Выделение новой ДНК-полимеразы репаративного типа из яйцеклеток костистой рыбы Вьюн (Misgurnus fossilis L. ) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Димитрова, Диана Димитрова

• Димитрова, Диана Димитрова
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Димитрова, Диана Димитрова

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

Список сокращений

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Повреждения в ДНК и факторы, их вызывающие

2.2. Механизмы репарации ДНК

2.2.1. Эксцизионная репарация основания

2.2.2. Эксцизионная репарация нуклеотидного остатка

2.3. Репаративные ДНК-полимеразы

2.3.1 ДНК-полимераза р

2.3.2. ДНК-полимеразы 5 и г

2.3.3. ДНК-полимераза а

2.3.4. ДНК-полимеразаС

2.4. ДНК-полимеразы в раннем развитии животных

2.5. Окислительный стресс и репарация ДНК

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Источник и квалификация основных реактивов и ферментов

3.2, Получение биологического материала

3.3 Фракционирование ДНК-полимераз

3.3.1. Получение препаратов репаративных ДНК-полимераз для исследования динамики их активности в эмбриогенезе

3.3.2. Получение очищенных препаратов ДНК-полимераз р и С,

из икры вьюна для седиментационного анализа

3.4. Получение ДНК-субстратов

3.4.1. Получение субстратов экзонуклеазы, меченных 3Н с З'-конца

3.4.2. Получение субстратов экзонуклеазы, меченных 32Р с 5'-конца

3.5.1. Определение активности ДНК-полимераз

3.5.2. Определение активности 3'-»5' и 5'->3'-экзонуклеазы

3.6. Определение процессивности ДНК-полимераз

3.7. Другие методы

3.7.1. Электрофоретическое разделение белков и

нуклеиновых кислот

3.7.2. Электрофорез ферментов в неденатурирующем полиакриламидном геле

3.7.3. Определение концентрации белка и соли

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Выделение репаративных ДНК-полимераз из зрелых

яйцеклеток вьюна

4.2. Полипептидный состав ДНК-полимеразы (3

4.3. Полипептидный состав ДНК-полимеразы С

4.4. Энзиматическая характеристика ДНК-полимеразы С

4.4.1. Матричные свойства

4.4.2. Процессивность

71

4.4.3. 3'->5'-экзонуклеазная активность

76

4.4.4. Ингибиторный анализ

4.5. Изменение активности ДНК-полимераз р и С в раннем

81

развитии вьюна

4.6. Влияние окислительного стресса на ДНК-полимеразы в

83

эмбриогенезе вьюна

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

87

5.1. Репаративные ДНК-полимеразы в эмбриональном развитии

5.2. Характеристика ДНК-полимеразы С из зрелых

89

яйцеклеток вьюна

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AP-сайт - апуриновый/ апиримидиновый сайт

БСА - бычий сывороточный альбумин

он ДНК - однонитевая дезоксирибонуклеиновая кислота

дн ДНК - двунитевая дезоксирибонуклеиновая кислота

«Да - килодальтон

o.e. - оптическая единица

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

н.о. - нуклеотидные остатки

ПААГ - полиакриламидный гель

ТЕМЕД - N, N, N, N, - тетраметилэтилендиамин

Трис - трис-(оксиметил)-аминометан

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭРО - эксцизионная репарация основания

ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидного остатка

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

А, G, С, U, Т - (в нуклеотидах и нуклеозидах) аденозин, гуанозин,

цитидин, уридин, тимидин BuAdATP - бутил-анилин-дезоксиаденозин-5'-трифосфат BuPhedGTP - бутил-фенил-дезоксигуанозин-5'-трифосфат DMSO - диметилсульфоксид Ds-Na - додецилсульфат натрия

dNMP, dNTP - дезоксинуклеозид-5'-монофофат, -трифосфат d2TTP - 2', 3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфат dRp - дезоксирибофосфат

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

PPi - пирофосфат

RF-C - репликативный фактор С

RP-A - репликативный белок А

SSB белки - белки, связывающие однонитевую ДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение новой ДНК-полимеразы репаративного типа из яйцеклеток костистой рыбы Вьюн (Misgurnus fossilis L. )»

1. ВВЕДЕНИЕ

Репарация ДНК является важнейшей генетической функцией, направленной на сохранение интактной структуры клеточного генома. Различные физические и химические факторы вызывают различные повреждения в ДНК, что определяет многообразие механизмов репарации этих повреждений. Проблема коррекции структурных аномалий, возникающих в ДНК, особенно актуальна на ранних этапах эмбрионального развития, так как дефект в репаративной системе клеток эмбриона в условиях интенсивной пролиферации приводит к многократному повторению ошибки. Репаративный синтез ДНК в ходе первых делений клеток эмбриона обеспечивается запасенными в зрелом ооците репаративными ДНК-полимеразами. Низкое содержание ДНК-полимеразы ß в зрелых яйцеклетках вьюна в сравнении с ее содержанием в яйцеклетках других видов (Mikhailov and Gulyamov, 1983; Carre et al., 1981, Matsumoto et al., 1994) ставит вопрос о возможном участии других ДНК-полимераз в репарации повреждений ДНК на ранних этапах эмбриогенеза.

Согласно современной классификации, существуют пять типов ДНК-полимераз эукариот: а, ß, у, 8 и s (Burgers et al., 1990), которые участвуют в репликации и репарации ДНК. Недавно опубликованы данные о новой ДНК-полимеразе, названной ДНК-полимеразой С,, выделенной из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993), зрелых яйцеклеток вьюна (Шарова и др., 1994) и клеток дрожжей (Nelson et al., 1996). ДНК-полимераза С, участвует, по-видимому, в репарации ДНК. Если о структуре, физико-химических и энзиматических свойствах ДНК-полимераз а, ß, у, 5 и в существуют многочисленные данные, то о новом ферменте известно крайне мало.

Решение вопроса о роли обнаруженной ДНК-полимеразы требует детального анализа строения фермента, идентификации каталитической субъединицы и исследования механизма взаимодействия с модельными ДНК-субстратами. Физико-химический и энзимологический анализ ДНК-полимеразы С, может выявить новые механизмы репарации клеточной ДНК и их специфику в раннем развитии животных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ПОВРЕЖДЕНИЯ В ДНК И ФАКТОРЫ, ИХ ВЫЗЫВАЮЩИЕ

Существуют два типа структурных аномалий, которые могут привести к стабильно наследуемым изменениям в последовательности ДНК, так называемым мутациям. В первом случае обычные нуклеотидные остатки, включаясь в ДНК, нарушают контекст последовательности ДНК. Эти аномалии связаны с появлением в ДНК неспаренных оснований, петель в ДНК за счет вставки или делеции нуклеотидных остатков и др. Ко второму типу относятся так называемые повреждения в структуре ДНК: в нормальный контекст последовательности ДНК включены аномальные, с точки зрения их химического строения, нуклеотидные остатки. К ним относятся модифицированные, фрагментированные и кросс-связанные нуклеотиды.

Как известно, ДНК постоянно подвергается разного рода изменениям, как спонтанным, так и индуцируемым физическими и химическими мутагенами, и даже клеточными метаболитами. В ДНК сравнительно часто происходят такие спонтанные изменения как апуринизация (Lindahl and Nyberg, 1972) и дезаминирование оснований (Sakumi and Sekiguchi, 1990). Продукты дезаминирования цитозина, аденина и гуанина а именно - урацил, гипоксантин и ксантин, соответственно, являются основаниями, не характерными для первичной структуры ДНК . Это обстоятельство позволяет репаративной системе клетки узнавать эти "необычные" основания и удалять их. Главным нарушением, возникающим под действием ультрафиолетового облучения, является насыщение двойных связей оснований и образование пиримидиновых димеров из двух соседних пиримидинов в одной цепи ДНК. Ионизирующая радиация приводит часто к размыканию пуринового кольца,

фрагментации основания и к образованию одно- и двухцепочечных разрывов (см. обзор Sankar, 1996) Продую- формамидопирин, например, препятствует дальнейшей репликации цепи ДНК. Химическими реагентами, которые модифицируют ДНК, могут являться как различные активные формы кислорода, образующиеся в процессе его метаболизма (Wallase, 1988), так и различные неорганические и органические электрофилы, включая металлы, алкилирующие агенты и полициклические ароматические углеводы (см. обзор Demple and Harrison, 1994).

2.2. МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК

Функциональная стабильность ДНК обеспечивается серией ферментативных реакций, объединенных термином репарация. Ряд повреждений клетка удаляет из ДНК путем прямой реактивации. Типичные ферменты такой репарации - ДНК-фотолиаза бактерий, которая способна "расшивать" циклобутановое кольцо пиримидинового димера, и m-06G-flHK-метилтрансфераза, которая переносит метильную группу с алкилированного гуанина на один из собственных цистеиновых остатков. Прямая реактивация повреждений в ДНК не нуждается в участии репаративных ДНК-полимераз, поэтому она не рассматривается детально в этом обзоре (для допольнительной информации см. обзор Wood, 1996).

Другим путем репарации является эксцизионная репарация. В этом случае для восстановления изначальной первичной структуры дуплекса необходимо наличие информации интактной комплементарной цепи, считываемой репаративными ДНК-полимеразами.

Репаративные реакции, в ходе которых происходит корректировка неспаренных нуклеотидов и повреждний ДНК, сходны. Неправильно вставленное или поврежденное основание удаляется (в этом сучае имеет

место т. наз. эксцизионная репарация основания), либо вырезается весь нуклеотидный остаток (т. е. происходит эксцизионная репарация нуклеотидного остатка). Образовавшаяся в результате реакции вырезания брешь "заполняется" ДНК-полимеразой в ходе репаративного синтеза, после чего разрыв в цепи ДНК лигируется.

2.2.1. Эксцизионная репарация основания

Эксцизионная репарация основания (ЭРО) является способом коррекции модифицированных оснований. Существуют данные об ЭРО, связанной с застраиванием однонуклеотидной бреши, что обычно наблюдается в случаях образования нормального апуринового/апиримидинового (АР)-сайта ("short-patch" repair), и ЭРО, в ходе которой ДНК-полимеразы заполняют брешь из нескольких (до шести) нуклеотидов ("long-patch" repair), зачастую связанной с репарированием аномального АР-сайта (Klunglan and Lindahl , 1997). Согласно модели, предложенной Lindahl (Lindahl, 1993), модифицированные основания репарируются в ходе пяти последовательных реакций: (1) удаление основания специфичной ДНК-1М-гликозилазой (показано в случаях гидролитического дезаминирования, алкилирования и при повреждениях, вызванных активными формами кислорода (Sakumi and Sekiguchi, 1990; Wallase, 1988) с получением общего промежуточного продукта - АР-сайта; (2) надрезание АР-сайта с его 5'-конца АР-эндонуклеазами класса II; (3) вырезание 5'-концевого дезоксирибофосфата (dRp) с образованием однонуклеотидной бреши; (4) репаративный синтез ДНК, застраивающего брешь; (5) "зашивание" разрыва ДНК-лигазой.

Так как АР-сайты образуются достаточно часто в клетке вследствие спонтанной или индуцированной потери основания, интересной представляется идентификация ферментов, эффективно обеспечивающих

репарацию данного типа. Были предприняты попытки установить, какие из известных ДНК-полимераз способны участвовать в эксцизионной репарации G:U пары синтетического олигомера (Dianov et al., 1992). Показано, что такой тип неправильного спаривания в экстрактах клеток Е. coli и линии клеток человека репарируется в результате замены одного одинственного нуклеотидного остатка, катализируемой, по всей видимости, ДНК-полимеразой ß, на что указывает ингибиторный анализ с использованием афидиколина, d2TTP и DMSO. Так как репарация сопровождалась образованием однонуклеотидной бреши, авторы предположили, что удаление dRp происходит при помощи не экзонуклеазы, а

дезоксирибофосфодиестеразы.

Участие ДНК-полимеразы ß в ЭРО подтверждено в экспериментах по реконструкции системы репарации in vitro с использованием клеток семенников быка (Singhai et al., 1995). В грубом ядерном экстракте репарация G:U пары подавлялась поликлональными антителами к ДНК-полимеразе ß и ее 8-кДа домену, а также при полном исключении из среды Мд2+. Правильная замена нуклеотида происходила при внесении препаративно очищенной ДНК-полимеразы ß в реакционную смесь, содержащую частично очищенные компоненты фракций, обладающие урацил-ДНК-гликозилазной, АР-эндонукпеазной и лигазной активностями. Практически никакой активности в данной системе не проявляли ДНК-полимеразы 5 или е и очень низкую репаративную активность демонстрировала ДНК-полимераза а, что, в действительности, могло быть проявлением связанной с ДНК-полимеразой а корректирующей активности ДНК-полимеразы Это вполне правдоподобно в виду полученных результатов авторов о том, что ни афидиколин, ни нейтрализующие ДНК-полимеразу а антитела не блокировали репаративный синтез.

Недавно Sobol с соавт. (Sobol et al., 1996) опубликовали результаты работ, выполненных на клеточной линии гомозиготных по делетированному гену ДНК-полимеразы р фибробластов из эмбрионов трансгенных мышей, по выявлению роли этой полимеразы in vivo. Экстракты этих клеток оказались дефектными по урацил-инициированной ЭРО. Они также обладали повышенной чувствительностью к монофункциональным ДНК-алкилирующим агентам, однако их чувствительность к другим ДНК-повреждающим агентам, таким как ультрафиолетовая радиация, у-облучение, Н202 и цисплатина не отличалась от контрольных экстрактов. Эти данные допускают участие других репаративных ДНК-полимераз в ликвидации повреждений, вызванных этими факторами.

Альтернативный путь репарации АР-сайта с участием ДНК-полимеразы 5 был исследован Matsumoto с соавт. (Matsumoto et al., 1994). Репарация тетрагидрофурана (синтетический аналог АР-сайта) поддерживалась системой, состоящей из фракций очищенных PCNA, АР-эндонуклеазы, ДНК-полимеразы 5 и ДНК-лигазы. Эта PCNA-зависимая система репарировала нормальный АР-сайт так же хорошо, как и тетрагидрофурановый остаток. В отличие от ДНК-полимеразы 5, ДНК-полимераза р была способна осуществлять замену только естественного АР-сайта независимо от присутствия PCNA. Активность очищенной ДНК-полимеразы а в подобном эксперименте не проявлялась. Эксцизионная репарация основания с участием ДНК-полимеразы 8 происходит также в тех случаях, когда вместо нормального АР-сайта в составе олигонуклеотида присутствует его редуцированное или окисленное производное (Klungland and Lindahl, 1997). Репарация при этом сопровождается не одной нуклеотидной заменой, а заполнением бреши из 4-6 нуклеотидов. Удаление этих нуклеотидов осуществляет специфическая нуклеаза DNase IV, а репаративный синтез

выполнялся как ДНК-полимеразой 5, так и ДНК-полимеразой р. Это дает основание считать, что эксцизионная репарация АР-сайта может осуществляться двумя различными путями - PCNA-зависимым - с участием ДНК-полимеразы 8 и PCNA-независимым - с участием ДНК-полимеразы р. В настоящее время отсутствуют данные относительно участия недавно открытой ДНК-полимеразы £в репарации с вырезанием основания.

Изучение механизма ЭРО способствовало обнаружению новой ферментативной активности у ДНК-полимеразы р (Matsumoto and Kim, 1995). В течение нескольких десятилетий считалось, что эта низкомолекулярная ДНК-полимераза не обладает никакой другой активностью кроме ДНК-полимеразной. Поэтому полной неожиданностью оказалось идентифицирование у этого фермента дезоксирибофосфатазной (dRase) активности. В реакционной системе, состоящей из очищенных после суперэкспрессии в бактериях ДНК-полимеразы р крыс и ДНК-лигазы бактериофага Т4, 5'-концевой dRp вырезался из состава олигонуклеотида, что приводило к его укорачиванию на одно звено. Эксцизионная активность ДНК-полимеразы р, однако, проявлялась только в случаях предварительного надрезания АР-сайта АР-эндонуклеазой. Дезоксирибофосфатазная активность фермента локализована в районе 8 кДа домена фермента. Кроме того, выяснено, что механизм освобождения 5'-концевого dRp ДНК-полимеразой р представляет p-элиминирование с образованием ненасыщенного производного dRp. Механизм вырезания 5'-dRp позже экспериментально подтвердили Piersen с сотр. (Piersen et al., 1996). Были определены основные аминокислотные остатки в структуре ДНК-полимеразы Р, которые ответственны за стабилизацию dRp при его вырезании в дезоксирибофосфатазном каталитическом центре фермента (Mullen et al., 1997).

Эксцизионная репарация невозможна без согласованного действия нескольких классов ферментов: N-гликозилаз, АР-эндонуклеаз, репаративных ДНК-полимераз и ДНК-лигаз. В настоящее время методом двойных гибридов в дрожжах удалось показать, что белок-белковое взаимодействие между ДНК-полимеразой (3 и АР-эндонуклеазой стимулируется образованием комплекса АР-эндонуклеазы с интактным АР-сайтом (Bennett et al., 1997). После надрезания АР-сайта только ДНК-полимераза р обладает стабильным сродством к ДНК. Роль АР-эндонуклеазы на этом этапе заключается в ускорении реакции вырезания dRp ДНК-полимеразой (3. С помощью Western-блот-анализа и метода афинного осаждения обнаружено взаимодействие ДНК-полимеразы р и белка XRCC1 в ходе репарации пары G:U в in vitro реконструированной системе с рекомбинантными белками клеток человека (Kubota et al., 1996). Отсутствие белка XRCC1 не лимитирует реакцию, однако он обеспечивает эффективное лигирование продуктов репарации за счет направленного связывания его N-концевого домена с ДНК-полимеразой р и его С-концевого домена с ДНК-лигазой.

Аномалии в структуре ДНК - неспаренные основания и разного рода повреждения - вызывают деформации вторичной структуры ДНК. Сравнительно мало данных существует относительно факторов, участвующих в распознавании этих стуктурных дефектов ДНК. В "узнавании" повреждения участвуют разные белки. Одноцепочечные разрывы в ДНК ядер клеток печени крыс, полученные в результате инъекции афлатоксина В-1, "узнаются" поли(АРР-рибоза)-полимеразой, которая, как известно, использует их в качестве кофактора (Webster and Bhattacharya, 1995). Увеличение активности поли(АОР-рибоза)-полимеразы, ДНК-полимеразы р и ДНК-лигазы коррелирует с изменением уровня повреждений в структуре

ДНК. Поли(АйР-рибоза)-полимераза в комплексе сДНК-лигазой приобретает новую "сенсорную" функцию в эксцизионной репарации. (Caldegott et al., 1996). Для репарации разрывов в структуре ДНК необходимо согласованное действие четырех белков - XRCC1, поли(АОР-рибоза)-полимеразы, ДНК-полимеразы ß и ДНК-лигазы, которые, по всей вероятности, образуют мультисубъединичный комплекс (Prasad et al., 1996).

2.2.2. Эксцизионная репарация нуклеотидого остатка

Репарация с вырезанием нуклеотидного остатка может быть выполнена двумя основными механизмами. По первому из них, фосфодиэстеразная связь гидролизуется с 5' или 3' конца от неспаренного остатка и затем неправильный нуклеотидный остаток удаляется 5'-УЗ- либо 3'-»5'-экзонуклеазой вместе с прилегающими к нему нуклеотидами. Этот способ репарации служит основным для коррекции неспаренных оснований как у Е. coli, так и у человека (Wood, 1996), но он не используется для удаления модифицированных оснований ДНК. Возможное объяснение состоит в том, что большинство модифицированных оснований при удалении из ДНК ингибируют экзонуклеазу. Один из путей преодоления этой проблемы -существование ферментативной системы, один из компонентов которой вносит разрывы в поврежденную цепь с обеих сторон нарушения, но на определенном растоянии от него. Второй механизм эксцизионной репарации найден во всех изученных видах (Sanear, 1995). В репарации с вырезанием нуклеотидного остатка как у прокариот, так и у эукариот гидролизуется третья - пятая фосфодиэстеразная связь с 3' конца повреждения, на 5' конце у прокариот гидролизуется восьмая (Sanear, 1994), а у эукариот 21 -25-ая фосфодиэфирная связь (Svoboda et al., 1993). Таким образом, у прокариот повреждение элиминируется в виде 12-13-звенного олигомера, в

то время как у эукариот фрагмент вырезания еще длиннее - 27-29 нуклеотидных остатков. Такой механизм "двойного" разрезания вырезания присущ нуклеазам "вырезания" (exinucleases). Одноцепочечная брешь, образованная после вырезания, застраивается репаративными ДНК-полимеразами и "зашивается" ДНК-лигазой.

Наиболее хороо изучены три типа болезней человека связанные с нарушениями в репаративной системе: пигментная ксеродерма, Cockayne синдром и трихотиодистрофия. Пациенты с пигментной ксеродермой страдают повышенной фоточувствительностью, часто приводящей к раку кожи и неврологическим аномалиям.

На сегодняшний день показано участие двух ДНК-полимераз в репаративном синтезе, сопровождающимся вырезанием нуклеотида - ДНК-полимераз 8 и s. Ферментативная система, обеспечивающая эксцизионную репарацию нуклеотида (ЭРН), намного более сложна в сравнении с ферментативной системой ЭРО. Так как побочным продуктом репарации является олигонуклеотид длиной 21-30 и.о., несущий повреждение, то вполне объяснимо, что наряду с уже известными участниками репаративного процесса, такими как эндонуклеазы, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы, необходимо также участие SSB-белков и ферментов с геликазной и АТР-азной активностями (Sancar, 1995). Наиболее хорошо охарактеризованы компоненты ХР-факторов (от xeroderma pigmentosum) репаративной системы человека. Считается, что ХР-белки необходимы на первых стадиях процесса эксцизионной репарации. Среди них наиболее известны белок ХРА, который связывается с поврежденным участком ДНК, ХРС (SSB-белок), эндонуклеаза XPG. Интересно участие транскрипционнго фактора TFIIH, две субъединицы которого являются ДНК-геликазами (ХРВ и XPD). Для идентификации новых белков, вовлеченных в ЭРН, и для понимания

механизма действия уже известных факторов часто применяется подход реконструкции репаративной реакции in vitro. Для этой цели экстракт клеток разделяют на активные фракции, которые впоследствии заменяют очищенными белками. Таким образом было установлено, что репарация UV-поврежденного нуклеотида в клетках человека требует участия более 30 полипептидов среди которых также оказались RP-A и RF-C (Aboussekhra et al., 1995; Mu et al., 1995). Кроме того, эта репарация оказалась PCNA-зависимой, что косвенно указывает на участие ДНК-полимеразы б либо г в репаративном синтезе (Shivji et al., 1992). Была сопоставлена эффективность репаративного синтеза на UV-обработанной матрице ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразами 5 и в в присутствии PCNA, RP-A и RF-C (Shivji et al., 1995). Способность ДНК-полимеразы 5 заполнять образующиеся бреши в ДНК строго зависила от присутствии PCNA и RF-C, однако количество полностью лигированных продуктов репарации в присутствии ДНК-лигазы было довольно низко. Напротив, ДНК-полимераза g заполняет репарируемый участок в отсутствие PCNA и RF-C с получением лигированных продуктов при идентичных условиях. Репаративный синтез, осуществляемый ДНК-полимеразой е в присутствии RP-A, становится полностью зависимым от наличия факторов PCNA и RF-C в реакционой среде. Эти данные дают основание предположить, что RP-A является ключевым фактором, контролирующим активность ДНК-полимеразы s как в репаративном, так и в репликативном синтезе.

Другим регуляторным белком оказался белок р21, известный как ингибитор циклинзависимых киназ. Повреждения в ДНК клеток млекопитающих вызывают значительное увеличение его количества наряду с увеличением количества ядерного супрессора опухолей р53. PCNA является мишенью регуляторного воздействия р21, которое переключаете

репликативного на репаративный синтез ДНК. Имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что повреждения в ДНК вызывают остановки репликации ДНК хромосом, допуская при этом репарацию поврежденной ДНК. В клетках млекопитающих р21 может напрямую блокировать репликацию ДНК путем связывания РСМ'(Ы е! а1., 1994; Ы е! а1., 1996). р21 ингибирует ДНК-репликацию Б\/-40, не влияя на РСЫА-зависимую репарацию с вырезанием нуклеотидного остатка. Вполне вероятно, что синтез коротких брешей, осуществляемый ДНК-полимеразами 5 и в, не чувствителен к ингибированию р21, в отличие от репликативного синтеза, связанного с значительным удлинением праймера. Эффект связывания р21 с РСМА исследован позднее Подустом с соавт. (Рос^э! е! а1., 1995) Оказалось, что связывание р21 с РСМА приводит к диссоциации холоэнзима ДНК-полимеразы 5, вследствие чего синтез ДНК останавливается. Ими также показано, что ингибирующее действие р21 проявляется при наличии "препятствия" для эффективной полимеризации. При сравнении активности ДНК-полимераз 5 и в на матрицах с праймером, в составе которого имелась брешь, оказалось, что большая часть продуктов ДНК-полимеразы в относится к району бреши (□ е! а1., 1994). Таким образом, ДНК-полимераза в кажется более "приспособленной" к репарации с вырезанием нуклеотидного остатка, в ходе которой происходит застраивание бреши длиной до 30 н., чем ДНК-полимераза 5 (БЫур е! а1., 1995; □ е! а1, 1994). РСЫА-зависимая активность ДНК-полимеразы в также оказалась менее чувствительной к действию р21. Эти данные и результаты рассмотренных выше работ позволяют предположить, что в случаях повреждений в ДНК р21, связываясь с РСМА, подавляет РСЫА-зависимый репликативный синтез, осуществляемый ДНК-полимеразой бив. Поскольку репаративный синтез ДНК-полимеразы в не зависит от РСМА, то представляется вероятным

участие этой ДНК-полимеразы в репарации, связанной с вырезанием нуклеотидного остатка.

2.3. РЕПАРАТИВНЫЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 2.3.1. ДНК-полимераза (3

ДНК-полимераза р выделена из всех видов позвоночных и представляет собой один каталитически активный полипептид с молекулярной массой 39 -40 кДа (см. обзор Wang, 1991). Постоянный уровень ДНК-полимеразы р на протяжении клеточного цикла, индукция этого фермента некоторыми агентами, повреждающими ДНК, и каталитические свойства указывают на репаративную функцию ДНК-полимеразы р. Обработка клеточной культуры хомяка агентом алкилирующим ДНК М-метил-1М'-нитро-М-нитрозогуанидином (MNNG) индуцирует экспрессию гена ДНК-полимеразы р и повышает клеточный уровень фермента (Narayan et al., 1995 ). Активность ДНК-полимеразы р также коррелирует с изменением количества одноцепочечных разрывов в ядерной ДНК клеток печени после их обработки афлатоксином В-1 (Webster and Bhattacharya, 1995).

Мутантные формы ДНК-полимеразы р являются характерной особенностью "мутантного" фенотипа клеток в канцерогенезе. Причиной этих мутаций часто являются делеции в области каталитического центра как, например, в случае колоректального рака, рака груди и простаты (Wang and Banerjee, 1995), либо аминокислотные замены в карбоксильном домене фермента (Sweasy and Yoon, 1995), которые приводят к дефектам в ДНК-синтезирующей активности фермента. Возникновение разного рода стабильных генетических изменений в структуре гена ДНК-полимеразы р

может быть связано с его полиморфизмом. В гене ДНК-полимеразы ß человека были обнаружены 6 таких полиморфных районов (Dobashi et al.,

1995). С другой стороны, мутантная форма ДНК-полимеразы ß может быть получена вследствие альтернативного сплайсинга мРНК. В клеточной линии рака мозга человека обнаружены 8 изоформ мРНК для ДНК-полимеразы ß, в семи из них отсутствуют экзоны, кодирующие первые 20 - 60 аминокислот, а в экзоне V восьмой изоформы присутствует вставка 19 н.о. (Chyan et al.,

1996).

Структурная организация и свойства ДНК-полимеразы ß

Нативная ДНК-полимераза ß организована в 4 структурно и функционально отличающихся домена. Мягкий протеолиз ДНК-полимеразы ß крыс приводит к образованию N-концевого 8 кДа -домена и С-концевого 31 кДа-домена. Дальнейший протеолиз 31 кДа-домена расщепляет его на 6, 10 и 12 кДа-фрагменты (расположение последовательно or N - к С-концу) (Srivastava et al., 1996). 8кДа домен ответственен за связывание с он ДНК и дн ДНК (Pelletier et al., 1996). Каталитический центр нуклеотидилтрансферазной реакции расположен в 10 «Да-домене, но в связывании dNTP участвуют также 4-40 аминокислоты 8 кДа-фрагмента и 263 - 280 аминокислоты 12 кДа-фрагмента (Menge et al., 1995; Srivastava et al., 1996). ДНК-полимеразная активность фермента локализована в двух последних С-концевых доменах. Эта активность, как и активность фермента в реакции эксцизионной репарации основания in vitro, специфически подавляется 14 кДа -N-концевым доменом фермента, который не влияет при этом ни на остальные ДНК-полимеразы млекопитающих, ни на ДНК-полимеразу I Е. coli (Husain et al., 1995). В одном и том же 8 кДа-домене локализованы две активности фермента - ДНК-связывающая и дезоксирибофосфатазная, обнаруженная недавно (Matsumoto and Kim,

1995). Для каталитического центра дезоксирибофосфатазной активности характерна Lys-богатая область, аминокислотные остатки которой His34, Lys35, Lys68 и Lys72 непосредственно участвуют в освобождении dRp (Mullen et al., 1997). Гидролиз АР-сайта зависит от концентрации Мд2+ и подавляется в присутствии ЭДТА в реакционной среде.

ДНК-полимераза р не чувствительна к афидиколину, сульфгидрильным агентам, солям и BuAdATP или BuPhedGTP, но чувствительна к d2TTP. ДНК-полимераза р - низкопроцессивный фермент, который присоединяет к праймер-матрице всего лишь один нуклеотид за один цикл связывания. Ее процессивность зависит от присутствия ионов металлов в реакционной среде: она в 5 раз выше в реакции с Мп2+чем с Mg2+ (Wang, 1991). Сочетание способности к дистрибутивному синтезу ДНК и наличия 5'-дезоксирибофосфатазной активности делают ДНК-полимеразу р идеальным ферментом для репарации с вырезанием основания, "short-patch" репарации, где происходит замена только одного нуклеотида с неправильным основанием. Показано, что она эффективно репарирует неспаренные пары нуклеотидов типа G:U, где уридин является продуктом дезаминирования цитозина (Singhal et al., 1995), а также модифицированные алкилирующими агентами основания (Narayan et al., 1996) и образованные под действием у-облучения окисленные АР-сайты (Klungland and Lindahl, 1997). Однако при определенных условиях дистрибутивная ДНК-полимераза Р способна осуществлять и процессивный синтез ДНК, застраивая сразу от 4 до 6 нуклеотидов в районе бреши - "long-patch" репарация. 8 кДа домен ДНК-полимеразы р в присутствии ионов Мд2+ обладает сродством к фосфорилированному 5'-концу бреши, когда размер бреши составляет 1-5 нуклеотидов (Matsumoto and Kim, 1995). "Чувствуя" оба конца бреши, ДНК-полимераза р застраивает ее в ходе процессивного синтеза. Однако синтез

дистрибутивен, когда субстрат является праймер-матрицей с длинным однонитевым участком.

В отличие от ДНК-полимераз а, 5 и s, которые останавливаются, достигая группы с1(СрО)-цисплатина в составе гена HRAS человека в условиях in vitro, ДНК-полимераза ß успешно преодолевает этот модифицированный участок (Hoffmann et al., 1995). Таким образом, она является единственной из ядерных ДНК-полимераз, способной продолжить синтез "прерванных" продуктов репликации других ДНК-синтезирующих ферментов, что еще раз подтверждает ее роль в устранении повреждений в структуре ДНК.

ДНК-полимераза ß не отличается высокой точностью синтеза ДНК (Werneburg et al., 1996). Репликация in vivo нерепарированных повреждений О6 -метилгуанина (m(6)dG), осуществляемая ДНК-полимеразой ß, может привести к мутациям (Singh et al., 1996). Против m(6)dG ДНК-полимераза ß предпочтительнее встраивает dTMP по сравнению с dCMP. Когда вместо нормального AP-сайта используется его синтетическое производное тетрагидрофуран, ДНК-полимераза ß дуплицирует нуклеотид, комплементарный нуклеотиду, предшествующему AP-сайту (Efrati et al., 1997). Отмечено, что точность синтеза ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразой ß повышается, когда вместо Мд2+ в реакционной среде присутствует Mn2+ (Wang, 1991).

Представления о том, что ДНК-полимераза ß является исключительно репаративной ДНК-полимеразой, начали менятся с появлением ряда данных, указывающих на то, что она способна участвовать и в репликативных, и в рекомбинационных событиях клетки. ДНК-полимераза ß участвует в процессинге фрагментов Оказаки и в рекомбинации ДНК (Nowak, 1990); она способна заменить ДНК-полимеразу I в клетках Е. coli, мутантных по этому гену, инициируя репликацию ДНК с З'-конца РНК/ДНК-гибрида в

районе ori репликации (Sweasy et al., 1995). Кроме того, высокий уровень экспрессии ДНК-полимеразы ß в семенниках мышей и крыс указывает на ее возможное участие в процессе мейоза млекопитающих. С помощью антител к ДНК-полимеразе ß установлено, что фермент находится в дискретных участках гомологичных хромосом на стадии синапса и профазы 1-ого деления мейоза (Plug et al., 1997), что не исключает его прямого участия в событиях, связанных с синапсом и рекомбинацией хромосом. Афидиколин-устойчивая репликация ДНК обнаружена в таких дифференциированных клетках, как бластоцисты млекопитающих и клетки щитовидной железы (Shadan and Villarreal, 1996). Предполагается, что ДНК-полимераза ß может играть роль в клеточной дифференцировке, участвуя возможно в субгеномной репликации ДНК.

2.3.2. ДНК-полимеразы § и в

ДНК-полимеразы бив отличаются от а и ß наличием корректирующей 3'->5'-экзонуклеазной активности. Они обе чувствительны к афидиколину и практически нечувствительны к BuAdATP или BuPhedGTP (Welser et al., 1991; Syvaoja et al., 1990). Активность ДНК-полимеразы 5 стимулируется 10%-ным диметилсульфоксидом (DMSO), в то время как активность ДНК-полимеразы в ингибируется этим реагентом (Weiser et al., 1991). ДНК-полимераза 5 представляет собой гетеродимер с каталитической единицей 125-130 кДа и второй субъединицей 48 - 50 кДа с неизвестной функцией (Hindges and Hubsher, 1997а). ДНК-полимераза в, выделенная из клеток HeLa, также содержит два полипептида - каталитически активный - 215 кДа и полипептид 55 кДа (Chui and Linn, 1995). ДНК-полимеразы бив исключительно консервативны в эволюционном развитии (Hindges and

Hubsher, 1997a). Для малой субъединицы ДНК-полимеразы 5 показано 96%-ная гомологии первичной структуры фермента среди млекопитающих и 57%-ная - между дрожжами и млекопитающими (Hindges and Hubsher, 1997b). Показано взаимодействие 125 «Да-каталитической субъединицы фермента с 50 кДа-субъединицей с помощью двухгибридной системы дрожжей (Hindges and Hubsher, 1997b). ДНК-полимеразная и 3'-»5'-экзонуклеазная активности обеих ДНК-полимераз локализованы в высокомолекулярном полипептиде (Wang Т., 1991). Обе ДНК-полимеразы, обладая структурным сходством, различаются как в отношении предпочтительного субстрата - для ДНК-полимеразы 5 это poly(dA-dT), а для ДНК-полимеразы s - poly(dA)*oligo(dT), так и по своей процессивности. ДНК-полимераза 5 имеет низкую процессивность на длинных однонитевых праймер-матрицах, однако в присутствии репликативного фактора PCNA ее процессивность возрастает примерно в 10 раз (Zhang P. et al., 1995). Процессивность ДНК-полимеразы s высока в отсутствие PCNA и при низкой концентрации Мд 2+ в реакционной среде (Syvaoja et al., 1990). PCNA ингибирует ДНК- полимеразу е на 20 -65%, причем эффект зависит от молярного соотношения РС1ЧА:ДНК-полимераза. Это ингибирование максимально при соотношении 1:1, что указывает на возможное взаимодействие двух белков (Syvaoja et al., 1990).

С помощью экспрессии делеционных мутантов по ДНК-полимеразе б в клетках Sf9 мышей установлено, что первые 182 аминокислоты N-концевой области каталитического полипептида ДНК-полимеразы 5 ответственны за связывание PCNA (Zhang S. et al.,1995), С-концевой домен менее консервативен и содержит два участка связывания ДНК. N-концевой домен ДНК-полимеразы s обеспечивает ДНК-полимеразную активность фермента (Navas et al., 1995), а ее С-концевой домен необходим для вступления репликативного аппарата клетки в S-фазу клеточного цикла.

Синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой Б, зависит от присутствия трех репликативных факторов PCNA, RP-A и RF-C в реакционной среде (Podust et al., 1992). Репликативные факторы RP-A и RF-С слабо стимулируют ДНК-полимеразную активность и процессивность ДНК-полимеразы е как на праймированной матрице ДНК фага М13, так и на poly(dA)*oligo(dT) (Chui and Linn, 1995). При этом совместное действие всех трех факторов - PCNA, RP-A и RF-C увеличивает в два раза активность фермента, так как благоприятствует связыванию фермента с ДНК-праймером (Maga and Hubscher, 1995).

Высокая степень функциональной и структурной гомологии между ДНК-полимеразами 5 и в и их способность образовывать комплекс с одними и теми же вспомогательными белками - PCNA, RP-A и RF-C предполагает их функционирование в хромосомной репликации ДНК и в процессах, связанных с ее репарацией. Репликативный фактор С (RF-C) представляет собой гетеропентамерный белок, обладающий АТР-азной активностью, стимулируемой PCNA (Podust et al., 1992). RF-C в присутствии PCNA и ATP способен связываться с З'-ОН концом праймера на ДНК, "покрытым" SSB-белком (RP-A) (Tsurimoto and Stillman, 1991). Все пять субъединиц этого фактора имеют в своей С-концевой области консервативные PCNA-связывающие участки (Fotedar et al., 1996). В настоящее время продемонстрировано взаимодействие 36 кДа-субъединицы RF-C с С-концевой областью PCNA (Mossi et al., 1997). Недавно показано, что фосфорилирование PCNA-связывающего домена RF-C Са2+-кальмодулин-зависимой протеинкиназой II (СаМКП) ингибирует связывание PCNA с RF-C и как следствие ингибирует PCNA-зависимый синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами бив (Maga et al., 1997). С другой стороны, RF-C в комплексе с PCNA и ДНК недоступен для фосфорилирования СаМКИ. Таким

образом, фосфорилирование PCNA-связывающего домена RF-C, вероятно, является способом регуляции PCNA-зависимого синтеза ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразами 5 и s.

Выше было отмечено, что ДНК-полимераза s способна удлинять праймер в отсутствие белка PCNA. Интересно, что присутствие в реакционной среде белка RP-A, связывающего однонитевую ДНК, делает синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой s, также зависимым от PCNA, RF-C и ATP (Podust et al., 1992; Shivji et al., 1995). Кроме того, продукты ДНК-полимеразы s в отсутствие вспомагательных белков значительно короче, чем в случаях PCNA-зависимого синтеза (Podust et al., 1992; Li et al., 1994), что вполне может служить указанием на регуляцию ДНК-полимеразной активности ДНК-полимеразы е путем контроля ее чувствительности к PCNA.

При оптимальных условях репликации скорость синтеза ДНК холоэнзимом ДНК-полимеразы ев 10 раз ниже скорости синтеза, катализируемого холоэнзимом ДНК-полимеразы 5 (Podust et al., 1992). Все эти данные указывают на разну роль этих ДНК-полимераз в репликативном и репаративном синтезе ДНК. В репликации ДНК это различие выражается в участии этих ферментов в двух разных репликативных комплексах, обеспечивающих синтез лидирующей и запаздывающей цепи ДНК. Высокая скорость и высокая процессивность синтеза ДНК-полимеразой 5 обеспечивают элонгацию лидирующей цепи ДНК (Tsurimoto et al., 1990). Для синтеза запаздывающей цепи необходимо совместное действие двух полимераз - ДНК-полимеразы а-праймазы и ДНК-полимеразы е (Burgers, 1991). В "зоне Оказаки" несколько фрагментов Оказаки одновременно инициируются несколькими комплексами репликазы. ДНК-полимераза а синтезирует короткие фрагменты ДНК, РНК-праймер которых удаляется РНКазой Н. Фрагменты остающейся ДНК используется для дальнейшей

элонгации ДНК-полимеразой е. В узнавании З'-ОН конца праймера, "покрытого" SSB-белком, участвуют PCNA, RF-C и АТР, образуя так называемый "комплекс узнавания праймера" (Maga and Hubscher, 1995). Ясно, что для синтеза фрагментов запаздывающей цепи, где концентрация праймеров высока, более необходимо аккуратное застраивание, чем высокая скорость репликации. Интересно, что частота ошибок при синтезе запаздывающей цепи значительно ниже в сравнении с лидирующей цепью (Izuta et al„ 1995).

Существуют данные о том, что способность ДНК-полимераз 8 и s в составе холоэнзимов взаимодействовать с двухнитевым субстратом, содержащим бреши, определяется геометрией этого субстрата (Podust L. et al., 1994). Так, кольцевая структура субстрата благоприятствует этому взаимодействию, и синтез, осуществляемый обеими ДНК-полимеразами, продуктивен, в то время как линеаризация кольцевой ДНК приводит к прерыванию синтеза, катализируемого ДНК-полимеразой 5, а ДНК-полимераза е не формирует холоэнзим с PCNA и RF-C. В то же время переход ДНК из кольцевой в линейную форму снимает ингибирующий эффект PCNA и RF-C на ДНК-полимеразу а. Разный эффект PCNA и RF-C на активность ДНК-полимераз в случаях кольцевого и линейного двухнитевого субстрата говорит о том, что эти три ДНК-полимеразы требуют различной конфигурации ДНК в районе репликативной вилки и что вспомогательные белки способны образовывать подвижную "платформу", легко перемещающуюся вдоль дн ДНК, позволяя или запрещая синтез ДНК определенной ДНК-полимеразой в конкретном участке ДНК.

Экспрессия ДНК-полимеразы 8 в клеточном цикле регулируется на стадии транскрипции (Zeng et al., 1994). Уровень мРНК фермента, как и его количество сильно возрастает на границе GI/S-фазы. Время полужизни

мРНК и белка ДНК-полимеразы 5, соответственно, 8 и 10 ч. Интересно, что экспрессия PCNA в ходе клеточного цикла коррелирует с экспрессией ДНК-полимеразы 8, однако количество белка PCNA стабильно увеличивается и остается высоким к G2/M. Кроме того, оказалось, что ДНК-полимераза 5 представляет собой фосфопротеид, наибольшая степень фосфорилирования которого относится KS-фазе. Количество мРНК для ДНК-полимеразы s в клеточном цикле также меняется, достигая своего максимума непосредственно перед клеточным делением (Chui and Linn, 1995). Уровень ее транскрипта в пролиферирующих клетках HeLa в 5-16 раз выше в сравнении с уровнем мРНК в "покоящихся" клетках и клетках фибробластов.

3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы 8 и е ингибируется афидиколином (Sabatino et al., 1990). При этом афидиколин ингибирует деградацию только двухнитевой ДНК и не влияет на вырезание нуклеотидов из однонитевой ДНК. 3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз б и е также ингибируется AMP, в то время как их ДНК-полимеразная активность стимулируется AMP (Sabatino and Bambara, 1988; Lee and Toomey, 1987; Grute et al., 1986). 3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы 8 регулируется вспомагательными факторами, входящими в состав холоэнзима (Lee, 1993). В отсутствие вспомагательных факторов 3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы 8 низка. Однако в присутствии SSB-белка RP-A, она возрастает в 8-10 раз. Интересно, что если для ДНК-полимеразной активности фермента происхождение RP-A не имеет особого значения, то для 3'->5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы 8 человека это условие очень важно - она проявляется только в присутствии SSB-белка человека. Кроме того, 3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы 8 ингибируется BuPhedGTP. RF-C и PCNA по отдельности и вместе не влияют на 3'-»5'-экзонуклеазную активность фермента. Однако

как PCNA, так и RF-C снимают стимулирующий эффект RP-A на экзонуклеазную активность. 3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы 5 также ингибируется в присутствии dNTP, но не АТР. Присутствие PCNA и RF-C не влияет на реакцию.

2.3.3. ДНК-полимераза а

ДНК-полимераза а в комплексе с ДНК-праймазой является единственным эукариотическим ферментом, способным инициировать репликацию ДНК de novo. Уровень ее активности наиболее высок в активно пролиферирующих клетках и низок в непролиферирующих (Wang Т., 1991).

ДНК-полимераза а представляет собой комплекс из четырех субъединиц: большой субъединицы (165-180 «Да), субъединицы 70 кДа и двух малых субъединиц (приблизительно 48-50 и 55-60 кДа). ДНК-полимеразная активность связана с большой субъединицей. Часто ей сопутствует набор протеолитических полипептидов, молекулярная масса которых варьирует от 140 до 160 кДа. Изоэлектрическая точка фермента находится в диапазоне pi 5.5-6.2. Определенная на основании последовательности кДНК первичная структура каталитической субъединицы 180 кДа из клеток FM3A обнаруживает 88, 38 и 32% гомологии с каталитическими полипептидами ДНК-полимераз а человека, дрозофилы и дрожжей, соответственно (Miyazawa, 1993). Функция субъединицы 70 кДа неизвестна. С двумя малыми субъединицами связана праймазная активность, при этом субъединица 48 кДа непосредственно осуществляет праймирование ДНК (Wang Т., 1991). Субъединица 58 кДа участвует в связывании инициирующего пуринового нуклеотида. Она также влияет на скорость полимеризации и стабильность продукта, синтезируемого 48 кДа

субъединицей. ДНК-полимераза а представляет собой фосфопротеин, фосфорилированный преимущественно по Ser. Уровень фосфорилирования фермента различается на разных стадиях клеточного цикла - он в три раза выше в клетках поздней S-фазы, чем в клетках на стадии G2 и М (Park, 1995), при этом сайты фосфорилирования ДНК-полимеразы а в S- и G2/M-клетках неодинаковы.

Ферментативные свойства ДНК-полимеразы а

ДНК-полимераза а отличается от ДНК-полимеразы р высокой чувствительностью к сульфгидрильному агенту N-этилмалеимиду и низкой чувствительностью к d2TTP, от ДНК-полимеразы у - чувствительностью к афидиколину и низкой чувствительностью к d2TTP; от ДНК-полимераз 5, е ид- чувствительностью к аналогам нуклеотидов BuAdATP и BuPhedGTP. Оптимальной матрицей для ДНК-полимеразы а является ДНК, активированная ДНКазой. ДНК-полимераза ос является ДНК-зависимым ферментом и не использует в качестве матрицы poly(A). Четырехсубъединичная ДНК-полимераза а эффективно утилизирует матрицы с высокой концентрации праймера. Однако при использовании матриц, содержащих протяженные участки однонитевой ДНК, эффективность ее крайне низка. Это согласуется с данными о невысокой процессивности фермента в условиях in vitro. Однако ДНК-полимераза а становится высокопроцессивной на матрице poly(dA)-oligo(dT) или на ДНК фага М13 при рН 6.0 в присутствии 1мМ MgCI2 (Sabatino et al., 1988). Методом "защиты от ДНКаз" определен участок связывания ДНК-полимеразы а с ДНК. ДНК-полимераза а защищает от гидролизного расщепления ДНКазой I 9 н.о. из состава праймера, 13 н.о. из дуплексного участка матрицы и 14 н.о. однонитевой ДНК (Thompson et al., 1995).

ДНК-праймаза образует прочный комплекс с ДНК-полимеразой а, который часто называют ДНК-репликазой. Образование комплекса праймазы с ДНК-полимеразой подавляет синтез мультимерных праймеров и приводит к уменьшению длины праймеров (Cotterill, 1987).

Четырехсубъединичный комплекс ДНК-полимераза а - праймаза лишен других активностей помимо ДНК-полимеразной и ДНК-праймазной (Bialek and Grosse, 1992). Однако в высокомолекулярных формах ДНК-полимеразы а найдены и другие энзиматические активности. Так, из клеток дрожжей S. cerevisiae выделен 650 кДа-репликативный комплекс, в котором помимо ДНК-полимеразы а и праймазы присутствуют 5'->3'-экзонуклеазная и АТР-азная активности (Biswas et al., 1993). Сочетание всех этих активностей соответствует активностям, необходимым репликативному комплексу для синтеза и удлинения праймеров запаздывающей цепи. 3'-»5'-экзонуклеазную активность также можно регистрировать на ранних этапах очистки комплекса, однако в ходе выделения она быстро исчезает. 5'->3'-экзонуклеаза этого высокомолекулярного комплекса была недавно выделена и охарактеризована (Zhu et al., 1997). Она связана с полипептидом 47 кДа, который идентичен RTH1 нуклеазе дрожжей. Нативная экзонуклеаза обладает также эндонукпеазной активностью, подобной RTH1 нуклеазе и эндонуклеазе млекопитающих. 5'->3'-экзонуклеаза делает специфические паузы в процессе вырезания нуклеотида, задерживаясь в G:C богатых районах ДНК. Однако функциональная связь найденных активностей с ДНК-полимеразой а не показана.

Представляет интерес обнаружение у субъединицы 182 кДа ДНК-репликазы дрозофилы корректирующей 3'->5'-экзонуклеазной активности, которая проявляется только при диссоциации субъединицы 73 кДа (Cotterill, 1987). С этим наблюдением согласуется тот факт, что точность синтеза

изолированной субъединицей 182 кДа в 100 раз выше, чем у четырехсубъединичного фермента. С ДНК-полимеразой а также ассоциирован белок Р1, гомолог белка МСМЗ дрожжей (Kimura et al., 1994), внутриядерное распределение которого зависит от степени его фосфорилирования. В ранних эмбрионах дрозофилы обнаружен другой 130 кДа-полипептид, который ассоциирован с 180 кДа-каталитической субъединицей ДНК-полимеразы а - праймазы (Kuroda and Ueda, 1995). Интересно, что уровни экспрессии 180 «Да, 72 кДа и 130 кДа-полипептидов коррелируют в интерфазе и митотической фазе клеточного цикла.

Выделенная из клеток на стадии прометафазы 1-ого деления мейоза базидиомицета Coprinus cinereus ДНК-полимераза а имеет молекулярную массу 135 кДа и не обладает праймазной активностью (Sawado and Sakaguchi, 1997). Ее биохимические свойства идентичны свойствам комплекса ДНК-полимераза ос - праймаза с той разницей, что она не утилизирует активированную ДНК. Выделение ДНК-полимеразы а из клеток на стадии прометафазы 1-ого деления мейоза только в форме каталитического полипептида предполагает диссоциацию комплекса ДНК-полимераза а - праймаза в ходе мейоза.

Фосфорилирование ДНК-полимеразы а - праймазы рассматривается как способ регуляции инициации ДНК-репликации. Фосфорилирование р180 и р68 субъединицы этого комплекса циклин А-зависимыми киназами представляет одну из возможных моделей этой регуляции (Voitenleitner et al., 1997).

Отсутствуют сведения о том, что ДНК-полимераза а участвует в процессах репарации ДНК. Однако имеется большое количество данных о том, что она соочищается с 5'->3'-, 3'->5'- экзонуклеазами и эднонуклеазой, что не исключает ее роль в репарации ДНК. Вполне возможно, что ДНК-

полимераза а способна застраивать бреши, образованные этими нуклеазами в процессе репарации ДНК.

2.3.4. ДНК-полимераза £

Впервые ДНК-полимераза £ выделена из тимуса теленка (Bialek and Grosse, 1993). Этот фермент первоначально идентифицирован как корректирующая 3'->5'-экзонукпеаза, которая соочищалась с комплексом ДНК-полимераза а - праймаза. Разделение двух активностей достигнуто на оксиапатите и при ультрацентрифугировании в градиенте глицерина. 3'-»5'-экзонуклеазная активность выделенного фермента оказалась ассоциирована с ДНК-полимеразой, которая по своим свойствам отличается от уже известных типов ДНК-полимераз.

При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии Ds-Na в препарате ДНК-полимеразы £ выявлялись три мажорных полипептида с молекулярными массами 66, 40 и 35 кДа, количество которых коррелировало с экзонуклеазной и с ДНК-полимеразной активностью фермента. Поскольку количество полипептидов 40 и 35 кДа увеличивалось в ходе очистки, можно предположить, что они являются результатом протеолитической деградации полипептида 66 кДа. Коэффициент седиментации ДНК-полимеразы £в градиенте глицерина составляет 6 S. На основании величины коэффициента седиментации и радиуса Стокса вычислена молекулярная масса нативного белка, которая составила 120 кДа. Эта величина согласуется с предположением, что ДНК-полимераза £ представляет собой димер, состоящий из двух субъединиц 66 кДа.

Обе активности ДНК-полимеразы £ строго дистрибутивны. В отличие от ДНК-полимеразы 6 процессивность ДНК-полимеразы £ не увеличивается в

присутствии PCNA. Подобно ДНК-полимеразам а, 8 и е ДНК-полимераза q чувствительна к афидиколину, но в отличие от ДНК-полимеразы а она не ингибируется BuAdATP. От ДНК-полимеразы 8 и s ДНК-полимераза с, отличается высокой чувствительностью обеих ее активностей к AMP и GMP (ингибирование более чем на 90% в присутствии 5 мМ AMP), в то время как ДНК-полимеразная активность ДНК-полимераз 8 и s стимулируется в присутствии AMP (Sabatino and Bambara, 1988; Lee and Toomey, 1987). Афидиколин ингибирует только деградацию двухнитевого субстрата ДНК, не влияя на гидролиз однонитевой ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами 8 и е. В случае ДНК-полимеразы £ он блокирует гидролиз обоих субстратов. 10% DMSO слабо стимулирует экзонуклеазную и ДНК-полимеразную активности ДНК-полимеразы в то время как он подавляет синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой в.

Изучение матричной специфичности ДНК-полимеразы £ показало, что в отличие от ДНК-полимеразы 8 она не утилизирует матрицу poly(dA-dT) ни в присутствии, ни в отсутствие PCNA. Не обнаруживается ее активность и на активированной ДНК, которая является оптимальным субстратом для ДНК-полимеразы а. Наибольшая активность ДНК-полимеразы % наблюдалась на матрице poly(dA)*(dT)2o. При этом удельная полимеразная активность фермента была низкой и составляла 400 ед/мг. 3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы £ имеет свойства корректирующей активности: она удаляет мононуклеотиды в направлении от З'-конца к 5'-концу дистрибутивным образом, более эффективно деградирует однонитевую ДНК по сравнению с двунитевой и на синтетических матрицах с затравками удаляет неправильно спаренные З'-концевые нуклеотиды в 20 раз быстрее, чем правильно спаренные. В ходе синтеза ДНК отношение встроенных нуклеотидов к удаленным составляет приблизительно 1:3, что

свидетельствует о том, что синтез протяженных цепей ДНК не является основной функцией этого фермента. По мнению авторов, наиболее вероятным кажется предположение, что ДНК-полимераза £ участвует в репарации ДНК, заменяя неправильно встроенные З'-концевые нуклеотиды.

Известно, что ДНК-полимераза а плохо утилизирует матрицы с неправильно спаренным З'-концом (Perrino and Loeb, 1989). В присутствии ДНК-полимеразы £ эффективность утилизации таких матриц сильно возрастает, по-видимому за счет ее корректирующей активности. Хотя данных о взаимодействии двух ферментов in vivo пока нет, их соочищение на протяжении пяти хроматографических стадий, а также часто наблюдаемое присутствии экзонуклеазной активности в высокоочищенных препаратах ДНК-полимеразы a (Brooke, 1991; Bialek and Grosse 1992), позволили высказать предположение, что соочищение двух ферментов не случайно и что ДНК-полимераза возможно, выполняет функцию корректора ДНК-полимеразы а в клетке (Bialek and Grosse, 1993).

В 1994 г. Шарова Н. П. с соавт. (Шарова и др., 1994) опубликовали данные о том, что обнаруженная в икре костистой рыбы вьюн ДНК-полимераза по чувствительности к ингибиторам, низкой процессивности и наличии высокой 3'->5'-экзонуклеазной активности соответствует ДНК-полимеразе выделенной из тимуса теленка. Различие наблюдалось только в эффективной утилизации активированной ДНК ферментом из икры вьюна, что не характерно для ДНК-полимеразы ¿Гиз тимуса теленка.

В 1996 г. обнаружена новая ДНК-полимераза дрожжей, кодируемая геном REV3 (Nelson et al., 1996). Ранее установлено, что последовательность гена REV3, кодирующая полипептид с молекулярной массой 173 кДа, гомологична генам ДНК-полимераз типа а, 5 и г (Morrison et al., 1989). Долгое время не удавалось выделить продукт этого гена. Новая ДНК-полимераза

изолирована в виде гибридного белка пришитого к глутатион-Б-трансферазе (Gst-Rev3p) с суммарной молекулярной массой ~205 «Да. При использовании двухгибридной системы дрожжей обнаружено, что Gst-Rev3p взаимодействует с продуктом гена REV7 с молекулярной массой 29 кДа. ДНК-полимеразная активность комплекса Gst-Rev3p:Rev7p в 30 раз выше и намного стабильнее, чем белка Gst-Rev3p. Комплекс Gst-Rev3p:Rev7p был назван ДНК-полимеразой £ Его коэффициент седиментации 13 S. Разрезание тромбин-чувствительного сайта в Gst-Rev3p увеличивало всего в два раза ДНК-полимеразную активность белка Rev3p, поэтому все результаты, описанные авторами, получены с использованием более устойчивого комплекса Gst-Rev3p:Rev7p .

ДНК-полимераза £ дрожжей - непроцессивный фермент, который обладает 3'->5'-экзонуклеазной активностью. В сравнении с другими ДНК-полимеразами, которые останавливаются, встречая тиминовые димеры в составе ДНК, ДНК-полимераза £ дрожжей "преодолевает" их в 10% случаев. В виду отсутствия корректирующей активности фермента, такой синтез приводит к мутациям. ДНК-полимераза if дрожжей предпочтительнее утилизирует короткие праймер-матрицы. Продукты дистрибутивного синтеза при этом могут иметь длины до 200 н.о. ДНК-полимераза £ дрожжей нечувствительна к афидиколину подобно ДНК-полимеразам р и у и также нечувствительна к d2TTP. К BuAdATP она слабо чувствительна (при 10мкМ -72% остаточная активность). Фермент практически неактивен на активированной ДНК, poly(dA)*oligo(dT) и poly(dA)*oligo(A).

Сравнение ДНК-полимеразы ^ из тимуса теленка и ДНК-полимеразы £ дрожжей позволяют сделать вывод о том, что это разные ферменты, так как чувствительность к ингибиторам и энзиматические свойства этих ферментов принципиально различаются. Эти ферменты предпочитают различные

праймер-матрицы и отличаются по чувствительности к афидиколину. Кроме того, у ДНК-полимеразы £ дрожжей отсутствует корректирующая функция. В этой работе мы сохраним первоначальное обозначение исследуемого нами фермента как ДНК-полимеразы £ в соответствии с обозначением предложенным ранее для фермента, выделенного из тимуса теленка.

2.4. ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В РАННЕМ РАЗВИТИИ ЖИВОТНЫХ

Изменение ДНК-синтезирующего аппарата в процессе развития изучено мало. Особенности репликативного синтеза ДНК в раннем эмбриональном развитии обусловлены высокой скоростью клеточной пролиферации. Так, продолжительность S-фазы на стадии бластулы у эмбрионов шпорцевой лягушки составляет 10-15 мин. (Zierler et а)., 1985), а у эмбрионов дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы - 3,4 мин. (Peck et al., 1992). Для обеспечения интенсивного синтеза ДНК на стадии дробления в ооцитах животных в отсутствие репликативного синтеза накапливается значительное количество ДНК-полимераз и других репликативных белков. Так, высокая активность ДНК-полимеразы а обнаружена в яйцеклетках иглокожих (Fansler and Loeb, 1969), дрозофилы (Banks et al., 1979), шпорцевой лягушки (Fox et al., 1980), костистых рыб (Mikhailov and Gulyamov, 1983). В неоплодотворенных яйцеклетках морского ежа Hemicentrotus pulcherrium показана связь ДНК-полимеразы а с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР) (Shloda et al., 1980). В ходе эмбриогенеза происходит транспорт ДНК-полимеразы а в ядро, причем связанная с ЭПР фракция фермента исчерпывается к окончанию стадии бластулы.

Суммарная активность ДНК-полимеразы а, приходящаяся на эмбрион, не изменяется в результате оплодотворения и сохраняется приблизительно на постоянном уровне до стадии гаструлы в эмбрионах морского ежа (Shioda et

al., 1980). В эмбрионах шпорцевой лягушки активность ДНК-полимеразы а в период дробления несколько снижается (Zierler et al., 1985). Репликативный синтез ДНК в период синхронных дроблений характеризуется следующими особенностями (Peck et al., 1992): (1) высокой скоростью репликации (за первые сутки после оплодотворения в эмбрионе шпорцевой лягушки синтезируется более 100000 ядерных эквивалентов ДНК (Dawid, 1965); (2) большим числом активных сайтов репликации (20000 на гаплоидный геном в эмбрионах дрозофилы); (3) синхронной инициацией всех репликонов; (4) обеспечением потребностей клеток в репликативных белках за счет запасов яйцеклетки; (5) отсутствием в клеточном цикле фаз G1 и G2 (Нага et al., 1980); (6) видимым отсутствием ДНК-полимераз 5 и е (Linn, 1991). Эти особенности репликации позволяют предположить, что организация ДНК-синтезирующего аппарата в дробящихся эмбрионах отличается от таковой в дифференцированных клетках. Высказано предположение, что в раннем эмбриогенезе амфибий функционирует более простой механизм репликации ДНК с использованием единственной репликативной ДНК-полимеразы а, осуществляющей прерывистый синтез обеих цепей ДНК (Gaudette and Benbow, 1986). Однако в зрелых яйцеклетках шпорцевой лягушки и в эмбрионах дрозофилы, наряду с низкопроцессивной ДНК-полимеразой а, обнаружена активность высокопрцессивной в присутствии PCNA ДНК-полимеразы 5 (Matsumoto,1994; Peck et al., 1992). Показано, что эмбрионы на стадии 9 ч. развития, у которых меньше активных сайтов инициации, а продолжительность S-фазы увеличена в 6 раз по сравнению с эмбрионами на стадии 2 ч. развития, также содержит две репликативные ДНК-полимеразы, не отличимые по свойствам от ферментов, выделенных на более ранней стадии развития. Присутствие ДНК-полимераз а и 5 в эмбрионах дрозофилы позволяют предположить, что высокая скорость

репликации ДНК обусловлена у них не особой организацией репликативного ансамбля, а увеличенным числом сайтов инициации репликации. Высказано предположение, что активация ДНК-полимераз и сайтов инициации репликации в раннем развитии контролируются путем посттрансляционной модификации. Не исключено, что низкое содержание ДНК-полимеразы 5 в клетках по сравнению с ДНК-полимеразой а, показанное для клеток человека, дрозофилы и дрожжей (Bauer et al., 1988; Syvaoja et al., 1990; Peck et al., 1992), и ее повышенная чувствительность к протеолизу при выделении (Bauer et al., 1988) является причиной, по которой ДНК-полимераза б до сих пор не обнаружена в эмбрионах других животных.

На стадии нейрулы у эмбрионов шпорцевой лягушки происходит увеличение продолжительности S-фазы пропорционально увеличению числа делящихся клеток (приблизительно в 12 раз по сравнению со стадией бластулы). Высказано предположение, что к стадии гаструляции количество ДНК-полимеразы а, приходящееся на клетку, становится фактором, лимитирующим скорость репликации ДНК (Zierler et al., 1985), и что, таким образом, возникает потребность в ресинтезе ДНК-полимеразы а. У эмбрионов морского ежа на стадии гаструляции активность ДНК-полимеразы а, приходящаяся на эмбрион, возрастает в два раза. Показано, что увеличение активности фермента связано не с его модификацией или наличием стиулирующих факторов, а с его ресинтезом на стадии гаструлы (Shioda et al., 1982). В эмбрионах шпорцевой лягушки постепенное повышение активности ДНК-полимеразы ос, приходящейся на эмбрион, происходит перед выклевом (Zierler et al., 1985).

Активность ДНК-полимеразы ß в процессе оогенеза у шпорцевой лягушки увеличивается примерно в 15 раз и затем практически не изменяется в ходе эмбриогенеза (Zierler et al., 1985). У вьюна в зрелых яйцеклетках удельная

активность ДНК-полимеразы ß крайне низка (Mikhailov and Gulyamov, 1983). К началу органогенеза (20 ч. развития) она увеличивается примерно в три раза, но остается низкой по отношению к удельной активности в дифференцированных клетках. В эмбрионах морского ежа Strongylocentrorus purpuratus активность ДНК-полимеразы ß удваивается сразу после оплодотворения и дополнительно возрастает на стадии ранней бластулы (Hobart and Infante, 1978).

При дифференцировке клеток и прекращении пролиферации активность ДНК-полимеразы а уменьшается. Так, активность ДНК-полимеразы а не обнаруживается после прекращения пролиферации в клетках сердечной мышцы и нейронах головного мозга крысы (Hubscher et al., 1977; Claycomb, 1979). В то же время в клетках печени крысы ее активность резко возрастает в постнатальный период в связи с началом клеточной пролиферации . При дифференцировке клеток куриных эмбрионов происходит быстрый распад репликативного аппарата клеток и деградация ДНК-полимеразы а, но не ß (Matsukage et al., 1986). У вьюна не обнаруживается активность ДНК-полимеразы а в клетках печени рыб, содержавшихся в течение нескольких месяцев при 4°С (Mikhailov and Gulyamov, 1983). Активность ДНК-полимеразы ß при этом остается высокой. Исследование активности ДНК-полимеразы 5 в развивающихся нейронах крысы, которые прекращают пролиферацию еще в пренатальный период, показало, что динамика изменения ее активности очень сходна с динамикой изменения активности ДНК-полимеразы а. (Spadarl et al., 1988). Активность обоих ферментов в клетках резко уменьшается с прекращением пролиферации и не обнаруживается через три недели после рождения. Эти данные свидетельствуют о том, что активность репликативных ДНК-полимераз коррелирует с пролиферативным состоянием клетки.

Таким образом, в раннем развитии многоклеточных животн наблюдается закономерное изменение активности ДНК-полимераз, котор по-видимому, отражает изменения в характере синтезе ДНК.

2.5. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС И РЕПАРАЦИИ ДНК

Источники окислительного стресса могут иметь эндогенную и экзогенную природу (Demple and Harrison, 1994; Thomas, 1997). Несмотря на функционирование антиоксидантных механизмов защиты, в клетках организма постоянно происходят повреждения, вызванные токсичными радикалами кислорода. Повреждения, связанные с активными формами кислорода (АФК), т.е. молекулами, в которых он неполностью восстановлен (ОН, 02", Н202 и др.) могут стимулировать развитие рака, а в высоких концентрациях вызывают гибель клетки (Dreher and Junod, 1996). Контроль образования ОН в клетке осуществляется путем регуляции уровня 02" и перекиси водорода. 02"' образуется в ходе многочисленных ферментативных реакций и при самоокислении многих соединений, присутствующих в клетке (Fridovich, 1975). В силу меньшей химической активности 02"' более стабилен, находясь в протонированной форме; так же как и Н202, он не имеет заряда и может проходить через мембрану (Lynch and Fridovich, 1978). 02" может вызывать окислительную модификацию ряда соединений, в том числе и нуклеотидов (Fridovich, 1986; Yamane et al., 1987). Из других АФК важную роль в действии на ДНК играют перекиси и радикалы липидов, а также окись азота. При анализе окислительных модификаций ДНК под действием АФК обнаруживаются десятки продуктов помимо разрывов сахаро-фосфатных связей (Dizdaroglu, 1992). Формально они могут быть разделены на три группы:

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Димитрова, Диана Димитрова

выводы

1. В яйцеклетках и эмбрионах вьюна обнаружена ДНК-полимераза нового типа, обозначенная как ДНК-полимераза £ (дзета), которая отличается по физико-химическим и энзиматическим свойствам от описанных ранее ДНК-полимераз а, Р,у, 6 и е эукариот.

2. ДНК-полимераза £ вьюна осуществляет дистрибутивный синтез ДНК на матрице ро[у(с1А)*с1Т1о как в отсутствие, так и в присутствии репликативного фактора РСМД.

3. ДНК-полимераза вьюна обладает высокой 3'->5'-экзонуклеазной активностью. Отношение 3'->5'-экзонуклеазной к ДНК-полимеразной активности в 20 раз выше подобного соотношения у ДНК-полимеразы е человека.

4. 3'-»5'-экзонуклеаза фермента гидролизует предпочтительно однонитевые олигонуклеотиды и неспаренные З'-концевые нуклеотиды двухнитевых субстратов. Гидролиз однонитевых олиго- и полинуклеотидов осуществляется дистрибутивным образом.

5. ДНК-полимеразная и 3'-»5'-экзонуклеазная активности соосаждаются совместно при ультрацентрифугировании в градиенте 15-30%-ного глицерина с коэффициентом седиментации 6 Б, при этом обе активности коррелируют с распределением полипептида 68 кДА в градиенте.

6. С помощью нативного электрофореза с последующим электрофорезом в денатурирующих условиях показано, что в препарате ДНК-полимеразы £ вьюна ДНК-полимеразной активностью обладает полипептид с кажущейся молекулярной массой 68 кДа. Полипептид 68 кДа является слабокислым белком с изоэлектрической точкой р! 6,3.

7. Активные формы кислорода, генерируемые системой ксантина с ксантиноксидазой в эмбрионах вьюна, повышают в несколько раз активность ДНК-полимераз р и £ не влияя на активность ДНК-полимеразы а.

8. Свойства ДНК-полимеразы £ свидетельствуют о репаративной функции этого фермента. Высказано предположение, что ДНК-полимераза ^ осуществляет репарацию ДНК в клетках эмбрионов костистых рыб.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Димитрова, Диана Димитрова, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Маниатис, Т.; Фрич, Е.; Сэмбрук, Д. II Молекулярное клонирование. -1984. -Мир.

Минин, A.A.; Иваненков, В.В.; Мещеряков, В.Н. Выделение актина на разных стадиях развития вьюна // Биохимия, -1987, -т. 52, -ч. 2, -с.342-347.

Михайлов, B.C.; Гулямов, Д.Б. Выделение и характеристика ДНК-полимераз альфа, бета и гамма из клеток вьюна Misgurnus fossilis L. // Биохимия, - 1981. -т. 46, -ч. 9, -с. 1539-1547.

Михайлов, B.C.; Атаева, Д.О.; Марлыев, К.А.; Атражев, A.M. Селективное ингибирование фторид-ионом 3'->5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I Escherichia coli // Молекулярная биология, -1989, -т. 23, -ч. 1, -с.306-314

Нейфах, A.A. Использование метода радиационной инактивации ядер для исследования их функций в раннем развитии рыб // Журн. общ. биол. - 1959. -т. 20, -с.202-213.

Шарова, Н.П.; Елисеева, Е.Д.; Михайлов, B.C. Взаимоотношение двух форм ДНК-полимеразы альфа из икры костистой рыбы Misgurnus fossilis L. // Биохимия -1993. -т58. -с. 1965-1976.

Шарова, Н.П.; Елисеева, Е.Д.; Михайлов, B.C. Присутствии в яйцеклетках костистогй рыбы Misgurnus fossilis L. ДНК-полимеразы типа дзета // Биохимия -1994. -т. 59, -с. 1067-1075.

Aboussekhra, A.; Biggerstaff, M.; Shivji, M.K.K.; Vilpo, J.A.; Moncollin, V.; Podust, V.N.; Protic, M.; Hubscher, U.; Egly, J.M.; Wod, R.D. Mammalian DNA nucleotide excision repair reconstituted with purified protein components // Cell. -1995. -v. 80. -No. 6. -p.859-868

Arkin, M.R.; Stemp, E.D.A.; Pulver, S.C.; Barton, J.K. Long-range oxidation of guanine by Ru(lll) in duplex DNA // Chemistry & Biology. -1997. -v. 4. -No. 5. -p.389-400

Banks, G.R. ; Boezi, J.A.; Lehman, I.R. A high molecular weight DNA polymerase from Drozophila melanogaster embryos. Purification, structure and partial characterization //J. Biol. Chem. -1979. -v. 254. -No. 19. -p.9886-9892

Bauer, G.R.; Heller, H.M.; Burgers, M. DNA polymerase III from Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization // J. Biol. Chem. -1988. -v. 263. -p. 917-924

Beauchamp, C. ; Fridovich, I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. // Anal. Biochem. -1971. -v. 44. -No. 1. -p.276-287

Bennett, R.A.O.; Wilson, D.M.; Wong, D.; Demple, B. Interaction of human apurinic endonuclease and DNA polymerase beta in the base excision repair pathway // Proc.Natl. Acad. Sei. USA. -1997. -v. 94. -No. 14. -p.7166-7169

Bialek, G. ; Grosse, F. The DNA synthesizing subunit of polymerase - primase from calf thymus //J. Biol. Chem. -1992. -v. 267. -No. 15. -p.2915-2919

Bialek , G.; Grosse, F. An error-correcting proofreading exonuclease-polymerase that copurifies with DNA-polymerase alfa - primase // J. Biol. Chem. -1993. -v. 268,. -No. 8. -p.6024-6033

Biswas, E.E.; Chen, P.H.; Gray, W.; Li, Y.H.; Ray, S.; Biswas, S. Purification and characterization of a yeast DNA polymerase alfa complex with associated primase, 5'-3'-exonuclease, and DNA-dependent ATPase activities // Biochemistry. -1993. -v. 32. -p. 3013-3019

Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilising the principal of protein dye binding II Analyt. Biochem. -1976. -v. 72. -No. 1. -p.248-254

Brooke, R.G.; Singhal, R. ; Hinkle, D.C.; Dumas, L.B. Purification and characterization of the 180- and 86-kilodalton subunits of the Saccharomyces cerevisiae DNA primase - DNA polymerase protein complex // J. Biol. Chem. -1991. -v. 266. -No. 5. -p.3005-3015

Burgers, M.; Bambara, R.; Campbell, J.; Chang, L.; Downey, K.; Hubscher, U.; Lee, M.; Linn, S.; So, A.; Sparadi, S. Revisied nomenclature for eukariotic DNA polymerases II Eur. J. Biochem. -1990. -v. 191. -p. 617-618

Burgers, M Saccharomyces cerevisiae replication factor C. Formation and activity of complexes with proliferating cell nuclear antigen and with DNA polymerases delta and epsilon II J. Biol. Chem. -1991. -v. 266, p. 22698-22706.

Caldecott, K.W.; Aoufouchi, S.; Johnson, P.; Shall, S. XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase beta and possibly poly(ADP-ribose) polymerase, and DNA ligase III is a novel molecular 'nick-sensor1 in vitro // Nucl. Acids Res. -1996. -v. 24. -No. 22. -p.4387-4394

Carre, D. ; Signoret , J. ; Lefresne, J. David , J.C. Enzymes involved in DNA replication in the axolotl. Analysis of the forms and activities of DNA polymerase and DNA ligase during development II Develop. Biol. -1981. -v. 87. -No. 1. -p. 114125

Chui, G.; Linn, S. Futher characterization of HeLa DNA polymerase epsilon // J. Biol. Chem. -1995. -v. 270. -No. 14. -p.7799-7808

Chyan, Y.J.; Strauss, P.R.; Wood, T.G.; Wilson, S.H. Identification of novel mRNA isoforms for human DNA polymerase beta // DNA and Cell Biology. -1996. -v. 15. -No. 8. -p.653-659

Claycomb, W.C. DNA synthesis and DNA enzymes in terminally differentiating cardiac muscle cells // Exp. Cell Res. -1979. -v. 118. -No. 1. -p. 111 -114

Cotterill, S. ; Chui, G. ; Lehman, I.R. DNA polymerase-primase from embryos of Drosophila melanogaster // J. Biol. Chem. -1987. -v. 262. -No. 33. -p.16105-16108

Crute, J.J. Pyrification and characterization of two new high molecular weight forms of DNA polymerase delta // Biochemistry. -1986. -v. 25. -No. 1. -p.26-36

Davis, B.J. //Ann. N.Y.Acad.Sci. -1964. -v. 121. -p. 404-427

Dawid, I. Deoxyribonucleic acid in amfibian eggs // J. Mol. Biol. -1965. -v. 3. -p. 581-599

Demple, B. ; Harrison, L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology //Annu. Rev. Biochem. -1994. -v. 63. -p. 915-948

Deng, G.R.; Wu, R. Terminal transferase: use of the tailing of DNA and for in vitro mutagenesis. // Methods Enzymol. -1983. -v. 100. -p.96-116

Dianov, G. ; Price, A. ; Lindahl, T. Generation of single-nucleitide repair patches following excision of uracil residues from DNA // Mol. Cell Biol. -1992. -v. 12. -No. 4. -p.1605-1612

Dizdaroglu, M. Oxidative damage to DNA in mammalian chromatin. // Mutat. Res. -1992. -v. 275. -No. 3-6. -p.331-342

Dobashi, Y.; Kubota, Y.; Shuin, T.; Torigoe, S.; Yao, M.; Hosaka, M. Polymorphisms in the human DNA polymerase beta gene // Human Genetics. -1995. -v. 95. -No. 4. -p.389-390

Dreher, D.; Jinod, A.F. Role of oxygen free radicals in cancer development // European J. Concer. -1996. -v. 32A. -No. 1. -p.30-38

Efrati, E.; Tocco, G.; Eritja, R.; Wilson, S.H.; Goodman, M.F. Abasic translesion synthesis by DNA polymerase beta violates the "A-rule" - Novel types of nucleotide incorporation by human DNA polymerase beta at an abasic lesion in different sequence contexts //J. Biol. Chem. -1997. -v. 272. -No. 4. -p.2559-2569

Fansler, B. ; Loeb, L.A. Sea urchin nuclear DNA polymerase. Changing localization during early development // Exp. Cell Res. -1969. -v. 57. -p. 305-310

Fotedar, R.; Mossi, R.; Fitzgerald, P.; Rousselle, T.; Maga, G.; Brickner, H.; Messier, H.; Kasibhatla, S.; Hubscher, U.; Fotedar, A. A conserved domain of the large subunit of replication factor C binds PCNA and acts like a dominant negative inhibitor of DNA replication in mammalian cells // EMBO Journal. -1996. -v. 15. -No. 16. -p.4423-4433

Fox, A.M. ; Breaux, C.B. ; Benbow, R.M. Intracellular localization of DNA polymerase activities within large oocytes of the frog, Xenopus laevis; // Develop. Biol. -1980. -v. 80. -No. 1. -p.79-95

Fridovich, I. Superoxide dismutases. //Annu. Rev. Biochem. -1975. -v. 44. -p. 147-159

Fridovich, I. Biological effects of the superoxide radical. // Arch. Biochem. Biophys. -1986. -v. 247. -No. 1. -p.1-11

Gaudette, M.F.; Benbow, R.M. Replication forks are underrepresented in chromosomal DNA of Xenopus laevis embryos // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1986. -v. 83. -No. 16. -p.5953-5957

Grishko, V.l.; Driggers, WJ; Ledoux, SP; Wilson, GL Repair of oxidative damage in nuclear DNA sequences with different transcriptional activities // Mutat. Res. -DNA Repair. -1997. -v. 2. -No. 3388. -p.73-80

Hara, K.; Tydeman, P.; Kirschner, M. A cytoplasmic clock with the same period as the division cycle in Xenopus eggs // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1980. -v. 77. -No. 1. -p.462-466

Hindges, R.; Hubscher, U. DNA polymerase delta, an essential enzyme for DNA transactions //J. Biol. Chem. -1997a. -v. 378. -No. 5. -p.345-362

Hindges, R.; Hubscher, U. Cloning, chromosomal localization, and interspecies interaction of mouse DNA polymerase delta small subunit (PolD2) // Genomics. -1997b. -v. 44. -No. 1. -p.45-51

Hobart, P.M.; Infante, A.A. A low molecular weight DNA polymerase b in the sea urchin Strongylocentrorus purpuratus // J. Biol. Chem. -1978. -v. 253. -No. 22. -p.8229-8238

Hoffmann, J.S.; Pillaire, M.J.; Maga, G.; Podust, V.; Hubscher, U.; Villani, G. DNA polymerase beta bypasses in vitro a single d(GpG)-cisplatin adduct placed on codon 13 of the HRAS gene // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1995. -v. 92. -No. 12. -p.5356-5360

Hubscher, U.; Kuenzle, C.C.; Spadari, S. Variation of DNA polymerase a, b and g during perinatal growth and differentiation // Nucl. Acids Res. -1977. -v. 4. -No. 8. -p.2917-2929

Husain, I.; Morton, B.S.; Beard, W.A.; Singhai, R.K.; Prasad, R.; Wilson, S.H.; Besterman, J.M. Specific inhibition of DNA polymerase beta by its 14 kDa domain: Role of single- and double-stranded DNA binding and 5'-phosphate recognition // Nucl. Acids Res. -1995. -v. 23. -No. 9. -p.1597-1603

Ikehata, H. Comparison of DNA Polymerase-alpha, Polymerase-delta, and Polymerase-epsilon of Mouse Cell Line FM3A and Its Temperature-Sensitive Mutant tsFT20 //Tohoku J. Exp. Med. -1994. -v. 172. -No. 1. -p.65-81

Izuta, S.; Roberts, J.D.; Kunkel, T.A. Replication error rates for G:dGTP, T:dGTP, and A:dGTP mispairs and evidence for differential proofreading by leading and lagging strand DNA replication complexes in human cells // J. Biol. Chem. -1995. -v. 270. -No. 6. -p.2595-2600

Jinno, S.; Kida, K.; Taguchi, T. Induction of DNA polymerase beta and gamma in the lungs of age-related oxygen tolerant rats // Mechanisms of Ageing and Development. -1995. -v. 85. -No. 2-3. -p.95-107

Kimura, H.; Nozaki, N.; Sugimoto, K. DNA polymerase alpha associated protein P1, a murine homolog of yeast MCM3, changes its intranuclear distribution during the DNA synthetic period // EMBO Journal. -1994. -v. 13. -No. 18. -p.4311-4320

Klungland, A.; Lindahl, T. Second pathway for completion of human DNA base excision-repair: Reconstitution with purified proteins and requirement for DNase IV (FEN1) II EMBO Journal. -1997. -v. 16. -No. 11. -p.3341-3348

Kubota, Y.; Nash, R.A.; Klungland, A.; Schar, P.; Barnes, D.E.; Lindahl, T. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: Interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein // EMBO Journal. -1996. -v. 15. -No. 23. -p.6662-6670

Kuroda, K.; Ueda, R. A 130 kDa polypeptide immunologically related to the 180 kDa catalytic subunit of DNA polymerase alpha-primase complex is detected in early embryos of Drosophila //J. Biochem. -1995. -v. 117. -No. 4. -p.809-818

Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. -1970. -v. 227. -No. 5259. -p.680-685

Layne, E. Spectrophotometric and turbidimeric methods for measuring proteins // Methods Enzymol. -1957. -v. 111. -p.447-454

Lee, Y.W.T.; Toomey, A.L. Human placental DNA polymerase delta: identification of a 170-kilodalton polypeptide by activity staining and immunoblotting // Biochemistry. -1987. -v. 26. -No. 4. -p.1076-1085

Lee, S.H. The 3-5-exonuclease of human DNA polymerase delta is regulated by polymerase delta accessory factors and deoxyribonucleoside triphosphates // Nucl. Acids Res. -1993. -v. 21. -No. 8. -p.1935-1939

Li, R.; Waga, S.; Hannon, G.J.; Beach, D.; Stillman, B. Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair // Nature. -1994. -v. 371. -No. 6497. -p.534-537

Li, R.; Hannon, G.J.; Beach, D.; Stillman, B. Subcellular distribution of p21 and PCNA in normal and repair-deficient cells following DNA damage // Current Biol. -1996. -v. 6. -No. 2. -p.189-199

Lindahl, T; Nyberg, B. Rate of depurinization of native deoxyribonucleic acid // Biochemistry. -1972. -v. 11. -p.3610-3618

Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. // Nature. -1993. -v. 362. -No. 6422. -p.709-715

Linn, S. How many pols does it take to replicate nuclear DNA? // Cell. -1991. -v. 66. -p.185-187

Lowry, O.H.; Rosebrough, N.J.; Farr, A.L.; Randall, R.J. Protein measurements with the folin phenol reagent//J. Biol. Chem. -1951. -v. 193. -No. 2. -p.265-275

Lynch, R.E.; Fridovich, I. Permeation of the erythrocyte stroma by superoxide radical. //J. Biol. Chem. -1978. -v. 253. -No. 13. -p.1838-1845

Maga, G.; Hubscher, U. DNA polymerase epsilon interacts with proliferating cell nuclear antigen in primer recognition and elongation // Biochemistry. -1995. -v. 34. -No. 3. -p.891-901

Maga, G.; Mossi, R.; Fischer, R.; Berchtold, M.W.; Hubscher, U. Phosphorylation of the PCNA binding domain of the large subunit of replication factor C by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase inhibits DNA synthesis // Biochemistry. -1997. -v. 36. -No. 18. -p.5300-5310

Matsukage, A.; Kitani, H.; Yamaguchi, M.; Kusakabe, M.; Morita, T.; Koshida, Y. Differentiation of lens and neural cells in chiken embryo is accompanied by simultaneous decay of DNA replication machinery // Develop. Biol. -1986. -v. 117. -No. 1. -p.226-232

Matsumoto, Y.; Kim, K.; Bogenhagen, D. Proliferating cell nuclear antigen-dependent abasic site repair in Xenopus laevis oocytes: an alternative pathway of base excision DNA repair // Mol. Cell Biol.. -1994. -v. 14. -No. 9. -p. 6187-6197

Matsumoto, Y.; Kim, K. Excision of deoxyribose phosphate residues by DNA polymerase beta during DNA repair // Science. -1995. -v. 269. -No. 5224. -p.699-702

Mechali M., Abadiedebat J.; A.M. DeRrecondo Eucariotic DNA polymerase alfa. Structural analysis of the enzyme from regeneration rat liver // J. Biol. Chem. -1980. -v. 255. -No. 5. -p.2114-2122

Menge, K.L.; Hostomsky, Z.; Nodes, B.R.; Hudson, G.O.; Rahmati, S.; Moomaw,

E.W.; Almassy, R.J.; Hostomska, Z. Structure-function analysis of the mammalian DNA polymerase beta active site: Role of aspartic acid 256, arginine 254, and arginine 258 in nucleotidyl transfer // Biochemistry. -1995. -v. 34. -No. 49. -p.15934-15942

Mikhailov, V.S., and Gulyamov, D.B. Changes in DNA polymerase allfa, beta, gamma activities during early development of the teleost fish Misgurnus fossilis (loach); // Eur. J. Biochem. -1983. -v. 135. -p.303-306.

Mikhailov, V.S. DNA polymerases in the early development of a teleost fish Misgurnus fossilis (loach) II Sov. Sci. Rev. : Physiol. Gen. Biol. -1987. -v. 1. -p.501-527

Miyazawa, H. ; Izumi, M. ; Tada, S. ; Takada, R. ; Masutani, M. ; Ui, M.; Hanaoka,

F. Molekular clonning of the four subunits of mouse DNA polymerase alfa -primase complex and their gene expression during cell proliferation and the cell cycle//J. Biol. Chem. -1993. -v. 268. -No. 11. -p.8111-8122

Morrison, A.; Christensen, R.B.; Alley, J.; Beck, A.K.; Bernstine, E.G.; Lemontt, J.F.; Lawrence, C.W. REV3, a Saccharomyces cerevisiae gene whose function is required for induced mutagenesis, is predicted to encode a nonessential DNA polymerase //J. Bacteriol. -1989. -v. 171. -No. 10. -p.5659-5667

Mossi, R.; Jonsson, Z.O.; Allen, B.L.; Hardin, S.H.; Hubscher, U. Replication factor C interacts with the C-terminal side of proliferating cell nuclear antigen // J. Biol. Chem. -1997. -v. 272. -No. 3. -p.1769-1776

Mu, D.; Park, С. H.; Matsunaga, Т.; Hsu, D.S.; Reardon, J.T.; Sancar, A. Reconstitution of human DNA repair excision nuclease in a highly defined system //J. Biol. Chem. -1995. -v. 270. -No. 6. -p.2415-2418

Mullen, G.P.; Antuch, W.; Maciejewski, M.W.; Prasad, R.; Wilson, S.H. Insights into the mechanism of the beta-elimination catalyzed by the N-terminal domain of DNA polymerase beta //Tetrahedron. -1997. -v. 53. -No. 35. -p. 12057-12066

Narayan, S.; Beard, W.A.; Wilson, S.H. DNA damage-induced transcriptional activation of a human DNA polymerase beta chimeric promoter: Recruitment of preinitiation complex in vitro by ATF/CREB // Biochemistry. -1995. -v. 34. -No. 1. -p.73-80

Narayan, S.; He, F.; Wilson, S.H. Activation of the human DNA polymerase beta promoter by a DNA-alkylating agent through induced phosphorylation of cAMP response element-binding protein-1 // J. of Biol. Chem. -1996. -v. 271. -No. 31. -p.18508-18513

Navas, T.A.; Zhou, Z.; Elledge, S.J. DNA polymerase epsilon links the DNA replication machinery to the S phase checkpoint//Cell. -1995. -v. 80. -p.29-39

Nelson, J.R.; Lawrence, C.W.; Hinkle, D.C. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase zeta // Science. -1996. -v. 272. -No. 5268. -p. 1646-1649

Nowak, R. ; Woszczynski, M. ; Sieelecki, J.A. Changes in the DNA polymerase beta gene expression during development of lung, brain, and testis suggest an involvement of the enzyme in DNA recombination // Exp. Cell Res. -1990. -v. 191. -No. 1. -p.51-56

O'Farrell, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. // J. Biol. Chem. -1975. -v. 250. -No. 10. -p.4007-4021

Oakley, B.R.; Kirsch, D.R.; Morris, N.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. //Anal. Biochem. -1980. -v. 105. -No. 2. -p.361-366

Park, H.; Davis, R.; Wang, T.S.F. Studies of Schizosaccharomyces pombe DNA polymerase alpha at different stages of the cell cycle // Nucl. Acids Res. -1995. -v. 23. -No. 21. -p.4337-4344

Peck, V.M.; Gerner, E.W.; Cress, A.E. Delta-type DNA polymerase characterized from Drozophila melanogaster embryos // Nucl. Acids Res. -1992. -v. 21. -No. 20. -p.5779-5784

Pelletier, H.; Sawaya, M.R.; Wolfle, W.; Wilson, S.H.; Kraut, J. Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with DNA: Implications for catalytic mechanism, processivity, and fidelity // Biochemistry. -1996. -v. 35. -No. 39. -p. 12742-12761

Perrino, F.W .; Loeb, L.A. Differential extension of 3'- mispair is a major contribution to the high fidelity of calf thymus DNA polymerase alfa // J. Biol. Chem. -1989. -v. 264. -No. 5. -p.2898-2905

Piersen, C.E.; Prasad, R.; Wilson, S.H.; Lloyd, R.S. Evidence for an imino intermediate in the DNA polymerase beta deoxyribose phosphate excision reaction II J. of Biol. Chem. -1996. -v. 271. -No. 30. -p.17811-17815

Plug, A.W.; Clairmont, C.A.; Sapi, E.; Ashley, T.; Sweasy, J.B. Evidence for a role for DNA polymerase beta in mammalian meiosis // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. -1997. -v. 94. -No. 4. -p.1327-1331

Podust, V.N.; Georgaki, A.; Strack, B.; Hubscher, U. Calf thymus RF-C as an essential component for DNA polymerase delta and epsilon holoenzymes function // Nucl. Acids Res. -1992. -v. 20. -No. 16. -p.4159-4165

Podust, L.M.; Podust, V.N.; Floth, C.; Hubscher, U. Assembly of DNA polymerase delta and epsilon holoenzymes depends on the geometry of the DNA template // Nucl. Acids Res. -1994. -v. 22. -No. 15. -p.2970-2975

Podust, V.N.; Podust, L.M.; Goubin, F.; Ducommun, B.; Hubscher, U. Mechanism of inhibition of proliferating cell nuclear antigen-dependent DNA synthesis by the cyclin-dependent kinase inhibitor p2l // Biochemistry. -1995. -v. 34. -No. 27. -p.8869-8875

Povirk, L.F; Houlgrave, C.W.; Han, Y.-H. Neocarzinostatin-induced DNA base release accompanied by staggered oxidative cleavage of the complementary strand //J. Biol. Chem. -1988. -v. 263. -No. 36. -p.19263-19266

Prasad, R.; Singhai, R.K.; Srivastava, D.K.; Molina, J.T.; Tomkinson, A.E.; Wilson, S.H. Specific interaction of DNA polymerase beta and DNA ligase I in a multiprotein base excision repair complex from bovine testis // J. Biol. Chem. -1996. -v. 271. -No. 27. -p.16000-16007

Sabatino, R.D.; Myers, T.W. ; Bambara , R.A. Calf thymus DNA polymerases alfa and delta are capable of highly processive DNA sinthesis // Biochemistry. -1988. -v. 27. -No. 8. -p.2998-3004

Sabatino, R.D. ; Bambara, R.A. Properties of the 3-5-exonuclease associated with calf DNA polymerase delta // Biochemistry. -1988. -v. 27. -No. 7. -p.2266-2271

Sabatino, R.D. ; Myers, T.W. ; Bambara, R.A. Substrate specificity of the exonuclease associated with calf DNA polymerase // Cancer Research. -1990. -v. 50. -No. 17. -p. 5340-5344

Sakumi, T.; Sekiguchi, T. Structures and functions of DNA glycosilases // Mutat. Res. -1990. -v. 236. -p. 161-172

Sancar, A. Mechanisms of DNA excision repair. // Science. -1994. -v. 266. -No. 5193. -p.1954-1956.

Sancar, A. Excision repair in mammalian cells // J. Biol. Chem. -1995. -v. 270. -No. 27. -p.15915-15918

Sancar, A. DNA excision repair //Annu. Rev. Biochem. -1996. -v. 65. -p. 43-81

Sawado, T.; Sakaguchi, K. A DNA polymerase alpha catalytic subunit is purified independently from the tissues at meiotic prometaphase I of a basidiomycete, Coprinus cinereus // Biochem. Biophys. Res. Commun, -1997. -v. 232. -No. 2. -p.454-460

Shadan, F.F.; Villarreal, L.P. Potential role of DNA polymerase beta in gene therapy against cancer: A case for colorectal cancer // Medical Hypotheses. -1996. -v. 47. -No. 1. -p.1-9

Shioda, M.; Nagano, H ; Mano, Y. Association of DNA polymerase alfa and beta with rough endoplasmic reticulum in sea urchin eggs and changes in subcellular distribution during early embryogenesis // Eur. J. Biochem. -1980. -v. 108. -p.345-355

Shioda, M. ; Nagano, H.; Mano, Y. Transition of DNA polymerase alfa and endoplasmic reticulum during gastrulation of sea urchin // Develop. Biol. -1982. -v. 91. -No. 1. -p.111-120

Shivji, M.K.K. ; Kenny, M.K. ; Wood, R.D. Proliferating cell nuclear antigen is required for DNA excision repair // Cell. -1992. -v. 69. -p.367-374

Shivji, M.K.K.; Podust, V.N.; Hubscher, U.; Wood, R.D. Nucleotide excision repair DNA synthesis by DNA polymerase epsilon in the presence of PCNA, RFC, and RPA//Biochemistry. -1995. -v. 34. -No. 15. -p.5011-5017

Singh, J.; Su, L.; Snow, E.T. Replication across 06-methylguanine by human DNA polymerase beta in vitro - Insights into the futile cytotoxic repair and mutagenesis of 06-methylguanine // J. Biol. Chem. -1996. -v. 271. -No. 45. -p.28391-28398

Singhal, R.K.; Prasad, R.; Wilson, S.H. DNA polymerase beta conducts the gap-filling step in uracil-initiated base excision repair in a bovine testis nuclear extract //J. Biol. Chem. -1995. -v. 270. -No. 2. -p.949-957

Sobol, R.W.; Horton, J.K.; Kuhn, R.; Gu, H.; Singhal, R.K.; Prasad, R.; Rajewsky, K.; Wilson, S.H. Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair// Nature. -1996. -v. 379. -No. 6561. -p.183-186

Sparadi, S.; F., Focher; Hubcher, U. Developmental activity profile of DNA polymerase delta and alfa in rat neurons sudgests a coordinated in vivo function II In vivo. -1988. -v. 2. -p.317-320

Srivastava, D.K.; Evans, R.K.; Kumar, A.; Beard, W.A.; Wilson, S.H. dNTP binding site in rat DNA polymerase beta revealed by controlled proteolysis and azido photoprobe cross-linking // Biochemistry. -1996. -v. 35. -No. 12. -p.3728-3734

Svoboda, D.L.; Taylor, J.S.; Sancar, A. DNA repair by eukaryotic nucleotide excision nuclease. Removal of thymine dimer and psoralen monoadduct by HeLa

cell-free extract and of thymine dimer by Xenopus laevis oocytes. // J. Biol. Chem. -1993. -v. 268. -No. 3. -p.1931-1936

Sweasy, J.B.; Yoon, M.S. Characterization of DNA polymerase beta mutants with amino acid substitutions located in the C-terminal portion of the enzyme // Mol. & Gen. Genetics. -1995. -v. 248. -No. 2. -p.217-224

Sweasy, J.B.; Chen, M.; Loeb, L.A. DNA polymerase beta can substitute for DNA polymerase I in the initiation of plasmid DNA replication // J. Bacteriol. -1995. -v. 177. -No. 10. -p.2923-2925

Syvaoja, J.; Siromensaari, S.; Nishida, C.; Goldsmith, J.S.; Chui, G.S.J.; Jain, S.; Linn, S. DNA polymerases alfa, delta and epsilon three distinct enzymes from HeLa cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. -v. 87. -No. 17. -p.6664-6668

Thomas, D.; Scot, A.D.; Barbey, R.; Padula, M.; Boiteux, S. Inactivation of OGG1 increases the incidence of G center dot C->T center dot A transversions in Saccharomyces cerevisiae: Evidence for endogenous oxidative damage to DNA in eukaryotic cells // Mol. & Gen. Genetics. -1997. -v. 254. -No. 2. -p.171-178

Thompson, H.C.; Sheaff, R.J.; Kuchta, R.D. Interactions of calf thymus DNA polymerase alpha with primer/templates // Nucl. Acids Res. -1995. -v. 23. -No. 20. -p.4109-4115

Tsurimoto, T.; Melendy, T.; Stillman, B. Sequential initiation of lagging and leading strand synthesis by two different polymerase complexes at the SV40 DNA replication origin // Nature. -1990. -v. 346. -p. 534-539

Tsurimoto, T.; Stillman, B. Replication factors required for SV40 DNA replication in vitro. I. DNA structure-specific recognition of a primer-template junction by

eukaryotic DNA polymerases and their accessory proteins. // J. Biol. Chem. -1991. -v. 266. -No. 3. -p.1950-1960.

Voitenleitner, C.; Fanning, E.; Nasheuer, H.P. Phosphorylation of DNA polymerase alpha-primase by cyclin A-dependent kinases regulates initiation of DNA replication in vitro // Oncogene. -1997. -v. 14. -No. 13. -p.1611-1615

Wallase, S.S. AP endonucleases and glycosylases that recognize oxidative DNA damage // Environmental and molecular mutagenesis. -1988. -v. 12. -No. 4. -p.431-478

Wang, T.S.F. Eukaryotic DNA polymerases //Annu. Rev. Biochem. -1991. -v. 60. -p.513-552

Wang, L.M.; Banerjee, S. Mutations in DNA polymerase beta occur in breast, prostate and colorectal tumors // Int. J. Oncol. -1995. -v. 6. -No. 2. -p.459-463

Webster, R.P.; Bhattacharya, R.K. Activity of some nuclear enzymes associated with DNA repair following hepatocarcinogen administration to rats // J. Biochem. Toxicol. -1995. -v. 10. -No. 1. -p.33-40

Weiser, T.; Gassmann, M.; Thommes, P.; Ferrari, E.; Hafkemeyer, P.; Hubscher, U. Biochemical and functional comparison of DNA polymerases alfa, delta and epsilon from calf thymus //J. Biol. Chem. -1991. -v. 266. -No. 16. -p. 10420-10428

Werneburg, B.G.; Ahn, J.; Zhong, X.J.; Hondal, R.J.; Kraynov, V.S.; Tsai, M.D. DNA polymerase beta: Pre-steady-state kinetic analysis and roles of arginine 283 in catalysis and fidelity // Biochemistry. -1996. -v. 35. -No. 22. -p.7041-7050

Wood, R. D. DNA repair in eukaryotes // Annu. Rev. Biochem. -1996. -v. 65. -p.135-1167

Yamane, H.; Yada, N. ; Katori, E.; Mashino, T. ; Nagano, T.; Hirobe, M. Base liberation from nucleotides by superoxide and intramolecular enhancement effect of phosphate group. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1987. -v. 142. -No. 3. -p. 1104-1110

Zeng, X.R.; Hao, H.; Jiang, Y.; Lee, M. Regulation of human DNA polymerase delta during cell cycle //J. Biol. Chem. -1994. -v. 269. -No. 39. -p.24027-24033

Zhang, P.; Frugulhetti, I.; Jiang, Y. ; Holt, G.; Condit, R.; Lee, M. Expression of the catalytic subunit of human DNA polymerase delta in mammalian cells using a Vaccinia virus vector system //J.Biol. Chem. -1995. -v. 270. -No. 14. -p.7993-7998

Zhang, S.J.; Zeng, X.R.; Zhang, P.; Toomey, N.L.; Chuang, R.Y.; Chang, L.S.; Lee, M. A conserved region in the amino terminus of DNA polymerase delta is involved in PCNA binding //J. Biol. Chem. -1995. -v. 270. -No. 14. -p.7988-7992

Zhu, F.X.; Biswas, E.E.; Biswas, S.B. Purification and characterization of the DNA polymerase alpha associated exonuclease: The RTH1 gene product // Biochemistry. -1997. -v. 36. -No. 20. -p.5947-5954

Zierler, M.K.; Marini, N.J. ; Stowers, D.J. ; Benbow, R.M. Stockpiling of DNA polymerases during oogenesis and embryogenesis in the frog, Xenopus laevis; // J. Biol. Chem. -1985. -v. 260. -No. 2. -p.974-981