Модифицированные полимерные наногели: синтез, свойства и применение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Нуколова, Наталия Владимировна

• Нуколова, Наталия Владимировна
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Нуколова, Наталия Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Синтез наногелей

1.1.1. Наногели с нековалентными сшивками

1.1.2. Наногели с ковалентными сшивками

1.2. Физико-химические свойства наногелей

1.3. Наногели как полимерные системы доставки лекарств

1.3.1. Введение БАВ в наногели

1.3.2. Контролируемое высвобождение БАВ из наногелей

1.4. Химическая модификация наногелей. Введение векторных 26 групп

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Реагенты и растворители

2.1.2. Блок-сополимеры этиленглиголя и метакриловой кислоты

2.1.3. Использованные клеточные культуры

2.1.4. Испытания на животных

2.2. Синтез полимерных наногелей и их модификация

2.2.1. Общая методика синтеза полимерных наногелей

2.2.2. Синтез флуоресцентно-меченых наногелей

2.2.3. Модификация наногелей векторными группами

2.2.3.1. Фолат-модифицированные наногели (ФК-наногель)

2.2.3.2. Наногели, модифицированные моноклональными 39 антителами или их фрагментами

2.2.4. Введение БАВ в наногели

2.2.4.1. Цисплатин-нагруженный наногель (наногель/CDDP)

2.2.4.2. Доксорубицин-нагруженный наногель (наногель/DOX)

2.2.5. Контролируемое высвобождение БАВ из наногелей

2.3. Физико-химические методы исследования

2.4. Исследования на клеточных культурах (in vitro эксперименты)

2.5. Исследования на животных (in vivo эксперименты)

2.5.1. Противораковая активность CDDP/наногелей

2.5.2. Визуализация раковых опухолей in vivo

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Синтез и физико-химические свойства полимерных наногелей

3.1.1. Синтез полимерных наногелей на основе 53 блок-иономерных комплексов

3.1.2. Физико-химические характеристики наногелей

3.2. Фолат-модифицированные наногели с введенными БАВ

3.2.1. Синтез ФК-наногелей

3.2.2. Морфология и набухание ФК-наногелей

3.2.3. Специфичность связывания ФК-наногелей с их мишенью

3.2.4. Введение БАВ в наногели

3.2.5. Высвобождение БАВ из наногелей

3.3. Наногели, модифицированные белками 82 (моноклональные антитела)

3.3.1. Модификация наногелей антителами или их фрагментами

3.3.2. Анализ mAb-наногелей и их физико-химические свойства

3.3.3. Специфичность связывания mAb-наногелей с их мишенью

3.4. Практическое применение разработанных наногелей в медицине

3.4.1. Применение ФК-наногелей с введенными противораковыми 93 препаратами

3.4.1.1. Исследования на клеточных культурах (ш vitro эксперименты)

3.4.1.2. Исследования противоопухолевой активности нагруженных 106 лекарством ФК-наногелей на мышах (in vivo эксперименты)

3.4.2. Флуоресцентно-меченые СС49-наногели для диагностики рака 110 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 112 ВЫВОДЫ 115 БЛАГОДАРНОСТИ 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACM атомно-силовая микроскопия

БАВ биологически активные вещества

БИК блок-иономерный комплекс

БПМ бычий подчелюстной муцин

БСА бычий сывороточный альбумин

ДВС дивинилсульфон

Дэфф гидродинамический диаметр

ДРС динамическое рассеяние света

ИСП-МС масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой

КДИ карбодиимид

МАЛ малеимидная группа наногель/CDD цисплатин-нагруженный наногель наногель/DOX доксорубицин-нагруженный наногель

ПАВ поверхностно-активное вещество

ПМАК полиметакриловая кислота

ППР поверхностно плазмонный резонанс

ПЭГ полиэтиленгликоль

ПЭГ-о-ПМАК блок-сополимер этиленгликоля и метакриловой кислоты

ПЭИ полиэтиленимин

РЭС ретикулоэндотелиальная система

СДЛ система доставки лекарств

ФИТЦ флуоресцеин изотиоцианат

ФК фолиевая кислота

ФК-наногель фолат-модифицированный наногель

ФР ф о латный рецептор

ФР-а фолатный рецептор а-изоформы

ФСБ фолат-связывающий белок

Н-ЯМР протонный ядерный магнитный резонанс

ABS ацетатно-солевой буферный раствор

CDDP цисплатин

DOX доксорубицин

Fab фрагменты моноклональных антител

РаЬ-наногель наногель, модифицированный фрагментами тАЬ иммуноглобулин О тАЬ моноклональные антитела тАЬ-наногель наногель, модифицированный моноклональными антителами тАЬ-ПЭГ-Ж12 ПЭГилированные антитела

N48 М-гидроксисукцинимид

РВ8 фосфатный буфер

5/<Я> относительная ширина распределения частиц по размерам

БОЭ-РАОЕ электрофорез в полиакриламидном геле

ББ среднеквадратичное отклонение

БЕМ стандартная ошибка среднего

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модифицированные полимерные наногели: синтез, свойства и применение»

Наногели представляют собой уникальный класс наноразмерных гидрогелей, основанных на гидрофильной или амфифильной полимерной сетке, которая стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей. В настоящее время наногели интенсивно исследуются и внедряются во многие области производственной деятельности человека благодаря способности обратимо откликаться на небольшие внешние воздействия« (температура, ионная сила, рН, электрическое поле и др.), а также включать в свой объем и контролируемо высвобождать различные биологически активные вещества (БАВ).

В последние годы гидрогели микро- и наноразмеров привлекают все большее внимаиие в качестве основы для создания систем доставки лекарств (СДЛ) в определенные органы. Наногели способны абсорбировать большое количество воды (до 95% в/в), тем самым, содействуя включению в свой объем различных молекул (РНК, ДНК, олигонуклеотиды, низкомолекулярные терапевтические и диагностические агенты), которые нестабильны, быстро выводятся из организма или характеризуются высокой системной токсичностью. Наногели позволяют конструировать СДЛ с контролируемым «спусковым- механизмом» высвобождения лекарств из наноконтейнера в ответ на изменения окружающей среды. Кроме того, наногели могут быть модифицированы различными векторными группами, которые способствуют избирательной направленной доставке БАВ в определенные органы или клетки-мишени.

Наногели - это интенсивно развивающийся, относительно новый класс наноматериалов (первый обзор вышел в 2002 [1]). Поэтому многие физико-химические свойства наногелей еще практически не изучены, в литературе мало работ по введению направляющих векторных групп в наногели, до сих пор нет успешных попыток использования наногелей для адресной доставки лекарственных препаратов in vivo.

Данная диссертационная работа посвящена синтезу сложных полимерных наногелей, которые способны включать и контролируемо высвобождать биологически активные вещества, созданию принципиально новых подходов для модификации этих сложных полимерных систем различными векторными группами (низкомолекулярные соединения или белки) с сохранением их биологической активности. Всесторонний анализ физико-химических особенностей таких наногелей в водных средах является важным этапом для создания новых систем доставки лекарств с контролируемым дозированием на их основе. Результаты этого исследования имеют принципиальное значение для развития этого нового класса наноматериалов и создают базис для разработки функциональных систем для направленной доставки терапевтических и диагностических молекул в раковые опухоли на основе наногелей.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Наногели представляют собой набухшую пространственную структурную сеть полимеров, которая способна сохранять форму и стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей (ковалентные сшивки). Дисперсионная стабильность наногелей зависит от комбинации многих факторов, например, химической природы полимеров, качества растворителя, степени сшивкши других. В настоящее время микро- и наногели интенсивно исследуются и внедряются во многие области производственной деятельности человека (оптоэлектроника, системы доставки лекарств (СДЛ) с контролируемым дозированием, диагностика заболеваний). Представленный обзор литературы посвящен основным подходам синтеза микро/наногелей, их физико-химическим характеристикам и возможности использования в качестве наноконтейнеров для адресной доставки лекарственных и диагностических препаратов.

1.1. Синтез наногелей

Методы синтеза наногелей можно разделить на два основных класса, а именно: 1) самоорганизация полимерных цепей и их стабилизация за счет физических нековалентных связей или 2) введение химических ковалентных сшивок. Первые работы по синтезу наногелей с нековалентными связями были выполнены в научной группе под руководством J. Sunamoto на основе холестерин-модифицированных полисахаридов [2]. Наногели, имеющие химические ковалентные сшивки, впервые были получены в группе A.B. Кабанова [3]. Эти наногели были синтезированы на основе блок-сополимера полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полиэтиленимина (ПЭИ) (ПЭГ-б-ПЭИ) для доставки олигонуклеотидов. Стоит отметить, что понятие «наногель» включает в себя широкий спектр наноразмерных частиц, основанных на полимерной сетке, которая способной набухать и изменять физико-химические характеристики в ответ на небольшие изменения в окружающей среде.

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Нуколова, Наталия Владимировна

выводы

1. Впервые синтезированы и всесторонне изучены полимерные ковалентно сшитые наногели, которые способны включать молекулы БАВ и нести различные векторные группы. Показано влияние природы комплексообразующих ионов металла и относительного соотношения анионного и неионогенного блоков в блок-сополимере ПЭГ-б-ПМАК на формирование блок-иономерных комплексов, которые являются исходными материалами для синтеза таких наногелей.

2. Показана принципиальная возможность контроля дисперсионной стабильности, размера и ^-потенциала наногелей и их производных посредством изменения плотности сшивки, степени модификации векторными группами и количества введенного лекарства. Установлено влияние изменения рН и ионной силы раствора на набухание таких наногелей и их производных.

3. Разработаны химические методы, позволяющие контролировать модификацию наногелей различными химическими группами (фолиевая кислота (ФК), антитела) с сохранением способности этих групп к специфическому связыванию с их мишенями (фолатный рецептор, антиген).

4. Впервые осуществлен синтез фолат-модифицированных наногелей с введенными молекулами БАВ (цисплатин, доксорубицин). Установлено, что количество ФК-векторов влияет на способность наногелей эффективно связывать и удерживать БАВ в своем объеме. Проведена оптимизация числа групп ФК (0.2 мкмоль ФК/мг полимера) с целью увеличения введения БАВ в наногели и достижения их стабильности в физиологических средах.

5. Впервые показана возможность одновременного использования цисплатина и ФК-векторов в одной системе для адресной доставки лекарства в опухоли. С помощью экспериментов in vitro и in vivo установлено, что ФК-наногели, разработанные в настоящей работе, улучшают активность и снижают токсичность цисплатина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Прежде всего я хотела бы выразить глубокую благодарность Татьяне Карповне Бронич и Александру Викторовичу Кабанову за постоянное внимание и поддержку в течение всего времени моей работы под их руководством, за их смелые идеи и удивительную работоспособность. За ценный урок: видеть картину в целом, но обращать внимание на детали. Также я хотела бы выразить благодарность Hardeep Oberoi за плодотворное сотрудничество в течение всего времени работы над проектом.

Работа была выполнена с использованием оборудования Центра «Наноматериалы» (отделение Center for Biomedical Research Excellence (CoBRE) в Небраске) при финансовой поддержке Национального Института Здоровья США грант RR021937. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства обороны США MRMC 06108004 (А.В.К.) и Национального Института Здоровья США CAI 16590 (Т.К.Б). Я благодарна Центру конфокальной микроскопии и проточной цитометрии (Dr. Charles A. Kuszynski), Центру по изучению межмолекулярного взаимодействия, Центру по получению АСМ-изображений (Медицинский центр университета Небраски).

В заключение, я хотела бы поблагодарить за оказанную помощь и поддержку весь состав Центра Доставки Лекарств и Наномедицины, под руководством Александра Викторовича Кабанова.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наногели - это уникальный класс гидрогелей, характеризующийся наноразмерами, дисперсионной стабильностью и способностью быстро откликаться на изменения в окружающей среде. Наногели, изученные в данной работе, представляют собой набухшую структурную трехмерную сетку, сшитых полимерных ПМАК цепей, покрытую гидрофильной ПЭГ короной. Сшитое формообразующее отрицательно заряженное ядро наногеля позволяет контролировать связывание и высвобождение низкомолекулярных заряженных молекул. В тоже время, благодаря гидрофильной ПЭГ короне увеличивается стабильность и время циркуляции таких наночастиц в кровотоке, предотвращается взаимодействие введенных лекарственных и/или диагностических молекул с белками сыворотки, обеспечивается био- и иммунногенная совместимость. В нашей работе продемонстрировано, что физико-химические свойства таких наноматериалов (набухание, размеры, заряд, дисперсионная стабильность и др.) зависят от многих параметров (состав блок-сополимера, степень сшивки, рН среды, ионная сила раствора и др.) и могут быть заранее заданы.

В настоящей работе впервые показана возможность адресной доставки наногелей, нагруженных терапевтическими лекарствами, в опухоль in vivo. Чтобы синтезировать активный и стабильный в физиологических условиях ФК-наногель, было решено несколько основных нетривиальных задач. Во-первых, разработаны химические методы, позволяющие контролировать модификацию наногелей, которые обладают несколькими различными функциональными группами. Каждая частица, изучаемого в настоящей работе наногеля, несет, по крайней мере, сотни карбоксильных, амино- и концевых гидроксильных групп, которые могут одновременно вступать в реакцию и влиять на выход основного продукта. Заслуживает внимания, что разработана воспроизводимая методика синтеза ФК-наногелей и всех промежуточных продуктов, которые можно хранить без потери активности до нескольких месяцев. Кроме того, предложен метод модификации наногелей, который позволяет вводить любые векторные группы без потери их биологической активности, что актуально по отношению к специфическим антителам.

Другая задача состояла в оптимизации числа векторных групп, ковалентно связанных с поверхностью наногеля. Как показано, степень' модификации ФК-наногелей влияет на их физико-химические характеристики. Так, при увеличении числа ФК-векторов наногели теряют способность к набуханию, а также уменьшается, эффективность их загрузки лекарствами и стабильность нагруженных ФК-наногелей. Кроме того, эндоцитоз сильно модифицированных ФК-наногелей в ФР-положительные клетки менее эффективен, так как большая часть ФК-наногеля «застревает» в клеточной мембране и не транспортируется внутрь клетки. Несмотря на сложность модификации, было найдено оптимальное количество связанных с наногелем ФК-векторов, при котором нагруженные наногели (до 50% в/в лекарства) стабильны в течение нескольких месяцев и максимально захватываются1 клетками. Следует отметить, что разработан метод загрузки наногелей лекарствами (ФК-наногель/СББР), при котором ФК-вектора сохраняют способность связываться с рецептором. Впервые показана возможность одновременного использования СЭОР и направляющих ФК-векторов в одной терапевтической молекуле. Недостаточный интерес к комбинации СББР/ФК, возможно, заключается в реакции СББР с а-карбоксильной группой фолата, что приводит к дезактивации ФК-вектора. Нами был предложен метод загрузки наногеля лекарством, позволяющий сохранять активность ФК-наногеля/СББР.

Заслуживает внимание, что доставка лекарства в желаемую область-мишень животного и его противоопухолевый эффект посредством ФК-наногеля/СБОР были подавлены введением свободной фолиевой кислоты.

Это означает, что ФК-наногели, разработанные в настоящей работе, действительно обладают специфичностью к ФР и улучшают активность новых лекарственных форм за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза, что подтверждено in vitro и in vivo экспериментами. Кроме того, данные полимерные наноматериалы обладают уникальной способностью различать раковые и здоровые клетки in vitro, что может быть дополнительным преимуществом этих систем. Также показана возможность использования флуоресцентно-меченых наногелей, модифицированных специфическими антителами или их фрагментами, для диагностики раковой опухоли.

Моноклональные антитела или фрагменты, а также ФК широко применяются в качестве векторов для адресной доставки различных терапевтических и диагностических агентов в области наномедицины. Мы считаем, что новые лекарственные формы, основанные на наногелях, это значительный шаг вперед в использовании нанотехнологий в медицине. В настоящей работе продемонстрирована возможность эффективной адресной доставки новых лекарственных форм, основанных на наногелях, что открывает широкие перспективы для дальнейшего развития этого особого класса полимерных материалов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Нуколова, Наталия Владимировна, 2010 год

1. S.V. Vinogradov, Т.К. Bronich, A.V. Kabanov, Nanosized cationic hydrogels for drug delivery: preparation, properties and interactions with cells, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 135-147.

2. K. Akiyoshi, S. Deguchi, N. Moriguchi, S. Yamaguchi, J. Sunamoto, Self-Aggregates of Hydrophobized Polysaccharides in Water. Formation and Charactenstics of Nanoparticles, Macromolecules 26 (1993) 30623068.

3. S. Vinogradov, E. Batrakova, A. Kabanov, Poly(ethylene glycol)-polyethyleneimine NanoGel (TM) particles: novel drug delivery systems for antisense oligonucleotides, Colloids and Surfaces B-Biointerfaces 161999) 291-304.

4. K. Akiyoshi, A. Ueminami, S. Kurumada, Y. Nomura, Self-association of cholesteryl-bearing poly(L-lysine) in water and control of its secondary structure by host-guest interaction with cyclodextrin, Macromolecules 332000) 6752-6756.

5. K.Y. Lee, W.H. Jo, I.C. Kwon, Y.H. Kim, S.Y. Jeong, Structural determination and interior polarity of self-aggregates prepared from deoxycholic acid-modified chitosan in water, Macromolecules 31 (1998) 378-383.

6. S.J. Shu, X.G. Zhang, D.Y. Teng, Z. Wang, C.X. Li, Polyelectrolyte nanoparticles based on water-soluble chitosan-poly (L-aspartic acid)-polyethylene glycol for controlled protein release, Carbohydrate Research 344 (2009) 1197-1204.

7. S. Daoud-Mahammed, P. Couvreur, K. Bouchemal, M. Cheron, G. Lebas, C. Amiel, R. Gref, Cyclodextrin and Polysaccharide-Based Nanogels: Entrapment of Two Hydrophobic Molecules, Benzophenone and Tamoxifen, Biomacromolecules 10 (2009) 547-554.

8. K. Akiyoshi, E.C. Kang, S. Kurumada, J. Sunamoto, T. Principi, F.M. Winnik, Controlled association of amphiphilic polymers in water:

9. Thermosensitive nanoparticles formed by self-assembly of hydrophobically modified pullulans and poly(N-isopropylacrylamides), Macromolecules 33 (2000) 3244-3249.

10. K. Akiyoshi, S. Kobayashi, S. Shichibe, D. Mix, M. Baudys, S.W. Kim, J.r

11. Sunamoto, Self-assembled hydrogel nanoparticle of cholesterol-bearing pullulan as a carrier of protein drugs: Complexation and stabilization of insulin, J. Control. Release 54 (1998) 313-320.

12. J.K. Oh, R. Drumright, D.J. Siegwart, K. Matyjaszewski, The development of microgels/nanogels for drug'delivery applications, Prog. Polym. Sci. 33 (2008) 448-477.

13. K. Raemdonck, J. Demeester, S. De Smedt, Advanced nanogel engineering for drug delivery, Soft Matter 5 (2009) 707-715.

14. V. Boyko, A. Pich, Y. Lu, S. Richter, K.F. Arndt, H.J.P. Adler, Thermosensitive poly(N-vinylcaprolactam-co-acetoacetoxyethyl methacrylate) microgels: 1 synthesis and characterization, Polymer 44 (2003) 78217827.

15. C.L. Lin, W.Y. Chiu, C.F. Lee, Preparation, morphology, and thermoresponsive properties of poly(N-isopropylacrylamide)-based copolymer microgels, J. Polym. Sci. Pol. Chem.-44 (2006) 356-370.

16. Ю.Д. Семчиков, Высокомолекулярные соединения, Издательский центр "Академия", Москва, 2006.

17. L. Liang, W. Funke, Cross-linking self-emulsifying copolymerization of an unsaturated polyester and styrene, Macromolecules 29 (1996) 86508655.

18. H. Nur, V.T. Pinkrah, J.C. Mitchell, L.S. Benee, M.J. Snowden, Synthesis and properties of polyelectrolyte microgel particles, Advances in Colloid and Interface Science 158 (2010) 15-20.

19. S. Mendrek, A. Mendrek, H.J. Adler, A. Dworak, D. Kuckling, Preparation of Temperature-Sensitive Core-Shell Poly(glycidol)/Poly(Nisopropylacrylamide) Nanohydrogels under Surfactant-Free Conditions, Macromolecules 42 (2009) 9161-9169.

20. S. Schachschal, A. Balaceanu, C. Melian, D.E. Demco, T. Eckert, W. Richtering, A. Pich, Polyampholyte Microgels with Anionic Core and Cationic Shell, Macromolecules 43 (2010) 4331-4339.

21. S.R. Marek, C.A. Conn, N.A. Peppas, Cationic nanogels based on diethylaminoethyl methacrylate, Polymer 51 (2010) 1237-1243.

22. E. Kohli, H.Y. Han, A.D. Zeman, S.V. Vinogradov, Formulations of biodegradable Nanogel carriers with 5'-triphosphates of nucleoside analogs that display a reduced cytotoxicity and enhanced drug activity, J. Control. Release 121 (2007) 19-27.

23. S.V. Vinogradov, A.D. Zeman, E.V. Batrakova, A.V. Kabanov, Polyplex Nanogel formulations for drug delivery of cytotoxic nucleoside analogs, J. Control. Release 107 (2005) 143-157.

24. L.F. Yan, W. Tao, One-step synthesis of pegylated cationic nanogels of poly(N,N '-dimethyl amino ethyl methacrylate) in aqueous solution via self-stabilizing micelles using an amphiphilic macroRAFT agent, Polymer 51 (2010) 2161-2167.

25. G.M. Eichenbaum, P.F. Kiser, S.A. Simon, D. Needham, pH and ion-triggered volume response of anionic hydrogel microspheres, Macromolecules 31 (1998) 5084-5093.

26. K. McAllister, P. Sazani, M. Adam, M.J. Cho, M. Rubinstein, R.J. Samulski, J.M. DeSimone, Polymeric nanogels produced via inverse microemulsion polymerization as potential gene and antisense delivery agents, J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 15198-15207.

27. I. Kaneda, A. Sogabe, H. Nakajima, Water-swellable polyelectrolyte microgels polymerized in an inverse microemulsion using a nonionic surfactant, Journal of Colloid and Interface Science 275 (2004) 450-457.

28. K. Ogawa, A. Nakayama, E. Kokufuta, Electrophoretic behavior of ampholytic polymers and nanogels, J. Phys. Chem. B 107 (2003) 82238227.

29. K. Ogawa, A. Nakayama, E. Kokufuta, Preparation and characterization of thermosensitive polyampholyte nanogels, Langmuir 19 (2003) 31783184.

30. A.V. Kabanov, S.V. Vinogradov, Nanogels as Pharmaceutical Carriers: Finite Networks of Infinite Capabilities, Angew Chem Int Ed Engl 48 (2009) 5418-5429.

31. T.K. Bronich, Keifer, P. A., Shlyakhtenko, L. S., Kabanov, A. V., Polymer micelle with cross-linked ionic core, J Am Chem Soc 127 (2005) 8236-8237.

32. J.O. Kim, N.V. Nukolova, H.S. Oberoi, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Block ionomer complex micelles with cross-linked cores for drug delivery, Polym. Sci. Ser. A 51 (2009) 708-718.

33. J.Y. Zhang, Y.M. Zhou, Z.Y. Zhu, Z.S. Ge, S.Y. Liu, Polyion complex micelles possessing thermoresponsive coronas and their covalent core stabilization via "click" chemistry, Macromolecules 41 (2008) 1444-1454.

34. R.K. O'Reilly, M.J. Joralemon, K.L. Wooley, C.J. Hawker, Functionalization of micelles and shell cross-linked nanoparticles using click chemistry, Chemistry of Materials 17 (2005) 5976-5988.

35. S. Yusa, M. Sugahara, T. Endo, Y. Morishima, Preparation and Characterization of a pH-Responsive Nanogel Based on a Photo-Cross1.nked Micelle Formed From Block Copolymers with Controlled Structure, Langmuir 25 (2009) 5258-5265.

36. R.K. O'Reilly, C.J. Hawker, K.L. Wooley, Cross-linked block copolymer micelles: functional nanostructures of great potential and versatility, Chemical Society Reviews 35 (2006) 1068-1083.

37. R.K. O'Reilly, M.J. Joralemon, C.J. Hawker, K.L. Wooley, Facile syntheses of surface-functionalized micelles and shell cross-linked nanoparticles, J. Polym. Sci. Pol. Chem. 44 (2006) 5203-5217.

38. K.B. Thurmond, T. Kowalewski, K.L. Wooley, Shell cross-linked knedels: A synthetic study of the factors affecting the dimensions and properties of amphiphilic core-shell nanospheres, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 6656-6665.

39. S. Bontha, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Polymer micelles with cross-linked ionic cores for delivery of anticancer drugs, J. Control. Release 114(2006) 163-174.

40. T.K. Bronich, S. Bontha, L.S. Shlyakhtenko, L. Bromberg, T.A. Hatton, A.V. Kabanov, Template-assisted synthesis of nanogels from Pluronic-modified poly(acrylic acid), Journal of Drug Targeting 14 (2006) 357366.

41. S.E.A. Gratton, P.A. Ropp, P.D. Pohlhaus, J.C. Luft, V.J. Madden, M.E. Napier, J.M. DeSimone, The effect of particle design on cellular internalization pathways, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (2008) 11613-11618.

42. L.E. Euliss, J.A. DuPont, S. Gratton, J.M. DeSimone, Imparting size, shape, and composition control of materials for nanomedicine, Chemical Society Reviews 35 (2006) 1095-1104.

43. J.P. Rolland, B.W. Maynor, L.E. Euliss, A.E. Exner, G.M. Denison, J.M. DeSimone, Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials, J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 10096-10100.

44. S.E.A. Gratton, P.D. PohhauS, J. Lee, I. Guo, M.J. Cho, J.M. DeSimone,

45. Nanofabricated particles for engineered drug therapies: A preliminary

46. Biodistribution study of PRINT (TM) nanoparticles, J. Control. Release 121 (2007) 10-18.

47. L.C. Glangchai, M. Caldorera-Moore, L. Shi, K. Roy, Nanoimprint lithography based fabrication of shape-specific, enzymatically-triggered smart nanoparticles, J. Control. Release 125 (2008) 263-272.

48. M. Oishi, Y. Nagasaki, Stimuli-responsive smart nanogels for cancer diagnostics and therapy, Nanomedicine 5 (2010) 451-468.

49. Y. Qiu, K. Park, Environment-sensitive hydrogels for drug delivery, Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (2001) 321-339.

50. S.V. Vinogradov, Colloidal microgels in drug delivery applications, Current Pharmaceutical Design 12 (2006) 4703-4712.

51. J. He, X. Tong, Y. Zhao, Photoresponsive Nanogels Based on Photocontrollable Cross-Links, Macromolecules 42 (2009) 4845-4852.

52. A. Suzuki, T. Tanaka, Phase transition in polymer gels induced by visible light, Nature 346 (1990) 345-347.

53. R. Pelton, Temperature-sensitive aqueous microgels, Advances in Colloid and Interface Science 85 (2000) 1-33.

54. G.M. Eichenbaum, P.F. Kiser, D. Shah, S.A. Simon, D. Needham, Investigation of the swelling response and drug loading of ionic microgels: The dependence on functional group composition, Macromolecules 32 (1999) 8996-9006.

55. G.M. Eichenbaum, P.F. Kiser, A.V. Dobrynin, S.A. Simon, D. Needham, Investigation of the swelling response and loading of ionic microgels with drugs and proteins: The dependence on cross-link density, Macromolecules 32 (1999) 4867-4878.

56. F. Ilmain, T. Tanaka, E. Kokufuta, Volume transition in a gel driven by hydrogen-bonding, Nature 349 (1991) 400-401.

57. N.A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50 (2000) 27-46.

58. N.A. Peppas, J.Z. Hilt, A. Khademhosseini, R. Langer, Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology, Adv. Mater. 18 (2006) 1345-1360.

59. J. Ricka, T. Tanaka, Swelling of ionic gels: quantitative performance of the Donnan theory, Macromolecules 17 (1984) 2916-2921.

60. S.A. Dubrovskii, V.V. Vasil'ev, Swelling pressure and elastic behavior of polymacromonomer networks with different functionalities of junctions, Polym. Sci. Ser. A 48 (2006) 924-933.

61. S.K. De, N.R. Aluru, B. Johnson, W.C. Crone, D.J. Beebe, J. Moore, Equilibrium swelling and kinetics of pH-responsive hydrogels: Models, experiments, and simulations, Journal of Microelectromechanical Systems 11 (2002) 544-555.

62. S.V. Vinogradov, T.K. Bronich, A.V. Kabanov, Self-assembly of polyamine-poly(ethylene glycol) copolymers with phosphorothioate oligonucleotides, Bioconjugate Chemistry 9 (1998) 805-812.

63. S. Kazakov, M. Kaholek, I. Gazaryan, B. Krasnikov, K. Miller, K. Levon, Ion concentration of external solution as a characteristic of micro- and nanogel ionic reservoirs, J. Phys. Chem. B 110 (2006) 15107-15116.

64. T.K. Bronich, S.V. Vinogradov, A.V. Kabanov, Interaction of nanosized copolymer networks with oppositely charged amphiphilic molecules, Nano Letters 1 (2001) 535-540.

65. P. Colombo, R. Bettini, P. Santi, A. DeAscentiis, N.A. Peppas, Analysis of the swelling and release mechanisms from drug delivery systems with emphasis on drug solubility and water transport, J. Control. Release 39 (1996) 231-237.

66. J.O. Kim, G. Sahay, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Polymeric Micelles with Ionic Cores Containing Biodegradable Cross-Links for Delivery of Chemotherapeutic Agents, Biomacromolecules 11 (2010) 919-926.

67. A.V. Dobrynin, R.H. Colby, M. Rubinstein, Polyampholytes, J. Polym. Sci. Pt. B-Polym. Phys. 42 (2004) 3513-3538.

68. Y. Ogawa, K. Ogawa, B.L. Wang, E. Kokufuta, A biochemo-mechanical system consisting of polyampholyte gels with coimmobilized glucose oxidase and urease, Langmuir 17 (2001) 2670-2674.

69. S.H. Choi, J.H. Lee, S.M. Choi, T.G. Park, Thermally reversible pluronic/heparin nanocapsules exhibiting 1000-fold volume transition, Langmuir 22 (2006) 1758-1762.

70. S. Zschoche, J. Rueda, V. Boyko, F. Krahl, K.F. Amdt, B. Voit, Thermo-Responsive Nanogels Based on PolyNIPAAm-graft-(2-alkyl-2-oxazoline)]s Crosslinked in the Micellar State, Macromol. Chem. Phys. 211 (2010) 1035-1042.

71. Y. Ogawa, K. Ogawa, E. Kokufuta, Swelling-shrinking behavior of a polyampholyte gel composed of positively charged networks with immobilized polyanions, Langmuir 20 (2004) 2546-2552.

72. T. Sawai, H. Shinohara, Y. Ikariyama, M. Aizawa, Electrical control of the volume of pH-sensitive microgels, Journal of Electroanalytical Chemistry 297 (1991) 399-407.

73. J.K. Oh, D.I. Lee, J.M. Park, Biopolymer-based microgels/nanogels for drug delivery applications, Prog. Polym. Sci. 34 (2009) 1261-1282.

74. K.N. Minh, D.S. Lee, Injectable Biodegradable Hydrogels, Macromol. Biosci. 10(2001) 563-579.

75. T. Tanaka, I. Nishio, S.-T. Sun, S. Ueno-Nishio, Collapse of Gels in an Electric Field, Science 218 (1982) 467-469.

76. N. Sahiner, A.M. Alb, R. Graves, T. Mandal, G.L. McPherson, W.F. Reed, V.T. John, Core-shell nanohydrogel structures as tunable delivery systems, Polymer 48 (2007) 704-711.

77. H. Kobayashi, O. Katakura, N. Morimoto, K. Akiyoshi, S. Kasugai, Effects of Cholesterol-Bearing Pullulan (CHP)-Nanogels in Combination with Prostaglandin El on Wound Healing, J. Biomed. Mater. Res. Part B 9IB (2009) 55-60.

78. N.A. Peppas, P. Colombo, Analysis of drug release behavior from swellable polymer carriers using the dimensionality index, J. Control. Release 45 (1997)35-40.

79. A.V. Kabanov, V.Y. Alakhov, Pluronic (R) block copolymers in drug delivery: From micellar nanocontainers to biological response modifiers, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 19 (2002) 1-72.

80. H.B. Zhang, C. Zhao, H. Cao, G.J. Wang, L. Song, G.G. Niu, H.A. Yang, J. Ma, S.Q. Zhu, Hyperbranched poly(amine-ester) based hydrogels for controlled multi-drug release in combination chemotherapy, Biomaterials 31 (2010) 5445-5454.

81. K. Nagahama, M. Hashizume, H. Yamamoto, T. Ouchi, Y. Ohya, Hydrophobically Modified Biodegradable Polyethylene glycol) Copolymers that Form Temperature-Responsive Nanogels, Langmuir 252009) 9734-9740.

82. K. Nagahama, Y. Mori, Y. Ohya, T. Ouchi, Biodegradable nanogel formation of polylactide-grafted dextran copolymer in dilute aqueous solution and enhancement of its stability by stereocomplexation, Biomacromolecules 8 (2007) 2135-2141.

83. G. Sahay, J.O. Kim, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, The exploitation of differential endocytic pathways in normal and tumor cells in the selective targeting of nanoparticulate chemotherapeutic agents, Biomaterials 312010) 923-933.

84. K. Ulbrich, V. Subr, P. Podperova, M. Buresova, Synthesis of novel hydrolytically degrasable hydrogels for controlled drug-release, J. Control. Release 34 (1995) 155-165.

85. B. Sun, B. Ranganathan, S.S. Feng, Multifunctional poly(D,L-lactide-co-glycolide)/montmorillonite (PLGA/MMT) nanoparticles decorated by Trastuzumab for targeted chemotherapy of breast cancer, Biomaterials 29 (2008) 475-486.

86. R.A. Gatenby, R.J. Gillies, Why do cancers have high aerobic glycolysis?, Nature Reviews Cancer 4 (2004) 891-899.

87. C. He, S.W. Kim, D.S. Lee, In situ gelling stimuli-sensitive block copolymer hydrogels for drug delivery, J. Control. Release 127 (2008) 189-207.

88. V.P. Torchilin, Multifunctional nanocarriers, Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (2006) 1532-1555.

89. E.S. Gil, S.M. Hudson, Stimuli-reponsive polymers and their bioconjugates, Prog. Polym. Sci. 29 (2004) 1173-1222.

90. H. Maeda, The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: The key role of tumor-selective macromolecular drug targeting, in: G. Weber (Ed.), Advances in Enzyme Regulation, Vol 41, vol. 41, 2001, pp. 189-207.

91. H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, K. Hori, Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review, J. Control. Release 65 (2000) 271-284.

92. D.E. Owens, N.A. Peppas, Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles, International Journal of Pharmaceutics 307 (2006) 93-102.

93. F. Alexis, E. Pridgen, L.K. Molnar, O.C. Farokhzad, Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles, Molecular Pharmaceutics 5 (2008) 505-515.

94. S.D. Conner, S.L. Schmid, Regulated portals of entry into the cell, Nature 422 (2003) 37-44.

95. D.C. Drummond, O. Meyer, K.L. Hong, D.B. Kirpotin, D. Papahadjopoulos, Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors, Pharmacological Reviews 51 (1999) 691-743.

96. R.A. Petros, J.M. DeSimone, Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications, Nature Reviews Drug Discovery 9 (2010) 615627.

97. V.P. Torchilin, PEG-based micelles as carriers of contrast agents for different imaging modalities, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 235-252.

98. G.S. Kwon, K. Kataoka, Block copolymer micelles as long-circulating drug vehicles, Adv. Drug Deliv. Rev. 16 (1995) 295-309.

99. T.R. Daniels, T. Delgado, G. Helguera, M.L. Penichet, The transferrin receptor part II: Targeted delivery of therapeutic agents into cancer cells, Clinical Immunology 121 (2006) 159-176.

100. P.S. Low, W.A. Henne, D.D. Doorneweerd, Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for Imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases, Accounts of Chemical Research 41 (2008) 120-129.

101. Y.J. Lu, P.S. Low, Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 675-693.

102. C.P. Leamon, P.S. Low, Folate-mediated targeting: from diagnostics to drug and gene delivery, Drug Discovery Today 6 (2001) 44-51.

103. J. Sudimack, R.J. Lee, Targeted drug delivery via the folate receptor, Adv. Drug Deliv. Rev. 41 (2000) 147-162.

104. A.C. Antony, The biological chemistry of folate receptors, Blood 79 (1992) 2807-2820.

105. J.A. Reddy, V.M. Allagadda, C.P. Leamon, Targeting therapeutic and imaging agents to folate receptor positive tumors, Current Pharmaceutical Biotechnology 6 (2005) 131-150.

106. H.Z. Zhao, L.Y.L. Yung, Selectivity of folate conjugated polymer micelles against different tumor cells, International Journal of Pharmaceutics 349 (2008) 256-268.

107. S.H. Kim, J.H. Jeong, K.W. Chun, T.G. Park, Target-specific ccllular uptake of PLGA nanoparticles coated with poly(L-lysine)-poly(ethylene glycol)-folate conjugate, Langmuir 21 (2005) 8852-8857.

108. D. Kim, Z.G. Gao, E.S. Lee, Y.H. Bae, In Vivo Evaluation of Doxorubicin-Loaded Polymeric Micelles Targeting Folate Receptors and Early Endosomal pH in Drug-Resistant Ovarian Cancer, Molecular Pharmaceutics 6 (2009) 1353-1362.

109. R.J. Lee, P.S. Low, Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor mediated endocytosis, Journal of Biological Chemistry 269(1994)3198-3204.

110. P.S. Low, S.A. Kularatne, Folate-targeted therapeutic and imaging agents for cancer, Current Opinion in Chemical Biology 13 (2009) 256-262.

111. N. Dinauer, S. Balthasar, C. Weber, J. Kreuter, K. Langer, H. von Briesen, Selective targeting of antibody-conjugated nanoparticles to leukemic cells and primary T-lymphocytes, Biomaterials 26 (2005) 58985906.

112. J.C. Olivier, R. Huertas, H.J. Lee, F. Calon, W.M. Pardridge, Synthesis of pegylated immunonanoparticles, Pharm. Res. 19 (2002) 1137-1143.

113. C.J. Sunderland, M. Steiert, J.E. Talmadge, A.M. Derfus, S.E. Barry, Targeted nanoparticles for detecting and treating cancer. Drug Dev. Res. 67 (2006) 70-93.

114. C.B. Hansen, G.Y. Kao, E.H. Moase, S. Zalipsky, T.M. Allen, Attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes- evaluetion,comparison and optimization of coupling procedures, Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1239 (1995) 133-144.

115. P. Kocbek, N. Obermajer, M. Cegnar, J. Kos, J. Kristl, Targeting cancer cells using PLGA nanoparticles surface modified with monoclonal antibody, J. Control. Release 120 (2007) 18-26.

116. S. Dhar, F.X. Gu, R. Langer, O.C. Farokhzad, S.j. Lippard, Targeted delivery of cisplatin to prostate cancer cells by aptamer functionalized Pt(IV) prodrug-PLGA-PEG nanoparticles, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (2008) 17356-17361.

117. A.L.Z. Lee, Y. Wang, H.Y. Cheng, S. Pervaiz, Y.Y. Yang, The co-delivery of paclitaxel and Herceptin using cationic micellar nanoparticles, Biomaterials 30 (2009) 919-927.

118. A. I to, Y. Kuga, H. Honda, H. Kikkawa, A. Horiuchi, Y. Watanabe, T. Kobayashi, Magnetite nanoparticle-loaded anti-HER2 immunoliposomes for combination of antibody therapy with hyperthermia, Cancer Lett. 212 (2004) 167-175.

119. P. Debbage, W. Jaschke, Molecular imaging with nanoparticles: giant roles for dwarf actors, Histochem. Cell Biol. 130 (2008) 845-875.

120. W.W.K. Cheng, T.M. Allen, Targeted delivery of anti-CD19 liposomal doxorubicin in B-cell lymphoma: A comparison of whole monoclonal antibody, Fab' fragments and single chain Fv, J. Control. Release 126 (2008) 50-58.

121. A.P. Chapman, PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: a review, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 (2002) 531-545.

122. J.S. Wang, S.K. Varshney, R. Jerome, P. Teyssie, Synthesis of AB (BA), ABA and BAB block copolymers of tert-butyl methacrylate (A) and ethylene oxide (B), J. Polym. Sci. Pol. Chem. 30 (1992) 2251-2261.

123. M. Pourfarzaneh, G.W. White, J. Landon, D.S. Smith, Cortisol directly determined in serum by fluoroimmunoassay with magnetizable solid phase, Clin Chem 26 (1980) 730-733.

124. K.L. Holmes, L.M. Lantz, H.A.C.J.P.R. Zbigniew Darzynkiewicz, Chapter 9 Protein labeling with fluorescent probes, Methods in Cell Biology, vol. Volume 63, Part 1, Academic Press, 2001, pp. 185-204.

125. S.W. Sun, Y.C. Lin, Y.M. Weng, M.J. Chen, Efficiency improvements on ninhydrin method for amino acid quantification, Journal of Food Composition and Analysis 19 (2006) 112-117.

126. R.R. Traut, A. Bollen, T.-T. Sun, J.W.B. Hershey, J. Sundberg, L.R. Pierce, Methyl 4-mercaptobutyrimidate as a cleavable crosslinking reagent and its application to the Escherichia coli 30S ribosome, Biochemistry 12 (1973) 3266-3273.

127. B. Johnsson, S. Lofas, G. Lindquist, Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface-plasmon resonance sensors, Analytical Biochemistry 198(1991)268-277.

128. R. Karlsson, A. Michaelsson, L. Mattsson, Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system, Journal of Immunological Methods 145 (1991) 229240.

129. U.K. Laemmli, Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680-685.

130. T. Mosmann, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, Journal of Immunological Methods 65 (1983) 55-63.

131. F. Horkay, I. Tasaki, P.J. Basser, Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions, Biomacromolecules 1 (2000) 84-90.

132. K. Ogawara, S. Kawazoe, T. Tamura, S. Kawauchi, M. Satoh, J. Komiyama, Divalent counterion binding of Na poly(alpha:hydroxy acrylate), Polymer 39 (1998) 437-440.

133. G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1st edition ed., Academic Press, San Diego, CA, 1996.

134. S.Y. Liu, J.V.M. Weaver, M. Save, S.P. Armes, Synthesis of pH-responsive shell cross-linked micelles and their use as nanoreactors for the preparation of gold nanoparticles, Langmuir 18 (2002) 8350-83571

135. M.L. Teyssot, M. Fayolle, C. Philouze, C. Dupuy, Bis-heteronucleophilic Michael addition to divinyl sulfone: A new efficient access to macrocycles, European Journal of Organic Chemistry (2003) 54-62.

136. M.P. Lutolf, J.A. Hubbell, Synthesis and Physicochemical Characterization of End-Linked Poly(ethylene glycol)-co-peptide Hydrogels Formed by Michael-Type Addition, Biomacromolecules 4 (2003) 713-722.

137. Y.-F. Lam, G. Kotowycz, Self Association of Folic Acid in Aqueous Solution by Proton Magnetic Resonance, Canadian journal of chemistry 50(1972) 2357-2363

138. J.O. Kim, A.V. Kabanov, T.K. Bronich, Polymer micelles with cross-linked polyanion core for delivery of a cationic drug doxorubicin, J. Control. Release 138 (2009) 197-204.

139. B.C. Nelson, K.E. Sharpless, L.C. Sander, Quantitative determination of folic acid in multivitamin/multielement tablets using liquidchromatography/tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A 1135 (2006) 203-211.

140. A.C. Alagon, T.P. King, Activation of polysaccharides with 2-iminothiolane and its uses, Biochemistry 19 (1980) 4341-4345.

141. A.L. Tarentino, A.W. Phelan, T.H. Plummer, 2-Iminothiolane: a reagent for the introduction of sulphydryl groups into oligosaccharides derived from asparagine-linked glycans, Glycobiology 3 (1993) 279-285.

142. D. Kim, E.S. Lee, K. Park, I.C. Kwon, Y.H. Bae, Doxorubicin Loaded pH-sensitive Micelle: Antitumoral Efficacy against Ovarian A2780/DOXR Tumor, Pharm. Res. 25 (2008) 2074-2082.

143. B.A. Kamen, M.T. Wang, A.J. Streckfuss, X. Peryea, R.G. Anderson, Delivery of folates to the cytoplasm of MA 104 cells is mediated by a surface membrane receptor that recycles, Journal of Biological Chemistry 263 (1988) 13602-13609.

144. J.A. Reddy, C. Abburi, H. Hofland, S.J. Howard, I. Vlahov, P. Wils, C. Leamon, Folate-targeted, cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors. Gene Therapy 9 (2002) 1542-1550.

145. C.P. Leamon, P.S. Low, Delivery of macromolecules into living cells: A method that exploits folate receptor endocytosis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (1991) 5572-5576.

146. R.G.W. Anderson, B.A. Kamen, K.G. Rothberg, S.W. Lacey, Potocytosis: Sequestraton and transport of small molecules by caveolae, Science 255 (1992)410-411.