Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Омельченко, Андрей Владимирович

• Омельченко, Андрей Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Омельченко, Андрей Владимирович

Принятые сокращения и аббревиатуры.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.g

1.1 Геном эукариот. Структура и характеристика генома эукариот.

1.1.1 Уникальные последовательности генома эукариот.

1.1.2 Умерено повторяющиеся последовательности генома эукариот.

1.1.3 Часто повторяющиеся последовательности генома эукакриот.

1.2 Микросателлитные последовательности ДНК.

1.2.1 Определение и классификация микросателлитов.

1.2.2 Роль и функции микросателлитов.

1.2.3 Механизмы нестабильности микросателлитов.

1.3 Термодинамический аепект структурной организации генома эукариот. Изохоры. CpG-островки.

1.4 Вариабельность генома и генетико-популяционные исследования.

1.4.1 Маркеры в генетических исследованиях: роль, свойства и классификация.

1.4.1.1 Биохимические маркеры.

1.4.1.2 ДНК-маркеры.

1.4.1.2.1 Маркеры на основе ПДРФ.

1.4.1.2.2 Маркеры, основанные на ПЦР.

1.4.1.2.2.1 Мономорфные ДНК-маркеры.

1.4.1.2.2.2 Полиморфные ДНК-маркеры.

1.4.2 Математическое моделирование генетико-популяционных процессов.

1.4.2.1 Классификация математических моделей в биологии, классы задач и математический аппарат.

1.4.2.2 Математическое моделирование генетических процессов на популяционном и видовом уровнях.

1.5 Однополые виды позвоночных животных и их популяции.

1.5.1 Общая характеристика вида Darevskia unisexualis.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Выделение ДНК из крови.

2.2 Анализ нативности ДНК.

2.3 Анализ ДНК на спектрофотометре.

2.4. Анализ геномной клонотеки D. unisexualis.

2.4.1 Скрининг геномной библиотеки на наличие (TG)n последовательностей.

2.4.1.1 «Колони» - гибридизация.

2.4.1.2 Приготовление (TG)9-зонда.

2.4.1.3 Гибридизация.

2.5 Выделение плазмидной ДНК.

2.6 Рестрикция плазмидной ДНК, электрофорез рестрикционных фрагментов в агарозном геле, блоттинг, блот-гибридизация.

2.7 Секвенирование рекомбинантной ДНК, содержащей (TG)n -последовательности. Постановка вычислительного эксперимента.

2.8 Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.8.1 Подбор праймеров.

2.8.2 Подбор условий для ПЦР.

2.9 ПЦР-анализ.-.

2.9.1 Подготовка стекол.

2.9.2 Приготовление 8 % полиакриламидного геля (ПААГ) для нативной ДНК и 6% геля ПААГ для денатурированной ДНК.

2.9.3 Заливка ПААГ «накатом».

2.9.4 Электрофорез нативной ДНК и денатурированной ДНК в ПААГ.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Получение и характеристика рекомбинантных клонов, содержащих (ТО)п-микросателлиты, из геномной клонотеки D. unisexualis.

3.2 Анализ изменчивости микросателлитных локусов у партеновида D.unisexualis.

3.3 ПЦР-анализ локусов, гомологичных Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365, у двуполых родительских видов Darevskia raddei и Darevskia valentini.

3.4 Сравнительный анализ биохимических и физико-химических характеристик микросателлитных локусов генома D.unisexualis.

3.5 Математическое моделирование и анализ закономерностей распределения частот аллелей вариабельных локусов в популяциях D.unisexualis. Разработка математической модели для характеристики генофонда однополых видов.

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1 Полиморфизм микросателлитсодержащих локусов генома у различных однополых и двуполых видов рода Darevskia.

4.2 Интерпретация результатов биохимического и физико-химического анализа в приложении к исследованиям вариабельных участков генома.

4.3 Сравнительный анализ, практика и перспективы применения предложенной математической модели.

5 ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярная характеристика локусов, содержащих динуклеотидные микросателлиты, генома партеногенетической ящерицы Darevskia unisexualis»

Молекулярные механизмы и характеристика процессов нестабильности генома являются наиболее актуальными вопросами молекулярной биологии и биохимии нуклеиновых кислот. Микросателлитные последовательности ДНК выступают как один из факторов подобной нестабильности. Микросателлиты представляют собой тандемные повторы ДНК с размером мономерного звена от 2 до 6 нуклеотидов. Микросателлитный кластер занимает в среднем от 20 до 60 пар нуклеотидов (за исключением экспансии триплетных повторов, наблюдаемой при некоторых наследственных болезнях человека О

Гайцхоки с соавт., 2000]). Микросателлиты имеют высокие скорости мутирования от 10" до 10 5 в зависимости от типа микросателлита [Ellcgren, 2004], что приводит к накоплению популяционно-специфических мутаций и позволяет использовать информацию об изменчивости микросателлитных локусов для анализа структуры популяций [Rosenberg et al., 2002]. Тамдемпые повторы в целом и микросателлитные последовательности ДНК в частности наделяются рядом исследователей важной ролью в функционировании генома на биохимическом, молекулярном и субклеточном уровнях [Зимпицкий с соавт., 2005]. В настоящее время к наиболее изученным относятся микросагеллиты человека, ряда животных и растений [Neff et al., 2001; Животовский, 2006]. В то же время, однополые виды животных с клональным типом размножения остаются все еще малоизученными как с точки зрения молекулярной биологии и биохимии ДНК, так и с точки зрения генетической изменчивости [Tokarskaya et al., 2001]. Уникальной природной моделью для проведения исследований по характеристике и анализу микросателлитных последовательностей ДНК является облигатно-партеногенетический вид кавказских скальных ящериц Darevskia unisexualis [Arribas, 1999], который имеет гибридное происхождение от родоначальных двуполых видов D. raddei и D. valentini. Среди всего спектра микросателлитных последовательностей особое значение имеют динуклеотидные микросателлиты, которые не только наиболее широко представлены в геноме эукариот [Sharma et al., 2007], но и являются наиболее эволюционно-консервативными генетическими маркерами ДНК.

Важным представляется характеристика полиморфных динуклеотидных микросателлитных участков генома на уровне первичной структуры молекулы ДНК. Подобные исследования становятся все более актуальными для геномов многих позвоночных животных, однако проводятся лишь в очень незначительной степени для геномов партеногенетических видов в целом и ящерицы D. unisexualis в частности. Мутационные изменения, затрагивающие размеры микросателлитных кластеров и число микросателлитных звеньев, изменяют такие важные молекулярно-биологические и биохимические характеристики как нуклеотидный состав, GC-содержание локусов, энергия Гиббса образования ДНК/ДНК-дуплекса, соотношение молекулярных масс 5'-3' и 3'-5' последовательностей. Количественная оценка подобных параметров характеризующих и объясняющих направление и интенсивность биохимических реакций и взаимодействий при формировании вторичной структуры, репликации и репарации молекулы ДНК поможет в дальнейшем раскрытию глубинных биологических закономерностей на различных уровнях организации живого.

Практическая ценность исследования микросателлитных участков ДНК заключается в том, что на основе анализа вариабельности и распространенности аллельных вариантов данных локусов в популяциях выделяются последовательности применимые в качестве генетических маркеров. Однако, распространенные математические модели в большинстве своем адаптированы для исследований популяций двуполых видов и не приспособлены для популяций партеновидов [Петросян с соавт., 2003]. В связи с этим, актуальной представляется разработка и реализация математической модели, количественно определяющей вклад популяций в генофонд партеногенетических видов и раскрывающая генетико-популяционную структуру партеновида. Данные количественные оценки могут быть широко применимы в работе по охране редких» видов позвоночных животных в целом и партеновида/). unisexualis в частности.

В связи с этим, цель данной pa6oiM - получение и молекулярная характеристика локусов, содержащих микросателлитные динуклеотидные последовательности генома партеногенетической ящерицы D. unisexualis, для оценки их изменчивости и вклада в генетическое разнообразие партеновидов.

Для достижения указанной цели в данной работе решались следующие задачи:

1) поиск вариабельных динуклеотидных микросателлитных последовательностей ДНК генома D. unisexualis;

2) определение молекулярной природы микросателлитных локусов в популяциях D. unisexualis;

3) исследование биохимических и молекулярно-биологических параметров микросателлитных последовательностей ДНК и их аллельных вариантов для характеристики и формализации процессов изменчивости молекулы ДНК;

4) разработка и применение системы количественной оценки вариабельности микросателлитных последовательностей ДНК как генетических маркеров для оценки внутри- и межпопуляционных закономерностей у партеновида/).unisexualis.

1 Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Омельченко, Андрей Владимирович

5 Выводы

1. Впервые определена молекулярная структура пяти микросателлитных динуклеотидных локусов (Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365) генома партеногенетической ящерицы D. unisexualis и гомологичных локусов в геномах родительских видов D. raddei и D. valentini.

2. Проведена оценка внутривидового полиморфизма этих локусов у партеновида D.unisexualis.

3. Установлено, что аллельные варианты локусов Dul83, Du214, Du231, Du255, Du365, и гомологичные локусы родительских видов отличаются числом повторов мономерного звена в микросателлитных кластерах и единичными нуклеотидными заменами в прилежащих к микросателлиту областях ДНК.

4. Показано, что интенсивность и направление изменений микросателлитных последовательностей Dul83, Du214, Du231, Du255 и Du365 может объясняться изменением средней свободной энергии (AG) образования ДНК/ДНК-дуплекса на данных участках молекулы ДНК.

5. Разработана и реализована математическая модель генетико-популяционной структуры партеновидов, на основе которой установлен генетический вклад каждой из пяти исследованных популяций (21,5%, 18,4%, 21,5%, 17,1% и 21,5%) в генофонд партеновида D. unisexualis.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Омельченко, Андрей Владимирович, 2009 год

1. Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. Т. 98. № 9. С. 11-73.

2. Апонин Ю.М., Апонина Е.А. Иерархия моделей математической биологии и численно-аналитические методы их исследования // Математическая биология и биоинформатика, 2007. Т. 2. №2. С.347-360.

3. Базыкин А.Д. Нелинейная динамика взаимодействующих популяций. М. Иж.: ИКИ. 2003. 368 с.

4. Бакланов Г.И. Некоторые вопросы индексного метода. М.: Статистика, 1972. 72 с.

5. Банников А.Г., Даревский И.С., Денисова М.Н., Дроздов Н.Н., Иорданский Н.Н. Жизнь животных. М.: "Просвещение". 1969. Т. 6. С. 282 284.

6. Брусиловский П.М. Становление теоретической биологии и математическое оделирование // Проблемы анализа биологических систем: Сборник Под. Ред. В.Н.Максимова. Изд-во МГУ, 1983. - 132 с.

7. Даревский И.С. Эволюция и экология партеногеиетического размножения у пресмыкающихся / В сб.: Современные проблемы теории эволюции. М.: "Наука". 1993. С. 89-109.

8. Елисеева И.И., Юзбашев М.М. Общая теория статистики. М.: Финансы и Статистика, 2008. 655 с.

9. Животовский JI.A. Микросателлитная изменчивость в популяциях человека и методы её изучения // Вестник ВОГиС. 2006. Т. 10. № 1. С. 74-96.

10. Забаровский Е.Р. Альтернативные подходы к секвенированию и картированию генома// Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 2. С. 224.

11. Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., Уразбаев В.Н. Тамдемные повторы ДНК и концепция матричного синтеза протеогликанов. М.: Лабиринт, 2005. - 103 с.

12. Калюжный Д. Н., Бондарев Ф. С., Щелкина А. К., Лившиц М. А., Борисова О.Ф. Внутримолекулярные G-квадруплексы, образованные микросателлитной последовательностью d(GT)i2 в присутствии ионов К+ // Молекулярная биология, 2008. Т.42. №1. С.693-700.

13. Костюченко М.В., Удина И.Г., Зайцев A.M., Храброва Л.А., Сулимова Г.Е. Изучение генетического разнообразия пород лошадей отечественной селекции на основе RAPD-PCR и микросателлитных маркеров //Сельскохоз. биология. 2001. №6. С.29-34.

14. Куприянова Л.А. Некоторые цитогенетические закономерности сетчатого видообразования однополых видов ящериц (Reptilia, Lacerddae) и других групп позвоночных животных. // Цитология. 1997. Т.39. № 2. С. 1089 1108.

15. Левич А.П. Энтропия как мера структурированности сложных систем // Труды семинара "Время, хаос и математические проблемы". Вып.2. М.: Книжный дом "Университет". 2001. С. 163 - 176.

16. Левич А.П., Фурсова П.В. Задачи и теоремы вариационного моделирования в экологии сообществ // Фундаментальная и прикладная математика, 2002, том 8, вып. 4, с. 1035-1045.

17. Малышева Д.Н., Вергун А.А., Токарская О.Н. Нуклеотидные последовательности аллельных вариантов микросателлитного локуса Du215 (arm) у партеновида Darevskia armeniaca (Lacertidae). II Генетика, 2007. Т. 43. № 2. С. 170-175.

18. Малышева Д.Н., Токарская О.Н., Даниелян Ф.Д., чл-корр. Даревский И.С., чл-корр. Рысков А.П. Обнаружение микросателлитных мутаций у партеногенетических ящериц Darevskia armeniaca. // Доклады Академии Наук.2005. Т. 400(2). С. 265-268.

19. Мартиросян И.А., Кан Н.Г., Петросян В.Г. и др. Фингерпринтный анализ вариабельности мини- и микросателлитных повторов ДНК упартеногенетических ящериц Darevskia armeniaca. II Генетика. 2003. Т. 39(2). С. 215-222.

20. Патрушев JT. И., Минкевич И. Г. Проблема размеров генома эукариот // Успехи биологической химии, 2007. Т.47. С. 293-370.

21. Ризниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. // М-Ижевск, Изд. РХД, 2002, 236 с.

22. Ризниченко Г.Ю. Математические модели в биофизике и экологии. М. — Иж.: ИКИ. 2003. 184 с.

23. Ризниченко Г.Ю. Математическое моделирование // 1999. http://www.library.biophys.msu.ru/MathMod/

24. Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию: от клеток к атомам: Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 142с.

25. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекуляр. биология, 1999. Т. 33. №6. С. 997-1011.

26. Симан Н. Нанотехнология и двойная спираль // В мире науки, 2007. №9. С.23-31.

27. Сингер М, Берг П. Гены и Геномы. М.: "Мир". 1998. Т. 2. С. 201 204.

28. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Электронный журнал лаб. Сравнительной генетики животных ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН, 2004. №1. (http://lab-cga.ru/articles/Jornal01/Statial.htm).

29. Токарская О.Н., Даревский И.С., Мартиросян И.А. Генетическая нестабильность (GATA)n микросателлитных повторов ДНК и соматический мозаицизм у однополых ящериц Darevskia unisexualis II Доклады Академии Наук. 2003. Т. 388. №6. С. 825-828.

30. Токарская О.Н., Кан Н.Г., Петросян В.Г., и др. Вариабельность GATA-микросателлитных ДНК в популяциях партеногенетического вида ящериц Lacerta unisexualis Darevsky.ll Генетика. 2000. Т.36. № 5. С. 693 698.

31. Фомин С. В., Беркинблит М.Б. Математические проблемы в биологии. М.: 1973. 200 с.

32. Хедрик Ф. Генетика популяций. М.: Техносфера, 2003,- 592с.

33. Шноль С.Э. Физико-химические факторы эволюции. М.: Наука, 1979. 201с.

34. Aharoni A., Baran N., Manor Н. Characterization of a multi-subunit human protein which selectively binds single stranded d(GA) n and d(GT)n sequence repeats in DNA. // Nucleic Acid Research, 1993. V. 21. P.5221 -5228.

35. Anselmi C., Bocchinfuso G., De Santis P., Savino M., Scipioni A. A Theoretical Model for the Prediction of Sequence-Dependent Nucleosome Thermodynamic Stability//Biophysical Journal, 2000. V. 79. P. 601-613.

36. Arcot S.S., Wang Z., Weber J.L., Deininger P.L. and Batzer M.A. Alu repeats: a source for the genesis of primate microsatellites. // Genomics, 1995. V.29. P. 136 -144.

37. Arribas О J. Phylogeny and relationships of the mountain lizards of Europe and Near

38. East (Archaeolacerta Merttens, 1921, Sensu Lato) and their relationships among the i Eurasian Lacertid lizards. // Russian J. Herpetology, 1999. V. 6(1). P. 1-22.

39. Badaeva T.N., Malysheva D.N., Korchagin V.I., Ryskov A.P. Genetic variation and de novo mutations in the parthenogenetic Caucasian rock lizard Darevskia unisexualis. // PloS One, 2008. V.3(7): e2730. (http://www.plosone.org/home.action).

40. Berger S.L. Histone modifications in transcriptional regulation // Curr. Opin. Genet. Devel., 2002. V. 12. P.142-148.

41. Bernardi G. Isochores and the evolutionary genomics of vertebrates.// Gene, 2000. V. 241. P. 3-17.

42. Bernardi G. The neoselectionist theory of genome evolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, V.104. P. 8385-8390.

43. Bertoni F., Codegoni A.M., Furlan D., Tibiletti M.G., Capella C., Broggini M. CHK1 frameshift mutations in genetically unstable colorectal and endometrial cancers. // Genes Chromosomes Cancer, 1999. V. 26. P. 176-180.

44. Biemont C., Vieira C. Genetics: Junk DNA as an evolutionary force // Nature, 2006. V. 443. P. 521-524.50