Новые подходы к оценке фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Дамбаева, Светлана Владимировна

• Дамбаева, Светлана Владимировна
• кандидат медицинских наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Дамбаева, Светлана Владимировна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Клетки-фагоциты. Классификация, онтогенез, характеристика фагоцитов.

1.1.1. Гранулоцитарная система фагоцитов.

1.1.2. Мононуклеарные система фагоцитов.

1.2. Изучение функциональной активности клеток-фагоцитов.

1.2.1. Уровень внутриклеточного Са2+ и полимеризация актина в фагоцитах.

1.2.2. Адгезивные свойства фагоцитов.

1.2.3. Хемотаксис, распознавание и поглощение объектов фагоцитоза.

1.2.4. Дегрануляция и кислороднезависимые микробицидные факторы фагоцитарных клеток.

1.2.5. Кислородзависимые микробицидные факторы фагоцитарных клеток.

1.2.5.1. Система НАДФН-оксидазы.

1.2.5.2. Система индуцибельной ЫО-синтазы (¡N08).

1.2.6. Апоптоз.

1.3. Патология фагоцитоза.

1.3.1. Наследственно обусловленные дефекты фагоцитов.

1.3.1.1. Нейтропении.

1.3.1.2. Патология хемотаксиса и дефекты адгезии фагоцитов

1.3.1.3. Дефекты опсонизации и поглощения.

1.3.1.4. Нарушение микробицидной функции фагоцитарных клеток

1.3.1.4.1. Хроническая гранулематозная болезнь.

1.3.1.4.2. Дефицит миелопероксидазы.

1.3.1.4.3. Дефицит вторичных гранул.

1.3.2. Вторичная иммунологическая недостаточность и функционирование фагоцитарной системы.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Характеристика обследованных групп населения.

2.2. Реактивы и расходные материалы.

2.3. Оборудование.

2.4. Методика исследований.

2.4.1. Анализ хемилюминесценции лейкоцитов.

2.4.2. Оценка фагоцитарного кислородного «взрыва» с помощью проточной цитофлюорометрии.

2.4.3. Оценка поглотительной активности фагоцитов по отношению к золотистому стафилококку.

2.4.4. Анализ внутриклеточного киллинга бактерий.

2.4.5. Анализ поглощения и киллинга грибов фагоцитами периферической крови.

2.4.6. Исследование апоптоза нейтрофилов.

2.4.7. Оценка экспрессии поверхностных молекул адгезии на лейкоцитарной популяции.

2.5. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты и обсуждения.

3.1. Разработка новых методов к оценке фагоцитарного звена иммунитета с помощью проточной цитофлюорометрии.

3.1.1. Определение наработки активных форм кислорода во время респираторного «взрыва». Уровень внутриклеточной перекиси водорода в фагоцитах периферической крови.

3.1.1.1. Выбор флюорохромных индикаторов активных форм кислорода.

3.1.1.2. Отработка тестов оценки фагоцитарного кислородного «взрыва» с помощью проточной цитометрии.

3.1.2. Разработка методов поглощения и киллинга Candida albicans фагоцитами периферической крови с использованием проточной цитофлюорометрии.

3.1.2.1. Оценка поглощения С.albicans фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитофлюорометрии.

3.1.2.2. Оценка киллинга С.albicans фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитофлюорометрии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые подходы к оценке фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности»

Актуальность темы диссертации

Одной из главных задач клинической иммунологии является диагностика нарушенного звена иммунной системы, в том числе и фагоцитарной. Все основные системы иммунитета задействованы в защите организма против инфекционных агентов - Т-лимфоциты и NK-клетки, фагоциты, иммуноглобулины и комплемент. Элиминация возбудителя осуществляется общими «усилиями» и все-таки центральное место в конечном этапе противоинфекционной защиты - киллинге микробных агентов и их разрушении -занимает фагоцитоз [33].

Известные врожденные дефекты фагоцитарных клеток характеризуются яркой клинической картиной, например, хроническая гранулематозная болезнь, синдром Чедиака-Хигаси, LAD (Leukocyte Adhesion Deficient) [3]. Однако постановка окончательного диагноза чаще всего запаздывает, т.к. основанием для этого могут служить только результаты комплексного исследования фагоцитарного звена. Соответственно может иметь место отсутствие необходимого соответствующего лечения и в период обострений, и профилактического.

Вторичная, приобретенная иммунологическая недостаточность, доминирующей формой которой является спонтанная, проявляется хроническими рецидивирующими инфекционно-воспалительными процессами самой различной локализации [32]. Изучение фагоцитарного звена иммунитета при вторичном иммунодефиците необходимо для выяснения степени его нарушения и причинно-следственной роли фагоцитарных факторов иммунной защиты в развитии иммунодефицита. Важно установить причины нарушения фагоцитоза, они могут быть как внутренними, так и внешними [33]. Вн> фенние причины обусловлены дефектом самих фагоцитов. К внешним причинам можно отнести факторы, активирующее действие которых является необходимым для полноценного функционирования фагоцитов, например, Т-лимфоциты и продуцируемые ими цитокины.

В клинической ii| дктике изучение фагоцитоза чаще всего сводится к анализу поглотительном активности клеток фагоцитов, причем особого внимания выбору мишени фагоцитоза не уделяется. Другими распространенными методами являются исследования кислородного «взрыва» с помощью НСТ-теста и хемилюминесценции. Ключевой функциональный тест фагоцитарных клеток -киллинг захваченных микробов - проводится микробиологическим методом, с подсчетом выживших после фагоцитоза микробов по числу колоний. Метод не имеет широкого распространения, так как является трудоемким и продолжительным по времени выхода результата.

В настоящее время прочные позиции во всех областях науки, где проводятся работы по исследованию структуры и функции клеточных популяций, завоевывает проточная цитофлюорометрия. Использование проточной цитофлюорометрии в иммунологии дает возможность оценки практически всех параметров иммунного статуса, включая и фагоцитарное звено [41, 60, 99].

Применение цитометрических методов исследования к оценке основных этапов фагоцитоза - это получение более объективной информации о состоянии фагоцитарных клеток. Среди неоспоримых преимуществ проточной цитометрии -возможность исследовать метаболизм отдельно взятой клетки, анализ очень большого числа клеток, наконец, высокая скорость, точность, простота постановки реакции и быстрое получение результата. В этом направлении уже сделаны большие успехи по разработке и внедрению методов оценки поглощения стафилококка и бактерицидности - внутриклеточного киллинга стафилококка [15| - пиогенного (внеклеточного) микробного агента.

В связи с этим, целью работы явилась дальнейшая разработка цитофлюорометрических методов к оценке фагоцитарного звена иммунитета и изучение фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности на новом методическом уровне с использованием проточной цитофлюорометрии.

Задачи исследования

1. Разработать метод оценки уровня активных форм кислорода в фагоцитарных клетках крови человека во время респираторного «взрыва» с использованием проточной цитофлюорометрии.

2. Разработать метод оценки поглощения и киллинга фагоцитами крови человека грибкового микробного возбудителя на примере Candida albicans с использованием проточной цитофлюорометрии.

3. Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с первичными иммунодефицитными состояниями.

4. Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.

Научная новизна

Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов тесты оценки кислородного «взрыва» в нейтрофилах и моноцитах периферической крови человека с применением индикаторов внутриклеточной перекиси водорода ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии.

Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов методики оценки поглощения и киллинга ФИТЦ-меченой С.albicans нейгрофилами и моноцитами крови человека с помощью проточной цитофлюорометрии для цельной крови (киллинг) и для выделенной лейкоцитарной суспензии (поглощение и киллинг).

Впервые проведено комплексное исследование состояния фагоцитарной системы у детей с ХГБ, в том числе с анализом бактерицидной и фунгицидной активности фагоцитов и анализом уровня продукции активных форм кислорода в отдельно взятых фагоцитарных клетках. Показаны возможное i и цитометрического метода оценки продукции активных форм кислорода для выявления Х-сцепленных вариантов наследования болезни.

При исследовании влияния полиоксидония на бактерицидную функцию фагоцитов впервые были получены данные о значительном киллинг-стимулирующем свойстве этого иммуномодулятора повышение киллинга бактерий на 50-100%. Эффект полиоксидония, выявленный при исследовании фагоцитарных клеток здоровых людей, в полной мере проявляется и в отношении НАДФН-оксидаза дефектных фагоцитов крови больных ХГБ. При этом показатели бактерицидности у больных ХГБ достигают нормативных значений.

Проведено комплексное изучение фагоцитарного звена иммунитета ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси и выявлены значительные дефекты в продукции активных форм кислорода и бактерицидности фагоцитов. Впервые обнаружено, что поглотительная активность фагоцитов крови больного в отношении стафилококка сопровождается апоптозом самих нейтрофилов, а опсонизация бактерий значительно увеличивает процент апоптоза фагоцитов.

Впервые использован цитометрический подход к исследованию основных показателей фагоцитоза у больных с вторичными иммунодефицитами. Выявлено, что для больных хроническим рецидивирующим фурункулезом характерно снижение бактерицидных качеств фагоцитарных клеток крови, а фагоцитарные клетки больных туберкулезом легких отличаются сниженными фунгицидными качествами (способностью убивать грибковые микробные агенты).

Практическая значимость работы

Метод оценки уровня внутриклеточной перекиси водорода (ДХФ-ДА и ДГР 123 тесты) с помощью проточной цитофлюорометрии разработан в виде микрометодов как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии, и подтвержден хемилюминесцентным анализом. Метод высокочувствительный, позволяет выявлять все клетки с дефектом НАДФН-оксидазы, например, при ХГБ, а также гетерозиготное носительство при X-сцепленном варианте наследования этой патологии. Разработаны нормативные показатели. Тесты просты в исполнении и могут использоваться для поточных исследований.

Для поточных исследований подготовлены и методы оценки поглощения и киллинга С.albicans с помощью проточной цитофлюорометрии. Набраны нормативные показатели по анализам здоровых людей. Метод оценки поглощения С.albicans пригоден для постановки как в цельной крови, так и с выделенной лейкоцитарной суспензией.

На примере различных патологий показана возможность исследования фагоцитоза с помощью проточной цитофлюорометрии и диагностики нарушенного звена фагоцитарной системы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование индикаторных красителей ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать уровень внутриклеточной перекиси водорода в отдельно взятой фагоцитарной клетке. Метод можно использовать для диагностики ХГБ и выявления гетерозиготного носительства при Х-сцепленном варианте ХГБ.

2. Использование живой и фиксированной ФИТЦ-меченой С.albicans и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать соответственно фунгицидную активность и поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов.

3. Применение цитофлюорометрических подходов к оценке функциональной активности фагоцитарных клеток позволяет провести комплексную оценку фагоцитарного звена при различных видах иммунологической недостаточности, в том числе первичных иммунодефицитах - ХГБ и синдроме Чедиака-Хигаси и вторичных иммунодефицитах - хроническом рецидивирующем фурункулезе и туберкулезе легких.

4. Под влиянием иммуномодулятора полиоксидония значительно повышается бактерицидная активность фагоцитарных клеток in vitro

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и одна работа принята к печати. Результаты доложены на 4-ом конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» 29-31 мая 2001г., Москва.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Дамбаева, Светлана Владимировна

Выводы

1. Адаптирован для практического применения цитометрический метод оценки уровня внутриклеточной перекиси водорода в фагоцитах периферической крови, отражающий интенсивность кислородного «взрыва» в этих клетках и предложены варианты с различными индикаторными красителями - ДХФ-ДА тест и ДГР 123 тест.

2. Разработан метод оценки поглощения ФИТЦ-меченых бластоспор Candida albicans нейтрофилами и моноцитами периферической крови с помощью проточной цитофлюорометрии.

3. Разработан метод оценки киллинга бластоспор Candida albicans фагоцитарными клетками периферической крови с использованием двойной флюоресцентной метки (ФИТЦ/PI) и проточной цитофлюорометрии.

4. С помощью цитофлюорометрических методов показано, что у детей с первичной иммунологической недостаточностью - хронической гранулематозной болезнью -дефицит по лейкоцитарной НАДФН-оксидазе в первую очередь отражается на бактерицидных качествах фагоцитов и менее - на способности убивать грибы.

5. Показано, что с помощью цитометрического метода оценки активных форм кислорода (ДХФ-ДА теста) можно выявлять Х-сцепленный вариант наследования болезни по исследованию лейкоцитов матери ребенка.

6. Выявлено in vitro значительное дозозависимое усиление бактерицидных качеств фагоцитарных клеток под влиянием иммуномодулятора полиоксидония как у здоровых лиц, так и у больных ХГБ.

7. С помощью цитофлюорометрических методов исследования выявлено значительное снижение продукции активных форм кислорода, внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитарными клетками и повышенный апоптоз нейтрофилов при синдроме Чедиак-Хигаси.

8. С помощью цитофлюорометрических методов оценки киллинга и поглощения микробов показано, что при туберкулезе легких и хроническом рецидивирующем фурункулезе происходит снижение способности фагоцитов убивать С.albicans и St.aureus соответственно.

3.3.3. Заключение

Исследование функциональной активности фагоцитарных клеток при вторичной иммунологической недостаточности было проведено больным с хроническим рецидивирующим фурункулезом и туберкулезом легких. Для оценки основных этапов фагоцитоза применялись методы, основанные на проточной цитофл юорометрии.

Было установлено, что при данных патологиях отклонения поглотительной активности не так существенны, хотя при сравнении с контрольной группой здоровых людей разброс намного выше. Это наблюдается и для нейтрофилов, и для моноцитов.

Нарушение микробоцидных качеств фагоцитарных клеток свойственно для обеих патологий. Причем в зависимости от патологии заметно страдает либо бактерицидная, либо фунгицидная активность лейкоцитов. При хроническом рецидивирующем фурункулезе достоверно снижены показатели внутриклеточного киллинга St.aureus - микробного агента, наиболее часто высеваемого из отделяемого фурункула. Способность убивать С.albicans клетками этих больных сохранена в рамках нормы.

Туберкулез легких в противоположность сопровождается нормальными значениями бактерицидной активности фагоцитов. Фунгицидные качества нейтрофилов и моноцитов достоверно снижены при сравнении с донорскими показателями. Это в какой-то степени и определило патологию, т.к. природа защитного иммунитета против туберкулезной палочки очень близка к антимикотической защите, связанной с Т-клеточным иммунитетом, цитокинами и макрофагами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Дамбаева, Светлана Владимировна, 2002 год

1. Абдуллаев Р.Ю., Мишин В.Ю. Сдвиги в показателях окислительного метаболизма лейкоцитов крови у больных туберкулезом легких// 3 (12) Съезд научн.-мед. ассоц. фтизиатров. Екатеринбург. - 17-20 июня. 1997: Сб.-рез. - M., 1997.-С.101.

2. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1989.

3. Гомес Л.А. Ярцев М.Н., Хахалин Л.Н. Всесоюзный регистр первичных иммунодефицитных состояний// Педиатрия. №9. - 1989. - с.81-85.

4. Гомес Л.А., Ярцев М.Н. Хроническая гранулематозная болезнь// Иммунология. 1995. - №4. - с.53-58.

5. Дамбаева C.B., Мазуров Д.В., Голубева Н.М., Пинегин Б.В. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность фагоцитарных клеток периферической крови доноров// Иммунология. -2000. №6.-с. 15-20.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.

7. Ершикова Ю.Е., Куликова Л.И., Головчанский О.В. Наследственно обусловленные дефекты фагоцитов. Лекция. М.: ЦОЛИУВ, 1987.

8. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета// Иммунология. 1995. - №3. -с.30-44.

9. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб.: Гиппократ, 1992.

10. Ю.Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов// Успехи современной биологии. 1999. - т.119. - №5. -с.461-474.

11. Клиническая иммунология и аллергология. Т.1 /Под ред. Л.Иегера. М.: Медицина, 1990.

12. Козлов И.Г., Горлина Н.К., Чередеев А.Н. Рецепторы кошактного взаимодействия// Иммунология. 1995. - №4. - с. 14-24.

13. Лактионова Л.В. Клинико-иммунологическая оценка эффективности терапии полиоксидонием у больных хроническим бронхитом и хроническим рецидивирующим фурункулезом/ Автореферат диссертации на соиск ученой степени кандидата медицинских наук М., 1998.

14. Мазуров Д.В. Разработка методов оценки поглотительной и бактерицидной функций фагоцитов периферической крови человека с использованием проточн. цитофлюорометрии/ Диссертация на соиск. ученой степени кандидата медицинских наук М., 2000. с.54-84.

15. Мазуров Д.В., Хамидуллина К.Ф., Пинегин Б.В. Оценка поглощения гранулоцитами и моноцитами периферической крови методом проточной цитометрии// Иммунология. 2000. - №1. - с.57-61.

16. Мазуров Д.В., Дамбаева C.B., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии// Иммунология. 2000. - №2. - с.57-59.

17. Маянский А.Н., Маянский H.A., Заславская М.И., Поздеев Н.М., Плескова С.Н. Апоптоз нейтрофилов// Иммунология. 1999. - №6. - С.11-20.

18. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. Казань: Магариф, 1993.

19. Набокина С.М. Регуляция экзоцитоза а нейтрофилах человека/ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук М., 1999.

20. Описов А.Н., Якутова Э.Ш., Владимиров Ю.А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа// Биофизика. -1993. т.38. - №3. - с.390.

21. Первичные имунодефициты. Рекомендации международной группы по детской астме. М.: Алтус. 1996г.

22. Петров Р.В., Ульянкина Т.И. И. И. Мечников: открытие иммунной системы// Иммунология. 1995. - №3. - с.3.-6.

23. Полякова М.И., Караев 3.0., Сардыко Н.В. Фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных хроническим кандидозом кожи и слизистых оболочек// ЖМЭИ. 1991. - № - с.63-65

24. Потапнев М.П., Печковский Д.В. Иммунорегуляция антимикробной активности нейтрофилов человека// Иммунология. 1995. - №5. - с.4-6.

25. Ройт А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991.

26. Сергеев А.Ю. Иммунитет при кандидозе// Иммунопатология, аллергология и инфектология. 1999. - №1. - с.91-99.

27. Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Клиническая иммунология и иммунопатология детского возраста / Руководство для врачей. М.: Медицина, 1996.

28. Фрейдлин И.А. Система мононуклеарных фагоцитов. М.: Медицина, 1984.

29. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Вторичные иммунодефициты: клиника, диагностика, лечение//Иммунология. 1999. -№1. -с. 14-17.

30. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные задачи клинической иммунологии по изучению функциональной активности фагоцитарных клеток// Иммунология. 1995. - №3. - с.6-10.

31. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М.: Изд-во ВНИРО, 1995.

32. Хаитов P.M., Чувиров Г.П., Маркова Т.П. Роль макрофагов в патогенезе ВИЧ-инфекции// Иммунология. 1995. - №3. - с. 10-14.

33. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса// Иммунология. 1995. - №4. - с.3-8

34. Ярилин A.A. Основы иммунологии: Учебник. М.: Медицина, 1999.

35. Asagoe К., Yamamoto К., Takahashi A., Suzuki К., Maeda A., Nohgawa М., Harakawa N., et al. Down-regulation of ezpression on human polymorphonuclear leukocytes by TNF-a// J.Immun. 1998. - V.160. - P.4518-4525.

36. Вагап J., Guzik K., Hryniewicz W., Ernst M., Fiad H.D., Pryjma J. Apoptosis of monocytes and prolonged survival of granulocytes as a result of phagocytosis of bacteria// Infect Immun. 1996. - V.64. - N.10. - P.4242-4248.

37. Bass D.A., Parce J.W., Dechaitelet L.R., Szejda P., Seeds M.C., Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neurtophils: a graded response to membrane stimulation// J Immunol. 1983. - V.130. - N4. - P. 19101917.

38. Bjerknes R. Flow cytometric assay for combined measurement of phagocytosis and intracellular killing of Candida albicans// J. Immunol. Methods. 1984. -V.72. - P.229-241.

39. Borregaard N., Kjeldsen L., Lollike K., Sengelov H. Granules and secretory vesicles of the human neutrophil// J.Clin. Exp.Immunol. 1995. - V. 101. - P.6-9.

40. Bredt D.S., Hwang P.M., Glatt C.E., Lowenstein C.L., Reed R.R., Snyder S.H. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase// Nature. 1991. - V. 351. - P.714-718.

41. Buschmann H., Winter M. Assesment of phagocytic activity of granulocytes using laser flow cytometry// J. Immunol. Methods. 1989. - V. 124. - N.2. - P. 129-138.

42. Cale C.M., Goldblatt D. Follow up of patients with chronic granulomatous disease diagnosed since 1990// Clin Exp Immunol. 2000. - V.120. - N.2. - P.351-355.

43. Christin L„ Wysong D.R., Meshulam T„ Wang S., Diamond R.D. Mechanism and target sites of damage in killing of Candida albicans Hyphae by human polymorphonuclear neutrophils// JID. 1997. - V. 176. - P.l 567-1578.

44. Condino-Neto A., Muscara M.N., Grumach A.S., Carneiro-Sampaio M.M., De Nucci G. Neutrophils and mononuclear cells from patients with chronic granulomatous disease release nitric oxide// Br J Clin Pharmacol. 1993. - V.35. - N.5. - P.485-490.

45. Darley-Usmar V., Wiseman H. Nitric oxide and oxygen radical: a question of balance// FEBS Letters. 1995. - V.369. - P.131-135.

46. Demircay Z., Eksioglu-Demiralp E., Ergun T., Akoglu T. Phagocytosis and oxidative burst by neutrophils in patients with reccurent furunculosis// Br. J. Dermatol. 1998,-V. 138,-N. 6. - P. 1036-1038.

47. Denis M. Killing of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: activation by cytokines and calcitriol// Clin. Exp. Immunol. 1991. - V.84. -P.200-206.

48. Diamond R.D., Clare R.A., Haudenshild C.C. Damage to Candida albicans hyphae and pseudohyphae by the myeloperoxidase system and oxidative products of neutrophils metabolism in vitro// J.Clin.Invest. 1980. - V.66. - P.908.

49. Diamond R.D., Lyman C.A., Wysong D.R. Disparate effects of interferon-y and tumor necrosis factor-a on early neutrophil respiratory burst and fungicidal responses to Candida albicans Hyphae in vitro// J. Clin. Invest. 1991. - V.87. -P.711-720.

50. Drevets D.A., Elliot A.M Fluorescence labeling of bacteria for studies of intracellular pathogenesis// J. Immunol. Methods. 1995. - V.187. - P.69-79.

51. Dugas B., Mossalayi M.D., Damais C., Kolb J.-P. Nitric oxide production by human monocytes: evidence for a role of CD23// Immunol. Today. 1995. -V.16.-P.574-580.

52. Eeden S.F., Klut M.E., Walker B.A.M., Hogg J.C. The use of flow cytometry to measure neutrophil function // J. of Immun. Meth. 1999. - V.232. - P.23-43.

53. Emmendorffer A., Hecht M., Lohmann-Mattes M.-L., Roester J. A fast easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorodamine 123 // J. of Immunol. Meth. -1990.-Vol.131.-P.269-275.

54. Evans T.J., Buttery L.D.K., Carpenter A., Springall D.R., Polak J.-M., Cohen J. Cytokine-treated human neutrophils contain inducible nitric oxide synthase that produces nitration of ingested bacteria// Proc Natl Acad Sci. 1996. - V.93. -P.9553-9558.

55. Flad H.D., Grade-Griebenow E., Petersen F., Scheueber B„ Brandt E., Baran J., Pryjama J., Ernst M. The role of cytokines in monocyte apoptosis// Pathobiology. 1999. - V.67. - N.5-6. - P.291-293.

56. Grage-Griebenow E., Durrbaum-Landmann I., Pryjma J., Loppnow 11., Flad H-D. Ernst M. Apoptosis in monocytes// Eur Cytokine Netw. 1998. - V.9(4). - P.699-700.

57. Hansen P.R. Myocardial reperfusion injury: experimental evidence and relevance //Eur. Heart J. 1995.-V.16.-P.736.

58. Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecule Probe). 1996.

59. Introne W., Boissy R.E., Gahl W.A. Clinical, molecular, and cell biological aspects of Chediak-Higashi syndrome// Mol.Genet.Metab. 1999. - V.68. - N.2.- P.283-303.

60. Johnston R.B. Clinical aspects of chronic granulomatous disease// Curr Opin Hematol. 2001. - V.8. - N. 1. - P. 17-22.

61. Kettritz R., Falk R.J., Jennete J.C., Gaido M.L. Neutrophil superoxide release is required for spontaneous and FMLP-mediated but not TNF alpha-mediated apoptosis// J.Am.Soc.Nephrol. 19997. - V.8. N.7. - P. 1091-1100.

62. Lammas S., Marsden P.A., Li G.K., Tempst P., Michel T. Endotelial nitric oxide synthase: molecular cloning and characterisation of a distinct constitutive enzyme isoform// Proc Natl Acad Sci USA. 1992. - V.89. - P.6348-6352.

63. Lehrer R.I., Ganz T., Szlarek D., Selsted M.E. Modulation of the in vivo candidacidal activity of human neutrophils defensins by target cell metabolism and divalent cations// J Clin Invest. 1988. - V.81. - P.1829-1835.

64. Levy R., Schlaeffer F. Succesful treatment of a patient with reccurent furunculosis by vitamin C: improvement of clinical course and of impaired neutrophil functions// Int. J. Dermatol. 1993. - V.32. - N. 11. - P.832-834.

65. Liese J., Kloos S., Jendrossek V., Petropoulou T., Wintergerst U., Notheis G., Gahr M„ Belohradsky B.H. Long-term follow-up and outcome of 39 patients with chronic granulomatous disease// J Pediatr. 2000. - V.137. - N.5. - P.687-693.

66. Liese J.G., Jendrossek V., Jansson A., Petropolou T., Kloos S„ Gahr M„ Belohradsky B.H. Chronic granulomatous disease in adults// Lancet. 1996. -V.347. - N.8996. - P.220-223.

67. Marodi L., Forehand J.R., Johnston R.B. Mecha .ism of host defense against Candida species. II. Biochemical basis for the killing of Candida by mononuclear phagocytes// J Immunol. 1991. - V.146. - P.2790-2794.

68. Marodi L., Kaposzta R., Campbell D.E., Polin R.A., Csongor J., Johnston R.B. Candidaeidal mechanism in the new human neonate. Impaired INF-y activation of macrophages in newborn infants// J Immunol. 1994. - V.l 53. - P.5643-5649.

69. Matsuba K.T., van Eeden S.F., Bicknell S.G., Walker B.A., Hayashi S., Hogg J.C. Apoptosis in circulating PMN: increased susceptibility in L-selektin-deficient PMN// Am.J.Phys. 1997. - V .272. - P.H2852.

70. Medical Immunology. Ed. Stites D.P., Terr A.I., Parslow T.G. A lange medical book, 9-th edition, Prentice-Hall International Inc., USA, 1997.

71. Model M.A., KuKuruga M.A., Todlll R.F. A sensitive flow cytometric method for measuring the oxidative burst// J. Immunol. Methods. 1997. - V.202. - P. 105111.

72. Murthy A.R., Lehrer R.I., Harwig S.S., Miyasaki K.T. In vitro candidastatic properties of human neutrophil calprotectin complex// J Immunol. 1993. -V. 151. — N. 11. — P.6291-6301.

73. Pietraforte D„ Triterelli E„ Testa U„ Minetti M. gp 120 HIV-1 envelope glycoprotein increases the production of nitric oxide in human monocyte-derived macrophages// J.Leukoc.Biol. 1994. - V.55. - P. 175-182.

74. Prince H.E., Lape-Nixon M. Influence of specimen age and anticoagulant on flow cytometric evaluation of granulocyte oxidative burst generation// J. Immunol. Methods. 1995. - V.l88. - P. 129-138.

75. Rollet-Labelle E., Grange M.-J.,k Elbim C., Marquetty C., Gougerot-Pocidalo M.-A., Pasquier C. Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator ofpolymorphonuclear neutrophil apoptosis// Free Radical Biol.&Med. 1998. -V.24. - N.4. - P.563-572.

76. Roos D., Van Bruggen R. Genetic analysis of patients with chronic granulomatous disease: insights in a clinical situation// Centr Eur J Immunol. 2000. - V25. -N.3. - P.106-112.

77. Rothbaum R.J., Williams D.A., Daugherty C.C. Unusual surface distribution of concanavalin A reflects a cytoskeletal defect in neutrophils in Shwachman's syndrome// Lancet. 1982. - V.9. - N.2. - P.800-801.

78. Rothe G., Valet G. Phagocytosis, intracellular pH and cell volume in the multifunctional analysis of granuloc;, tes by flow cytometry// Cytometry. 1988. -V.9.-P.316-324.

79. Rotstein D., Parodo J., Taneja R., Marshall J.C. Phagocytosis of Candida albicans induces apoptosis of human neutrophils// Shock. 2000. - V.14. - N.3. - P.278-283.

80. Salgo M.G., Stone K., Squadrito., Battista J.P., Pryor W.A. Peroxinitrite couses DNA nics in plasmide pBR322// Biochem and Biophys Res Communs. 1995. -V.210. - P.1025.

81. Saresella M., Roda K., Speciale L., Taramelli D„ Mendozzi E„ Guerini F., Ferrante P. A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes//J of Immunol Methods. -1997. V.210. - P.227-234.

82. Saresella M., Roda K., Speciale L„ Taramelli D., Mendozzi E., Guerini F„ Ferrante P. A flow cytometric method for the analysis of phagocytosis and killing by polymorphnuclear leukocytes// Ann N Y Acad Sci. 1997. - V.832. - P.53-61.

83. Shapiro H.M. Practical flow cytometry. Third v-dition. New York: Wiley Liss, 1995.-p.316-347.

84. Sicdlar M., Mytar B., Krzeszowiak A., Baran J., Hyszko M. Ruggiero I. Wieckiewicz J., Stachura J., Zembala M.// Demonstration of iNOS-mRNA in human monocyte stimulated with cancer cells in vitro. 1999. - V.65. - N.5. -P.597-604.

85. Springer Adgesion receptors of the immune system// Nature. 1990. - V.346. -P.425.

86. Strucks D. Strucrure function studies od iNOS// Nitric oxide: biology and chemistry. 1998. - V.2. -N.6. -P.385-428.

87. Tamir S., Tannenbaum H. The role of nitric oxide in cancerogenic process// Biochenm and Biophysical Acta. 1996. - V.1288. - P.31-36.

88. TsukaharaY., Morisaki T., Kojima M., Uchijama A., Tanaka M. iNOS expression by activated neutrophils from patients with sepsis// Aust N Z J Surg.2000. -V.71.-N.1.- P. 15-20.

89. Vazquez-Torres A., Jones-Carson J., Balish E. Peroxynitrite contributes to the candidacidal activity of nitric oxide-producing macrophages// Infect Immun.1996. V.64. - N.8. - P.3127-3; 33.

90. Webb J.L., Polak J.M., Evans T.J. Effect of adhesion on inducible nitric oxide synthase (iNOS) production in purified human neutrophils// Clin.Exp.Immunol.2001. V123. - N. 1. - P.42-48.

91. Weinberg J., Misukonis M. Human mononuclear phagocyte inducible nitric oxide synthase (iNOS): analysis of iNOS, mRNA, iNOS protein, biopterin. and nitric oxide production by blood monocyte// Blood. 1995. - V.86. - N.3. -P.l 184-1195.

92. Zeman K., Banasik M., Scopczynska H., Pokoca L., Bernatowska E. Contemporary diagnostics of chronic granulomatous disease// Centr Eur J Immunol. 2000. - V.25. - N3. - P. 113-118.

93. Zembala M., Siedlar M., Marcinkiewkcz J., Pryjma J. Human monocytes are stimulated for nitric oxide release in vitro by some tumor cells but not by cytokines and lipopolysaccharide// Eur.J.Immunol. 1994. - V.24. - 435-439.

94. Zysk G., Bejo L„ Schneider-Wald B.K., Nau R., Heinz H. Induction of necrosis and apoptosis of neutrophil granulocytes by Streptococcus pneumoniae// Clin.Exp.Immunol. 2000. - V. 122. - N. 1. - P.61 -66.