Стимул-чувствительные амфифильные сополимеры альфа-аминокислот для внутриклеточной доставки миРНК/ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Коровкина Ольга Михайловна

• Коровкина Ольга Михайловна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Коровкина Ольга Михайловна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Системы доставки лекарств на основе полимерных наночастиц

1.2. Системы доставки нуклеиновых кислот

1.2.1 Типы систем доставки нуклеиновых кислот и способы их получения

1.2.2 Типы полимеров для создания систем доставки нуклеиновых кислот

1.2.2.1 Природные полимеры

1.2.2.2 Синтетические полимеры

1.2.2.3 Биодеградируемые полипептиды

1.2.3 Методы получения полиаминокислот

1.2.4 Синтез сополимеров на основе а-аминокислот

1.2.5 Синтез гибридных сополимеров на основе а-аминокислот и полисахаридов

1.3 Стимул-чувствительные системы доставки нуклеиновых кислот

1.3.1 Типы природных стимулов

1.3.1.1 Изменения рН среды

1.3.1.2 Изменения окислительно-восстановительного потенциала

1.3.1.3 Присутствие ферментов

1.3.1.4 Изменение температуры

1.3.2. Типы стимул-чувствительных полимеров для доставки нуклеиновых кислот

1.4. Методы исследования полимерных систем доставки

1.4.1. Размер и морфология

1.4.2 Свойства поверхности

1.4.3. Биологические свойства

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Характеристики исходных веществ, материалов и их подготовка

2.2 Оборудование и статистическая обработка данных

2.3. Методы синтеза

2.3.1. Синтез амфифильных полиаминокислот

2.3.1.1. Синтез К-карбоксиангидридов а-аминокислот

2.3.1.2. Синтез статистических сополимеров а-аминокислот

2.3.1.3. Деблокирование сополимеров

2.3.2. Синтез гистидин-содержащих полиаминокислот

2.3.2.1. Ковалентная модификация полимеров молекулами гистидина

2.3.2.2. Деблокирование гистидин-содержащих полиаминокислот

2.3.3. Синтез цистеин-содержащих полиаминокислот

2.3.3.1. Ковалентная модификация полимеров молекулами цистеина

2.3.3.2. Деблокирование цистеин-содержащих полиаминокислот

2.3.4. Синтез компонентов для графт-сополимеров

2.3.4.1. Синтез модифицированных азид-содержащих полисахаридов

2.3.4.1.1 Модификация гепарина

2.3.4.2. Синтез модифицированных алкин-содержащих полисахаридов

2.3.4.3. Синтез алкин- /азид-содержащих гомополимеров аминокислот

2.3.4.4. Синтез графт-сополимеров

2.4. Методы исследования состава мономеров и (со)полимеров

2.5. Получение и исследование характеристик полимерных частиц

2.6 Исследование размера, поверхностного заряда и морфологии наночастиц

2.7 Исследование стабильности частиц

2.8. Модификация частиц флуоресцентными метками

2.9. Создание инкапсулированных форм нуклеиновых кислот на основе разработанных полимерных наносистем

2.9.1 Полипептидные системы доставки

2.9.1.1 Инкапсулирование олигонуклеотида и миРНК

2.9.1.2 Изучение размеров и поверхностного заряда комплексов полимер-олигонуклеотид

2.9.1.3 рН-чувствительное высвобождение олигонуклеотида

2.9.1.4 Высвобождение олигонуклеотида в присутствии конкурентных молекул

2.9.2 Системы доставки на основе графт-сополимеров

2.9.2.1 Инкапсулирование плазмидной ДНК

2.9.2.2 Изучение размеров и поверхностного заряда комплексов полимер-плазмидная ДНК

2.9.2.3 Высвобождение пДНК в присутствии конкурентных молекул

2.10 Исследование биологических свойств разработанных носителей

2.10.1. Культивирование клеток

2.10.2 Анализ цитотоксичности полимерных частиц

2.10.3 Исследование внутриклеточного проникновения полимерных частиц

2.10.4 Исследование эффективности разработанных носителей в качестве систем доставки нуклеиновых кислот

2.10.4.1 Ингибирование фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) с использованием комплексов амфифильных полиаминокислот с миРНК

2.10.4.2 Подавление экспрессии гена GFP в MDA-MB-231/GFP с использованием комплексов рН-чувствительных полимеров с миРНК

2.10.4.3 Инициирование экспрессии вБР белка в НЕК-293Т с использованием

94

комплексов графт-сополимеров с пДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Синтез полимеров для получения систем доставки нуклеиновых кислот

3.1.1 Синтез амфифильных сополимеров а-аминокислот

3.1.1.1 Синтез статистических сополимеров а-аминокислот

3.1.1.2 Синтез гистидин-содержащих полиаминокислот

3.1.1.3 Синтез цистеин-содержащих полиаминокислот

3.1.2 Синтез компонентов для графт-сополимеров

3.2. Формирование полимерных частиц и комплексов с НК и изучение их физико-химических характеристик

3.2.1 Исследование частиц на основе статистических сополимеров а-аминокислот

3.2.1.1 Изучение гидродинамического диаметра и дзета-потенциала полимерных частиц

3.2.1.2 Изучение стабильности образцов и влияния рН на характеристики частиц

3.2.1.3 Изучение инкапсулирования и высвобождения модели миРНК

3.2.2 Исследование частиц на основе гистидин-содержащих полиаминокислот

3.2.2.1 Изучение гидродинамического диаметра и дзета-потенциала частиц

3.2.2.2 Изучение инкапсулирования и высвобождения модели миРНК

3.2.3 Исследование частиц на основе цистеин-содержащих полиаминокислот

3.2.3.1 Изучение гидродинамического диаметра и дзета-потенциала частиц

3.2.3.2 Изучение стабильности частиц

3.2.4 Формирование частиц из графт-сополимеров

3.2.4.1 Изучение гидродинамического диаметра и дзета-потенциала

3.2.4.2 Изучение формирования комплексов полимер/пДНК

3.3 Биологические свойства разработанных носителей

3.3.1 Цитотоксичность полимерных систем

3.3.2 Исследование проникновения частиц внутрь клеток

3.3.3 Исследование способности полимерных носителей доставлять лекарства в клетки и ткани

3.3.3.1 Ингибирование фактора роста эндотелия сосудов с использованием интерполиэлектролитных комплексов на основе статистических сополимерисаов и миРНК

3.3.3.2 Подавление экспрессии гена GFP с использованием интерполиэлектролитных комплексов на основе гистидин-содержащих 153 сополимеров и миРНК

3.3.3.3 Инициирование синтеза GFP-белка в клетках HEK-293 с использованием

интерполиэлектролитных комплексов на основе графт-сополимеров и пДНК

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Список сокращений

Мономеры и другие низкомолекулярные вещества:

N-КА - N-карбоксиангидрид ГМДС - гексаметилдисилозан

Cy3, Cy5 - флуоресцентный краситель индокарбоцианин EDC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

DAPI - 4',6- диамидино-2-фенилиндол dT-dA - дуплекс олиготимидин-олигоаденин

NHS - N-гидроксисукцинимид СТB - реагент CellTiter-Blue

Lys - L-лизин Lys(Z) - е-карбоксибензил^-лизин

Glu - L-глутаминовая кислота Glu(OBzl) - у-бензил-1-глутамат

Cys - L-цистеин His - L-гистидин

Fmoc-Cys(Acm)-OPfp - Na- флуоренилметоксикарбонил-S-ацетамидометил^-цистеин пентафторфениловый эфир Fmoc-His(Trt)-OH - N- флуоренилметоксикарбонил-N-тритил-^-гистидин

Phe - L-фенилаланин Ile - L-изолейцин

Полимеры:

PLys - поли^-лизин) PGlu - поли( L-глутаминовая кислота)

PLys(Z) - поли( е-карбоксибензил-L-лизин) PGlu(OBzl) — поли(у-бензил-£-глутамат)

Hep - гепарин CS - хитозан

пДНК - плазмидная дезоксирибонуклеиновая кислота миРНК - малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота

Hep-g-PLys - гепарин-графт-поли(Ь-лизин) CS-g-PGlu - хитозан-графт-поли( L-глутаминовая кислота)

Группы в составе полимеров:

OBzl - у-бензильная группа Trt - тритильная группа

Boc - трет-бутоксикарбонильная группа Fmoc - флуоренилметоксикарбониль-ная группа

Z - е-карбоксибензильная группа Acm - ацетамидометильная группа

Растворители и среды:

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) - Дюльбекко синтетическая среда Игла MEM (Minimum Essential Medium) -среда Игла

ФБР - натрий-фосфатный буферный ДМСО - диметилсульфоксид

раствор

ЭБС - эмбриональная бычья MES - 2-(К-морфолино)этансульфо-

сыворотка новая кислота

ДМФА - диметилформамид

Условные обозначения:

НЧ - наночастицы ИПД - индекс полидисперности

БАВ - биологически активное вещество ФЧ - фоточувствительность или фоточувствительные

ЭИ - эффективность ROP (Ring-opening polymerization)

инкапсулирования полимеризация с раскрытием цикла

I - инициатор M - мономер

VEGF (Vascular endothelial growth factor) - фактор роста эндотелия сосудов GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

ИПЭК - интерполиэлектролитный комплекс GFP (green fluorescent protein) -зелёный флуоресцентный белок

Методы исследования:

ЯМР-спектроскопия - спектроскопия ядерного магнитного резонанса УФ-спектроскопия - спектроскопия в ультрафиолетовой области

ДРС - динамическое рассеяние света ИК-спектроскопия - спектроскопия в инфракрасной области

СРС - статическое рассеяние света АТЧ - анализ траектории частиц

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия ЭЖХ - эксклюзионная жидкостная хроматография

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стимул-чувствительные амфифильные сополимеры альфа-аминокислот для внутриклеточной доставки миРНК/ДНК»

ВВЕДЕНИЕ

Создание систем контролируемой внутриклеточной доставки лекарств представляет собой одно из крайне перспективных и востребованных научных направлений, отвечающих современным потребностям биомедицины в области повышения эффективности и пролонгирования действия лекарственных препаратов [1]. Биосовместимые и биодеградируемые полимеры являются крайне привлекательными для создания подобных систем, способных повысить биодоступность терапевтических субстанций, предотвратить или существенно снизить ферментативную деградацию лекарства, а также улучшить проникновение через биологические барьеры и адресно доставить действующее вещество в целевой орган [2].

Одним из важных направлений современной медицины является генная терапия -метод лечения генетических заболеваний путем переноса одной или нескольких терапевтических нуклеиновых кислот в клетки пациента с целью коррекции или замены дефектного гена. Такая терапия дает возможность лечить широкий спектр заболеваний на транскрипционном и трансляционном уровне. Известно, что применение генетических конструкций в свободной форме (ДНК, РНК) в большинстве случаев является неэффективным ввиду низкой селективности, ферментативной деградации нуклеиновых кислот в присутствии нуклеаз, быстрого снижения концентрации препарата, а также низкой биодоступности [3-5].

Разработка биосовместимых стимул-чувствительных носителей для доставки лекарств различной природы позволяет преодолеть имеющиеся недостатки. В частности, связывание лекарства с носителем или инкапсулирование внутрь наночастиц позволяет доставлять его в целевые ткани с возможностью регулируемого высвобождения под действием естественных или искусственных стимулов. Кроме того, в подобных системах связанное лекарство защищено от ферментативной деградации, а также может высвобождаться с поддержанием заданной терапевтической концентрации [2,6]. Таким образом, клиническое применение стимул-чувствительных полимерных наноконтейнеров для доставки лекарств существенно увеличивает эффективность терапии благодаря повышению биодоступности, контролируемому высвобождению и снижению общей токсичности для организма. По упомянутым причинам применение инкапсулированных форм терапевтических субстанций в полимерные носители представляет собой перспективный подход к лечению заболеваний широкого спектра.

Значительным достоинством синтетических высокомолекулярных соединений, с точки зрения материалов для полимерных систем, является возможность создания полимерных частиц с точно заданными свойствами, включая гидрофобность, поверхностный заряд, скорость деградации, которые могут варьироваться в зависимости от природы полимера, длины цепи и ее постмодификаций [7-9]. Также, большинство полимерных синтезов можно достаточно легко контролировать и масштабировать до промышленных объемов, получая целевые объекты с воспроизводимыми характеристиками.

Среди множества синтетических полимеров большим интересом пользуются полиаминокислоты, благодаря своей схожести с природными белками, а также способности к биодеградации до нетоксичных простых аминокислот [10]. Варьируя природу мономеров и длину полимерных цепей, можно синтезировать полиаминокислоты с контролируемым гидрофильно-гидрофобным балансом и сформировать наночастицы различного размера и морфологии на их основе. Сочетание в полимере гидрофильных и гидрофобных фрагментов, то есть амфифильность, обеспечивает полимерам способность к самоорганизации - самопроизвольному формированию наночастиц в растворах. С точки зрения доставки нуклеиновых кислот, поликатионы (например, полилизин и полиаргинин) являются хорошей основой, благодаря высокому положительному заряду аминогрупп, однако в чистом виде они могут проявлять значительную цитотоксичность [11-13]. В литературе встречаются работы по созданию полимерных частиц на основе комбинации поликатионов и полианионов с целью частичного экранирования положительно заряженных функциональных групп поликатиона и, как следствие, облегчения высвобождения лекарственного препарата из комплекса с носителем при попадании в клетку [14-19]. Подобный подход также может способствовать снижению токсичности полимерных носителей. Одним из решений проблемы баланса эффективного связывания нуклеиновых кислот и своевременного высвобождения может стать сочетание звеньев лизина со звеньями глутаминовой кислоты для получения положительно заряженного полимера, способного умеренно связывать РНК/ДНК, а также высвобождать лекарство в присутствии конкурентных полианионов, таких как внутриклеточные белки.

Чувствительность наночастиц на основе полиаминокислот к внешним стимулам может быть обеспечена, в частности, за счет включения в полимерную цепь звеньев

гистидина - аминокислоты, содержащей в боковой цепи имидазольную группу, которая известна проявлением «эффекта протонной губки» в физиологических условиях. Этот эффект основан на протонировании аминогруппы гистидина = 6) в кислой среде лизосомы (рН 5-6) в процессе эндоцитоза и буферизации кислого микроокружения органеллы, с подавлением естественного падения рН в лизосоме. Это приводит к аномальному притоку протонов и прочих ионов, а также воды, что способствует набуханию и разрушению клеточной органеллы, а также высвобождению ее содержимого в цитоплазму [20,21]. Эффективность проникновения подобных систем высока, потому разработки pH-чувствительных систем развиваются с каждым годом.

Природные полимеры, в особенности биоразлагаемые, также являются привлекательными для создания систем доставки лекарств. Биосовместимость, невысокая стоимость производства, наличие функциональных групп, возможность варьирования структуры и физико-химических свойств за счет модификации являются несомненными преимуществами таких материалов [22]. Выбор природы и структуры полимера позволяет задавать физико-химические и биологические свойства получаемых наноконтейнеров, а именно размер частиц, стабильность, способность связывать лекарственные вещества различной природы, функционализации поверхности и т.д. Природные полимеры, используемые для генной терапии, включают хитозан, коллаген, желатин и их производные. В литературе наиболее распространены полимерные системы на основе хитозана, а также сочетания хитозана с природными или синтетическими полианионами. Хитозан проявляет чувствительность к изменению pH в физиологическом диапазоне значений благодаря существенному протонированию/ депротонированию аминогрупп при физиологических значениях pH (р^ = 6.0-6.5) [23].

Принимая во внимание высокий потенциал полимерных биодеградируемых частиц на основе полиаминокислот, а также на основе сочетания полиаминокислот с полисахаридами в качестве основы для систем доставки лекарств, создание стимул-чувствительных полимерных наноконтейнеров и исследование влияния химического состава и молекулярно-массовых характеристик, а также соотношения положительных и отрицательных зарядов звеньев и гидрофобно-гидрофильного баланса полимера на размер и поверхностный заряд формирующихся частиц, их стабильность к агрегации в физиологических условиях, способность инкапсулировать и высвобождать терапевтические нуклеиновые кислоты под действием внешних факторов, а также

способность эффективно транспортировать лекарственные вещества в клетки и ткани является актуальной проблемой, решение которой даст возможность получить новые лекарственные формы для лечения широкого спектра наследственных и приобретенных заболеваний, в рамках генной терапии.

Цель настоящей работы - синтез и изучение свойств новых биодеградируемых сополимеров на основе а-аминокислот, а также их сополимеров с полисахаридами, для создания систем доставки нуклеиновых кислот (миРНК/ДНК) с улучшенной биодоступностью и эффективностью действия, в том числе за счет обеспечения быстрого стимул-индуцированного высвобождения.

Достижение поставленной цели включало в себя решение следующих задач:

• Синтез новых амфифильных статистических сополимеров на основе а-аминокислот, содержащих катионные, анионные, и гидрофобные аминокислоты в полипептидной цепи, а также получение наноразмерных частиц на их основе;

• Дизайн и синтез полипептидов, чувствительных к изменению рН в физиологическом диапазоне, а также формирование наночастиц на их основе;

• Стабилизация полимерных частиц дисульфиными связями, а также исследование стабильности полученных структур;

• Разработка и оптимизация состава и структуры интерполиэлектролитных комплексов на основе графт-сополимеров, состоящих из полисахаридов и полиаминокислот, а также разработка методов получения наночастиц на их основе;

• Изучение особенностей инкапсулирования нуклеиновых кислот (миРНК/ДНК) и исследование профилей их высвобождения из полимерных частиц;

• Изучение внутриклеточного проникновения, цитотоксичности и биологической активности полученных лекарственных наноформуляций;

Методы исследования:

• Для синтеза и модификации полиаминокислот использовался метод полимеризации с раскрытием цикла ^ОР) К-карбоксиангидридов а-аминокислот, получение графт-сополимеров проводилось методом азид-алкинового 1,3-диполярного циклоприсоединения;

• Для установления состава, структуры и молекулярно-массовых характеристик синтезированных полимеров использовались методы ЯМР-спектроскопии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), статического рассеяния света

(СРС), эксклюзионная жидкостная хроматография (ЭЖХ) и инфракрасная спектроскопия;

• Для исследования физико-химических характеристик сформированных полимерных частиц, изучения их устойчивости к агрегации и исследования их чувствительности к различным стимулам применялись методы динамического рассеяния света (ДРС), анализа траектории наночастиц (АТЧ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ);

• Качественный и количественный анализ инкапсулированных нуклеиновых кислот проводили методами гель-электрофореза в слое агарозы и спектрофотометрии в УФ- и видимой области;

• Для определения биологических свойств исследуемых материалов использовались методы анализа цитотоксичности частиц, флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

• Для оценки безопасности наночастиц и биологической активности исследуемых наноформуляций применялись флуоресцентная микроскопия и анализ цитотоксичности частиц. Повышение концентраций РНК, выделенной в исследованиях РНК-интерференции, проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Визуализация процесса эндоцитоза проводилась с использованием метода конфокальной микроскопии.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые:

• Методом полимеризации с раскрытием цикла осуществлен синтез новых амфифильных статистических сополимеров, включающих в свой состав одновременно катионные, анионные и гидрофобные ¿-аминокислоты;

• Предложен способ синтеза новых полимерных pН-чувствительных амфифильных полипептидов, сшитых дисульфидными связями, с целью повышения стабильности частиц в условиях циркуляции в кровотоке;

• Разработан и оптимизирован способ получения новых графт-сополимеров на основе полисахаридов и гомополимеров аминокислот;

• Исследовано формирование наночастиц на основе различных сополимеров, установлена взаимосвязь между составом полимера и физико-химическими характеристиками частиц;

• Получены и систематизированы научные представления о влиянии включения анионных фрагментов (глутаминовая кислота) и стимул-чувствительных компонентов (гистидин) на инкапсулирование и высвобождение нуклеиновых кислот из полиплексов в различных условиях;

• Получены доказательства принципиальной возможности применения полученных полимерных частиц в качестве систем доставки нуклеиновых кислот.

Практическая значимость работы:

• Полученные амфифильные статистические полипептиды и частицы на их основе перспективны для использования в качестве систем доставки нуклеиновых кислот за счет их относительно малых размеров, высокой эффективности инкапсулирования нуклеиновых кислот и низкой цитотоксичности носителей, что позволяет расширить возможности генной терапии;

• Разработанные рН-чувствительные полипептидные системы, содержащие гистидин, в комплексе с миРНК способны проникать в клетки и эффективно высвобождать генетический материал под воздействием внутриклеточного изменения рН в процессе эндоцитоза, сохраняя биологическую активность нуклеиновых кислот. Благодаря повышенной эффективности проникновения внутрь клеток, требуется небольшое количество носителя для успешной терапии, что уменьшает риски побочных процессов при клиническом применении;

• Синтезированные высокомолекулярные графт-сополимеры на основе полисахаридов (хитозан, гепарин) и полиаминокислот (поли(^-лизин) и поли(£-глутаминовая кислота)) способны эффективно связывать плазмидные ДНК и переносить в клетки, что может быть применено для инициирования биосинтеза определенных белков в клетках пациента. Благодаря биодеградации всех компонентов сополимеров, такие системы являются безопасными и могут быть использованы для лечения различных генетических заболеваний.

Обоснованность и достоверность результатов и выводов настоящей работы обеспечивается применением современных методов синтеза и анализа полимеров, а также получения и изучения полимерных частиц и комплексов с нуклеиновыми кислотами на их основе; подтверждается высокой воспроизводимостью результатов и их соответствием имеющимся литературным данным, а также согласованностью полученных результатов при использовании независимых методов исследования.

Положения, выносимые на защиту:

• Использование метода полимеризации с раскрытием цикла N карбоксиангидридов а-аминокислот, а также метода азид-алкинового 1,3-диполярного циклоприсоединения для создания графт-сополимеров на основ полисахаридов и полиаминокислот дает возможность получать узкодисперсные сополимеры различного состава;

• Варьирование химической структуры полимеров (содержание аминокислот, гидрофильно-гидрофобный баланс, баланс положительно и отрицательно заряженных звеньев), а также условий формирования (рН раствора) позволяет регулировать гидродинамические размеры самоорганизованных структур;

• Включение гистидина, обладающего чувствительностью к pH в физиологическом диапазоне, в состав полимеров на основе лизина, глутаминовой кислоты и фенилаланина позволяет уменьшить цитотоксичность полимерных наночастиц, существенно повысить эффективность внутриклеточной доставки генетических конструкций и обеспечить их успешное внутриклеточное высвобождение;

• Частичная ковалентная сшивка цепей полиаминокислот дисульфидными связями в составе наночастиц позволяет получить более высокую устойчивость полимерных систем к агрегации в среде, содержащей белки, по сравнению с исходными сополимерами;

• Использование сочетания противоположных по заряду полиаминокислот и полисахаридов дает возможность формировать интерполиэлектролитные комплексы высокой молекулярной массы, способные эффективно связывать молекулы ДНК и эффективно транспортировать их внутрь клеток;

• Включение в полимер конкурентных анионных фрагментов и стимул-чувствительных компонентов увеличивает стабильность полимерных частиц, позволяет контролировать скорость высвобождения инкапсулированных биомолекул и повышает эффективность внутриклеточного высвобождения генетических конструкций;

• Перспективность применения полученных полимерных наночастиц на основе синтетических полиаминокислот, а также их гибридных графт-сополимеров с природными полисахаридами в качестве стимул-чувствительных систем доставки лекарств нуклеиновых кислот определяется отсутствием цитотоксичности, высоким уровнем загрузки инкапсулируемых веществ, способностью быстро и контролируемо

высвобождать лекарство под действием внешнего стимула и способностью эффективно проникать в клетки.

Апробация результатов. Основные результаты научной работы были представлены на российских и международных конференциях и симпозиумах: International Student Conference "Science and Progress" (Санкт-Петербург, 2021), VII Международная конференция Молекулярные и биологические аспекты химии, фармацевтики и фармакологии (Москва, 2021), XI, XII International Conference on Chemistry for Young Scientists «Mendeleev 2021» (Санкт-Петербург, 2019, 2021), Первая всероссийская школа для молодых ученых по медицинской химии «MEDCHEMSCHOOL 2021» (Новосибирск, 2021), 6-ая Междисциплинарная конференция «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии» (Нижний Новгород, 2020), 14th, 15th International Saint Petersburg Conference of Young Scientists «Modern problems of polymer science» (Санкт-Петербург, 2018, 2019), Международный конгресс молодых ученых в фармации «Drag Research» (Казань, 2019), Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии (Крым, 2019), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2019» (Москва, 2019).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в международных рецензируемых журналах, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus и РИНЦ, а также тезисы 13 докладов.

Личный вклад автора состоял в непосредственном участии на всех этапах работы: постановке цели и задач, выполнении всех экспериментальных исследований, комплексном анализе, интерпретации и обобщении полученных результатов, а также подготовке докладов для конференций и публикаций в международных журналах.

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Образовательном Учреждении Высшего Образования «Санкт-Петербургский Государственный Университет» (Институт Химии, кафедра медицинской химии) с использованием оборудования и ресурсов Научного парка Санкт-Петербургского Государственного Университета, а именно ресурсных центров: Магнитно-резонансные методы исследования, Криогенный отдел, Методы анализа состава вещества, Развитие молекулярных и клеточных технологий.

Работа была поддержана грантами РФФИ (20-33-90181), РНФ (19-73-10045), Министерства науки и высшего образования РФ (мегагрант 14^.03.31.0025).

Проведение экспериментов с культурами клеток осуществлялось во время стажировок в Институте технической химии университета Лейбница (Ганновер, Германия) и в Восточном универстете Финляндии (Куопио, Финляндия).

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов, списка используемой литературы (214 наименований). Работа изложена на 179 страницах и включает 18 таблиц и 59 рисунков. Текст диссертационной работы включает фрагменты текста выпускной квалификационной работы соискателя, выполненной в рамках программы подготовки научно-педагогических кадров в аспирантуре СПбГУ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Системы доставки лекарств на основе полимерных наночастиц

Разработка безопасных систем контролируемой внутриклеточной доставки лекарств представляет собой востребованное направление современной науки. За последние десятилетия активно развивалась сфера создания и практического применения в медицине различных микро- и наноразмерных носителей на основе полимеров. Использование систем контролируемой доставки терапевтических субстанций дает множество преимуществ, таких как увеличение биодоступности лекарства, регулирование скорости высвобождения и повышении концентрации действующего вещества в целевом органе, снижение системной токсичности и побочных эффектов, а также обеспечение устойчивости биомолекул по отношению к химической и ферментативной деградации.

Среди множества потенциальных материалов полимеры занимают одну из лидирующих позиций в качестве носителей лекарственных веществ благодаря широкому спектру природных и синтетических полимеров с разнообразными физико-химическими характеристиками. Полимерные наночастицы могут иметь различную морфологию, например, наносферы, нанокапсулы, мицеллы, наногели, полимеросомы и полиплексы (Рисунок 1) [24]. Структура наночастиц и их способ получения зависят от свойств используемого (конкретного) полимера и лекарства, загружаемого в полимерные носители.

Рисунок 1. Схематичное изображение полимерных частиц: наносферы полимерные визикулы (полимеросомы) (б), мицеллы (в) и липосомы (г) [24].

липидныи бислой

(а) (б) (в) (г)

Наноразмерные системы обладают такими исключительными свойствами, как преодоление биологических барьеров (например, гематоэнцефалического барьера), стабильность, высокая биодоступность, малая токсичность [25], способность

взаимодействовать с определенными рецепторами на поверхности клеток за счет модификации векторными молекулами [26], накопление частиц с лекарственной субстанцией в паталогических тканях, длительное время циркуляции и снижение побочных эффектов от лекарств [27]. Полимерные наночастицы являются чрезвычайно привлекательными материалами для применения в контролируемой доставке лекарств благодаря особым химическим и физическим свойствам. Варьируя гидрофильно-гидрофобный баланс полимера, его поверхностную модификацию, гибкость/жесткость макромолекул, обуславливающих конформационные особенности полимерных цепей, кристалличность/аморфность или плотность сшивки, можно обеспечить контролируемое высвобождение терапевтической субстанции, чувствительность к внешним стимулам, задавать скорость биодеградации и снижать токсические эффекты [25,28]. Также, полимерные частицы на основе заряженных полимеров способны компактизовать крупные биомолекулы, например плазмидную ДНК или матричную РНК, длина которых достигает десятков тысяч азотистых оснований. Формирование интерполиэлектролитных комплексов полимер-нуклеиновая кислота обеспечивает успешную доставку нуклеиновой кислоты в клетку путем пассивного или рецептор-опосредованного эндоцитоза полученных наносистем, а также контролируемое высвобождение генетического материала во внутриклеточном пространстве [25]. Кроме того, наночастицы обладают большой удельной поверхностью, которая обеспечивает высокую загрузку лекарственного вещества [29].

1.2. Системы доставки нуклеиновых кислот

1.2.1 Типы систем доставки нуклеиновых кислот и способы их получения

Нуклеиновые кислоты являются универсальными генетическими строительными блоками, которые кодируют белки и выполняют ключевые функции по хранению, передаче и реализации генетической информации. Генная терапия - это метод лечения генетических заболеваний путем переноса одной или нескольких терапевтических нуклеиновых кислот в клетки пациента с целью коррекции или замены дефектного гена. Такая терапия дает возможность лечить широкий спектр заболеваний на транскрипционном и трансляционном уровне [11,30,31].

В состав нуклеиновых кислот входят азотистые основания (аденин, цитозин, гуанин, тимин и урацил), связанные с остатками простых сахаров (рибоза и

дезоксирибоза), а также с остатками фосфорной кислоты. Фосфатные группы придают существенный отрицательный заряд нуклеиновым кислотам, размер которых варьируется от 20 нуклеотидов до более чем 5000 пар оснований. Наиболее часто используемыми терапевтическими субстанциями являются различные виды рибонуклеиновых (РНК) и дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК).

Поскольку нуклеиновые кислоты в свободной форме нестабильны, быстро захватываются макрофагами и разлагаются нуклеазами, присутствующими во внеклеточных матриксах, а также с затруднениями проходят через клеточные мембраны, для их эффективного использования в медицине требуются специально сконструированные системы доставки (Рисунок 2). Носители нуклеиновых кислот должны быть биосовместимыми, биоразлагаемыми и обладать подходящим сочетанием химико-физических свойств, таких как заряд, размер, стабильность и возможность функционализации. В зависимости от типа нуклеиновых кислот конечной точкой их доставки будет являться цитоплазма (для РНК) или ядро клетки (для ДНК), проникновение в которое также имеет определенные барьеры.

В литературе выделяют два основных типа систем доставки нуклеиновых кислот: вирусные векторы и системы невирусной доставки. В свою очередь, последние подразделяются на липидные и полимерные наночастицы (Рисунок 2). Наиболее изученной группой являются вирусы. На протяжении столетий они естественным образом эволюционировали и эффективно доставляли нуклеиновые кислоты в цитозоль или ядро клеток-хозяев [32]. Вирусы отличаются очень высокой проникающей способностью в различные клетки любых организмов, поэтому они одни из первых привлекли внимание в качестве основы для доставки нуклеиновых кислот. Основными преимуществами вирусных векторов являются возможность эффективного транспорта геномов внутрь клетки без существенного негативного влияния на жизнеспособность клеток, интеграция целевого гена в заданную мишень, сильная и устойчивая экспрессия гена. Несмотря на это, применение вирусных векторов сопряжено с рядом ограничений, таких как продолжительные иммунные реакции у пациентов, невозможность повторного использования вирусного вектора ввиду его распознавания иммунной системой, а также ограниченная загрузка нуклеиновых кислот в вирусный вектор (до 5000 пар оснований) [33]. Указанные проблемы стимулировали поиск новых

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Коровкина Ольга Михайловна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1] A.J. Gavasane, Synthetic Biodegradable Polymers Used in Controlled Drug Delivery System: An Overview, Clin. Pharmacol. Biopharm. 3 (2014). https://doi.org/10.4172/2167-065x.1000121.

[2] E. Blanco, H. Shen, M. Ferrari, Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery, Nat. Biotechnol. 33 (2015) 941-951. https://doi.org/10.1038/nbt.3330.

[3] G. Pietersz, C.-K. Tang, V. Apostolopoulos, Structure and Design of Polycationic Carriers For Gene Delivery, Mini-Reviews Med. Chem. 6 (2006) 1285-1298. https://doi.org/10.2174/138955706778992987.

[4] P. Zhang, E. Wagner, History of Polymeric Gene Delivery Systems, Top. Curr. Chem. 375 (2017) 1-39. https://doi.org/10.1007/s41061-017-0112-0.

[5] I.M.S. Degors, C. Wang, Z.U. Rehman, I.S. Zuhorn, Carriers break barriers in drug delivery: endocytosis and endosomal escape of gene delivery vectors, Acc. Chem. Res. 52 (2019) 1750-1760. https://doi.org/10.1021/acs.accounts.9b00177.

[6] U.A. Ashfaq, M. Riaz, E. Yasmeen, M. Yousaf, Recent advances in nanoparticle-based targeted drug-delivery systems against cancer and role of tumor microenvironment, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 34 (2017) 317-353.

https://doi.org/10.1615/CritRevTherDrugCarrierSyst.2017017845.

[7] H. Bermudez, A.K. Brannan, D.A. Hammer, F.S. Bates, D.E. Discher, Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability, Macromolecules. 35 (2002) 8203-8208. https://doi.org/10.1021/ma020669l.

[8] J. Karlsson, H.J. Vaughan, J.J. Green, Biodegradable polymeric nanoparticles for therapeutic cancer treatments, Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 9 (2018) 105-127. https://doi.org/10.1146/annurev-chembioeng-060817-084055.

[9] A. Karabasz, M. Bzowska, K. Szczepanowicz, Biomedical applications of multifunctional polymeric nanocarriers: A review of current literature, Int. J. Nanomedicine. 15 (2020) 8673-8696. https://doi.org/10.2147/IJN.S231477.

[10] Z. Song, Z. Han, S. Lv, C. Chen, L. Chen, L. Yin, J. Cheng, Synthetic polypeptides: From polymer design to supramolecular assembly and biomedical application, Chem. Soc. Rev. 46 (2017) 6570-6599. https://doi.org/10.1039/c7cs00460e.

[11] T. Ahmadzada, G. Reid, D.R. McKenzie, Fundamentals of siRNA and miRNA therapeutics and a review of targeted nanoparticle delivery systems in breast cancer, Biophys. Rev. 10 (2018) 69-86. https://doi.org/10.1007/s12551-017-0392-1.

[12] D.L. McKenzie, K.Y. Kwok, K.G. Rice, A potent new class of reductively activated peptide gene delivery agents, J. Biol. Chem. 275 (2000) 9970-9977. https://doi.org/10.1074/jbc.275.14.9970.

[13] A.I.S. van den Berg, C.O. Yun, R.M. Schiffelers, W.E. Hennink, Polymeric delivery systems for nucleic acid therapeutics: Approaching the clinic, J. Control. Release. 331

(2021) 121-141. https://doi.Org/10.1016/j.jconrel.2021.01.014.

[14] A. Rafiee, M.H. Alimohammadian, T. Gazori, F. Riazi-rad, S.M.R. Fatemi, A. Parizadeh, I. Haririan, M. Havaskary, Comparison of chitosan, alginate and chitosan/alginate nanoparticles with respect to their size, stability, toxicity and transfection, Asian Pacific J. Trop. Dis. 4 (2014) 372-377. https://doi.org/10.1016/S2222-1808(14)60590-9.

[15] A. Almalik, R. Donno, C.J. Cadman, F. Cellesi, P.J. Day, N. Tirelli, Hyaluronic acid-coated chitosan nanoparticles: Molecular weight-dependent effects on morphology and hyaluronic acid presentation, J. Control. Release. 172 (2013) 1142-1150. https://doi.org/10.1016/joconrel.2013.09.032.

[16] K.L. Douglas, C.A. Piccirillo, M. Tabrizian, Effects of alginate inclusion on the vector properties of chitosan-based nanoparticles, J. Control. Release. 115 (2006) 354-361. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2006.08.021.

[17] W. Agut, R. Agnaou, S. Lecommandoux, D. Taton, Synthesis of block copolypeptides by click chemistry, Macromol. Rapid Commun. 29 (2008) 1147-1155. https://doi.org/10.1002/marc.200800123.

[18] P. Erbacher, A.C. Roche, M. Monsigny, P. Midoux, The reduction of the positive charges of polylysine by partial gluconoylation increases the transfection efficiency of polylysine/DNA complexes, Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1324 (1997) 27-36. https://doi.org/10.1016/S0005-2736(96)00204-0.

[19] I. Pilipenko, V. Korzhikov-Vlakh, V. Sharoyko, N. Zhang, M. Schafer-Korting, E. Ruhl, C. Zoschke, T. Tennikova, pH-sensitive chitosan-heparin nanoparticles for effective delivery of genetic drugs into epithelial cells, Pharmaceutics. 11 (2019). https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11070317.

[20] D.S.W. Benoit, W. Gray, N. Murthy, H. Li, C.L. Duvall, pH-Responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs, Compr. Biomater. II. 4 (2017) 472-492. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100691 -7.00019-7.

[21] T. Hayashi, M. Shinagawa, T. Kawano, T. Iwasaki, Drug delivery using polyhistidine peptide-modified liposomes that target endogenous lysosome, Biochem. Biophys. Res. Commun. 501 (2018) 648-653. https://doi.org/10.1016Zj.bbrc.2018.05.037.

[22] Z. Shariatinia, Big family of nano- and microscale drug delivery systems ranging from inorganic materials to polymeric and stimuli-responsive carriers as well as drug-conjugates, J. Drug Deliv. Sci. Technol. 66 (2021) 102790.

https://doi.org/10.1016/j.jddst.2021.102790.

[23] N.M. Alves, J.F. Mano, Chitosan derivatives obtained by chemical modifications for biomedical and environmental applications, Int. J. Biol. Macromol. 43 (2008) 401-414. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2008.09.007.

[24] H. Lu, S. Zhang, J. Wang, Q. Chen, A Review on Polymer and Lipid-Based Nanocarriers and Its Application to Nano-Pharmaceutical and Food-Based Systems, Front. Nutr. 8 (2021) 1-13. https://doi.org/10.3389/fnut.2021.783831.

[25] L.H. Madkour, Nanoparticle and polymeric nanoparticle-based targeted drug delivery systems, 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-819777-6.00013-5.

[26] A. Zielinska, F. Carreiro, A.M. Oliveira, A. Neves, B. Pires, D. Nagasamy Venkatesh, A. Durazzo, M. Lucarini, P. Eder, A.M. Silva, A. Santini, E.B. Souto, Polymeric Nanoparticles: Production, Characterization, Toxicology and Ecotoxicology, Molecules. 25 (2020). https://doi.org/10.3390/molecules25163731.

[27] Z. Shariatinia, K. Fasihozaman-Langroodi, Biodegradable Polymer Nanobiocomposite Packaging Materials, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-816683-3.00008-6.

[28] Z. Shariatinia, Pharmaceutical applications of natural polysaccharides, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-817055-7.00002-9.

[29] M. Haider, K.Z. Zaki, M.R. El Hamshary, Z. Hussain, G. Orive, H.O. Ibrahim, Polymeric nanocarriers: A promising tool for early diagnosis and efficient treatment of colorectal cancer, J. Adv. Res. (2021). https://doi.org/10.1016/joare.2021.11.008.

[30] A. Gupta, J.L. Andresen, R.S. Manan, R. Langer, Nucleic acid delivery for therapeutic applications, Adv. Drug Deliv. Rev. 178 (2021) 113834.

https://doi.org/10.1016/j.addr.2021.113834.

[31] J.C. Kaczmarek, P.S. Kowalski, D.G. Anderson, Advances in the delivery of RNA therapeutics: From concept to clinical reality, Genome Med. 9 (2017) 1-16. https://doi.org/10.1186/s13073-017-0450-0.

[32] L.S. Young, P.F. Searle, D. Onion, V. Mautner, Viral gene therapy strategies: From basic science to clinical application, J. Pathol. 208 (2006) 299-318. https://doi.org/10.1002/path.1896.

[33] M.A. Kotterman, D. V. Schaffer, Engineering adeno-associated viruses for clinical gene therapy, Nat. Rev. Genet. 15 (2014) 445-451. https://doi.org/10.1038/nrg3742.

[34] A.A. Mikheev, E. V. Shmendel, E.S. Zhestovskaya, G. V. Nazarov, M.A. Maslov, Cationic Liposomes As Delivery Systems for Nucleic Acids, Fine Chem. Technol. 15 (2020) 7-27. https://doi.org/10.32362/2410-6593-2020-15-1-7-27.

[35] J. Li, C. Cai, J. Li, J. Li, J. Li, T. Sun, L. Wang, H. Wu, G. Yu, Chitosan-based nanomaterials for drug delivery, Molecules. 23 (2018) 1-26. https://doi.org/10.3390/molecules23102661.

[36] Z. Shariatinia, M. Fazli, Mechanical properties and antibacterial activities of novel nanobiocomposite films of chitosan and starch, Food Hydrocoll. 46 (2015) 112-124. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2014.12.026.

[37] Y. Feng, W. Xia, Preparation, characterization and antibacterial activity of water-soluble O-fumaryl-chitosan, Carbohydr. Polym. 83 (2011) 1169-1173. https://doi.org/10.1016/jxarbpol.2010.09.026.

[38] Y.C. Chung, C.Y. Chen, Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan, Bioresour. Technol. 99 (2008) 2806-2814.

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2007.06.044.

[39] G. Lu, L. Kong, B. Sheng, G. Wang, Y. Gong, X. Zhang, Degradation of covalently cross-linked carboxymethyl chitosan and its potential application for peripheral nerve regeneration, Eur. Polym. J. 43 (2007) 3807-3818.

https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj .2007.06.016.

[40] K. Kim, J.H. Kim, S. Kim, H. Chung, K. Choi, C.K. Ick, H.P. Jae, Y.S. Kim, R.W. Park, I.S. Kim, Y.J. Seo, Self-assembled nanoparticles of bile acid-modified glycol chitosans and their applications for cancer therapy, Macromol. Res. 13 (2005) 167-175. https://doi.org/10.1007/BF03219048.

[41] H.S. Yoo, J.E. Lee, H. Chung, I.C. Kwon, S.Y. Jeong, Self-assembled nanoparticles containing hydrophobically modified glycol chitosan for gene delivery, J. Control. Release. 103 (2005) 235-243. https://doi.org/10.1016/joconrel.2004.11.033.

[42] C. Zheng, X.G. Zhang, L. Sun, Z.P. Zhang, C.X. Li, Biodegradable and redox-responsive chitosan/poly(L-aspartic acid) submicron capsules for transmucosal delivery of proteins and peptides, J. Mater. Sci. Mater. Med. 24 (2013) 931-939. https://doi.org/10.1007/s10856-013-4863-z.

[43] I.Y. Tsai, C.C. Kuo, N. Tomczyk, S.J. Stachelek, R.J. Composto, D.M. Eckmann, Human macrophage adhesion on polysaccharide patterned surfaces, Soft Matter. 7 (2011) 3599-3606. https://doi.org/10.1039/c0sm01353f.

[44] A. George, P.A. Shah, P.S. Shrivastav, Natural biodegradable polymers based nano-formulations for drug delivery: A review, Int. J. Pharm. 561 (2019) 244-264. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2019.03.011.

[45] F.E. Farber, J.L. Melnick, J.S. Butel, Optimal conditions for uptake of exogenous DNA by chinese hamster lung cells deficient in hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, BBA Sect. Nucleic Acids Protein Synth. 390 (1975) 298311. https://doi.org/10.1016/0005-2787(75)90350-0.

[46] E. Ramsay, J. Hadgraft, J. Birchall, M. Gumbleton, Examination of the biophysical interaction between plasmid DNA and the polycations, polylysine and polyornithine, as a basis for their differential gene transfection in-vitro, Int. J. Pharm. 210 (2000) 97-107. https://doi.org/10.1016/S0378-5173(00)00571 -8.

[47] J.C. Roberts, M.K. Bhalgat, R.T. Zera, Preliminary biological evaluation of polyamidoamine (PAMAM) Starburst™ dendrimers, J. Biomed. Mater. Res. 30 (1996) 53-65. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-4636(199601)30:1<53::AID-JBM8>3.0.C0;2-Q.

[48] L. Wightman, R. Kircheis, V. Rössler, S. Garotta, R. Ruzicka, M. Kursa, E. Wagner, Different behavior of branched and linear polyethylenimine for gene delivery in vitro and in vivo, J. Gene Med. 3 (2001) 362-372. https://doi.org/10.1002/jgm.187.

[49] C.F. Jones, R.A. Campbell, A.E. Brooks, S. Assemi, S. Tadjiki, G. Thiagarajan, C. Mulcock, A.S. Weyrich, B.D. Brooks, H. Ghandehari, D.W. Grainger, Cationic PAMAM Dendrimers Disrupt Key Platelets Functions, ACS Nano. 6 (2012) 9900-9910.

[50] K. Itaka, A. Harada, Y. Yamasaki, K. Nakamura, H. Kawaguchi, K. Kataoka, In situ single cell observation by fluorescence resonance energy transfer reveals fast intra-cytoplasmic delivery and easy release of plasmid DNA complexed with linear polyethylenimine, J. Gene Med. 6 (2004) 76-84. https://doi.org/10.1002/jgm.470.

[51] S.K. Prajapati, A. Jain, A. Jain, S. Jain, Biodegradable polymers and constructs: A novel approach in drug delivery, Eur. Polym. J. 120 (2019) 109191.

https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj .2019.08.018.

[52] P. Jana, M. Shyam, S. Singh, V. Jayaprakash, A. Dev, Biodegradable polymers in drug delivery and oral vaccination, Eur. Polym. J. 142 (2021) 110155. https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj .2020.110155.

[53] P. Rai, S. Mehrotra, S. Priya, E. Gnansounou, S.K. Sharma, Recent advances in the sustainable design and applications of biodegradable polymers, Bioresour. Technol. 325 (2021) 124739. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124739.

[54] E. Liarou, S. Varlas, D. Skoulas, C. Tsimblouli, E. Sereti, K. Dimas, H. Iatrou, Smart polymersomes and hydrogels from polypeptide-based polymer systems through a-amino acid N-carboxyanhydride ring-opening polymerization. From chemistry to biomedical applications, Prog. Polym. Sci. 83 (2018) 28-78.

https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2018.05.001.

[55] T.J. Deming, Synthetic polypeptides for biomedical applications, Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 858-875. https://doi.org/10.1016/j .progpolymsci.2007.05.010.

[56] K. Bauri, M. Nandi, P. De, Amino acid-derived stimuli-responsive polymers and their applications, Polym. Chem. 9 (2018) 1257-1287. https://doi.org/10.1039/c7py02014g.

[57] D.T. Auguste, K. Furman, A. Wong, J. Fuller, S.P. Armes, T.J. Deming, R. Langer, Triggered release of siRNA from poly(ethylene glycol)-protected, pH-dependent liposomes, J. Control. Release. 130 (2008) 266-274. https://doi.org/10.1016Zj.jconrel.2008.06.004.

[58] Z. Yang, J. Yuan, S. Cheng, Self-assembling of biocompatible BAB amphiphilic triblock copolymers PLL(Z)-PEG-PLL(Z) in aqueous medium, Eur. Polym. J. 41 (2005) 267274. https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj.2004.09.023.

[59] H. Gao, G. Li, Z. Hu, Z. Xiao, G. Liang, Q. Wu, Synthesis of amphiphilic polyethylene-b-poly(l-glutamate) block copolymers with vastly different solubilities and their stimuli-responsive polymeric micelles in aqueous solution, Polymer (Guildf). 55 (2014) 45934600. http s://doi.org/10.1016/j.polymer.2014.07.019.

[60] Y. Xia, J. Tian, X. Chen, Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery, Biomaterials. 79 (2016) 56-68. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.11.056.

[61] H. Kukula, H. Schlaad, M. Antonietti, S. Förster, The formation of polymer vesicles or "peptosomes" by polybutadiene-block-poly(L-glutamate)s in dilute aqueous solution, J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 1658-1663. https://doi.org/10.1021/ja012091l.

[62] D.M.M. Jaradat, Thirteen decades of peptide synthesis: key developments in solid phase peptide synthesis and amide bond formation utilized in peptide ligation, Amino Acids.

50 (2018) 39-68. https://doi.org/10.1007/s00726-017-2516-0.

[63] R.B. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) 2149-2154. https://doi.org/10.1021/ja00897a025.

[64] F. Albericio, A. Isidro-llobet, A. Mercedes, Review Amino acid protecting, Chem. Rev. 109 (2009)2455-2504.

[65] O. Al Musaimi, Y.E. Jad, A. Kumar, J.M. Collins, A. Basso, B.G. de la Torre, F. Albericio, Investigating green ethers for the precipitation of peptides after global deprotection in solid-phase peptide synthesis, Curr. Opin. Green Sustain. Chem. 11 (2018) 99-103. https://doi.org/10.1016/jxogsc.2018.06.017.

[66] R. Behrendt, P. White, J. Offer, Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis, J. Pept. Sci. 22 (2016) 4-27. https://doi.org/10.1002/psc.2836.

[67] a-Amino acid N-carboxyanhydride (NCA)-derived synthetic.pdf, (n.d.).

[68] A. Rasines Mazo, S. Allison-Logan, F. Karimi, N.J.A. Chan, W. Qiu, W. Duan, N.M. O'Brien-Simpson, G.G. Qiao, Ring opening polymerization of a-amino acids: Advances in synthesis, architecture and applications of polypeptides and their hybrids, Chem. Soc. Rev. 49 (2020) 4737-4834. https://doi.org/10.1039/c9cs00738e.

[69] X. Tao, M.H. Li, J. Ling, a-Amino acid N-thiocarboxyanhydrides: A novel synthetic approach toward poly( a-amino acid)s, Eur. Polym. J. 109 (2018) 26-42. https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj .2018.08.039.

[70] H. Leuchs, Ueber die Glycin-carbonsäure, Berichte Der Dtsch. Chem. Gesellschaft. 39 (1906) 857-861.

[71] F. Fuchs, Über N-Carbonsäure-anhydride, Eur. J. Inorg. Chem. 55 (1922) 2943-2943. https://doi.org/10.1016/jxopsyc.2017.04.017.

[72] A.C. Farthing, Synthetic Polypeptides. Part I . 3213 627. Synthetic Polypeptides. Part, J. Chem. Soc. resumed (1950) 3213-3217.

[73] W.H. Daly, D. Poché, The preparation of N-carboxyanhydrides of a-amino acids using bis(trichloromethyl)carbonate, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5859-5862. https://doi.org/10.1016/S0040-4039(00)82209-1.

[74] T.E. KOICHI KOGA, ATSUSHI SUDO, Revolutionary Phosgene-Free Synthesis of a-Amino Acid N-Carboxyanhydrides Using Diphenyl Carbonate Based on Activation of a-Amino Acids by Converting into Imidazolium Salts, J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 48 (2010) 4351-4355. https://doi.org/10.1002/pola.

[75] T.E. YUKIHIRO FUJITA, KOICHI KOGA, HYUN-KYOUNG KIM, XIAO-SHUI WANG, ATSUSHI SUDO, HARUO NISHIDA, Phosgene-Free Synthesis of N-Carboxyanhydrides of a-Amino Acids Based on Bisarylcarbonates as Starting Compounds, J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 45 (2007) 5365-5369. https://doi.org/10.1002/pola.

[76] Z.L. Zhao Zhang, Kunmei Su, Carboxylic Anhydride Synthesis from

y-Benzyl-L-glutamate and.pdf, Org. Lett. 21 (2019) 749-752.

[77] I. Dimitrov, H. Schlaad, Synthesis of nearly monodisperse polystyrene-polypeptide block copolymers via polymerisation of N-carboxyanhydrides, Chem. Commun. 3 (2003) 2944-2945. https://doi.org/10.1039/b308990h.

[78] M. Barz, A. Duro-Castano, M.J. Vicent, A versatile post-polymerization modification method for polyglutamic acid: Synthesis of orthogonal reactive polyglutamates and their use in "click chemistry," Polym. Chem. 4 (2013) 2989-2994.

https://doi.org/10.1039/c3py00189j.

[79] X. Zhang, M. Oddon, O. Giani, S. Monge, J.J. Robin, Novel strategy for ROP of NCAs using thiols as initiators: Synthesis of diblock copolymers based on polypeptides, Macromolecules. 43 (2010) 2654-2656. https://doi.org/10.1021/ma9025916.

[80] H. Lu, J. Cheng, Hexamethyldisilazane-mediated controlled polymerization of a-amino acid N-carboxyanhydrides, J. Am. Chem. Soc. 129 (2007) 14114-14115. https://doi.org/10.1021/ja074961q.

[81] H. Lu, J. Cheng, N-trimethylsilyl amines for controlled ring-opening polymerization of amino acid N-carboxyanhydrides and facile end group functionalization of polypeptides, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008) 12562-12563. https://doi.org/10.1021/ja803304x.

[82] H. Peng, J. Ling, Y. Zhu, L. You, Z. Shen, Polymerization of a-amino acid N-carboxyanhydrides catalyzed by rare earth tris(borohydride) complexes: Mechanism and hydroxy-endcapped polypeptides, J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 50 (2012) 30163029. https://doi.org/10.1002/pola.26077.

[83] G.J.M. Habraken, M. Peeters, C.H.J.T. Dietz, C.E. Koning, A. Heise, How controlled and versatile is N-carboxy anhydride (NCA) polymerization at 0 °C? Effect of temperature on homo-, block- and graft (co)polymerization, Polym. Chem. 1 (2010) 514-524. https://doi.org/10.1039/b9py00337a.

[84] J. Cheng, T.J. Deming, Synthesis of polypeptides by ring-opening polymerization of a-Amino acid N-carboxyanhydrides, Top. Curr. Chem. 310 (2012) 1-26. https://doi.org/10.1007/128_2011_173.

[85] T.J. Deming, S.A. Curtin, Chain initiation efficiency in cobalt- and nickel-mediated polypeptide synthesis, J. Am. Chem. Soc. 122 (2000) 5710-5717. https://doi.org/10.1021/ja994281q.

[86] T.J. Deming, Cobalt and iron initiators for the controlled polymerization of a-amino acid-N-carboxyanhydrides, Macromolecules. 32 (1999) 4500-4502. https://doi.org/10.1021/ma9902899.

[87] Y. Wu, D. Zhang, P. Ma, R. Zhou, L. Hua, R. Liu, Lithium hexamethyldisilazide initiated superfast ring opening polymerization of alpha-amino acid N-carboxyanhydrides, Nat. Commun. 9 (2018) 1-10. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07711-y.

[88] J. Yuan, Y. Sun, J. Wang, H. Lu, Phenyl Trimethylsilyl Sulfide-Mediated Controlled Ring-Opening Polymerization of a-Amino Acid N-Carboxyanhydrides,

Biomacromolecules. 17 (2016) 891-896. https://doi.org/10.1021/acs.biomac.5b01588.

[89] E. Katchalski, M. Sela, Synthesis and Chemical Properties of Poly-a-Amino Acids, Adv. Protein Chem. 13 (1958) 243-492. https://doi.org/10.1016/S0065-3233(08)60600-2.

[90] A. Wamsley, B. Jasti, P. Phiasivongsa, X. Li, Synthesis of random terpolymers and determination of reactivity ratios of N-carboxyanhydrides of leucine, P-benzyl aspartate, and valine, J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 42 (2004) 317-325. https://doi.org/10.1002/pola.11020.

[91] P. Studies, T. Beginning, C. Investigations, E.C. Trials, 8.14 Copaxone, (2007) 173-185.

[92] M. Fridkis-Hareli, R. Aharoni, D. Teitelbaum, R. Arnon, M. Sela, J.L. Strominger, Binding of random copolymers of three amino acids to class II MHC molecules, Int. Immunol. 11 (1999) 635-641. https://doi.org/10.1093/intimm/11.5.635.

[93] K. Yoshino, K. Nakamura, Y. Terajima, A. Kurita, T. Matsuzaki, K. Yamashita, M. Isozaki, H. Kasukawa, Comparative studies of irinotecan-loaded polyethylene glycol-modified liposomes prepared using different PEG-modification methods, Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1818 (2012) 2901-2907. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2012.07.011.

[94] K. Kita-Tokarczyk, J. Grumelard, T. Haefele, W. Meier, Block copolymer vesicles -Using concepts from polymer chemistry to mimic biomembranes, Polymer (Guildf). 46 (2005) 3540-3563. https://doi.org/10.1016/j.polymer.2005.02.083.

[95] I. Sadeghi, J. Kronenberg, A. Asatekin, Selective Transport through Membranes with Charged Nanochannels Formed by Scalable Self-Assembly of Random Copolymer Micelles, ACS Nano. 12 (2018) 95-108. https://doi.org/10.1021/acsnano.7b07596.

[96] S.J. Song, S. Lee, K.S. Ryu, J.S. Choi, Amphiphilic Peptide Nanorods Based on Oligo-Phenylalanine as a Biocompatible Drug Carrier, Bioconjug. Chem. 28 (2017) 22662276. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.7b00247.

[97] J. Zhu, H. Han, F. Li, X. Wang, J. Yu, C.C. Chu, D. Wu, Self-assembly of amino acid-based random copolymers for antibacterial application and infection treatment as nanocarriers, J. Colloid Interface Sci. 540 (2019) 634-646. https://doi.org/10.1016Zj.jcis.2018.12.091.

[98] Y. Hong, Y. Xi, J. Zhang, D. Wang, H. Zhang, N. Yan, S. He, J. Du, Polymersome-hydrogel composites with combined quick and long-term antibacterial activities, J. Mater. Chem. B. 6 (2018) 6311-6321. https://doi.org/10.1039/c8tb01608a.

[99] X. Liu, S. Su, F. Wei, X. Rong, Z. Yang, J. Liu, M. Li, Y. Wu, Construction of nanoparticles based on amphiphilic copolymers of poly(y-glutamic acid co-l-lactide)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine as a potential drug delivery carrier, J. Colloid Interface Sci. 413 (2014) 54-64. https://doi.org/10.1016/jocis.2013.09.022.

[100] Y. Yue, M. Zhao, J. Xu, Z. Yang, C. Zheng, Z. Fan, L. Cao, M. Zhang, K. Deng, Thermo-sensitive random poly(L-alanine-co-L-lactic acid) with no cytotoxicity by the structure-controlled synthesis for a nano-drug carrier, Int. J. Polym. Anal. Charact. 22 (2017) 435-446. https://doi.org/10.1080/1023666X.2017.1315480.

[101] Y. Ai, Y. Li, H.L.K. Fu, A.K.W. Chan, V.W.W. Yam, Aggregation and Tunable Color Emission Behaviors of l-Glutamine-Derived Platinum(II) Bipyridine Complexes by Hydrogen-Bonding, n-n Stacking and Metal-Metal Interactions, Chem. - A Eur. J. 25 (2019) 5251-5258. https://doi.org/10.1002/chem.201805901.

[102] K. Sutoh, H. Mori, T. Endo, Controlled radical polymerization of an acrylamide containing L-phenylalanine moiety, Polym. Prepr. Japan. 54 (2005) 180.

[103] J. Nicolas, G. Mantovani, D.M. Haddleton, Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates, Macromol. Rapid Commun. 28 (2007) 1083-1111. https://doi.org/10.1002/marc.200700112.

[104] K.R. Chaudhari, M. Ukawala, A.S. Manjappa, A. Kumar, P.K. Mundada, A.K. Mishra, R. Mathur, J. Mönkkönen, R.S. Ramchandra Murthy, Opsonization, biodistribution, cellular uptake and apoptosis study of PEGylated PBCA nanoparticle as potential drug delivery carrier, Pharm. Res. 29 (2012) 53-68. https://doi.org/10.1007/s11095-011-0510-x.

[105] X. Lin, X. He, C. Hu, Y. Chen, Y. Mai, S. Lin, Disk-like micelles with cylindrical pores from amphiphilic polypeptide block copolymers, Polym. Chem. 7 (2016) 2815-2820. https://doi.org/10.1039/c6py00152a.

[106] Z. Zhuang, C. Cai, T. Jiang, J. Lin, C. Yang, Self-assembly behavior of rod-coil-rod polypeptide block copolymers, Polymer (Guildf). 55 (2014) 602-610. https://doi.org/10.1016/j.polymer.2013.12.016.

[107] J.G. Ray, S.S. Naik, E.A. Hoff, A.J. Johnson, J.T. Ly, C.P. Easterling, D.L. Patton, D.A. Savin, Stimuli-responsive peptide-based ABA-triblock copolymers: Unique morphology transitions with pH, Macromol. Rapid Commun. 33 (2012) 819-826. https://doi.org/10.1002/marc.201100881.

[108] P. Chen, M. Qiu, C. Deng, F. Meng, J. Zhang, R. Cheng, Z. Zhong, pH-Responsive Chimaeric Pepsomes Based on Asymmetric Polyethylene glycol)-b-Poly(L-leucine)-b-Poly(L-glutamic acid) Triblock Copolymer for Efficient Loading and Active Intracellular Delivery of Doxorubicin Hydrochloride, Biomacromolecules. 16 (2015) 1322-1330. https://doi.org/10.1021/acs.biomac.5b00113.

[109] Y. Yang, J. Cai, X. Zhuang, Z. Guo, X. Jing, X. Chen, PH-dependent self-assembly of amphiphilic poly(l-glutamic acid)-block-poly(lactic-co-glycolic acid) copolymers, Polymer (Guildf). 51 (2010) 2676-2682. https://doi.org/10.1016/j.polymer.2010.04.008.

[110] K. Kumar Upadhyay, J.F. Le Meins, A. Misra, P. Voisin, V. Bouchaud, E. Ibarboure, C. Schatz, S. Lecommandoux, Biomimetic doxorubicin loaded polymersomes from hyaluronan-block- poly(y-benzyl glutamate) copolymers, Biomacromolecules. 10 (2009) 2802-2808. https://doi.org/10.1021/bm9006419.

[111] C. Schatz, S. Louguet, J.-F. Le Meins, S. Lecommandoux, Polysaccharide- block -polypeptide Copolymer Vesicles: Towards Synthetic Viral Capsids , Angew. Chemie. 121 (2009) 2610-2613. https://doi.org/10.1002/ange.200805895.

[112] H. Yang, L.M. Zhang, Hollow organic/inorganic hybrid nanoparticles from dextran-

block-polypeptide copolymer: Double click reaction synthesis and properties, Int. J. Biol. Macromol. 181 (2021) 1243-1253. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2021.05.101.

[113] K. Stana-kleinschek, T. Mohan, K. Stana, R. Kargl, Polysaccharide peptide conjugates : Chemistry , properties and applications Polysaccharide peptide conjugates : Chemistry , properties and applications, Carbohydr. Polym. 280 (2021) 118875. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2021.118875.

[114] W. Vollmer, D. Blanot, M.A. De Pedro, Peptidoglycan structure and architecture, 32 (2008) 149-167. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2007.00094.x.

[115] M. Zink, K. Hotzel, U.S. Schubert, T. Heinze, D. Fischer, Amino Acid - Substituted Dextran-Based Non-Viral Vectors for Gene Delivery, 1900085 (2019) 1-14. https://doi.org/10.1002/mabi.201900085.

[116] H. Song, X. Dou, R. Li, B. Yu, N. Zhao, F. Xu, Acta Biomaterialia A general strategy to prepare different types of polysaccharide- graft - poly ( aspartic acid ) as degradable gene carriers, Acta Biomater. 12 (2015) 156-165. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2014.10.041.

[117] H. Yang, M. Qi, L. Mo, R. Yang, X. Xu, Reduction-sensitive amphiphilic dextran derivatives as theranostic nanocarriers for chemotherapy and MR imaging, RSC Adv. 6 (2016) 114519-114531. https://doi.org/10.1039/C6RA22373G.

[118] R. Nakamura, K. Aoi, M. Okada, Controlled Synthesis of a Chitosan-Based Graft Copolymer Having Polysarcosine Side Chains Using the NCA Method with a Carboxylic Acid Additive, (2006) 1725-1732. https://doi.org/10.1002/marc.200600455.

[119] J. Chen, C. Liu, W. Shan, Z. Xiao, H. Guo, Y. Huang, J. Chen, C. Liu, W. Shan, Z. Xiao, H. Guo, Y. Huang, Enhanced stability of oral insulin in targeted peptide ligand trimethyl chitosan nanoparticles against trypsin Enhanced stability of oral insulin in targeted peptide ligand trimethyl chitosan nanoparticles against trypsin, 2048 (2015). https://doi.org/10.3109/02652048.2015.! 065920.

[120] X.C. Tao Liu , Shaohua Chen , Siyi Zhang , Xidong Wu, Peina Wu, Beiping Miao, Transferrin-functionalized chitosan-graft-poly(L-lysine) dendrons as a high-efficiency gene delivery carrier for nasopharyngeal carcinoma therapy, (2018). https://doi.org/10.1039/C8TB00489G.

[121] O.K. Nag, L.D. Field, Y. Chen, A. Sangtani, J.C. Breger, J.B. Delehanty, Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: An update on recent progress, Ther. Deliv. 7 (2016) 335-352. https://doi.org/10.4155/tde-2016-0003.

[122] Y. Li, J. Gao, C. Zhang, Z. Cao, D. Cheng, J. Liu, X. Shuai, Stimuli-Responsive Polymeric Nanocarriers for Efficient Gene Delivery, Top. Curr. Chem. 375 (2017) 1-49. https://doi.org/10.1007/s41061-017-0119-6.

[123] J. Han, K. Burgess, Fluorescent Indicators for Intracellular pH, (2010) 2709-2728.

[124] M.J. Sis, M.J. Webber, Drug Delivery with Designed Peptide Assemblies, Trends Pharmacol. Sci. 40 (2019) 747-762. https://doi.org/10.1016/j.tips.2019.08.003.

[125] M.H. Lee, A. Sharma, M.J. Chang, J. Lee, S. Son, J.L. Sessler, C. Kang, J.S. Kim, Fluorogenic reaction-based prodrug conjugates as targeted cancer theranostics, Chem. Soc. Rev. 47 (2018) 28-52. https://doi.org/10.1039/c7cs00557a.

[126] F. Ofridam, M. Tarhini, N. Lebaz, E. Gagniere, F. Ofridam, M. Tarhini, N. Lebaz, E. Gagniere, D. Mangin, F. Ofridam, M. Tarhini, E. Gagniere, D. Mangin, N. Lebaz, A. Elaissari, pH-sensitive polymers : Classification and some fine potential applications To cite this version: HAL Id : hal-03132353 pH-sensitive polymers : classification and some fine potential applications, (2021).

[127] T. Yoshida, T.C. Lai, G.S. Kwon, K. Sako, pH- and ion-sensitive polymers for drug delivery, (2013) 1-17.

[128] V. Razzano, M. Paolino, A. Reale, G. Giuliani, A. Donati, G. Giorgi, R. Artusi, G. Caselli, M. Visintin, F. Makovec, S. Battiato, F. Samperi, F. Villafiorita-Monteleone, C. Botta, A. Cappelli, Poly-histidine grafting leading to fishbone-like architectures, RSC Adv. 8 (2018) 8638-8656. https://doi.org/10.1039/c8ra00315g.

[129] P. Sabourian, M. Tavakolian, H. Yazdani, M. Frounchi, T.G.M. van de Ven, D. Maysinger, A. Kakkar, Stimuli-responsive chitosan as an advantageous platform for efficient delivery of bioactive agents, J. Control. Release. 317 (2020) 216-231. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2019.11.029.

[130] P. Rajitha, D. Gopinath, R. Biswas, M. Sabitha, R. Jayakumar, Chitosan nanoparticles in drug therapy of infectious and inflammatory diseases, Expert Opin. Drug Deliv. 13 (2016) 1177-1194. https://doi.org/10.1080/17425247.2016.1178232.

[131] X. Zhang, X. Yang, J. Ji, A. Liu, G. Zhai, Tumor targeting strategies for chitosan-based nanoparticles, Colloids Surfaces B Biointerfaces. 148 (2016) 460-473. https://doi.org/10.1016/jxolsurfb.2016.09.020.

[132] Y.C. Nho, J.S. Park, Y.M. Lim, Preparation of poly(acrylic acid) hydrogel by radiation crosslinking and its application for mucoadhesives, Polymers (Basel). 6 (2014) 890-898. https://doi.org/10.3390/polym6030890.

[133] J. Brady, T. Drig, P.I. Lee, J.X. Li, Polymer properties and characterization, 2017. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802447-8.00007-8.

[134] S. Bazban-Shotorbani, M.M. Hasani-Sadrabadi, A. Karkhaneh, V. Serpooshan, K.I. Jacob, A. Moshaverinia, M. Mahmoudi, Revisiting structure-property relationship of pH-responsive polymers for drug delivery applications, J. Control. Release. 253 (2017) 46-63. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2017.02.021.

[135] C. Helmschrodt, S. Höbel, S. Schöniger, A. Bauer, J. Bonicelli, M. Gringmuth, S.A. Fietz, A. Aigner, A. Richter, F. Richter, Polyethylenimine Nanoparticle-Mediated siRNA Delivery to Reduce a-Synuclein Expression in a Model of Parkinson's Disease, Mol. Ther. - Nucleic Acids. 9 (2017) 57-68. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2017.08.013.

[136] S. V. Raik, S. Andranovits, V.A. Petrova, Y. Xu, J.K.W. Lam, G.A. Morris, A. V. Brodskaia, L. Casettari, A.S. Kritchenkov, Y.A. Skorik, Comparative study of diethylaminoethyl-chitosan and methylglycol-chitosan as potential non-viral vectors for

gene therapy, Polymers (Basel). 10 (2018). https://doi.org/10.3390/polym10040442.

[137] Y. Kodama, H. Kuramoto, Y. Mieda, T. Muro, H. Nakagawa, T. Kurosaki, M. Sakaguchi, T. Nakamura, T. Kitahara, H. Sasaki, Application of biodegradable dendrigraft poly-l-lysine to a small interfering RNA delivery system, J. Drug Target. 25 (2017) 49-57. https://doi.org/10.1080/1061186X.2016.1184670.

[138] U. Lungwitz, M. Breunig, T. Blunk, A. Göpferich, Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems, Eur. J. Pharm. Biopharm. 60 (2005) 247-266. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2004.11.011.

[139] T. HE, L. LF, D. GJ, W. WT, C. SC, K. ML, T. R, L. GS, T. MH, Pro-opiomelanocortin gene delivery suppresses the growth of established Lewis lung carcinoma through a melanocortin-1 receptor-independent pathway, J. Gene Med. 14 (2012) 44-53. https://doi.org/10.1002/jgm.

[140] M. Kitazoe, J. Futami, M. Nishikawa, H. Yamada, Y. Maeda, Polyethylenimine-cationized ß-catenin protein transduction activates the Wnt canonical signaling pathway more effectively than cationic lipid-based transduction, Biotechnol. J. 5 (2010) 385-392. https://doi.org/10.1002/biot.200900132.

[141] H. Murata, J. Futami, M. Kitazoe, M. Kosaka, H. Tada, M. Seno, H. Yamada, Transient cell proliferation with polyethylenimine-cationized N-terminal domain of simian virus 40 large T-antigen, J. Biosci. Bioeng. 105 (2008) 34-38. https://doi.org/10.1263/jbb.105.34.

[142] M. Kitazoe, H. Murata, J. Futami, T. Maeda, M. Sakaguchi, M. Miyazaki, M. Kosaka, H. Tada, M. Seno, N.H. Huh, M. Namba, M. Nishikawa, Y. Maeda, H. Yamada, Protein transduction assisted by polyethylenimine-cationized carrier proteins, J. Biochem. 137 (2005) 693-701. https://doi.org/10.1093/jb/mvi081.

[143] M.J. Sis, M.J. Webber, Drug Delivery with Designed Peptide Assemblies, Trends Pharmacol. Sci. 40 (2019) 747-762. https://doi.org/10.1016Zj.tips.2019.08.003.

[144] Q. Zhang, J. Tang, L. Fu, R. Ran, Y. Liu, M. Yuan, Q. He, A pH-responsive a-helical cell penetrating peptide-mediated liposomal delivery system, Biomaterials. 34 (2013) 7980-7993. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.07.014.

[145] O. Osipova, N. Zakharova, I. Pyankov, A. Egorova, A. Kislova, A. Lavrentieva, A. Kiselev, T. Tennikova, E. Korzhikova-vlakh, Journal of Drug Delivery Science and Technology Amphiphilic pH-sensitive polypeptides for siRNA delivery, J. Drug Deliv. Sci. Technol. 69 (2022) 103135. https://doi.org/10.1016/joddst.2022.103135.

[146] V. Ribas, C. García-Ruiz, J.C. Fernández-Checa, Glutathione and mitochondria, Front. Pharmacol. 5 JUL (2014) 1-19. https://doi.org/10.3389/fphar.2014.00151.

[147] P. Kuppusamy, H. Li, G. Ilangovan, A.J. Cardounel, J.L. Zweier, K. Yamada, M.C. Krishna, J.B. Mitchell, Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels, Cancer Res. 62 (2002) 307-312.

[148] P.S. Syamala, R.M. Ramesan, Thiol redox-sensitive cationic polymers for dual delivery of drug and gene, Ther. Deliv. 9 (2018) 751-773. https://doi.org/10.4155/tde-2018-0041.

[149] H. Sun, Y. Zhang, Z. Zhong, Reduction-sensitive polymeric nanomedicines: An emerging multifunctional platform for targeted cancer therapy, Adv. Drug Deliv. Rev. 132 (2018) 16-32. https://doi.org/10.1016Zj.addr.2018.05.007.

[150] J. Hu, G. Zhang, S. Liu, Enzyme-responsive polymeric assemblies, nanoparticles and hydrogels, Chem. Soc. Rev. 41 (2012) 5933-5949. https://doi.org/10.1039/c2cs35103j.

[151] N.N. Zashikhina, M. V. Volokitina, V.A. Korzhikov-Vlakh, I.I. Tarasenko, A. Lavrentieva, T. Scheper, E. Ruhl, R. V. Orlova, T.B. Tennikova, E.G. Korzhikova-Vlakh, Self-assembled polypeptide nanoparticles for intracellular irinotecan delivery, Eur. J. Pharm. Sci. 109 (2017) 1-12. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2017.07.022.

[152] P.T. Wong, S.K. Choi, Mechanisms of Drug Release in Nanotherapeutic Delivery Systems, Chem. Rev. 115 (2015) 3388-3432. https://doi.org/10.1021/cr5004634.

[153] K.C.T. Sheng Dai, Palaniswamy Ravib, Thermo-Photo Respinsive Polymers.Pdf, (2009).

[154] R. Nasseri, C.P. Deutschman, L. Han, M.A. Pope, K.C. Tam, Cellulose nanocrystals in smart and stimuli-responsive materials: a review, Mater. Today Adv. 5 (2020) 100055. https://doi.org/10.1016/j.mtadv.2020.100055.

[155] J.E.G. M. Heskins, Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide), J. Macromol. Sci. Part A - Chem. 2 (1968) 1441-1455. https://doi.org/10.1081/MA-100103872.

[156] K. Mortensen, W. Brown, Poly(ethylene oxide)—Poly(propylene oxide)—Poly(ethylene oxide) Triblock Copolymers in Aqueous Solution. The Influence of Relative Block Size, Macromolecules. 26 (1993) 4128-4135. https://doi.org/10.1021/ma00068a010.

[157] L. Ayres, K. Koch, P.H.H.M. Adams, J.C.M. Van Hest, Stimulus responsive behavior of elastin-based side chain polymers, Macromolecules. 38 (2005) 1699-1704. https://doi.org/10.1021/ma047923p.

[158] F. Meeussen, E. Nies, H. Berghmans, S. Verbrugghe, E. Goethals, F. Du Prez, Phase behaviour of poly(N-vinyl caprolactam) in water, Polymer (Guildf). 41 (2000) 85978602. https://doi.org/10.1016/S0032-3861(00)00255-X.

[159] S. Chatterjee, P.C.L. Hui, Review of applications and future prospects of stimuli-responsive hydrogel based on thermo-responsive biopolymers in drug delivery systems, Polymers (Basel). 13 (2021). https://doi.org/10.3390/polym13132086.

[160] M.S. Shim, Y.J. Kwon, Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications, Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (2012) 1046-1059. https://doi.org/10.1016/j.addr.2012.01.018.

[161] A. Sullivan, Sean; Rolland, Polymer-Based Gene Delivery Systems, Pharm. Gene Deliv. Syst. 20035023 (2003).

[162] A.S. Piotrowski-Daspit, A.C. Kauffman, L.G. Bracaglia, W.M. Saltzman, Polymeric vehicles for nucleic acid delivery, Adv. Drug Deliv. Rev. 156 (2020) 119-132. https://doi.org/10.1016/j.addr.2020.06.014.

[163] Y.H. Kim, J.H. Park, M. Lee, Y.H. Kim, T.G. Park, S.W. Kim, Polyethylenimine with acid-labile linkages as a biodegradable gene carrier, J. Control. Release. 103 (2005) 209-219. https://doi.org/10.1016/jjconrel.2004.11.008.

[164] K. Miyata, Y. Kakizawa, N. Nishiyama, A. Harada, Y. Yamasaki, H. Koyama, K. Kataoka, Block Catiomer Polyplexes with Regulated Densities of Charge and Disulfide Cross-Linking Directed to Enhance Gene Expression, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2355-2361. https://doi.org/10.1021/ja0379666.

[165] S. Matsumoto, R.J. Christie, N. Nishiyama, K. Miyata, A. Ishii, M. Oba, H. Koyama, Y. Yamasaki, K. Kataoka, Environment-responsive block copolymer micelles with a disulfide cross-linked core for enhanced siRNA delivery, Biomacromolecules. 10 (2009) 119-127. https://doi.org/10.1021/bm800985e.

[166] K. Gao, L. Huang, Synthesis and Biological Evaluation of a Bioresponsive and Endosomolytic siRNA-Polymer Conjugate, Mol. Pharm. 6 (2009) 651-658. https://doi.org/10.1021/mp800134q.

[167] J.M. Benns, J.S. Choi, R.I. Mahato, J.S. Park, Sung Wan Kim, pH-Sensitive cationic polymer gene delivery vehicle: N-Ac-poly(L-histidine)-graft-poly(L-lysine) comb shaped polymer, Bioconjug. Chem. 11 (2000) 637-645. https://doi.org/10.1021/bc0000177.

[168] S.H. Lee, S.H. Choi, S.H. Kim, T.G. Park, Thermally sensitive cationic polymer nanocapsules for specific cytosolic delivery and efficient gene silencing of siRNA: Swelling induced physical disruption of endosome by cold shock, J. Control. Release. 125 (2008) 25-32. https://doi.org/10.1016/jjconrel.2007.09.011.

[169] M. Oishi, Y. Nagasaki, K. Itaka, N. Nishiyama, K. Kataoka, Lactosylated Poly(ethylene glycol)-siRNA Conjugate through Acid-Labile ?-Thiopropionate Linkage to Construct pH-Sensitive Polyion Complex Micelles Achieving Enhanced Gene Silencing in Hepatoma Cells Motoi, J. Am. Chem. Soc. (2005) 1624-1625.

[170] M.S. Shim, Y.J. Kwon, Acid-responsive linear polyethylenimine for efficient, specific, and biocompatible siRNA delivery, Bioconjug. Chem. 20 (2009) 488-499. https://doi.org/10.1021/bc800436v.

[171] C. Yao, J. Liu, X. Wu, Z. Tai, Y. Gao, Q. Zhu, J. Li, L. Zhang, C. Hu, F. Gu, J. Gao, S. Gao, Reducible self-assembling cationic polypeptide-based micelles mediate co-delivery of doxorubicin and microRNA-34a for androgen-independent prostate cancer therapy, J. Control. Release. 232 (2016) 203-214. https://doi.org/10.1016/jjconrel.2016.04.034.

[172] A. Zintchenko, M. Ogris, E. Wagner, Temperature dependent gene expression induced by PNIPAM-based copolymers: Potential of hyperthermia in gene transfer, Bioconjug. Chem. 17 (2006) 766-772. https://doi.org/10.1021/bc050292z.

[173] R.C. Carlisle, T. Etrych, S.S. Briggs, J.A. Preece, K. Ulbrich, L.W. Seymour, Polymer-coated polyethylenimine/DNA complexes designed for triggered activation by intracellular reduction, J. Gene Med. 6 (2004) 337-344. https://doi.org/10.1002/jgm.525.

[174] X. Jiao, Y. Yu, J. Meng, M. He, C.J. Zhang, W. Geng, B. Ding, Z. Wang, X. Ding, Dual-

targeting and microenvironment-responsive micelles as a gene delivery system to improve the sensitivity of glioma to radiotherapy, Acta Pharm. Sin. B. 9 (2019) 381396. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2018.12.001.

[175] J. Li, Z. Ge, S. Liu, PEG-sheddable polyplex micelles as smart gene carriers based on MMP-cleavable peptide-linked block copolymers, Chem. Commun. 49 (2013) 69746976. https://doi.org/10.1039/c3cc43576h.

[176] P. Midoux, M. Monsigny, Efficient gene transfer by histidylated polylysine/pDNA complexes, Bioconjug. Chem. 10 (1999) 406-411. https://doi.org/10.1021/bc9801070.

[177] C. Pichon, C. Gon5alves, P. Midoux, Histidine-rich peptides and polymers for nucleic acids delivery, Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (2001) 75-94. https://doi.org/10.1016/S0169-409X(01)00221-6.

[178] D. Putnam, Polymer-based gene delivery with low cytotoxicity by a unique balance of side-chain termini, Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (2001) 1200-1205. https://doi.org/10.1073/pnas.031577698.

[179] M. Naeem, W. Kim, J. Cao, Y. Jung, J.W. Yoo, Enzyme/pH dual sensitive polymeric nanoparticles for targeted drug delivery to the inflamed colon, Colloids Surfaces B Biointerfaces. 123 (2014) 271-278. https://doi.org/10.1016/jxolsurfb.2014.09.026.

[180] H. Cai, X. Wang, H. Zhang, L. Sun, D. Pan, Q. Gong, Z. Gu, K. Luo, Enzyme-sensitive biodegradable and multifunctional polymeric conjugate as theranostic nanomedicine, Appl. Mater. Today. 11 (2018) 207-218. https://doi.org/10.1016/j.apmt.2018.02.003.

[181] P. Lin, S. Lin, P.C. Wang, R. Sridhar, Techniques for physicochemical characterization of nanomaterials, Biotechnol. Adv. (2013).

https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.11.006.

[182] J.B. Hall, S.E. Mcneil, Characterization of nanoparticles for therapeutics, 2 (2007) 789803.

[183] C.I.C. Crucho, M.T. Barros, Polymeric Nanoparticles: A study on the preparation variables and characterization methods, Mater. Sci. Eng. C. (2017). https://doi.org/10.1016/j.msec.2017.06.004.

[184] J. Williford, J. Wu, Y. Ren, M.M. Archang, K.W. Leong, H. Mao, Recent Advances in siRNA Delivery, (2014) 347-370. https://doi.org/10.1146/annurev-bioeng-071813-105119.

[185] D. Liu, D.T. Auguste, Cancer targeted therapeutics: Frommolecules to drug delivery vehicles, J. Control. Release. 219 (2016) 632-643.

https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2015.08.041.

[186] A.K. Jain, D. Singh, K. Dubey, R. Maurya, Models and Methods for In Vitro Toxicity, Elsevier Inc., 2018. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-804667-8.00003-1.

[187] C. Eskes, A. Bostrom, G. Bowe, T. Hartung, G. Hendriks, D. Pamies, C. Rovida, Good cell culture practices & in vitro toxicology Chantra, Toxicol. Vitr. (2017). https://doi.org/10.1016/j.tiv.2017.04.022.

[188] L. Semlin, M. Scha, C. Borelli, H.C. Korting, In vitro models for human skin disease, 16 (2011). https://doi.org/10.1016/j.drudis.2010.12.001.

[189] M. Eva, A. Urtti, Rabbit as an animal model for intravitreal pharmacokinetics : Clinical predictability and quality of the published data, Exp. Eye Res. (2015) 1-14. https://doi.org/10.1016/j.exer.2015.05.003.

[190] M. Murata, T. Takanami, S. Shimizu, Y. Kubota, S. Horiuchi, W. Habano, J.X. Ma, S. Sato, Inhibition of ocular angiogenesis by diced small interfering RNAs (siRNAs) specific to vascular endothelial growth factor (VEGF), Curr. Eye Res. 31 (2006) 171180. https://doi.org/10.1080/02713680500514636.

[191] C.W. Chen, M.K. Yeh, C.Y. Shiau, C.H. Chiang, D.W. Lu, Efficient downregulation of VEGF in Retinal pigment epithelial cells by integrin ligand-labeled liposome-mediated siRNA delivery, Int. J. Nanomedicine. 8 (2013) 2613-2627. https://doi.org/10.2147/IJN.S39622.

[192] B. Kim, Q. Tang, P.S. Biswas, J. Xu, R.M. Schiffelers, F.Y. Xie, A.M. Ansari, P. V. Scaria, M.C. Woodle, P. Lu, B.T. Rouse, Inhibition of ocular angiogenesis by siRNA targeting vascular endothelial growth factor pathway genes: Therapeutic strategy for herpetic stromal keratitis, Am. J. Pathol. 165 (2004) 2177-2185. https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)63267-1.

[193] O. Osipova, V. Sharoyko, N. Zashikhina, N. Zakharova, T. Tennikova, A. Urtti, E. Korzhikova-Vlakh, Amphiphilic polypeptides for VEGF siRNA delivery into retinal epithelial cells, Pharmaceutics. 12 (2020) 1 -17. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics12010039.

[194] N.A. Patil, B. Kandasubramanian, Functionalized polylysine biomaterials for advanced medical applications: A review, Eur. Polym. J. 146 (2021) 110248. https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj .2020.110248.

[195] B.M. Sela, E. Katchalski, Biological Properties of Poly-a- Amino Acids, Adv. Protein Chem. 14 (1959) 391-478.

[196] N.N. Zashikhina, D. V. Yudin, I.I. Tarasenko, O.M. Osipova, E.G. Korzhikova-Vlakh, Multilayered Particles Based on Biopolyelectrolytes as Potential Peptide Delivery Systems, Polym. Sci. - Ser. A. 62 (2020) 43-53.

https://doi.org/10.1134/S0965545X20010125.

[197] M. Mashat, H. Chrystyn, B.J. Clark, K.H. Assi, Development and validation of HPLC method for the determination of tobramycin in urine samples post-inhalation using pre-column derivatisation with fluorescein isothiocyanate, J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 869 (2008) 59-66. https://doi.org/10.1016/jjchromb.2008.05.012.

[198] A. Fabiani, A. Versari, G.P. Parpinello, M. Castellari, S. Galassi, High-performance liquid chromatographic analysis of free amino acids in fruit juices using derivatization with 9-fluorenylmethyl-chloroformate, J. Chromatogr. Sci. 40 (2002) 14-18. https://doi.org/10.1093/chromsci/40.1.14.

[199] M. Nilges, Structure calculation from NMR data, Curr. Opin. Struct. Biol. 6 (1996) 617-

623. https://doi.org/10.1016/S0959-440X(96)80027-3.

[200] S.K. Bharti, R. Roy, Quantitative 1H NMR spectroscopy, TrAC - Trends Anal. Chem. 35 (2012) 5-26. https://doi.org/10.1016/j.trac.2012.02.007.

[201] O. Osipova, N. Zakharova, I. Pyankov, A. Egorova, A. Kislova, A. Lavrentieva, A. Kiselev, T. Tennikova, E. Korzhikova-Vlakh, Amphiphilic pH-sensitive polypeptides for siRNA delivery, J. Drug Deliv. Sci. Technol. 69 (2022) 103135. https://doi.org/10.1016/j.jddst.2022.103135.

[202] N. Maity, A. Dawn, Conducting polymer grafting: Recent and key developments, Polymers (Basel). 12 (2020). https://doi.org/10.3390/polym12030709.

[203] N. Zashikhina, V. Sharoyko, M. Antipchik, I. Tarasenko, Y. Anufrikov, A. Lavrentieva, T. Tennikova, E. Korzhikova-Vlakh, Novel formulations of c-peptide with long-acting therapeutic potential for treatment of diabetic complications, Pharmaceutics. 11 (2019). https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11010027.

[204] H. ENGELBERG, Plasma heparin levels in normal man., Circulation. 23 (1961) 578581. https://doi.org/10.1161/01.CIR.23A578.

[205] J. Ho, S. Kim, K. Dong, M. Chul, W. Ick, S. Won, J. Yeun, J. Woo, Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells using a thermosensitive poly ( N -isopropylacrylamide ) and water-soluble chitosan copolymer, 25 (2004) 5743-5751. https://doi .org/10.1016/j.biomaterials.2004.01.051.

[206] P.M. Preparation, Effect of Different Particles on Cell Proliferation in Polymer Scaffolds Using a Solvent-Casting and Particulate Leaching, (2002) 1-5. https://doi.org/10.1097/01.MAT.0000026344.66193.10.

[207] T. Witzmann, M. Meinhart, Supposedly identical microplastic particles substantially differ in their material properties influencing particle-cell interactions and cellular responses, 425 (2022). https://doi.org/10.1016/johazmat.2021.127961.

[208] Y. Yang, Y. Cao, The impact of VEGF on cancer metastasis and systemic disease, Semin. Cancer Biol. (2022). https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2022.03.011.

[209] M. Shibata, K. Kono, S. Takenoshita, Inhibiting VEGF in cancer immunotherapy, Clin. Immunol. Commun. 2 (2022) 12-16. https://doi.org/10.1016/j.clicom.2021.12.003.

[210] H. Chen, B. Qiu, G. Gao, Y. Chen, H. Min, Z. Wu, Proteomic changes of aqueous humor in proliferative diabetic retinopathy patients treated with different intravitreal anti-VEGF agents, Exp. Eye Res. 216 (2022) 108942.

https://doi.org/10.1016/j.exer.2022.108942.

[211] M. Reibaldi, M. Fallico, T. Avitabile, P. Marolo, G. Parisi, G. Cennamo, C. Furino, E. Lucenteforte, G. Virgili, Frequency of Intravitreal Anti-VEGF Injections and Risk of Death: A Systematic Review with Meta-analysis, Ophthalmol. Retin. 6 (2022) 369-376. https://doi.org/10.1016/j.oret.2021.12.019.

[212] C.J. Narvaez, D. Matthews, E. LaPorta, K.M. Simmons, S. Beaudin, J.E. Welsh, The impact of vitamin D in breast cancer: Genomics, pathways, metabolism, Front. Physiol.

5 JUN (2014) 1-10. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00213.

[213] D. Eusébio, A.R. Neves, D. Costa, S. Biswas, G. Alves, Z. Cui, Â. Sousa, Methods to improve the immunogenicity of plasmid DNA vaccines, Drug Discov. Today. 26 (2021) 2575-2592. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2021.06.008.

[214] C. Bellefroid, C. Reusch, A. Lechanteur, B. Evrard, F. Debacq-Chainiaux, D. Mottet, G. Piel, Systematic study of liposomes composition towards efficient delivery of plasmid DNA as potential application of dermal fibroblasts targeting, Int. J. Pharm. 593 (2021) 120122. https://doi.org/ 10.1016/j.ijpharm.2020.120122.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает огромную благодарность научному руководителю - старшемй научному сотруднику кафедры медицинской химии Института химии СПБГУ, к.х.н., доценту Е.Г. Коржиковой-Влах за общее руководство работой на всех этапах, неоценимую поддержку и помощь при планировании экспериментов и обсуждении результатов. Автор также выражает благодарность проф., д.х.н. Т.Б. Тенниковой за всестороннюю поддержку и предоставленную возможность работы с использованием уникальной современной материально-технической платформы для проведения экспериментов. Автор благодарит к.х.н., доцента В.А. Коржикова-Влах за поддержку и консультирование в работе, а также помощь в организации международных стажировок.

Автор благодарит коллектив кафедры медицинской химии СПбГУ за отзывчивость, поддержку на различных этапах работы и консультационном участии при интерпретации результатов.

Автор благодарит сотрудников лаборатории полимерных сорбентов и носителей для биотехнологии ИВС РАН за помощь в обучении синтезу полимеров, а также за проведение анализа ЭЖХ и экспериментов по статическому рассеянию света.

Автор выражает благодарность доктору А. Лаврентьевой (Институт технической химии университета Лейбница) за обучение работе с культурами клеток и помощь в проведении и интерпретации результатов клеточных исследований.

Автор выражает признательность профессору Арто Уртти (Университет Восточной Финляндии) и коллективу лаборатории за неоценимую консультационную поддержку, а также предоставленные возможности проведения биологических экспериментов.

Автор благодарит научные фонды за финансовую поддержку исследований, а именно РФФИ (20-33-90181), РНФ (19-73-10045), Министерство науки и высшего образования РФ (мегагрант 14^.03.31.0025).

Автор благодарит сотрудников ресурсных центров СПбГУ «Магнитно-резонансные методы исследования», «Методы анализа состава вещества», «Развитие молекулярных и клеточных технологий» за помощь при выполнении научной работы.

SAINT PETERSBURG STATE UNIVERSITY

As a manuscript

KOROVKINA Olga Mikhailovna

STIMULI-RESPONSIVE AMPHIPHILIC COPOLYMERS OF ALPHA AMINO ACIDS FOR THE INTRACELLULAR DELIVERY OF siRNA/DNA

Specialization: 1.4.7. High molecular weight compounds

DISSERTATION

is submitted for the degree of candidate of chemical sciences Translation from Russian

Scientific supervisor:

Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor Korzhikova-Vlakh Evgenia Georgievna

Saint Petersburg 2022

CONTENTS

Abbreviations........................................................................................................................................................................................6

INTRODUCTION..........................................................................................................................................................................8

CHAPTER 1. LITERATURE REVIEW......................................................................................................................15

1.1 Polymer nanocarriers for drug delivery................................................................................................................15

1.2. Nucleic acid delivery systems......................................................................................................................................16

1.2.1 Types of nucleic acid delivery systems and their synthesis................................................................16

1.2.2 Polymer types for nucleic acid delivery systems......................................................................................18

1.2.2.1 Natural polymers............................................................................................................................................................18

1.2.2.2 Synthetic polymers......................................................................................................................................................20

1.2.2.3 Biodegradable polypeptides..................................................................................................................................................20

1.2.3 Polyamino acid synthesis..............................................................................................................................................22

1.2.4 Synthesis of copolymers based on a-amino acids........................................................................................27

1.2.5 Synthesis of hybrid copolymers based on a-amino acids and polysaccharides................35

1.3 Stimuli-responsive nucleic acid delivery systems......................................................................................36

1.3.1 Types of natural stimuli................................................................................................................................................37

1.3.1.1 pH factor alterations..................................................................................................................................................37

1.3.1.2 Redox potential alterations..........................................................................................................................................40

1.3.1.3 The presence of enzymes....................................................................... 41

1.3.1.4 Temperature alterations................................................................................................................................................42

1.3.2 Types of stimuli-responsive polymers for nucleic acid delivery..............................................44

1.4 Research methods for polymeric delivery systems........................................................................................48

1.4.1 Size and morphology........................................................................................................................................................49

1.4.2 Surface properties................................................................................................................................................................49

1.4.3 Biological properties......................................................................................................................................................50

CHAPTER 2. EXPERIMENTAL PART......................................................................................................................51

2.1 Starting materials and their preparation............................................................................................................51

2.2 Equipment and statistics................................................................................................................................................53

2.3 Synthesis....................................................................................................................................................................................55

2.3.1 Synthesis of amphiphilic poly(amino acids)..................................................................................................55

2.3.1.1 Synthesis of a-amino acid N-carboanhydrides....................................................................................55

2.3.1.2 Synthesis of a-amino acid statistical copolymers................................................................................56

2.3.1.3 Copolymer deblocking............................................................................................................................................57

2.3.2 Synthesis of histidine-containing poly(amino acids)............................................................................58

2.3.2.1 Covalent modification of polymers with histidine............................................................................58

2.3.2.2 Deblocking of histidine-containing poly(amino acids)......................................................................58

2.3.3 Synthesis of cysteine-containing poly(amino acids)..............................................................................59

2.3.3.1 Covalent modification of polymers with cysteine..............................................................................59

2.3.3.2 Deblocking of cysteine-containing poly(amino acids)........................................................................59

2.3.4 Synthesis of graft-copolymer constituents....................................................................................................60

2.3.4.1 Synthesis of modified azide-containing polysaccharides................................................................60

2.3.4.2 Synthesis of modified alkyne-containing polysaccharides..........................................................62

2.3.4.3 Synthesis of alkyne-/azide-containing amino acid homopolymers........................................63

2.3.4.4 Synthesis of graft-copolymers............................................................................................................................64

2.4 Monomer and copolymer constitution studies................................................................................................66

2.5. Polymeric particles: preparation and properties investigation................................................69

2.6 Investigation of the size, surface charge and morphology of nanoparticles................................70

2.7 Particle stability..........................................................................................................................................................................71

2.8 Fluorescent labeling of particles................................................................................................................................71

2.9 The development of forms of encapsulated nucleic acid based on the obtained polymeric nanosystems............................................................................................................................................................72

2.9.1 Polypeptide delivery systems..................................................................................................................................72

2.9.1.1 Encapsulation of the oligonucleotide and siRNA..............................................................................72

2.9.1.2 The size and surface charge of polymer-oligonucleotide complexes....................................72

2.9.1.3 pH-sensitive oligonucleotide release............................................................................................................73

2.9.1.4 Oligonucleotide release in the presence of competitive molecules......................................73

2.9.2 Graft-copolymers-based delivery systems......................................................................................................74

2.9.2.1 Encapsulation of plasmid DNA........................................................................................................................74

2.9.2.2 The size and surface charge of polymer-plasmid DNA complexes......................................74

2.9.2.3 pDNA release in the presence of competitive molecules............................................................74

2.10 Biological properties of developed nanocarriers......................................................................................75

2.10.1. Cell cultivation............................................................................................................................................................75

2.10.2 Cytotoxic analysis of polymeric particles..................................................................................................76

2.10.3 Cell permeation by polymeric particles..........................................................................................................77

2.10.4 Evaluating efficacy of the developed carriers as nucleic acid delivery systems..........78

2.10.4.1 Inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) using amphiphilic polyamino acid complexes with siRNA......................................................................................................................78

2.10.4.2 GFP gene expression suppression in MDA-MB-231/GFP cells using pH-sensitive polymer complexes with siRNA................................................................................................................80

2.10.4.3 Initiating of GFP protein expression in HEK-293T cells using graft-copolymers-

pDNA complexes..........................................................................................................................................................................80

CHAPTER 3. RESULTS & DISCUSSION............................................................................................................81

3.1. Synthesis of polymers for nucleic acid delivery systems....................................................................81

3.1.1 Synthesis of amphiphilic a-amino acid copolymers............................................................................81

3.1.1.1 Synthesis of a-amino acid statistical copolymers................................................................................82

3.1.1.2 Synthesis of histidine-containing poly(amino acids)..........................................................................87

3.1.1.3 Synthesis of cysteine-containing poly(amino acids)............................................................................90

3.1.2 Synthesis of graft-copolymers' constituents................................................................................................93

3.2. Preparation of polymeric particles and complexes and study of their physicochemical characteristics......................................................................................................................................102

3.2.1 Study of particles based on the a-amino acid statistical copolymers....................................103

3.2.1.1 Study of hydrodynamic diameter and Z-potential of the polymeric particles............103

3.2.1.2 Study of sample stability and pH impact on the particles characteristics....................105

3.2.1.3 Encapsulation and release studies of model siRNA........................................................................106

3.2.2 Study of the particles based on histidine-containing poly(amino acids)................................109

3.2.2.1 Study of hydrodynamic diameter and Z-potential of the polymeric particles............109

3.2.2.2 Encapsulation and release of model siRNA studies....................................................................112

3.2.3 Study of the particles based on cysteine-containing poly(amino acids)................................116

3.2.3.1 Study of hydrodynamic diameter and Z-potential of the polymeric particles............116

3.2.3.2 Particle stability study............................................................................................................................................118

3.2.4 Preparation of the particles from graft-copolymers..........................................................................119

3.2.4.1 Study of hydrodynamic diameter and Z-potential of the polymeric particles............119

3.2.4.2 Study of the polymer/pDNA complexes formation..........................................................................122

3.3 Biological properties of the developed carriers............................................................................................124

3.3.1 Cytotoxicity of polymeric systems....................................................................................................................124

3.3.1.2 Cell permeability study........................................................................................................................................128

3.3.3 Cell and tissue drug delivery study of the polymeric carriers..................................................130

3.3.3.1 Vascular endothelial growth factor inhibition with the use of interpolyelectrolyte complexes based on copolymers and siRNA..........................................................................................................130

3.3.3.2 GFP gene silencing with the use of interpolyelectrolyte complexes based on histidine-containing copolymers and siRNA..........................................................................................................132

3.3.3.3 Initiating of GFP-protein synthesis in HEK-293 cells with the use of

interpolyelectrolyte complexes based on graft-copolymers and pDNA..........................................135

CONCLUSIONS..........................................................................................................................................................................137

REFERENCES................................................................................................................................................................................138

ACKNOWLEDGEMENTS......................................................................................................................................................160

Abbreviations

Monomers and other low-molecular-weight species:

N-CA - N-carboxyanhydride HMDS - hexamethyldisilazane

Cy3, Cy5 - fluorescent dye indocarbocyanine EDC - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

DAPI - 4',6-diamidino-2-phenylindole CTB - CellTiter-Blue dye

NHS - N- hydroxysuccinimide dT-dA - oligotidine oligoadenine duplex

Lys - ¿-lysine Lys(Z) - e-carboxybenzyl-L-lysine

Glu - ¿-glutamic acid Glu(OBzl) - y-benzyl-L-glutamate

Cys - ¿-cystein His - L-histidine

Fmoc-Cys(Acm)-OPfp - Na- fluorenylmethoxycarbonyl-S-trityl-¿-cystein pentafluorophenyl ester Fmoc-His(Trt)-OH - N- fluorenylmethoxycarbonyl-N- trityl-L-histidine

Phe - ¿-phenylalanine Ile - L-isoleucine

Polymers:

PLys - poly(L-lysine) PGlu - poly( L-glutamic acid)

PLys(Z) - poly( e-carboxybenzyl-L-lysine) PGlu(OBzl) - poly(y-benzyl-L-glutamate)

Hep - heparin CS - chitosan

pDNA - plasmid deoxyribonucleic acid siRNA - small interfering ribonucleic acid

Hep-g-PLys - heparin-gra/t-poly(L-lysine) CS-g-PGlu - chitosan-gra/t-poly( L-glutamic acid)

Polymeric groups:

OBzl - y-benzyl group Boc - tret-butoxycarboxylic group

Trt - tiryl group Fmoc - fluorenylmetoxycarboxylic group

Z - e-carboxybenzyl group Acm - acetamidomethylic group

Solvents and media:

DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium MEM (Minimum Essential Medium) -Eagle's Medium

PBS - phosphate-buffer saline DMSO - dimethyl sulfoxide

FBS - fetal bovine serum MES - 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid

DMF - dimethylformamide

Signs:

NP - nanoparticles PDI - polydispersity index

BAA - biologically active agent PS - photosensitivity or photosensitive

EE - encapsulation efficacy ROP - Ring-opening polymerization

I - initiating agent M - monomer

VEGF - Vascular endothelial growth factor GAPDH - Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

IPEC - interpolyelectrolyte complexe GFP - green fluorescent protein

Methods:

NMR-spectroscopy - nuclear magnetic resonance spectroscopy UV-spectroscopy - spectroscopy of ultraviolet spectra range

DLS - dynamic light scattering IR-spectroscopy - spectroscopy of infrared spectra range

SLS - static light scattering NTA - nanoparticle tracking analysis

TEM - transmission electron microscopy SEC - size-exclusion chromatography

INTRODUCTION

Development of controlled intracellular drug delivery systems is one of the most promising and demanding scientific tasks that meet the modern needs of biomedicine to improve the effectiveness and prolongation of drug action [1]. Biocompatible and biodegradable polymers are extremely attractive for development of such systems that can increase drug bioavailability, prevent or significantly reduce enzymatic degradation of the drug, as well as improve penetration through biological barriers and deliver the drug to the target organ [2].

One of the important areas of modern medicine is gene therapy, a method of treating genetic diseases by transferring one or more therapeutic nucleic acids into the patient's cells to correct or replace a defective gene. Such therapy makes it possible to treat a wide range of diseases at the transcriptional and translational level. It is known that the use of genetic constructs (DNA, RNA) in their free form is ineffective in most cases due to low selectivity, enzymatic degradation of nucleic acids in the presence of nucleases, rapid decrease in drug concentration, and low bioavailability [3-5].

The development of biocompatible stimuli-sensitive carriers of various nature for drug delivery allows to overcome the existing problems. In particular, drug binding to the carrier or encapsulation inside nanoparticles allows drug delivery to target tissues with the possibility of controlled release under natural or artificial stimuli. In addition, in such systems the bound drug is protected from enzymatic degradation and can be released at a given therapeutic concentration [2,6]. Thus, clinical application of stimuli-sensitive polymeric nanocontainers for drug delivery significantly increases the chances of successful therapy by increasing bioavailability, controlled release and reducing the overall toxicity to the body. For the reasons mentioned above, the use of encapsulated drug forms in polymeric carriers represents a promising approach to treatment of a wide range of diseases.

A significant advantage of synthetic high-molecular compounds, in terms of materials for polymer systems, is the possibility of preparation polymer particles with precisely defined properties, including hydrophobicity, surface charge, degradation rate, which may vary depending on the nature of the polymer, chain length and its postmodifications [7-9]. Moreover, most polymer syntheses can be quite easily controlled and scaled up to industrial volumes, yielding target objects with reproducible characteristics.

Among the many synthetic polymers, poly(amino acids) are of great interest due to their similarity to natural proteins and their ability to biodegrade to non-toxic simple amino acids [10]. By varying the monomers nature and polymer chains length, it is possible to synthesize poly(amino acids) with a controlled hydrophilic-hydrophobic balance and form nanoparticles of various sizes and morphologies on their basis. The combination of hydrophilic and hydrophobic fragments in the polymer, i.e., amphiphilicity, provides polymers with the ability to self-assemble - to spontaneously form nanoparticles in solutions. In terms of nucleic acid delivery, polycations (e.g., polylysine and polyarginine) are good bases due to the high positive charge of amino groups, but in their pure form they can exhibit significant cytotoxicity [11-13]. There are works on preparation of polymeric particles based on a combination of polycations and polyanions in order to partially shield positively charged functional groups of a polycation and, as a result, to facilitate drug release from the complex with carrier when it enters cells [14-19]. This approach can also help to reduce the toxicity of polymeric carriers. The problem of balance between efficient nucleic acid binding and timely release could be solved by combining lysine units with glutamic acid units to obtain a positively charged polymer capable of moderate binding with RNA/DNA and also releasing the drug in the presence of competitive polyanions, such as intracellular proteins.

Sensitivity of polyamino acid based nanoparticles to external stimuli can be ensured, in particular, by incorporating histidine links into polymer chain, an amino acid containing an imidazole group in a side chain, which is known to exhibit the "proton sponge effect" under physiological conditions. This effect is based on protonation of the histidine amino group (pKa = 6) in the acidic environment of the lysosome (pH 5-6) during endocytosis and buffering of the acidic organelle microenvironment, with suppression of the natural pH drop in lysosome. This leads to an abnormal influx of protons and other ions as well as water, which promotes swelling and destruction of cell organelle as well as release of its contents into cytoplasm [20,21]. The penetration efficiency of such systems is high, so the development of pH-sensitive systems increases every year.

Natural polymers, especially biodegradable polymers, are also attractive for developing drug delivery systems. Biocompatibility, low production costs, availability of functional groups, and the possibility of varying structure and physical and chemical properties through modification are certain advantages of such materials [22]. The choice of the nature and structure of the polymer allows setting physicochemical and biological properties of the