Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат химических наук Андреева, Ольга Игоревна

• Андреева, Ольга Игоревна
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Андреева, Ольга Игоревна

Список сокращений.

Введение.

I. ДНК- и РНК-полимеразы: структурно-функциональное разнообразие и единый каталитический механизм (литературный обзор).

1.1. Пространственная структура односубъединичных нуклсотид-полимсраз.

1.2. Структура активного центра и связывание субстратов.

1.2.1. Структурные мотивы.

1.2.2. Связывание матрицы/праймсра.

1.2.3. Связывание нуклеозидтрифосфатов.

1.3. Катализ полимеразной реакции.

1.3.1. Ионы металла в активном центре полимеразы.

1.3.2. Конформационные изменения полимераз при связывании субстратов.

1.3.3. Процессивность полимераз.:

II. Материалы и методы.

11.1. Материалы.

11.1.1. Ферменты.

11.1.2. Реактивы.

П.1.2.Нуклеозиды, нуклеотиды и их производные.

11.1.4. Среды для культивирования клеток E.coli.

11.1.5. Плазмиды, использованные в работе.

11.2. Методы.

11.2.1. Выделение и очистка Т7 РНКП и ее мутаитной формы

Tyr639Phe, Scr641 Ala Т7 РНКП).

11.2.2. Выделение обратной транскритазы ВИЧ-1 и ее мутантных форм.

11.2.3. Электрофорез белков.

11.2.4. Препаративное выделение плазмидной ДНК.

11.2.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

11.2.6. Транскрипция in vitro. Получение смешанных полинуклеотидов.

11.2.7. Электрофорез образцов нуклеиновых кислот в ПЛАТ.

11.2.8. Электрофорез образцов в агарозном геле. Элюция из геля.

11.2.9. Определение эффективности полимеразной реакции.

11.2.10. РНК/РНК-полимеразная реакция, катализируемая формы

Tyr639Phc, Ser641Ala Т7 РНКП.

11.2.11. Реакция обратной транскрипции.

11.2.12. Получение [иР]-мечсных ДНК и олигонуклеотидов.

11.2.13. Секвенирование РНК и СПН.

11.2.14. Получение активированной ДНК.

11.2.15. Определение констант ингибирования аналогами пирофосфата и нуклеотидов.

11.2.16. Включение модифицированных rNTP в РНК-продукт реакции

Т7 РНКП.

II.3. Построение пространственных моделей.

11.3.1. Моделирование связывания модифицированных праймеров в активном центре ОТ.

11.3.2. Моделирование связывания аналогов в активном центре Т7 РНКП.

III. Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскиптазой ВИЧ-1. (обсуждение результатов)

111.1. Синтез смешанных рибо/дезоксирибополинуклсотидов мугантной формой Т7 РНКП.

111.2. Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1.

111.3. Исследование взаимодействия ОТ ВИЧ-1 с модифицированными праймерами, содержащими 2'-0-(Р-0-рибофуранозил)адснозин.

111.4. Взаимодействие ОТ ВИЧ-1 и Т7 РНКП с фосфонатными аналогами

NTP и неорганического пирофосфата.

IV. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1»

Нуклеотид-полимеразы (ДНК- и РНК-полимеразы разных типов) представляют собой большой класс ферментов, ответственных за синтез ДНК и РНК в клетке и катализирующих единую химическую реакцию — синтез 3'-5'-фосфодиэфирной связи между рибо- или дезоксирибонуклсотидами. Большая часть этих ферментов представляют собой сложные мультисубъсдиничные комплексы, исследование которых во многих случаях затруднительно. В то же время существует значительное число нуклеотид-полимераз, сохраняющих весь спектр функций, но гораздо более простых по строению (в частности, односубъединичпых). Последнее обстоятельство делает такие полимеразы наиболее удобными моделями для изучения фундаментальных механизмов биосинтеза нуклеиновых кислот и позволяет получить максимум достоверной информации об их структуре и особенностях катализируемых ими реакций.

Особое место в исследованиях нуклеотид-полимераз занимает анализ их субстратной специфичности. Выяснение вопросов о том, какие факторы влияют на выбор нуклеотид-полимеразой РНК или ДНК матрицы, рибо- или дсзоксирибонуклеозидтрифосфата (rNTP или dNTP) представляются основополагающими в нашем понимании их функционирования.

Целыо настоящей работы являлся поиск критериев, влияющих на выбор субстратов, для представителей двух различных семейств нуклеотид-полимераз: ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Т7 РНКП) и обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека 1 (ОТ ВИЧ-1). Оба этих фермента представляют собой относительно простые по структуре полимеразы, катализирующие реакции транскрипции и обратной транскрипции, соответственно. Особый интерес представляло исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ ВИЧ-1 в отношении неканонических субстратов, поскольку их использование потенциально может существенно расширить спектр применения этих ферментов в различных областях физико-химической биологии.

В работе был проведен поиск условий препаративного синтеза смешанных полинуклеотидов определенного состава мутантной формой Т7 РНКП, а также использование последних в качестве матриц для ОТ ВИЧ-1. Исследовано влияние введения объемного заместителя [2'-0-(Р-рибофуранозил)адснозина] в различные положения цепи нраймера на протекание реакции обратной транскрипции, катализируемой ОТ ВИЧ-1. Отдельной частью работы являлось исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ в отношении нуклеозидтрифосфатов, содержащих модификации трифосфатной части молекулы.

I. Литературный обзор.

ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРЛЗЫ: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ЕДИНЫЙ КАТАЛИТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ.

Среди процессов, протекающих в клетке, важнейшими являются воспроизведение и передача генетической информации от родителей потомству. Для этого все живые организмы кодируют ряд ферментов — нуклеотид-полимераз, осуществляющих репликативные, рспаративные и транскрипционные функции. На первый взгляд, между этими ферментами мало общего: к ним относятся и оД11осубъсдиничпая рспарирующая ДНК-полимераза р эукариотичсской клетки с молекулярной массой 39 кДа [1], и огромные мультисубъсдиничные полимеразы, например, ДНК-полимераза III E.coli, которая состоит, по крайней мере, из 20 субъсдиниц, а се молекулярная масса достигает 900 кДа [2]. Среднюю ступень сложности занимают такие полимеразы, как ДНК-полимераза I E.coli, имеющая несколько ферментативных активностей, связанных с единственной достаточно большой полипептидной цепью [3]. В настоящем обзоре речь будет идти в первую очередь об односубъединичных полимеразах. Именно эти ферменты, относительно простые по строению, и, в то же время, обладающие всей функциональной полнотой, способны в настоящее время дать наиболее полную информацию о тонких механизмах их действия. Успехи последних лет, связанные, в первую очередь, с исследованиями трехмерных структур этих ферментов, позволяют, сформулировать общие черты функционирования нуклеотид-полимераз.

Несмотря на значительное разнообразие в семействе нуклеотид-полимераз, при ближайшем рассмотрении оказывается, что все они являются вариациями на одну тему. Как ДНК-, так и РНК-полимеразы катализируют одну и ту же химическую реакцию - образование фоефодиэфирной связи при взаимодействии концевой 3'-гидроксильной группы вновь синтезирующейся полинуклеотидной цепи с а-фосфатом субстрата — dNTP или rNTP [4]. Изучение точности полимеризации, важного атрибута ферментов этого типа, позволяет предположить, что многие (хотя и не все) механизмы дискриминации между правильными и неправильными парами оснований сохраняются во всем семействе полимераз [5].

Вероятно, наиболее важный аргумент в пользу схожести механизма всех полимераз вытекает из анализа их белковых последовательностей. Хотя существует лишь небольшое сходство последовательностей отдаленно родственных полимераз, оказывается, что несколько критических остатков их активного центра консервативны. Такого рода гомологии среди ДНК-, РНК- полимераз и обратных транскриптаз предполагают существование общего механизма переноса фосфата, необходимого для синтеза межнуклеотидной связи [6]. Однако эти ферменты обладают и рядом различий — способностью дискриминации между рибо- и дезоксирибо-субстратами, специфичностью в отношении типа матрицы (так, обратная транскриптаза (ОТ) способна использовать в качестве последней как РНК, так и ДНК [4]) и характером белок-нуклеинового взаимодействия характера белок-нуклеинового взаимодействия (РНК-полимеразы узнают специфическую нуклеотидную последовательность промотора, ДНК-полимсразы относительно неспецифично связываются с 3'- концом ДНК-нраймера, комплементарно взаимодействующего с ДНК-матрицей). Очевидно, что эти отличия обусловлены тем, что разные полимеразы участвуют в различных молекулярно-генетических клеточных процессах (репликация, транскрипция, обратная транскрипция, репарация). Как следствие, от них требуется работа с различными типами матриц, с отличающейся процессивиостью, точностью и скоростью, в разных условиях и в различном окружении. Поэтому большинство полимераз имеет дополнительные активности, ассоциированные с различными доменами белковой молекулы или с отдельными субъсдиницами мультисубъедипичиого комплекса, a in vivo многие из них работают лишь в комплексе с несколькими вспомогательными белками. Так, полимеразы, участвующие в репарации, часто обладают 5'—>3' экзонуклеазной активностью [4] и эндонуклеазной активностью по отношению к одноцепочечным 5'-"хвостам" [7]. Большое число ДНК-полимераз, от которых требуется высокая точность копирования (в первую очередь репликационные), обладают корректирующей У—>5* экзонуклеазной активностью, ассоциированной либо с отдельным доменом (ДНК-полимераза I E.coli [8]), либо с отдельной субъедипицей (s-субъединица ДНК-полимсразы III E.coli [2]). Обратные транскриптазы часто содержат домен с активностью РНКазы Н, отвечающей за удаление РНК из РНК-ДНК -гибрида при синтезе второй цепи ДНК [9J.

Локализация различных функций в определенных элементах вторичной структуры и структурах более высокого порядка привела к представлению о модульной организации полимераз: помимо доменов с "минимальной" полимеразной активностью, имеющих определенные черты сходства у всех полимераз, в подавляющем большинстве ферментов содержатся также домены, ассоциированные с различными дополнительными активностями. Эти домены, как правило, не имеют структурного сходства друг с другом [2,10].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Андреева, Ольга Игоревна

IV. выводы.

I. Исследована реакция ферментативного синтеза нуклеиновых кислот нового типа — смешанных рибо/дезоксирибонуклеотидов (СПН), катализируемая мутантной формой РНК-полимсразой бактериофага Т7 Tyr639Phc, Ser641AIa. Установлено, что эффективность включения дсзоксирибонуклсотида зависит от его позиции относительно начала транскрипции. Инициация транскрипции с дсзоксирибонуклсозидтрифосфата в наших условиях не наблюдалась, а эффективное включение dNMP происходило примерно -Ф Позиции. Отработаны условия препаративного получения моно-, ди-. и тризамещенных СПН.

2. Показано, что СПН являются эффективными матрицами в реакции, катализируемой ОТ ВИЧ-1. Посредством кинстичсскош анализа выяснено, что ОТ действует избирательно не только при выборе типа приходящего нуклеотида (rNTP или dNTP), но и чувствительна к структуре сахарного фрагмента в каждом нуклеотидном остатке матричной цепи.

3. Обнаружен принципиально новый принцип ингибирования ОТ ВИЧ, достигаемый за счет введения остатка 2'-0-(Р-0-рибофуранозил)аденозина в определенное положение праймера. При этом формальным терминатором реакции является природный нуклсозидтрифосфат, а эффект терминации достигается за счет невозможности связывания ферментом праймера, удлиненного на одно нуклеотидное звено.

4. Изучена специфичность Т7 РНК-полимеразы и ОТ к метиленбисфосфонатным аналогам неорганического пирофосфата и r/dNTP. Найден универсальный ингибитор этих ферментов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Андреева, Ольга Игоревна, 2004 год

1. Kumar A., Widen S.G., Williams K.R., Kedar P., Karpel R.L., Wilson S.H. Studies of the domain structure of mammalian DNA polymerase P: identification of discrete template binding domain//J. Biol. Chcm. 1990. V. 265. P. 2124-2131.

2. Hcrcndccn D.R., Kelly T.J. DNA polymerase III: running rings around the fork. // Cell. 1996. V. 84. P. 5-8.

3. Joycc C.M., Stcitz T.A. Function and structure relationships in DNA polymerases. // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 777-822.

4. Kornbcrg A., Baker T.A. 1992. DNA Replication. // San Francisco: Freeman. 931pp. 2nd ed.

5. Joycc C.M., Sun X.C., Grindley N.D.F. R. Reactions at the polymerase activc site that contribute to the fidelity of Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 2485-2500.

6. Delaruc M., Poch O., Tordo N., Moras D., Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases. // Protein Eng. 1990. V. 3. P. 461-467.

7. Lyamichcv V., Brow M.A.D., Dahlbcrg J.E. Structure-specific cndonucleolytic clcavage of nuclcie acids by eubactcrial DNA polymerases. // Sciencc. 1993. V. 260. P. 778-783.

8. Bccsc L.S., Steitz T.A. Structural basis for the 3'->5' cxonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. // EMBO J. 1991. V. 10. P. 25-33.

9. Davies J.F., Hostomska Z., Hostomsky Z., Jordan S.R., Matthews D.A. Crystal structure of ribonucleasc H domain of HIV-1 reverse transcriptase. // Science. 1991. V. 252. P. 88-95.

10. Arnold E., Ding J., Hughes S.H., Hostomsky Z. Structures of DNA and RNA polymerases and their interactions with nuclcic acids substrates. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. V. 5. P. 27-38.

11. Ollis D.L., Brick P., Hamlin R., Xuong N.G., Stcitz Т.Д. Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase 1 complcxcd with dTMP. // Nature. 1985. V. 313. P. 762-766.

12. Frccmont P.S., Friedman J.M., Bccse L.S., Sanderson M.R., Steitz T.A. Cocrystal structure of an editing complex of Klcnov fragment with DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85 P. 8924-8928.

13. Beese L.S., Derbyshire V., Steitz T.A. Structure of DNA polymerase 1 Klcnow fragment bound to duplex DNA. // Science. 1993. V.260. P. 352-355.

14. Beesc L.S., Friedman J.M., Steitz T.A. Crystal structure of Klenow fragment DNA polymerase 1 complcxcd with deoxynuclcosidc triphosphate and pyrophosphate. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 14095-14101.

15. Doublic S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., Ellcnberger T. Crystal structure of a bactcriofage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. // Nature. 1998. V. 391. P. 251-258.

16. Kim Y., Eom S.H., Wang J., Lcc D.-S., Suh S.W., Stcitz T.A. Crystal stracturc of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Nature. 1995. V. 376. P. 612-616.

17. Li Y., Korolev S., Waksman G. Crystal structures of open and closcd forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation. // EMBO J. 1998. V. 17. P. 7514-7525.

18. Eom S.H., Wang J., Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at polymerase active site. //Nature. 1996. V. 382. P. 278-81.

19. Korolev S., Nayal M., Barnes W.M., Di Cera E., Waksman G. Crystal structure of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase 1 at 2.5 A resolution: structural basis for thermostability. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 9264-9268.

20. Kcifcr J.R., Мао С., Bramant J.C., Bccse L.S. Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal. // Nature. 1998. V. 391. P. 304-307.

21. Kohlstacdt L.A., Wang J., Friedman J.M., Rice P.A., Steitz T.A. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. // Science. 1992. V. 252. P. 1783-1790.

22. Huang H., Chopra R., Vcrdine G.L., Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. // Science. 1998. V.282. P. 1669-1675.

23. Boyer P.L., Ferris A.L., Hughes S.H. Cassette mutagenesis of the reverse transcriptase of human immunodeficient virus type 1. // J. Virol. 1992. V. 66. P. 1031-1039.

24. Larder B.A.,Purifoy D.J.M., Powell K.L., Darby G. Sitc-spcsific mutagenesis of AIDS virus reverse transcriptase. //Nature. 1987. V.327. P. 716-718.

25. Polesky A.H., Stcitz T.A., Grindley N.D.F., Joycc C.M. Identification of residues critical for the polymerase activity of Klcnow fragment of DNA polymerase I from E.coli. II J. Biol Chem. 1990. V. 265. P. 14579-14591.

26. Polesky Л.Н., Dahlberg M.E., Bencovic M.J., Grindley N.D.F., Joyce C.M. Side chains involved in catalysis of polymerase reaction of DNA polymerase 1 from Escherichia coli. I I J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 8417-8428.

27. Sousa R., Chung Y.J., Rose J.P., Wang B.-C. Crystal structure of bacteriofage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution. //Nature. 1993. V. 364. P. 593-599.

28. Jcruzalmi D., Stcitz T.A. Structure of T7 RNA polymerase complexcd to the transcriptional inhibitor T7 lysozyme. // EMBO J. 1998. V. 17. P. 4101-4113.

29. Chcctham G.M.T., Jcruzalmi D., Steitz T.A. Structural basis for initiation of transcription from an RNA polymerasc-promotor complex. // Nature. 1999. V. 399. P. 80-83.

30. Chccthman G.M.T., Stcitz Т.Л. Structure of transcribing T7 RNA polymerase initiation complex. // Science. 1999. V. 286. P. 2305-2309.

31. Tahirov Т.Н., Temiakov D., Anikin M., Patlan V., McAllister W.T., Vassylycv D.G., Yokoyama S. Structure of a T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9 A resolution. // Nature. 2002. V. 420. P. 43-50.

32. Basu S., Basu A., Modak M.J. Pyridoxal 5'-phosphate mediated inactivation of Escherichia coli DNA polymerase I: identification of lysin-635 as an essential residue for the proccssivc mode of DNA synthesis. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6710-6716.

33. Mullcr D.K., Martin C.T., Coleman J.E. Processivity of proteolytically modified forms of T7 RNA polymerase. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 5763-5771.

34. Patra D., Lafcr E.M., Sousa R. Isolation and characterization of mutant bacteriofage T7 RNA polymerase. // J. Mol. Biol. 1992. V. 224. P. 307-318.

35. Moras D. Two sisters and their cousin. // Nature. 1993. V. 364. P. 572-573.

36. Lesburg С.Л., Cable M.B., Ferrari E., Hong Z., Mannarino A.F., Weber P.C. Crystal structure of the RNA-dcpendcnt RNA polymerase from hepatitis С virus reveals a fully encircled active site. // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 937-943.

37. Ago H., Adashi Т., Yoshida A., Yamamoto M., Habuka N., Yatsunami K., Miyano M. Crystal structure of the RNA-depcndcnt RNA polymerase of hepatitis С virus. // Structure. 1999. V.7. P. 1417-1426.

38. Bressanelli S., Tomci L., Roussel A., Incitti I., Vitalc R.L., Mathieu M., De Francesco R., Rey F.A Crystal structure of the RNA-dcpendent RNA polymerase of hepatitis С virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 13034-13039.

39. Bressanelli S, Tomci L, Rcy FA, De Francesco R. Structural analysis of the hepatitis С virus RNA polymerase in complex with ribonucleotides. // J Virology. 2002. V. 7. P. 34823492.

40. O'Farrcll D, Trowbridge R, Rowlands D, Jager J. Substrate complexes of hepatitis С virus RNA polymerase (HC-J4): structural cvidencc for nucleotide import and dc-novo initiation. // J Mol Biol. 2003. V. 326. P. 1025-1035.

41. Poch O., Sauvaget I., DeLarue M., Tordo N. Identification of four concerved motifs among the RNA-depended polymerase encoding element. // EMBO J. 1989. V. 8. P. 3867-3874.

42. Sousa R. Structural and mechanistic relationships between nucleic acid polymerases. // Trends Biochem. Sci. 1996. V. 21. P. 186-190.

43. Canard В., Chowdhury K., Sarfati R., Doublie S., Richardson C.C. The motif D loop of Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase is critical for nucleoside 5'-triphosphate selectivity. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 35768-35776.

44. Cheng Y.C., Dutschman G.E., Bastow K.F., Sarngadharan M.G., Ting R.Y. Human immunodcficicncy virus reverse transcriptase. General properties and its interactions with nucleoside triphosphate analogs. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 2187-2189.

45. Basu S., Basu A., Modak M.J. Pyridoxal 5'-phosphate mediated inactivation of Escherichia coli DNA polymerase I: identification of lysin-635 as an essential residue for the processive mode of DNA synthesis. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6710-6716.

46. Mohan P.M., Basu A, Basu S., Abraham K.I., Modak M.J. DNA binding domain of Escherichia coli DNA polymerase I: identification of arginine-841 as an essential residue. //Biochemistry. 1988. V. 27. P. 226-233.

47. Catalano C.E., Allen D.J., Benkovic S.J. Interaction of Escherichia coli DNA polymerase I with azidoDNA and fluorescent DNA probes: identification of protein-DNA contacts. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 3612-3621.

48. Carroll S.S., Co wart M., Benkovic S.J. A mutant of DNA polymerase I (KJcnow fragment) with reduced fidelity. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 804-813.

49. Allen D.J., Darke P.L., Benkovic S.J. Fluorescent oligonucleotides and deoxynucleotide triphosphates: preparation and their interaction with large (Klenow) fragment of Escherichia coli DNA polymerase I.// Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4601-4607.

50. Kati W.M., Johnson K.A., Jerva L.F., Anderson K.S. Mechanism and fidelity of HIV reverse transcriptase. //1992. J. Biol. Chem. V. 267. P. 25988-25997.

51. Gopalakrishnan V., Peliska J.A., Benkovic S.J. Human immunodeficicncy virus tipe 1 reverse transcriptase: spatial and temporal relationship between the polymerase and RNase H activities. // Proc. Natl. Acad. ScL 1992. V. 89. P. 10763-10367.

52. Kim J.L., Nikolov D.B., Birlcy S.K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element. // Nature. 1993. V. 365. P. 520-527.

53. Basu A., Ahluwalia K.K., Basu S., Modak M.J. Identification of the primer binding domain in human immunodeficicncy virus reverse transcriptase. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 616-623.

54. Sobol R.W., Suhadolnik R.J., Kumar A., Lee B.J., Hatfield D.L., Wilson S.II. Localization of a polynucleotide binding region in HIV-1 reverse transcriptase: implications for primer binding. // Boichemistry. 1991. V.30. P. 10623-10631.

55. Ikeda R.A., Richardson C.C. Interactions of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3614-3618.

56. Steitz T.A. DNA- and RNA-dependcnt DNA-polymcrases. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1993. V.3. P. 31-38.

57. Raskin C.A., Diaz G., Joho K., McAllister W.T. Substitution of a single bacteriophage T3 residue in bacteriophage T7 RNA polymerase at position 748 result in a switch in promoter specifity. // J. Mol. Biol. 1992. V. 228. P. 506-515.

58. McGinness K.E., Joyce G.F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. Hi. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 2987-2991.

59. Kuchta R.D., Mizrahi V., Benkovic P.A., Johnson K.A., Benkovic S.J. Kinetic mechanism of DNA polymerase I (Klenow fragment) // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 8410-8417.

60. Tabor S., Richardson C.C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase 1 family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6339-6343.

61. Astatkc M., Grindlcy N.D.F., Joyce C.M. How E.coli DNA polymerase (Klenow fragment) distinguishes between deoxy- and dideoxynucleotides. //J. Mol. Biol. 1998. V. 278. P. 147165.

62. Tabor S., Richardson C.C. DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 4767-4771.

63. Tabor S., Richardson C.C. Effect of manganese ions on the incorporation of dideoxynuclcotides by bacteriophage T7 DNA polymerase and Escherichia coli DNA polymerase 1.11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 4076-4080.

64. Innis M.A., Myambo K.B., Gelfand D.H., Brow M.A.D. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 9436-9440.

65. Cheng N., Merrill B.M., Painter G.R., Frick L.W., Furman P.A. Identification of the nucleotide binding site of HIV-1 reverse transcriptase using dTTP as a photoaffinity label. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 7630-7634.

66. Gao G., Orlova M., Georgiadis M.M., Hendrickson W.A., Goff S.P. Conferring RNA polymerase activity to a DNA polymerase: a single residue in reverse transcriptase controls substrate selection. //Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1997. V. 94. P. 407-411.

67. Krebs R., Immcndorfcr U., Thrall S.H., Wohrl B.M., Goody R.S. Single-step kinetics of HIV-1 reverse transcriptase mutants responsible for virus resistance to nucleoside inhibitors zidovudine and 3-TC. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 10292-10300.

68. Caroll S.S., Geib J., Olsen D.B., Stahlhut M., Shafer J.A., Kuo L.S. Sensitivity of H1V-1 reverse transcriptase and its mutants to inhibition by azidothymidine triphosphate. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 2113-2120.

69. Kellam P., Bouchcr C.A.B., Larder B.A. Fifth mutation in human immunodeficiency virus typc-1 reverse transcriptase contributes to the development of high-level resistance to zidovudine. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1934-1938.

70. Bonner G., Patra D., Lafer E.M., Sousa R. Mutations in T7 polymerase that support the proposal for a common polymerase activc site structure. // EMBO J. 1992. V. 11. P. 27673775.

71. Kostyuk D.A., Dragan S.M., Lyakhov D.L., Rechinsky V.O., Tunitskaya V.L., Chernov B.K., Kochetkov S.N. Mutants of T7 RNA polymerase that are able to synthesize both RNA and DNA. // FEBS Lett. 1995. V. 369. P. 165-168.

72. Reardon J.E. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase: steady-state and pre-steady-state kinctics of nucleotide incorporation. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 44734479.

73. Reardon J.E. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase. A kinetic analysis of RNA-dependent and DNA-dcpcndent DNA polymerisation. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 8743-8751.

74. Allen D.J., Darke P.L., Benkovic S.J. Fluorescent oligonucleotides and deoxynuclcotidc triphosphates: preparation and their interaction with large (Klenow) fragment of Escherichia coli DNA polymerase I. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4601-4607.

75. Johnson K.A. Conformational coupling in DNA polymerase fidelity. // Annu. Rev. Biochem. 1993. V. 62. P. 685-713.

76. Ferrin L.J., Mildvan A.S. NMR studies of conformations and interactions of substrates and ribonucleotide templates bound to the large fragment of DNA polymerase I. // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 5131-5145.

77. Eger B.T., Benkovic S.J. Mcchanism of DNA replication fidelity for three mutants of DNA polymerase I: Klenow fragment KF(exo+),KF(polA5), KF(cxo-). // Biochemistry. 1992 V. 31. P. 9227-9236.

78. Painter G.R., Wright L.L., Hopkins S.t Furman Р.Л. Initial binding of 2'-dcoxynuclcoside 5'-triphosphates to human immunodeficicncy virus type I reverse transcriptase. // J.Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 19362-19368.

79. Dahlberg M.E., Benkovic S.J. Kinetic mcchanism of DNA polymerase I (Klenow fragment): identification of a sccond conformational changc and evaluation of the internal equilibrium constant. // Biochemistry. 1991 V. 30. P. 4835-4843.

80. Краевский A.A., Куханова M.K. Итоги науки и техники. Серия Молекулярная биология. 1986. Т. 22. С. 3-164.

81. Краевский А.А. Химические реакции, катализируемые ДНК-полимеразами. // Биоорг. Химия. 2000. Т. 26. С. 4-11.

82. Brody R.S., Frey Р.А. Unambiguous determination of the stereochemistry of nucleotidil transfer catalyzed by DNA polymerase I from Escherichia coli. II Biochemistry. 1981. V. 20. P. 1245-1252.

83. Brautigam C.A., Stcitz Т.Л. Structural principles for the inhibition of the 3'-5' cxonucleasc activity of Escherichia coli DNA polymerase I by phosphorothioates. // J. Mol. Biol. 1998. V. 277. P. 363-377.

84. Burgers P.M., Eckstcin F. A study of mechanism of DNA polymerase I from Escherichia coli with diastereomeric phosphorothioate analogs of dcoxyadenosinc triphosphate. //J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 6889-6893.

85. Doublic S., Ellenberger T. The mechanism of action of T7 DNA polymerase. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. V. 8. P. 704-712.

86. Wong I., Patcl S.S., Johnson K.A. An induccd-fit kinetic mcchanism for DNA replication fidelity: direct measurement by single-turnover kinctics. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 526-537.

87. Kaushik N., Pandey V.N., Modak M.J. Significance of the O-hclix residues of Escherichia coli DNA polymerase I in DNA synthesis: dynamics of the dNTP binding pocket. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 7256-7266.

88. Doublic S., Sawaya M.R., Ellenberger T. An open and closcd case for all polymerases. // Structure. 1999. V. 7. P. R31-R35.

89. Martin C.T., Mullcr D.K., Coleman J.E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 3966-3974.

90. Ikeda R.A., Richardson C.C. Interactions of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3614-36.

91. Sousa R., Patra D., Lafer E.M. Model for the mcchanism of bacteriophage T7 RNAP transcription initiation and termination. // J. Mol. Biol. 1992. V. 224. P. 319-334.

92. Moroncy S.E., Piccirilli J.A. Abortive products as initiating nucleotides during transcription by T7 PNA polymerase. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 10343-10349.

93. Brieba L.G., Sousa R. The T7 RNA polymerase intercalating hairpin is important for promoter opcrning during initiation but not for RNA displacement or transcription bubble stability during elongation. // Biochcmisrty. 2001. V. 40. P. 3882-3890.

94. Bedford E., Tabor S., Richardson C.C. The thioredoxin binding domain of bacteriophage T7 DNA polymerase confcrs processivity on Escherichia coli DNA polymerase I. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 479-484.

95. Richardson C.C. Bacteriophage T7: minimal requirements for the replication of a duplex DNA molecule. // Cell. 1983. V. 33. P. 315-317.

96. Himawan J.S., Richardson C.C. Amino acid residue critical for the interaction between bacteriophage T7 DNA polymerase and Escherichia coli thioredoxin. // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P. 19999-20008.

97. Olson M.W., Wang Y., Elder R.H., Kaguni L.S. Subunit strucrute of mitochondrial DNA polymerase from Drosophila embryos. Physical and immunological studies. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 28932-28937.

98. Boehmer P.E., Lehman I.R. Herpes simplex virus DNA replication. // Annu. Rev. Biochem. 1995. V. 66. P. 347-384.

99. McDonald W.F., KIcmpcrcr N., Traktman P. Characterization of a proccssive form of the viccinia virus DNA polymerase. // Virology. 1997. V. 234. P. 168-175.

100. Das S.K., Fujimura R.K. Proccssiveness of DNA polymerases. A comparative study using a simple procedure. //J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1227-1232.

101. Braithwaitc D.K., Ito J. Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymarases. //Nucleic Acid Res. 1993. V.21. P. 787-802.

102. Речинский B.O., Драган C.M., Костюк Д.Л., Ляхов Д.Л., Кочетков С.Н. Генетическая система отбора точечных мутантов РНК-полимеразы бактериофага Т7. // Мол. Биология. 1991. Т. 25. С. 1588-1593.

103. Pokholok D.K., Gudima S.O., Ycsipov D.S., Dobrynin V.N., Rechinsky V.O., Kochctkov S.N. Interactions of the HIV-1 reverse transcriptase 'AZT-resistant' mutants with substrates and AZT-TP // FEBS Lett. 1993. V. 325. P. 237-241.

104. Kumar A., Wilson S.H. Mapping of nuclcic acid binding in proteolytic domains of HIV-1 reverse transcriptase. // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 7466-7474.

105. Sambrook K.J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

106. Promega protocol and application guide. 2nd edition, Madison: Promega Corporation, 1991.

107. Бсрезин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. Москва. Высшая школа. 1997.

108. Ricchetti M., Вис Н. E.coli DNA polymerase I as a reverse transcriptase. // EMBO J. 1993. V. 12. P. 387-396.

109. Cazenave C., Uhlcnbcck O.C. RNA template-dircctcd RNA synthesis by T7 RNA polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 6972-6976.

110. Тупицкая В.Л., Мемслова Л.В., Косткж Д.А., Гудима С.О., Кочетков С.Н. Исследование закономерностей утилизации дезоксирибонуклсозид-трифосфатов муталтными формами РНК-полимсразы бактериофага Т7. // Мол. Биология. 1997. Т.31.С. 353-358.

111. Gudima S.O., Kostyuk D.A., Grishchcnko O.I., Tunitskaya V.L., Memelova L.V., Kochetkov S.N. Synthesis of mixed ribo/deoxyribopolynuclcotides by mutant T7 RNA polymerase. // FEBS Lett. 1998. V. 439. P. 302-306.

112. Basu S., Maitra U. Specific binding of monomcric bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases to their rcspcctivc cognate promoters requires the initiating ribonucleoside triphosphate (GTP).//J. Mol. Biol. 1986. V. 190. P. 425-437.

113. Reardon J.E., Furfinc E.S., Cheng N. Human immunodeficiency virus reverse transcriptase. Eficct of primer length on template-primer binding. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 14128-14134.

114. Kedar P.S., Abbots J., Ко vacs Т., Lesiak K., Torrence P., Wilson S.I I. Mechanism of HIV reverse transcriptase: enzyme-primer interaction as revealed through studies of a dNTP analogue, З'-azido-dTTP. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 3606-3611.

115. Martin-Hernandez A.M., Domingo E., Menendez-Arias L. Human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase: role of Tyrll5 in deoxynucleotide binding and misinscrtion fidelity of DNA synthesis.// EMBO. 1996. V. 15. P. 4434-4442.

116. Hcidcnreich O., Kruhoffer M., Grossc F., Ekstein F. Inhibition of human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase by З'-azidothymidine triphosphate. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 192. P. 621-625.

117. Richman D.D. Antiretroviral activity of cmtricitabinc, a potent nucleoside reverse transcriptase inhibitor. // Antivir Ther. 2001.V. 6. P. 83-88.

118. Kaufmann G.R., Cooper D.A. Antiretroviral therapy of HIV-1 infection: established treatment strategies and new therapeutic options. // Current Opinion in Microbiology. 2000. V. 3. P. 508-514.

119. Rando R.F., Nguycn-Ba N. Development of novel nucleoside analogues for use against drug resistant strains of HIV-1. // Drug Discovery Today. 2000. V. 5. P. 465-476.

120. Canard В., Sarfati S.R., Richardson C.C. Binding of RNA template to a complex of HIV-1 reverse transcriptasc/primcr/template. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. V. 94. P. 11279-11284.

121. E.V.Efimtscva, G.V.Bobkov, S.N.Mikhailov, A Van Acrschot, G.Schcpers, R.Busson, J.Rozenski, P.Hcrdcwijn. Oligonucleotides containing disaccharidc nucleosides. // Hclv. Chim. Acta. 2001. V. 84. P. 2387-2397.

122. Basavappa R., Siglcr P.B. The 3 A crystal structure of yeast initiator tRNA: functional implications in initiator/clongator discrimination. // EMBO J. 1991. V. 10. P. 3105-3111.

123. Valverdc-Garduno V., Gariglio P., Gutierrez L. Functional analysis of HIV-1 reverse transcriptase motifC: site-directed mutagenesis and metal cation interaction. //J Mol Evol. 1998. V. 47. P. 73-80.