 1, 239-245

116. Finn, B.E., Drakenberg, T. and Forsen, S. (1993). The structure of apocalmodulin: a 1H NMR examination of the carboxy-terminal domain. FEBS Lett. 336, 368-374.

117. Skeleton, N.J., Korderl, J., Akke, M., Forsem, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal transduction versus buffering activity in Ca2+-binding proteins. Nature Struct. Biol. 1, 239-245.

118. Kawasaki, H. and Kretsinger, R.H. (1994). Calcium-binding proteins 1: EF-hands. Protein Profile 1, 343-346.

119. Molecular aspects of cellular regulation. Cohen, P. and Klee, C.B. eds. (Elsevier, Amsterdam, 1988).

120. da Silva, A.C.R. and Reinach, F.C. (1991). Calcium binding induces conformational changes in muscle regulatory proteins. Trends Biochem. Sci. 16, 53-57.

121. Means, A.R., VanBerkum, M.F.A., Bagchi,I., Lu, K.R. and Rasmussen, C.D. (1991). Regulatory function of calmodulin. Pharmac. Ther. 50, 255-270.

122 . Vogel, H.J. (1994). Calmodulin: a versatile calcium mediator protein. Biochem. Cell Biol. 72, 357-376.

123. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 31-39.

124. Cheung, W.Y. Regulatory properties of bovine brain calmodulin-dependent phosphatase. Calcium and calcium binding proteins. Eds. C. Gerday et al. B.; Heidelberg: Springer, 1988, 163-178.

125 . Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 67-93.

126. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 132-158.

127.. Trifaro, J.M., Bader, M.F. and Duocet, J.P. (1985). Chromaffin cell cytoskeleton: Its possible role in secretion. Canad. J. Biochem. Cell Biol. 63, 661-679.

128. Afshar, M. (1994). Investigating the high affinity and low sequence specificity of calmodulin binding to its targets. J. Biol. Chem. 244, 554571.

129 . O' Neil, K.T. and DeGrado, W.F. (1990) How calmodulin binds its targets: sequence inderpendent recognition of amphiphilac a-helices. Trends Biochem. Sci. 15, 59-64.

130. Meador, W.E., Means, A.R. and Quiocho, F.A. (1992). Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex. Science 257, 1251-1255.

131. Kretsinger, R.H., Rudnick, S.E. and Weissman, L.J. (1986). Crystal

structure of calmodulin. J. Inorg. Biochem. 28, 289-302.

132 Babu, Y.S., Bugg, C.E. and Cook, W.J. (1988). Three-dimensional

structure of calmodulin refined at 2.2 A resolution. J. Molec. Biol. 204,

191-204.

133. Zhang, M., Tanaka, T. and Ikura, M. (1995). Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nature Struct. Biol. 2, 758-767.

134. Finn, E.B. and Forsen, S. (1995). The evoluting model of calmodulin structure, function and activation. Structure 3, 7-11.

135. LaPorte, D.C., Wierman, B.M. and Storm, D.R. (1980). Calcium-induced expopsure of a hydrophobic surface on calmodulim. Biochemistry 19, 3814-3819.

136. Clore, G.M., Bax, A., Ikura, I. and Gronenborn, A.M. (1993). Structure of calmodulin-target peptide complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 838-845.

137. Woodruff, M.L. and Bownds, M.D. (1979). Regulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cell. J. Gen. Physiol. 73, 629653.

138. Ratto, G.M., Payne, R., Owen, W.G. and Tsien, R.Y. (1988). Identification of adenylyl cyclase activity in rod photoreceptor cells. J. Neurosci. 8, 3240-3246.

139. Stryer, L. (1986). Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci. 9, 87-119.

140. Gray-Keller, M.P. and Detwiler, P.B. (1994). Regulation of the cAMP synthesis by calcium in rods. Neuron 13, 846-861.

141. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 198-239.

142. Walsh, D.A. and Van Patten, S.M. (1994). Multiple pathway signal transduction by the cAMP-dependent protein kinase. FASEB J. 8, 12271236.

143. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W.

(1996). Regulation of phosducin phosphorylation in retinal rods by

Ca /calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1475-1479.

144. Gorczyca, W.A., Gray-Keller, M.P., Detwiler, P.B. and Palczewski, K. (1994). Purification and physiological evaluation of a guanylate cyclase activating protein from retinal rods. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4014-4018.

145. Gorczyca, W.A., Polands, A.S., Surgucheva, I.G., Subbaraya, I., Baehr, W. and Palczewski, K. (1995). Guanylyl cyclase activating protein. J. Biol. Chem. 270, 22029-22036.

146. Semple-Rowland, S.L., Gorczyca, W.A., Buczylko, J., Helekar, B.S., Ruiz, C.C., Subbaraya, I., Palczewski, K. and Baehr, W. (1996). Expression of GCAP1 and GCAP2 in the retinal degeneratiom mutant chicken retina. FEBS Lett. 385, 47-52.

147. Olshevskaya, E.V., Hughes, R.E., Hurley, J.B., Dizhoor, A.M.

(1997). Calcium binding, but not a calcium-myristoyl switch, controls the ability of guanylyl cyclase-activating protein GCAP-2 to regulate photoreceptor guanylyl cyclase. J Biol Chem. May 272(22), 1432714333.

148. Dizhoor, A.M. and Hurley, J.B. (1996). Inactivation of EF-hand makes GCAP-2 (p24) a constitutive activator of photoreceptor guanylyl

cyclase by preventing a Ca2+ induced activator-to-inhibitor transition. J. Biol. Chem. 271, 19346-19350.

149. Lambrecht, H.-G. and Koch, K.-W. (1991). Light-dependent phosphorylation a 26 kd calcium binding protein from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 317, 45-48.

150. Nockolds, C.E., Kretsinger, R.H., Coffee, C.J. and Bradshaw, R.H. (1972). Structure of a calcium binding carp myogen. Proc. Natl .Acad. Sci. USA 69,581-584.

151. Dizhoor, A.M., Chen, C.-K., Olshevskaya, E., Sinelnikova, V.V., Phillipov, P. and Hurley, J.B. (1993). Role of the acylated amino terminus of recoverin in Ca2+-dependent membrane interaction. Science 259, 829-832.

152. Dizhoor, A.M., Ericsson, L.H., Johnson, R.S., et al. (1992). The NH2 terminus of retinal recoverin is acylated by a small family of fatty acids. J.Biol.Chem. 267, 16033-16036.

153. Sanada, K., Kokame, K., Yoshizawa, T., Takao, T., Shimonishi, Y. and Fukada, Y. (1995). Role of heterogeneous N-terminal acylation of recoverin in rhodopsin phosphorylation. J. Biol. Chem. 270, 1545915462.

154. Flaherty, K.M., Zozulya, S., Stryer, L. and McKay, D.B. (1993). Three-dimensional structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell 75, 709-716.

155. Hughes, R.E., Brzovic, P.S., Klevit, R.E. and Hurley, J.B. (1995). Calcium-dependent solvation of the myristoyl group of recoverin. Biochemistry 34, 11410-11416.

156. Ray, S., Zozulya, S., Niemi, G.A., Flaherty, K.M., Brolley, D.,, Dizhoor, A.M., McKay, D.B., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1992).

Cloning, expression, and crystallization of recoverin, a calcium sensor in vision. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89, 5705-5709.

157. Zozulya, S. and Stryer, L. (1992). Calcium-myristoyl protein switch. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 11569-11573.

158. Neubert, T.A., Walsh, K.A., Hurley, J.B., Johnson, R.S. (1997). Monitoring calcium-induced conformational changes in recoverin by electrospray mass spectrometry. Protein Sci. 6(4), 843-850.

159. Senin, I.I., Dean, K.R., Zargarov, A.A., Akhtar, M., Philippov, P.P. Recoverin inhibits the phosphorylation of dark-adapted rhodopsin more then it does that of bleached rhodopsin: a possible mechanism through which rhodopsin kinase is prevented from participation in side reaction. Biochem. J. 321 (Pt 2). 551-555.

160. Senin, I.I., Zargarov, A.A., Akhtar, M., Philippov, P.P. Rhodopsin phosphorylation in bovine rod outer segments is more sensitive to the inhibitory action of recoverin at the low rhodopsin bleaching that it is at high bleaching. FEBS Lett. 408. 251-254.

161. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж. "Молекулярное клонирование", Москва, Мир, 1984.

162. М13 cloning and sequencing handbook. Amersham Internetional, 1984.

163. Ханаан Д. Методы трансформации E.coli. "Клонироавние ДНК. Методы". Под ред. Д. Гловера. Москва, Мир, 1988.

164. Sculptor in vitro mutagenesis system. Amersham UK, 1995.

165. Seraphin, B. and Kandel-Lewis, S. (1996). An efficient PCR mutagenesis strategy without gel purification step that is amenable to automation. Nucl. Acids Res. 24, 3276-3277.

166. Кутузов М.А. и др. (1992). Р26-кальцийсвязывающий белок фоторецепторных клеток сетчатки быка: первичная структура и экспрессия в E.coli. 18, 623-634.

167. Senger, F., Nicklen, S. and Couson, A.R. (1977). DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 74, 54635467.

168. Заргаров A.A. и др. (1996). Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина в клетках E.coli и сравнение их функциональной активности. Биоорг. химия. 22, 483-488.

169. Maruyama, К., Mikawa, Т. and Ebashi, S. (1984). Detection of Calcium Binding Protein By 45Ca Autoradiography on Nitricellulose Membrane after Sodium Dodecyl Sulfate Gel Electrophoresis. J. Biochem. 95, 511-519.

170 Burstein, E.A., Vedenkina, N.S. and Ivkova, M.N. (1973) Photochem. Photobiol. 18, 263-279

171 Permyakov, E.A. andBurstein, E.A. (1984) Biophys. Chem. 19, 265271.

172 Blum, H.E., Lehky, P., Kohler, L., Stein, E.A., & Fisher, E.H. (1977) J. Biol. Chem. 252, 2834-2838)

173. Palczewski, K., McDowell, J.H. and Hargrave, P.A. (1988). Purification and characterization of rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 263, 14067-14073.

174. Kawamura, S., Cox, J. A. and Nef, P. (1994). Inhibition of rhodopsin phosphorylation by non-myristoylated recombinant recoverin. Biochem. Biophys. Res. Comm. 203, 121-127.

175. Shichi, H. and Somers, R.L. (1978). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin. J. Biol. Chem. 253, 7040-7046.

176. Klenchin, V.A., Calvent, P.D. and Bownds, M.D. (1995). Rhodopsin kinase inhibition by recoverin. J. Biol. Chem. 270, 1614716152.

177. Практикум по Биохимии/ Издательство Московского университета 1989, стр. 85.

178. Laemmli. U.K. (1970). Nature, 227, 680.

179. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электорофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. стр. 93.

180. Е. Godbille and P. Devaux, (1976) J. Chromatography A., 122 317.

181. H. Colin, P. Hilaireau and J. de Tournemire, (1991) LC GC, 8 302.

182. G. Guiochon, M. Sarker, (1995) J. Chromatogr. A, 704 247.

183. Toyopearl News No. 11 (1981).