Направленный мутагенез рековерина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Зинченко, Дмитрий Валерьевич

• Зинченко, Дмитрий Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зинченко, Дмитрий Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Молекулярные механизмы передачи сигнала в фоторецепторной клетке.

1.1.1 Родопсин.

1.1.2 Трансдуцин.

1.1.3 cGMP-фосфодиэстераза.

1.1.4 cGMP-зависимый катионный канал.

1.2 Механизмы выключения сигнала в фоторецепторной клетке и восстановление темнового состояния.

1.2.1 Выключение родопсина.

1.2.2 Выключение трансдуцина и фосфодиэстеразы.

1.2.3 Светозависимое изменение концентрации Са2+ в фоторецепторной клетке.

1.2.4 Гуанилатциклаза.

1.3 Са2+-связывающие белки НСП, принимающие участие в фототрансдукции.

1.3.1 Общая характеристика Са2+-связывающих белков, содержащих структуру типа "EF-hand".

1.3.2 Общая характеристика калъмодулина.

1.3.3 Активатор гуаншатциклазы 1 и 2.

1.3.4 Нейрокалъцин.

1.3.5 Рековерин.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Материалы и реактивы.

2.2 Ферменты.

2.3 Методы.

2.3.1 Выделение ДНК плазмид из бактериальных клеток.

2.3.2 Выделение одноцепочечной формы фага М13тр19.

2.3.3 Олигонуклеотид-направленный мутагенез рековерина.

2.3.4 Приготовление компетентных клеток.

2.3.5 Трансформагщя Е. coli.

2.3.6 Отбор мутантных клонов.

2.3.7 Электрофорез ДНК в агарозных гелях.

2.3.8 Секвенирование ДНК.

2.3.9 Экспрессия рековерина а его мутантов в клетках Е. coli.

2.3.10 Выделение мутантных рекомбинантных рековеринов.

2.3.11 Определение степени миристоилирования рекомбинантных рековеринов.

2.3.12 Выделение наружных сегментов палочек сетчатки (НСП).

2.3.13 Получение родопсинкиназы и отмытых мочевиной мембран НСП.

2.3.14 Фосфорилирование родопсина в суспензии НСП.

2.3.15 Определение активности родопсинкиназы в реконструированной системе.

2.3.16 Прямое связывание радиоактивного 45Са2+ с рековерином и его мутантными формами.

2.3.17 Связывание рековерина и его мутантных форм с фоторецепторной мембраной.

2.3.18 Аналитические процедуры.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Получение и выделение рековерина и его мутантных форм.

3.1.1 Клонирование и экспрессия мутантных форм рековерина, модифицированных по Са2+-связывающим участкам.

3.1.2 Выделение миристоилированного и немиристоилированного рековерина дикого типа и его мутантных форм.

3.2 Изучение механизма Са2+-зависимого экспонирования миристоильной группы рековерина.

3.2.1 Связывание С а2 + рековерином и его миристоилированными и немиристоилированными мутантными формами RcEF2- и RcEF3-.

3.2.2 Связывание рековерина и его миристоилированных и немиристоилированных мутантных форм RcEF2- и RcEF3- с фоторецепторными мембранами.

3.2.3 Функциональная активность рековерина и его миристоилированных и не миристоилированных мутантных форм RcEF2- и RcEF3-.

3.3 Изучение мутантных форм рековерина с четвертым реконструированным Са2+-связывающим центром.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Направленный мутагенез рековерина»

Рецепция света в сетчатке позвоночных осуществляется фоторецепторными клетками. Палочки, - клетки сетчатки глаза, отвечают за высокочувствительное зрение на слабом свету. Процессы фоторецепции протекают в наружном сегменте палочки (НСП) и представляют собой сложный многостадийный процесс, в котором принимает участие множество белков и ферментов. Последовательность ферментативных реакций, в ходе которых световой сигнал, воспринимаемый фоторецепторной клеткой, усиливается и трансформируется в изменение электрической проводимости плазматической мембраны НСП, называется фосфодиэстеразным каскадом. Практически все компоненты этой цепи в настоящее время установлены, и их первичные структуры определены. Однако до сих пор не совсем ясны тонкие молекулярные механизмы регуляции и взаимодействия компонентов цепи друг с другом. Предполагается, что одним из регуляторов определенных этапов каскада является концентрация свободного Са2+.

2+

Действие Са на системы клеточной сигнализации зачастую опосредовано Са2+-связывающими белками, мишенями для которых очень часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Са -связывающим белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилирования дефосфорилирования посвящено огромное число работ; фоторецепторная клетка в этом отношении - исключение. Систематическое и интенсивное исследование роли Са -связывающих белков в регуляции фототрансдукции у позвоночных животных, в том числе, в регуляции фосфорилирования зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей протеинкиназы (родопсинкиназы), было начато, во многом, благодаря обнаружению в 1991 году Са -связывающего белка рековерина, функция которого, по-видимому, является предотвращение нежелательного фосфорилирования темно6 адаптированного родопсина. Отличительной особенностью природного рековерина является его пострансляционная модификация остатком миристиновой кислоты, который ковалентно связан с аминоконцевым остатком глицина белка. Было показано, что в отсутствии ионов кальция остаток миристиновой кислоты погружен в гидрофобный карман рековерина, тогда как

7+ связывание Са белком приводит к раскрытию гидрофобного кармана и экспонированию миристоильного остатка, что позволяет рековерину связываться с мембранами и своей функциональной мишенью в фоторецепторной клетке - родопсинкиназой. Описанный механизм в литературе получил название Са2+-миристоильного переключателя

Известно еще около 20 белков со сходной с рековерином структурой, которые используют для своего функционирования механизм Са2+-миристоильного переключателя.

Настоящая работа посвящена выяснению роли отдельных Са2+-связывающих участков в данном механизме.

1 Обзор литературы

Функцию рецепции света в сетчатке выполняют два типа клеток: палочки и колбочки, представляющие собой высокоспециализированные нейроны. Палочек в сетчатке млекопитающих, в том числе человека, примерно 120 миллионов на одну сетчатку, причем расположены они преимущественно по периферии ее зрительной части; колбочки - их около 7 миллионов на сетчатку - концентрируются в центральной ее зоне. Палочки отвечают за сумеречное зрение при низкой освещенности, которое имеет малую разрешающую способность, и преобладают у животных, ведущих ночной образ жизни. Колбочки эффективно работают при достаточно ярком освещении и обеспечивают цветное зрение; соответственно, их больше у животных, активных преимущественно днем [1,2].

Оба типа фоторецепторов - это длинные, узкие клетки, свое название они получили из-за формы их наружных сегментов, которые у палочек тонкие, цилиндрические, у колбочек - значительно утолщенные (рис. 1). В наружном сегменте присутствуют зрительный пигмент и катаболические ферменты, необходимые этой структуре для выполнения функции световой антенны [3]. Наружный сегмент палочки (НСП) в онтогенезе развивается из цилии и представляет собой стопку из сотен или даже тысяч так называемых фоторецепторных дисков. Фоторецепторные диски образуются у основания НСП как впячивания плазматической мембраны, причем внутреннее пространство вновь образованных дисков еще сообщается с внеклеточным пространством. Позднее диски превращаются в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от плазматической мембраны, так и друг от друга. Таким образом, наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет ведет свое происхождение от внеклеточного пространства [3].

Диски

А.

Палочка

Внешний сегмент

Внутренний сегмент

Колбочка

Биполярные нейроны

Ганглии

Нервные волокна к мозгу

Рисунок 1. Схема строения отдельной палочки (А) и сетчатки позвоночных (Б) [1].

Наружные сегменты колбочек отличаются от НСП тем, что их= диски представляют собой складки плазматической мембраны и сообщаются с внеклеточной средой.

На диски приходится подавляющая часть массы НСП, в то время как на плазматическую мембрану всего - 1-5% [4, 5]. Около 70% общего белка НСП составляет интегральный мембранный белок - родопсин [6]. Только два белка присутствуют в количестве, превышающем 1 копию на 100 молекул родопсина, - это трансдуцин и аррестин. Еще 16 белков, включая cGMP-фосфодиэстеразу (ФДЭ), представлены 1-10 копиями на 1000 молекул родопсина. Молярное соотношение ФДЭ : трансдуцйн : родопсин - 1 : 10 : 100 [7].

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зинченко, Дмитрий Валерьевич

Выводы

1. Впервые получены и исследованы миристоилированные и немиристоилированные рекомбинантные формы рековерина дикого типа и его точечные мутанты в гомогенном виде.

2. Немиристоилированный рековерин дикого типа связывает два иона кальция с Kd, равными 0,21мкМ и 5,6 мкМ, при этом высокоаффинньш участком связывания является EF3, а за низкоаффинное связывание отвечает участок EF2.

3. Миристоилирование понижает аффинность рековерина к ионам кальция и придает кооперативность процессу связывания Са2+.

4. Заполнение центров связывания кальция в рековерине происходит последовательно, причём заполнение участка EF2 оказывается возможным только после связывания по EF3-участку.

5. Связывание ионов кальция в участке EF2 является необходимым е механизме Са2+-зависимого экспонирования миристоильной группы и проявления ингибирующей активности по отношению к родопсинкиназе.

6. Восстановление способности связывать Са в участке EF4 не оказывает существенного влияния на функциональные свойства рековерина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зинченко, Дмитрий Валерьевич, 2002 год

1. Lodish, Н., Baltimore, D., Berk, A., Zipursky St., L., Matsudaira, P., Darnell, J. (1995). .Molecular Cell Biology 3d ed.

2. Филиппов П.П., Аршавский В.Ю., Дижур A.M. (1987). Биохимия зрительной рецепции. Итоги науки и техники. ВИНИТИ, т.26.

3. Schwartz, Е.А. (1981). First events in vision: the generation of responses in vertebrate rods. J. Cell Biol. 90, 271-278.

4. Chabre, M. (1985). Trigger and amplification mechanisms in visual phototransduction. Ann. Rev. Biophys. Chem. 14, 331-60.

5. Абдулаев, Н.Г. и Артамонов, И.Д. (1984). Биоорганическая химия зрительного процесса. Биол. мембраны. 1, 775-793.

6. Dratz, Е.А. and Hargrave, P.А. (1983). The structure of rhodopsin and the rod outer segment disk membrane. Trends Biochem. Sci. 8, 128-131.

7. Hamm, H.E. and Bownds, M.D. (1986). Protein complement of rod outer segments of frog retina. Biochemistry 25, 4512-4525.

8. Stryer, L. (1986). Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci. 9, 87-119.

9. Ovchinnikov, Y.A. (1982). Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure function relationships. FEBS Lett. 148, 179-191.

10. Mullen, E. and Akhtar, M. (1982). Topographic and activesite studies on bovine rhodopsin. FEBS Lett. 132, 261-264.

11. Ovchinnikov, Y. A., Abdulaev, N. G. and Bogachuk, A. S. (1988). Two adjacent cysteine residues in the C-terminal cytoplasmic fragment of bovine rhodopsin are palmitylated. FEBS Lett. 230, 1-5.

12. Khorana, H.G. (1992). Rhodopsin, photoreceptor of the rod cell. J. Biol. Chem. 267, 1-4.

13. Hargrave, P. A. and Hofmann, K. P. (1989). Three cytoplasmic loops of rhodopsin interact with transducin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6878-6882.

14. Anukanth, A. and Khorana, H.G. (1994). Structure and function in rhodopsin: requirement of a specific structure for the intradiscal domain. J. Biol. Chem. 269. 19738-19744.

15. Hargrave, P. A. and McDowell, J. H. (1993). Rhodopsin and Phototransduction. Int. Rev. Cytology 137B, 49-97.

16. Jurgen, A.W., Heymann and Sriram Subramaniam (1997). Expression, stability, and membrane integration of truncation mutants of bovine rhodopsin. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 4966-4971.

17. Nathans, J. (1992). Rhodopsin: Structure, function, and genetics. Biochemistry 31,4923-4931.

18. Oprian, D.D. (1992). The ligand-binding domain of rhodopsin and other С protein-linked receptors. J. Bioenerg. Biomem. 24, 211-217.

19. Strader, C.D., Fong, T.M., Tota, M.R., Underwood, D. and Dixon, R.A.F. (1984) Structure and function of G protein-coupled receptor. Annu. Rev. Biochem. 63, 101132.

20. Sakmar, T. P., Franke, R. R. and Khorana, H. G. (1989). Glutamic acid-113 serves as the retinylidine schiff base counterion in bovine rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 8309-8313.

21. Applebury, M. A. (1991). Molecular determinants of visual pigment function Curr. Opin. Neurobiol. 1, 263-269.

22. Farrens, D.L., Altenbach, С., Ke Yang, Hubbel, W.L., Khorana, H.G. (1997) Requirement of Rigid Body Motion of Transmembrane Helices for Light Activation of Rhodopsin. Science. 274. 768-770.

23. Kinig, В., Arendt, A., McDowell, J. H., Kahlert, M., Hargrave, P. A. and Hofmann, K. P. (1989). Three cytoplasmic loops of rhodopsin interact with transducin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6878-6882.

24. Kuhn, H. (1980). Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature 283, 587-589.

25. Stryer, L., Hurley, J.B. and Fung, B.K.K. (1981). First stage of amplification in the cyclic nucleotide cascade of vision. Trends Biochem. Sci. 6, 245-247.

26. Hurley, J.B. (1992). Signal Transduction Enzymes of Vertebrate Photoreceptors, J. Bioenerg. and Biomemb. 24, 219-226.

27. Arshavsky, V.Y., Dizhoor, A.M., Shestakova, I.K. and Philippov, P.P. (1985), The effect of rhodopsin phosphorylation on the light-dependent activation oi phosphodiesterase from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 181,264-266.

28. Fukada, Y., Takao, Т., Ohguor, H., Yoshizawa, Т., Akino, T. and Shimonishi, Y (1990) Farnesylated gamma subunit of photoreceptor G protein indispensable foi GTP-binding. Nature 346, 658-660.

29. Justice, J.M., Bliziotes, M.M., Stevens, L.A. and Vaughan, M.M. (1995). Involvement of N-myristoylatiom in monoclonal antibody recognition sites on chimeric G protein alpha subunits. J. Biol. Chem. 270, 6436-6439.

30. Bigay, J., Faurobert, E., Franco, M. and Chabre, M. (1994). Roles of lipid modifications of transducin subunits in their GDP-dependent association and membrane binding. Biochemistry 33, 14081-14090.

31. Parish, C.A., Smrcka, A.V., Rando, R.R., (1996) The role of G-protein methylation in the function of a geranylgeranylated beta gamma isoform. Biochemistry. 35(23). 7499-7505.

32. Lambright, D.G., Sondek, J., Bohm, A., Skiba, N.P., Hamm, H.E., Sigler, P.B. (1996). The 2.0 crystal structure of a heterotrimeric G protein. Nature. 379, 311-319.

33. Baehr, W., Delvin, M.J. and Applebury, M.L. (1979). Isolation and characterization of cGMP phosphodiesterase from bovine ROS. J. Biol. Chem. 254, 11669-11677.

34. Hurley, J.B. and Stryer, L. (1982). Purification and characterization of the gamma regulatory subunit of the cGMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 257, 11094-11099.

35. Florio, S.K., Prusti, R.K and Beavo J.A. (1996). Solubilization of membrane-bound phosphodiesterase by the rod phosphodiesterase recombinant 5 subunit. J. Biol. Chem. 271, 24036-24047.

36. Yamazaki, A., Stein, P.I., Chernoff, N. and Bitensky, M.W. (1983). Activation mechanism of rod outer segment cyclic GMP phosphodiesterase. R inhibitor by the GTP/GDP-binding protein. J. Biol. Chem. 258, 8188-8194.

37. Palczewski, K., Saari, J.C. (1997). Activation and inactivation steps in the visual transduction pathway. Curr. Opin. Neurobiol., 7(4): 500-504.

38. Yamazaki, A., Sen, I., Bitenski, M.W., Casnellie, J.E. and Greengard, P. (1980) Cyclic GMP-specific, high-affinity, noncatalytic binding sites on light-activatec phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 255, 11619-11624.

39. Yuen, P.S.T., Walseth, T.F., Panter, S.S., Sundby, S.R. and Goldberg, N.D (1986). Identification of rod outer segment cGMP binding proteins by direc photoaffmity labeling. Biophys. J. 49, 248a.

40. Kaupp, U.B. and Koch, K.-W. (1992). Role of cGMP and Ca2+ in vertebratf photoreceptor excitation and adaptation. Annu. Rev. Physiol. 54, 153-175.

41. Cote, R.H., Bownds, M.D. and Arshavsky, V.Y. (1994). cGMP binding sites on photoreceptor phosphodiesterase: role in feedback regulation of visual transdaction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 4845-4849.

42. Yamazaki, A., Bondarenko, V.A., Dua, S., Yamazaki, M., Usukura, J., Hayashi, F. (1996). Possible stimulation of retinal rod recovery to dark state by cGMP release from a cGMP phosphodiesterase non catalytic site. J. Biol. Chem., 51, 32495-32498.

43. Rieke, F., Baylor, D.A., (1996). Molecular origin of continuous dark noise in rod photoreceptors. Biophys. J., 71, 2553-2572.

44. Fesenko, E.E., Kolesnikov, S.S. and Lyubarsky, A.L. (1985). Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segments. Nature 313, 310-313.

45. Lefkowitz, R.J. (1993). G protein-coupled receptor kinase. Cell. 74, 409-412.

46. Inglese, J., Koch, W.J., Caron, M.G. and Lefkowitz, R.J. (1992). Isoprenilation in regulation of signal transduction by G protein-coupled receptor kinases. Nature. 359, 147-150.

47. Palczewski, K., Arendt, A., McDowell, J.H.,Hargrave, P.A. (1989). Substrate recognition determinants for rhodopsin kinase: studies with syntetic peptides, polyanions, and polycations. Biochemistry 28, 8764-8770.

48. Palczewski, K, Buczylko, J., Kaplan, M.W., Polans, A.S., Crabb, J.W. (1991). Mechanism of rhodopsin kinase activation. J. Biol. Chem. 266, 12949-12955.

49. Palczewski, K., Biczylko, J., Lebioda, L., Crabb, J.W., Polans, A.S. (1993). Identification of the N-terminal region in rhodopsin kinase involved in its interactions with rhodopsin. J. Biol. Chem. 268, 6004-6013.

50. Dizhoor A.M. (2000). Regulation of cGMP synthesis in photoreceptors: role in signal transduction and congenital diseases of the retina. Cellular Signalling 12, 711 719.

51. Palczewski, K., Buczylko, J., Van Hooser, P.Carr, S.A., Huddleston, M.J., Crabb, J.W. (1992). Identification of the autophosphorylation sites in rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 267. 18991-18998.

52. Kuhn, H. and Wilden, U. (1987). Deactivation of photoactivated rhodopsin by rhodopsin kinase and arrestin. J. Recept. Res. 7, 283-298.

53. Gurevich, V.V. and Benovic, J.L. (1992). Cell-free expression of visual arrestin. Truncation mutagenesis identifies identifies identifies multiples domains involved in rhodopsin interaction. J. Biol. Chem. 267, 21919-21923.

54. Hargrave, P.A. and McDowell, J.H. (1992). Rhodopsin and phototransduction: A model system for G protein-linked receptors. FASEB Journal 6, 2323-2331.

55. Arshavsky, V.Y. and Bownds, M.D. (1992). Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP. Nature 357, 416-417.

56. Lee, R.H., Lieberman, B.S. and Lolley, R.N. (1987). A novel complex from bovine visual cells of a 33,000-dalton phosphoprotein with beta and gamma transducin: purification and subunit structure. Biochemistry 28, 3983-3990.

57. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W. (1996). Regulation of phosducin phosphorylation in retinas rods by Ca2+/calmodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1475-1479.

58. Faurobert, E., Hurley, J.B. (1997). The core domain of new retina specific RGS protein stimulates the GTPase activity of transducin in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2945-2950.

59. Chen, C.-K., Wieland, Т., Simon, M.I. (1996). RGS-r, a retinal specific RGS protein, binds an intermediate conformational of transducin and enchances recycling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 12885-12889.

60. Schnetkamp, P.P.M. (1989). Na+ -Ca2+ or Na+ -Ca2+-K+ exchange in rod photoreceptors. Progr. Biophys. Mol. Biol. 54, 1-29.

61. Schnetkamp, P.P.M., Basu, D.K. and Szerencsei, R.T. (1989). Na+ -Ca2+ exchanger in bovine rod outer segment requires and transports. Am. J. Physiol. 257, CI 53-157.

62. Schnetkamp, P.P.M., Szerencsei, R.T. and Basu, D.K. (1991). Unidirectional Na+, Ca2+ and K+ fluxes through the bovine rod outer segment Na+ -Ca2+-K+-exchanger. J. Biol. Chem. 266, 198-206.

63. Cook, N.J. and Kaupp, U.B. (1988). Solubilisation, purification and reconstitution of the sodium-calcium exchanger from bovine retinal rod outer segment. J. Biol. Chem. 263, 11382-11388.

64. Kaupp, U.B. and Koch, K.-W. (1992). Role of cGMP and Ca2+ in vertebrate photoreceptor excitation and adaptation. Annu. Rev. Physiol. 54, 153-175.

65. Lambrecht, H.-G. and Koch, K.-W. (1991). A 26 kd calcium binding protein from bovine rod outer segments as modulator of photoreceptor guanylate cyclase. EMBOJ. 10,793-798.

66. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1991). Recoverin: A calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science 251, 915-918.

67. Gorodovikova, E.N. and Philippov, P.P. (1993). The presense of a calcium-sensitive p26-containing complex in bovine retina rod cell. FEBS Lett. 335, 277-279.

68. Dizhoor, A.M., Lowe, D.G., Olshevskaya, E.V., Laura, R.P. and Hurley, J.B. (1994). The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present inouter segments and is regulated by calcium and a soluble activator. Neuron. 12, 1345-1352.

69. Hsu, Y.-T. and Molday, R.S. (1993). Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cell by calmodulin. Nature. 361, 76-79.

70. Dizhoor, A.M., Ray, S., Kumar, S., Niemi, G., Spencer, M., Brolley, D., Walsh, K.A., Philipov, P.P., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1991). Recoverin: A calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. Science. 251, 915-918.

71. Kawamura, S. (1993). Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic

72. GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin. Nature 362, 855-857.101 . Gorczyca, W.A., Polans, A.S., Surgucheva, I.G., Subbaraya, I., Baehr, W. and

73. Palczewski, K. (1995). Guanylyl cyclase activation protein. J.Biol.Chem. 270,22029-22036.

74. Chazin, W.J. (1995). Releasing the calcium trigger. Nature struct. Biol. 2, 707710.113 . Herzberg, O. and James, M.N.G. (1988). Refined crystal structure of troponin С from turkey skeletal muscle at 2.OA resolution. J. molec. Biol. 203, 761-779.

75. Skelton, N.J., Korder, J., Akke, M., Forsen, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal transduction versus buffering activity in Ca2+-binding proteins. Nature struct. Biol. 1,239-245

76. Finn, B.E., Drakenberg, T. and Forsen, S. (1993). The structure of apocalmodulin: a 1H NMR examination of the carboxy-terminal domain. FEBS Lett. 336,368-374.

77. Skeleton, N.J., Korderl, J., Akke, M., Forsem, S. and Chazin, W.J. (1994). Signal transduction versus buffering activity in Ca2+-binding proteins. Nature Struct. Biol. 1, 239-245.

78. Kawasaki, H. and Kretsinger, R.H. (1994). Calcium-binding proteins 1: EF-hands. Protein Profile 1, 343-346.

79. Means, A.R., VanBerkum, M.F.A., Bagchi,I., Lu, K.R. and Rasmussen, C.D. (1991). Regulatory function of calmodulin. Pharmac. Ther. 50, 255-270.121 . Vogel, H.J. (1994). Calmodulin: a versatile calcium mediator protein. Biochem. Cell Biol. 72,357-376.

80. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 31-39.

81. Cheung, W.Y. Regulatory properties of bovine brain calmodulin-dependent phosphatase. Calcium and calcium binding proteins. Eds. C. Gerday et al. В.; Heidelberg: Springer, 1988, 163-178.

82. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 67-93.

83. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 132-158.

84. Trifaro, J.M., Bader, M.F. and Duocet, J.P. (1985). Chromattin cell cytoskeleton: Its possible role in secretion. Canad. J. Biochem. Cell Biol. 63, 661679.

85. Afshar, M. (1994). Investigating the high affinity and low sequence specificity of calmodulin binding to its targets. J. Biol. Chem. 244, 554-571.

86. O' Neil, K.T. and DeGrado, W.F. (1990) How calmodulin binds its targets: sequence inderpendent recognition of amphiphilac a-helices. Trends Biochem. Sci. 15, 59-64.

87. Meador, W.E., Means, A.R. and Quiocho, F.A. (1992). Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex. Science 257, 1251-1255.

88. Kretsinger, R.H., Rudnick, S.E. and Weissman, L.J. (1986). Crystal structure of calmodulin. J. Inorg. Biochem. 28, 289-302.

89. Babu, Y.S., Bugg, C.E. and Cook, W.J. (1988). Three-dimensional structure of calmodulin refined at 2.2 A resolution. J. Molec. Biol. 204, 191-204.

90. Zhang, M., Tanaka, T. and Ikura, M. (1995). Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin. Nature Struct. Biol. 2, 758-767.

91. Finn, E.B. and Forsen, S. (1995). The evoluting model of calmodulin structure, function and activation. Structure 3, 7-11.

92. LaPorte, D.C., Wierman, B.M. and Storm, D.R. (1980). Calcium-induced expopsure of a hydrophobic surface on calmodulin!. Biochemistry 19, 3814-3819.

93. Clore, G.M., Bax, A., Ikura, I. and Gronenborn, A.M. (1993). Structure of calmodulin-target peptide complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 838-845.

94. Woodruff, M.L. and Bownds, M.D. (1979). Regulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cell. J. Gen. Physiol. 73, 629-653.

95. Ratto, G.M., Payne, R., Owen, W.G. and Tsien, R.Y. (1988). Identification of adenylyl cyclase activity in rod photoreceptor cells. J. Neurosci. 8, 3240-3246.

96. Stryer, L. (1986). Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci. 9, 87119.

97. Gray-Keller, M.P. and Detwiler, P.B. (1994). Regulation of the cAMP synthesis by calcium in rods. Neuron 13, 846-861.

98. Nicholson, D.G. Proteins, Transmitters and Synapses. Blackwell Scientific Publication: Oxford, 1994, 198-239.

99. Walsh, D.A. and Van Patten, S.M. (1994). Multiple pathway signal transduction by the cAMP-dependent protein kinase. FASEB J. 8, 1227-1236.

100. Willardson, B.M., Wilkins, J.F., Yoshida, T. and Bitensky, M.W. (1996).• • 2+

101. Regulation of phosducin phosphorylation in retinal rods by Ca /calmodulindependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1475-1479.

102. Gorczyca, W.A., Gray-Keller, M.P., Detwiler, P.B. and Palczewski, K. (1994). Purification and physiological evaluation of a guanylate cyclase activating protein from retinal rods. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4014-4018.

103. Gorczyca, W.A., Polands, A.S., Surgucheva, I.G., Subbaraya, I., Baehr, W. and Palczewski, K. (1995). Guanylyl cyclase activating protein. J. Biol. Chem. 270, 22029-22036.

104. Semple-Rowland, S.L., Gorczyca, W.A., Buczylko, J., Helekar, B.S., Ruiz, C.C., Subbaraya, I., Palczewski, K. and Baehr, W. (1996). Expression of GCAP1 and GCAP2 in the retinal degeneratiom mutant chicken retina. FEBS Lett. 385, 47-52.

105. Ames J.B., Dizhoor A.M., Ikura M., Palczewski K., Stryer L. (1999). Three-dimensional Structure of Guanylyl Cyclase Activating Protein-2, a Calcium-sensitive

106. Modulator of Photoreceptor Guanylyl Cyclases. J. Biol. Chem. 274, (27), 1932919337.

107. Okazaki, K., Watanabe, M., Ando, Y., Hagiwara, M., Terasawa, M., Hidaka, H. (1992) Full sequence of neurocalcin, a novel calcium-binding protein abundant in central nervous system. Biochem Biophys Res Commun. 185(1), 147-153.

108. Terasawa, M., Nakano, A., Kobayashi, R., Hidaka, H. (1992). Neurocalcin: a novel calcium-binding protein from bovine brain. J. Biol. Chem. 267(27), 1959619599.

109. Okazaki, K., Obata, N.H., Inoue, S., Hidaka, H. (1995). S100 beta is a target protein of neurocalcin delta, an abundant isoform in glial cells. Biochem J 1995, 306(Pt 2), 551-555.

110. Ladan. D., Calcium and membrane binding properties of bovine neurocalcin delta expressed in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 270(7), 3179-3185.

111. Faurobert, E., Chen, C.K., Hurley, J.B., Teng, D.H. Drosophila neurocalcin, a fatty acylated, Ca2+-binding protein that associates with membranes and inhibits in vitro phosphorylation of bovine rhodopsin. J. Biol. Chem., 271(17), 10256-10262

112. Lambrecht, H.-G. and Koch, K.-W. (1991). Light-dependent phosphorylation a 26 kd calcium binding protein from bovine rod outer segments. FEBS Lett. 317, 4548.

113. Nockolds, C.E., Kretsinger, R.H., Coffee, C.J. and Bradshaw, R.H. (1972). Structure of a calcium binding carp myogen. Proc. Natl .Acad. Sci. USA 69, 581584.

114. Dizhoor, A.M., Chen, C.-K., Olshevskaya, E., Sinelnikova, V.V., Phillipov, P. and Hurley, J.B. (1993). Role of the acylated amino terminus of recoverin in Ca2+-dependent membrane interaction. Science 259, 829-832.

115. Dizhoor, A.M., Ericsson, L.H., Johnson, R.S., et al. (1992). The NH2 terminus of retinal recoverin is acylated by a small family of fatty acids. J.Biol.Chem. 267, 16033-16036.

116. Sanada, К., Kokame, К., Yoshizawa, Т., Такао, Т., Shimonishi, Y. and Fukada, Y. (1995). Role of heterogeneous N-terminal acylation of recoverin in rhodopsin phosphorylation. J. Biol. Chem. 270, 15459-15462.

117. Flaherty, K.M., Zozulya, S., Stryer, L. and McKay, D.B. (1993). Three-dimensional structure of recoverin, a calcium sensor in vision. Cell 75, 709-716.

118. Hughes, R.E., Brzovic, P.S., Klevit, R.E. and Hurley, J.B. (1995). Calcium-dependent solvation of the myristoyl group of recoverin. Biochemistry 34, 1141011416.

119. Ray, S., Zozulya, S., Niemi, G.A., Flaherty, K.M., Brolley, D., Dizhoor, A.M., McKay, D.B., Hurley, J.B. and Stryer, L. (1992). Cloning, expression, and crystallization of recoverin, a calcium sensor in vision. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89, 5705-5709.

120. Zozulya, S. and Stryer, L. (1992). Calcium-myristoyl protein switch. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 11569-11573.

121. Neubert, T.A., Walsh, K.A., Hurley, J.B., Johnson, R.S. (1997). Monitoring calcium-induced conformational changes in recoverin by electrospray mass spectrometry. Protein Sci. 6(4), 843-850.

122. Sculptor in vitro mutagenesis system. Amersham UK, 1995.

123. Seraphin, В. and Kandel-Lewis, S. (1996). An efficient PCR mutagenesis strategy without gel purification step that is amenable to automation. Nucl. Acids Res. 24, 3276-3277.

124. Кутузов M.A. и др. (1992). Р26-кальцийсвязывающий белок фоторецепторных клеток сетчатки быка: первичная структура и экспрессия в E.coli. 18, 623-634.

125. Senger, F., Nicklen, S. and Couson, A.R. (1977). DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467.

126. Заргаров А. А. и др. (1996). Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина в клетках E.coli и сравнение их функциональной активности. Биоорг. химия. 22, 483-488.

127. Palczewski, К., McDowell, J.H. and Hargrave, P.А. (1988). Purification and characterization of rhodopsin kinase. J. Biol. Chem. 263, 14067-14073.

128. Kawamura, S., Cox, J.A. and Nef, P. (1994). Inhibition of rhodopsin phosphorylation by non-myristoylated recombinant recoverin. Biochem. Biophys. Res. Comm. 203, 121-127.

129. Shichi, H. and Somers, R.L. (1978). Light-dependent phosphorylation of rhodopsin. J. Biol. Chem. 253, 7040-7046.

130. Klenchin, V.A., Calvent, P.D. and Bownds, M.D. (1995). Rhodopsin kinase inhibition by recoverin. J. Biol. Chem. 270, 16147-16152.

131. Практикум по Биохимии/ Издательство Московского университета 1989, стр. 85.

132. Laemmli. U.K. (1970). Nature, 227, 680.

133. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электорофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. стр. 93.

134. Paulus,H.(1969) Anal. Biochem. 32, 91-100109

135. Alekseev A.M., ShuFga-Morskoy S.V., Zinchenko D.V., Suchkov D.V. Vaganova S.A., Senin I.I., Zargarov A.A., Lipkin V.M., Akhtar M, PhilippovP.P (1998) Obtaining and Characterization of EF-hand mutants of recoverin. FEBS Lett. 440(1-2), 116-118.

136. Автор выражает благодарность всем сотрудникам группы регуляторных белков ФИБХ РАН за помощь и создание творческой обстановки в ходе работы.