Новые подходы к оценке функциональной активности лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Бахус, Галина Олеговна

• Бахус, Галина Олеговна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бахус, Галина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Проточная цитометрия - современный инструмент лабораторных методов исследования.

1.1.1 История создания клеточных анализаторов.

1.1 ,2.Принципы работы проточного цитомепра.

1.1.3. Современные технологии, связанные с развитием проточной цитометрии.

1.2. Методы оценки цитотоксической активности лимфоцитов.

1.2.1. Виды цитотоксической активности лимфоцитов и подходы к ее измерению.

1.2.2. Традиционные методы оценки клеточной цитотоксичности, их характеристика.

1.2.3. Витальные флюоресцентные красители для проточной цитометрии.

1.2.4. Эволюция принципов оценки клеточной цитотоксичности с помощью проточной цитофлюориметрии.

1.3. Методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов

1.3.1. Обычные методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов.

1.3.2. CFSE - новый подход к оценке клеточной пролиферации с помощью проточной цитометрии.

1.3.2.1. Анализ двухкратного разведения CFSE - показателя деления клеток.

1.3.2.2. Изучение взаимосвязи пролиферации и дифференцировки лимфоцитов in vitro с помощью CFSE-разведений.

1.3.2.3. CFSE в изучении миграции и пролиферации лимфоцитов in vivo.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Характеристика обследованных групп населения.4S

2.2 Реактивы и расходные материалы.

2.3. Растворы.

2.4. Стандартное оборудование.

2.5. Проточный цитофлюориметр, его характеристики и настройка.

2.6. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Разработка метода оценки функциональной активности NK-клеток периферической крови с использованием проточной цитофлюорометрии.

3.1.1. Выбор флюоресцентного красителя и мечение клеток-мишеней для оценки их киллинга NKклетками.

3.1.2. Отработка постановки цитотоксической реакции NK-клеток.

3.1.3. Двухцветный анализ функциональной активности NK-клеток на проточном цетгофлюориметре.

3.1.4. Корреляционный анализ цитометрическогои радиоактивного методов оценки функциональной активности NK-клеток.

3.1.5. Применение цитометрического метода анализа функциональной активности NK-клеток для изучения влияния на NK-активность введения препарата «Аллоферон».

3.1.6. Применение цитометрического метода анализа функциональной активности NK-клеток для изучения NK-активности у больных ВИЧ-инфекцией, и больного с синдромом Чедиака-Хигаси.

3.2. Разработка метода оценки функциональной активности лимфоцитов периферической крови с использованием проточной лазерной цитометрии.

3.2.1. Выбор флюоресцентного красителя и мечение лимфоцитов для оценки их бласттрансформации и пролиферации.

3.2.2. Отработка постановки реакции бласттрансформации и анализ её на проточном цитометре.

3.2.3. Корреляция между цитометрическим и радиоактивным методами оценки бласттрансформации лимфоцитов.

3.2.4. Изучение влияния циклоспорина А на функциональную активность лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии.

3.2.5. Применение цитометрического метода для оценки функциональной активности лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые подходы к оценке функциональной активности лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии»

Актуальность темы диссертации.

Одной из важнейших задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса. Она включает в себя следующий комплекс основных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипирование лимфоцитов, функциональнальная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса. [12]. Оценка функциональной активности лимфоцитов имеет важное значение, так как часто при многих заболеваниях и вторичных иммунодефицитах наблюдается нормальное количественное содержание этих клеток, но их функции зачастую угнетены /увеличены/ в значительной степени, и это может являться определяющим звеном в патогенезе того или иного заболевания. Комплекс оценки функциональной активности лимфоцитов включает в себя измерение цитотоксической активности NK-клеток, пролиферативный ответ лимфоцитов на Т- и В-митогены, определение Thl и Th2 клеток, определение количества синтезируемых цитокинов мононуклеарами периферической крови, апоптоз лимфоцитов при специфической и неспецифической стимуляции. Изменения функциональной активности лимфоцитов происходят при следующих состояниях:

-первичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета

-вторичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (ВИЧ-инфекция, острые и хронические вирусные инфекции, злокачественные заболевания и др.)

-физиологических иммунодефицитах, например, при старении, когда ослабление иммунитета затрагивает реакции, обусловленные Т-клетками, что служит одной из причин повышения частоты опухолей в старости -аутоиммунных заболеваниях.

Как правило, эти изменения, не являются основной причиной заболевания, но их анализ представляет определенный интерес для клинической иммунологии, так как позволяет оценить эффективность проводимого лечения и прогнозировать течение заболевания.

Функциональную активность лимфоцитов оценивают как их способность к пролиферации и бласттрансформации под влиянием митогенов. В России, результаты пролиферативного ответа лимфоцитов до последнего времени оценивались чаще всего с помощью микроскопического метода (морфологическая идентификация и подсчет процента бластов), либо с помощью включения радиоактивной метки (чаще всего это предшественник ДНК, 0-излучатель 3Н-тимидин[2]), либо с помощью МТТ-теста, основанного на изменении цвета связывающегося с клетками красителя 3-[4,5 диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил 2-тетразолия из синего в желтый. Функциональную активность естественных (натуральных) киллерных клеток (NK) чаще всего оценивали так же в радиоактивных цитотоксических тестах, используя в качестве мишеней меченые 3Н-уридином или 51 Сг клетки культуры опухолевых миелобластов К-562, полученной из плеврального выпота больных хроническим эритромиелолейкозом. NK-клетки лизируют клетки- мишени, и К-562 выделяют в среду культивирования радионуклид. По количеству высвободившейся из мишеней радиоактивной метки и определяют NK-активность (процент NK-активности). Эти традиционные методики имеют ряд недостатков, в случае микроскопического метода - это высокая субъективность оценки результата, в случае радиоактивных методов -использование радиоактивного излучателя. Кроме того, классические радиоактивные тесты дают лишь косвенные данные о наличии (отсутствии) ответа.

С появлением проточной лазерной цитометрии (ТОЩ) более 20-ти лет назад значительно расширились возможности изучения всех показателей иммунного статуса. Методы изучения клеточного звена иммунной системы 8 с помощью проточной цитометрии имеют ряд неоценимых приемуществ: объективность, высокая скорость и точность анализа, простота постановки реакции, быстрое получение результата, безопасность. Существующие методы оценки функциональной активности лимфоцитов с использованием ПЛЦ обобщены в ряде обзоров (разделы 1.3.1-1.3.2)

В связи с этим целью работы явилась разработка цитометрических методов оценки цитотоксической акти »*'ости NK-клеток и пролиферативной активности лимфоцитов крови человека, пригодных для рутинных исследований в клинической лаборатории. Для проверки эффективности разработанных методов с перспективой их дальнейшего внедрения в лабораторную практику мы использовали три подхода: во-первых, сравнение новых методик с хорошо себя зарекомендовавшими старыми методами во-вторых, применение новых методик для детекции изменений функций лимфоцитов под воздействием иммунотропных веществ в-третьих, определение с помощью разработанных методов нарушения функциональной активности лимфоцитов у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

Задачи исследования.

1. Разработать микрометод оценки цитотоксической активности NK-клеток с использованием проточной лазерной цитометрии.

2. Разработать метод оценки функциональной активности лимфоцитов -их способности к бласттрансформации и пролиферации под влиянием Т-клеточного митогена с использованием проточной лазерной цитометрии.

3. Провести корреляционный анализ между цитометрическими и классическими методами определения функциональной активности лимфоцитов.

4. Показать возможность изучения функциональной активности лимфоцитов с помощью цитометрической методики для оценки действия иммунотропных лекарственных препаратов на клетки иммунной системы.

S. Апробировать разработанные методики на больных с нарушениями этого звена иммунной системы.

Научная новизна.

Впервые разработана оригинальная методика, позволяющая оценивать цитотоксическую активность NK клеток периферической крови человека, которые лидируют клетки-мишени, с использованием проточной лазерной цитометрии Основой для определения убитых в ходе реакции клеток К-562 явилось двойное флюоресцентное окрашивание. Окрашенные карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром (КФСЭ) мишени (К-562) смешиваются с клетками-эффекторами (мононуклеарами периферической крови - МПК) и инкубируются несколько часов. Затем пробы окрашиваются йодистым пропидием (PI). Среди всех вовлеченных в реакцию клеток мишени определяют как включившие в себя КФСЭ (зеленое свеченге), а убитые киллерами среди них, включившие в себя как КФСЭ, так и PI (красно-зеленое свечение). По количеству убитых в ходе реакции мишеней и определяется цитотоксическая активность образца. Показана высокая степень корреляции нового метода с классическим радиоактивным тестом (коэффициент корреляции составил 0,75 при г<0,05).

С помощью цитометрического метода установлено влияние на цитотоксическую активность МПК здоровых доноров Аллоферона -химически чистого олигопептида из 13 L-аминокислот с цитокиноподобной активностью, в частности то, что он вызывает достоверное повышение цитотоксической активности NK-клеток здоровых доноров на 7 сутки после введения.

Эффективность разработанной методики подтверждает её клиническая значимость: достоверное снижение функций NK-клеток у обследованных больных ВИЧ-инфекцией и у ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси.

Впервые модифицирован и адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их бласттрансформации и пролиферации с помощью проточной лазерной цитометрии. Сущность измерения пролиферативной активности заключается в том, что окрашенные КФСЭ клетки делятся под влиянием митогена, и из одной клетки с большей исходной интенсивностью свечения образуются две клетки, интенсивность свечения каждой из которых примерно в два раза ниже исходной, и так далее. С помощью цитометрического метода можно наглядно проследить за судьбой почти всех клеток, определить до 8 митозов в реакции и тем самым более тонко определить функциональное состояние лимфоцитарной системы. Предложены три параметра измерения активности вместо одного в радиоактивном методе, процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления Новая методика имеет высокую степень корреляции с радиоактивным методом. Коэффиценты корреляции по всем трем параметрам были высокими (0,72,0,75 и 0,73)при р<0,05.

С помощью цитометрической методики установлено значительное угнетение как бласттрансформации, так и дальнейшей пролиферации лимфоцитов здоровых доноров под влиянием циклоспорина А - ингибитора синтеза ИЛ2. Цитометрический метод позволил более детально изучить влияние этого иммуносупрессора на поведение лимфоцитов: установлено, что его влияние является дозозависимым.

При помощи разработанной методики подтверждено достоверное снижение функций лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией - их способности отвечать активацией и пролиферацией на поликлональный Т-митоген-фитогемагглютинин.

Практическая значимость работы.

Методы оценки функциональной активности лимфоцитов разработаны в микроварианте, подтверждены классическими радиоактивными методами, набраны нормативные показатели, поэтому их можно использовать в рутинных исследованиях в любой иммунологической лаборатории при наличии проточного цитометра. Разработанные методики включены в методическое пособие для врачей-лаборантов «Применение лазерной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека».

Основные положения, выносимые на защиту.

Двойная метка (КФСЭ/PI) для клеток-мишеней К-562 является оптимальной в щггометрической методике оценки функциональной активности NK-клеток - их способности убивать мишени в 4-х часовом цитопгоксическом тесте.

Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром клеток линии К-562 позволяет более точно, быстро и эффективно оценивать цитотоксическую активность NK-клеток, фиксировать эффекты влияния иммунотропных веществ на изучаемый параметр и исследовать NK-активность при различных патологиях с нарушениями данного звена.

Использование меченых 5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром мононуклеаров периферической крови позволяет точно и эффективно исследовать их способность отвечать бласттрансформацией и пролиферацией на митоген. Применение проточной лазерной цитометрии позволяет всесторонне оценивать, во-первых, степень влияния различных иммунотропных веществ на функциональную активность лимфоцитов, во-вторых, изучать более тонкие механизмы функционирования лимфоцитов при различных иммунопатологиях.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Бахус, Галина Олеговна

выводы.

1. Разработан метод оценки функциональной активности NK-клеток, основанный на двойном флюоресцентном окрашивании (карбоксифлюоресцеин-пропидиума иодид). Метод высоко коррелирует с радиометрическим классическим тестом с включением ДНК-предшественника Н-уридина (г=0,75).

2. Показана высокая эффективность цитометрического метода как для оценки влияния иммунотропных препаратов на функциональную активность NK клеток, тал и для оценки иммунного статуса у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

3. Апробирован и модифицирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов, основанный на двойном разведении карбоксифлюоресцеина при каждом клеточном делении. Предложены три параметра измерения активности: процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления. Метод высоко коррелирует с радиометрическим классическим тестом.

4. Показана эффеетивносгь применения цитометрической методики для детального изучения воздействия на пролиферацию лимфоцитов циклоспорина А - ингибитора активности Т-клеток: продемонстрировано, что данный иммуносупрессор угнетает процент бласттрансформации, митотическую активность бластов и индекс деления лимфоцитов здоровых доноров, и его влияние является дозозависимым.

5. На модели ВИЧ-больных показана высокая информативность по сравнению с радиометрическим тестом цитометрического метода оценки бласттрансформации и пролиферации лимфоцитов, позволяющего получить более подробную информацию о состоянии данного звена иммунитета.

Заключение

Адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов - их способности к бластгрансформации и пролиферации в ответ на поликлональный Т-митоген - ФГА с помощью проточной цитометрии. Метод основан на уменьшении флуоресценции окрашенных карбоксифлюоресцеином клеток при делении, когда из одной клетки с исходной большой интенсивностью свечения образуются две клетки, интенсивность каждой из которых примерно в два раза меньше.

Цитометрической методика достоверно коррелирует с классическим радиометрическим тестом на включение 3Н-тимидин-1. Набраны показатели для контрольной группы доноров. Определены оптимальное время реакции и концентрация митогена. При помощи разработанной методики продемонстрирована её клиническая и диагностическая значимость: достоверное снижение способности лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией отвечать активацией на ФГА. Функциональная активность лимфоцитов по

83 данным реакции РБТЛ с ФГА при нормальном количественном содержании Т-хелперов достоверно коррелирует со степенью тяжести заболевания и поэтому может быть использована как прогностический маркер СПИДа, в частности, низкий ответ лимфоцитов на ФГА подтверждаяет прогрессирование течения инфекции.

Цитометрический метод зафиксировал значительное снижение ответа лимфоцитов при воздействии агента, блокирующего образование ИЛ 2 -циклоспорина А.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бахус, Галина Олеговна, 2002 год

1. Арцимович Н. Г. Галушина Т. С. Естественные киллеры и их гипотетическая роль в патогенезе синдрома хронической усталости. // Иммунология -№ 6 -2001 с. 4-6.

2. Иммунологические методы под. ред. Г. Фримеля -М - Медицина -с. 294-302.

3. Леви Д. А. Вирус иммунодефицита человека. Патогенез инфекции и возможности контроля. Иммунология. 1990, 4, 14-20.

4. Лимфоциты. Методы. Под ред. Дж. Клауса.-М.-Мир-1990 с.299-303.

5. Кулаков В. В. Дис. . докт. мед. наук. М., 1998

6. Кулаков В. В., Воробьёва Н. В., Пинегин Б. В. // Иммунология -1995,- № 4.-С. 31-34.

7. Кулаков В. В., Пинегин Б. В. // Иммунология.-1995 № 5.-С. 44- 46.

8. Пальцев М. А., Иванов А. А. Межклеточные взаимодействия М -Медицина - 1995 - с.92-97.

9. Ройт А., Бростофф Д., Дейл Д. Иммунология -М.-Мир с.179-181.

10. Саидов М.З., Пинегин Б.В. // Лабораторное дело 1991 - №3 - с. 5660.

11. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии // Иммунология 2001 - с.4-6.

12. Хаитов РМ, Игнатьева ГА. СПИД. М. Изд. «Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей». 1992.

13. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология М - ВНИРО - 1995.

14. Ярилин А. А. Основы иммунологии -М -Медицина 1999 -с.136-144.

15. Angulo R., Fulcher DA. Measurement of Candida- Specific Blastogenesis: Comparison of Carboxyfluorescein Succinimidyl Es;er Labelling of T Cells, Thymidine Incorporation and CD69 Expression // Cytometry 1998 - 34 - p. 143-151.

16. Biseili R. et al. Multiparametric flow cytometric analysis of the kinetics of surface molecule expression after polyclonal activation of human peripheral blood T lymphocytes. // Scand. J. Immunol. 1992 -35 - p.439-447.

17. Bloom B. R. Et al. Dissotiation of MIF production and cell proliferetion // J. Immunol. 1972 - 109 - p. 1395-1398.

18. Boutonnat J. et al. PKH26 probe in the study of the proliferation of chemoresistant leukemic sublines. //Anticancer Res. 1998 - 18 -p.4243-4251.

19. Brooks A G. et al. Natural killer cell recognition of HLA class I molecules // Rev Immunogenet 2000 - 2(3) - p.433-448.

20. Chang L. et al. Rapid flow cytometric assay for the assessment of natural killer cell activity // J Immunol Methods 1993 - 166 - p.45.

21. Cook E.B. et al. Simultaneous measurement of six cytokines in a single sample of human tears using microparticle-based flow cytometry allergies vs. non-allergics // Journal of Immunological Methods 2001 -254 - pl09-l 18.

22. Crouch S. et al. The use of ATP bioluminescence as a measure of proliferation and cytotoxicity // J Immunol Methods 1993 - 160 - p.81-88.

23. Deenick E.K. et al. Switching to IgG3, IgG2b and IgA is division-linked and independent revealing a stochastic framework for dascribing differentiation // J Immunol. in press.

24. Fazekas de St Groth B. et al. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester and the virgin lymphocyte: A marriage made in heaven // Immunology and Cell Biology 1999 - 77 - p.530-538.

25. Flieger D. et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells // J Immunol Methods 1995 - 180 - p. 1.

26. Fulcher D.A., Wong S.W.J. Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assesment of T cell function in the diagnostic laboratory // Immunology and Cell Biology 1999 - 77 - p.559-564.

27. Fulton R.J. et al. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system // Clin Chem 1997 - 43 - p. 1749-1756.

28. Geha R. S., et al. Responses of human thymus-derived (T) and non-thymus-derived (B) lymphocytes to mitogenic stimulation // Nature -1972-240-p. 198-200.

29. Gett A.V., Hodgkin P.D. Cell division regulates the T cell cytokine repertoire revealing a mechanism underlying immune class regulation // Proct Nat Acad Sci USA 1998 - 95 - p.9488-9493.

30. Hasbold J. et al. Quantitative analysis of lymphocyte differentiation and proliferation in vitro using carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester 11 Immunology and Cell Biology 1999 - 77 - p.516-522.

31. Hasbold J., Hong JS-Y et al. Integrating signals from INF-y and DL-4 by B-cells: Positive and negative effects on CD40 ligand-inducedproliferation, survival and division-linked isotype switching to IgGl, IgE and IgG2a // J Immunol in press.

32. Hasbold J., Lyons A.B. et al. Cell division number regulates IgGl and IgE switching of В cells following stimulation by CD40 ligand and IL-4 // Eur J Immunol 1998 - 28 - p. 1040-1051.

33. Hatam L. et al. Flow cytometric analysis of natural killer cell function as a clinical assay // Cytometry 1994 - 16 - p.59.

34. Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sixth Edition - Molecular Probes - 1996 - p. 491.

35. Hodgkin P.D., Lee J-H., Lyons A.B. B-cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number // J. Exp. Med. 1996 -184 - p.277-281.

36. Hoffmann B, Lindhart BO, Gerstoff J et al. Lymphocyte transformation response to pokeweed mitogen as predictive marker for the development AIDS and AIDS related symptom in homosexual men with HIV antibodies. // Br.Med.J. 1987, 295, 293-297.

37. Hoffmann B, Jakobsen KD, Odum N et al. HIV-induced immunodeficiency. //J.Immunol. 1989, 143, 1874-1880.

38. Honig M.G., Hume R.I. Dil and DiO: versatile fluorescent days for neuronal labeling and pathway tracing // Trends Neurosci 1989 - 12 -p.333-341.

39. Jaroszeski M. J., Radcliff G. Fundamentals of Flow Cytometry // Molecular Biotechnology 1999 - 11 - p.37-53.

40. Jewettt A., Bonavida B. Target-induced inactivation and cell death by apoptosis in a subset of human NK cells // J Immunol 1996 - 156 -p.907.

41. Johann S. et al. A versatile flow cytometry-based assay for the determination of short- and long-term natural killer cell activity // J Immunol Methods 1995 - 185 - p.209.

42. Kashii Y. Et al. Constitutive exspression and role of the TNF family ligands in apoptotic killing of tumor cells by human NK cells // J Immunol. 1999 - 163 - p.5358.

43. Keast D., Bartholomaeus W. N. A micromethod for stimulation of lymphocytes by PHA // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1972 - 50 -p.603-609.

44. Kimberley M.G. et al. A fluorescence NK assay using flow cytometry // J Immunol Methods 1986 - 86 - p.7.

45. King M.A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry // Journal of Immunological Methods 2000 - 243 -p. 155-166.

46. King M.A. et al. Flow cytomrtric analysis of cell killing by the jumper and venom peptide pilosulin I // Cytometry 1998 - 32 - p.268.

47. Lazda V., Baram P.,/Participation of different cell populations in antigen-and mitogen induced lymphocyte proliferation // J. of Imminology.-1974.-Vol. 112.-Р,- 1705-1717.

48. Lecoeur H. et al. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparamertic characterization of cell-mediated cytotoxicity // Journal of Immunological Methods 2001 - 253 - p.177-187.

49. Lees J.E., Hales J.M. Imaging and quantitative analysis of tritium-labelled cells in lymphocyte proliferation assays using microchannel plate detectors originally developed for X-ray astronomy // Journal of Immunological Methods 2001 - 247 - p. 95-102.

50. Lyons A.B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution // Journal of Immunological Methods 2000 - 243 - p. 147-154.

51. Lyons A.B. Divided we stand: Tracking cell proliferation with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester // Immunology and Cell Biology 1999 - 77 - p.509-515.

52. Lyons A.B., Parish C.R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry // Journal of Immunological Methods 1994 - 171 - p. 131137.

53. Maecker H.T. et al. Use of overlapping peptide mixtures as antigens for cytokine flow cytometry // Journal of Immunological Methods 2001 -255 - p.27-40.

54. Mattis A. et al. Analyzing cytotoxic T lymphocyte activity: a simple and reliable flow cytometry-based assay // Journal of Immunological Methods 1997 - 204 - p. 135-142.

55. McGinnes К. Et al. A fluorescence NK assay using flow cytometry // J Immunol Methods 1986 - 86 - p. 7.

56. Mintern J. et al. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester to determine the site, duration and cell type responsible for antigen presentation in vivo // Immunology and Cell Biology 1999 - 77 -p.539-543.

57. Noguchi P., Johnson J. В., at al.,/Measurement of DNA synthesis by flow cytometry/ Cytometry.-1981.-Vol. 1.-P.-390.

58. Nordon R E. et al. Analysis of growth kinetics by division tracking // Immunology and Cell Biology 1999 - 77 - p.523-529.

59. O'Brien J et al. Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity // Eur J Biochem -2000-267-p.5421-5426.

60. O'Callaghan C.A. Molecular basis of human natural killer cell recognition of HLA-E (human leucocyte antigen-E) and its relevance to clearance of pathogen-infected and tumor cells // Clin Sci (Colch) 2000 -Jul 99(1) - p.9-17.

61. Papa S. et al. Natural killer function in flow cytometry. Evaluation of NK lytic activity on K562 cell line // Journal of Immunological Methods -1988- 107-p. 73-78.

62. Papadopoulos N.G. et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotxicity using flow cytometry // J Immunol Methods 1994 - 177 - plOl.

63. Parish C.R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies // Immunology and Cell Biology 1999 - 77 - p.499-508.

64. Scharton T.M., Sher A. Role of natural killer cells in innate resistance to protozoan infections // Curr Opin in Immunol 1997 - 9 -p.44-51.

65. Shapiro H.M. Practical Flow Cytometry Third Edition - New York -Wiley Liss - 1995 - p.316-317, 317-319, 345-347.

66. Slezak S.E., Horan P.K. Cell-mediated cytotoxicity. A highly sensitive and informative flow cytometric assay // J Immunol Methods 1989 -117 - p.205.

67. Stater K. Cytotoxicity tests for high-throughput drug discovery // Curr Opin in Biotechnology 2001 - 12 - p. 70-74.

68. Sultzer B. et al. PPD Tuberculin: a B-cell mitogen // Nature -1972 240 -p. 198-200.

69. Taga K. Et al. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells // Blood 1996 - 87 - p.2411.

70. Taylor M. et al. Problems encoutered in the preparetion of MIF and mitogenic factor (MIT) from PHA-stimuleted human peripheral lymphocytes //Cell Immunol. 1975 - 19 - p. 41-47.

71. Thiel A. et al. Immunomagnetic cell sorting pushing the limits // Immunotechology 1998 - 4 - p.89-96.

72. Tobery T.W. et al. A simple and efficient method for the monitoring of antigen-specific T cell responses using peptide pool arrays in a modified ELISpot assay // Journal of Immunological Methods 2001- 254 - p. 5966.

73. Vales-Gomez M. et al. Interaction between the human NK receptors and their ligands // Crit Rev Immunol 2000 - 20(3) - p.223-244.

74. Vujanovic N.L. et al. Non-secretory apoptotic killing by human NK cells // J Immunol. 1996 - 157 - p. 1117.

75. Wahlberg B.J. et al. Measurement of NK activity by the microcytotoxicity assay (MCA): a new application for an old assay // Journal of Immunological Methods 2001 - 253 - p.69-81,

76. Warren H.S. Using carboxyfluorescein diacetate succimidyl ester to monitor human NK cell division: Analysis of the effect of activating and ingibitory class I MHC receptor // Immunology and Cell Biology 1999 - 77 -p.544-551.

77. Watson J.V. The Early Fluidic and Optical Physics of Cytometry // Cytometry 1999 - 38 - p.2-14.

78. Wedemeyer N., Potter T. Flow cytometry: an "old" tool for novel application in medical genetics // Clin Genet 2001 - 60 - p. 1-8.

79. Weston S.A., Parish C.R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy// Journal of Immunological Methods 1990 - 133 - p.87-97.

80. Wodnicka M. et al. Novel fluorescent technology platform for high throughput cytotoxicity and proliferation assays // J Biomol Screening -2000-5-p. 141-152.

81. Zarcone D. Et al. Flow cytometry evaluation of cell mediated cytotoxicity // J Immunol Methods 1986 - 94- p. 73.