Синтез ДНК ab initio, стимулируемый никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Зырина, Надежда Витальевна

• Зырина, Надежда Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зырина, Надежда Витальевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ !

1.1. СИНТЕЗ ДНК В ОТСУТСТВИЕ МАТРИЦЫ И ПРАЙМЕРА

1.1.1. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразами 1 о

1.1.2. Синтез ДНК ab initio в присутствии эндонуклеаз рестрикции

1.1.3. Распространененность феномена формирования ферментами информации, 17 независимо от матрицы ДНК или РНК

1.1.4. Возможная функциональная роль независимого от матрицы синтеза ДНК

1.2. НИКУЮЩИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

1.2.1. Общая характеристика никаз. Никаза Nt.Bsp.D6I

1.2.2. Применение никующих эндонуклеаз

1.3. БЕЖИ БАКТЕРИОФАГА Т4 И Е. coli, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С 31 ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК

1.3.1. Структурно-функциональные особенности белков SSB

1.3.2. Применение белков Т4 gp32 и EcoSSB

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.2. ОБОРУДОВАНИЕ

2.3. ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ И ИНТЕРНЕТ РЕСУРСЫ

2.4. МЕТОДЫ

2.4.1.Электрофорезы

2.4.2. Работа с радиоактивными изотопами

2.4.3.Ферментативные реакции

2.4.4. Выделение ДНК

2.4.5. Работа с бактериями и бактериофагами

2.4.6. Синтез ДНК ab inito

2.4.7. Электронная микроскопия

2.4.8. Изотермическая амплификация ДНК 5

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТОВ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ

3.2. СИНТЕЗ ДНК ab initio

3.2.1. Синтез ДНК ab initio одной ДНК-полимеразой Bst

3.2.2. Нуклеотидилтрансферазная активность ДНК-полимеразы Bst

3.2.3. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst в присутствие различных 61 никующих эндонуклеаз

Синтез ДНК ab initio, стмулируемый Nt.BspD6I

Синтез ДНК ab initio стмулируемый никазами Nt.AlwI, Nb.BbvCI и

Nb.BsmAI

3.2.4. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst в присутствие никующей 65 эндонуклеазы Nt.BspD6I

Зависимость синтеза ab initio от времени и количества никазы Nt.BspD6I

Анализ первичной стуктуры ДНК

Электронная микроскопия ДНК

3.2.5. Определение нуклеотидной последовательности продуктов синтеза ДНК 70 ab initio

Клонирование последовательностей

Секвенирование ДНК

3.3. СХЕМАТИЧЕСКОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ МОДЕЛИ ЭЛОНГАЦИИ ДНК ПРИ 76 СИНТЕЗЕ ab initio

3.4. ИНГИБИРОВАНИЕ СИНТЕЗА ДНК ab initio. 80 ВЛИЯНИЕ БЕЖОВ Т4 gp32 И SSB E.coli НА СИНТЕЗ ДНК

3.4.1. Влияние белков SSB на синтез ДНК полимеразой Bst 81 Синтез ДНК ab initio в присутствие Т4 gp32 и EcoSSB 83 Синтез ДНК на праймированной матрице в присутствие Т4 gp32 и

EcoSSB

3.4.2. Влияние белков Т4 gp32 и EcoSSB на синтез ДНК в присутствие никазы 85 Nt.BspD6I

Синтез ДНК ab initio в присутствие Т4 gp32 и EcoSSB

Синтез ДНК на праймированной матрице

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Список публикаций по материалам диссертационной работы

ПРИЛОЖЕНИЕ. ПОЛУЧЕНИЕ БОЛЬШОГО ФРАГМЕНТА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Bst

И БЕЛКА gp32 БАКТЕРИОФАГА Т4 ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез ДНК ab initio, стимулируемый никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I»

ВВЕДЕНИЕ

При использовании различных методов амплификации ДНК часто возникает проблема появления неспецифических продуктов, особенно, если в реакции используется сложная матрица (геномная ДНК или ДНК, способная формировать вторичные структуры) и/или очень низкое количество матричной ДНК. Одним из источников образования неспецифических продуктов во многих случаях может быть способность термофильных ДНК-полимераз синтезировать ДНК в присутствии только dNTP. Синтез ДНК в отсутствие матричной ДНК и праймера термофильными ДНК-полимеразами был впервые убедительно продемонстрирован в середине 90-х в работах Огата и Миура. Авторы назвали наблюдаемый синтез синтезом ДНК ab initio. Продуктами синтеза ab initio были высокомолекулярные ДНК длиной от 0.1 до 50 т.п.о., состоящие из повторов длиной 8-10 п.о., состав которых зависел от условий реакции. На основании того, что подобные последовательности широко распространены как в сателлитной ДНК, так и в кодирующих участках генома эукариотов, Огата и Миура выдвинули предположение, что такие тандемные повторы были синтезированы ДНК-полимеразой на определенной стадии эволюции генома и что генетическая информация потенциально может создаваться непосредственно белком. Спустя несколько лет, Франк-Каменецким с соавт. было показано, что скорость синтеза ДНК ab initio значительно увеличивается при добавлении эндонуклеаз рестрикции. ДНК, синтезируемая в этом случае, состоит из палиндромных повторов, содержащих один или два сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, участвующей в реакции. Несмотря на то, что в работах, в которых изучается синтез ДНК ab initio, реагенты, участвующие в реакции, подвергаются тщательной очистке, тем не менее, это не исключает полностью присутствия следовых количеств ДНК, связанной с ферментами. В связи с этим, в англоязычной литературе этот синтез называют также синтезом, независимым от матрицы и праймера (template/primer-independent DNA synthesis).

Нами обнаружено, что синтез ДНК ab initio сильно стимулируется в присутствии никующих эндонуклеаз. Никующие эндонуклеазы (никазы) - недавно выделенная отдельная группа ферментов, которые, действуя в виде мономеров, узнают короткую специфическую последовательность (сайт), вносят разрыв (ник - nick) в одну из цепей ДНК в фиксированном положении относительно этой последовательности. На сегодняшний день известны никазы как выделенные из природных штаммов, так и полученные путем мутагенеза различных эндонуклеаз рестрикции. Одной из первых открытых никаз была никаза Nt.BspD6I

выделенная в нашей лаборатории из термофильного штамма Bacillus species D6. Этот 70.8-кДа белок узнает на двухспиральной ДНК последовательность (сайт) б'-ОАСТС-З'/З7-GACTC-3 и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 нт от сайта узнавания в сторону З'-конца. В нашей лаборатории определена и первая для этого класса ферментов пространственная структура.

Несмотря на то, что никующие эндонуклеазы открыты сравнительно недавно, они уже нашли применение в разработке различных методов, в том числе методов, предназначенных для медицинской диагностики. Среди последних методов - амплификация ДНК с вытеснением цепи, изотермическая амплификация олигонуклеотидов, амплификация случайных последовательностей геномной ДНК, реакция экспоненциальной амплификации ДНК, картирование ДНК, мечение уникальной последовательности в ДНК. Однако использование никующих эндонуклеаз в сочетании с ДНК-полимеразами, как показано в настоящей работе, приводит к синтезу неспецифических продуктов, с которым столкнулись и другие исследователи. В связи с этим остро стоит проблема избавления от продуктов неспецифического синтеза ДНК в присутствии никующих эндонуклеаз. В качестве возможных ингибиторов неспецифического синтеза в настоящей работе были выбраны белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК (single-stranded DNA binding, SSB).

Белки SSB связываются неспецифически с высокой аффинностью с оцДНК в стехиометрических количествах, стабилизируют и придают ей регулярную форму, денатурируя побочные вторичные структуры, а также защищают одноцепочечную ДНК от нуклеаз. В ряде работ показано, что эти белки способны повышать эффективность амплфикации ДНК различными ДНК-полимеразами как за счет увеличения скорости элонгации и процессивности полимеразы, так и за счет увеличения точности синтеза. Считается, что присутствие белков SSB может сильно стимулировать изотермическое вытеснение цепи, и таким образом уменьшать формирование димеров праймеров и приводить к устранению неспецифических продуктов.

Таким образом, цель данного исследования заключалась в изучении синтеза ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst, стимулируемого никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I.

В ходе исследования решались следующие задачи:

- сконструировать штаммы-суперподуценты большого фрагмента ДНК-полимеразы Bst и SSB белка Т4 gp32 и выделить эти белки в электорофоретически и функционально чистом состоянии;

- изучить синтез ДНК ab initio одной ДНК-полимеразой Bst;

- изучить влияние Nt.BspD6I и других никующих эндонуклеаз на синтез ДНК ab initio;

- изучить зависимость синтеза ДНК ab initio от времени и количества никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I;

- установить структуру ДНК, синтезируемой в присутствии Nt.BspD6I;

- определить нуклеотидную последовательность продуктов синтеза ДНК ab initio;

- изучить влияние белков SSB на синтез ДНК ab initio.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. СИНТЕЗ ДНК В ОТСУТСТВИЕ МАТРИЦЫ И ПРАЙМЕРА 1.1.1. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразами

Обычно для начала синтеза ДНК ДНК-полимеразами необходимы матричная нить и праймер - короткий олигонуклеотид со свободным Ъ1 ОН концом, комплементарный участку матричной цепи (Kornberg and Baker, 2005). Вскоре после выделения ДНК-полимеразы I Е. coli Корнбергом с соавт. было обнаружено, что частично очищенные препараты этого фермента могут синтезировать длинные сополимеры dAT без добавления праймера и матрицы (Schachman et al., 1960). Этот синтез, названный синтезом de novo или непраймированным синтезом ДНК, был исследован достаточно подробно (Kornberg et al., 1964; Radding et al., 1962). Однако, существующие в то время методы очистки ферментов не позволяли получить высокоочищенные препараты и поэтому возникло представление, что наблюдаемый синтез может быть связан с недостаточной очисткой препарата фермента от примесей ДНК. Значительно позднее к этому синтезу вновь вернулись Огата и Миура, которые обнаружили, что термофильная ДНК-полимераза Tli из археи Thermococcus litoralis может синтезировать до 50 т.п.о. ДНК из dNTP в отсутствии любой инициирующей нуклеиновой кислоты (рис. 1А) (Ogata and Miura, 1997). После одночасового лаг периода реакция продолжалась почти линейно и через 4 часа в высокомолекулярный продукт включались все dNTP (рис. 1В).

Рис. 1. Временная зависимость синтеза ДНК в отсутствие праймера и матрицы ДНК-полимеразой ТИ.(А)

Продукты синтеза ДНК в 1% агарозном геле, окрашенном этидиум бромидом. Маркер длин ДНК показан слева в т.п.о. (В) Включение радиоактивного dA (•), dT (▼), dG (A), dC (□) или всех dNTP (о) в кислотонерастворимый материал (Ogata and Miura, 1997).

Time (h)

Для исключения возможного влияния примесей нуклеиновых кислот, которые могли бы служить матрицей или праймером в реакции синтеза, авторы провели дополнительную обработку коммерческой ДНК-полимеразы ТН ДНКазой I и РНКазой А, денатурацию с последующей ренатурацией ДНК-полимеразы, а также дополнительную очистку субстратов хроматографией.

Для первоначального анализа первичной структуры синтезированного полимера, авторы подвергали его гидролизу эндонуклеазой ДНКазой I, специфичной к дц- и оцДНК, нуклеазой Ва131, обладающей 3 —>5' экзонуклеазой активностью к дцДНК и эндонуклеазной активностью к оцДНК, а также специфичными только к оцДНК эндонуклеазами S1 и золотистой фасоли (mung bean). Оказалось, что продукт синтеза полностью расщеплялся ДНКазой I и Ва131 и абсолютно не расщеплялся эндонуклеазой S1 или нуклеазой из золотистой фасоли. На этом основании авторы заключили, что продукт реакции является линейной двухцепочечной ДНК. Это заключение подтвердили и данные электронной микроскопии (линейная ДНК) и КД спектроскопии (правозакрученная спираль ДНК в В форме).

Авторы назвали обнаруженный ими синтез «креативным» или синтезом ДНК ab initio, и высказали предположение, что генетическая информация потенциально может быть создана непосредственно белком (Ogata and Miura, 1997).

В последующих работах Огата и Миура изучили влияние температуры, ионной силы и рН на синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Tli (Ogata and Miura, 1998а). Когда меняли температуру реакции, последовательность ДНК синтезированного продукта тоже значительно изменялась. Так, при 69°С продуктами реакции были повторы (ТААТ)п, при 84°С - (TATCCGGA)n -и при 89°С - (TATCGCGATAGCGATCGC)n. Ионная сила условий реакции также влияла на характер последовательности: последовательность (TATCTAGA)n синтезировалась при 0 мМ КС1, (TATATACG)n - при 50 мМ КС1 и (TATAGTTATAAC)n -при 100 мМ КС1. Когда рН реакции изменялся от 6.8 до 10.8, максимальный размер синтезированной ДНК уменьшался с 50 до 3 т.п.о., но характер последовательности не менялся. Эти результаты показали, что на состав ДНК, синтезированной ab initio ДНК-полимеразой Tli, в значительной степени влияют условия реакции. Огата и Миура предположили, что генетическая информация, которая могла быть создана белком в первобытных условиях, в сильной степени зависела от факторов окружающей среды.

Огата и Миура обнаружили, что термофильная ДНК-полимераза Tth из бактерии Thermus thermophilus также синтезирует ab initio длинные повторяющиеся последовательности ДНК при полном отсустсвии экзогенной матричной и праймерной ДНК (Ogata and Miura, 1998b). Подобно синтезу ДНК ab initio ДНК-полимеразой Tli этот синтез характеризовался 1-часовым лаг периодом. После этого реакция продолжалась почти линейно и через 4 часа в высокомолекулярный продукт включалось 2.2% субстратов (Ogata and Miura, 1997, 1998b). Синтезированная ДНК имела 25% -ный GC состав, и последовательности, в основном представленные тандемными повторами (CATGTATA)n, (TGTATGTATACATACATA)n и (TATACGTA)n, а также вырожденными последовательностями этих основных повторяющихся единиц. Авторы подчеркнули, что большинство последовательностей повторяющихся единиц (мотивов) имела палиндромную или кавзипалиндромную структуру (Ogata and Miura, 1998b).

Для выяснения механизма увеличения количества повторов при синтезе ДНК ab initio ДНК-полимеразами Tli и Tth Огата и Миура провели ряд экспериментов с внесением в реакционную смесь одноцепочечной олигонуклеотидной ДНК с различными последовательностями. Добавление случайных олигонуклеотидов не стимулировало синтез ДНК ab initio (Ogata and Miura, 1997; Ogata and Morino, 2000). Но при добавлениии в реакционную смесь олигонуклеотидов, имеющих состав, подобный тому, который синтезируется полимеразами, они очень эффективно элонгировались ДНК-полимеразами более чем до 20 т.п.о. Эффективность элонгации добавленного олигонуклеотида уменьшалась при нарушении его палиндромной структуры или тогда, когда GC состав был вне пределов 25-50% (Ogata and Miura, 2000; Ogata and Morino, 2000). Собственная экзонуклеазная активность Tth и Tli ДНК полимераз, стимулируя в значительной степени синтез ab initio, не являлась обязательной для стимулирования синтеза в присутствии тандемной олигонуклеотидной ДНК.

Спектроскопические определения температуры плавления олигонуклеотидной ДНК показали, что температура их перехода шпилька-открытое кольцо очень близка к температуре реакции элонгации, однако, выше, чем температура стабильного существования дуплексной олигонуклеотидной ДНК (Ogata and Miura, 2000; Ogata and Morino, 2000). Этот факт позволил авторам сделать заключение о том, что повторяющиеся олигонуклеотидные ДНК с палиндромнои или квазипалиндромной структурой эффективно элонгируются гипертермофильной полимеразой через переход шпилька-открытое кольцо, а также

предположить, что такой механизм элонгации мог служить движущей силой как для образования тандемных повторов сателлитной ДНК, так и умножение последовательностей ДНК в первобытных условиях развития жизни на Земле.

В это же время Ханаки с соавт. провели аналогичные работы по изучению независимого от праймера и матрицы синтеза ДНК различными термофильными ДНК-полимеразами (Hanaki et al, 1997; Hanaki et al., 1998). Авторы показали, что одни ДНК-полимеразы (Taq и др.) образуют из dATP и dTTP полимер поли-с1(АТ), тогда как другие ДНК-полимеразы (Tth, Vent и др.) не ведут этот синтез. Кроме этого Hanaki с соавт. отмечают, что независимый от праймера и матрицы синтез поли-с!(АТ) ведется ДНК-полимеразами, обладающими 5'-Ъ' экзонуклеазной и дезоксинуклеотидил трансферазной (TdT) активностями (Табл. 1).

Ханаки с соавт. показали, что независимый от матрицы синтез поли d(AT) термофильными ДНК-полимеразами, происходит с участием двух реакций: медленного процесса формирования 16-19-нуклеотидного d(AT) без участия праймированной матрицы и быстрого процесса элонгации олигонуклеотидной d(AT) за счет самопраймирования (Hanaki et al., 1998). Авторы также отметили, что при отсутствии субстратов ДНК-полимераза Taq за

г! о/

счет Ь -5 экзонуклеазной активности деградировала высокомолекулярный полимер d(AT) до олигомеров, размером менее 75 п.о., которые были устойчивы к дальнейшему расщеплению. Этот факт позволил им сделать заключение об одновременном прохождении реакций элонгации и деградации при независимом от матрицы и праймера синтезе.

Таблица 1. Независимый от праймера и матрицы синтез поли d(AT)

и активности различных ДНК-полимераз (Hanaki et al., 1998)

Коммерческое Производитель Организм Независимый от 5'-Ъ' 3'-5' TdT

название праймера/матрицы экзонуклеазная экзонуклеазная

ДНК-полимеразы синтез поли д(А-Т)

AmpliTaq Perkin-Elmer Thermus aquaticus + + - +

AmpliTaq LD Perkin-Elmer Thermus aquaticus + + - +

AmpliTaq Gold Perkin-Elmer Thermus aquaticus + + - +

Taq Gibco BBL Thermus aquaticus YT-1 + + - +

rTaq Toyobo Thermus aquaticus YT-1 + +/- - +

TaKaKa Taq Takara Thermus aquaticus + + - +

Hot Tub Amersham Thermus flavus ubiquitos + + - +

Tfl Promega Thermus flavus + + - +

Tth Toyobo Thermus thermophilus HB 8 + +/- - +

rTth Perkin-Elmer Thermus thermophilus + + - +

Red Hot Advanced Biotechnologies Thermus icelandicus + + - +

BcaBEST Takara Bacillus cardotenax YT-G - - + n.i.

KOD Toyobo Pyrococcus sp. KOD1 - n.i. + +/-

Pfo Stratagene Pyrococcus furiosus - +/- + +/-

Pwo Boehringer Mannheim Pyrococcus woesei - - + -

Ultma Perkin-Elmer Thermotoga maritima - +/- + -

Vent NEB Thermococcus litoralis - - + -

AmpliTaq, Stoffel Perkin-Elmer Thermus aquaticus - - - +/-

Fragment

ATth Toyobo Thermus thermophilus HB 8 - - - +

Ven(exo-) NEB Thermococcus litoralis - - - +/-

n.i.: no information available.

1.1.2. Синтез ДНК ab initio в присутствии эндонуклеаз рестрикции

Новый тип синтеза ДНК, независимого от матрицы и праймера, обнаружил. Франк-Каменецкий с соавт. (Liang et al., 2004). Авторы показали, что достаточно медленный синтез ДНК ab initio, описанный Огата и Миура, сильно стимулируется при добавлении эндонуклеазы рестрикции в реакционную смесь с ДНК-полимеразой. В присутствии эндонуклеазы рестрикции лаг период сокращается до 4 мин (рис. 2а), тогда как в экспериментах Огата и Миура в отсутствие эндонуклеазы лаг период составлял 1 час. После лаг периода синтез ДНК становился линейным и заканчивался через 2 часа, когда использовались все dNTP. Выход синтезированной ДНК составлял более 90% от теоретически возможного количества, тогда как в отсутствии эндонуклеаз рестрикции, даже после 4 часов синтеза в высокомолекулярный продукт включалось только 2.2% субстратов (Ogata and Miura, 1997, 1998b).

STO

Time (min)

Cone, of Tsp5091 (U/ml,)

50-jHH

30 - ■ИИ

12 —

Рис. 2. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Vent(exo-) в присутствие эндонуклеазы рестрикции Tsp509I. (а) Временная зависимость синтеза ДНК-полимеразой Vent (ехо-) в присутствии эндонуклеазы рестрикции Tsp509I. Количественный анализ по измерению флуоресценции в присутствии 10 ед./мл эндонуклеазы рестрикции Tsp509I. Вставка показывает результат в течение первых 5 мин. (Ь) Синтез при различных концентрациях Tsp509I Электрофорез в 10% неденатурирующем ПААГ. Слева показаны маркеры длин ДНК в п. o.(Liang et al., 2004).

Картина синтеза ДНК сильно зависела от количества внесенной эндонуклеазы (рис. 2Ь). Сначала по мере увеличения количества эндонуклеазы рестрикции увеличивалось и количество синтезированной высокомолекулярной ДНК. Однако при дальнейшем увеличении количества эндонуклеазэ рестрикции картина менялась: регистрировали широкий спектр низкомолекулярных продуктов ДНК вплоть до отсутствия детектируемых электрофорезом продуктов.

Факт, что на синтез ДНК не влияли обработка ДНК-полимеразы и эндонуклеазы рестрикции ДНКазой I, РНКазой А, и нуклеазой Р1 указывает на то, что этот синтез не был обусловлен примесями ДНК.

Результаты, представленные на рисунке 2, были получены для эндонуклеазы рестрикции Tsp509I (узнаваемая последовательность jAATT) и ДНК-полимеразы Vent (ехо-). Стрелкой указано место расщепления ДНК относительно узнаваемого сайта. Аналогичная картина наблюдалась при использовании ДНК-полимераз Vent, Bst и 9°Nm и 12 эндонуклеаз рестрикции - TspRI (NNCA(G/C)TGNN|), Tsp45I (|GT(G/C)AC), Tli (CjTCGAG), BstBI (TTjCGAA), Tthllll (GACN|NNGTC), BsaBI (GATNNjNNATC), TaqRI (T|CGA),Tfi (G|A(A/T)TC), PspGI (|CC(A/T)GG), Apol (Pu|AATTPy), HincII (GTPy|PuAC), и EcoRI (GjAATTC).

Для изучения природы синтезированной ДНК анализировали продукты, полученные с использованием Tsp509I. Продукты реакции полностью расщеплялись ДНКазой I, но не расщеплялись нуклеазой золотистой фасоли (специфичной к одноцепочечной ДНК), указывая на то, что он представляет собой двухцепочечную ДНК.

Для выяснения механизма реакции продукты синтеза длиной 10-50 п.о. сначала обрабатывали полимеразой Vent (ехо-). Оказалось, что короткие молекулы ДНК, элонгировались до более длинных молекул (2 т.п.о.) и количество ДНК возрастало более чем в 100 раз. Эта высокомолекулярная ДНК, очищенная от полимерзы, при добавлении рестриктазы Tsp509I снова расщеплялась на короткие фрагменты. Цикл элонгация-расщепление воспроизводился в работе 3 раза. Таким образом, эти эксперименты показали, что затравками для синтеза более длинных молекул ДНК в реакции служили короткие фрагменты, получающиеся в результате специфического гидролиза эндонуклеазой.

Для определения нуклеотидной последовательности синтезированной ДНК продукты были клонированы. Оказалось, что повторяющимися мотивами последовательности являются палиндромы с сайтами, узнаваемыми использованными эндонуклеазами. Так в случае эндонуклеазы Tsp509I, узнающей последовательность ААТТ, мотив имеет последовательность (А4Т4)п и (A5Ts)n и число повторов варьирует от 2 до 8. В случае же другой эндонуклеазы TspRI, узнающей непалиндромную последовательность CA(G/C)TG, мотив также представляет собой палиндром, однако более протяженный -(ATACACTGTATATACAGTGTAXm. При этом сайты узнавания были отделены друг от друга дополнительной последовательностью. Последовательности, подобные синтезированным в ходе реакции, были найдены в некоторых геномных ДНК, например в ДНК человека, мыши Mus Musculus и крокодила Crocodylus moreletii (Liang et al., 2004).

Таким образом, рассмотренные примеры синтеза ДНК ab initio достаточно убедительно демонстрируют, что термофильные ДНК-полимеразы могут в отсутствие матрицы и праймера синтезировать последовательности ДНК, представленные тандемными повторами последовательностей палиндромной или квазипалиндромной струтктуры. Последовательности, подобные синтезированным ab initio, широко распространены как в сателлитной ДНК, так и в кодирующих участках генома эукариотов.

1.1.3. Распространененность феномена формирования ферментами информации, независимо от матрицы ДНК или РНК

Известно, что ДНК-полимеразы кроме полимеразной активности, катализирующей реакцию присоединения нуклеотида к 3'' концу праймерной ДНК, обладают и другими активностями. Многие ДНК полимеразы обладают 5;—>3' экзонуклеазной активностью (ДНК-полимераза Taq) или 3'—>5'' корректирующей экзонуклеазной активностью (ДНК-полимераза Pfu) или даже двумя активностями вместе, как у некоторых ферментов семейства A (Pavlov et al., 2004). ДНК-полимеразы обладают также способностью вытеснять цепь ДНК, с которой она сталкивается по ходу полимеризации (Walker et al., 1992). Этой активностью обладает в частности большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst, использованный в настоящей работе (http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/polymerases/polymerases_frorn_neb.asp).

Перечисленные выше свойства ДНК-полимераз проявляются в присутствии матрицы, однако ДНК-полимеразы могут создавать информацию в отсутствие матричной цепи, катализируя добавление одного и более нуклеотидов на Ъ1 тупые концы дуплексной

субстратой ДНК (Berdis and McCutcheon, 2007; Clark, 1988; Garcia et al., 2004). Примерами таких полимераз являются фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е coli, Taq полимераза, эукариотические ДНК-полимеразы а и полимераза (3, ДНК-полимераза I из Saccharomyces cerevisiae, обратная транскриптаза AMV (Clark, 1988, 1991; Ни, 1993; Garcia et al., 2004) и использованный в настоящей работе большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst.

В качестве еще одного примера синтеза в отсутствие матрицы можно рассматривать репликативное прохождение поврежденных участков ДНК (translesion synthesis, TLS), которые не удалось восстановить в процессе репарации. Эти участки, например апуриновые/апиримидиновые сайты и пр., возникают в результате воздействия повреждающих агентов на химические связи ДНК (Prakash et al., 2005). Прохожение таких участков эквивалентно синтезу в отсутствие матрицы. Следует подчеркнуть, что при этом ДНК-полимеразы вносят изменения в генетическй код организма. Полимеразы, способные эффективно проходить поврежденные участки ДНК известны у про- и эукариот (Garcia-Diaz and Bebenek, 2007; Prakash et al., 2005). Большинство этих полимераз выделено в особое семейство Y. Они характеризуются низкой точностью синтеза на неповрежденной ДНК (частота ошибок Ю^-Ю"3) (Goodman, 2002; Ohmori et al., 2001). Интересно, что в экспериментах да vitro показано, что и высокоточные полимеразы могут проходить поврежденные участки (Berdis and McCutcheon, 2007; Hsu et al., 2004).

Еще одним примером формирования информации, независимой от матрицы, является способность некоторых ДНК-полимераз (фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli, ДНК-полимераза Taq, ДНК-полимеразы человека а, (3, 8) синтезировать новую цепь ДНК, стыкуя две отдельные матрицы (рис. 3) (Garcia et al., 2004).

р с"

Т

т

i

Template synapsis

Рис. 3. Схематическое представление этапов стыковке матрицы.

Обозначения: С и Т - отдельные матрицы, Р - праймер. Отмечены комплементарные Ъ' концы (Garcia 2004).

i

Primer extension

Согласно предложенной модели, стыковка матрицы происходит в два этапа. На первом этапе полимераза ведет синтез ДНК на праймированной матрице, после чего формирует дуплекс с 3'' выступющим конецом (одноцепочечным участком) на цепи праймера. Следует подчеркнуть, что формирование такого участка происходит в результате независимого от матрицы включения нуклеотидов в 3'"' конец синтезированной цепи. Другая матрицы является одноцепочечной и ее 3' конец комплементарен 3' выступающему концу дуплекса. На втором этапе ДНК-полимераза совмещает две отдельные матрицы и после этого она может продолжать полимеризацию. Результатом стыковки отдельных матриц может быть синтез прямых повторяющиехся последовательностей ДНК (Clark, 1991; King et al., 1996).

Таким образом, при изменении обычных условий репликации (депуринизация, разрыв матрицы) ДНК-полимеразы могут переключаться на независимый от матрицы синтез ДНК.

Способность формировать информацию, независимую от матрицы присуща целому ряду ферментов. Так, QP репликаза (РНК зависимая РНК полимераза бактериофага QP Е. coli) в отсутствие добавленной матрицы синтезировала РНК in vitro (Biebricher et al., 1981; Kacian et al., 1972; Mills et al., 1973; Sumper and Luce, 1975). Первичная структура синтезированной «de novo» РНК зависела от условий эксперимента. Последовательности РНК не являлись гомополимерами или чередующимися нуклеотидами и имели выраженную вторичную структуру. В последующих экспериментах было показано, что в основе независимого от матрицы синтеза РНК лежит способность Qp репликазы конденсировать

нуклеозидтрифосфаты до более или менее случайных олигонуклеотидов (Biebricher et al., 1986).

Способность катализировать белком создание генетической информации было показано и для ДНК зависимых РНК-полимераз (Biebricher and Luce, 1996; Krakow and Karstadt, 1967). Так, ДНК-зависимая РНК полимераза бактериофага Т7 синтезировала большое разнообразие различных видов РНК в отсутствие матрицы (Biebricher and Luce, 1996). Более того, синтезированная РНК специфически реплицировалась РНК-полимеразой Т7, но не реплицировалась РНК-полимеразами Е. coli или бактериофага SP6 или Qß репликазой. Однако, это свойство появлялось при длительном времени инкубации (20 ч и более) и достаточно высоких концентрацях фермента и субстратов. В клетках in vivo, экспресирующих РНК-полимеразу Т7, не обнаружили видов РНК, подобных синтезируемым in vitro в отсутствие матрицы.

Среди ферментов, способных вести синтез полинуклеотидов в отсутствие матрицы следует отметить полинуклеотид-фосфорилазу (Grunberg-Manago et al., 1955; Ochoa, 1956). Этот фермент катализирует синтез случайного сополимера РНК из отдельных нуклеозиддифосфатов (NDPs) и их смесей. Однако, в отличие от РНК-полимеразы, полинуклеотид-фосфорилазе в обычных условиях не требуется матрица. Считают, что в клетках полинуклеотид-фосфорилаза играет важную роль в процессинге РНК (Lin-Chao et al., 2007). Показано, что при замене MgCl2 на FeCl3 полинуклеотид-фосфорилаза начинает использовать дезоксирибонуклеозиддифосфаты (dNDPs) в качестве субстатов и синтезировать гетерополимер (Beljanski, 1996). Интересно, что в синтезированных полимерах отношение пурин/пиримидин очень близко к тем отношениям, которые найдены в геномной ДНК вида бактерии, из которого выделен фермент.

Таким образом, при изменении обычных условий полимеризации формирование информации в отсутствии матрицы представляется довольно распространенным феноменом не только среди ДНК-полимераз, но и среди других ферментов, катализирующих образование фосфодиэфирной связи.

1.1.4. Возможная функциональная роль независимого от матрицы синтеза ДНК

Как было показано выше, при секвенировании продуктов синтеза ДНК ab initio Огата и Миура установили, что последовательность синтезированной ДНК представлена

тандемными повторами, подобными (CTAGATAT)n. Проведя сравнение с известными последовательностями ДНК, авторы с удивлением обнаружили, что подобные повторяющиеся последовательности ДНК представлены в сателлитной ДНК, а также в кодирующих участках генома эукариот (Ogata and Miura, 1997).

Возможно, что тандемная повторяющеяся структура многих генов могла возникнуть путем синтеза ДНК ab initio, а не путем дупликации генов, как обычно считают (Ogata and Miura, 1997, 1998b). Повторяющиеся последовательности ДНК широко распрстранены в природе. Известны не только ди- и тринуклеотидные повторы, но и повторы из 12 и 14 пар оснований (Schlotterer and Tautz, 1992; Tuntiwechapikul and Salazar, 2002). Увеличение числа повторов в тандеме приводит к множествам тяжелых генетических заболеваний у человека таким как миотоническая дистрофия, болезнь Хантингтона, синдром Мартина-Белла (синдром ломкой Х-хромосомы), атаксия Фридрейха (Ji et al., 1996; Wells et al., 2005) Однако, несмотря на многочисленные исследования, механизм увеличения числа повторов in vivo остается в значительной степени неизвестным. Вероятно, изучение механизма элонгации молекул при независимом от матрицы синтезе ДНК может внести свой вклад в понимание механизма возникновения этих тяжелых и довольно распространенных наследственных заболеваний.

Тот факт, что ДНК полимеразы могут синтезировать ДНК ab initio, дает осование предполагать, что синтез ДНК белком мог происходть на ранней Земле у некоторых примитивных организмов, которые появились перед дивергенцией архей и бактерий (Ogata and Miura, 1997, 1998b).

В свое время, Ohno высказал гипотезу о том, что первый набор кодирующих последовательностей, возникших в предбиотическом мире, был представлен повторами нуклеотидных олигомеров (Ohno, 1987а, 1987b). В работах, посвященных изучению синтеза ДНК ab initio, эта гипотеза получила дальнейшее pa3BHTne(Ogata and Miura, 1998b). Огата и Миура предположили, что на ранних этапах эволюции живой материи примитивные полипептиды, имеющие полимеразоподобную активность, синтезировали длинные молекулы ДНК с простыми повторяющимися последовательностями (Ogata and Miura, 1998а). Эти молекулы постепенно эволюционировали в вырожденные последовательности путем накопления мутаций во время репликации с относительно низкой точностью (error-prone) первичными ферментами. Разнообразие последовательностей, которое авторы наблюдали в

реакциях синтеза ДНК ab initio при изменении температуры, рН и ионной силы, могло возникать и в результате изменений условий окружающей среды в предбиотическом мире.

На начальных этапах эволюции генетического материала синтез ab initio случайных последовательностей ДНК происходил с очень низкой эффективностью. Франк-Каменецкий и соавт., продемонстрировав в работах стимулирвание синтеза рестриктазами, подчеркнули, что расщепление нуклеиновых кислот могло играть важную роль на начальном этапе эволюции нуклеиновых кислот (Liang et al., 2004). Помимо повышения эффективности амплификации ДНК ab initio, ферменты рестрикции могли служить дополнительным фактором селекции, определяя последовательность, которая будет синетзироваться ДНК полимеразой. Синтез в присутствии ферментов рестрикции мог быть дополнительным фактором разнообразия последовательностей, так как различные ферменты рестрикции могли помогать конструировать библиотеку последовательности ДНК и комбинации этих последовательностей могли производить информационно более насыщенные длинные последовательности ДНК. Авторы предполагают, что механизм реакции, состоящий из циклов полимеризации (роста) и расщепления (генерирования новых затравок) мог отвечать за основание жизни, поскольку полимеризация и расщепление могли выполняться не только белком, но и РНК или другой функциональной молекулой.

1.2. НИКУЮЩИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1.2.1. Общая характеристика никаз. Никаза Nt.Bsp.D6I

К никующим эндонуклеазам относят две группы ферментов, вносящих разрыв (nick) только в одну из цепей ДНК (Roberts et al., 2003). В первую группу входят эндонуклеазы, ассоциированные в клетке исключительно с т5С-ДНК-метилтрансферазами. Они вносят разрыв рядом с неспаренными основаниями G/T пар, возникающими в результате дезаминирования ш5-цитозинов внутри последовательности, узнаваемой метилтрансферазой. Ферменты этого типа в соответствие с номенклатурой обозначаются префиксом «V» перед названием штамма, с которым ассоциирована данная метилтрансфераза.

Во вторую группу входят никующие эндонуклеазы, которые узнают в двухцепочечной ДНК короткую специфическую последовательность и расщепляют ДНК в фиксированном положении относительно узнаваемой последовательности. Никующие эндонуклеазы этой группы обозначаются символом «N» перед сокращенным названием рода бактерии, из

которой выделен фермент. В зависимости от того, какую цепь - верхнюю (top) или нижнюю (bottom) расщепляет никующая эндонуклеаза, она обозначается символом Nt или Nb, соответственно (Железная и др., 2009).

Впервые никующая эндонуклеаза, со свойствами, присущими никазам, не связанными с метилированием, были впервые выделены из вируса NYs-1 хлореллы. Она узнает последовательность всего из двух п.о. (СС) и вносит разрыв непосредственно перед сайтом узнавания в ту же цепь (Xia et al., 1988). Однако очень низкая специфичность этой никующей эндонуклеазы не привлекла к ней в свое время внимания. Выделение этих никующих эндонуклеаз в отдельный тип ферментов началось после обнаружения в 1996 г сотрудниками НПО «Сибэнзим» никующей эндонуклеазы Nt.BstSEI из Bacillus stearothermophilus SE, описаннной под названием «никаза» (Абдурашитов и др., 1996). После нескольких лет, почти одновременно появилось несколько сообщений о других никующих эндонуклеазах. В 2000 г. о выделении такого же фермента, N.BstNBI, из штамма В. stearothermophilus NB сообщили сотрудники фирмы New England Biolabs (Morgan et al, 2000). В 2001 г. в Лаборатории Н.И. Матвиенко (Институт белка РАН) из штамма Bacillus species D6 была выделена никаза Nt.BspD6I (Железная и др., 2001). Перечисленные никующие эндонуклеазы (Nt.BstSEI, Nt.BstNBI, Nt.BspD6I) обладают одинаковой специфичностью (узнают одинаковую последовательность в ДНК) и одинаково расщепляют ДНК. Две никующих эндонуклеазы с новыми специфичностями - Nb.BsrDI и Nb.BtsI - были найдены в природных бактериальных штаммах лишь в 2007 году (Xu et al., 2007).

Широкое применение никующих эндонуклеаз в научных исследованиях и медицинской диагностике долгое время сдерживалось недостаточным разнообразием специфичности природных ферментов. В то же время, количество работ, в которых используются никующие эндонуклеазы, возрастает, и эти ферменты становятся еще одним инструментом молекулярной биологии (см. следующий раздел). Возрастающий интерес к практическому применению никующих эндонуклеаз стимулировал интенсивную работу по конструированию искусственных никаз с новыми сайтами узнавания. Можно выделить две основные стратегии, используемые при конструировании искусственных никующих эндонуклеаз. Первая состоит в получении никаз путем нарушения димеризационного интерфейса эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Вторая стратегия связана с инактивацией каталитического центра в одной из субъединиц гетеродимерных эндонуклеаз рестрикции (например, на основе гетеродимерных эндонуклеаз Ври 101 и BbvCI) (Heiter et al., 2005;

Stankevicius et al., 1998) или с инактивацией одного каталитического центра в эндонуклеазах с двумя центрами в мономерной молекуле (Sapl, Bsal и др.) (Samuelson et al., 2004; Zhu et al., 2004). Перечень никующих эндонуклеаз, приводимый в базе данных REBASE (http://rebase.neb.com), состоит в основном из искусственно полученных ферментов.

В настоящей работе использована ииказа Nt.BspDól. Она узнает в двухспиральной ДНК последовательность (сайт) 5 -GAGTC-3 /5 -GACTC-3 и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 п.о. от сайта узнавания в сторону 3-конца. Никаза проявляет активность в присутствии ионов Mg2~. При внесении разрыва образуется 3 -ОН конец.

1.2.2. Применение никующих эндонуклеаз

Несмотря на то, что никующие эндонуклеазы (далее никазы) открыты сравнительно недавно (Абдурашитов и др., 1996), они уже нашли применение в разработке различных методов, в том числе методов, предназначенных для медицинской диагностики. В настоящем разделе мы остановимся в основном на описании методов, в которых никазы используются совместно с ДНК-полимеразами. В большинстве этих методов никазы используются для внесения в одну из цепей двухцепочечной ДНК разрыва с образованием 3 -ОН конца, с которого ДНК-полимеразы начинают синтез комплементарной цепи. Принцип одного из первых методов (Van Ness et al., 2003), представлен на рис. 4.

Ness et al., 2003).

В этом методе один из олигонуклеотидов дуплекса имеет в своем составе последовательность расщепляемой цепи сайта никазы. После расщепления этой цсгш никазой образовавшийся фрагмент олигоиуклеотида (12 нт) уходит в раствор, т.к. его температура плавления ниже температуры, при которой идет реакция (55°С). ДНК-полимсраза, присутствующая в реакции, использует появившейся свободный 3 -ОН-конец, и начинает синтез. Но как только ДНК-полимераза достраивает цепь, никаза снова вносит разрыв в достроенную цепь. Этот процесс многократно повторяется и таким образом синтезируется большое количество олигоиуклеотида длиной 12 нт.

На схеме, представленной на предыдущем рисунке, реакция амплификации носит линейный характер. Схема перехода реакции в экспоненциальный режим представлена на рис 5.

Олигонуклеотид-триггер

формирование временного дуплекса

ш.

5'

ШШ1ШН11)£|

X'

Матрица

X'

активация новых молекул матрицы

5'_3'

mimiiiiiiilgl

освобождение продление

продукта Линейная Амплификация дуплекса

5-..............• ;............ 5-.

N Н'ЩППГПП>ПП11и11ИИ11 5. N '"И.......... -i............... 5-

никовамная двухцепочечная матрица двухцепочечмая матрица

IHHIIIIIIIH|g|HIIIIIHIHII

никование

5' - GAGTCNNNN - 3' 3' - CTCAGNNNN - 5'

winuiiiiiiBimiinniini

Сайт узнавания/

расщепления

Nt.BstNBI

Рис. 5. Экспоненциальная реакции амплификации (EXPAR). Матрица и триггерный олигонуклеотид подписаны на рисунке, X и X - комплементарные последовательности, прямоугольником - сайт узнавания/расщепления никазы (Tan et al., 2008).

Основным участником в реакции становится амплифицируемая матрица -олигонуклеотид с особой последовательностью ('I an et al., 2008). Олигонуклеотид состоит из двух одинаковых последовательностей, которые разделены последовательностью нижней цепи сайта узнавания никазы и четырьмя дополнительными нуклеотидами. В этой реакции олигонуклеотид, синтезируемый в линейной реакции, выступает в качестве триггера, запускающего экспоненциальную реакцию. При связывании триггера X с комплементарной З'-концевой половиной матрицы последовательность триггера продлевается ДНК полимеразой, формирующей двухцепочечный сайты узнавания и расщепления для пиказы 5 -GAGTC(N)4-3 на верхней цепи. Верхняя цепь расщепляется никующей эндонуклеазой. При температуре реакции 55°С новосиптезированиый триггер диссоциирует с матрицы. Триггер-продуцирующая форма матрицы вновь вступает в цикл линейной амплификации, и цикл продления дуплекса, никования и освобождения триггера повторяется. Реакция, протекающая по этой схеме, получила название EXPAR (exponential amplification reaction) (Van Ness et al., 2003). Важно отметить, что эта реакция - изотермическая и синтезирует до 109 копий триггера за 10 мин. Модифицированный метод EXPAR был успешно применен для разработки метода детектирования вируса простого герпеса I (I-ISV1) (Tan et al., 2007).

В методе, названном амплификацией ДНК, опосредованной никующей эндонуклеазой (nicking-endonuclease mediated DNA amplification, NEMDA). предложенном Чан с соавг., для амплификации случайных последовательностей геномной ДНК, использовалась никующая эндонукпеаза Nt.CviPIl с узнаваемой последовательностью размером три п.о. в комбинации с ДНК-полимеразой Bst (рис. 6.) (Chan el al., 2004).

Расщепление геномной ДНК Nl.CviPII 5 4-i-1-

Продление 3' концов Bs! ДНК-полимеразой

5'----

3' • -

Расщепление фрагментов Nl.CviPII

у-4—

5'-

3~г

5'-

3'-

Рис. 6. Механизм реакции NEMDA; используются большой фрагмент Bst ДНК и Nt.CviPII.

Красным цветом обозначены фрагменты геномной ДНК, синим -продукты амплификации, черной стрелкой - сайты расщепления никазы. Частичное расщепление никазой Nt.CviPII может

генерировать продукты различной длины (Chan et al„ 2004).

Т

Амплифицированные фрагменты он ДНК

3'-5'

3'-5' 3'-

3'-

3 - 5'

3'-

■ 5'

- 5' ■ 5'

Представленный метод изотермической амплификации ДНК проходит за один этап, не требует синтеза праймеров и генерирует большое количество оцДНК (103 копий) из одной бактериальной колонии за короткий временной период времени (10-30 мин). Амплификацию случайных последовательностей ДНК авторы предлагают использовать в гибридизационном анализе для выявления патогенов, имеющем большое значение в области биологической защиты и здоровья общества. Подчеркивается, что данный метод может быть адаптирован для клинических образцов или проб из окружающей среды, использоваться с различными метками (например, биотип или флуоресцеин) или проходить с включением в продукты амплификации модифицированных dNTP.

На основе использования никующих эндонуклеаз предложен метод мечения уникальных последовательностей в двухцепочечной ДНК (Kuhn and Frank-Kamenetskii, 2008). Метод основам на внесении никазой (никазами) двух разрывов на расстоянии 15-25 нуклеотидов друг от друга в одной и той же цепи ДНК. Фрагмент, фланкированный разрывами, в реакции вытеснения цепи замещается олигонуклеотидом и лигазой ковалентно «сшивается » с ДНК. Длинный 3 -конец олигонуклеотида не комплементарен ДНК-мишени и представляет собой разветвленную ДНК (3 -Пар). Этот конец используется в качестве

праймера в реакции амплификации по типу катящегося кольца, и наработанная ДНК регистрируется с помощью флуоресцентного зонда. Метод предполагается использовать для детектирования вирусной двухцепочечной ДНК.

В методе картирования ДНК с использованием флуоресцентной метки ДНК подвергается обработке никазой, в результате чего в ДНК образуются ники со свободными 3 -ОН концами. Присутствующая в реакционной смеси ДНК-полимераза начинает синтез с образовавшихся ников. Но так как последовательность сайта, узнаваемого никазой, и место внесение разрыва в ДНК известны, то в реакционную смесь добавляется только флуорецентно меченый дидезоксинуклеотид, соответствующий первому добавляемому пуклеотиду. Присоединение дидезоксинуклеотида блокирует дальнейший синтез ДНК. Обработанную таким образом ДНК анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии. По характеру распределения флуоресцентной метки вдоль ДНК можно определить, к какому патогену относится эта ДНК (рис. 7) (Xiao et al., 2007).

А 1Í.7U)

12-7№ ,17 Jk» ЗОкЬ I 40.Ш>

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Зырина, Надежда Витальевна

выводы

1. Впервые установлено, что никующие эндонуклеазы стимулируют высокоэффективный синтез ДНК в отсутствие матрицы и праймера (синтез ДНК ab initio).

2. Установлено, что структура ДНК, синтезированная в присутствии никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I, является двухцепочечной, содержащей разветвленные участки.

3. Определена нуклеотидная последовательность ДНК, синтезированной в присутствии Nt.BspD6I, которая состоит из повторов сайта узнавания никазы в прямой или обратной ориентации.

4. Предложен механизм синтеза ДНК ab initio в присутствии Nt.BspD6I.

5. Показано, что белок gp32 бактериофага Т4, связывающийся с одноцепочечной ДНК, ингибирует синтез ДНК ab initio, но не влияет на синтез ДНК в присутствии матрицы и праймера. Таким образом, его можно рекомендовать в качестве ингибитора синтеза ДНК ab initio в реакциях амплификации ДНК с участием никующих эндонуклеаз.

Список публикаций по материалам диссертационной работы

Статьи

1. Zyrina N.V., Zheleznaya L.A., Dvoretsky E.V., Vasiliev V.D., Chernov A., Matvienko N.I. N.BspD6I DNA nickase strongly stimulates template independent synthesis of non-palindromic repetitive DNA by Bst DNA polymerase. Biol. Chem. 2007, Vol. 388, pp. 367-372.

2. H.B. Зырина. Л.А.Железная, И.В. Свадьбина, Н.И. Матвиенко.

Новый метод получения выеокоочищенного белка р32 бактериофага Т4 для биомедицинских исследований. Биомедицинский журнал Medline.ru, 2011, Т. 12, с. 1101-1118.

3. Н.В. Зырина. Р.И. Артюх, И.В. Свадьбина, Л.А. Железная, Н.И. Матвиенко.

Влияние белков, связывающихся с одноцпочечной ДНК, на безматричный/беспраймерный синтез ДНК в присутствии никующей эндонуклеазы Nt.BspD6I. Биоорганическая химия, 2012, Т. 38, N2, с. 199-205.

Тезисы докладов

1. Зырина Н.В., Железная Л.А., Матвиенко Н. И. Очистка С-концевого фрагмента ДНК полимеразы Bacillus stearothermophillus и его применение в амплификации ДНК по типу катящегося кольца. Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы Третьего Московского международного конгресса (Москва, 14-18 марта, 2005 г.) М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2005-часть 1, с.68.

2. Дворецкий Е. В., Зырина Н.В. Матвиенко Н. И., Васильев В. Д. Безматричный синтез Bst ДНК-полимеразой в присутствии никазы. Биология - наука XXI века: X Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17-21 апреля, 2006 г.) Сборник тезисов, Т.1, с. 13.

3. Дворецкий Е. В., Зырина Н.В. ДНК никазы N.Bsp D6I, N. Alwl, N.BbvC IA, BsmI стимулируют синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой из Bacillus stearothermophilus.

XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2006» (Москва, 12-15 апреля 2006 г). Материалы конференции, с. 72-73.

4. Zyrina N.V. Zheleznaya L.A., Dvoretsky E.V., Vasiliev V.D., Chernov A., Matvienko N.I. Template independent DNA synthesis by Bst DNA polymerase in the presence of site-specific DNA nickases. Proceedings of the 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences International Conference on «Protein Biosynthesis, Structure and Function» June 9-13, 2007, Pushchino, Russia, p 35.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа посвящена решению актуальной молекулярно-биологической научной задачи - изучению неспецифического синтеза ДНК в отсутствии добавленных извне матрицы и праймера (синтез ДНК ab initio). Нами впервые обнаружено, что синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst эффективно стимулируется никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I, открытой в нашей лаборатории, а также никующими эндонуклеазами Nt. Alwl, Nb.BbvcI и Nb.BsmI. Синтез ДНК ab initio в присутствии никующих эндонуклеаз показал зависимый от концентрации характер: при небольших количествах никазы синтезировались высокомолекулярные продукты, при высоких количествах появлялись низкомолекулярные гомогенные полосы. Наличие низкомолекулярных продуктов свидетельствует о том, что синтез ДНК сопровождается гидролизом.

Мы остановились на детальном изучении синтеза ДНК ab initio в присутствии никазы Nt.BstD6I. Проведенный анализ структуры синтезированной ДНК обработкой различными нуклеазами (ДНКазой I, эндонуклеазой рестрикции Hinfl, нуклеазой золотистой фасоли) а также анализ с использованием электронной микроскопии показал, часть молекул ДНК имела разветвленные участки. Таким образом, было установлено, что синтезированная ДНК имеет необычную структуру.

Для определения нуклеотидной последовательности продуктов синтеза ДНК ab initio была поставлена задача клонировать ДНК, синтезированную ab initio, в плазмидном векторе pUC 18. Задача осложнялась тем, что большие вставки, содержащие большое количество повторяющихся последовательностей ДНК, не поддерживаются при клонировании, поскольку в таких вставках часто происходят делеции. По этой причине мы получали вставки небольшого размера, гидролизуя синтезированную до среднего размера 100 п.о. Были клонированы продукты синтеза ДНК ab initio, стимулированного никующей эндонуклеазой, а также продукты синтеза только полимеразы Bst. Анализ последовательностей ДНК, синтезированной в присутствии никазы, показал, что большинство продуктов состоит из повторов в прямой или обратной ориентации последовательности сайта, узнаваемого никазой, с одним дополнительным нуклеотидом А или Т (Рис. 8). Встречались также повторы сайта узнавания никазы без вставки дополнительного нуклеотида. Последовательности ДНК, синтезированной в присутствии только полимеразы, оказались представленными dAT сополимерами. Таким образом, оказалось, что последовательности продукта синтеза ab initio в присутствии ииказы четко отличается от опубликованных ранее последовательностей продуктов, синтезированных только полимеразой и полимеразой в присутствие эндонуклеаз рестрикции.

На основе полученных нами данных мы предложили модель элонгации ДНК при синтезе ab initio, стимулируемом никующими эндонуклеазами. Модель объясняет образование разветвленной структуры и учитывает особенности использованных нами ферментов. Модель хорошо согласуется с известными данными по амплификации ДНК полимеразами при независимом от матрицы синтезе ДНК.

В данной работе проведено изучение возможности ингибирования неспецифического синтеза ДНК ab initio. Дело в том, что в настоящее время для диагностических исследований предложен целый методов, основанных на использовании ДНК-полимераз совместно с никующими эндонуклеазами. В этих методах никующие эндонуклеазы часто используются вместе с большим фрагментом ДНК-полимеразы Bst. Использование никующих эндонуклеаз в сочетании с ДНК-полимеразами, как показано в данной работе, приводит к синтезу неспецифических продуктов, с которым столкнулись и другие исследователи. В связи с этим остро стоит проблема избавления от продуктов неспецифического синтеза ДНК в присутствии никующих эндонуклеаз. В качестве возможных ингибиторов были рассмотрены белки SSB Е. coli (Eco SSB) и продукт гена 32 бактериофага Т4 (Т4 gp32), наиболее изученные и доступные в качестве коммерческих препаратов. Оказалось, что белок Eco SSB несколько стимулирует синтез ДНК ab initio одной ДНК-полимеразой Bst и практически не вляет на синтез ДНК ab initio в присутствии никазы Nt.BspD6I. Т4 gp32. Мы показали, что белок Т4 gp32 ингибирует синтез ДНК ab initio, но не влияет на синтез ДНК в присутствии матрицы и праймера. Таким образом, его можно рекомендовать в качестве ингибитора синтеза ДНК ab initio в реакциях амплификации ДНК с участием никующих эндонуклеаз.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зырина, Надежда Витальевна, 2012 год

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Абдурашитов, М. А., Беличенко, О. А., Шевченко, А. В., и Дегтярев, С. X. (1996). N.BstSE - сайт-специфическая нуклеаза из Bacillus stearothermophilus SE-589. Мол. биол. 30,1261-1267.

2. Железная, Л. А., Перевязова, Т. А., Альжанова, Д. В., и Матвиенко, Н. И. (2001). Сайт-специфическая никаза из штамма Bacillus species D6. Биохимия 66,1215-1220.

3. Железная, Л. А., Качалова, Г. С., Артюх, Р. И., Юнусова А. К., Перевязова Т. А. и Матвиенко, Н. И. (2009). Никующие эндонуклеазы. Успехи биологической химии, 49, с. 107-128.

4. Маниатис, Т., Фрич, Э., and Сэмбрук, Д. (1984). Молекулярное клонирование. Мир, Москва

5. Alberts, В. М., and Frey, L. (1970). Т4 bacteriophage gene 32: a structural protein in the replication and recombination of DNA. Nature 227 (5265), 1313-1318.

6. Aliotta, J. M., Pelletier, J. J., Ware, J. L., Moran, L. S., Benner, J. S., and Kong, H. (1996). Thermostable Bst DNA polymerase I lacks a 3'->5' proofreading exonuclease activity. Genet Anal 12 (5-6), 185-195.

7. Bath, J., Green, S. J., and Turberfield, A. J. (2005). A free-running DNA motor powered by a nicking enzyme. Angew Chem Int Ed Engl 44 (28), 4358-4361.

8. Baugh, L. R., Hill, A. A., Brown, E. L., and Hunter, C. P. (2001). Quantitative analysis of mRNA amplification by in vitro transcription. Nucleic Acids Res 29 (5), E29.

9. Beljanski, M. (1996). De Novo synthesis of DNA-like molecules by polynucleotide phosphorylase in vitro. Journal of Molecular Evolution 42 (5), 493-499.

10. Berdis, A. J., and McCutcheon, D. (2007). The use of non-natural nucleotides to probe template-independent DNA synthesis. Chembiochem 8 (12), 1399-1408.

11. Biebricher, С. K., and Luce, R. (1996). Template-free generation of RNA species that replicate with bacteriophage T7 RNA polymerase. EMBOJ15 (13), 3458-3465.

12. Biebricher, С. K., Eigen, M., and Luce, R. (1981). Product analysis of RNA generated de novo by Q beta replicase. JMol Biol 148 (4), 369-390.

13. Biebricher, С. K., Eigen, M., and Luce, R. (1986). Template-free RNA synthesis by Q beta replicase. Nature 321 (6065), 89-91.

14. Bochkarev, A., Pfuetzner, R. A., Edwards, A. M., and Frappier, L. (1997). Structure of

the single-stranded-DNA-binding domain of replication protein A bound to DNA. Nature 385 (6612), 176-181.

15. Brack, C. (1981). DNA electron microscopy. CRC Crit Rev Biochem 10 (2), 113-169.

16. Brack, C., Bickle, T. A., and Yuan, R. (1975). The relation of single-stranded regions in bacteriophage PM2 supercoiled DNA to the early melting sequences. Journal of Molecular Biology 96 (4), 693-702.

17. Brockman, J. M., Frutos, A. G., and Cora, R. M. (1999). A Multistep Chemical Modification Procedure To Create DNA Arrays on Gold Surfaces for the Study of Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance Imaging. Journal of the American Chemical Society 121 (35), 8044-8051.

18. Brukner, I., Paquin, B., Belouchi, M., Labuda, D., and Krajinovic, M. (2005). Self-priming arrest by modified random oligonucleotides facilitates the quality control of whole genome amplification. Anal Biochem 339 (2), 345-347.

19. Bujalowski, W., Overman, L. B., and Lohman, T. M. (1988). Binding mode transitions of Escherichia coli single strand binding protein-single-stranded DNA complexes. Cation, anion, pH, and binding density effects. J Biol Chem 263 (10), 4629-4640.

20. Canceill, D., Viguera, E., and Ehrlich, S. D. (1999). Replication slippage of different DNA polymerases is inversely related to their strand displacement efficiency. J Biol Chem 274 (39), 27481-27490.

21. Chan, S. H., Zhu, Z., Van Etten, J. L., and Xu, S. Y. (2004). Cloning of CviPII nicking and modification system from Chlorella virus NYs-1 and application of Nt.CviPII in random DNA amplification. Nucleic Acids Res 32 (21), 6187-6199.

22. Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., and Bloch, W. (1992). Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acids Res 20 (7), 1717-1723.

23. Chrysogelos, S., and Griffith, J. (1982). Escherichia coli single-strand binding protein organizes single-stranded DNA in nucleosome-like units. Proc Natl Acad Sei U S A 79 (19), 5803-5807.

24. Clark, J. M. (1988). Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res 16 (20), 9677-9686.

25. Clark, J. M. (1991). DNA synthesis on discontinuous templates by DNA polymerase I of Escherichia coli. Gene 104 (1), 75-80.

26. Coggins, L. W. (1987). Preparation of nucleic acids for electron microscopy. In "Electron Microscopy in Molecular Biology" (J. Sommerville, and U. Scheer, Eds.), pp. 1-29. IRL Press, Oxford, England.

27. Curth, U., Genschel, J., Urbanke, C., and Greipel, J. (1996). In vitro and in vivo function of the C-terminus of Escherichia coli single-stranded DNA binding protein. Nucleic Acids Res 24(14), 2706-2711.

28. Dabrowski, S., and Kur, J. (1999). Cloning, overexpression, and purification of the recombinant His-tagged SSB protein of Escherichia coli and use in polymerase chain reaction amplification. Protein Expr Purif16 (1), 96-102.

29. Davydova, E. K., and Rothman-Denes, L. B. (2003). Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein mediates template recycling during transcription by bacteriophage N4 virion RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 100 (16), 9250-9255.

30. Delius, H., Mantell, N. J., and Alberts, B. (1972). Characterization by electron microscopy of the complex formed between T4 bacteriophage gene 32-protein and DNA. J Mo I Biol 67 (3), 341-350.

31. Drabovich, A., and Krylov, S. N. (2004). Single-stranded DNA-binding protein facilitates gel-free analysis of polymerase chain reaction products in capillary electrophoresis. J ChromatogrA 1051 (1-2), 171-175.

32. Dunn, J. J., and Studier, F. W. (1981). Nucleotide sequence from the genetic left end of bacteriophage T7 DNA to the beginning of gene 4. JMol Biol 148 (4), 303-330.

33. Ehses, S., Ackermann, J., and McCaskill, J. S. (2005). Optimization and design of oligonucleotide setup for strand displacement amplification. J Biochem Biophys Methods 63 (3), 170-186.

34. Garcia, P. B., Robledo, N. L., and Islas, A. L. (2004). Analysis of non-template-directed nucleotide addition and template switching by DNA polymerase. Biochemistry 43 (51), 16515-16524.

35. Garcia-Diaz, M., and Bebenek, K. (2007). Multiple functions of DNA polymerases. CRC Crit Rev Plant Sci 26 (2), 105-122.

36. Goodman, M. F. (2002). ERROR-PRONE REPAIR DNA POLYMERASES IN PROKARYOTES AND EUKARYOTES. Annual Review of Biochemistry 71 (1), 17-50.

37. Grunberg-Manago, M., Oritz, P. J., and Ochoa, S. (1955). Enzymatic synthesis of nucleic acidlike polynucleotides. Science 122 (3176), 907-910.

38. Hanaki, K., Odawara, T., Muramatsu, T., Kuchino, Y., Masuda, M., Yamamoto, K., Nozaki, C., Mizuno, K., and Yoshikura, H. (1997). Primer/template-independent synthesis of poly d(A-T) by Taq polymerase. Biochem Biophys Res Commun 238 (1), 113-118.

39. Hanaki, K., Odawara, T., Nakajima, N., Shimizu, Y. K., Nozaki, C., Mizuno, K., Muramatsu, T., Kuchino, Y., and Yoshikura, H. (1998). Two different reactions involved in the primer/template-independent polymerization of dATP and dTTP by Taq DNA polymerase. Biochem Biophys Res Commun 244 (1), 210-219.

40. Heiter, D. F., Lunnen, K. D., and Wilson, G. G. (2005). Site-specific DNA-nicking mutants of the heterodimeric restriction endonuclease R.BbvCI. J Mol Biol 348 (3), 631640.

41. Hsu, G. W., Ober, M., Carell, T., and Beese, L. S. (2004). Error-prone replication of oxidatively damaged DNA by a high-fidelity DNA polymerase. Nature 431 (7005), 217221.

42. Hu, G. (1993). DNA polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' end of a DNA fragment. DNA Cell Biol 12 (8), 763-770.

43. Huberman, J. A., Kornberg, A., and Alberts, B. M. (1971). Stimulation of T4 bacteriophage DNA polymerase by the protein product of T4 gene 32. J Mol Biol 62 (1), 39-52.

44. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96 (1), 23-28.

45. Inoue, J., Shigemori, Y., and Mikawa, T. (2006). Improvements of rolling circle amplification (RCA) efficiency and accuracy using Thermus thermophilus SSB mutant protein. Nucleic Acids Res 34 (9), e69.

46. Ji, J., Clegg, N. J., Peterson, K. R., Jackson, A. L., Laird, C. D., and Loeb, L. A. (1996). In Vitro Expansion of GGC:GCC Repeats: Identification of the Preferred Strand of Expansion. Nucleic Acids Research 24 (14), 2835-2840.

47. Joyce, C. M., and Steitz, T. A. (1994). Function and structure relationships in DNA polymerases. Annu Rev Biochem 63, 777-822.

48. Kacian, D. L., Mills, D. R., Kramer, F. R., and Spiegelman, S. (1972). A replicating RNA molecule suitable for a detailed analysis of extracellular evolution and replication. Proc Natl Acad Sci USA 69 (10), 3038-3042.

49. Kaspar, P., Zadrazil, S., and Fabry, M. (1989). An improved double stranded DNA sequencing method using gene 32 protein. Nucleic Acids Res 17 (9), 3616.

50. Kazmierczak, K. M., Davydova, E. K., Mustaev, A. A., and Rothman-Denes, L. B. (2002). The phage N4 virion RNA polymerase catalytic domain is related to single-subunitRNA polymerases. EMBOJ21 (21), 5815-5823.

51. Kerman, K., Morita, Y„ Takamura, Y., Ozsoz, M., and Tamiya, E. (2004). Modification of Escherichia coli single-stranded DNA binding protein with gold nanoparticles for electrochemical detection of DNA hybridization. Analytica Chimica Acta 510 (2), 169174.

52. Kiefer, J. R, Mao, C., Hansen, C. J., Basehore, S. L., Hogrefe, H. H., Braman, J. C., and Beese, L. S. (1997). Crystal structure of a thermostable Bacillus DNA polymerase I large fragment at 2.1 A resolution. Structure 5 (1), 95-108.

53. King, J. S., Fairley, C. F., and Morgan, W. F. (1996). DNA end joining by the Klenow fragment of DNA polymerase I. J Biol Chem 271 (34), 20450-20457.

54. Koraberg, A., and Baker, T. A. (2005). "DNA replication." University Science.

55. Kornberg, A., Bertsch, L. L., Jackson, J. F., and Khorana, H. G. (1964). Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid, Xvi. Oligonucleotides as Templates and the Mechanism of Their Replication. Proc Natl Acad Sei USA 51, 315-323.

56. Kowalczykowski, S. C., Bear, D. G., and Von Hippel, P. H. (1981). Single-Stranded DNA Binding Proteins. In "The Enzymes" (D. B. Paul, Ed.), Vol. 14, pp. 373-444. Academic Press.

57. Kowalczykowski, S. C., Lonberg, N., Newport, J. W., Paul, L. S., and von Hippel, P. H. (1980). On the thermodynamics and kinetics of the cooperative binding of bacteriophage T4-coded gene 32 (helix destabilizing) protein to nucleic acid lattices. Biophys J 32 (1), 403-418.

58. Krakow, J. S., and Karstadt, M. (1967). Azotobacter vinelandii ribonucleic acid polymerase. IV. Unprimed synthesis of rIC copolymer. Proc Natl Acad Sei USA 58 (5), 2094-2101.

59. Krisch, H. M., and Selzer, G. B. (1981). Construction and properties of a recombinant plasmid containing gene 32 of bacteriophage T4. Journal of Molecular Biology 148 (3), 199-218.

60. Kuhn, H., and Frank-Kamenetskii, M. D. (2008). Labeling of unique sequences in double-

stranded DNA at sites of vicinal nicks generated by nicking endonucleases. Nucleic Acids Res 36 (7), e40.

61. Kunkel, T. A., Meyer, R. R., and Loeb, L. A. (1979). Single-strand binding protein enhances fidelity of DNA synthesis in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 76 (12), 63316335.

62. Kur, J., Olszewski, M., Dlugolecka, A., and Filipkowski, P. (2005). Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) — sources and applications in molecular biology. Acta Biochim Pol 52 (3), 569-574.

63. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (5259), 680-685.

64. Li, H., Cui, X., and Arnheim, N. (1990). Direct electrophoretic detection of the allelic state of single DNA molecules in human sperm by using the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA 87 (12), 4580-4584.

65. Liang, X., Jensen, K., and Frank-Kamenetskii, M. D. (2004). Very efficient template/primer-independent DNA synthesis by thermophilic DNA polymerase in the presence of a thermophilic restriction endonuclease. Biochemistry 43 (42), 13459-13466.

66. Lin-Chao, S., Chiou, N. T., and Schuster, G. (2007). The PNPase, exosome and RNA helicases as the building components of evolutionarily-conserved RNA degradation machines. JBiomedSci 14 (4), 523-532.

67. Lizardi, P. M., Huang, X., Zhu, Z., Bray-Ward, P., Thomas, D. C., and Ward, D. C. (1998). Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet 19 (3), 225-232.

68. Lohman, T. M., and Ferrari, M. E. (1994). Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein: multiple DNA-binding modes and cooperativities. Annu Rev Biochem 63, 527570.

69. Lohman, T. M., and Overman, L. B. (1985). Two binding modes in Escherichia coli single strand binding protein-single stranded DNA complexes. Modulation by NaCl concentration. J Biol Chem 260 (6), 3594-3603.

70. Lohman, T. M., Overman, L. B., and Datta, S. (1986). Salt-dependent changes in the DNA binding co-operativity of Escherichia coli single strand binding protein. J Mol Biol 187 (4), 603-615.

71. McClary, J., Ye, S. Y., Hong, G. F., and Witney, F. (1991). Sequencing with the large

fragment of DNA polymerase I from Bacillus stearothermophilus. DNA Seq 1 (3), 173180.

72. Mead, D. A., McClary, J. A., Luckey, J. A., Kostichka, A. J., Witney, F. R., and Smith, L. M. (1991). Bst DNA polymerase permits rapid sequence analysis from nanogram amounts of template. Biotechniques 11 (1), 76-78, 80, 82-77.

73. Milavetz, B. (1989). Oligonucleotide-directed restriction endonuclease digestion. Nucleic Acids Res 17 (8), 3322.

74. Mills, D. R., Kramer, F. R., and Spiegelman, S. (1973). Complete nucleotide sequence of a replicating RNA molecule. Science 180 (89), 916-927.

75. Molineux, I. J., and Gefter, M. L. (1974). Properties of the Escherichia coli in DNA binding (unwinding) protein: interaction with DNA polymerase and DNA. Proc Natl Acad Sei USA 71 (10), 3858-3862.

76. Molineux, I. J., Pauli, A., and Gefter, M. L. (1975). Physical studies of the interaction between the Escherichia coli DNA binding protein and nucleic acids. Nucleic Acids Res 2 (10), 1821-1837.

77. Morgan, R. D., Calvet, C., Demeter, M., Agra, R., and Kong, H. (2000). Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol Chem 381 (11), 1123-1125.

78. Murzin, A. G. (1993). OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBO J 12 (3), 861867.

79. Myers, T. W., and Romano, L. J. (1988). Mechanism of stimulation of T7 DNA polymerase by Escherichia coli single-stranded DNA binding protein (SSB). J Biol Chem 263 (32), 17006-17015.

80. Novagen (2002). pET Manual. TB055, 10th edition

81. Ochoa, S. (1956). Enzymatic synthesis of ribonucleic acid-like polynucleotides. Fed Proc 15 (2), 832-840.

82. Ogata, N., and Miura, T. (1997). Genetic information 'created' by archaebacterial DNA polymerase. Biochem J 324 (Pt 2), 667-671.

83. Ogata, N., and Miura, T. (1998a). Creation of genetic information by DNA polymerase of the archaeon Thermococcus litoralis: influences of temperature and ionic strength. Nucleic Acids Res 26 (20), 4652-4656.

84. Ogata, N., and Miura, T. (1998b). Creation of genetic information by DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Nucleic Acids Res 26 (20), 4657-4661.

85. Ogata, N., and Miura, T. (2000). Elongation of Tandem Repetitive DNA by the DNA Polymerase of the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus litoralis at a Hairpin-Coil Transitional State: □ A Model of Amplification of a Primordial Simple DNA Sequence. Biochemistry 39 (45), 13993-14001.

86. Ogata, N., and Morino, H. (2000). Elongation of repetitive DNA by DNA polymerase from a hyperthermophilic bacterium Thermus thermophilus. Nucleic Acids Res 28 (20), 3999-4004.

87. Ohmori, H., Friedberg, E. C., Fuchs, R. P. P., Goodman, M. F., Hanaoka, F., Hinkle, D., Kunkel, T. A., Lawrence, C. W., Livneh, Z., Nohmi, T., Prakash, L., Prakash, S., Todo, T., Walker, G. C., Wang, Z., and Woodgate, R. (2001). The Y-Family of DNA Polymerases. Molecular Cell 8 (1), 7-8.

88. Ohno, S. (1987a). Early genes that were oligomeric repeats generated a number of divergent domains on their own. Proc Natl Acad Sei USA 84 (18), 6486-6490.

89. Ohno, S. (1987b). Evolution from primordial oligomeric repeats to modern coding sequences. J Mol Evol 25 (4), 325-329.

90. Pavlov, A. R„ Pavlova, N. V., Kozyavkin, S. A., and Slesarev, A. I. (2004). Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications. Trends in Biotechnology 22 (5), 253-260.

91. Phang, S. M., Teo, C. Y., Lo, E., and Wong, V. W. (1995). Cloning and complete sequence of the DNA polymerase-encoding gene (Bstpoll) and characterisation of the Klenow-like fragment from Bacillus stearothermophilus. Gene 163 (1), 65-68.

92. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., and Armes, N. A. (2006). DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol 4 (7), e204.

93. Prakash, S, Johnson, R. E., and Prakash, L. (2005). EUKARYOTIC TRANSLESION SYNTHESIS DNA POLYMERASES: Specificity of Structure and Function. Annual Review of Biochemistry 74 (1), 317-353.

94. Radding, C. M., Josse, J., and Romberg, A. (1962). Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. Journal of Biological Chemistry 237 (9), 2869-2876.

95. Raghunathan, S., Ricard, C. S., Lohman, T. M., and Waksman, G. (1997). Crystal structure of the homo-tetrameric DNA binding domain of Escherichia coli single-stranded

DNA-binding protein determined by multiwavelength x-ray diffraction on the selenomethionyl protein at 2.9-A resolution. Proc Natl Acad Sci U S A 94 (13), 66526657.

96. Ramadan, K., Shevelev, I. V., Maga, G., and Hubscher, U. (2004). De novo DNA synthesis by human DNA polymerase lambda, DNA polymerase mu and terminal deoxyribonucleotidyl transferase. JMol Biol 339 (2), 395-404.

97. Rap ley, R. (1994). Enhancing PCR amplification and sequencing using DNA-binding proteins. Mol Biotechnol 2 (3), 295-298.

98. Riggs, M. G., Tudor, S., Sivaram, M., and McDonough, S. H. (1996). Construction of single amino acid substitution mutants of cloned Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I which lack 5'—>3' exonuclease activity. Biochim Biophys Acta 1307 (2), 178-186.

99. Rigler, M. N., and Romano, L. J. (1995). Differences in the mechanism of stimulation of T7 DNA polymerase by two binding modes of Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem 270 (15), 8910-8919.

100. Roberts, R. J., Belfort, M., Bestor, T., Bhagwat, A. S., Bickle, T. A., Bitinaite, J., Blumenthal, R. M., Degtyarev, S., Dryden, D. T., Dybvig, K., Firman, K., Gromova, E. S., Gumport, R. I., Halford, S. E., Hattman, S., Heitman, J., Hornby, D. P., Janulaitis, A., Jeltsch, A., Josephsen, J., Kiss, A., Klaenhammer, T. R., Kobayashi, I., Kong, H., Kruger,

D. H., Lacks, S., Marinus, M. G., Miyahara, M., Morgan, R. D., Murray, N. E., Nagaraja, V., Piekarowicz, A., Pingoud, A., Raleigh, E., Rao, D. N., Reich, N., Repin, V. E., Selker,

E. U., Shaw, P. C., Stein, D. C., Stoddard, B. L., Szybalski, W., Trautner, T. A., Van Etten, J. L., Vitor, J. M., Wilson, G. G., and Xu, S. Y. (2003). A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res 31 (7), 1805-1812.

101. Robinson, M., Lilley, R., Little, S., Emtage, J. S., Yarranton, G., Stephens, P., Millican, A., Eaton, M., and Humphreys, G. (1984). Codon usage can affect efficiency of translation of genes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res 12 (17), 6663-6671.

102. Samuelson, J. C., Zhu, Z., and Xu, S. Y. (2004). The isolation of strand-specific nicking endonucleases from a randomized Sapl expression library. Nucleic Acids Res 32 (12), 3661-3671.

103. Sancar, A., Williams, K. R., Chase, J. W., and Rupp, W. D. (1981). Sequences of the ssb

gene and protein. Proc Natl Acad Sei USA 78 (7), 4274-4278.

104. Sandhu, D. K., and Keohavong, P. (1994). Effects of the T4 bacteriophage gene 32 product on the efficiency and fidelity of DNA amplification using T4 DNA polymerase. Gene 144 (1), 53-58.

105. Schachman, H. K., Adler, J., Radding, C. M„ Lehman, I. R., and Kornberg, A. (1960). Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. Journal of Biological Chemistry 235 (11), 3242-3249.

106. Schlotterer, C., and Tautz, D. (1992). Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res 20 (2), 211-215.

107. Schwarz, K., Hansen-Hagge, T., and Bartram, C. (1990). Improved yields of long PCR products using gene 32 protein. Nucleic Acids Res 18 (4), 1079.

108. Shamoo, Y. (2001). Single-stranded DNA-binding Proteins. In "eLS". John Wiley & Sons, Ltd.

109. Shamoo, Y., Adari, H., Königsberg, W. H., Williams, K. R., and Chase, J. W. (1986). Cloning of T4 gene 32 and expression of the wild-type protein under lambda promoter PL regulation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA 83 (23), 8844-8848.

110. Shamoo, Y., Friedman, A. M., Parsons, M. R., Königsberg, W. H., and Steitz, T. A. (1995). Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA binding protein (T4 gp32) complexed to DNA. Nature 376 (6538), 362-366.

111. Shortle, D., Koshland, D„ Weinstock, G. M., and Botstein, D. (1980). Segment-directed mutagenesis: construction in vitro of point mutations limited to a small predetermined region of a circular DNA molecule. Proc Natl Acad Sei USA 77 (9), 5375-5379.

112. Sigal, N., Delius, H., Kornberg, T., Gefter, M. L., and Alberts, B. (1972). A DNA-unwinding protein isolated from Escherichia coli: its interaction with DNA and with DNA polymerases. Proc Natl Acad Sei USA 69 (12), 3537-3541.

113. Spargo, C. A, Fraiser, M. S., Van Cleve, M., Wright, D. J., Nycz, C. M., Spears, P. A., and Walker, G. T. (1996). Detection of M. tuberculosis DNA using thermophilic strand displacement amplification. Mol Cell Probes 10 (4), 247-256.

114. Stankevicius, K., Lubys, A., Timinskas, A., Vaitkevicius, D., and Janulaitis, A. (1998). Cloning and analysis of the four genes coding for BpulOI restriction—modification enzymes. Nucleic Acids Research 26 (4), 1084-1091.

115. Sumper, M., and Luce, R. (1975). Evidence for de novo production of self-replicating and

environmentally adapted RNA structures by bacteriophage Qbeta replicase. Proc Natl Acad Sei USA 72 (1), 162-166.

116. Tan, E., Erwin, B., Dames, S., Ferguson, T., Buechel, M., Irvine, B., Voelkerding, K., and Niemz, A. (2008). Specific versus nonspecific isothermal DNA amplification through thermophilic polymerase and nicking enzyme activities. Biochemistry 47 (38), 9987-9999.

117. Tan, E., Erwin, B., Dames, S., Voelkerding, K., and Niemz, A. (2007). Isothermal DNA amplification with gold nanosphere-based visual colorimetric readout for herpes simplex virus detection. Clin Chem 53 (11), 2017-2020.

118. Tebbe, C. C., and Vahjen, W. (1993). Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Appl Environ Microbiol 59 (8), 2657-2665.

119. Tuntiwechapikul, W., and Salazar, M. (2002). Mechanism of in vitro expansion of long DNA repeats: effect of temperature, repeat length, repeat sequence, and DNA polymerases. Biochemistry 41 (3), 854-860.

120. Van Ness, J., Van Ness, L. K., and Galas, D. J. (2003). Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences 100 (8), 4504-4509.

121. Viguera, E., Canceill, D., and Ehrlich, S. D. (2001). In vitro replication slippage by DNA polymerases from thermophilic organisms. J Mol Biol 312 (2), 323-333.

122. Villalva, C„ Touriol, C., Seurat, P., Trempat, P., Delsol, G., and Brousset, P. (2001). Increased yield of PCR products by addition of T4 gene 32 protein to the SMART PCR cDNA synthesis system. Biotechniques 31 (1), 81-83, 86.

123. Vincent, M., Xu, Y., and Kong, H. (2004). Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep 5 (8), 795-800.

124. Walker, G. T, Fraiser, M. S., Schräm, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G, and Malinowski, D. P. (1992). Strand displacement amplification—an isothermal, in vitro DNA amplification technique. Nucleic Acids Research 20 (7), 1691-1696.

125. Wang, L., Hall, J. G., Lu, M., Liu, Q., and Smith, L. M. (2001). A DNA computing readout operation based on structure-specific cleavage. Nat Biotechnol 19 (11), 10531059.

126. Wells, R. D., Dere, R., Hebert, M. L., Napierala, M., and Son, L. S. (2005). Advances in mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseases. Nucleic

Acids Res 33 (12), 3785-3798.

127. Williams, K. R., and Königsberg, W. (1978). Structural changes in the T4 gene 32 protein induced by DNA polynucleotides. J Biol Chem 253 (7), 2463-2470.

128. Williams, K. R., LoPresti, M. B., Setoguchi, M., and Königsberg, W. H. (1980). Amino acid sequence of the T4 DNA helix-destabilizing protein. Proc Natl Acad Sei U S All (8), 4614-4617.

129. Williams, K. R., Spicer, E. K., LoPresti, M. B., Guggenheimer, R. A., and Chase, J. W. (1983). Limited proteolysis studies on the Escherichia coli single-stranded DNA binding protein. Evidence for a functionally homologous domain in both the Escherichia coli and T4 DNA binding proteins. J Biol Chem 258 (5), 3346-3355.

130. Xia, Y. N., Morgan, R., Schildkraut, I., and Van Etten, J. L. (1988). A site-specific single strand endonuclease activity induced by NYs-1 virus infection of a Chlorella-like green alga. Nucleic Acids Res 16 (20), 9477-9487.

131. Xiao, M., Phong, A., Ha, C., Chan, T. F., Cai, D., Leung, L., Wan, E., Kistler, A. L., DeRisi, J. L., Selvin, P. R., and Kwok, P. Y. (2007). Rapid DNA mapping by fluorescent single molecule detection. Nucleic Acids Res 35 (3), el6.

132. Xu, S. Y., Zhu, Z., Zhang, P., Chan, S. H., Samuelson, J. C., Xiao, J., Ingalls, D., and Wilson, G. G. (2007). Discovery of natural nicking endonucleases Nb.BsrDI and Nb.BtsI and engineering of top-strand nicking variants from BsrDI and Btsl. Nucleic Acids Res 35 (14), 4608-4618.

133. Yang, J., Zhang, Z., Zhang, X. A., and Luo, Q. (2010). A ligation-independent cloning method using nicking DNA endonuclease. Biotechniques 49 (5), 817-821.

134. Zhang, D. Y., Zhang, W., Li, X., and Konomi, Y. (2001). Detection of rare DNA targets by isothermal ramification amplification. Gene 274 (1-2), 209-216.

135. Zhang, W., Cohenford, M., Lentrichia, B., Isenberg, H. D., Simson, E., Li, H., Yi, J., and Zhang, D. Y. (2002a). Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol 40 (1), 128-132.

136. Zhang, X., Yan, H., Shen, Z., and Seeman, N. C. (2002b). Paranemic cohesion of topologically-closed DNA molecules. J Am Chem Soc 124 (44), 12940-12941.

137. Zheleznaya, L. A., Kopein, D. S., Rogulin, E. A., Gubanov, S. I., and Matvienko, N. I. (2006). Significant enhancement of fluorescence on hybridization of a molecular beacon to a target DNA in the presence of a site-specific DNA nickase. Anal Biochem 348 (1),

123-126.

138. Zhu, Z., Samuelson, J. C., Zhou, J., Dore, A., and Xu, S. Y. (2004). Engineering strand-specific DNA nicking enzymes from the type IIS restriction endonucleases Bsal, BsmBI, and BsmAI. J Mol Biol 337 (3), 573-583.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я благодарна своим научным руководителям Людмиле Алексеевне Железной и Николаю Ивановичу Матвиенко за идеи и вдохновение, поддержку и неоценимую помощь в течение многих лет работы, за создание атмосферы сотрудничества среди коллег.

Хотелось бы поблагодарить коллектив Лаборатории кристаллофизики ИТЭБ и, особенно, коллег из Лаборатории молекулярной генетики ИБ за готовность прийти на помощь словом и делом.

Я выражаю глубокую личную благодарность Ильясовой Елене Николаевне, председателю профкома ИТЭБ, за неравнодушие и помощь в выживании в условиях постаспирантуры.

Я искренне признательна родным и друзьям за переживание и моральную поддержку.

Хочу поблагодарить мою подругу к.б.н. Веру Холыневу и свекровь Софью Павловну за то, что подставляли мне свое верное плечо в трудную минту.

Я бесконечно благодарна своему супругу Вадиму за любовь, терпение и поддержку моих начинаний.