Характер немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Самышкина, Наталья Евгеньевна

• Самышкина, Наталья Евгеньевна
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Самышкина, Наталья Евгеньевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Защитные факторы генитального тракта: микоцидный ответ клеток врожденной иммунной системы

1.2. Модификация микоцидной активности клеток врожденной иммунной системы грибами рода Candida и патогенетические механизмы развития вульвовагинального кандидоза

Глава 2. Материал и методы исследования

2.1. Характеристика обследованных лиц

2.1.1. Микробиологическое обследование больных вульвовагинальным кандидозом женщин

2.1.2. Характеристика клинических групп больных вульвовагинальным кандидозом

2.2. Отбор изолятов грибов рода Candida для исследования

2.3. Иммунологические методы исследования немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК

2.3.1. Оценка фагоцитарной реакции

2.3.2. Оценка экстраклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов

2.3.3. Оценка уровня цитокинов в экстраклеточной среде

2.4. Методы статистической обработки данных

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3. Характер немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК здоровых лиц при культивировании с клиническими и природными изолятами грибов рода Candida в условиях in vitro

3.1. Особенности немедленной эффекторной реакции микоцидной активности ЛПК доноров в отношении клинических изолятов С.albicans

3.1.1. Микоцидная активность ЛПК в отношении двух клинических штаммов C.albicans, выбранных в качестве экспертных

3.1.2. Микоцидная активность ЛПК в отношении клинических изолятов C.albicans в зависимости от пола донора

3.1.3. Микоцидная активность различных фагоцитов периферической крови в отношении клинических изолятов C.albicans

3.1.4. Сравнение микоцидной активности ЛПК в отношении клинических изолятов C.albicans и контрольного штамма C.albicans АТСС

3.2. Сравнительный анализ характера немедленной эффекторной фазы микоцидной активности ЛПК в отношении природных изолятов C.guilliermondii и клинических изолятов C.albicans

3.2.1. Микоцидная активность ЛПК в отношении двух природных изолятов C.guilliermondii

3.2.2. Сравнение микоцидной активности ЛПК в отношении природных изолятов C.guilliermondii с клиническими изолятами C.albicans

Глава 4. Особенности немедленной эффекторной фазы микоцидной активности ЛПК больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с клиническими изолятами C.albicans

4.1. Сравнительный анализ характера немедленной эффекторной фазы микоцидной активности ЛПК больных ВВК и здоровых лиц

4.2. Характер немедленной эффекторной фазы микоцидной активности ЛПК больных в зависимости от клинических форм вульвовагинального кандидоза

Глава 5. Влияние патогенетических факторов риска на характер немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК больных при различных клинических формах ВВК

5.1. Влияние состояния вагинального микробиоценоза на характер микоцидной активности ЛПК больных с различными клиническими формами ВВК

5.2. Частота встречаемости системной нейтропении у больных с различными клиническими формами ВВК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характер немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом»

Актуальность проблемы

Вульвовагинальный кандидоз (ВВК) является оппортунистической инфекцией слизистых нижнего отдела генитального тракта, вызванной грибами рода Candida. Наиболее частым возбудителем является вид Candida albicans, который с легкостью демонстрирует свои дуалистические способности: с одной стороны - это уверенный комменсал (временный или постоянный) вагинальной слизистой, ротовой полости, желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, а с другой — успешный оппортунист этих же анатомических мест [7, 22, 63, 82, 116, 126].

Начиная со второй половины XX столетия, во всем мире отмечен рост не только системных, но и поверхностных форм кандидоза, в том числе, вульвовагинального [74, 80]. Несмотря на значительные успехи в диагностике и лечении, у 75% женщин, по крайней мере, однократно в течение репродуктивного периода жизни наблюдается ВВК [53, 115]. И хотя количество работ, посвященных изучению поверхностных кандидозов, постоянно возрастает, многие вопросы и проблемы остаются не решенными.

До конца не определены формы иммунной защиты при вагинальном кандидозе — клеточный/гуморальный, врожденный/адаптивный иммунный ответ. Часть авторов отводят главную роль Т-клеточному иммунитету [63, 102, 112, 122]. Однако при иммунодефицитах, в частности при ВИЧ-инфекции, частота вагинального кандидоза не повышается, а СПИД-ассоциированной инфекцией является орофарингеальный кандидоз [75, 76, 84, 95]. Многие исследователи указывают на важную роль клеток врожденной иммунной системы, что определяется анатомическими особенностями строения нижнего отдела генитального тракта [53, 59, 60, 78, 79, 112]. Важнейшим механизмом защиты вагинальной слизистой считается выселение в толщу эпителия и на его поверхность лейкоцитов, в основном, нейтрофилов, которые первыми и очень рано выходят из циркулирующей крови в очаг инфекции [14, 24, 46, 74, 101, 132]. Особый интерес представляют данные, подтверждающие функциональную гетерогенность популяции нейтрофильных гранулоцитов [121]. Показано, что часть нейтрофилов отвечает немедленной эффекторной реакцией на встречу с инфекционным агентом, осуществляя фагоцитоз, секреторную дегрануляцию бактерицидных продуктов во внеклеточную среду и формируя NETs - нейтрофильные экстраклеточные ловушки [62, 97, 98, 123]. А другая часть нейтрофилов становится продуцентами различных медиаторов, цитокинов и хемокинов, играя связующую иммунорегуляторную роль между врожденным и адаптивным иммунитетом [71, 72, 135].

До сих пор нет четких представлений не только об инициаторах различных клинических форм вагинального кандидоза, но и о патогенетических механизмах, определяющих развитие острых и хронических форм ВВК. Известно, что острые формы ВВК характерны для молодых, сексуально-активных женщин, у которых манифестация вагинального кандидоза связана, в основном, с эстрогенными факторами риска, либо острый ВВК развивается у иммунокомпрометированных лиц [12, 22]. Тогда как хронические формы ВВК, в том числе рецидивирующие, более чем в половине случаев не связаны с предрасполагающими факторами и встречаются у иммунокомпетентных женщин детородного возраста [51, 74, 111, 113, 114, 122]. Остается не достаточно изученным и влияние патогенетических факторов риска, таких как бактериальный вагиноз или системная нейтропения, на течение различных клинических форм вульвовагинального кандидоза.

Существует еще одна проблема. За последние два десятилетия среди возбудителей ВВК доля грибов Candida non-albicans увеличилась до 15-30%. Многие авторы объясняют данный факт ростом во всем мире популяции иммунокомпрометированных лиц, для которых характерен довольно высокий процент колонизации ротовой полости, кишечника, кожи, в том числе промежности, грибами поп-albicans видов — C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.guilliermondii [3, 30, 43, 75, 80, 118], способных выступать в качестве эндогенных источников вагинального кандидоза. В связи с тем, что механизмы иммунной защиты нижнего отдела генитального тракта до конца не ясны, особенно в отношении грибов Candida поп-albicans, но хорошо известна устойчивость последних к современным антифунгальным препаратам, то перед клиницистами стоят серьезные проблемы, связанные с разработкой методов профилактики и лечения таких оппортунистических инфекций.

Цель исследования

Оценить профиль изменений иммунных параметров, характерных для немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом в отношении живых изолятов грибов рода Candida различных экологических ниш (клинические вагинальные С.albicans и природные C.guilliermondii) в условиях in vitro, с целью выделения иммунологических маркеров острых и хронических клинических форм вульвовагинального кандидоза.

Задачи исследования

1. Изучить характер немедленной эффекторной фазы (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг непоглощенных фагоцитами грибов, уровень цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды) микоцидной активности лейкоцитов периферической крови здоровых лиц при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans в условиях in vitro.

2. Оценить иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови здоровых лиц при культивировании с живыми природными изолятами C.guilliermondii в условиях in vitro.

3. Определить иммунные параметры немедленной эффекторной фазы (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг непоглощенных фагоцитами грибов, уровень цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды) микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans.

4. Изучить профили иммунных параметров, характеризующие немедленную эффекторную реакцию микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных в зависимости от клинических форм вульвовагинального кандидоза — острые и хронические с редкими и частыми рецидивами, при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans.

5. Оценить влияние патогенетического фактора риска — наличие вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах, на реализацию немедленной эффекторной фазы микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных при различных клинических формах вульвовагинального кандидоза.

Научная новизна

Впервые в условиях in vitro при культивировании лейкоцитов периферической крови (ЛПК) здоровых лиц с живыми изолятами грибов рода Candida различных экологических ниш (природные C.guilliermondii и клинические вагинальные С.albicans) и контрольным штаммом С.albicans АТСС10231 определены особенности немедленной эффекторной реакции (с 15 по 60 минуту) микоцидного ответа: показатели этапов фагоцитоза, выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде, содержание основных цитокинов с про- и противовоспалительным эффектом в супернатантах экстраклеточной среды.

Установлено, что киллинг живых непоглощенных фагоцитами природных грибов C.guilliermondii и клинических вагинальных изолятов С. albicans происходит, в основном, внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых и больных ВВК в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту). Выживаемость клинических вагинальных изолятов C.albicans в среде культивирования с ЛПК здоровых лиц достоверно выше, чем природных изолятов C.guilliermondii, достоверно нарастает к 60 минуте инкубации и сопровождается достоверно более высокими показателями индекса поглощения лейкоцитами во все сроки наблюдения.

Установлены профили иммунных параметров, характеризующие особенности начального этапа развития (в течение первых 15 минут) немедленной эффекторной фазы микоцидной активности лейкоцитов периферической крови больных в зависимости от клинических форм ВВК

- острые и хронические с редкими и частыми рецидивами, при культивировании с живыми клиническими изолятами C.albicans.

Показано, что профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК имеет различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде в зависимости от наличия/отсутствия у больных с различными клиническими формами ВВК вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах. При наличии бактериальных ассоциаций у больных острым ВВК наблюдается достоверное снижение уровня IFN-y и повышение уровня IL-IRa, а при хроническом ВВК с редкими и частыми рецидивами наблюдается достоверное повышение уровней TNF-a, IFN-y, и снижение уровня IL-IRa по сравнению с имеющими кандидозную моно-инфекцию.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты оценки характера немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных ВВК в отношении живых клинических вагинальных изолятов C.albicans (показателей этапов фагоцитоза, экстраклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровней основных цитокинов с про-и противовоспалительным эффектом в супернатантах экстраклеточной среды) позволили установить наличие ассоциаций между клиническими формами ВВК и профилем изменений отдельных иммунных параметров (в первые 15 минут после контакта ЛПК с грибами C.albicans), что позволяет считать их иммунологическими маркерами острых и хронических клинических форм заболевания.

Полученные данные могут быть использованы не только в качестве информативных диагностических тестов в лабораторной практике при дифференциальной диагностике хронических форм вульвовагинального кандидоза, но и служить лабораторными маркерами, позволяющими определить подходы к лечению острых и хронических форм ВВК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Киллинг живых непоглощенных фагоцитами грибов природных C.guilliermondii и клинических вагинальных C.albicans изолятов происходит внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту).

2. Определенные профили иммунных параметров, характеризующие немедленную эффекторную фазу микоцидного ответа (показатели фагоцитарной реакции, экстраклеточный киллинг не фагоцитированных грибов, уровень основных цитокинов в супернатантах среды культивирования) лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans в условиях in vitro, могут использоваться в качестве патогенетически значимых иммунологических маркеров острых и хронических форм вульвовагинального кандидоза.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы микологии» (Челябинск, 2004); IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005); юбилейной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», посвященной 10-летию Российской Академии Естествознания (Москва, 2005); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006). Участие в работе Всероссийского конгресса по медицинской микологии (Москва, 2003, 2004, 2005 и 2006); научной конференции «Климат и окружающая среда» (Амстердам, 2006); конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2006); Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006); Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006). XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы используются в учебном процессе: при преподавании вопросов инфекционной иммунологии, как в лекционном материале, так и на практических занятиях на кафедре микробиологии ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, включает 11 рисунков, 8 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка литературы, включающего работы 52 отечественных и 84 иностранных авторов, и приложения, включающего 2 рисунка и 4 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Самышкина, Наталья Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Киллинг живых непоглощенных фагоцитами грибов природных C.guilliermondii и клинических вагинальных изолятов C.albicans происходит, в основном, внеклеточно - в среде культивирования с лейкоцитами периферической крови здоровых лиц, в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту). Внеклеточная выживаемость клинических вагинальных изолятов C.albicans достоверно выше, чем природных изолятов C.guilliermondii, достоверно нарастает к 60 минуте инкубации и сопровождается достоверно более высокими показателями индекса поглощения лейкоцитами во все сроки наблюдения.

2. Немедленная эффекторная фаза (с 15 по 60 минуту) микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови больных вульвовагинальным кандидозом при культивировании с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans характеризуется низкими показателями поглотительной способности фагоцитов, высоким уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) в экстраклеточной среде культивирования и выживаемостью менее 50% оставшихся непоглощенными грибов (по сравнению с аналогичными показателями, характеризующими ответы лейкоцитов здоровых лиц).

3. При остром вульвовагинальном кандидозе начальный этап (на 15 минуте) немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови характеризуется следующими особенностями: достоверно сниженными показателями индекса поглощения грибов C.albicans-, достоверно высоким уровнем провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) и низким уровнем IL-IRa в среде культивирования по сравнению с аналогичными показателями у больных с хроническими формами и здоровых лиц; показателями выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов, равными контролю на 15 минуте и достоверно снижающимися к 60 минуте наблюдения.

4. При хроническом вульвовагинальном кандидозе с редкими эпизодами рецидивов профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов характеризуется: низкими значениями всех показателей фагоцитарной реакции, за исключением поглотительной способности (при сравнении с показателями здоровых и больных другими формами вульвовагинального кандидоза); отсутствием динамики выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов (с 15 по 60 минуту); слабовыраженным провоспалительным цитокиновым потенциалом экстраклеточной среды по сравнению с острой формой заболевания.

5. При хроническом вульвовагинальном кандидозе с частыми эпизодами рецидивов иммунные параметры немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови имеют наиболее значимые различия, регистрируемые на 15 минуте инкубации с живыми клиническими вагинальными изолятами C.albicans: достоверно высокие показатели индекса поглощения, особенно моноцитами периферической крови, на фоне достоверно низкой выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов и достоверно низких уровней провоспалительных цитокинов (TNF-a и IFN-y) по сравнению с аналогичными показателями больных острой формой ВВК.

6. Профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови имеет различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде в зависимости от наличия у больных с различными клиническими формами вульвовагинального кандидоза вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах: при наличии бактериальных ассоциаций у больных в острой форме достоверно снижен уровень IFN-y и повышен IL-IRa, а при хронических формах с редкими и частыми рецидивами достоверно повышены уровни TNF-a, IFN-y и снижен уровень IL-IRa, по сравнению с имеющими кандидозную моноинфекцию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вульвовагинальный кандидоз (ВВК) является инфекционно-воспалительным заболеванием нижнего отдела генитального тракта женщин, вызванным оппортунистическими грибами рода Candida. Широкая распространенность у здоровых сексуально-активных женщин асимптоматической колонизации влагалища грибами Candida spp. (от 20 до 40%) и высокая частота рецидивов симптоматического генитального кандидоза у иммунокомпетентных пациенток репродуктивного возраста делают ВВК актуальной медицинской проблемой [53, 74, 77, 115].

Основываясь на данных ряда работ [53, 79, 111, 112], демонстрирующих важность клеточных компартаментов врожденной иммунной системы в защите вагинальной слизистой от Candida-инфекции, в частности, полиморфно-ядерных лейкоцитов, дендритных клеток, тканевых макрофагов и моноцитов, мы обратили наше внимание на раннюю, быструю эффекторную фазу (в течение первых 15-60 минут) воспалительного ответа клеток, которая включает фагоцитоз, формирование NETs и секреторную дегрануляцию микробицидных продуктов и различных медиаторов, в том числе цитокинов и хемокинов [33, 48, 49, 52, 61, 62, 72, 73, 97, 123, 135]. В условиях in vitro мы провели оценку иммунных параметров немедленной эффекторной реакции микоцидного ответа лейкоцитов периферической крови при встречи с антигенами живых изолятов грибов рода Candida, а именно — фагоцитоз и его этапы (показатели фагоцитарной реакции лейкоцитов), дегрануляцию (опосредовано через оценку киллинговых свойств экстраклеточной среды ЛПК в отношении живых грибов, то есть через оценку выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде культивирования лейкоцитов), и цитокиновый ответ этих клеток на встречу с антигеном (содержание основных цитокинов с про- и противовоспалительным эффектом в супернатантах среды культивирования). В работе мы использовали ЛПК - моноциты периферической крови, являющиеся секреторными клетками и активными продуцентами цитокинов, и гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы), так как в свете современных данных нейтрофильные гранулоциты рассматриваются как иммунорегуляторные клетки, являющиеся, в частности, источниками цитокинов IFN-y, TNF-a, IL-8, IL-IRa, и тесно взаимодействующие, в том числе, с моноцитами [61, 72, 73, 92, 135].

Определение всех параметров немедленной эффекторной фазы микоцидной активности (показателей фагоцитарной реакции, экстраклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровня основных цитокинов в супернатантах среды культивирования) проводили на лейкоцитах, адгезированных к стеклу в условиях взаимодействия всех клеток и плазменных факторов периферической крови в течение часа инкубации. Получение адгезированных ЛПК, несомненно, являлось фактором праймирования, то есть фактором неспецифической стимуляции, приводящим в состояние повышенной готовности и увеличению активности каждой функции клетки на действие нового стимула - контакт с живыми грибами рода Candida [70, 100, 101]. Адгезия, в общем, и связывание интегринов, в частности, является одним из законов клеточной биологии - поведение клетки контролируется интегриновыми и не-интегриновыми рецепторами. Контроль над полномасштабной активацией нейтрофила при инфекции или повреждении осуществляется через два сигнала: через сигнал, поступивший от связывания интегринов с белками внеклеточного матрикса на клеточных или неклеточных поверхностях, и через сигнал, переданный с поверхностных клеточных рецепторов для воспалительных факторов, цитокинов и хемокинов [100, 101, 136].

Известно, что грибы рода Candida экспрессируют поверхностные молекулы адгезии и инвазивные биомолекулы, которые оказывают влияние на фагоцитировавшие их клетки, повреждая или подавляя метаболизм кислородного взрыва и секрецию перекиси водорода, и способны защищать себя от фагоцитоза, пенетрируя клеточные мембраны фагоцита прорастающими гифами [53, 59, 111, 112]. Инактивация грибов нагреванием исключает их влияние на лиганд-рецепторные взаимодействия с клетками хозяина и фагоцитарную реакцию, поэтому в нашей работе мы использовали живые изоляты грибов рода Candida.

Все исследования были проведены на клетках одних и тех же доноров женского пола при культивировании с двумя клиническими вагинальными изолятами (штамм C.albicans-8 и штамм C.albicans-11) и двумя природными изолятами (штамм C.guilliermondii КБП-3198 и штамм C.guilliermondii КБП-3206). При сравнительном анализе показателей, характеризующих немедленную эффекторную фазу (с 15 по 60 минуту) микоцидной активности ЛПК, мы не обнаружили достоверных различий между штаммами, поэтому рассматривали их как клинические экспертные изоляты C.albicans и природные изоляты C.guilliermondii.

В результате оценки характера немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК при культивировании с живыми изолятами грибов рода Candida различных экологических ниш (природные C.guilliermondii, клинические вагинальные C.albicans) мы установили, что киллинг живых непоглощенных фагоцитами природных изолятов

C.guilliermondii и клинических вагинальных изолятов C.albicans происходит внеклеточно — в среде культивирования с лейкоцитами доноров, что соответствует данным других авторов [15, 53, 94, 122, 123]. Наиболее ярким свидетельством этого являются природные изоляты C.guilliermondii, в отношении которых наблюдалась достоверно низкая поглотительная активность лейкоцитов доноров, даже при достоверно высокой, возможно, неспецифической адгезии грибов к ЛПК, и достоверно низкая выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде по сравнению с клиническими вагинальными изолятами C.albicans. Следовательно, чем меньше индекс поглощения, тем больше бластоконидий грибов остается во внеклеточной среде, где они больше погибают под действием кандидацидных продуктов экстраклеточной среды, содержащей агрессивные кислородные радикалы и антимикробных субстанции [2, 14]. Возможно, данные события объяснимы малыми ко-эволюционными связями между природными изолятами и макроорганизмом, так как организм человека не являлся для них хозяином.

Клинические вагинальные изоляты, в отличие от природных грибов C.guilliermondii, демонстрировали более успешную тактику сосуществования с клетками макроорганизма, проявляя вирулентные свойства в отношении ЛПК: достоверно больше поглощались лейкоцитами, достоверно меньше погибали в экстраклеточной среде культивирования, и выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов достоверно нарастала к 60 минуте. Вероятно, благодаря тесным эволюционным связям и жесткому селективному отбору клинические изоляты приобрели способность легко адаптироваться к жизни в условиях физиологических экстримов хозяина, обеспечивая себе явные преимущества перед природными изолятами. Нарастание выживаемости с 15 по 60 минуту) непоглощенных клинических изолятов C.albicans в среде культивирования ЛПК доноров может свидетельствовать о хороших адаптационных возможностях C.albicans, а если это так, то стратегия возбудителя должна строится на включении механизмов, обеспечивающих наименьший воспалительный потенциал в месте инвазии при встречи с клетками врожденного иммунитета и гуморальными факторами. Работами многих авторов показана как иммуномодулирующая способность грибов C.albicans или их антигенов индуцировать продукцию множества провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-ф, IL-6, IL-2, GM-CSF, IFN-y), так и иммуносупрессирующая способность маннана, большого гликопротеина микотической клеточной стенки, подавлять воспалительный ответ, приводя к экспрессии генов IL-4, IL-5, IL-IRa и IL-10 [53, 111]. По нашим данным уровни основных цитокинов в супернатантах экстраклеточной среды ЛПК доноров, стимулированных грибами природных изолятов и клинических вагинальных изолятов, в ходе развития немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа (с 15 по 60 минуту) были одинаково низкими.

При оценке характера немедленной эффекторной фазы микоцидной активности ЛПК в качестве контрольного живого объекта мы использовали штамм C.albicans АТСС10231, в отношении которого наблюдалась достоверно высокая поглотительная активность лейкоцитов и достоверно низкая выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов по сравнению с клиническими вагинальными изолятами C.albicans. Штамм C.albicans АТСС10231 являлся коллекционным, культивируемым in vitro на питательных средах, не был пассирован через организм человека и, возможно, утратил некоторые вирулентные свойства по сравнению с клиническими изолятами, а поэтому не отвечал критериям экспертного изолята для изучения характера начального этапа микоцидного ответа ЛПК больных вульвовагинальным кандидозом. Поэтому в качестве экспертных были выбраны клинические вагинальные изоляты C.albicans.

Сравнительный анализ немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК больных ВВК показал, что грибы живых экспертных изолятов C.albicans поглощаются лейкоцитами достоверно хуже по сравнению с ЛПК здоровых лиц на 15 минуте и на 60 минуте, и индекс поглощения грибов лейкоцитами больных не нарастает к 60 минуте. Выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в среде культивирования с лейкоцитами больных ВВК достоверно ниже через 15 и 60 минут инкубации (по сравнению с ЛПК здоровых), и не изменяется во времени с 15 по 60 минуту. Исходя из наших данных, можно предположить, что основным механизмом киллинга грибов клетками врожденной иммунной системы является внеклеточное убийство в экстраклеточной среде окружения. Усиленный экстраклеточный киллинг грибов лейкоцитами больных, возможно, свидетельствует о повышенной реактивности ЛПК, обеспечивающей немедленный ответ на C.albicans в виде выброса микоцидных продуктов и секреции БАВ, в том числе цитокинов и хемокинов. В результате, в экстраклеточной среде формируется выраженный провоспалительный цитокиновый потенциал (достоверно высокий уровень IFN-y и TNF-a по сравнению с ЛПК доноров). По нашим данным, развитие немедленной эффекторной реакции микоцидной активности ЛПК больных ВВК в отношении клинических вагинальных изолятов C.albicans имеет общие черты с развитием микоцидной активности ЛПК здоровых лиц в отношении природных изолятов - достоверно низкие показатели поглощения грибов, достоверно низкая выживаемость непоглощенных грибов во внеклеточной среде (процент выживаемости как у природных изолятов) без положительной динамики с 15 по 60 минуту.

При сравнительном анализе немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК больных в зависимости от клинической формы ВВК, мы установили характерные различия начального этапа (на 15 минуте) микоцидного ответа ЛПК больных с острыми и хроническими фрмами вагинального кандидоза с редкими и частыми эпизодами рецидивов.

Больные острой формой ВВК: 1) достоверно низкая поглотительная способность лейкоцитов по сравнению с показателями групп сравнения больных и здоровых на 15 минуте инкубации, которая имеет положительную динамику во времени (с 15 по 60 минуту); 2) выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов в экстраклеточной среде соответствует контролю и достоверно выше показателей больных с частыми рецидивами хронического ВВК на 15 минуте, но достоверно снижается к 60 минуте, становясь равной показателям групп сравнения больных. Возможно, данный феномен связан с нарастанием микоцидной агрессивности экстраклеточной среды к 60 минуте, что определяет положительную динамику внеклеточного киллинга непоглощенных грибов и, в то же время, положительную динамику повышения их поглощения, возможно, активно создаваемого самими грибами. Об агрессивности экстраклеточной среды свидетельствует ее выраженный провоспалительный цитокиновый состав; 3) уровни TNF-a и IFN-y достоверно выше, а уровень IL-IRa достоверно ниже по сравнению с уровнями групп сравнения больных ВВК и здоровых доноров. Развитие острой воспалительной реакции у больных данной группы, возможно, обусловлено встречей с большой дозой и (или) необычным штаммом грибов рода Candida. При наличии сопутствующих вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах - уровень IFN-y в среде культивирования ЛПК достоверно ниже, а уровни IL-8 и IL-IRa достоверно выше по сравнению с имеющими моно-инфекцию. Следовательно, добавление дополнительного стимулирующего фактора в виде сопутствующей микст-инфекции у больных острым ВВК сопровождалось снижением провоспалительного цитокинового потенциала экстраклеточной среды ЛПК. Данная клиническая группа, как мы считаем, не требует назначения иммунокорригирующей терапии, выбор тактики лечения достаточно ограничить назначением антифунгальных препаратов.

Больные хроническим ВВК с редкими эпизодами рецидивов: 1) все показатели фагоцитарной реакции ЛПК, кроме индекса поглощения, отличаются достоверно низкими значениями на 15 минуте инкубации по сравнению с показателями групп сравнения больных и здоровых лиц; 2) отсутствует динамика выживаемости непоглощенных фагоцитами грибов (с 15 по 60 минуту контакта); 3) наблюдается слабовыраженный провоспалительный цитокиновый потенциал экстраклеточной среды по сравнению с больными острой формой ВВК (уровни TNF-a и IFN-y достоверно ниже уровней больных острым ВВК, но достоверно выше контроля, а уровень IL-IRa равен контролю, но достоверно выше уровня больных острым ВВК). Анализ полученных данных позволяет предположить, что для этой группы характерен невысокий потенциал общей микоцидной активности, включающей не только цитокины, но и микробицидные факторы, уровень которых во внеклеточной среде определяется активностью таких процессов, как дегрануляция нейтрофилов, эозинофилов и секреция моноцитов. О недостаточной активности этих клеток может свидетельствовать снижение всех показателей фагоцитарной реакции при наличии положительной динамики поглощения грибов. Такая инертность и низкая реактивность раннего воспалительного ответа клеток врожденного иммунитета, а также достаточно высокие концентрации противовоспалительного цитокина IL-IRa (на одном уровне со здоровыми) в экстраклеточной среде, вероятно, обеспечивают персистенцию хронического воспалительного специфического ответа и поддерживают состояние равновесного паразитизма, что, возможно, сопровождается селекцией устойчивых штаммов грибов и/или сменой возбудителей на виды Candida поп-albicans. При наличии сопутствующих вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах - уровни TNF-a и IFN-y достоверно выше, а уровень IL-IRa достоверно ниже по сравнению с имеющими моно-инфекцию. Следовательно, наличие сопутствующей микст-инфекция у больных хроническим ВВК с редкими эпизодами рецидивов сопровождалось повышением провоспалительного цитокинового потенциала экстраклеточной среды ЛПК. Возможный выбор тактики лечения больных данной клинической группы необходимо направить на стимуляцию фагоцитарной активности лейкоцитов и их микоцидного потенциала.

Больные хроническим рецидивирующим ВВК с частыми эпизодами рецидивов: 1) достоверно высокий на 15 минуте индекс поглощения по сравнению с аналогичными показателями групп сравнения больных. Для этой группы были характерны различия в поглотительной способности моноцитов и нейтрофилов — индекс поглощения грибов моноцитами был равен контролю, в отличие от групп сравнения больных (достоверно ниже показателей контрольной группы), а индекс поглощения нейтрофилами - достоверно ниже контроля. О роли моноцитов/макрофагов в защите от кандидозной инфекции существуют противоречивые мнения. Многие авторы считают, что микоцидная активность моноцитов/макрофагов чрезвычайно низка, и в определенных условиях они могут служить резервуаром бластоконидий C.albicans [88, 96, 112, 122, 125]. Но все авторы отмечают [53, 70, 111, 113], что кандидацидная способность этих лейкоцитов резко активируется под влиянием TNF-a и IFN-y; 2) выживаемость непоглощенных фагоцитами грибов достоверно ниже показателей групп сравнения на 15 минуте, но к 60 минуте контакта возрастает и становится равной показателям групп сравнения больных; 3) уровни TNF-a и IFN-y достоверно выше контроля, равны уровням больных хроническим ВВК с редкими рецидивами, но достоверно ниже уровней больных острым ВВК, а уровень IL-IRa равен контролю и достоверно выше уровня больных острым ВВК, то есть по сравнению с больными острой формой ВВК наблюдается слабовыраженный провоспалительный цитокиновый потенциал экстраклеточной среды. Следовательно, особенностью немедленной эффекторной реакции ЛПК больных данной группы, как мы можем предполагать, является ранняя агрессивность экстраклеточной среды (на 15 минуте), о чем свидетельствует высокий индекс поглощения грибов и низкая выживаемость непоглощенных грибов во внеклеточной среде в данный промежуток времени по сравнению с группами сравнения больных. Чрезмерно быстрая ответная реакция ЛПК, вероятно, не особенно продуктивна, так как нами показано, что к 60 минуте выживаемость грибов повышается, а цитокиновый потенциал среды не изменяется и остается слабо провоспалительным. Развитие такой непродуктивной реакции обусловлено, возможно, низким порогом возбудимости полиморфно-ядерных гранулоцитов на антигены грибов рода Candida. Моноциты больных данной группы, поглощая бластоконидии C.albicans на одном уровне со здоровыми клетками становятся, возможно, своего рода резервуаром для выживания и ускользания грибов от экстраклеточного киллинга. Последующее прорастание и выход грибов Candida spp. через клеточную мембрану моноцита/ макрофага вызывает, даже в низкой дозе, очередное развитие воспалительной реакции со стороны нейтрофилов, находящихся в состоянии высокой реактивности. Такой дисбаланс иммунорегуляторных взаимоотношений между нейтрофилами и моноцитами, возможно, приводит к рецидивирующему характеру течения ВВК в данной группе больных., При наличии сопутствующих вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах — уровень TNF-a и IFN-y в среде культивирования ЛПК выше, а уровень IL-IRa достоверно ниже по сравнению с имеющими моно-инфекцию. Следовательно, наличие сопутствующей микст-инфекции сопровождалось повышением провоспалительного цитокинового потенциала экстраклеточной среды ЛПК. Данная группа больных требует выбора тактики лечения, направленного на снижение реактивного состояния нейтрофилов, стабилизацию клеточных мембран клеток с целью предотвращения чрезмерной дегрануляции и продления ранней фазы воспалительного ответа, нормализацию взаимоотношений между фагоцитами.

Таким образом, анализ показателей (этапов фагоцитарной реакции, внеклеточного киллинга непоглощенных фагоцитами грибов, уровней основных цитокинов с про- и противовоспалительными эффектами в экстраклеточной среде культивирования), характерных для немедленной эффекторной реакции ЛПК в отношении живых изолятов грибов рода Candida различных экологических ниш — природные C.guilliermondii и клинические вагинальные C.albicans, позволил выделить отличительные признаки начального этапа (в течение первых 15 минут) микоцидного ответа лейкоцитов здоровых и больных вульвовагинальным кандидозом лиц, которые ассоциируются не только с экологической нишей изолята природные/клинические) и состоянием организма хозяина — здоровый/больной ВВК, но и с формой клинического течения вульвовагинального кандидоза, что позволит использовать эти показатели в качестве информативных показателей при лабораторной диагностике острых и хронических форм ВВК. Проведенные исследования показали, что в зависимости от наличия/отсутствия у больных с различными клиническими формами ВВК вагинальных бактериальных ассоциантов в этиологически значимых титрах профиль иммунных параметров немедленной эффекторной фазы микоцидного ответа ЛПК имел различия по содержанию цитокинов в экстраклеточной среде. При наличии бактериальных ассоциаций у больных при остром ВВК наблюдалось достоверное снижение уровня IFN-y и повышение уровня IL-IRa, а при хроническом ВВК с редкими и частыми рецидивами наблюдалось достоверное повышение уровней TNF-a и IFN-y, и снижение уровня IL-IRa по сравнению с имеющими кандидозную моноинфекцию.

Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований в данном направлении, а расширение спектра лабораторных иммунологических методов позволит оптимизировать диагностику хронических клинических форм вульвовагинального кандидоза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Самышкина, Наталья Евгеньевна, 2008 год

1. Анкирская, А.С. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища/ А.С. Анкирская, В.В. Муравьева // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. -Т.З, №2. — С.190-194.

2. Андреева, Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин / Ю.С. Андреева // Автореф. дисс. .канд. мед. наук. -Челябинск, 2005. 22с.

3. Белянин, В.Л. Нарушение неспецифического звена резистентности основа патогенеза кандидоза / В.Л. Белянин, Р.А. Аравийский // Успехи медицинской микологии. - М., 2004. - Т.4. - С.41-42.

4. Бурмистрова, А.Л. Вагинальный кандидоз и беременность / А.Л. Бурмистрова, Ю.С. Рамина, Н.Е. Самышкина, О.А. Заврина, А.В. Поспелова, Л.И. Бахарева // Успехи медицинской микологии. М., 2004. -Т.4. - С.157-159.

5. Бурмистрова, A.JI. Некоторые характеристики генитального кандидоза / A.JI. Бурмистрова, О.А. Заврина, Л.И. Бахарева, Н.Е. Самышкина, М.А. Попова, А.В. Поспелова // Успехи медицинской микологии. М., 2003. - Т.2. - С.20-22.

6. Бышевский, А.Ш. Биохимия для врача / А.Ш. Бышевский, О.А. Терсенов //Екатеринбург : Уральский рабочий, 1994. 384с.

7. Волкова, М.А. Современные возможности лечения фебрильной нейтропении / Волкова М.А., Птушкин В.В. // Русский медицинский журнал. 1998. - Т.6, №22. http://www.rmi.ru/articles 2343.htm (05.05.2008)

8. Гейро, О.А. Клинико-лабораторная характеристика генитального кандидоза у беременных женщин / О.А. Гейро // Проблемы медицинской микологии. 2006. - Т.8, №4. - С. 32-36.

9. Гланц, С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц // М. : Практика, 1998. 459с.

10. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин // Екатеринбург : УрО РАН, 2001. 284с.

11. Дуглас, С.Д. Исследование фагоцитоза в клинической практике: Пер. с англ. / С.Д. Дуглас, П.Г. Кун // М.: Медицина, 1983. 112с.

12. Егорова, Е.В. Грибковые и некоторые паразитарные заболевания женских половых органов / Е.В. Егорова, О.Б. Минскер // М. : Медицина, 1988.-224с.

13. Ермоленко, Е.И. Взаимодействие Candida albicans и Lactobacillus plantarum in vitro / Е.И. Ермоленко, C.X. Ждан-Пушкина, A.H. Суворов // Проблемы медицинской микологии. 2004. - Т.6, №2. - С. 49-54.

14. Иммунологические методы исследования: Учебное пособие / Под общей ред. проф. Е.А. Олейниковой, проф. Л.Я. Эберта // Саранск, 1981. -92 с.

15. Кира, Е.Ф. Бактериальный вагиноз / Е.Ф. Кира // СПб. : ООО «Нева-Люкс». 2001. - 364с.

16. Климко, Н.Н. Кандидемия у пациентов в стационарах Санкт-Петербурга / Н.Н. Климко, Т.С. Богомолова, З.К. Колб, А.В. Сатурнов, Т.Н. Перекатова, М.Б. Белогурова и др. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. — Т.4, №1. - С. 15-21.

17. Клиническая гинекология: Избранные лекции / Под ред. проф. В.Н. Прилепской // М.: МЕДпресс-информ. 2007. - 470с.

18. Колбин, А.С. Кандидоз у новорожденных с очень низкой массой тела при рождении / А.С. Колбин, Н.П. Шабалов, Н.Н. Климко // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2005. — Т.7, №2.-С. 189-196.

19. Лебедев, К.А. Иммунофизиология эпителиальных клеток и образраспознающие рецепторы / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина // Физиология человека. 2006. - Т.32, №2. - С. 114-126.

20. Липова, Е.В. Клинико-диагностическое обследование женщин на инфекции, передаваемые половым путем, с учетом анатомо-физиологических особенностей мочеполовой системы / Е.В. Липова // М., 2004.-56с.

21. Литвин, В.Ю. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий / В.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева, Ю.М. Романова, Б.В. Боев // М. : Фармарус-принт, 1997.-256с.

22. Мавзютов, А.Р. Бактериальный вагиноз: этиопатологические аспекты / А.Р. Мавзютов, К.Р. Бондаренко, В.М. Бондаренко // Журнал микробиологии. 2007. - №6. - С. 93-100.

23. Маянский, А.Н. Введение в медицинскую микологию: Учебно-методическое пособие / А.Н. Маянский, М.И. Заславская, Е.В. Салина // Нижний Новгород : НГМА, 2003. 51с.

24. Мирзабалаева А.К. Кандидозный вульвовагинит у беременных женщин: современные подходы к лечению / А.К. Мирзабалаева // Русский медицинский журнал. Гинекология. 2005. - Т.7, №4. - С.3-6.

25. Михайлов, А.В. Фармакотерапия вульвовагинального кандидоза с позиции фармакоэпидемиологии и доказательной терапии /А.В. Михайлов, О.В. Решетько, К.А. Луцевич // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2007. - Т.9, №1. - С.34-47.

26. Муравьева, В.В. Микробиологическая диагностика бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста / В.В. Муравьева // Автореф. дисс. .канд. мед. наук. -М., 1997. — 23с.

27. Назарова, Е.К. Микробиоценоз влагалища и его нарушения (этиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика) / Е.К. Назарова, Е.И. Гиммельфарб, Л.Г. Созаева // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - №2. - С.25-32.

28. Нестерова, И.В. Пептидная регуляция продукции интерлейкина-8 нейтрофильными гранулоцитами в эксперименте in vitro / И.В. Нестерова,

29. Е.Ю. Синельникова, И.Н. Швыдченко // Иммунология. 2006. - №5. - С. 274-278.

30. Платонов, А.Е. Бактерицидной действие нейтрофилов человека на менингококки in vitro / А.Е. Платонов, И.В. Вершинина, X. Кейти, К. Файен, Е. Кайпер // Журнал микробиологии. 1999. - №3. - С. 47-52.

31. Поспелова, А.В. Влияние грибов рода Candida на синтез 1L-10 иммунными клетками периферической крови человека in vitro / А.В. Поспелова, A.JI. Бурмистрова, Ю.С. Хомич, Н.Е. Самышкина // Успехи медицинской микологии. М., 2006. - Т.8. - С.53-55.

32. Прилепская, В.Н. Современные представления о вагинальном кандидозе / В.Н. Прилепская, Г.Р. Байрамова // Русский медицинский журнал. 1998. - Т.6, №5. - С. 301-308.

33. Рябичева, Т.Г. Определение цитокинов методом иммуноферментного анализа / Т.Г. Рябичева, Н.А. Вараксин, Н.В. Тимофеева, М.Ю. Рукавишников // Информационный бюллетень «Новости «Вектор-Бест»». 2004. - №4 (34). - С. 7-14.

34. Саидова, Р.А. Бактериальный вагинит или бактериальный вагиноз? / Р.А. Саидова // Русский медицинский журнал. 2001. - Т.9, №19. - С. 843847.

35. Саттон, Д. Определитель патогенных и условно-патогенных грибов: Пер. с англ. / Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди // М. : Мир, 2001.-486с.

36. Сергеев, А.Ю. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение / А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев // М. : Триада-Х. 2001. - 472с.

37. Сибиряк, С.В. Цитокиновая регуляция биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных соединений / С.В. Сибиряк, В.А. Черешнев, А.С. Симбирцев, Д.С. Сибиряк, Т.В. Гаврилова // Екатеринбург : УрО РАН, 2006.-163с.

38. Смолянская, А.З. Грибковая инфекция в онкологической клинике / А.З. Смолянская, Н.В. Дмитриева, Е.В. Кулага, И.Н. Петухова // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - №44 (4). - С.25-30.

39. Тихомиров, А.Л. Современное лечение кандидозного вульвовагинита / А.Л. Тихомиров, Ч.Г. Олейник // Русский медицинский журнал. 2001. - Т.9, №6. - С. 227-232.

40. Третьякова, И.Е. Состояние секреторной функции нейтрофилов в норме ив условиях гнойного раневого процесса / И.Е. Третьякова, И.И. Долгушин // Иммунология. 2004. - №5. - С. 260-263.

41. Швыдченко, И.Н. Цитокинсекретирующая функция нейтрофильных гранулоцитов / И.Н. Швыдченко, И.В. Нестерова, Е.Ю. Синельникова // Иммунология. 2005. - №1. - С. 31-34.

42. Ashman, R.B. Production and function of cytokines in natural and acquired immunity to Candida albicans infection / R.B. Ashman, J.M. Papadimitriou // Microbiological Reviews. 1995. - Vol.59, No.4. - P.646-672.

43. Al-Mohanna, F. IL-12-dependent nuclear factor-kB activation leads to de novo synthesis and release of IL-8 and TNF-a in human neutrophils / F. Al-Mohanna, S. Saleh, R.S. Parhar, K. Collison // J. Leukoc. Biol. 2002. - Vol.72. -P.995-1002.

44. Amsel, R. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations / R. Amsel, P.A. Totten, C.A. Spiegel, K. Chen, D. Eschenbach, К. K. Holmes // The American Journal of Medicine. — 1983. -Vol.74, No.l. P. 14-22.

45. Anding, K. Flow cytometric measurements of neutrophil functions: the dependence on the stimulus to cell ratio / K. Anding, J.M. Rost, E. Jacobs, F.D. Daschner // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2003. - Vol.35. -P.147-152.

46. Barousse, M.M. Vaginal yeast colonization, prevalence of vaginitis, and associated local immunity in adolescents / M.M. Barousse, B.J. Van Der Pol, D. Fortenberry, D. Orr, P.L. Fidel // Sex. Transm. Infect. 2004. - Vol.80. - P.48-53.

47. Brandt, E. IL-4 production by human polymorphonuclear neutrophils / E. Brandt, G. Woerly, A.B. Younes, S. Loiseau, M. Capron // J. Leukoc. Biol. -2000. Vol.68. - P.125-130.

48. Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria / V. Brinkmann, U. Reichard, Ch. Goosmann, B. Fauler, Y. Uhlemann, D.S. Weiss, Y. Weinrauch, A. Zychlinsky // Science. 2004. - Vol.303. - P.1532-1535.

49. Calderone, R.A. Virulence factors of Candida albicans / R.A. Calderone, W.A. Fonzi // TRENDS in Microbiology. 2001. - Vol.9, No.7. -P.327-335

50. Cannon, R.D. Oral Candida: clearance, colonization, or candidiasis? / R.D. Cannon, A.R. Holmes, A.B. Mason, B.C. Monk // Dent. Res. 1995. -Vol.74, No.5. - P.l 152-1161.

51. Cannon, R.D. Oral colonization by Candida albicans. / R.D. Cannon, W.L. Chaffin // Crit. Rev. Oral Biol. 1999. - Vol.10, No.3. - P.359-383.

52. Casadevall, A. Antibody immunity and invasive fungal infections / A. Cassadevall //Infection and Immunity. 1995. -Vol.63, No.l 1. - P.4211-4218.

53. Das, G. The source of early INF-y that plays a role in Thl priming / G. Das, S. Sheridan, C.A. Janeway // The Journal of Immunology. 2001. -Vol.167.-P. 2004-2010.

54. De Groot, P.W. Features and functions of covalently linked proteins in fungal cell walls / P.W. De Groot, A.F. Ram, F.M. Klis II Fungal. Genet. Biol. -2005. Vol.42, No.8. - P.657-675.

55. Ellis, T.N. Interferon-y activation of polymorphonuclear neutrophil function / T.N. Ellis, B.L. Beaman // Immunology. 2004. - Vol.112. - P.2-12.

56. Ellis, T.N. Murine polymorphonuclear neutrophils produce interferon-y in response to pulmonary infection with Nocardia asteroides / T.N. Ellis, B.L. Beaman // J. Leukoc. Biol. 2002. - Vol.72. - P.373-381.

57. Ethuin, F. Human neutrophils produce interferon gamma upon stimulation by interleukin-12 / F. Ethuin, B. Gerard, J.E. Benna, A. Boutten, M.-A. Gougerot-Pocidalo, L. Jacob, S. Chollet-Martin // Laboratory Investigation. -2004. Vol.84. - P.1363-1371.

58. Ethuin, F. Interleukin-12 increases interleukin-8 production and release by human polymorphonuclear neutrophils / F. Ethuin, Ch. Delarche, S. Benslama, M.-A. Gougerot-Pocidalo, L. Jacob, S. Chollet-Martin // J. Leukoc. Biol. 2001. - Vol.70.-P.439-446.

59. Fidel, P.L. Candida glabrata: review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C.albicans / P.L. Fidel, J.A. Vazquez, J.D. Sobel // Clinical Microbiology Reviews. 1999. - Vol.12, No.l. - P.80-96.

60. Fidel, P.L. Distinct protective host defenses against oral and vaginal candidiasis / P.L. Fidel // Med. Micol. 2002. - 40(4). - P.359-375.

61. Fidel, P.L. Immune regulation and its role in the pathogenesis of Candida vaginitis / P.L. Fidel // Curr. Infect. Dis. Rep. 2003. - 5(6). - P.488-493.

62. Fidel, P.L. The protective immune response against vaginal candididasis: lessons learned from clinical studies and animal models / P.L. Fidel // Int. Rev. Immunol. 2002. - 21(6). - P.515-548.

63. Flanagan, P.G. Fungal infection in the intensive care unit / P.G. Flanagan, R.A. Barnes // J. Hosp. Infect. 1998. - Vol.38, No.3. - P. 163-177.

64. Gow, N.A. Fungal morphogenesis and host invasion / N.A. Gow, A J. Brown, F.C. Odds // Curr. Opin. Microbiol. 2002. - Vol.5, No.4. - P.366-371.

65. Hazen, K.C. Influence of fluconazole at subinhibitory concentrations on cell surface hydrophobicity and phagocytosis of Candida albicans / K.C. Hazen, G. Mandell, E. Coleman, G. Wu // FEMS Microbiology Letters. 2000. -Vol.183. — P.89-94.

66. Hoyer, L.L. Identification of Candida albicans ALS2 and ALS4 and localization of ALS proteins to the fungal cell surface / L.L. Hoyer, T.L. Payne, J.E. Hecht //Journal of Bacteriology. 1998. - Vol.l 80, No.20. - P.5334-5343.

67. Hoyer, L.L. The ALS gene family of Candida albicans / L.L. Hoyer // TRENDS in Microbiology. 2001. - Vol.9, No.4. - P. 176-180.

68. Jabra-Risk, M.A. Cell surface hydrophobicity-associated adherence of Candida dubliniensis to human buccal epithelial cells / M.A. Jabra-Risk, W.A. Falkler, W.G. Merz, A. Baqui, J.I. Kelley, T.F. Meiller // Rev. Iberoam. Micol. -2001.-Vol.18.-P. 17-22.

69. Janssens, S. R Role of Toll-like receptors in pathogen recognation / S. Janssens, R. Beyaert // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - Vol.16, No.4. - P.637-646.

70. Klis, F.M. Molecular organization of the cell wall of Candida albicans / F.M. Klis, P. de Groot, K. Hellingwerf// Med. Mycol. 2001. - Vol.39, Suppl.l. -P.l-8.

71. Lehrer, R.I. Interaction of Candida albicans with human leukocytes and serum / R.I. Lehrer, M.J. Cline // J. Bacteriol. 1969. - Vol.98, No.3. - P.996-1004.

72. Lewandowski, D. Altered CD4+ T cell phenotype and function determine the susceptibility to mucosal candididasis in transgenic mice expressing HIV-1 / D. Lewandowski, M. Marquis, F. Aumont, A.-C. Lussier-Morin, M.

73. Raymond, S. Senechal, Z. Hanna, P. Jolicoeur, L. de Repentigny // The Journal of Immunology. 2006. - Vol.177. - P.479-491.

74. Mansour, M.K. Interactions of fungi with phagocytes / M.K. Mansour, S.M. Levitz // Curr. Opin. Microbiol. 2002. - Vol.5, No.4. - P.359-365.

75. Mayer-Scholl, A. How neutrophils and pathogens interact? / A. Mayer-Scholl, P. Averhoff, A. Zychlinsky // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - Vol.7. -P.62-66.

76. Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis / D. Money // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 2005. - 16 (2). - P.77-79.

77. Nathan, C. Neutrophil activation on biological surfaces / C. Nathan // J. Clin. Invest. 1987. - Vol.80. - P. 1550-1560.

78. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities / C. Nathan // Nature Reviews Immunology. 2006. - Vol.6. - P.173-182.

79. Nawrot, U. Study of cell-mediated immune response in recurrent vulvovaginal candididasis / U. Nawrot, K. Grzybek-Hryncewicz, U. Zielska, A. Czarny, J. Podwinska // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2000.- Vol.29.-P.89-94.

80. Netea, M.G. Toll-like receptor 2 suppresses immunity against Candida albicans through induction of IL-10 and regulatory T cells / M.G. Netea, R. Sutmuller, C. Hermann, C.A. Van Der Graaf, J.W. Van Der Meer, J.H. van

81. Krieken, Т. Hartung, G. Adema, В J. Kullberg // J. Immunol. 2004. - Vol.172, No.6. - P.3712-3718.

82. Nugent, R.P. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of Gram stain interpretation / R.P. Nugent, M.A. Krohn, S.L. Hillier // Journal of Clinical Microbiology. 1991. - Vol.29, No.2. -P.297-301.

83. Pricop, L. Redox regulation of Fcgamma receptor-mediate phagocytosis: implications for host defense and tissue injury / L. Pricop, J.E. Salmon // Antioxid. Redox. Signal. 2002. - Vol.4, No.l. - P. 85-95.

84. Ramage, G. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans / G. Ramage, K.V. Walle, B.L. Wickes, J.L. Lopez-Ribot // Rev. Iberoam. Micol. -2001.-Vol.18.-P.163-170.

85. Romani, L. Fungi, dendritic cells and receptors: a host perspective of fungal virulence / L. Romani, F. Bistoni, P. Puccetti // TRENDS in Microbiology. 2002. - Vol.10, No.l 1. - P.508-514.

86. Romani, L. Immunity to fungal infections / L. Romani // Nature Reviews. 2004. - Vol.5. - P.l-13.

87. Romany, L. Innate and adaptive immunity in Candida albicans infections and saprophytism / L. Romany // J. Leukoc. Biol. 2000. - Vol.68. -P.175-179.

88. Sobel, J.D. Pathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis / J.D. Sobel // Curr. Infect. Dis. Rep. 2002. - 4 (6). - P.514-519.

89. Sobel, J.D. Vulvovaginal candidiasis: epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations / J.D. Sobel, S. Faro, R.W. Force, B. Foxman, W.J. Ledger, P.R. Nyirjesy, B.D. Reed, P.R. Summers // Am. J. Obstet. Gynecol. -1998. 178 (2). -P.557-558.

90. Sturtevant, J. Candida albicans adhesins: biochemical aspects and virulence / J. Sturtevant, R. Calderone // Rev. Iberoam. Micol. 1997. - Vol.14. -P.90-97.

91. Sullivan, D. Candida dubliniensis: characteristics and identification / D. Sullivan, D. Coleman // Journal of Clinical Microbiology. 1998. - Vol.36, No.2. -P.329-334.

92. Teloni, G. Arancia, A. Cassone, R. Nisini // Infection and Immunity. 2004. -Vol.72, No.2.-P.833-843.

93. Tuite, A. Genetic analysis of innate immunity in resistance to Candida albicans / A. Tuite, A. Mullick, P.Gros // Genes and Immunity. 2004. - Vol.5. -P.576-587.

94. Urban, C.F. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms / C.F. Urban, U. Reichard, V. Brinkmann, A. Zychlinsky // Cellular Microbiology. 2006. - Vol.8, No.4. - P.668-676.

95. Vasselon, T. Toll Receptors: a central element in innate immune responses / T. Vasselon, P.A. Detmers // Infection and Immunity. 2002. -Vol.70, No.3. -P.1033-1041.

96. Vazquez-Torres, A. Macrophages in resistance to candididasis / A. Vazquez-Torres, E. Balish // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - Vol.61, No.2. -P. 170-192.

97. Verstrepen, K.J. Origins of variation in the fungal cell surface / K.J. Verstrepen, T.B. Reynolds, G.R. Fink // Reviews. 2004. - Vol.2. - P.533-540.

98. Vidotto, V. Adherence of Candida albicans and Candida dubliniensis to buccal and vaginal cells / V. Vidotto, B. Mantoan, A. Pugliese, J. Ponton, G. Quindos, S. Aoki, S. Ito-Kuwa // Rev. Iberoam. Micol. 2003. - Vol.20. - P.52-54.

99. Villamon, E. Toll-like receptor 2 is essential in murine defenses against Candida albicans infections / E. Villamon, D. Gozalbo, P. Roig, J.E. O'Connor, D. Fradelizi, M.L. Gil // Microbes and Infection. 2004. - Vol.6, No.l. - P. 1-7.

100. Watari, M. Lipopolysaccharide induces interleukin-8 productions by human cervical smooth muscle cells / M. Watari, H. Watari, T. Fujimoto, H.

101. Yamada, J. Nishihira, J. Strauss, S. Fujimoto // Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 2003. - Vol.10, No.2. - P. 110-117.

102. Whiteway, M. Candida morphogenesis and host-pathogen interactions / M. Whiteway, U. Oberholzer // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - Vol.7, No.4. -P.350-357.

103. Whiteway, M. Transcriptional control of cell type and morphogenesis in Candida albicans / M. Whiteway // Curr. Opin. Microbiol. 2000. - Vol.3, No.6. -P.582-588.

104. Wira, C.R. Innate and adaptive immunity female genital tract: cellular responses and interactions / C.R. Wira, J.V. Fahey, C.L. Sentman, P.A. Pioli, L. Shen // Immunological Reviews. 2005. - Vol.206. - P.306-334.

105. Wira, C.R. The innate immune system: gatekeeper to the female reproductive tract / C.R. Wira, J.V. Fahey // Immunology. 2004. - Vol.111. — P.13-15.

106. Zhao, T. The molecular basis for adhesion-mediated suppression of reactive oxygen species generation by human neutrophils / T. Zhao, V. Benard, B.P. Bohl, G.M. Bokoch // J. Clin. Invest. 2003. - Vol.112. - P.l732-1740.