Модификация спектров биолюминесценции и термостабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica методами мутагенеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Кокшаров, Михаил Иванович

• Кокшаров, Михаил Иванович
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кокшаров, Михаил Иванович

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Строение люцифераз светляков.

1.1. Механизм биолюминесцентной реакции люциферазы.

1.2. Первичные структуры люцифераз жуков.

1.3. Пространственная структура и активный центр люциферазы светляков.

2. Спектры биолюминесценции люцифераз.

2.1. Особенности спектров биолюминесценции люцифераз жуков.

2.2. Физико-химические представления о влиянии окружения на спектры испускания флуорофоров.

2.3. Механизмы изменения спектров биолюминесценции, описанные в литературе.

2.4. Связь между структурой и спектрами биолюминесценции люцифераз.

3. Стабильность люциферазы светляков.

3.1. Факторы, влияющие на стабильность люциферазы светляков.

3.2. Повышение термостабильности люцифераз методом мутагенеза.

3.3. Повышение устойчивости ферментов к действию органических растворителей методом мутагенеза.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Вещества и реагенты.

2. Штаммы и плазмиды.

3. Аппаратура.

4. Методики проведения экспериментов.

4.1. Выделение и очистка люциферазы.

4.2. Изучение свойств люциферазы.

4.3. Методы работы с ДНК.

4.4. Конструирование плазмид.

4.5. Получение мутантной формы люциферазы с заменой С216К, А217Ы методом сайт-направленного мутагенеза.

4.6. Получение мутантных форм люциферазы с измененным спектром биолюминесценции и повышенной устойчивостью к ДМСО методом случайного мутагенеза.

4.7. Получение мутантных форм люциферазы с повышенной термостабильностью методом направленной эволюции.

4.8. Компьютерное моделирование и анализ структуры люциферазы L. mingrelica. 56 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение и свойства двойного мутанта G216N,A217L.

1.1. Получение и физико-химические свойства мутанта.

1.2. Спектры биолюминесценции.

1.3. Термостабильность мутанта G216N,A217L.

1.4. Обсуждение эффектов замены G216N,A217L.

2. Векторы для получения люциферазы и сравнение свойств различных форм рекомбинантного фермента дикого типа.

2.1. Конструирование использованных плазмид.

2.2. Экспрессия генетических конструкций и очистка рекомбинантных ферментов.

2.3. Сравнение свойств различных форм рекомбинантной WT-люциферазы.

3. Получение мутантов с измененными спектрами биолюминесценции методом случайного мутагенеза.

3.1. Отбор мутантов с измененным спектром биолюминесценции.

3.2. Выделение, каталитические свойства и стабильность мутантов.

3.3. Спектры биолюминесценции мутантов.

2.4. Обсуждение эффекта замены Y35 на Asn, His.

4. Получение мутантов с повышенной устойчивостью к ДМСО.

5. Повышение термостабильности люциферазы методом направленной эволюции.

5.1 Случайный мутагенез и скрининг мутантов по термостабильности.

5.2 Кинетические свойства и спектры биолюминесценции мутанта 4TS.

5.3 Термостабильность мутанта 4TS.

5.4 Сравнение свойств мутанта 4TS и нативной люциферазы.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модификация спектров биолюминесценции и термостабильности люциферазы светляков Luciola mingrelica методами мутагенеза»

Биолюминесценция широко распространена в природе и встречается во многих группах живых организмов [1-3], например, среди насекомых, бактерий, кишечнополостных, грибов и т. д. В основе биолюминесценции во всех случаях является реакция окисления субстрата - люциферина - молекулярным кислородом, катализируемая ферментом - люциферазой. Люциферин и люцифераза являются собирательными названиями: структуры фермента, субстрата и механизм протекания реакции у разных групп могут быть совершенно различными.

Люцпферин-люциферазная система светляков является одной и наиболее часто используемых [4] и давно изучаемых [5]. Она обладает наиболее высоким квантовым выходом [6, 7] среди других биолюминесцентных процессов. Для протекания реакции в этом случае кроме люциферина необходим также второй субстрат - АТФ.

Высокая специфичность к АТФ и простота детекции света обусловили применение люциферазы в качестве высокоэффективного реагента для определения ультрамалых количеств АТФ, что широко используется для оценки биомассы, жизнеспособности клеток, определения метаболитов и бактериальных загрязнений [8, 9]. Люцифераза также широко используется в качестве удобного гена-репортера [9-11] для визуализации экспрессии генов в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Кроме того, этот фермент применяется в пиросеквенировании [12]. Известны работы по применению люциферазы для изучения белок-белковых взаимодействий. [13-15] и в качестве метки в иммуноферментном [16, 17] и ДНК-анализе [17].

Химическая схема реакции и продукт идентичны для всех люцифераз жуков, но при этом максимумы спектров биолюминесценции люцифераз из различных видов лежат в диапазоне волн от зеленого (Лшах=534 нм) до красного (Ятох=623 нм) [18], то есть различия в спектрах определяются свойствами люциферазы [19]. Люциферазы жуков кроме того можно условно разделить на две группы по чувствительности спектра биолюминесценции к рН [18]: рН-нечувствительные люциферазы жуков-щелкунов и нескольких других видов, у которых Атах и форма спектра практически не изменяются при понижении рН, и рН-чувствительные люциферазы светляков, для которых Лтах биолюминесценции смещается от 540-570 нм (зеленое или желто-зеленое свечение) при рН~8 до -620 нм (красное свечение) при рН~6. Такой значительный сдвиг обычно объясняют тем, что продукт реакции (электронно-возбужденный оксилюциферин) может существовать в активном центре в двух различных молекулярных формах: в виде «зеленого» и «красного» излучателей. В зависимости от условий их соотношение изменяется, что определяет Ятах и форму спектра биолюминесценции. Но несмотря на то, что исследования ферментативной реакции люциферазы светляков ведутся уже более 50 лет [6]; конкретная природа этих форм и механизм влияния структуры фермента на спектр биолюминесценции до сих пор однозначно не установлены и являются предметом обсуждения [18, 20-22]. Благодаря многочисленным работам по мутагенезу различных люцифераз было выявлено множество аминокислотных остатков как в активном центре фермента, так и вне его, мутации которых приводят к сдвигу в положении спектра биолюминесценции, изменяют форму спектра и его pH-зависимость.

Актуальной задачей является поиск новых положений в структуре люциферазы, влияющих на спектр биолюминесценции, что представляет значительный теоретический интерес и способно приблизить нас к пониманию механизма взаимосвязи между структурой фермента и спектрами биолюминесценции. В связи с тем, что практически все известные мутации такого типа были обнаружены на участке люциферазы после 225 остатка, интересен вопрос, насколько важное участие в формировании спектра биолюминесценции принимают остатки из начальной области фермента. Кроме того, мутанты с различными спектральными свойствами могут быть полезны в качестве генов-маркеров при изучении экспрессии генов in vivo [23, 24].

Практическое применение люцифераз жуков, в том числе и изучаемой нами люциферазы светляков Lucióla mingrelica, часто ограничивается низкой стабильностью нативных ферментов при повышенных температурах. В частности, период полуинактивации при 37°С обычно составляет 15-50 мин. Другой проблемой является снижение активности люциферазы в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО), который нередко используется для разрушения бактерий при определении внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом. Известен ряд работ, в которых стабильность люциферазы была успешно повышена методами направленного и случайного мутагенеза [25-28].

Целью данной работы было:

1. Получение и изучение мутантов люциферазы светляков L. mingrelica, обладающих:

• измененными спектрами биолюминесценции;

• повышенной устойчивостью к ДМСО;

• повышенной температурной стабильностью.

2. Анализ взаимосвязи между изменениями структуры и функциональных свойств мутантных ферментов.

В соответствии с целью в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Получение мутанта люциферазы с заменами 02161ч[, А217Ь. Изучение его термостабильности и каталитических свойств.

2. Конструирование плазмид на основе системы рЕТ, кодирующих люциферазу с концевой полигистидиновой последовательностью, что позволяет проводить высокоэффективную экспрессию и быструю очистку люциферазы светляков.

3. Получение мутантов люциферазы, обладающих измененными спектрами биолюминесценции, с помощью случайного мутагенеза первых 225 остатков фермента. Исследование влияния полученных мутаций на спектральные и каталитические свойства люциферазы.

4. Получение мутантных форм люциферазы, обладающих повышенной устойчивостью к присутствию ДМСО.

5. Получение методом направленной эволюции мутантных форм люциферазы, обладающих повышенной термостабильностью. Изучение кинетики термоинактивации и физико-химических свойств полученных мутантов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Катализ», Кокшаров, Михаил Иванович

выводы

1. Получен мутант люциферазы светляков Lucióla mingrelica с двойной заменой G216N/A217L. Введение этих замен повышает термостабилъность и устойчивость люциферазы по отношению к ДМСО, а также смещает максимум спектра биолюминесценции в длинноволновую область (от 566 до 610 нм). Хотя активность полученного мутанта снижается в 7 раз по сравнению с исходной люциферазой, тем не менее превышает в 200 раз активность люциферазы Н. parvula (98% гомологии с i люциферазой L. mingrelica) с единичной заменой A217L.

2. Сконструированы плазмиды pETL4, pETL7 на основе серии рЕТ, которые кодируют ген люциферазы, содержащей шестигистидиновую на N- и С-конце фермента соответственно (N-His()-luc и C-His6-luc). Использование плазмид pETL4, pETL7 вместо ранее применявшейся плазмиды pLR позволило сократить длительность культивирования клеток в два раза, а длительность очистки - в 18 раз. При этом удельная активность люциферазы увеличилась в 2,3 раза, а выход фермента - в 2-3 раза по сравнению с нативным. Показано, что спектральные свойства и стабильность C-Hisö-luc практически совпадают с наблюдаемым для нагивной люциферазы в отличие от N-Hise-luc.

3. В результате случайного мутагенеза первых 225 остатков люциферазы идентифицирован 31 мутант, обладающий изменённым цветом биолюминесцен-ции и сохраняющий заметную активность. Изучены свойства пяти отобранных мутантов. Показано, что замены F16L, Y35N, Y35H, A40S приводят к значительному снижению pH-чувствительности спектра биолюминесценции люциферазы светляков L. mingrelica. Впервые обнаружена единичная замена (Y35N и Y35H), в результате которой спектр биолюминесценции люциферазы не зависит от pH в диапазоне pH 68. Предложен механизм, объясняющий влияние замен остатка Y35 на рН-чувствительность спектра биолюминесценции люциферазы. Найдена мутация SI 18С, повышающая термостабильность люциферазы в 2 раза и удельную активность в 1,3 раза.

4. Адаптирована методика скрининга библиотеки мутантов люциферазы в колониях Е. coli для отбора мутантов с повышенной устойчивостью к действию ДМСО. Идентифицировано 17 мутантов, более устойчивых к действию ДМСО. Изучены три мутанта, активность которых в присутствии 30% ДМСО в два раза превышает активность люциферазы дикого типа.

5. В результате четырех последовательных циклов случайного мутагенеза получен мутант 4TS люциферазы светляков с восемью заменами, стабильность которого возросла в 66 раз при 42°С. Повышение термостабильности мутантного фермента в основном обусловлено заменами R211L, A217V, Е356К и S364C. Удельная активность мутанта возросла в ~2 раза по сравнению с люциферазой дикого типа, а Кт по АТФ понизилась в 8 раз. При 37°С мутант через двое суток сохраняет 70% активности, т. е. его термостабильность достаточна для большинства практических применений люциферазы светляков.

6. Получен продуцент люциферазы светляков Lucióla mingrelica на основе плазмиды pETL7, содержащей ген термостабильного мутанта 4TS люциферазы. Выход фермента повысился в 3,5-4 раза, а удельная активность - в 4,4 раза по сравнению с ранее использовавшимся продуцентом нативной люциферазы L. mingrelica.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кокшаров, Михаил Иванович, 2009 год

1. Haddock S.H.D. Luminous marine organisms. II in Photoproteins in Bioanalysis. / Eds. Daunert S. and Deo S.K. Wiley-VCH. Weinheim. 2006. P. 25-47.

2. Wilson Т., Hastings J.W. BIOLUMINESCENCE. // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998. V. 14. P. 197-230.

3. Hastings J.W. Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems. II J. Mol. Evol. 1983. V. V19. P. 309-321.

4. Hastings J.W., Johnson C.H. Bioluminescence and chemiluminescence. II Methods Enzymol. 2003. V. 360. P. 75-104.

5. Harvey E.N. Review of Bioluminescence. П Annu. Rev. Biochem. 1941. V. 10. P. 531-552.

6. Seliger H.H., McElroy W.D. Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. II Arch. Biochem. Biophys. 1960. V. 88. P. 136-141.

7. Ando Y., Niwa K., YamadaN., Enomoto Т., Irie Т., Kubota H., Ohmiya Y., Akiyama H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission. II Nat. Photon. 2008. V. 2. P. 44-47.

8. Lundin A. Use of firefly luciferase in ATP-related assays ofbiomass, enzymes, and metabolites. 11 Methods Enzymol. 2000. V. 305. P. 346-370.

9. Roda A., Pasini P., Mirasoli M., Michelini E., Guardigli M. Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence. // Trends Biotechnol. 2004. V. 22. P. 295-303.

10. Viviani V.R., Ohmiya Y. Beetle luciferases: colorful lights on biological processes and diseases. II in Photoproteins in Bioanalysis. / Eds. Daunert S. and Deo S.K. Wiley-VCH. Weinheim. 2006. P. 49-63.

11. Greer III L.F., Szalay A. A. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review. II Luminescence. 2002. V. 17. P. 43-74.

12. Nyren P. The History ofPyrosequencing®. U Methods Mol. Biol. 2007. V. 373. P. 1-13.

13. Arai R., Nakagawa H., Kitayama A., Ueda H„ Nagamune T. Detection of protein-protein interaction by bioluminescence resonance energy transfer from firefly luciferase to red fluorescent protein. II J. Biosci. Bioeng. 2002. V. 94. P. 362-364.

14. Paulmurugan R., Gambhir S.S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. 11 Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 2346-2353.

15. Chen H„ Zou Y., Shang Y., Lin H., Wang Y„ Cai R., Tang X., Zhou J.-M. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. И Plant. Physiol. 2008. V. 146. P. 368-376.

16. Funabashi H., Matsuzawa R., Nakamura M., Mie M., Kobatake E. Bioluminescent enumeration of surface antigen-specific cells using the streptavidin-luciferase fusion protein. II Sens. Actuators, B. 2006. V. 120. P. 51-56.

17. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ (Развитие некоторых аспектов проблемы за последнее десятилетие). II Биохимия. 1993. Т. 58. С. 1351-1372.

18. Viviani V.R. The origin, diversity, and structure function relationships of insect luciferases. // Cell Mol Life Sci. 2002. V. 59. P. 1833-1850.

19. Morton R.A., Hopkins T.A., Seliger H.H. Spectroscopic properties of firefly luciferin and related compounds; an approach to product emission. II Biochemistry. 1969. V. 8. P. 15981607.

20. Liu Y.-J., De Vico L., Lindh R. Ab initio investigation on the chemical origin of the firefly bioluminescence. II J. Photochem. Photobiol., A. 2008. V. 194. P. 261-267.

21. Viviani V.R., Arnoldi F.G.C., Neto A.J.S., Oehlmeyer T.L., Bechara E.J.H., Ohmiya Y. The structural origin and biological function ofpH-sensitivity in firefly luciferases. II Photochem. Photobiol. Sci. 2008. V. 7. P. 159-169.

22. Nakajima Y., Kimura Т., Sugata K., Enomoto Т., Asakawa A., Kubota H., Ikeda M., Ohmiya Y. Multicolor luciferase assay system: one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. II BioTechniques. 2005. V. 38. P. 891-894.

23. Branchini B.R., Southworth T.L., Khattak N.F., Michelini E., Roda A. Red- and green-emitting firefly luciferase mutants for bioluminescent reporter applications. II Anal. Biochem. 2005. V. 345. P. 140-148.

24. White P.J., Squirrell D.J., Arnaud P., Lowe C.R., Murray J.A. Improved thermostability of the North American firefly luciferase: saturation mutagenesis at position 354. II Biochem. J. 1996. V. 319 (Pt 2). P. 343-350.26