Клонирование и молекулярно-генетическая характеристика (GATA)n-содержащих локусов генома партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Корчагин, Виталий Иванович

• Корчагин, Виталий Иванович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Корчагин, Виталий Иванович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Гипервариабельные последовательности генома: минисателлиты.

Минисателлиты М13 -типа.

Мутации в минисателлитах. ф II. Гипервариабельные последовательности генома: микросателлиты

Типы микросателлитов.

Геномная локализация.

Участие в формировании хромосомных структур.

Влияние на рекомбинацию.

Влияние на репликацию.

Участие в регуляции экспрессии генов.

Участие в образовании неканонических структур ДНК.

Механизмы нестабильности микросателлитов.

Факторы, влияющие на нестабильность микросателлитов.

Ретропозоны и нестабильность тандемных повторов ДНК.

III. Использование мини- и микросателлитных последовательностей в 30 ф молекулярно-генетических исследованиях.

Однополые позвоночные как модельные организмы для исследования изменчивости 31 гипервариабельных последовательностей ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Получение геномной библиотеки £>. итвехиаШ и отбор клонов, содержащих микросателлитные повторы.

2. ПЦР-анализ внутри и межпопуляционного полиморфизма £>. итэехиаШ по локусам Би323, Ви2\5 и Ои281.

3. ПЦР-анализ локусов, гомологичных Би323, Би215 и Би281, у родительских видов й. птгетьз и й. ха1епйт.

4. Нуклеотидные последовательности аллельных вариантов локусов Эи323, Би215 и

Эи281.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование и молекулярно-генетическая характеристика (GATA)n-содержащих локусов генома партеногенетических ящериц Darevskia unisexualis»

Обнаружение и последующее применение гипервариабельных минисателлитных [Jeffreys et al., 1985] и микросателлитных последовательностей ДНК внесло значительный вклад в молекулярно-генетические исследования последних лет. У человека и остальных двуполых видов мини- и микросателлитные маркерные системы являются наиболее информативными, эффективно применяемыми в популяционной и эволюционной биологии, медицинских исследованиях, геномном картировании и определении родства [Goldstein and Pollock, 1997; Jeffreys et al., 1997; Ryskov, 1999; Ellegren, 2000]. Однако, до сих пор мало известно о природе генетической нестабильности, аллельной структуре, уровне и природе мутаций гипервариабельных мини- и микросателлитных локусов, особенно у видов с клональной структурой популяций.

С другой стороны, именно клональные виды (партеногенетические и гиногенетические), система размножения которых исключает рекомбинацию с мужским геномом, являются уникальными объектами для мониторинга генетической изменчивости в локусах с повышенной мутационной активностью [Даревский с соавт., 1993]. Партеногенетические виды ящериц рода Darevskia имеют гибридное происхождение, характеризуется диплоидным набором хромосом, невысоким уровнем гетерозиготности аллозимных локусов [Fu et al., 1998] и незначительной вариабельностью сайтов рестрикции митохондриальной ДНК [Moritz et al., 1992].

Ранее с помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга была изучена изменчивость различных типов мини- и микросателлитных маркёров ДНК у четырёх партеногенетических видов рода Darevskia [Канн и соавт. 1998; Tokarskaya et al., 2001; Мартиросян с соавт., 2002; Мартиросян с соавт., 2003]. Было показано, что на фоне видоспецифических картин ДНК-фингерпринтных спектров партеновидов выявляется генетическая неоднородность партеногенетических особей по некоторым микросателлитным маркёрам ДНК.

В то же время, молекулярная природа и механизмы возникновения мшсросателлитных мутаций, а также уровень аллельного полиморфизма микросателлитных локусов остаются неясными. Очевидно, определённый прогресс в решении этих вопросов могут дать генно-инженерные исследования этих локусов.

Целью настоящей работы является клонирование и молекулярно-генетический анализ 3-х (ОАТА)п-содержащих локусов В. итвехиаШ, изучение внутривидового полиморфизма этих локусов у В. итзехиаШ, молекулярная характеристика аллельных вариантов клонированных локусов и выявление гомологичных локусов у двуполых родительских видов £>. па/ге/шя и £). \alentini.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ /. Гипервариабельные последовательности генома: минисателлиты.

В настоящее время известно, что в геноме всех живых организмов существуют участки с повышенной вариабельностью. Существование различий в строении ДНК у разных представителей одной популяции получило название полиморфизма ДНК. Полиморфные участки ДНК могут быть выявлены с помощью блот-гибридизационного анализа при гидролизе ДНК ферментами рестрикции и использовании определенных клонированных последовательностей генома - ДНК зондов. Это явление получило название полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Различные рестрикционные фрагменты выявляются по гомологии с определенными ДНК-зондам, следовательно, ПДРФ и соответствующий ДНК-зонд представляют собой систему, за наследованием которой можно проследить. Впервые явление геномного полиморфизма было использовано в 1974 г. Дж. Сэмбруком, осуществившим картирование температурочувствительных мутаций аденовируса с помощью полиморфных маркеров. В 1978г. Д. Ботстейном и соавт. [Botstain et al., 1980] было высказано предположение, что любые анонимные последовательности ДНК могут служить маркерами полиморфизма, и могут быть использованы для генетического анализа. При этом любые генетические признаки, сегрегирующие в поколениях, может быть маркированы вариантами ПДРФ, которые наследуются как простые менделевские признаки [Botstain et al., 1980]. Ценность отдельного полиморфного маркера зависит от числа его аллельных вариантов в популяции. В большинстве случаев варианты ПДРФ возникают в результате точковых нуклеотидных замен, небольших делеций и вставок в сайтах узнавания рестриктазами. Такие изменения (мутации) приводят к появлению всего двух аллельных вариантов. Однако диморфные маркеры малоинформативны. Поэтому используют ДНК-зонды, детектирующие области генома с повышенной вариабельностью, позволяющие получить маркеры, характеризующиеся многоаллельностью. Существование подобных гипервариабельных локусов впервые было показано при исследовании генома человека в 1980г. А. Вайманом и Р. Уайтом [Wyman and White, 1980]. Этот гипервариабельный локус выявили с помощью клонированной анонимной последовательности ДНК из теломерного района 14 хромосомы человека. Проведенный сегрегационный анализ показал, что все аллельные варианты данного локуса наследуются по менделевскому типу. Авторы также показали, что по структуре локус представляет собой повторяющиеся олигонуклеотидные звенья. Позднее подобные локусы были обнаружены в других участках генома человека. Характерным свойством локусов, состоящих из тандемно повторяющихся олигонуклеотидных звеньев, является заметная асимметрия в содержании пуринов и пиримидинов в разных звеньях, что напоминает сателлитную ДНК. При таком необычном нуклеотидном составе они, как правило, не содержат сайтов узнавания большинства рестриктаз. Однако, в отличие от сателлитной ДНК, сконцентрированной в основном в центромерных районах хромосом, эти локусы имеют разную геномную локализацию. Поскольку гипервариабельные локусы высоко полиморфны, то их информативность как маркеров, в частности для анализа сцепления, значительно выше, чем у большинства биохимических маркеров (например, изозимов ферментов или групп крови), а гетерозиготность в популяциях приближается к 100%.

Минисателлиты - это участки ДНК длиной 0.5 - 30 т.п.о., состоящие из повторяющихся звеньев размером от 6 до 100 п.о. [Jeffreys et al., 1995].

Последовательность нуклеотидов, образующая повторяющееся звено получила название ✓ коровой Последовательности». Минисателлиты могут отличаться не только «коровой ^ последовательностью», но и количеством ее повторений, а также некоторыми различиями в составе самого повторяющегося звена. Такие минисателлиты представляют собой разные аллельные варианты, число которых в популяциях живых организмов может быть очень велико. По этой причине минисателлиты также называют «гипервариабельными участками ДНК» (hypervariable regions - HVR).

Роль минисателлитов в геноме практически не изучена. Считается, что они могут участвовать в процессе связывания различных белков, а также являются горячими точками рекомбинации. В пользу последнего предположения свидетельствуют факты гомологии между последовательностями некоторых минисателлитов и участков, отвечающих за рекомбинацию: например, коровая последовательность Джеффриса, М13 минисателлит и сЫ-сайт E.coli имеют участки гомологии. Последовательность, гомологичная коровой последовательности Джеффриса, была найдена в гене Ер главного комплекса гистосовместимости мышей, который содержит горячую точку рекомбинации. Однако ряд данных, указывают на то, что присутствие минисателлита не является необходимым условием для рекомбинации [Jeffreys, 1987]. Таким образом, выяснение роли минисателлитов и других типов тандемных повторов в геноме живых организмов требует проведения дополнительных исследований. 0

Значительный вклад в изучение гипервариабельных локусов и их использование 1 для генетического анализа внесли А. Джеффрис и соавт. [Jeffreys et al., 1985, 1987]. В первом интроне миоглобинового гена человека ими был открыт 33-нуклеотидный минисателлитный повтор, фланкированный прямыми повторами из девяти нуклеотидов. Используя данную коровую последовательность в качестве зонда для скрининга библиотеки геномной ДНК человека, А. Джеффрис показал, что этот фрагмент способен гибридизоваться с другими участками ДНК человека. В результате были выделены и охарактеризованы минисателлитные последовательности, состоящие из 3-29 тандемно v организованных звеньев, повторяющиеся единицы которых различались по нуклеотидному составу и варьировали по длине от 16 до 64 п.о. Однако все повторяющиеся звенья содержали практически одинаковую «коровую последовательность» длиной 16 нуклеотидов. За пределами коровой последовательности повторяющиеся звенья не имели гомологии.

Применив для блот-гибридизации различные поликоровые пробы (33.15 и 33.6),

Джеффрис и соавт. впервые показали, что на одной гибридизационной картине можно выявить сразу все или почти все локусы, содержащие минисателлитные последовательности данного семейства. Полиморфизм таких картин блот-гибридизации чрезвычайно высок, так как определяется комбинацией многих, до нескольких десятков, независимых полиморфных локусов. Как показывают расчеты, вероятность совпадения гибридизационных профилей, то есть всех фрагментов, для двух неродственных индивидуумов очень мала , ~10"и , только при использовании одной поликоровой пробы

Jeffreys et al., 1985], а для родственников первого порядка она составляет ~10"5 .

Получаемые картины гибридизации оказались индивидуально высоко специфичными и, по аналогии с картинами папиллярных линий, были названы «ДНК-фингерпринтами» или t дактилоскопическими оттисками» генома. Дальнейшие исследования показали, что профили гибридизации с гипервариабельными минисателлитами обладают соматической стабильностью, различия выявляются лишь для рестриктаз, сайты узнавания которых блокируются при метилировании.

В ходе дальнейших исследований Уонг и соавт. [Wong et al., 1986] впервые показали, что пробы Джеффриса могут служить не только для получения фингерпринтов тотальной человеческой ДНК, но также для скрининга геномных библиотек и выявления клонов, представляющих индивидуальные гипервариайельные локусы. Такие последовательности, которые содержат тандемные повторы, но представляют только один локус, обозначили как локусы с различающимся числом тандемных повторов (variable number of tandem repeats - VNTR) [Nakamura et al., 1987]. Эти локусы представляют большую ценность как точки отсчета при составлении генетической карты сцепления. Вследствие высокой гетерозиготности эти локусы достаточно информативны для картирования генетических болезней и могут использоваться при работе с малочисленными родословными.

Минисателлиты М13 — типа.

Семейство гипервариабельных последовательностей, детектируемое минисателлитной ДНК бактериофага М13 было обнаружено в 1987 г. при изучении полиморфизма ДНК человека. В качестве пробы использовали конструкцию из ДНК человека и фага М13 [Джинчарадзе и др., 1987], а также ДНК фага М13 дикого типа [Vassart et al., 1987]. При определенных условиях наблюдалась гибридизация ДНК человека и ДНК бактериофага. При дальнейших исследованиях показали, что в гибридизации участвовал фрагмент ДНК в гене фагового белка III, состоящий из двух кластеров повторяющихся 15-нуклеотидных звеньев. Обнаруженный минисателлит давал удовлетворительные картины гибридизации с образцами ДНК разных объектов, и оказался уникальной пробой, которую можно использовать для выявления множества гомологичных локусов в геноме различных живых организмов [Ryskov et al., 1988].

Мутации в м ин исателл и max.

Вариабельность в минисателлитных локусах связана со спонтанным мутагенезом и частота мутационных событий различна для разных типов минисателлитов. Это может зависеть не только от структуры минисателлита, но и от локализации его в геноме, пола объекта, от того, в каких клетках проводился анализ - половых или соматических, от возраста исследуемой особи.

Минисателлиты могут различаться не только строением, длиной и степенью изменчивости, но и частотой мутаций в мужских и женских половых клетках [Jeffreys et al., 1997]. Например, для минисателлита человека СЕВ1 эта величина составляет 15% для сперматозоидов и 0.5% - для ооцитов. Для других минисателлитов, например A.MS1, этого не наблюдается. Эти различия могут отражать разные механизмы, приводящие к появлению тех или иных мутаций в геноме, такие как рекомбинация, репликация и генная конверсия.

Анализ частоты спонтанно возникающих мутаций (около 5% на гамету), приводящих к появлению новых аллельных вариантов человеческого минисателлита A.MS1, показал, что эта величина пропорциональна размеру исходного аллеля. При этом частота мутаций растет с увеличением гетерозиготности, что согласуется с теорией нейтральных мутаций или случайного дрейфа генов [Jeffreys et al., 1988]. Исследования XMS1 не обнаружили отличий в частоте мутаций между мужскими и женскими половыми клетками, однако характер возникающих изменений был разный. В сперматозоидах изменения затрагивали участки минисателлита от 4 до 10 пар оснований, а в ооцитах — около 200 п.о. Это свидетельствует о различных механизмах возникновения новых аллелей: возможно, изменения в мужских половых клетках происходят в результате проскальзывания вилок репликации, а в женских - в результате генной конверсии в мейозе [Jeffreys et al., 1988].

В случае других минисателлитов человека - MS32, MS205, В6.7, СЕВ1 было показано, что независимо от длины исходного аллеля большинство изменений аллелей представляют собой увеличение числа повторов. Это может иметь большое значение для изучения распределения минисателлитов в популяциях и для объяснения того, каким образом из короткой и относительно стабильной исходной последовательности может возникнуть длинный и очень изменчивый тандемно организованный локус [Jeffreys et al., 1997]. Анализ изменчивости 50 аллельных вариантов минисателлита человека MS32 показал, что все они отличаются друг от друга строением одного из концов. Изменения числа повторов происходили в участке, который ранее был идентифицирован как «горячая точка нестабильности» [Jeffreys et al., 1995] и при этом наблюдалось равновесие между частотой меж- и внутриаллельных конверсионных событий. Похожие результаты были получены при изучении нестабильности MS205, В6.7 и СЕВ1, однако степень полярности внутриаллельных мутаций отличалась в зависимости от исследуемого локуса [Jeffreys et al., 1995]. Было показано, что основной механизм возникновения новых аллельных вариантов минисателлитов - это генная конверсия. Рассмотрим немного подробнее этот процесс.

В процессе мейоза происходит конъюгация гомологичных хромосом и образование структуры Холлидея. При этом в одном аллеле, который называется акцепторным, может произойти двунитевой разрыв в начале минисателлита, и возникшая брешь будет достраиваться по матрице другого, донорного аллеля. Таким образом, в результате конверсии, участок аллеля-донора появится в акцепторном аллеле. Более простые случаи, такие как делеции и дупликации в акцепторном аллельном варианте, можно объяснить однонитевым разрывом в его начале. В обоих случаях возникновение разрывов нитей ДНК предполагает существование некоего белка - ^-действующего фактора, который связывается с участком ДНК, фланкирующим акцепторный аллельный вариант минисателлита:

В А В

-1- донор -1-' .1 ■1

D С D

-1- акцептор -* 1 * .1—L сг$ фактор

Модель такого механизма генной конверсии получила название «модели инициирующего фактора». Одним из доказательств, подтверждающих верность этой гипотезы, является то, что частота мутаций в исследуемых минисателлитах остается постоянной независимо от длины исходного аллеля. Участки изучаемого локуса, удаленные от инициаторной последовательности ДНК, с которой связывается си-фактор, не затрагиваются мутацией. Это было показано для минисателлитов человека MS32, MS205, СЕВ1, В6.7. Точечные замены в области связывания фактора влияют на частоту мутаций [Jeffreys et al., 1997].

II. Гипервариабельные последовательности генома: микросателлиты

Микросателлиты, SSR (short simple repeats) или STR (short tandem repeats) представляют собой тандемно повторяющиеся элементы генома из одного и более (до б) пар оснований, способные образовывать достаточно протяжённые кластеры, до 60 и более повторов. Также, как и минисателлиты, микросателлиты относятся к гипервариабельным участкам генома, так называемому классу VNTR (variable number of tandem repeats), полиморфизм которых связан прежде всего с изменениями числа повторов в кластере.

0 л

Частота мутаций индивидуальных микросателлитных локусов варьирует от 10" до 10 событий на генерацию, что является чрезвычайно высоким показателем, при сравнении с частотой мутаций в кодирующих областях генома. Обычно микросателлитные локусы имеют 10 и более аллельных вариантов и гетерозиготность выше 60%, даже при небольшой выборке [Bowcock et al., 1994; Deka et al., 1995]. Все вышеперечисленные качества, в совокупности с широкой распространённостью микросателлитов по всему геному, делает их наиболее привлекательными генетическими маркерами для высокоэффективного генетического картирования [Dib et al., 1996; Dietrich et al., 1996]. Кроме того, они всё чаще подменяют RFLP и RAPD в популяционно-генетических и филогенетических исследованиях. Интерес к микросателлитам и механизмам их повышенной нестабильности связан, также, с их ролью в возникновении различных наследственных заболеваний, таких как синдром фрагильной Х-хромосомы, хорея Гантингтона, спиноцеребральная атаксия, миодистрофия Дюшена и др. Имеются данные о связи некоторых онкологических заболеваний с микросателлитными последовательностями.

Однако к настоящему времени, благодаря существенной интенсификации молекулярно-генетических исследований, доступны микросателлитные карты практически всех генетически и экономически важных организмов, включая человека, мышь, дрозофилу, коров, овец, кур, свиней, томатов, сои, риса и т.д. Имеются работы посвященные микросателлитам простейших [Su and Willems, 1996] и растений [Causse et al., 1994].

Классификация микросателлитов основана на повторяющемся мономерном звене: мононуклеотидные (А)п; динуклеотидные (СТ)П, (АС)П; тринуклеотидные (САС)П, (ТСС)„, (CTG)n, (ТСТ)П; тетрануклеотидные (GATA)n, (GACA)n и т.д. Р. Шафером и совт. [Schafer et al., 1994] в поисках подходящих информативных проб было изучено восемь простых повторяющихся олигонуклеотидов и обнаружено, что наиболее информативные картины гибридизации с ДНК человека даёт проба (CAC)s. При использовании её в методе ДНК-фингерпринтинга в сочетании с рестриктазами AluI, Hinfl, Mbol получаемые картины гибридизации фрагментов ДНК были идентичны у монозиготных близнецов, соматически стабильны и наследовались согласно законам Менделя. Широко применяется в популяционных исследованиях проба Bkm-2(8) (Banden krait minor satellite). Эта последовательность первоначально была выделена из геномной ДНК одного из видов змей Bungarus fasciatus, а позднее обнаружена у многих эукариот. Показано, что у » некоторых видов Bkm-повтор локализован на половых хромосомах [Lang et al., 1993]. Bkm-проба содержит в основном GATA/GACA повторы и эффективно используется для изучения геномного полиморфизма у высших эукариот.

Геномная локализация.

Многочисленные исследования демонстрируют, что локализация микросателлитов в геноме не является случайной. Обычно их рассматривают как эволюционно нейтральные последовательности ДНК [e.g. Tachida & Iizuka, 1992; Awadalla & Ritland, 1997; Schlötterer & Wiehe, 1999]. Чаще всего микросателлиты входят в состав обширной фракции некодирующей ДНК и относительно редки в кодирующих областях генома. Например, для 54 растительных вида показана локализация 101 моно-, ди- и тетрануклеотидных повторов в некодирующих областях [Wang et al., 1994]. Все типы микросателлитных повторов (от моно- до гексануклеотидных) были в избытке обнаружены в некодирующих областях генома эукариот разных классов: Saccharomyces cerevisiae, Caenorabditis elegans, Shizosaccharomyces pombe, Mus, Drosophila [Metzgar et al., 2000]. В геноме рыбы Fugu rubripes 11.6% из 6042 микросателлитов обнаружено в кодирующих областях [Edwards et al., 1998]. Ранее сходная картина геномной локализации триплетных повторов в кодирующих и некодирующих областях генома была описана для грибов, простейших, прокариот, вирусов, органелл, плазмид и человека [Field & Wills, 1996; Wren et al., 2000]. Тем не менее, триплетные повторы, связанные с различными заболеваниями, были найдены и в кодирующих областях генома человека [Nadir et al., 1996].

Подавляющее большинство микросателлитов (48-67%), представленных в геномах многих видов являются динуклеотидами [Wang et al., 1994; Schug et al., 1998], однако, y приматов наиболее копийными в геноме являются мононуклеотидные повторы (главным образом поли-А/Т-кластеры)[ТоЙ1 et al., 2000; Wren et al., 2000]. В противоположность тринуклеотидным микросателлитам, ди- и тетрануклеотидные повторы значительно более редки в кодирующих областях. Например, динуклеотидные повторы приблизительно в 20 раз реже встречаются в экспрессируемых последовательностях генома ели Picea abies [Scotti et al., 2000]. В восьми прокариотах и дрожжах длинные моно- и динуклеотидные тракты представлены исключительно в некодирующих областях [Field & Wells, 1998]. В некоторых геномах динуклеотидные повторы могут находится в нетранслируемой 5' и 3' областях. Это показано для пяти генов рыбы Ictaïurus punctatus [Liu et al., 1999] и для генов белка теплового шока 70 млекопитающих (hsp 70), содержащих (GA)6CAG(TC)24-кластер [Lisowska et al., 1997]. Динуклеотидные повторы также обнаружены в интронах. Например, в интроне А гена Adh-1 Mus musculus имеется (ТА)н, (TG)8 и (TA)i9 кластеры, а интрон гена IL-5 содержит (АТ)17-кластер. В интроне гена BVGC 34 генома берёзы Betula pendula находятся (СА)п, (ТА)и и (TGTA)3 микросателлиты. Возможные изменения размеров тандемных повторов в 5' и 3' областях и интронах способны привести к изменениям в структуре кодируемых белков и/или формированию новых генов за счёт сдвига рамки считывания (ORF) [Bachfrog et al., 1999; Liu et al., 1999].

Toth et al. (2000) провели детальный анализ микросателлитов в нескольких классах эукариот, от грибов до человека, и установили высокую • видовую специфичность в локализации различных типов повторов (от моно- до гексануклеотидов) для разных мотивов в кодирующих и некодирующих областях, интронах и межгенных спейсерах. Такая специфичность может быть частично объяснена совокупным действием мутационных механизмов и дифференцирующего отбора. Накопленные эмпирические сведения с известной долей вероятности указывают, что микросателлитные последовательности более распространены и протяжённы у позвоночных, чем у беспозвоночных, и среди позвоночных наиболее протяжённые микросателлиты представлены у холоднокровных видов [Chambers & MacAvoy, 2000]. Интересно, что среди таксонов, исследованных Toth et al. (2000) наибольшая представленность микросателлитов показана для грызунов, а наименьшая - для С. elegans.

Участие в формировании хромосомных структур.

Некоторые аспекты широкой распространённости микросателлитных последовательностей в геноме основаны на их вероятной роли в формировании видоспецифичных хромосомных структур. Например, сигнал гибридизации микросателлитного зонда в сходных хромосомных позициях, независимо от используемого мотива, выявляет заметное сходство полученных паттернов в пшенице и ржи, что свидетельствует о специфической роли микросателлитов в хромосомной организации, поскольку выявляет вероятные древние компоненты генома семейства Triticum [Cuadro & Schwarzacher, 1998].

Во многих видах центромерная область хромосом образована множеством тандемных повторов, влияющих на центромерную организацию. Длинные микросателлиты с moho-, ди-, три- и тетрануклеотидными мотивами высоко кластеризованы в центромерных областях томатов [Areshchenkova &• Ganal, 1999], Arabidopsis [Brandes et al., 1997] и свёклы Beta vulgaris [Schmidt & Heslop-Harrison, 1996]. В Neurospora crassa анализ центромерной последовательности ДНК обнаружил уникальную структуру, содержащую разнообразные семейства специфических повторов [Centola & Carbon, 1994]. Характеристики и строение простых повторов в центромере N. crassa сходно с таковым центромер Drosophila, но представленность каждого класса повторов уникальна для Neurospora [Cambaren et al., 1998]. В минихромосомах Drosophila участки ДНК, фланкирующие центромеры, состоят преимущественно из большого числа повторяющихся последовательностей, причём количество повторов различается между полами [Murphy & Karpen, 1995].

Агрегация различных тандемных повторов в высокоорганизованные хромосом-специфичные повторы является общим свойством большинства центромер и предполагает, что эволюционные механизмы формирования и поддержания таких структур высоко консервативны для большинства геномов [Janzen et al., 1999]. Повсеместная представленность повторяющихся последовательностей в геномах различных видов свидетельствует о эволюционных связях между структурой и функциями их в центромерах [Eichler, 1999]. Предположительно, повторы фланкирующие г центромерные области могут выполнять две функции: удержание сестринских хроматид и косвенное участие в образовании и функционировании кинетохор [Murphy & Karpen, 1995].

Влияние на рекомбинацию.

Большое число микросателлитных и минисателлитных ДНК являются, вероятно, «горячими» точками рекомбинации [Jeffreys, 1998; Templeton et al., 2000]. Это подтверждается экспериментами, проведёнными на вирусах [Wahls & Moore, 1990], дрожжах [Treco & Aruheim, 1986], человеке [Aharoni et al., 1993; Majewski & Ott, 2000; Templeton et al., 2000], и клеточных линиях млекопитающих [Wahls & Moore ,1990].

Динуклеотидные повторы являются предпочтительными сайтами рекомбинации из-за их высокого сродства к ферментам рекомбинации [Biet et al., 1999]. Некоторые микросателлиты способны вызывать рекомбинацию непосредственно влияя на структуру ДНК. Предположительно, белки, связывающиеся с (GT)n, (CA)n, (CT)n, (GA)„, (GC)n или (АТ)П -повторами могут участвовать в рекомбинационном процессе, индуцируя Z-конформацию или другие альтернативные вторичные структуры ДНК [см. обзоры: Kord et al., 1994; Karlin et al., 1998; Biet et al., 1999]. Экспериментальные данные свидетельствуют, что на рекомбинацию влияет, также, количество повторов в микросателлите. Например, при изучении влияния GT/GC-микросателлитов на RecA-зависимую гомологичную рекомбинацию in vitro, было установлено, что количество молекул ДНК, претерпевших обмен цепями уменьшался от 100% до 80% и 30% для ДНК, содержащей 7, 16 и 37 повторов (GT)n, соответственно [Dutreix, 1997]. Majewski and Ott (2000) анализировали представленность разных микросателлитов и интенсивность рекомбинации вдоль 22 хромосомы человека. Существенная взаимосвязь между усилением рекомбинации и присутствием микросателлитных повторов была установлена только для (СГ)п-повторов. У дрожжей (СТ)п-микросателлитный повтор в локусе ARG4 приводит к увеличению частоты генной конверсии; повторяющаяся последовательность стимулировала образование множественных кроссоверов, но не влияла на одиночные кроссоверы [Genderel et al., 2000]. Очевидно, что на рекомбинацию влияет не только мотив микросателлита, но и количество повторов в кластере.

Влияние на репликацию.

Установлено, что микросателлитные последовательности способны влиять на репликацию ДНК [Field & Wills, 1996]. Так, в клетках крыс амплификация ДНК останавливалась внутри специфической области, содержащей d(GA)27'd(TC)27-ioiacTep. Он обнаруживается на конце ампликона и коньюгирует с обратным повтором, выступая в качестве сайта терминации репликации ДНК in vivo [Caligo et al., 1999]. Имеются данные, свидетельствующие о способности простых тандемных повторов влиять на клеточный цикл. Например, в человеческом гене СНК1 ответственном за прохождение клеточного s цикла, в кодирующей области имеется (А)9-кластер [Codegoni et al., 1999], который является потенциальным сайтом мутаций, вызывающих нарушение клеточного цикла и образование опухолевых клеток [Bertoni et al., 1999]. Изменения в гене СНК1, наблюдаемые при некоторых видах рака у человека связаны с высокой степенью поли-А-нестабильности. Инсерция или делеция одного А-нуклеотида в кластере влияет на структуру экспрессируемого белка. Таким образом, мутации в гене СНК1 представляет собой ещё один путь образования раковых клеток с нарушениями в клеточном цикле [Bertoni et al., 1999]. Некоторые гены, контролирующие клеточный цикл, такие как hMSH3, hMSH6, ВАХ, IGFIIR, TGFplIR, E2F4 и BRCA2, имеют в своём составе повторяющиеся последовательности, играющие важную роль в контроле роста клетки. Нестабильность повторяющихся последовательностей этих генов связана как с инсерциями, так и с делениями мономерных звеньев. Большинство опухолей, ассоциируемых с этими повторами, связаны с мутациями в более чем одном из этих генов, причем длинные повторы являются наиболее частыми мишенями для мутаций [Johannsdottir et al., 2000].

Участие в регуляции экспрессии генов.

Некоторые исследования показывают, что микросателлиты, расположенные в промоторных областях могут влиять на активность генов. Так, в промоторной области ген белка теплового шока hsp26 находится (ТС)п-кластер выступающий в качестве транскрипционного элемента у Drosophila [Sandaltzopoulos et al., 1995], Aspergillus [Punt et al., 1990] и Phytophtora [Chen & Roxby, 1997]. Деления различных ди-, три- и тетрануклеотидных повторов заметно хменяет транскрипционную активность. Например, транскрипционная активность промоторов генов c-KI-ras [Hoffman et al., 1990] и TGF-ß3 [Lafyatis et al., 1991] может критически снижаться при делеции (ТССС)п-кластера из промоторной области. A (GT)n-n0BT0p способен увеличивать активность гена независимо от его ориентации, находясь на некотором расстоянии от гена, однако, наиболее эффективное усиление транскрипции будет наблюдаться при локализации (GT)n-noBTopa в непосредственной близости от промотора [Stallings et al., 1991].

Тандемные повторы в области интронов могут также существенно влиять на транскрипцию генов. Например, тетрануклеотидный микросателлитный локус HUMTH01, расположенный в первом интроне гена тирозингидроксилазы, выступает в качестве регуляторного элемента транскрипции [Meloni et al., 1998]. Gebhardt et al. (1999, 2000) установили, что транскрипционная активность гена рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) подвержена влиянию (СА)п-кластера, расположенного в первом интроне гена. Предполагается, что тандемный повтор выступает в качестве «соединителя», переносящего промоторный участок ближе к возможному белку-репрессору, расположенному по цепи ниже (СА)п-кластера.

Во многих случаях простые тандемные повторы выступают ключевым элементом в регуляции экспрессии генов. Некоторые гены могут экспрессироваться только в присутствие специфических тандемных повторов. Например, (GAA)n в промоторе гена LacZ Е. coli способствует экспрессии этого гена, в то время, как ни (GAA)i4.i6 ни (GAA)5-n не влияют на его экспрессию [Liu et al., 2000]. Некоторые гены могут экспресироваться в узкой области числа тандемных повторов, вне пределов этой области ген инактивируется. У дрожжей, промотор содержит (CTG/CAG)n с п=25 и отвечает за экспрессию репортерного гена URA3. Тем не менее, при изменении числа повторов >30 ген выключается [Miret et al., 1998]. У цыплят, конструкция из 10, 15 или 22 повторов (СТ) в промоторной области гена (malic enzyme) усиливает экспрессию по сравнению с диким типом, содержащим (СТ)7 [Xu & Goodridge, 1998]. Некоторые тандемные повторы, располагающиеся выше активаторной последовательности служат сайтом связывания для различных регуляторных белков [Lue et al., 1989; Csink & Henikoff, 1998]. Например, белки связывающие поли-(ОА) и поли-(СТ) последовательности обнаружены в фибробластах человека [Aharoni et al., 1993].

Участие в образовании неканонических структур ДНК.

Микросателлитные последовательности способны образовывать большое количество неканонических структур ДНК. Структурные характеристики (GA)n- цепей представляют биологический интерес, в связи с их широкой распространённостью в геномах [Manor et al., 1998], включая центромеры, где они по всей вероятности участвуют в специфических конформационных изменениях ДНК [Grady et al., 1992; Chou et al., 1996]. Повторяющиеся (GA)n-TpaKTbi способны образовывать различные варианты так называемых гомеодуплексов - параллельных и антипараллельных. [Vorlichkova et al., 1999]. 20-мерный (GA)io повтор образовывал гомеодуплекс в условиях близких к физиологическим. Другой 20-мерный повтор (GATA)5 вёл себя в одном случае как (ТА)ю в АТ-дуплексе, в другом случае как (GA)io в G А-дуплексе. При этом он свободно переходил из одного состояния в другое. [Vorlichkova, 1998].

К неканоническим структурам ДНК относятся шпильки, образуемые повтором (CCG)n (фрагильный Х-повтор) или триплетная структура формируемая (GAA)n/(TTC)n.

Подобные триплеты могут иметь важное регуляторное значение для экспрессии генов [Fabregat et al., 2001]. Человеческий центромерный (AATGG)n может образовывать двойную шпилечную ДНК-структуру [Catasti et al., 1999]. Короткие тринуклеотидные повторы также способны формировать протяжённые вторичные структуры в одноцепочечном состоянии, как показано Zheng et al. (1996). Длинные (CAG)n и (CTG)n повторы образуют необычные вторичные структуры при денатурации с последующей ренатурацией [Pearson & Sinden, 1996]. Помимо шпилек, тринуклеотидные повторы могут образовывать и другие конформации ДНК. Одноцепочечные (CGG)n повторы сворачиваются в устойчивую четырёхспиральную структуру (квадруплекс), стабилизируемую квартетами G-G-G-G и С-С-С-С [Usdin et al., 1998]. Под влиянием отрицательной сверхспирализации повторы (GAA)n'(TTC)n могут приобретать конформацию трёхспиральной Н-ДНК [Сиянова, Миркин, 2001]. Формирование подобных стабильных структур предполагает наличие механизма разворачивания, что выгодно для транскрипции и способствует образованию участков узнавания белков [Catasti et al., 1999].

Значительная распространённость динуклеотидных тандемных повторов в геномах многих организмов может свидетельствовать об их роли в формировании таких высокоорганизованных структур ДНК, как суперскрученная [Karlin et al., 1998; Baldi & Basnee, 2000]. Количество повторов, вероятно, является критическим параметром, определяющим равновесие между «выгодностью» необычных структур для экспрессии гена и «невыгодностью» подобных структур при репликации [Catasti et al., 1999], поскольку известно, что ДНК-полимераза может замедляться или останавливаться на стабильных шпильках, триплексах и квадруплексах [Сиянова, Миркин, 2001].

Механизмы нестабильности микросателлитов.

Именно способность простых тандемных повторов к формированию неканонических структур ДНК стала основой для их исключительной нестабильности. Основными механизмами мутации микросателлитов, как уже отмечалось ранее, являются неравный • кроссинговер, проскальзывание вилок репликации и ошибки при репарации ДНК. В основе последних двух механизмов лежит описанная выше способность некоторых микросателлитов ((CGG)n, (CTG)n, (GAG)n и др.) к образованию вторичных структур ДНК [Wells, 1996]. Хотя мутационные процессы различны среди разных видов, типов повторов, локусов и аллелей и зависят от возраста и пола [Brock et al., 1999; Hancock et al., 1999; Ellegren, 2000; Schlotterer et al., 2000], нестабильность их преимущественно связана с изменениями в числе повторов. Значительные изменения количества повторяющихся звеньев в микросателлитных локусах происходит за счёт ошибок проскальзывания в ходе ДНК-репликации [Eisen, 1999]. Некоторые из этих ошибок исправляются различными механизмами, но многие избегают исправления и становятся мутациями. Изучение проскальзывания вилок репликации (slipped-strand), как механизма нестабильности микросателлитов, проводили на (СГС)п-повторах у Е. coli. Было показано, что в зависимости от ориентации повтора относительно точки начала репликации происходит либо увеличение, либо уменьшение числа повторяющихся звеньев. Выявлено, что нарушение процесса репликации происходит на «отстающей» цепи. Если (СГС)п-повтор расположен на матричной цепи ДНК, то на ней могут образовываться шпильки за счёт образования антипараллельных дуплексов. Вновь синтезированная цепь ДНК в свою очередь будет содержать меньшее число повторов, чем исходная цепь [Wells, 1996]. нормальная делеция репликация

Если же (СГС)п-повторы находятся в растущей цепи, то образование ими шпилечных структур приводит к увеличению (экспансии) числа повторов в образующейся цепи. Образование шпилек на растущей цепи может быть вызвано «прыжками» ДНК-полимеразы в области 5'-концов фрагментов Оказаки [ЦДап, 1998].

Прямое доказательство сворачивания удлиняемых повторов (CGG)n, (CGC)n, (CTG)n и (CAG)n в несовершенные шпильки, стабилизированные как уотсон-криковскими, так и неканоническими парами нуклеотидов получено с помощью ЯМР-анализа [Zheng et al., 1996; Gacy et al., 1995; Chen et al., 1995]. Установлено, что шпильки, образуемые четырьмя перечисленными выше повторами, различаются природой некомплементарных пар, а их стабильность меняется в ряду CGC>CCG~CTG>CAG [Gacy et al., 1995]. У дрожжей были также изучены CTG/CAG и CGC/CCG повторы,, способные к образованию петлеобразных I структур [Moore et al., 1999]. Таким образом, нестабильность тандемных повторов может быть представлена как равновесие между образованием ошибок репликации и их исправлением. В случае мутаций генов, отвечающих за исправление ошибок репликации, нестабильность микросателлитов возрастает. Это в свою очередь может приводить к возникновению «микросателлитных» заболеваний и онкогенезу.

Однако, и сама система репарации повреждений ДНК (MMR - mismatch repair) способна индуцировать нестабильность микросателлитных последовательностей. Повреждения ДНК, вызывающие одно- и двухнитевые разрывы, приводят к появлению свободных однонитевых участков ДНК. нормальная репликация числа повторов

Тандемные повторы, содержащиеся в таких участках могут образовывать петлеобразные структуры и последующая репликация, восстанавливающая повреждения, приводит к увеличению числа повторов [Цдап, 1998].

5' > 51 С ^ Б1 У ^ 51

3' 3' 3' разрыв образование экспансии шпильки

Так, изучение линии дрожжей, мутантных по генам, контролирующим систему репарации неспаренных оснований, выявило увеличение нестабильности участков ДНК, состоящих из повторяющихся GT-последовательностей [Strand et al., 1993; Vilkki et al., 2001]. Недавние исследования обращают внимание на важную роль неравной рекомбинации в дестабилизации тандемных повторов (большинства мини- и микросателлитов) [Jakupciak & Wells, 2000; Richard & Paques, 2000]. Неравный кроссинговер приводит к увеличению числа повторов в одном аллеле и уменьшению в другом. неравный кроссинговер

В связи с этим, частота мутаций может расти с увеличением различий по длине между аллелями одного локуса [Goldstein & Pollock, 1997]. В зависимости от мотива, неравный кроссинговер может вызывать однонаправленные или двунаправленные изменения. Неравный обмен в комбинации с генетическим дрейфом и отбором может иметь сильное влияние на накопление тандемных повторов в геноме [Charlesworth et al., 1994]. Однако, по некоторым данным, преимущественным механизмом мутации микросателлитов является проскальзывание вилки репликации, поскольку мутантные аллели нерекомбинантны по фланкирующим маркерам, что свидетельствует о внутрикластерных мутациях [Ellegren, 2000].

Факторы, влияющие на нестабильность микросателлитов.

В настоящее время имеется большое количество данных о зависимости частоты мутаций микросателлитов от их структуры: мотива, длины — и от фланкирующих последовательностей. Так Чакраборти [Chakraborty et al., 1997] показал, что Ф' динуклеотидные повторы мутируют с частотой в 1.2-2.4 раза чаще, чем три- или тетрануклеотидные повторы. Однако, эти закономерности верны только для «нейтральных» микросателлитов. Установлены относительные различия в частоте мутаций микросателлитов среди ди-, три- и тетрануклеотидных повторов в геноме D. melanogaster. Так, три- и тетрануклеотидные повторы мутируют в 6.4 и 8.4. раза реже, чем динуклеотидные соответственно [Shug et al., 1998]. Эти данные были соотнесены с тем, что длина три- и тетрануклеотидных повторов в геноме D. melanogaster меньше, чем длина динуклеотидных повторов. Положительная корреляция между длиной микросателлитного кластера и аллельным полиморфизмом предполагает, что частота мутаций увеличивается с увеличением длины микросателлита. Подобные данные получены для Drosophila ananassae, в геноме которой были выявлены динуклеотидные повторы более короткие, чем в геноме D. melanogaster. Тем не менее, уровень генетической вариабельности сравним с таковым у D. melanogaster [Schug et al., 2004].

Данные полученные при изучении дрожжей in vitro указывают, что длинные динуклеотидные повторы более мутабельны чем короткие [Wierdl, Dominska, 1997]. Сходные результаты получены при исследовании микросателлитных мутаций у человека [Brinkmann et al., 1998] и ласточки Hirundo rustica [Primmer et al., 1998].

Кроме того, в некоторых исследованиях установлена зависимость нестабильности ^ микросателлитных локусов от пола родителя-носителя, которая выражается не только в разной частоте возникающих нарушений, но и в их характере. Например, у самок изменения представляют собой небольшие делеции, затрагивающие от двух до семи повторов, и возникающие приблизительно в 60% случаев. У самцов мутации возникают с частотой 10% - 70% и это в основном увеличение числа повторов. Наблюдаемые половые различия могут быть связаны с разным механизмом гаметогенеза мужских и женских половых клеток, а также полоспецифическими /rans-действующими факторами. Индивидуальные различия могут быть вызваны действием индивидуум - специфических с/^-факторов. Высокий уровень соматической нестабильности и присутствие мутантных аллелей почти во всех тканях организма могут быть связаны с возникновением мутаций на очень ранних стадиях эмбриогенеза — во время первых двух делений после оплодотворения [цит. по Monckton et al., 1997].

Согласно модели Маркова [Kruglyak et al., 1998], частота изменений в микросателлите зависит не только от его длины, но и от частоты возникновения точковых мутаций в нём и явлений проскальзывания вилок репликации. Для микросателлитных локусов характерна положительная асимметрия распределения мутаций, т.е. склонность к увеличению числа повторов в новых аллелях. Число повторяющихся звеньев в микросателлитах обычно не превышает 60, за исключением локусов, образованных тринуклеотидными повторами и вызывающими генные заболевания. Для всех типов микросателлитов существует зависимость частоты мутаций от размера исходного аллеля. Мораном в 1975 г. была предложена формула, согласно которой различия по размеру для локуса, подверженного одноступенчатым изменениям, равны мутационному дрейфу [цит. по Goldstein and Pollock, 1997]: 2(N-1)P, где N- гаплоидный размер популяции, 2р - общая частота ¡мутаций.

Объяснение закономерностей мутационных изменений в микросателлитах получило отражение в «одноступенчатой» и «двухступенчатой» мутационных моделях.

Согласно «одноступенчатой» мутационной модели размер новых аллелей микросателлита увеличивается или уменьшается на одно звено. Все аллели случайно распределены в популяциях и имеют одинаковое селективное значение.[Valdes et al., 1993].

Изменения в микросателлитах в соответствии с «двухступенчатой мутационной моделью» представляют собой совокупность одноступенчатых, т.е. изменение числа повторов на 1 или очень небольшое число звеньев, и скачкообразных (быстрое большое увеличение повторяющихся единиц) изменений. За основу было положено, что каждый локус нейтрален и изменение численности популяции происходит случайно [Di Rienzo et al., 1994]. Наблюдаемые частоты мультиступенчатых изменений (2-5 мономерных звена) существенно варьируют среди разных организмов, например, 4-14% у человека, 12% у pipefish, 16% у ласточки Hirundo rustica, 46% у австралийских ящериц и 74% у зелёных черепах.

Изучение мутационных изменений микросателлитов дрозофилы показало, что большинство нарушений представляют собой сложный процесс [Colson and Goldstein, 1999]. Особенностью этой работы являлось то, что все изучаемые повторяющиеся последовательности характеризовались небольшим числом звеньев и низким уровнем гетерозиготности. Была показала положительная корреляция между полиморфизмом микросателлита и числом повторов в нем, связь структуры микросателлита со структурой фланкирующих участков ДНК, а также подтверждена роль мутационных процессов в поддержании размера микросателлита. Микросателлиты, как и любая последовательность ДНК, подвержены точечным мутациям. Если предшествующий аллель состоял из «чистой» (совершенной) последовательности повторов, результирующий мутантный аллель может содержать прерывистый (несовершенный) кластер повторов из-за точечных мутаций. Несовершенные микросателлитные локусы менее вариабельны, чем совершенные [Weber & Wong, 1993]. Исследования свидетельствуют, что подобные изменения в структуре микросателлитного локуса ведут к уменьшению частоты мутации проскальзывания рамки ДНК-полимеразы. Таким образом, если мутации проскальзывания вилок репликации приводят к увеличению размера микросателлита, то точечные мутации приводят к его превращению в несовершенный повтор и, тем самым, к ослаблению его экспансии. Это может стать первым шагом к «смерти» микросателлита, поскольку несколько точечных мутаций превратят его в набор коротких несовершенных повторов [ЕИе^еп, 2000].

Ретропозоны и нестабильность тандемных повторов ДНК.

В геномах многих организмов были обнаружены повторяющиеся последовательности ДНК, специфичные для таксономических групп и обладающие свойствами ретропозонов. Эти повторы можно разделить на два больших семейства: короткие диспергированные повторы - SINE (short interspersed repeats) и длинные диспергированные повторы - LINE (long interspersed repeats) [Сингер, Берг, 1998].

SINE элементы, вероятнее всего, представляют собой процессированные псевдогены, происходящие от генов, кодирующих тРНК и 7SL РНК. Они имеют длину, не превышающую 500 п.н., содержат А-богатую З'-концевую последовательность, транскрибируются РНК полимеразой III и часто бывают окружены прямыми повторами. SINE последовательности также могут транскрибироваться РНК полимеразой И.

К группе SINE элементов относятся Alu-последовательности приматов, вероятно произошедших от 7SL РНК. Эти элементы составляют около 9% геномной ДНК человека (9x105 копий на гаплоидный геном) и содержат сайт узнавания эндонуклеазы Alu I [Сингер, Берг, 1998].

Строение Alu-повтора человека: s* 3*

1- участки, гомологичные ^^^ИИ^И^^^^^^ЗИИИИИ^ИЭ последовательностям 7SL РНК 4-/х/ 4

2- А-богатые участки 12 12

Типичная Alu-последовательность представляет собой димер, состоящий из двух повторов длиной около 130 п.н., соединенных «голова-к-хвосту». Каждая мономерная единица содержит участки, гомологичные 5'- и 3'- концевым последовательностям 7SL РНК, однако центральная часть 7SL РНК длиной 155 п.н. у них делетирована. Соседние

Alu-последовательности могут располагаться друг относительно друга в разной ориентации [Сингер, Берг, 1998].

В геноме млекопитающих также были обнаружены 81ЫЕ»элементы другого типа, вероятно, возникшие из генов транспортных РНК. К этой группе относятся MIR последовательности (mammalian wide interspersed repeats) или В1-В2-элементы [Krayev et al., 1980, 1982]. Они состоят из 5'- концевого промотора для РНК полимеразы III (гомологичного тому же участку гена тРНК) «коровой» последовательности из 65 п.н. и вариабельного 3' участка [Gilbert and Labuda, 1999]. Перемещение (ретропозиция) SINE элементов также может осуществляться за счет LINE последовательностей, кодирующих энзиматический механизм транспозиции [Ogiwara et al., 1999].

В геномах многих организмов были обнаружены длинные диспергированные повторы - LINE. У млекопитающих наиболее широко распространенным является семейство LINE-1 элементов.

Строение LINE- 5.^^^^^ элемента: I ■' I - ■' "' " : ' ■ ' - ^ : '• • -

I \/

1 - Открытая рамка считывания i 2 3

2 - Стоп-кодон

3 - А-богатый участок

Размер LINE-1 последовательностей 6-7 т.п.н., однако многие представители этого семейства имеют меньшую длину за счет отсутствия 5'-концевых последовательностей. LINE элементы оканчиваются А-богатыми 3' участками и часто окружены прямыми повторами.

Недавние исследования показали, что некоторые мини- и микросателлиты встречаются в геноме в тесной связи с регропозон-подобными элементами. В геноме человека и приматов существуют Alu-повторы, ретропозиция которых происходит с большой частотой. Эти элементы могут являться источником возникновения в геноме некоторых микросателлитных повторов, например (АС)„- типа, а следовательно, и связанного с ними полиморфизма ДНК [Arcot et al., 1995]. Существует несколько моделей возникновения микросателлитов при участии Alu (В1, В2) - элементов:

1. Изменение некоего исходного микросателлита в результате встраивания в его последовательность Alu - элемента

2. Встраивание в геном Alu - ' элемента, изменившегося в процессе обратной транскрипции. Изменения могут затрагивать области элемента, обогащенные А-основаниями (31 концевая область и/или центральная зона Alu - повтора) [Arcot et al., 1995].

Недавно было показано, что гипервариабельные мышиные минисателлиты Ms 6 — hm и Hm -2, возникли в результате изменений, связанных с ретроиозон^подобными * элементами. Эти минисателлиты окружены длинными концевыми повторами (LTR - long terminal repeats) и содержат (GGGCA)n и (GGCA)n олигонуклеотидные повторы, присутствующие в центральной области некоторых LINE-элементов млекопитающих [Kelly, 1994].

Таким образом, существование диспергированных повторов со свойствами ретропозонов является еще одним источником полиморфизма ДНК. Обладая способностью к перемещению, SINE и LINE элементы, встраиваясь в различные участки t генома, приводят к появлению различных изменений. Например, предполагается, что некоторые SINE элементы представлены в геноме в виде тандемно организованных кластеров, и изменение числа повторяющихся единиц или мутации в отдельном звене, могут приводить к появлению ДНК-полиморфизма [Spruell, Thorgaagd, 1996]. Последовательности со свойствами ретропозонов могут являться источниками возникновения мини- и микросателлитов и, следовательно, связанным с ними полиморфизмом ДНК [Spruell, Thorgaagd, 1996; Arcot et al., 1995; Bois et al., 1998; Kelly, 1994]. Предполагается, что длинные концевые повторы, окружающие некоторые мини- и микросателлиты, и образующиеся в результате обратной транскрипции LINE элементов, могут регулировать мутационные события в тандемно организованных последовательностях. LTR - повторы могут являться горячими точками гомологичной рекомбинации или eis — действующими промоторами в геноме млекопитающих [Kelly, 1994].

III. Использование мини- и микросателлитных последовательностей в молекулярно-генетических исследованиях

Присутствие гипервариабельных последовательностей в геноме живых организмов позволяет широко использовать маркерные системы на основе мини- и микросателлитных зондов для решения различных генетических задач. Картирование генов, сцепленных с тем или иным гипервариабельным маркером, создает предпосылки для выделения и клонирования последовательности генов, выяснения структуры кодируемых генами белков. Это, в частности, открывает возможности для изучения молекулярных механизмов различных генных болезней. Данные ДНК-фингерпринтного анализа сейчас используют в криминалистике, медицинской генетике, медицине.

Современные молекулярно-генетические методы, основанные на использовании мультилокусных маркеров ДНК, занимают сегодня выдающееся место не только в медицинских исследованиях, но и при решении таких фундаментальных проблем биологии, как структура и организация генома, его нестабильность, генетическая изменчивость, видообразование, эволюция и систематика. Метод геномной дактилоскопии эффективно используется для геномного маркирования, видового и популяционного типирования, установления родства в различных таксономических группах, включая прокариотические организмы [см. обзор: Рысков, 1999]. Например, была установлена степень генетического сходства и межвидовая изменчивость в группе диких копытных животных [Потапов и др., 1997], проведено изучение внутри- и межвидового генетического разнообразия у грызунов [Потапов и Рысков, 1993; Потапов и др., 1994], межпородного разнообразия у кур [Семенова и др., 1996]. Возможность определения родства позволяет выявить особенности структуры популяций изучаемых видов и основные генетические процессы, происходящие в них, что особенно важно для редких и исчезающих видов [Tokarskaya et al., 1994, 1995].

Исследования, проводимые на разных объектах, показали, что различия в дифференцирующей способности маркеров различного типа связаны с особенностями структурной организации самих маркерных последовательностей ДНК, а также со спецификой их распределения в геноме различных групп животных.

Особый интерес представляет изучение популяционно-генетических закономерностей в клональных, малых и изолированных популяциях, т.к. действие факторов, нарушающих генетическое равновесие (дрейф генов, прохождение через «горлышко бутылки», случайная гибель особей и др.), в таких популяциях может быть легко прослежено. Процесс фиксации аллелей гипервариабельных локусов в малых изолированных популяциях идет быстрее, поэтому метод ДНК-фингерпринтинга является наиболее эффективным для изучения изменчивости в этих популяциях.

Однополые позвоночные как модельные организмы для исследования изменчивости гипервариабельных последовательностей ДНК.

Однополые виды представляют собой удобную - природную модель для решения важных биологических задач. Использование однополых видов позволит разработать новые тест-системы для, например, изучения спонтанного мутагенеза и мутагенного воздействия токсических веществ и радиации. Клонально размножающиеся позвоночные интересны и достаточно удобны для исследований, т.к. их клоны генетически стабильны в ряду поколений, что невозможно для животных с обычным типом полового размножения.

Известно, что для всех однополых видов позвоночных (кроме Poescilia Formosa), в том числе и в группе однополых кавказских скальных ящериц, характерен мейотический партеногенез [Cognetti et al., 1961]. Более детально механизм мейоза установлен у однополых ящериц рода Cnemidophorus. Доказано, что у этих видов имеет место премейотическое восстановление соматического набора хромосом. Изучение образования яиц у однополых ящериц-бегунов показало, что в клетках яичников [Коул, 1984] происходит премейотический эндомитоз, благодаря чему удваивается число хромосом в яйцеклетках [Dawley, 1989], и клетки становятся полиплоидными. У диплоидных видов образуются тетраплоидные клетки, а у триплоидных - гексаплоидные [Коул, 1984]. Мейоз начинается с образования пар между идентичными хромосомами. Между идентичными хромосомами происходит синапсис, что приводит к формированию псевдобивалентов. Дальше мейоз протекает как и у двуполых видов [Dawley, 1989], но происходящий при кроссинговере обмен ДНК не имеет генетических последствий, т. к. в нем участвуют идентичные молекулы ДНК [Коул, 1984]. Когда хромосомы переходят во вторую стадию мейотического деления, создается впечатление, что премейотической дупликации не происходило и первое деление мейоза отсутствовало [Dawley, 1989]. Как это обычно бывает при созревании половых клеток, вслед за кроссинговером клетки дважды делятся. И, в конечном счете, образуются яйца, в каждом из которых столько же хромосом и та же комбинация генов, что и в исходной клетке яичника до дупликации. С генетической точки зрения такое зрелое яйцо полноценно, в отличие от гаплоидного у самок двуполых видов, и может развиваться без оплодотворения [Коул, 1984].

Одной из центральных проблем изучения однополых видов позвоночных является оценка генетического и клонального разнообразия [Dawley, 1989]. Изучение изменчивости и клонального разнообразия у гиногенетического гибридного комплекса Phoxinus eos/ Phoxinus neogaeos [Elder and Schlosser, 1995], обитающего в Северной Америке [Dawley, 1989] показали, что существование большого числа клонов в популяциях клональных видов позвоночных не является правилом.

Низкий уровень клонального разнообразия в исследованных популяциях, по-видимому, связан со специализацией вида и с селективной ценностью одного определенного клона, который "колонизировал" определенную экологическую нишу.

Согласно данным электрофоретических исследований белков и рестрикционного анализа митохондриальной ДНК, партеногенетические виды рептилий в разной степени мультиклональны. Высокий уровень вариабельности аллозимных локусов бал обнаружен, например, у Heteronotra binoci (Gecconidae) и других представителей этого семейства (Nactus pelagiens) [Moritz et al., 1989]. Незначительная генетическая неоднородность была показана для американских партеногенетических ящериц рода Cnemidophorus [Cole et al., 1988]. У отдельных видов кавказских скальных ящериц рода Darevskia также наблюдалась ~ морфологическая изменчивость. Своеобразные вариации окраски были обнаружены в одной из популяций D. dahli. Были обнаружены самки с ярко желтой окраской нижней стороны тела, которые в отличие от обычных самок с бледно-желтой окраской, откладывали меньше яиц и были менее устойчивы к засушливым условиям (персональные наблюдения, Даниелян, Даревский, Куприянова, Murphy) [Murphy, 1997]. Таким образом, в каждом из рассмотренных случаев имеет место появление новых морфологических партеноклонов. Однако, далеко не всегда, такие "морфологические" клоны совпадают с "генетическими", выявленными различными хмолекулярно-генетическими методами [Даревский, 1993]

Согласно - современным представлениям, все партеногенетические виды рода Darevskia появились на Кавказе в постледниковую эпоху и являются молодыми видами, теоретически имеющими равные шансы для возникновения новых клонов [Moritz et al., 1992; Darevsky, 1993]. Клональное разнообразие однополых видов, включая партеногенетических ящериц, принято объяснять мутациями, гибридным происхождением и незаконной рекомбинацией, возможной в популяциях однополых видов. Размер ареала, возраст вида и другие факторы также могут определять степень его генетического разнообразия [Parker et al., 1979]. Одновременно было высказано мнение о том, что нестабильность кариотипа гибридных геномов может тоже приводить к генетическому разнообразию партеногенетических видов и появлению у них мутаций, часто определенного типа [Куприянова, 1999].

Darevskia unisexualis, как и все партеногенетические виды рода Darevskia, имеет гибридное происхождение. Родоначальными видами считаются бисексуальные виды D. nairensis и D. valentini [Даревский, 1993]. Цитогенетические исследования D. unisexualis показали, что хромосомы у этого вида акроцентрические и число их в диплоидном наборе равно 38, включая пару микрохромосом. У D. unisexualis присутствует редуцированная половая хромосома продвинутого типа - W хромосома [Куприянова, 1999].

Вид D. unisexualis распространен в горных районах центральной Армении и прилегающих областях северо-восточной Турции на высоте 1700 - 2100 метров. D. unisexualis обычно населяет коренную подстилающую породу в основном вулканического происхождения, каменистые осыпи, кучи камней и большие фрагменты лавы в степях вокруг гор, в местах ныне исчезнувших горных лесов, камнях на берегу горных прудов [Darevsky et al., 1985].

Исследования митохондриальной ДНК с помощью рестрикционного анализа продемонстрировали очень низкий уровень нуклеотидной изменчивости как у партеногенетического вида в целом, так и у предполагаемого материнского предка [Moritz et al., 1992]. Степень дивергенции митохондриального генома между особями «материнского» бисексуального вида и партеногенетического вида позволяет определить возраст однополого вида; например, приблизительный возраст партеногенетического вида D. unisexualis составляет 5000 лет. Степень дивергенции митохондриального генома между «материнскими» и соответствующими партеногенетическими видами кавказских скальных ящериц составляет 0% - 0.6%, что свидетельствует о недавнем возникновении партеногенетического типа размножения в роде Darevskia, вероятно, около 10000 лет назад, после ледникового периода [Moritz et al., 1992].

Происхождение партеновидов кавказских скальных ящериц можно описать при помощи теории «сетчатого видообразования» [Даревский, 1993]. Один из бисексуальных видов является «материнским», а другой - «отцовским», т. е. в процессе гибридизации участвовали самки одного вида и самцы другого.

Аллозимный анализ 35 локусов у партеногенетических видов D. armeniaca, D. dahli, D. unisexualis показал, что каждый из 3-х исследованных видов представлен одним широко распространенным клоном, но в некоторых популяциях были обнаружены единичные особи, представляющие собой редкие клоны [MacCulloch et al., 1995, 1997; Muphy et al., 1997; Fu et al., 1998]. У D. armeniaca найдено всего 4 клона [Fu et al., 1998], у D. dahli - 5 [Murphy, 1997], у D. unisexualis - 3 клона [MacCulloch et al., 1995]. Редкие клоны различались аллельными вариантами минимум в двух локусах, причем соответствующие варианты были выявлены и у родительских видов. Однако были обнаружены редкие аллели, которые не встречались ни у одного из родительских видов. Таким образом, впервые было доказано, что партеногенетические виды рода Darevskia характеризуются генетической изменчивостью [Куприянова, 1999].

Уровень изменчивости по аллозимным локусам оказался почти таким же, как у партеногенетических ящериц Cnemidophorus tesselatus, но был гораздо выше, чем у Cnemidophorus neomexicanus. Генетическое разнообразие у D. dahli оказалось намного ниже, чем разнообразие, обнаруженное Морицем [Moritz et al., 1989] у однополых гекконов Heteronotia binoe [Murphy, 1997]. Электрофоретический анализ белков трех популяций ящериц D. unisexualis показал, что 21 из 36 аллозимных локусов были константно гомозиготны, 14 показывали фиксированную гетерозиготность и лишь один локус был вариабелен (два аллозимных варианта) [Fu, MacCulloch, 1997]. При проведении экспериментов по пересадке участков ткани была доказана изогенность образцов ткани, полученных от отдаленных популяций из Армении. У 96% образцов ткани не отторгались, но небольшая вариабельность существовала [Даревский, 1993].

Наиболее эффективным методом изучения клональной изменчивости у однополых видов является метод ДНК-фингерпринтинга с использованием мини- и микросателлитных маркеров.

Исследование клонального разнообразия в популяции гиногенетического гибридного комплекса Phoxinus eos/Phoxinus neogaeos проводили с помощью ДНК-фингерпринтинга с олигонуклеотидными зондами и аллозимного анализа. Результаты, полученные при применении обоих методов, показали существование только одного клона. ДНК-фингерпринтный анализ гиногенетических особей комплекса Phoxinus eos /Phoxinus neogaeos в семействе Cyprinidae также обнаружил полное отсутствие клонального разнообразия по мини- и микросателлитным локусам. С помощью ДНК-фингерпринтинга проанализировали 464 особи, среди которых только 4 отличались одной полосой на фоне общей фингерпринтной картины. Наблюдаемые отличия авторы объясняли соматическим мозаицизмом особей [Elder and Schlosser, 1995]. Предварительные данные по анализу митохондриальной ДНК показали, что Phoxinus neogaeos является материнской родоначальной формой и подтвердили гипотезу о гибридном происхождении однополых видов путем многократных гибридизаций между родительскими формами [Dawley, 1989]. Исследования природных популяций Poecilia formosa [Turner et al., 1990] с помощью набора микросателлитных ДНК-проб позволили выявить гипервариабельные фрагменты, проявляющие изменчивость в ряду поколений [Schartl et al., 1991] и показали роль мутационных процессов в возникновении клонального разнообразия у этих видов рыб [Elder, 1995]. Среди 19 особей из одной популяции Poescilia formosa выявили 16 разных клонов, тогда как с помощью аллозимного анализа только 3. Число наблюдаемых полос на различных фингерпринтных картинах варьировало в зависимости от особи, вида, размера популяции и используемой рестриктазы.

Популяция рыб рода Сага^ш.? в Японии представлена диплоидными родственными видами и триплоидными гиногенетическими самками. С помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга было выявлено 3 клона, из чего можно сделать вывод, что почти вся популяция является потомком трех предковых материнских форм [11тто е^ а1., 1997].

С помощью ДНК-фингерпринтинга интенсивно изучались партеногенетические ящерицы рода БагвУвМа [Кан и соавт., 1998, 2000; Токарская и соавт., 2000; Рысков и соавт., 2000; Токагэкауа е1 а1., 2000, 2001, 2003; Мартиросян и соавт., 2002]. Исследование семей В. агтетаса, состоящих из самок и их потомков (первое поколение), проводили с использованием маркеров М13 БИА, (САТА)4, (ТСС)5о. Были обнаружены идентичные картины гибридизации для всех потомков и их матерей. [Токагэкауа е1 а1., 2001]. У О. итзехиаНз, фингерпринтные фенотипы потомков и матерей были также идентичны при анализе с пробой М13, однако, при использовании (ТСТ)5 и (ТСС)5о была обнаружена внутрисемейная вариабельность во всех семьях [Рысков и др., 2003]. Высокая частота мутаций этих локусов (частота мутантных фенотипов около 1) коррелирует с высокой полиморфностью популяционных фингерпринтов с этими полипиримидиновыми пробами [Рысков и др., 2000]. ДНК-фингерпринтный анализ 25 семей £>. итзехиаШ (более 84 потомков) с использованием пробы (САТА)4 демонстрировал мутантный фингерпринтный фенотип у 13 потомков, отличающихся от их матерей по нескольким рестриктным фрагментам ДНК [Токарская и др., 2003]. Мутантные фенотипы, обнаруженные в семьях также были обнаружены в популяционных образцах [Токарская и др., 2000]. Расчёт частоты мутаций (САТА)п-микросателлитов у данных ящериц показал, что она такая же, как у некоторых двуполых видов и составляет 15% на потомка или 0.95% на паттерн. Тем не менее, к настоящему времени практически нет данных о механизмах мутаций подобных полиморфных локусов у партеногенетических видов.

Очевидно, значительный вклад в решение этой проблемы могут внести генно-инженерные исследования вариабельных локусов у этих видов. Этим и определяются основные экспериментальные задачи настоящей работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на образцах ДНК, полученных из крови кавказских скальных ящериц рода Darevskia (D. unisexualis, D. nairensis, D. valentini). В работе использовали 90 особей природных популяций Армении: 13 образцов D. valentini, 10 образцов D. nairensis, 67 образцов D. unisexualis: 11 образцов из популяции Лчап, 10 образцов популяции Кутчак, 10 образцов из популяции Загалу, 19 из популяции Такярлу и 17 из популяции Норадуз. Выделение ДНК из куови

Образцы свежей крови ящериц D. unisexualis консервировали в 0,05М растворе ЭДТА (pH 8.0) и хранили при температуре +4° С. Выделение ядерной ДНК проводили по методу Мэтью с использованием протеиназы К [Mathew; 1984].

К одному объему пробы крови (~50 мкл) добавляли 10 объемов лизирующего буфера №1 следующего состава: 0.32 М сахароза, 0.005М MgCb, 0.01М трис-НС1, 1% тритон Х-100. Смесь инкубировали в ледяной бане в течение 30 минут. Ядра осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант сливали, осадок ядер суспендировали в 2-4 мл буфера №2 следующего состава: 75 mM NaCl, 25 тМ ЭДТА pH 8.0. Ядра вскрывали добавлением SDS до концентрации 1% и протеиназы К («Sigma») до концентрации 50-100 мкг/мл. Смесь инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение ночи. После инкубации в смесь добавляли 4M раствор ацетата натрия до концентрации 0.2 М, плавно перемешивали и добавляли фенол (насыщенный 1М трис-НС1, pH 8.0 ) в объемном соотношении 1:1. Депротеинизацию фенолом проводили в течение 15 минут. Фазы разделяли центрифугированием в течение 20 минут при 4000 об/мин. В результате центрифугирования происходило разделение на три фазы: верхнюю - раствор ДНК, среднюю - денатурированные белки, нижнюю - фенол. Раствор ДНК отбирали, к нему добавляли фенол-хлороформную смесь (соотношение компонентов в смеси 1:1). Далее аналогично проводили депротеинизацию ДНК смесью фенола-хлороформа и хлороформом.

Осаждение ДНК проводили 1 объемом изопропилового спирта. Раствор плавно перемешивали до полного высаживания ДНК. Осажденную в виде «медузы» ДНК дважды промывали раствором 75% этанола и растворяли в ТЕ буфере (10 тМ трис-HCl, 1шМ ЭДТА рН 8.0).

Анализ нативности ДНК проводили электрофорезом тотальной ДНК в 0,8% агарозном геле («Sigma») в 1х трис-боратном буфере (ТБЕ). Концентрацию ДНК проверяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм на приборе «Genesys 10UV».

2 ДНК-фингерпринтинг • Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами

Рестрикционный анализ ДНК проводили рестриктазами Bsu RI и Mva I («Fermentas»). В реакционную смесь входили образец ДНК 5 мкг, 10 мкл 10х буфера для рестрикции и 10 ед. фермента. Объем реакционной смеси составлял 100 мкл. 1х Буфер для используемых рестриктаз имел состав: ЮшМ трис-HCl рН 8.5, 10 шМ MgCb, 7 шМ |3-меркаптоэтанол, 100 mM КС1. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали 15 часов при 37°С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА рН 8.0 до 5 шМ. Для создания ионной силы в раствор добавляли ацетат натрия до 0.2 М. Далее проводили депротеинизацию смесью фенол-хлороформ и хлороформом, и осаждали 2.5 объемами 96% этанола. Смесь оставляли при температуре -20°С. Затем осадок промывали 1 (1 мл) объемом 75% этанола, ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 12000 об/мин, спирт сливали, и высушенную ДНК растворяли в 20 мкл дистиллированной воды. Добавляли 5 мкл 6х буфера для нанесения образцов. Использовали буферы двух составов: а) 0.25% бромфеноловый синий, 0.25% ксиленцианолл, 15% фикол (тип 400), ImM ЭДТА; б) 0.25% бромфеноловый синий, 0.25% ксиленцианолл, 30% глицерин, 1 шМ ЭДТА [Маниатис и др.; 1984а].

Полученные пробы (25-30 мкл) наносили на дорожки 0.8% геля для электрофоретического фракционирования.

• Электрофоретическое фракционирование фрагментов Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК проводили в 0.8% агарозном геле в ТБЕ-буфере при напряжении 25 V в течение 40 часов при двукратной смене буфера. Маркерными фрагментами являлись фрагменты ДНК фага X, обработанной рестриктазами Eco R I и Hind III. После электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия 50 мкг/л.

• Перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры

Перенос фрагментов ДНК, фракционированных в агарозном геле, на нитроцеллюлозные фильтры («Schllincher und Schuell», ВА85) осуществляли в 1М растворе ацетата аммония по методу Лихтенштейна [Lichtengstein et al.; 1990], при помощи нисходящего блоттинга как модификация метода Саузерна [Sousern; 1975].

Денатурацию ДНК в геле проводили в течение 30-40 минут, в 500 мл денатурирующего буфера следующего состава: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl при постоянном равномерном покачивании. Затем гель переносили в 1М раствор ацетата аммония.

Нитроцеллюлозный фильтр, размер которого больше размера геля на 1 см с каждой стороны, промывали 2 раза горячей дистиллированной водой, и переносили в 1М раствор ацетата аммония.

Гель переносили на подставку (нижней стороной кверху), на него плотно накладывали нитроцеллюлозный фильтр, удаляя пузыри воздуха и два листа фильтровальной бумаги 3 ММ (такого же размера, что и фильтр), предварительно смоченные в 1М растворе ацетата аммония. Все это переносили (фильтром снизу) на слой из 10 листов фильтровальной бумаги, а затем - на слой тканых полотенец. По краям геля прокладывали полиэтиленовые спейсеры, устанавливали рамку с грузом так, чтобы она не касалась геля. Для герметичности установки заливали участки между гелем и рамкой 0.8% агарозой. В полученную «кювету» заливали 1.5 литра 1М ацетата аммония и оставляли на 12-24 часа.

• Обработка нитроцеллюлозных фильтров перед гибридизацией

После переноса ДНК, нитроцеллюлозный фильтр выдерживали 10 минут в 4х растворе SSC (для удаления ацетата аммония) и высушивали при комнатной температуре. ДНК фиксировали на фильтре при 80°С и давлении в 1 атм. в течение 2 часов и проводили предгибридизацию (см. «Блот-гибридизация).

• Блот-гибридизация

В качестве стандартного гибридизационного раствора использовали смесь, состоящую из ôxSSC (или 5xSSPE) и 10-кратного раствора Денхардта (0.2% поливинилпирролидон, 0.2% фиколл, 0.2% бычий сывороточный альбумин ("Sigma")). Предгибридизацию проводили в течение 3-х часов в 30 мл гибридизационного буфера при температуре 60°С, гибридизацию - в 5-10 мл буфера при концентрации метки 10 млн. им./мнн на 1 мл смеси, при 60°С в течение 17 часов. Фильтры отмывали в 2xSSC - 0.1% SDS по 30 минут при 55°С, при трехкратной смене буфера.

Для олигонуклеотидов температуру отжига рассчитывали по формуле

Т0=Тт-5°С

Тт определяли согласно Сейну и соавторам, прибавляя по 2°С на каждую А-Т пару и по 4°С на каждую G-C пару [Thein et al.; 1986]. Для гибридизации использовали смесь 6xSSC (или 5xSSPE) и 10-кратного раствора Денхардта. После гибридизации фильтр отмывали в растворе 6х SSC, 0.1% SDS по 30 минут при комнатной температуре, при трехкратной смене буфера. Затем фильтр промывали в 6х растворе SSC, слегка подсушивали и заворачивали в пленку («Pacían»).

• Получение радиоавтографов

Фильтр закладывали в кассету с усиливающим экраном ЭУ-И1 и рентгеновской пленкой («Dupont»). Экспозицию проводили при -70°С в течение 3-7 дней.

3 Создание геномной библиотеки Р. итзехиаНз. (Геномная клонотека была создана совместно с Н.А. Чуриковым (Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта))

• Рестрикция геномной ДНК

Рестрикцию геномной ДНК £>. итзехиаИэ проводили рестриктазой БаиЗА («АтегеИат»). В реакционную смесь входили: образец ДНК 5 мкг, 1х буфер для рестрикции (10 шМ трис-НС1 рН 8.5, 10 тМ М§СЬ, 7 тМ. р-меркаптоэтанол, 100 тМ КС1) и 10 ед. фермента. Объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали 15 часов при 37°С. Рестриктазу инактивировали нагреванием до 75° С в течение 10 мин.

• Лигирование вставки в вектор для клонирования

Для лигирования брали 200 нг рестрицированного вектора риС12 (рестрикцию вектора рис 12 осуществляли рестриктазой Ваш Н1 («АшегвИат») по стандартному протоколу фирмы-изготовителя) и 1 мкг рестрицированной геномной ДНК Э. итБехиаНя. Реакцию лигирования проводили в течение ночи при 19°С в объёме 44 мкл. Состав лигазной смеси: раствор ДНК(0.5 мкг/мкл) - 2 мкл, р1ГС12 (0.2 мкг/мкл) - 1 мкл, буфер Ь9х (4М раствор ИаС1 - 50 мкл, 1М раствор трис-НС1 - 100 мкл, 1М раствор М§С1г - 16 мкл ,13М раствор р-меркаптоэтанола — 16 мкл, раствор рАТФ( 72мкг/мкл) - 30 мкл) — 5 мкл, раствор ВвА - 0.5 мкл, Т4-лигаза (100 ед./мкл) - 1 мкл, НгО до 44 мкл.

• Приготовление компетентных клеток

Клетки Е. сой штамма ХЫ-В1ие ("Зйаи^епе") инкубировали в течение ночи в 5 мл среды ЬВ (дрожжевой экстракт- 0,5 г., бакто-триптон - 1 г., хлорид натрия - 1 г., вода - 100мл) с тетрациклином (15мкг/мл). 1 мл «ночной» культуры помещали в 200 мл ЬВ среды с тетрациклином. Затем бактериальная масса наращивали до плотности ОБбоо = 0.8 и охлаждали 5 минут во льду. После чего полученный раствор центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 минут и осажденные клетки суспендировали в 50 мл буфера ТРВ1 (ИЬО

100 мМ, M11CI2 - 50 мМ, СНзСООК - 30 мМ, СаС12 - 10 мМ, раствор глицерина (со% =15%)), с последующим охлаждением смеси во льду на протяжении 30-40 минут. Далее полученный раствор центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 минут, и осажденные клетки суспендировали в 5 мл буфера TFB2 (MOPS - 10 мМ, RbCI - 10 мМ, СаС12 - 75 мМ, раствор глицерина (ю% =15%)), с последующем охлаждением смеси в течение 5 минут при 4°С. Полученные компетентные клетки расфасовывали в стерильные пробирки («Eppendorf») по 200 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

• Трансформация компетентных клеток рекомбинантной ДНК

Компетентные клетки Е. coli (200 мкл) размораживали в ледяной бане (0° С). Затем в пробирку добавляли 2 мкл лигазной смеси и инкубировали при 0° С в течение 30-40 мин. Далее проводили процедуру «heat-shock»: помещали пробирку, со смесью в водный термостат (42°С) на 30 сек с последующим охлаждением во льду в течение 5 мин. Затем в пробирку добавляли 1мл LB среды с тетрациклином (15мкг/мл) и ампицилином (100мкг/мл) и инкубировали при 37 °С в течение часа на термостатированной качалке. 250 мкл культуры высевали на чашки Петри с LB-агаром с добавлением 30-40 мкл X-Gal и 10-15 мкл IPTG. Клетки подращивали в течение 12 часов при 37 °С до образования отдельных колоний. Отбор осуществлялся на основании «сине-белого теста»: для дальнейшего анализа отбирали неокрашенные колонии клеток, несущие рекомбинантную плазмиду.

4. Скрининг геномной библиотеки на наличие (GATA)„ -последовательностей На чашку с LB-агаром (тетрациклин и ампицилин) помещали заранее разлинованный и обозначенный цифрами фильтр «Hybond N», на который стерильными наконечники «перекалывали» колонии клеток, содержащие рекомбинантную плазмиду. Инкубацию осуществляли в течение ночи при 37°С. Фильтр денатурировали в буфере состава: NaCI -1.5 М, NaOH — 0.5 М, а затем промывали в нейтрализующем буфере (NaCI - 1.5 М, трис-НС1

0.5 М). После чего фильтр промывали 2х раствором SSC (NaCl - 0.3 М, цитрат Na - 0.03 М), сушили и «запекали» на трансиллюминаторе (УФ).

• Мечение олигонуклеотидов с помощью киназной реакции

В экспериментах использовали олигонуклеотид (GATA)4, который метили по 5' концу в киназной реакции [Маниатис и др.; 1984с] при помощи Т4-полинуклеотидкиназы. Реакционная смесь состояла из 2мкл олигонуклеотида (0.001 о.е./мкл), 4,5 мкл воды, 1,5 мкл 10х киназного буфера (состав 10х буфера: 0.7М трис НС1 рН 8.0,0.1М MgCh, 50шМ дитиотреитол), 5 мкл [у-32 Р]- АТР (50 мкКи). Объем смеси 15 мкл; ее инкубировали 40 минут при 37°С.

• Определение включения метки

Включение метки контролировали с помощью минимонитора до и после процедуры очистки. Процент включившейся в ДНК метки определяли как отношение оставшейся после очистки метки к исходному ее количеству.

После реакции мечения объем реакционной смеси доводили до 50 мкл. Из полученного раствора отбирали аликвоту 1 мкл и переносили на стеклянный фильтр GFC («Millipore»), высушивали в течение 5 минут при комнатной температуре и измеряли по минимонитору количество импульсов в минуту. После очистки зонда на колонке с биогелем также отбирали аликвоту 1 мкл и переносили на стеклянный фильтр GFC («Millipore»), высушивали в течение 5 минут при комнатной температуре и измеряли по минимонитору количество импульсов в минуту. После этого считали процент включения метки.

Например, До очистки - 1900 1900 - 100 %

После очистки - 1600 1600 - х % х « 85 %

• Гибридизация.

Гибридизацию проводили с меченным по [ Р] (ОАТА)4-олигонуклеотидным зондом в стандартном буфере состава: 6xSSC, 5 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 5* раствора Денхардта (0.2% поливинилпирролидин, 0.2% фиколл, 0.2% бычий сывороточный альбумин ("Sigma")). Предгибридизацию проводили в течение 1 часа в 15 мл гибридизационного буфера при температуре 50°С, гибридизацию - в 10 мл буфера при концентрации метки 10 млн. имп/мин на 1 мл смеси, при 35°С в течение ночи. Фильтры отмывали в 2xSSC - 0.1% SDS по 20 минут, при трехкратной смене буфера. Затем фильтр промывали в 2х растворе SSC, слегка подсушивали и заворачивали в пленку («Pacían»), Фильтр закладывали с рентгеновской плёнкой на экспозицию в течение ночи. Проявляли радиоавтограф и отбирали рекомбинантные плазмиды, содержащие (GATA)„ -последовательности.

• Выделение плазмидной ДНК

Отдельную колонию Е. coli, содержащую рекомбинантную плазмиду, высевали в 10 мл LB среды и инкубировали на качалке при 200 об/мин и 37° С в течение ночи. Затем культуру клеток центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Осадок клеток суспендировали в 300 мкл воды. Суспензию клеток охлаждали в ледяной бане (0°С). Затем к суспензии добавляли 450 лизирующего буфера №2 следующего состава: 1% SDS, 0.2 N NaOH. Смесь инкубировали в ледяной бане в течение 5 минут. Выравнивали уровень pH добавлением 600 мкл 3 M раствора ацетата калия (pH 5.0). Содержимое клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант переносили в новые пробирки и добавляли 2V охлажденного изопропанола (-20°С). Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 минут, супернатант сливали, осадок промывали раствором 75% этанола, высушивали при 37° С, растворяли в 150 мкл воды. Затем добавляли 300 мкл 7.5 M NH4AC и инкубировали при -20° С 30-40 минут. Далее смесь центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10-15 минут, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли 2 объема сильно охлажденного 96% этанола и повторяли центрифугирование с охлаждением при

14000 об/мин в течение 10-15 минут. Супернатант сливали, а осадок промывали 75% раствором этанола, высушивали при 60° С, растворяли в 30 мкл воды. Затем добавляли РНКазу до концентрации 50-100 мкг/мл. Смесь инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа. После инкубации в смесь добавляли воду до 200 мкл и 4М раствор ацетата натрия до концентрации 0.5 М, плавно перемешивали и добавляли фенол (насыщенный 1М трисом-HCl, рН 8.0) в объемном соотношении 1:1. Депротеинизацию фенолом проводили в течение 10 минут. Фазы разделяли центрифугированием в течение 5 минут при 14000 об/мин. В результате центрифугирования происходило разделение на три фазы: верхнюю - раствор ДНК, среднюю - денатурированные белки, нижнюю - фенол. Раствор ДНК отбирали в новые пробирки, затем добавляли фенол-хлороформную смесь (соотношение компонентов в смеси 1:1). Далее повторяли депротеинизацию смесью фенол-хлороформ. Осаждение ДНК проводили 2 объемами сильно охлажденного 96% этилового спирта. Раствор плавно перемешивали до полного высаживания ДНК. Далее смесь центрифугировали с охлаждением при 14000 об/мин в течение 10-15 минут, осажденную ДНК дважды промывали раствором 75% этанола и один раз 96% этанолом, высушивали при 60° С до полного высыхания и растворяли в 20 мкл воды.

• Обработка плазмидной ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

Рестрикцию плазмидной ДНК проводили рестриктазами Hindlll и ЕсоШ. («Fermentas»). В реакционную смесь входили: образец ДНК 1 мкл (с концентрацией ДНК 1мкг/мкл), 1 мкл 10х буфера для рестрикции, по 1 единице каждого фермента и 6 мкл НгО. Объем реакционной смеси составлял 10 мкл.

• Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК Электрофоретическое фракционирование фрагментов ДНК проводили в 1.5% агарозном геле, окрашенным раствором бромистого этидия 50 мкг/л с использованием ТБЕ-буфера при напряжении 50 V в течение 10 минут и при 120 V в течение 1 часа. В качестве маркера молекулярного веса использовали стандартный маркер «Gene Ruler™» с разрешением 100 п.н. (100 bp DNA Ladder «Fermentas»).

• Перенос ДНК на мембрану Гель помещали в денатурирующий буфер (0.5 M NaOH, 1.5М NaCl) на 20 минут на качалку, далее переносили на 20 минут в нейтрализующий буфер (0.5М трис HCl, 1.5М NaCl), после чего гель помещали в lOxSSC (87.75 г NaCl и 53.55 г цитрата Na). Мембрану «Hybond N» необходимого размера опускали два раза в кипяток и один раз в 10х SSC. Далее перенос осуществляли с помощью восходящего блоттинга [Маниатис и др.; 1984с]. На следующий день мембрану помещали в 4xSSC на 2-3 минуты и высушивали на фильтровальной бумаге. Затем мембрану сушили и «запекали» на трансиллюминаторе (УФ) и гибридизовали.

5 Секвениуование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей (GA ТА) ^последовательности Секвестрование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. б Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР).

• Подбор праймеров

Подбор праймеров и температурных режимов осуществляли с помощью компьютерной программы "Primer Select" ®1993-2000 DNASTAR Inc.

• Полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию проводили в объёме 20 мкл в смеси следующего состава: 20 нг ДНК матрицы, 1 х амплификационный буфер (Диалат), 25 мМ раствор dATP, 25 мМ раствор dCTP, 25 мМ раствор dGTP, 25 мМ раствор dTTP, 2 мМ MgCl2; 16 мМ прямого праймера, 16 мМ обратного праймера, 0,8 ед. Taq - полимеразы (Диалат). Амплификацию проводили на четырёхканальном ДНК-амплификаторе ТП4-ПЦР-01 - «Терцик» при следующих температурных режимах: денатурация 3 мин., 94°С; амплификация 30 циклов (денатурация: 94°С - 1 мин., отжиг: WHra°C- 40 сек., элонгация: 72°С - 40 сек.); элонгация 5 мин., 72°С.

• Подбор условий для ПИР

Подбор условий для ПЦР происходил путём постановки ПЦР-анализа с изменением температуры отжига и дальнейшей проверкой полученных амплифицированных фрагментов ДНК в блот-гибридизационном анализе.

7. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)

• Приготовление 8% ПААГ

Для приготовления 50 мл 8% ПААГ использовали 40% стоковый раствор акриламида с бис-акриламидом (соотношение акриламида и бис-акриламида - 29:1). К 10 мл стокового раствора добавляли 5 мл 10х TBE и 35 мл НгО. Раствор отфильтровали. Непосредственно перед заливкой в раствор добавляли 300 мкл 10%-ого (МЩ^гОв и 40 мл TEMED.

• Подготовка стекол.

Использовали 2 стекла размерами 20x20 см. Перед заливанием геля проводили силиконирование стекла с «ушами», т.е. натирали его 5 мл 4% раствора диметилдихлорсилана в четыреххлористом углероде, давали просохнуть и повторяли процедуру еще раз. Стекло без «ушей» обрабатывали раствором, состоящим из 20мл «Bind-Silane», 20мл ледяной уксусной кислоты и 5мл 96% спирта.

• Вертикальный электрофорез Стекла с ПААГ устанавливали в камеру для вертикального электрофореза, заполняли 1хТБЕ буфером верхнюю и нижнюю камеры и наносили образцы ПЦР-продуктов по 5-10 мкл. В качестве маркера молекулярного веса использовали стандартный маркер с разрешением 100 п.н. (100 bp+ DNA Ladder «Fermentas») и 50 п.н. (50 bp DNA Ladder «Amersham»).

Электрофорез проводили при напряжении 95 V в течение 16 часов. Затем гель окрашивали в растворе бромистого этидия. Визуализировали на трансиллюминаторе («Sigma») с фиксированием результата на фотоплёнку. Далее плёнку обрабатывали по стандартной методике.

8 Элюиия ДНК из агарозного геля на DEAE ватман Выделение ПЦР-продуктов ДНК из агарозного геля для последующего секвенирования проводили по следующей методике:

1. Вырезали кусочек DEAE-мембраны (Whatman DE81), несколько шире нужной полоски ДНК, на 1 миллиметр выше, чем гель. Делали в геле разрез до дна прямо перед нужной полосой и помещали в него кусочек мембраны

2. ДНК переносили в электрофорезной камере, пустив ток (контроль под УФ).

3. Мембрану с ДНК перенесли в эппендорф на 1,5 ml, добавили к ней 250 ml буфера NET (NaCl 1М, EDTA 10 mM, Tris-Cl 50 mM pH 8.0), инкубировали 30 минут на +65°С. Затем перенесли супернатант в другую пробирку, долили к экстрагированной бумажке еще 100 ц1 NET. Инкубировали на +65°С 10 минут. Объединили супернатанты. полноту элюции ДНК контролировали под УФ.

4. Осаждение элюированной ДНК проводили с помощью 2,5 объемов 96% этанола в течение ночи при температуре -20°С. Далее центрифугировали 15 минут при 15000 об/мин. Осадок промывали 75% этанолом, высушили +65° С и растворили в бидистиллированной воде.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Корчагин, Виталий Иванович

выводы

Впервые определена молекулярная структура 3-х микросателлитных (ОАТА)п-локусов (Ои323, Эи215 и Ш281) генома партеногенетических ящериц £>. итяехиаИз.

Показан внутривидовой полиморфизм партеновида £). итхехиаШ по этим микросателлитным локусам.

Установлено, что аллельные варианты локусов Би323, Эи215 и Эи281 отличаются числом повторов мономерного звена в микросателлитных кластерах и точковыми мутациями в прилежащих к микросателлиту последовательностях ДНК. Показано, что локусы гомологичные Би323, Ои215 и Ои281 представлены в геномах родительских видов О. па1гет\8 и Э. \alentini.

Показано, что родительские локусы гомологичные Би323, Эи215 и Эи281 в разной степени полиморфны и отличаются числом мономерных (ОАТА)п-повторов в микросателлитных кластерах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Корчагин, Виталий Иванович, 2004 год

1. Даревский И.С. Эволюция и экология иартеногенетического размножения у пресмыкающихся / В сб.: Современные проблемы теории эволюции. М.: "Наука". 1993. С. 89-109.

2. Джинчарадзе А.Г., Иванов П.Л., Рысков А.П. // ДАН СССР. 1987.295. №1, С. 360.

3. Коул Чарльз Дж. Однополые ящерицы.// В мире науки, 1984. №3. С. 50-57.

4. Куприянова Л.А. Генетическое разнообразие гибридных однополых видов и форм рода Lacerta (Lacertidae, Reptilia): его возможные цитогенетические механизмы, цитогенетика мейоза природных полиплоидных форм. // Цитология. 1999. Т.41. № 12. С. 1038-1047.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Методы генетической инженерии «Молекулярное клонирование». Москва, «Мир»; а стр. 163,400-401 b - стр. 125, 342 с -стр. 132 d - стр. 409-410.

6. Потапов С.Г., Токарская О.Н., Семенова С.К., Данилкин A.A., Марков Г.Г., Рысков А.П. Диагностические возможности мультилокусных маркеров ДНК в систематике диких копытных животных. // Генетика. 1997. Т. 33. №7. С. 961-966.

7. Рысков А.П., Кан Н.Г., Мартиросян И.А и др. Повышенная вариабельность (ТСС)П микросателлитных локусов в популяциях партеногенетического вида ящериц Lacerta unisexualis Darevsky. II Генетика. 2000. T. 36. № 11. С. 1501 1506.

8. Семенова С.К., Филенко A.JL, Васильев В.А. Использование полиморфных маркеров ДНК для дифференциации пород кур различного происхождения.// Генетика. 1996. Т. 32. №6. С. 266-273.

9. Сингер М, Берг П. Гены и Геномы. М.: "Мир". 1998. Т. 2. С.201 204.

10. Сиянова Е.Ю., Миркин С.М. Экспансия тринуклеотидных повторов.// Мол. Биол. 2001. Т. 35. №2. С. 208-223.

11. Токарская О.Н., Кан Н.Г., Петросян В.Г., и др. Вариабельность GATA-микросателлитных ДНК в популяциях партеногенетического вида ящериц Lacerta unisexualis Darevsky.il Генетика. 2000. Т. 36. № 5. С. 693 698.

12. Aharoni А., Baran N., Manor Н. Characterization of a multi-subunit human protein which selectively binds single stranded d (GA) n and d (GT) n sequence repeats in DNA.// Nucleic Acids Research. 1993. V. 21. P. 5221-5228.

13. Arcot S.S., Wang Z., Weber J., Deininger P., Batzer M. Alu repeats: a source of the genesis of primate microsatellites.// Genomics. 1995. V. 29. P. 136-144.

14. Areshchenkova Т., Ganal M.W. Long tomato microsatellites are predominantly associated with centromeric regions.// Genome. 1999. V. 42. P. 536-544.

15. Awadalla P., Ritland K. Microsatellite variation and evolution in the Mimulus guttatus species complex with contrasting mating systems.// Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. P. 1023-1034.

16. Bachtrog D., Weiss S., Zangerl В., Brem G., Schlotterer C. Distribution of dinucleotide microsatellites in the Drosophila melanogaster genome.// Molecular Biology and Evolutionary. 1999. V. 16. P. 602-610.

17. Baldi P., Basnee P-F Sequence analysis by additive scale: DNA structure for sequences and repeats of all lengths.// Bioinformatics. 2000. V.16. P. 865-889.

18. Beckmann J.S., Weber J.L.// Genomics. 1992. V. 12. P. 627-631.

19. Bell G.I. and Jurka J. The length distribution of perfect dimmer repetitive DNA is consistent with its evolution by an unbiased single-step mutation process.// J. Mol. Evol. 1997. V. 44. P. 414-421.

20. Bertoni F., Codegoni A.M., Furlan D., Tibiletti M.G., Capella C., Broggini M. CHK1 frameshift mutations in genetically unstable colorectal and endometrial cancers.// Genes Chromosomes Cancer. 1999. V. 26. P. 176-180.

21. Biet E., Sun J., Dutreix M. Conserved sequence preference in DNA binding among recombination proteins: an effect of ssDNA secondary structure.// Nucleic Acids Research. 1999. V. 27. P. 596-600.

22. Bois P., Willianson J., Brown J. et al. A novel unstable mouse VNTR family expanded from SINE B1 elements.// Genomics. 1998. V.49. P.122-128.

23. Botstain D., White R.L., Skolnick M., Davis R.V. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms// Amer. J. Hum. Genet., 1980. 32; P. 314331.

24. Boudjemadi K., Martin O., Simon J.C., Estoup A. Development and cross-species comparison of microsatellite markers in two lizard species, Lacerta vivipara and Podarcis muralis.ll Mol. Ecol. 1999. V. 8. P. 518-520.

25. Bowcock A.M., Linares A.R., Tomfhorde J., Minch E., Kidd J.R. and Cavalli-Sforza L.L. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites // Nature. 1994. 368. P. 455-457.

26. Brandes A., Thompson H., Dean C., Heslop-Harrison J.S. Multiple repetitive DNA sequences in the paracentromeric regions of Arabidosis thaliana L .// Chromosome Research.1997. 5,238-246.

27. Brinkmann B., Klintschar M., Neuhuber F., Huhne J., Rolf B. Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat.// Am. J. Hum. Genet.1998. V. 62. P. 1408-1415.

28. Brock G.J., Anderson N.H., Monckton D.G. Cis-acting modifiers of expanded CAG/CTG triplet repeat expandability: association with flanking GG content and proximity to CpG islands.// Human Molecular Genetics. 1999. V. 8. P. 1061-1067

29. Caligo M.A., Ghimenti C., Sensi E., Piras A., Rainaldi G. Microsatellite instability is co-selectable with gene amplification in a mammalian mutator phenotypes.// Anticancer Research.1999. V. 19. P. 1271-1275.

30. Cambareri E.B., Aisner R., Garbon J. Structure of the chromosome VII centromere region in Neurospora crassa: degenerate transposons and simple repeats.// Molecular and Cellular Biology. 1998. V. 18. P. 5465-5477.

31. Catasti P., Chen X., Mariappan S.V., Bradbury E.M., Gupta G. DNA repeats in the human genome.// Genetica. 1999. V. 106. P. 15-36.

32. Centola M., Carbon J. Cloning and characterization of centromereic DNA from Neurospora crassa.H Molecular and Cellular Biology. 1994. V. 14. P. 1510-1519.

33. Chacraborty R., Kimmel M., Stivers D.N., Davison L.J. Deka R. Relative mutation rates at di-, tri- and tetranucleotide microsatellite loci.// Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. V. 94 P. 10411046.

34. Chambers G.K., MacAvoy E.S. Microsatellites: consensus and controversy.// Comparative Biochemistry and Physiology. 2000. B126. P. 455-476.

35. Charlesworth B., Sniegowski P., Stephan W. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes.// Nature. 1994. V. 371. P. 215-220.

36. Chen X., Mariappan S.V., Catasti P. et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 5199-5203.

37. Chen Y., Roxby R. Identification of a functional CT-element in the Phytophthora infestans piyptl gene promoter.//Gene. 1997. V. 198. P. 159-164.

38. Chou S.-H., Zhu L. and Reid B.R. //J. Mol. Biol. 1996. V. 259. P. 445-457.

39. Codegoni A.M., Bertoni F., Collela G. et al. Microsatellite instability and frameshift mutations in genes involved in cell cycle progression or apoptosis in ovarian cancer.// Oncology Research. 1999. V. 11. P. 297-301.

40. Cognetti C. Citogenetica della parthenogenesis negli ofidi. // Acho. Zool. Ital. 1961. V. 46. P. 89 122.

41. Cole C.J., Dessauer H.C., Barrowclough G.F. Hybrid origin of a unisexual species of whiptail lizard, Cnemidophorus neomexicanus, in Western North America: new evidence and a review. // Amer Mus Novitat.1988. V.2905. P. 1-38.

42. Collick A., Dunn M.G., Jeffreys A.J. Minisatellite binding protein Msbp-1 is a sequence-specific single-stranded DNA-binding protein.// Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 6399 6404.

43. Colson I., Goldstein D.B. Evidence for complex mutations at microsatellite loci in Drosophila.//Genetics. 1999. V.152. P.617-627.

44. Csink A.K., Henikoff S. Something from nothing: the evolution and utility of satellite repeats.//Trends in Genetics. 1998. V. 14. P. 200-204.

45. Cuadrado A., Schwarzacher T. The chromosomal organization of simple sequence repeats in wheat and rye genomes.// Chromosoma. 1998. V. 107. P. 587-594.

46. Dawley R.M. An introduction to unisexual vertebrates. // In: Dawley R.M., Bogart J.P. (eds.) Evolution and ecology of unisexual vertebrates. Bull New York State Museum (Albany. N.Y.). 1989.V. 466. P. 1-18.

47. Deka R., Jin L., Shriver M.D., Yu L.M., Decroo S., Hundrieser J., Bunker C.H., Ferrell R.E. and Chakraborty R. Population genetics of dinucleotide (dC-dA)n-(dG-dT)n polymorphisms in world populations.// Am. J. Hum. Genet. 1995. V. 56. P. 461-474.

48. Di Rienzo A., Peterson A.C., Garza J.C. et al. Mutational processes of simple sequence repeat loci in human populations.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.3166-3170.

49. Djian P. Evolution of simple repeats in DNA and their relation to human disease // Cell. 1998. V. 94. P. 155-160.

50. Donnellan S.C., Moritz C. Genetic diversity of bisexual and parthenogenetic populations of the tropical gecko Nactus pelagicus (Lacertilia: Gekkonidae).// Herpetologica. 1995. V. 51. P. 140-154.

51. Dutreix M. (GT)n repetitive tracts affect several stages of RecA-promoted recombination.// Journal of Molecular Biology. 1997. V. 273. P. 105-113.

52. Eichler E.E. Repetitive conundrums of centromere structure and function.// Human Molecular Genetics. 1999. V. 8. P. 151-155.

53. Eisen J.A. Mechanistic basis for microsatellite instability.// In: Microsatellites: Evolution and Applications (eds. Goldstein DB, Schlotterer C). 1999. P. 34-48. Oxford University Press, Oxford.

54. Elder J.F., and Schlosser I. Jr. Extreme clonal uniformity of Proxinus eos/ neogaeus gynogens (Pisces: Cyprinidae) among variable habitants in northern Minnesota beaver ponds// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 5001 5005.

55. Ellegren H. Microsatellite mutations in germline: implications for evolutionary inference.// Trends in Genetic. 2000. V. 16. P. 551-558.

56. Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution.// Genetics. 2004. V. 5. P. 435-445.

57. Ellegren H. Polymerase-chain-reaction (PCR) analysis of microsatellites — a new approach to studies of genetic relationships in birds.// AUK. 1992. V. 109. P. 886-895.

58. Ellegren H., Lindgren G., Primmer C.R. and Meller A.P. Fitness loss and germline mutations in barn swallows breeding in Chernobyl.// Nature. 1997. V. 389. P. 593-596.

59. Epplen J.T. On simple repeated GATA/GACA sequences in animal genomes: critical reappraisal.//Journal of Heredity. 1988. V. 7. P. 409-417.

60. Estoup A., Solignac M., Harry M., Cornuet J-M. Characterization of (GT)n and (CT)n microsatellites in two insect species: Apis mellifera and Bombus terrestris.// Nucl. Acid. Res. 1993. V. 21. N. 6. P. 1427-1431.

61. Fabregat I., Koch K.S., Aoki T. et al. Functional pleiotropy of an intramolecular triplex-forming fragment from the 3-UTR of the rat Pigr gene.// Physiological Genemics. 2001. V. 5. P. 53-65.

62. Field D., Wills C. Long, polymorphic microsatellite in simple organisms.// Proceedings of Royal Society of London B Biological Sciences. 1996. V. 263. P. 209-215.

63. Fu J., MacCulloch R.D, Murphy R.W., et al. The parthenogenetic Rock Lizard Lacerta unisexualis: An Example of Limited Genetic Polymorphism. // J. Mol. Evol.1998. V. 46. P. 127 -130.

64. Gacy A.M., Goellner G., Juranic N. et al.//Cell. 1995. V. 81. P. 533-540.

65. Gebhardt F., Burger H., Brandt B. Modulation of EGFR gene transcription by a polymorphic repetitive sequence — a link between genetics and epigenetics. International Journal of Biological Markers. 2000. V. 15. P. 105-110.

66. Gebhardt F., Zanker K.S., Brandt B. Modulation of epidermal growth factor receptor gene transcription by a polymorphic dinucleotide repeat in intron 1.// Journal of Biological Chemistry. 1999. V. 274. P. 13176-13180.

67. Gendrel C.G., Boulet A., Dutreix M. (CA/GT)n micro satellites affect homologous recombination during yeast meiosis.// Genes & Development. 2000. V. 14. P. 1261-1268.

68. Gibbs M., Collick A., Kelly R.G., Jeffreys A.J. A tetranucleotide repeat mouse minisatellite displaying substantial somatic instability during early preimplantation development.//Genomics. 1993. V. 17. P. 121 128.

69. Gibert N. And Labuda D. Core SINEs: Eukaryotic short interspersed retroposing elements with common sequence motifs.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 2869 - 2874.

70. Gilbert D.A., Pacer C., Pusey A.E., Stephens J.C., and O'Brien S.J. Analitical DNA Fingerprinting in Lions: Parentage, Genetic Diversity, and Kinship.// Journal of Heredity. 1991. V. 82. P. 378-386.

71. Goldstein D.B. and Pollock D.D. Launching microsatellites: a review of mutation processes and methods of phylogenetic inference.// Journal of Heredity. 1997. V.88. P.335-342.

72. Grady D.L., Ratliff R.L., McCanlies E.C., Meyne J. and Moyzis R.C. //Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1695-1699.

73. Gullberg A., Tegelstrom H., Olsson M. Microsatellites in the Sand Lizard (Lacerta agilis): description, variation, inheritance and applicability.// Biochem. Genetics. 1997. V. 35. Nos 7/8. P. 281-295.

74. Hancock J.M. Microsatellites and other simple sequences: genomic context and mutational mechanisms.// In: Microsatellites: Evolution and Applications (eds Goldstein DB, Schlotterer C). 1999. P. 1-9. Oxford University Press, Oxford.

75. Hill W.G. DNA fingerprints applied to animal and bird population // Nature. 1987. V.327; P. 98-99

76. Hoffman E.K., Trusko S.P., Murphy M., George D.L. An SI nuclease-sensitive homopurine/homopyrimidine domain in the c-KI-ras promoter interacts with a nuclear factor.// Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1990. V. 87. P. 2705-2709.

77. Jakupciak J.P., Wells R.D. Gene conversion (recombination) mediates expansions of CTG/CAG repeats.// Journal of Biological Chemistry. 2000. V. 275. P. 4003-4013.

78. Janzen M.A., Buoen L.B., Zhao F., Louis C.F. Characterization of a swine chromosome-specific centromeric higher-order repeat.// Mammal Genome. 1999. V. 10. P. 579-584.

79. Jeffreys A.J, Bois Ph., Buard J. et al. Spontaneous and induced minisatellite instability.// Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 1501-1511.

80. Jeffreys A.J. // Biochem. Soc. Trans. 1987. V.15. P.309.

81. Jeffreys A.J., Allen M.J., Armour J.A., et al. Mutation processes at human minisatellites// Electrophoresis. 1995. V. 16. P. 1577- 1585.

82. Jeffreys A.J., Murray J., Neumann R. High-resolution mapping of crossovers in human sperm defines a minisatellite-associated recombination hotspot.// Molecular Cell. 1998. V. 2. P. 267-273.

83. Jeffreys A.J., Royle N.J., Wilson V., Wong Z. Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandem-repetitive hypervariable loci in human DNA.// Nature. 1988. V. 322. P. 278281.

84. Jeffreys A.J., Wilson V., Tein S.L. Hypervariable minisatellite regions in human DNA // Nature. 1985. V. 314. P.67-73.

85. Karlin S., Campbell A.M., Mrazek J. Comparative DNA analysis across diverse genomes.// Annual Review of Genetics. 1998. V. 32. P. 185-225.

86. Kelly R.G. Similar origins of two mouse minisatellites within transposon-like LTRs.// Genomics. 1994. V. 24. P. 509 515.

87. Kordis D. and Gubensek F. Unusual horizontal transfer of a long interspersed nuclear element between distant vertebrate classes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 1070410709.

88. Korol A.B., Preygel I.A., Preygel S.I. Recombination Variability and Evolution.// Chapman & Hall. 1994. London.

89. Krayev A.S., Markusheva T.V., Kramerov D.A., Ryskov A.P., Skryabin K.G., Bayev A.A., Georgiev G.P. Ubiquitous transposon-like repeats B1 and B2 of the mouse genome: B2 sequencing.// Nucl. Acid. Res. 1982. V. 10. N. 23.

90. Kruglyak S., Durrett R.T., Schug M.D. and Aquadro C.F. Equilibrium distributions of microsatellite repeat length resulting from a balance between slippage events and point mutations.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 10774-10778.

91. Lafyatis R., Denhez F., Williams T., Sporn M., Roberts A. Sequence specific protein binding to and activation of the TGF-beta3 promoter through a repeated TCCC motif.// Nucleic Acids Research. 1991. V. 19. P. 6419-6425.

92. Lang J.W., Addarwal R.K., Majumdar K.C., Singh L. individualization and estimation of relatedness in crocodilians by DNA fingerprinting with a Bkm-derived probe.// Mol. Gen. Genet. 1993. V. 238. P.49-58.

93. Lisowska K., Loch T, Fiszer-Kierzkowska A., Scieglinska D., Krawczyk A. Identification of a microsatellite region composed of a long homopurine/homopyrimidine tract surrounded by

94. AT-rich sequences upstream of the rat stress-inducible hsp 70.1 gene.// Acta Biochimica Polonica. 1997. V. 44. P. 147-152.

95. Liu L., Dybvig K., Panangala V.S., van Santen V.L., French C.T. GAA trinucleotide repeat region regulates M9/pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticumJi Infection and Immunity. 2000. V. 68. P. 871-876.

96. Liu Z., Tan G., Li P., Dunham R.A. Transcribed dinucleotide microsatellites and their associated genes from channel catfish Ictalurus punctatus.il Biochemical and Biophysical Research Communication. 1999. V. 259. P. 190 -194.

97. Lue N.L., Buchman A.R., Kornberg R.D. Activation of yeast RNA polymerase II transcription by a thymidine-rich upstream element in vitro.H Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1989. V. 86. P. 486-490.

98. MacCulloch R.D., Murphy R.W., Kupriyanova L.A., Darevsky I.S. The Caucasian rock lizard Lacerta rostombekovi: a monoclonal parthenogenetic vertebrate. // Biochem System. Ecology. 1997. V. 25. №1. P. 33 37.

99. MacCulloch R.D., Murphy R.W., Kupriyanova L.A., et al. Clonal variation in the parthenogenetic rock lizard Lacerta armeniaca.il Genome. 1995. V.38. P. 1057- 1060.

100. Mahtani M.M. and Willard H.F. A polymorphic X-linked tetranucleotide repeat locus displaying a high rate of new mutation: implications for mechanisms of mutation at short tandem repeat loci.// Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. P. 431-437.

101. Majewski J., Ott J. GT repeats are associated with recombination on human chromosome 22.// Genome Research. 2000. V. 10. P. 1108-1114.

102. Manor H., Sridhara Rao B. and Martin R.G. // J. Mol. Evol. 1988. V. 27. P. 96-101.

103. Meeting Societas European Herpetologica (SEH), 12-16 August 2003, Sait-Petersburg, Russia. P. 106.

104. Mathew C.G.P. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA.; Methods in Molecular Biolog / Ed.Walker J.M.N.Y.; Humana press. 1984. V. 2. P. 31-34.

105. Metzgar D., Bytof J., Wills C. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA. // Genome Research. 2000. V. 10. P. 72-80.

106. Miret J.J., Pessoa-Brandao L., Lahue R.S. Orientation-dependent and sequence-specific expansions of CTG/CAG trinucleotide repeats in Saccharomyces cerevisiae.il Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1998. V. 95. P. 12438-12444.

107. Moncton D.G., Coolbaugh M.I. Ashizawa K.T. Siciliano M.J. Caskey C.T. Hypermutable myotonic dystrophy CTG repeats in transgenic mice.// Nature Genetics. 1997. V. 15. P. 193 — 196.

108. Moore H., Greenwell P.W., Liu C.P., Arnheim N., Petes T.D. Triplet repeats form secondary structures that escape DNA repair in yeast.// Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1999. V. 96. P. 1504-1509.

109. Moritz C., Donnelan S., Adams M., Baverstock P.R. The origin and evolution of parthenogenesis in Heteronotia binoei (Gekkonidae): extensive genotypic diversity among parthenogens. //Evolution. 1989. V.43. P.994-1003.

110. Moritz C., Uzzel T., Spolsky C., Hotz H., Darevsky I.S., Kupriyanova L.A., Danielyan F. The maternal ancestry and approximate age of parthenogenetic species of Caucasian rock lizards (Lacerta: Lacertidae). // Genetica, 1992, Vol. 87, P. 53-62.

111. Murphy R.W., Darevsky I.S., MacCulloch R.D., et al. Olde age, multiple formations or genetic plasticity, Clonal diversity in the uniparental Caucasian rock lizard, Lacerta dahli.// Genetica. 1997. V. 101. P. 125 130.

112. Murphy T.D., Karpen G.H. Localization of centromere function in a Drosophila minichromosome.// Cell. 1995. V. 82. P. 599-609.

113. Nadir E., Hargalit H., Gallily T., Ben-Sasson S.A. Microsatellite spreading in the human genome: Evolutionary mechanisms and structural implications.// Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1996. V. 93. P. 6470-6475.

114. Nakamura Y. et al.// Science. 1987. V. 235. P. 1616-1622. 1

115. Neff B., Gross M. Microsatellite evolution in vertebrates: inference from AC dinucleotide repeats.// Evolution. 2001. V. 55. № 9. p. 1717-1733.

116. Ogiwara I., Miya M., Ohshima K., and Okada N. Retropositional parasitism of SINEs on LINEs: Identification of SINEs and LINEs in Elasmobranches.// Mol. Biol. Evol. 1999. 16(9). P. 1238-1250.

117. Orti G., Pearse D.E., Avise J.C. Phylogenetic assessment of length variation at microsatellite locus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 10745-10749.

118. Palsboll P.J. et al. Multiple levels of single-strand slippage at cetacean tri- and tetranucleotide repeat microsatellite loci.// Genetics. 1999. V. 151. P. 285-296.

119. Parker E.D. Phenotypic consequences of parthenogenesis in Cnemidophorus lizards. Invariability in parthenogenetic and sexual populations.//Evolution. 1979.V.33.P.1150-1166.

120. Pearson C.E., Sinden R.R. Alternative structures in duplex DNA formed within the trinucleotide repeats of the myotonic dystrophy and fragile X loci.// Biochemistry. 1996. V. 35. P. 5041-5053.

121. Primmer C.R., Ellegren H. Patterns of molecular evolution in avian microsatellites.// Mol. Biol. Evol. 1998. V. 15. P. 997-1008.

122. Primmer C.R., Moller A.P., Ellegren H. Resolving genetic relationships with microsatellite markers: a parentage testing system for the swallow Hirundo rustica.ll Mol. Ecol. 1995. V. 4. P. 493-498.

123. Primmer C.R., Raudsepp T., Chowdhary B.P., Moller A.P. and Ellegren H. Low frequency of microsatellites in the avian genome.// Genome Res. 1997. V. 7. P. 471-482.

124. Punt P.J., Dingemanse M.A., Kuyvenhoven A. et al. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene coding glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase.// Gene. 1990. V. 93. P. 101-109.

125. Richard G.F., Paques F. Mini- and microsatellite expansions: the recombination connection.// EMBO Reports. 2000. V. 11. P. 122-126.

126. Rubinsztein D.C., Leggo J., Coetzee G.A. et al. Sequence variation and size ranges of CAG repeats in the Machado-Joseph disease, spinocerebellar ataxia type 1 and androgen receptor genes.// Hum. Mol. Genetics. 1995. V. 4. P. 1585-1590.

127. Ryskov A.P., Jincharadze A.G., Prosniak M.I., Ivanov P.L., Limborska S.A.// FEBS Lett. 1988. V. 233. №2. P 388. V

128. Sandaltzopoulos R., Mitchelmore C., Bonte E., Wall G., Decker P.B. Dual regulation of the Drosophila hsp26 promoter in vitro.// Nucleic Acids Research. 1995. V. 23. P. 2479-2487.

129. Schafer R., Zischler H., Epplen J.T. // Nucl. Acid Res. 1988. V.16. №11. P.5196.

130. Schlotterer C. and Tautz D. Slippage syntesis of simple sequences DNA.// Nucl. Acid. Res. 1992. V. 20. P. 211-215.

131. Schlotterer C., Wiehe T. Micro satellites, a neutral marker to infer selective sweeps. In: Microsatellites: Evolution and Applications (eds. Goldstein D.B., Schlotterer C.). Oxford University Press. 1999. P. 238-247.

132. Schlotterer C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA.// Chromosoma. 2000. V. 109. P. 365-371.

133. Schmidt T., Heslop-Harrison J.S. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet.// Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1996. V. 93. P. 87618765.

134. Schug M.D., Regulski E.E., Pearce A., Smith S.G. Isolation and characterization of dinucleotide repeat microsatellites in Drosophila ananassae.U Genet. Res. 2004. V 83. P. 19-29.

135. Schug M.D., Wetterstrand K.A., Gaudette M.S. et at. The distribution and frequency of microsatellite loci in Drosophila melanogaster.H Molecular Ecology. 1998. V. 7. P. 57-70.

136. Shimoda N. et al. Zebrafish genetic map with 2000 microsatellite markers.// Genomics. 1999. V. 58. P. 219-232.

137. Southern E. // Method Enzymol. 1975. V. 69. P.152.

138. Spruell P. And Thorgaard G.H. Sine sequences detect DNA fingerprints in salmonid fishes.// Heredity. 1996. V. 17. P. 317-324.

139. Stailings R.L., Ford A.F., Nelson D., Torney D.C., Hildebrand C.E., Moyzis R.K. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes.// Genomics. 1991. V. 10. P. 807-815.

140. Strand M., Prolla T.A., Liskay R.M., Petes T.D. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair.// Nature. 1993. V. 365. P. 274-276.

141. Su X.Z., and Willems T.E. Toward a high-resolution Plasmodium falciparum linkage map polymorphic markers from hundreds of simple sequence repeats.// Genomics. 1996. V. 33. P. 431-444.

142. Tachida H., Iizuka M. Persistence of repeated sequences that evolve by replication slippage// Genetics. 1992. V. 131. P. 471-478.

143. Templeton A.R., Clark A.G., Weiss K.M., Nickerson D.A., Boerwinkle E., Sing C.F. Recombinational and mutational hot spots within the human lipoprotein lipase gene.// American Journal of Human Genetics. 2000. V. 66. P. 69-83.

144. Thein S.L., Wallace R.B., in Davies K.E. (ed) // Human Genetic Diesis: A Practical Approach.; IRL Press, Oxford. 1986. P.33-50.

145. Tokarskaya O.N., Pertosyan V.G., Kashentseva T., Panchenko V.G., Ryskov A.P. // Electrophoresis. 1995. V. 16. P. 1766-1770.

146. Toth G., Gaspari Z., Jurka J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis.// Genome Research. 2000. V. 10. P. 967-981.

147. Treco D., Arnheim N. The evolutionary conserved repetitive sequence d(TG/AC)n promotes reciprocal exchange and generates unusual recombinant tetrads during yeast meiosis.// Molecular and Cellular Biology. 1986. V. 6. P. 3934-3947.

148. Turner B.J., Elder J.F., Laughlin T.H., and Davis W.P. Genetic variation in clonal vertebrates detected by simple sequence DNA fingerprinting// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 5653 5657. Evolution

149. Umino T, Arai K, Maeda K, et al. Natural clones detected by multilocus DNA fingerprinting in gynogenetic triploid ginbuna Carassius langsdorfii in the Kurose River, Hiroshima. // Fish Sci. 1997. V. 63 P.147-148.

150. Usdin K.// Nucleic Acids Research. 1998. V. 26. P. 4078-4085.

151. Valdes A.M., Slatkin M., Freimer N.B. Allele frequencies at microsatellite loci: the stepwise mutation model revisited.// Genetics. 1993. V.133. P.737-749.

152. Van Den Bussche R. A., Longmire J.L., Baker R.J. How bats achieve a small C-value: frequency of repetitive DNA in Macrotus.// Mamm. Genome. 1995. V. 6. P. 521-525.

153. Vassart G., Georgies M., Monsieur R., Brocas H., Lequarre A.S., Christophe D. A Sequences in M13 Phage Detects Hypervariable Minisatellites in Human and Animal DNA.// Science. 1987. V. 235. P. 683-684.

154. Vilkki S., Loukola A., Poyhonen M., Vierimaa O., Herva R., Aaltonen L.A., Shibata D. Extensive somatic microsatellite mutations in normal human tissue.// Cancer Research. 2001. V. 61. P. 4541-4544.

155. Vorlickova M., Kejenovska I., Kovanda J., Kyrp J. Dimerization of the guanine-adenine repeat strands of DNA.// Nucleic Acid^Res. 1999. V. 27. P. 581-586.

156. Vorlickova M., Kejnovska L, Kovanda J. and Kypr J. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1509-1514.

157. Wahls W.P., Moore P.D. Homologous recombination enhancement conferred by the Z-DNA motif d(TG)3o is abrogated by simian virus 40 T antigen binding to adjacent DNA sequences.// Molecular and Cellular Biology. 1990. V. 10. P. 794-800.

158. Wahls D.P. Swenson G., Moore P.D. Two hypervariable minisatellite DNA binding proteins.// Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 3269 3274.

159. Wahls W.P., Moore P.D. Relative frequencies of homologous recombination between plasmids introduced into DNA repair-deficient and other mammalian somatic cell lines.// Somatic Cell and Molecular Genetics. 1990. V. 16. P. 321-329.

160. Wang Z., Weber J.L., Zhong G., Tanksley S.D. Survey of plant short tandem DNA repeats.// Theoretical and Applied Genetics. 1994. V. 88. P. 1-6.

161. Weber JL, Wong C. Mutation of human short tandem repeats. //Hum Mol Gen. 1993. V.2. P. 1123-1128.

162. Wells R.D. Molecular basis of genetic instability of triplet repeats. //J. Biol. Chem. 1996. V. 271. №6. P. 2875-2878.

163. Wierdl M., Dominska M., Petes T.D. Microsatellite instability in yeast: dependence on length of the microsatellite.// Genetics. 1997. V. 146. P. 769-779.

164. Wintero A.K., Fredholm M., Thomsen P.D.// Genomics. 1992. V. 12. P. 281-288.

165. Wong Z., Wilson V., Jeffreys A.J., Thein S.L. // Nucl. Acids Res. 1986. V.14. P.4605.

166. Wren J.D., Forgacs E., Fondon J.W. et al. Repeat polymorphisms within gene regions: Phenotypic and evolutionary implications.// American Journal of Human Genetics. 2000. V. 67. P. 345-356.i /

167. Wyman A., White R. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P.6474.

168. Xin Xu, Mei Peng, Zhian Fang, Xiping Xu The direction of microsatellite mutations is depend upon allele length.// Nature Genetics. 2000. V. 24. P. 396-399.

169. Xu G., Goodridge A.G. A CT repeat in the promoter of the chicken malic enzyme gene is essential for function at an alternative transcription start site.// Archives of Biochemistry and Biophysics. 1998. V. 358. P. 83-91.

170. Yamazaki H., Nomoto S., Mishima Y., Kominami R. A 35-kDa protein binding to a cytosine-rich strand of hypervariable minisatellite UNA.// J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 12311 -12316.

171. Yandava C.N., Gastier J.M., Pulido J.C., Brody T., Val Sheffield, Murray J. et al. Characterization of Alu repeats that are associated with trinucleotide and tetranucleotide repeat microsatellites.// Genome Research. 1997. V. 7. N. 7. P. 716-724.

172. Zheng M., Huang X., Smith G.K., Yang X., Gao X. Genetically unstable CXG repeats are structurally dynamic and have a high propensity for folding. An NMR and UV spectroscopic study.// Journal of Molecular Biology. 1996. V. 264. P. 323-336.