Молекулярно-генетический мониторинг минимальной остаточной болезни после алло-ТГСК у больных множественной миеломой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, кандидат биологических наук Загривная, Мария Викторовна

• Загривная, Мария Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Загривная, Мария Викторовна

СОДЕРЖАНИЕ.

ОБ ОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ.

1 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ПРИ МОНИТОРИНГЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕРАПИИ ММ. (СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ).

1.1 Современные подходы к терапии ММ;.

1.2. Методы оценки МОЕ.

1.2.1 Иммунофлуоресцентный анализ и мониторинг МОЕ у больных^ ММ'.

1.2.2 Количественный анализ химеризма плазматических клеток (Ст38+).

1.3 Молекулярный мониторинг МОЕ ММ.

1.3.1 Клональные перестройки генов иммуноглобулинов, как опухоле-специфичный маркер для мониторинга МОЕ.

1.3.2 Транслокации: преимущества и недостатки.

1.3.3 Рекомбинация сегментов гена Н—ключ к опухоле-специфичной тест-системе для мониторинга МОЕ у больных ММ.

1.3.4 ПЦР анализ и мониторинг МОЕ при ММ.

1.3.5 Выбор методов анализа, перспективных для мониторинга МОЕ мм.:.

2 ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Пациенты и клеточные линии.

2.1.1 Пациенты, для которых проведен качественный и количественный мониторинг минимальной остаточной болезни.

2.2 Поэтапная схема подбора индивидуальных опухоль-специфичных тест-систем.

2.2.1 Первый этап. Получение образца КМ пациента до терапии. Выделение ДНК.

2.2.2 Второй этап. Амплификация с семейств-специфичными праймерами.

2.2.3 Третий этап. Получение клональной последовательности гена 1цН.

2.2.4 Четвертый этап. Сравнение последовательности с генетическими базами данных.

2.2.5 Пятый этап. Подбор опухоль-специфичных праймеров. Критерии для подбора опухоль-специфичных праймеров.

2.2.6 Шестой этап. Выбор оптимальной температуры отжига праймеров.

2.2.7 Седьмой этап. Тестирование опухоль-специфичных праймеров.

2.3 Молекулярный мониторинг МОБ.

2.3.1 Качественный анализ (ПЦР с «вмонтированными» праймерами)

2.3.2 Количественный анализ. (Методика выполнения ПЦР анализа в реальном времени с использованием гидролизных проб - TaqMan).

2.4 Материалы, реагенты.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Алгоритм индивидуального подбора тест-систем для мониторинга МОБ ММ.

3.2 Апробация методики молекулярно-генетического анализа при мониторинге МОЕ у больных ММ в клинических условиях.

3.2.1 Качественный аналнз.

3.2.2 Количественный анализ (ПЦР-РВ).

3.2.3 Магнитная селекция и последующий количественный анализ в линии клеток СО 138+.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДИК.

4.1 Проблема стандартизации молекулярных методик, основанных на детекции клональной перестройки 1вН.

4.2 Факторы, влияющие на эффективность молекулярного мониторинга МОЕ больных ММ, а также на подбор опухоль-специфичных тест-систем.

4.2.1 Детекция клоналъной перестройки гена Ну больных ММ.

4.2.2 Молекулярный мониторинг МОЕ в период активной регенерации КМ.

4.2.4 Неудачи при подборе опухоль-специфичных праймеров и их возможные причины.

4.2.5 Проблема ложно отрицательных результатов при молекулярном мониторинге МОЕ у больных ММ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический мониторинг минимальной остаточной болезни после алло-ТГСК у больных множественной миеломой»

Актуальность проблемы

Множественная миелома (ММ) - злокачественное новообразование из плазматических клеток, которые являются конечным продуктом дифференцировки В-клеток и в норме обычно продуцируют антитела (Абдулкадыров 2004). В странах Запада ММ - причина приблизительно 1% всех смертей связанных с онкологией [21]. Существенную роль в терапии ММ играет аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК). Ряд исследований показал, что пациенты, достигшие полной клинической ремиссии (ПР) после алло-ТГСК, характеризуются длительной выживаемостью [90]. При применении алло-ТГСК после стандартной миелоаблативной подготовки и после подготовки по щадящим схемам достигается высокий уровень ПР, варьирующий в пределах 27% - 81% [23, 27, 53, 54, 68, 70, 87]. Около 50% пациентов с ПР после стандартной миелоаблативной алло-ТГСК достигают молекулярной ремиссии (МР)[37, 89], которая ассоциирована с очень низким риском рецидива [39]. Таким образом, для улучшения результатов алло-ТГСК требуется достижение ПР и, в особенности, МР. Одним из способов достижения ПР является проведение посттрансплантационной терапии. Самой распространенной адоптивной терапией после алло-ТГСК является инфузия донорских лимфоцитов (ИДЛ) [77].

Для определения статуса МР и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) с количественной (в режиме "реального времени") и качественной оценкой опухоль-специфичной последовательности ДНК или РНК. Самым чувствительным, на сегодняшний день, является качественный ПЦР анализ. Именно с его появлением, наряду с термином «клиническая ремиссия» появилось понятие «молекулярная ремиссия» [36, 37, 101]. Наиболее универсальной мишенью для молекулярной диагностики МОБ у больных ММ служит \Т)1 перестройка гена тяжелой цепи иммуноглобулина (^Н) [85]. Неповторимый для каждого пациента характер перестройки гена ^Н определяет необходимость разработки эффективной методики подбора индивидуальных тест-систем. Разработка методики важна также для стандартизации процедуры молекулярного мониторинга МОБ у больных множественной миеломой, что необходимо для сопоставления результатов терапии, полученных в различных клиниках. Следует отметить, что при проведении молекулярного мониторинга МОБ у больных ММ после алло-ТГСК не учитываются особенности аллогенной трансплантации и инфузий донорских лимфоцитов, которые могут повлиять на эффективность молекулярного мониторинга.

Важной проблемой при организации молекулярного мониторинга у больных ММ после алло-ТГСК служит отсутствие диагностических образцов костного мозга (КМ). Как правило, аллогенные трансплантации проводятся в специализированных центрах, куда пациенты поступают после определенной терапии, приводящей к снижению опухолевой массы в КМ: В лучшем случае, для этих пациентов имеются образцы в виде цитологических препаратов КМ, полученных до начала терапии. Это не позволяет использовать для разработки тест-систем методики, основанные на обратно-транскриптазной ПЦР, материалом для которой служит тотальная РНК [7].

Все это и обусловило актуальность данного исследования.

Цель исследования

Разработать и апробировать в клинических условиях методики молекулярно-генетического мониторинга минимальной остаточной болезни после алло-ТГСК у больных множественной миеломой.

Задачи исследования

1. Разработать алгоритм подбора индивидуальных опухоль-специфичных тест-систем на основе клональной УБ1-перестройки гена ^Н для мониторинга МОБ у больных ММ.

2. Апробировать в клинических условиях и сравнить эффективность различных методик молекулярно-генетического мониторинга МОБ ММ, основанных на анализе опухоль-специфичной "УТЛ-перестройки гена ^Н (количественный ПЦР-анализ в режие "реального времени" и качественный ПЦР-анализ).

3. Выявить особенности использования разработанных тест-систем при молекулярной диагностике МОБ у больных ММ после проведения алло-ТГСК и инфузий донорских лимфоцитов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. УЕ)1-перестройка гена ^Н является стабильным маркером МОБ после проведения алло-ТГСК у больных ММ. Комплексирование качественного и количественного методов молекулярного анализа данного маркера обеспечивает надежный контроль эффективности терапии больных ММ при проведении алло-ТГСК и позволяет оперативно принимать терапевтические меры при превышении уровня молекулярной ремиссии.

2. Молекулярная диагностика клональной УЕ)1-перестройки гена ^Н обладает более высокой, по сравнению со стандартными методами анализа,

12

Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг МОБ у пациентов, получивших терапию с применением ауто-алло тандемного подхода, адоптивной терапии малыми дозами талидомида и ИДЛ. Аллогенная ТГСК проводилась со сниженной интенсивностью кондиционирования: флударабин (150 мг/м2), мелфалан (140 мг/м2), и анти-тимоцитарный глобулин (ATG: 3 х 10-20 мг/кг) три месяца спустя после л циторедуктивной ауто-ТГСК (мелфалан 200 мг/м ).

Практическая значимость

Внедрение результатов исследования в клиническую практику позволит повысить эффективность диагностики МОБ у больных ММ, что способствует своевременному принятию терапевтических мер по снижению риска рецидива заболевания.

Разработанный алгоритм может быть использован для сравнения режимов кондиционирования, для оценки эффективности иммуномодулирующей терапии, например, инфузий донорских лимфоцитов.

Апробация результатов исследования

Результаты исследования представлены на 30, 31 и 32 Ежегодных симпозиумах ЕВМТ (г. Барселона, Испания, 2004; г. Прага, Чехия, 2005; г. Гамбург, Германия 2006)[73, 75, 133, 135], на XVI съезде Wilsede «Modern Trends in Human Leukemias XVI», 2005 г. (Германия, г. Гамбург), конференции «Биотехнология и Онкология», 2005 г. (Санкт-Петербург)[9], на 46 и 47 ежегодных конференциях Американского гематологического общества (The American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition), 2004 г., 2005 г.[72, 74, 134].

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты настоящего исследования используются в Институте детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой ГОУ ВПО СПбГМУ им. академика И.П. Павлова (г. Санкт-Петербург) и в Центре трансплантации костного мозга Университетской клиники Эппендорф, г. Гамбург (Германия) для мониторига МОБ у больных ММ, а также в качестве эталона для разработки других методов анализа [77, 83].

Установленные в работе факты могут быть использованы в лекционных курсах ВУЗов медицинского и биологического профиля, а также в соответствующих учебниках, методических пособиях и руководствах.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них — 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК [8, 73, 76]. Соавторами работ, опубликованных по теме диссертации, являются: д.м.н. профессор Б.В. Афанасьев, MD профессор N. Kroger, MD профессор A. Zander, PhD профессор Fehse В., MD профессор Corradini P., MD профессор A. Nagler, MD A. Shimoni, MD F. Ayuk, PhD M.V. Lioznov, MD T. Zabelina, MD H. Schieder, H. Renges, S.Schwartz, A. Badbaran, M. Dietrich.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены в одной книге на 137 страницах текста, содержат 21 таблицу и 19 рисунков. Список использованных источников включает в себя 10 работ отечественных и 126 работ зарубежных

15 авторов. Диссертация состоит из: - 4 частей, в которых изложены результаты собственных исследований; - заключения, включающего и практические рекомендации; - выводов; - списка использованных источников.

Личный вклад автора

Разработка дизайна всех исследований, первичная обработка части клинического материала, все этапы молекулярного мониторинга, разработка методик, обобщение полученных результатов проведены автором самостоятельно. Изложение всех разделов диссертации, оформление работы выполнены соискателем.

1 Молекулярно-генетнческие методы анализа при мониторинге результатов терапии ММ. (Состояние проблемы)

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Загривная, Мария Викторовна

Выводы

1. Разработанный в рамках настоящего исследования алгоритм для подбора опухоль-специфичных праймеров позволяет с минимальными затратами времени и материалов подбирать индивидуальные опухоль-специфичные тест-системы. Алгоритм учитывает особенности аллогенной трансплантации и инфузий донорских лимфоцитов, которые могут повлиять на эффективность молекулярного мониторинга. Это является важным шагом на пути стандартизации молекулярного анализа МОБ у больных ММ после алло-ТГСК.

2. Апробация в клинических условиях молекулярного мониторинга МОБ, выполненная для оценки эффективности терапии ММ на основе алло-ТГСК с режимами кондиционирования со сниженной интенсивностью доз показала, что данные методики являются эффективным инструментом для оценки МОБ у больных ММ после алло-ТГСК.

3. Комплексирование качественного и количественного методов ПЦР -анализа обеспечивает надежный контроль эффективности терапии. Высокая чувствительность качественного ПЦР анализа (1*106) позволяет использовать его для определения молекулярной ремиссии и выявления МОБ. Количественная ПЦР в реальном времени позволяет проводить динамический мониторинг МОБ.

4. Магнитная селекция CD138+ лимфоцитов с использованием аппарата MACS (Myltenyi Biotech) значительно повышает чувствительность количественного анализа при оценке МОБ у больных ММ с помощью разработанного алгоритма.

5. Специфичность тест-систем на основе перестройки гена IgH1 миеломного клона сохраняется в течение не менее 4,5 лет после аллогенной трансплантации.

Практические рекомендации

1. При внедрении молекулярного мониторинга МОБ больных ММ в клиническую практику рекомендуется использовать разработанный алгоритм и методику индивидуального подбора специфичных праймеров, это уменьшает трудоемкость операции подбора.

2. При мониторинге МОБ у больных ММ молекулярно-генетический анализ должен выполняться с учетом, следующих методических требований: после проведения алло-ТГСК и ИДЛ молекулярный мониторинг за эффективностью терапии необходимо продолжать только после завершения периода активной регенерации в КМ, продолжающейся в тучение 3-х месяцев после алло-ТГСК и между 3 и 6 месяцами после ИДЛ; для предотвращения ложно-положительных результатов необходимо подбирать тест-системы с учетом возможных нуклеотидных совпадений с репертуаром IgH регенерирующего КМ, в связи с чем наряду с анализом с терминальными V, D и J сегментами, необходимо выполнять теоретическое сравнение с библиотекой рекомбинированных VDJ последовательностей других В клеток;

115 во избежание получения ложно-отрицательных результатов не следует использовать тест-системы на основе клональной перестройки гена IgH с вариабельным участком V4-34; при тестировании праймеров на специфичность необходимо использовать не менее 10 Отрицательных контролей, полученных от здоровых доноров (ВС).

3. При комплексировании качественной и количественной методик анализа рекомендуется проводить количественную оценку МОБ при положительных результатах, полученных при качественном анализе и проводить качественный анализ при отрицательных результатах, полученных с помощью количественного анализа. Это необходимо как для определения MP, имеющей высокую прогностическую важность, так и для выявления ранних динамических изменений МОБ, что позволит своевременно скорректировать курс проводимой терапии.

4. Методика определения нуклеотидной последовательности опухолевой клональной перестройки гена тяжелой цепи иммуноглобулина на основе ПЦР анализа ДНК дает возможность подбора индивидуальных тест-систем для пациентов, получавших ранее терапию в различных клиниках, при условии, что сохранен диагностический материал в виде ДНК, цитологических препаратов или замороженных клеток. Для обеспечения молекулярного мониторинга терапии ММ диагностические образцы КМ больных ММ с достаточным содержанием опухолевых клеток, полученные до начала терапии, необходимо помещать в банк ДНК, что, в дальнейшем, обеспечит возможность подбора индивидуальных высокоспецифичных тест-систем. Для реализации этого положения на практике необходимо в директивном порядке организовать такие банки ДНК во всех крупных лечебных заведениях, в которых проводится диагностика и терапия ММ, разработать инструктивные документы, рег

116 ламентирующие отбор, передачу в банк, хранение, доступ и обмен образцами ДНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Загривная, Мария Викторовна, 2010 год

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. Молекулярная биология клетки. 2-е изд.-М. : Мир, 1994.-517 с.

2. Афанасьев Б.В., Зубаровская JI.C. Роль трансплантации гемопоэтических тволовых клеток в терапии взрослых больных острыми лейкозами. Гематология 2006, №1 -2 : СС. 7085

3. Вотякова О. М. Множественная миелома: достижения лекарственного лечения XX—XXI века. В кн.: Современная онкология. 2004; 6 (1): 36—38.

4. Вотякова О. М., Османов Д. Ш, Демина Е. А. И др. Использование велкейда при множественной миеломе. Терапевтический архив №7, 2007. сс.70-73.

5. Дьюри Б. Множественная Миелома. Краткий обзор заболевания и возможностей лечения.2000. Международный фонд миеломы. — 30 с.

6. Жеребцова В. А. Детекция и мониторинг клональных перестроек генов тяжелых цепей иммуноглобулинов у больных множественной миеломой. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности: 14.00.29. М., 2008.- 129 с.

7. Загривная М.В., Badbaran A., Fehse В., Kröger N., Zander A.R.,118

8. Зубаровская JI.C., Ситская К.О., Морозова Е.В. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток в терапии детей с заболеваниями крови. Гематология и трансфузиология 1998; 43(3): СС. 36-37

9. Alizadeh М, Bernard М, Danic В et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002; 99(12): PP. 4618-4625.

10. Almeida J, Mateo G, Orfao A, Montalban A et al. Immunophenotypic evaluation of plasma cells: a useful tool for minimal residual disease evaluation in patiants with multiple myeloma. Haematologica/ journal of Hematology 2003; 88 (supp.14): PP. 12-13.

11. Attal M, Huguet F, Schlaifer D, Payen С et al. Intensive combined119therapy for previously untreated aggressive myeloma. Blood. 1992; 79: PP. 1130-1136.

12. Attal M, Harousseau JL, Stoppa AM et al. A prospective randomized trial of autologous transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. New England Journal of Medicine 1996; 335: PP. 91-97.

13. Attal M. Updated Results IFM 90 Abstracts of International Myeloma Workshop. 2001, Banff, Canada.

14. Attal M, Harousseau JL, Facon T et al. Single versus double autologous stem-cell transplantation for multiple myeloma. New England Journal of Medicine 2003; 349: PP. 2495-2502.

15. Aubin J, Davi F, Nguyen-Salomon F, Debert C et al. Description of novel FR1 IgH PCR strategy and its comparison with three other strategies for the detection of the detection of clonality in B cell malignancies. Leukemia 1995; 9: PP. 471-479.

16. Badros A, Barlogie B, Morris C, Desikan R et al. High response rate in refractory and poor-risk multiple myeloma after allotransplantation using a nonmyeloablative conditioning regimen and donor lymphocyte infusions. Blood 2001; 97 (9): PP. 25742579.

17. Bahler DW, Campbell MJ, Hart S et al. Ig VH Gene Expression Among Human Follicular Lymphomas. Blood 1991; 78(6): PP. 1561-1568.

18. Barlogie B, Shaughnessy J, Tricot G, Jacobson J. Treatment of multiple myeloma. Blood 2004; 103 (1): PP. 20-32.

19. Bataille R, Harousseau J-L Multiple myeloma. Medical progress. 1997; 336 (23): PP. 1657-1664.

20. Bellucci R, Alyea EP, Weller E et al. Immunologic effects of120prophylactic donor lymphocyte infusion after allogeneic marrow transplantation for multiple myeloma. Blood 2002; 99(12): PP. 4610-4617.

21. Bensinger WI; Buckner CD, Anasetti C, et al. Allogeneic marrow transplantation for multiple myeloma: an analysis of risk factors on outcome. Blood. 1996; 88: PP. 2787-2793.

22. Billadeau D, Blackstadt M, Greipp P, Kyle RA et al. Analysis of B lymphoid malignansies using allele-specific polymerase chain reaction: A technique for sequential quantitation of residual disease. Blood 1991; 78: PP. 3021-3029.

23. Bottema C. D.K., Sommer S.S. PCR amplification of specific alleles: Rapid detection of known mutations and polymorphisms. Mutation Research 1993; 288: PP. 93-102.

24. Bruno B, Rotta M, Patriarca F, et al. A comparison of allografting with autografting for newly diagnosed myeloma. N Engl J Med: 2007; 356: 1110-1120.

25. Cavo M, Benni M, Cirio TM, Gozzetti A et al. Allogeneic bone marrow transplantation for the treatment of multiple myeloma: an overview of published reports. Stem Cells. 1995; 13 (Suppl 2): PP. 126-131.

26. Cavo M, Terragna C, Martinelli G et al. Molecular monitoring of minimal residual disease in patients in long term complete remission after allogeneic stem cell transplantation for multiple myeloma. Blood 2000, 96(1): PP. 355-357.

27. Cavo M, Zamagni E, Cellini C et al. Single versus, tandem autologous transplants in multiple myeloma: Italian experience. Proceedings of the Ixth Myeloma Workshop. Hematology Journal 2003; 4(Suppl. 1), S60 (abstract)

28. Child JA, Morgan GJ, Davies FE et al. High-dose chemotherapy with hematopoietic stem-cell rescue for multiple myeloma. New England Journal of Medicine 2003; 348: PP. 1875-1883.

29. Chiusolo P, Sica S, Piccirillo N, Giordano G et al. Molecular and clinical follow-up after stem cell transplantation for multiple myeloma. Ann. Hematol. 2001; 80: PP. 90-95.

30. Corradini P, Voena C, Astolfi M et al. High-dose sequential chemoradiotherapy in multiple myeloma: residual tumor cells are detectable in bone marrow and peripheral blood cell harvests and after autografting. Blood 1995; 85(6): PP. 1596-1602.

31. Corradini P, Voena C, Tarella C, Astolfi M et al. Molecular and clinical remissions in multiple myeloma: role of autologous and allogeneic transplantation of hematopoietic cells. Journal of clinical oncology. 1999; 17(1): PP. 208-215.

32. Corradini P, Ladetto M, Pileri A, Tarella C. Clinical relevance of minimal residual disease monitoring in non-Hodgkin's lymphomas: a critical reappraisal of molecular strategies. Leukemia 1999; 13: PP. 1691-1695.

33. Corradini P, Cavo M, Lokhorst H, Martinelli G et al. Molecular remission after myeloablative allogeneic stem cell transplantation predicts a better relapse-free survival in patients with multiple myeloma. Blood, 2003; 102(5): PP. 1927-1929.

34. Davies FE, Forsyth PD, Rawstron AC et al.The impact of attaining a minimal disease state after high-dose melphalan and autologous transplantation for multiple myeloma. British Journal of Haematology 2001; 112: PP. 814-819.

35. Deane M, Norton JD. Immunoglbulin gene 'fingerprinting': an approach to analysis of B lymphoid clonality in lymphoproliferative disorders. British Journal of Haematology 1991; 77: PP. 274-281.

36. Devine SM, Adkins DR, Khouiy H, Brown RA et al. Recent advances in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Lab. Clin Med. 2003; 141(1): PP. 7-32.

37. Donovan J, Ladetto M, Zou G, Neuberg D et al. Immunoglobulin heavy-chain consensus probes for real-time PCR quantification of residual disease in scute lymphoblastic leukemia. Blood 2000; 95(8): PP. 2651-2658.

38. Einsele H, Schafer HJ, Hebart H et al. Follow-up of patients with progressive multiple myeloma undergoing allografts after reduced-intensity conditioning. British Journal of Haematology 2003; 121: PP. 411-418.

39. Fronkova E, Muzikova K, Mejstrikova E et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplantation. 2008; 42: PP. 187-196.

40. Fumoux F, Guigou VB, Blaise D et al. Reconstitution of Human Immunoglobulin VH Repertoire After Bone Marrow Transplantation Mimics B-Cell Ontogeny. Blood 1993; 181 (11): PR 3153-3157.

41. Gahrton G, Tura S, Ljungman P, Belanger C et al. Allogeneic bone marrow transplantation in multiple myeloma. European Group for Bone Marrow Transplantation. N. Engl. J: Med. 1991; 325(18): PP. 1267-1273.

42. Gahrton G, Tura S, Ljungman P, Blade J et al. Prognostic factors in allogeneic bone marrow transplantation for multiple myeloma. J. Clin. Oncol. 1995; 13(6): PP. 1312-1322.

43. Glazer AN, Peck K, Mathies RA. A stable double-stranded DNA125ethidium homodimer complex: Application to picogram fluorescence detection of DNA in agarose gels. Biochemistry 1990; 87: PP. 3851-3855.

44. Gonzalez D, Gonzalez M, Alonso ME, Lopez-Perez R et al. Incomplete DJH rearrangements as a novel tumor target for minimal residual disease quantitation in multiple myeloma using real-time PCR. Leukemia 2003; 17: PP. 1051-1057.

45. Gonzalez D, Balanzategui A, Garcia-Sanz R, Gutierrez N et al. Incomplete DJH rearrangements of the IgH gene are frequent in multiple myeloma patients: immunobiological characteristics and clinical implications. Leukemia 2003; 17: PP. 1398-1403.

46. Gonzalez D, Gonzalez M, Balanzategui A, Sarasquete ME et al. Molecular characteristics and gene segment usage in IGH gene rearrangements in multiple myeloma. Haematologica/The hematology journal 2005; 90(7): PP. 906-913.

47. Gorin NC. Autologous stem cell transplantation for adult acute leukemia. Curr Opin Oncol. 2002; 14: PP. 152-159.

48. Guikema JE, Vellenga E, Bakkus MH, Bos NA. Myeloma126clonotypic B cells are hampered in their ability to undergo B-cell differentiation in vitro. Br J Haematol. 2002; 119(1): PP. 54-61.

49. Hawkins RE, Zhu D, Ovecka M et al. Idiotypic Vaccination Against Human B-Cell Lymphoma. Rescue of Variable Region Gene Sequences From Biopsy Material for Assembly as Single-Chain Fv Personal Vaccines. Blood 1994; 83(11): PP. 3279-3288.

50. Hussein MA Arsenic trioxide: a new immunomodulatory agent in the management of multiple myeloma. Med. Oncol. 2001;18: PP. 239-242.

51. Janeway CA, Travers P, Walport M. Immunobiology. 5th ed. New York and London: Garland Publishing; 2001. 732 p.

52. Kröger N, Schwerdtfeger R, Kiehl M et al. Autologous stem cell transplantation followed by a dose-reduced allograft induces high complete remission rate in multiple myeloma. Blood 2002; 100 (3): PP. 755-760.

53. Kroger N, Shimoni A, Zagrivnaya M, Ayuk F et al. Low-dose thalidomide and donor lymphocyte infusion as adoptive immunotherapy after allogeneic stem cell transplantation in patients with multiple myeloma. Blood 2004; 104(10): PP. 3361-3363.I

54. Kröger N., Zagrivnaja M., Schwartz S., Badbaran A., Zabelina T., Lioznov M., Ayuk F., Zander A., Fehse B. Kinetics of plasma-cell chimerism after allogeneic stem cell transplantation// Bone Marrow128

55. Transplantation. March 2006.- Vol 37, suppl. 1. - P.7.

56. Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR. Cancer Medicine, 6th ed. Hamilton (Canada): BC Decker Inc; 2003. PP. 73-85.

57. Kyle RA, Rajkumar SV. Multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 2004; 351(18): PP. 1860-1873.

58. Ladetto M, Donovan JW, Harig S et al. Real-time polymerase chain reaction of immunoglobulin rearrangements for quantitative evaluation of minimal residual disease in multiple myeloma. Biol. Blood Marrow Transplant. 2000; 6(3): PP. 241-253.

59. Lioznov M, Badbaran A, Fehse B et al. Monitoring of minimal residual disease in multiple myeloma after allo-SCT: flow cytometry vs PCR-based techniques. Bone Marrow Transplantation 2008; 41: PP. 913-916.

60. Lokhorst HM, Bloem AC, Borst HPE. Measurement of minimal residual disease in multiple myeloma by quantitative PCR. Histopathology 2002, 41 (2): PP. 77-79.

61. Louis SA, Zapf R, Clarke E, Thomas TE et al. A negative-selection strategy for depleting myeloma cells from patients' BM and/or leukapheresis blood. Cytotherapy 2001; 3(6): PP. 489-504.

62. Maloney DG, Molina AJ, Sahebi F, et al. Allografting with nonmyeloablative conditioning following cytoreductive autografts for the treatment of patients with multiple myeloma. Blood. 2003;102: 3447-3454. Epub 2003 Jul 10.

63. Martinelli G, Terragna C, Zamagni E, Ronconi S et al. Molecular remission after allogeneic or autologous transplantation of130hemapoetic stem cells for multiple myeloma. J. Clin. Oncol. 2000; 18(11): PP. 2273-2281.

64. Martinez-Lopez J, Blade J, de la Rubia J, et al. Prognostic impact of posttransplantation complete remission in multiple myeloma. Final results of a prospective study in a series of homogenously treated patients. Haematologica. 2007;92: PP. 42

65. Mateo G, Corral M, Almeida J, Lopez-Berges C et al. Immunophenotypic analysis of peripheral blood stem cell harvests from patients with multiple myeloma. Haematologica/ journal of Hematology 2003; 88(09): PP. 1013-1021.

66. Matsuda F, Ishii K, Bourvagnet P, Kuma K et al. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. J. Experimental Medicine 1998; 188: PP. 2151-2162.

67. Mayer SP, Giamelli J, Sandoval C, Roach AS et al. Quantitation of leukemia clone-specific antigen gene rearrangements by a singlestep PCR and fluorescence-based detection method. Leukemia 1999; 13: PP. 1843-1852.

68. Negrin RS, Cleary ML. Laboratory evaluation of minimal residual disease. In: Thomas E.D., Blume K.G., Forman S.J. (eds): Hematopoietic Cell Transplantation. 2nd Edition. Boston, Blackwell Science, 1999, PP. 179.

69. Pekova S, Baran-Marszak F, Schwarz J, Matoska V. Mutated or non-mutated? Which database to choose when determining the IgVH hypermutation status in chronic lymphocytic leukemia? Haematologica 2006; 91: ELT01.

70. Pritsch O, Troussard X, Magnac C, Mauro FR et al. VH gene usage by family members affected with chronic lymphocytic leukaemia. Br J. Haematol 1999; 107: PP. 616-624.

71. Rasmussen T, Poulsen TS, Honore L, Johnsen HE. Quantitation of minimal residual disease in multiple myeloma using an allele-specific real-time PCR assay. Experimental Hematology 2000; 28(9): PP. 1039-1045.

72. Richardson PG, Mitsiades C, Schlossman R, Munshi N, Anderson132

73. K et al. New Drugs for Myeloma. Oncologist 2007; 12(6): PP. 664689.

74. Sahota SS, Leo R, Hamblin TJ et al. Ig VH Gene Mutational Patterns Indicate Different Tumor Cell Status in Human Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. Blood 1996; 87(2): PP. 746-755.

75. Sametti S, Astolfi M, Giaccone L, Ricca I, Ladetto M. Clinical relevance of minimal residual disease monitoring in mature B cell disorders: Role of qualitative and quantitative PCR-based strategies. Rev.bras.hematol.hemoter., 2001,23(1): PP. 3-13.

76. Sanz I. Multiple mechanisms partiipate in the of human H chain CDR3 generation of diversity regions. The Journal of Immunology 1991; 147 (5): PP. 1720-1729.

77. Singhai S, Mehta J, Desikan R, Ayers D et al. Antitumor activity of thalidomide in refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine 1999; 341(21): PP. 1565-1571.

78. Smith A et al. UK Myeloma Forum, Nordic Myeloma Study Group and British Committee for Standards in Haematology. Guidelines on the diagnosis and management of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 2006; 132: PP. 410-451.

79. Souto-Carneiro MM, Sims GP, Girschik H et al. Developmental Changes in the Human Heavy Chain CDR3. J. Immunology 2005; 175 (11): PP. 7425-7436

80. Stewart AK, Schwartz RS Immunoglobulin V regions and the B cells. Blood 1994; 83 (7): PP. 1717-1730

81. Swedin A, Lenhoff S, Olofsson T, Thuresson B. et al. Clinical utility of Immunoglobuline heavy chain gene rearrangement identification for tumour cell detection in multiple myeloma. British Journal ofHaematology 1998; 103: PP. 1145-1151.

82. Tricot G, Vesole DH, Jagannath S, Hilton J et al. Graft-versus-myeloma effect: proof of principle. Blood 1996; 87(3): PP. 11961198.

83. Verhagen OJ, Willemse MJ, Breunis WB et al. Application of germline IGH probes in real-time quantitative PCR for the detection of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2000; 14(8): PP. 1426-1435.

84. Vockerodt M, Soares M, Kanzler H, Küppers D et al. Detection of clonal Hodgkin and Reed-Sternberg cells with identical somatically mutated and rearranged VH genes in different biopsies in relapsed Hodgkin's disease. Blood 1998; 92 (8): PP. 2899-2907.

85. Voena C, Ladetto M, Astolfi M, Provan D et al. A novel nested-PCR strategy for detection of rearranged immunoglobulin heavy-chain genes in B cell tumors. Leukemia 1997; 11: PP. 1793-1798.

86. Willems P, Verhagen O, Segeren C, Veenhuizen P et al. Consensus strategy to quantitate malignant cells in myeloma patients is validated in multicenter study. Blood 2000; 96(1): PP. 63-70.

87. Wu C, Yang XF, McLaughlin S et al. Detection of a potent humoral response associated with immune-induced remission of chronic myelogenous leukemia.The Journal of Clinical Investigation 2000; 106(5): PP. 705-714.J133.134.135.136.