Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, доктор биологических наук Франк, Людмила Алексеевна

• Франк, Людмила Алексеевна
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Франк, Людмила Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ Са2+-РЕГУЛИРУЕМЫЕ ФОТОПРОТЕИНЫ КАК РЕПОРТЕРНЫЕ БЕЖИ В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Получение и очистка рекомбинантных Ca -регулируемых фотопротеинов.

1.2.Получение биоспецифичных производных рекомбинантных фотопротеинов, пригодных для использования в качестве меток в микроанализе in vitro.

1.2.1. Химический синтез коньюгатов.

1.2.2. Получение бифункциональных химерных белков акворин -биоспецифичный полипептид.

1.3. Биолюминесцентный молекулярный микроанализ с использованием акворина в качестве репортерного белка

1.3.1. Биолюминесцентный иммуноанализ с использованием акворина как репортерного белка.

1.3.2. ДНК-гибридизационный анализ с использованием акворина в качестве репортерного белка.

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3.ВЫ ДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА.

3.1. Экстракция апообелина из рекомбинантных клеток Е. coli (этапы 1-3).

3.2. Очистка апообелина ионообменной хроматографией в денатурирующих условиях (этап 4).

3.3. Активация апообелина целентеразином. (этап 5).

3.3.1. Влияние природы восстановителя и его концентрации на эффективность активации апообелина.

3.3.2. Зависимость эффективности активации от остаточной концентрации мочевины.

3.3.3. Зависимость эффективности активации от pH активационного буфера.

3.3.4. Зависимость эффективности активации от концентрации апобелка.

3.3.5. Кинетика активации.

3.4. Очистка обелина ионообменной хроматографией (этап 6).

3.5. Основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина.

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ БИОСПЕЦИФИЧНЫХ КОНЬЮГАТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ МЕТОК В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ.

4.1. Получение биоспецифичных коньюгатов обелина химическими методами.

4.1.1 Синтез биотинилированных производных.

4.1.2. Синтез коньгатов с другими гаптенами и с белками.

4.2. Получение коньюгатов обелина в виде генетических химер.

4.2.1. Биотинилирование обелина in vivo.

4.2.2. Получение химерного белка proZZ-Obe.

ГЛАВА 5. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЬЮГАТОВ ОБЕЛИНА В КАЧЕСТВЕ МЕТКИ.

5.1. Биолюминесцентный иммуноанализ альфафетопротеина (АФП).

5.2. Биолюминесцентный • иммуноанализ тиреотропина (ТТГ) и двух форм тироксина — общего (ТТ4) и свободного (FT4).

5.3i, Бйолюминесцентнышиммуноанализ инфекционных агентов.'.

5.4. Био люминесцентный ä иммуноанализ; антител к туберкулезному ТОКСИН^!.';.'1.1.

5.5. Одновремешшй биолюминесцентный иммуноанализ . двух антигенов в. одном образце с ипользованием мутантных вариантов обелина с измененными^ спектрами биолюминесценции :.;.:.

5.6. Биолюминесцентный иммуноанализ двух антигенов в одном образце с ипользованием обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой

Metridia longa.

5.6.1. Выделение, очистка и некоторые физико-химические свойства целентеразин-зависимой рекомбинантной люциферазы Metridia longa (MLuc39).

5.6.2. Биотинилирование MLuc39 и использование полученных производных в твердофазном микроанализе двух антигенов в одном образце в тандеме с обелином.

ГЛАВА 6. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА.

6.1. Твердофазный гибридизационный анализ в модельных системах.

6.1.1. Анализ на мелкодисперсном полимере ДМЭГ-7.

6.1.2. Анализ на поверхности микропланшет.

6.2. Анализ продуктов ПЦР гена вируса гепатита С.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина»

Биолюминесценция - это излучение света в видимом диапазоне, происходящее в процессе жизнедеятельности живых организмов [Hastings J.W., 2001]. Хотя светящиеся организмы стоят на разных ступенях эволюционной лестницы — от бактерий до рыб, — все они имеют одинаковую природу свечения. Фактически, биолюминесценция - это хемилюминесцентная реакция, в которой происходит окисление субстрата -люциферина, катализируемое специфическим ферментом — люциферазой. Все люциферазы принадлежат к классу оксигеназ и катализируют реакции окисления субстратов молекулярным кислородом, в результате чего образуются молекулы продукта в высокоэнергетичном (возбужденном) состоянии. При переходе в основное состоянии избыток энергии высвобождается в виде кванта света. Важным преимуществом биолюминесцентных реакций, по сравнению с хемилюминесцентными, является высокий квантовый выход, достигающий в некоторых случаях 90%. Этот факт предопределил перспективность создания сверхчувствительных и высокоспецифичных аналитических систем с использованием биолюминесцентных белков в качестве репортеров биоспецифического взаимодействия [Kricka L., 1988]. Сейчас люциферазы используются как репортерные белки во всех областях фундаментальной биологической науки, где требуется визуализация протекающих процессов — от изучения белок-белковых взаимодействий в отдельных клетках до поведенческих реакций организмов. Гены люцифераз широко используются для визуализации экспрессии генов в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Люцифераза светляка используется как репортер в пиросеквенировании ДНК. Активно развивается применение люцифераз в аналитических методах in vitro для решения! широкого спектра аналитических задач — от экологического мониторинга среды обитания человека (интегральные биотесты) до молекулярной диагностики различных заболеваний и инфекций. применения фотопротеинов в качестве репортеров в анализе in vitro [Lewis J.C., Daimert S., 2000, Actor J., 2000]. Мощным стимулом для развития этого направления послужило клонирование кДНК ряда апофотопротеинов (акворина, обелина и других) в период с 1985-1995 и получение рекомбинантных белков, практически не отличающихся по своим физико-химическим свойствам от природных. В последующий период появился ряд работ, описывающий эффективное использование рекомбинантного фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в иммуноанализе ряда биологически важных соединений, а также в гибридизационном анализе для решения целого ряда задач - от изучения механизмов регуляции экспрессии генов в ответ на различные стимулы, до определения генмодифицированных источников в пищевых продуктах. Эти исследования проводятся исключительно за рубежом, и хотя некоторые фирмы производят этот белок, его коммерческая стоимость велика, что делает его недоступным для широкомасштабного практического использования.

В-Институте биофизики СО РАН на протяжении последних 20-ти лет проводились интенсивные исследования биолюминесцентной системы гидроидного полипа Obelia longissima, обитающего в водах Белого моря. Свечение этого организма обусловлено наличием белка обелина, также принадлежащего семейству Са2+-регулируемых фотопротеинов. Были получены в чистом виде и изучены* несколько изоформ природного обелина, клонирован ген апообелина, получены генетические конструкции для экспрессии рекомбинантного апообелина в клетках Е. coli, что обеспечило постоянный источник, рекомбинантного белка. Проведенные исследования; создали предпосылки? для, разработки высокоэффективных биолюминесцентных аналитических систем на основе обелина. Современная; отечественная? медицина, фундаментальная? биология» и биотехнология нуждаются в новых высокочувствительных, высокоспецифичных; и; в то же время, недорогих методах, молекулярной диагностики. К создаваемым новым аналитическим системам предъявляются следующие основные требования:

1) высокая чувствительность, сравнимая с радиоизотопным анализом, но при этом все компоненты должны отличаться стабильностью и безопасностью для работы персонала; 2) доступность всех составляющих компонентов; 3) возможность проведения анализа в автоматическом режиме; 4) простота процедуры анализа, не требующая высокой квалификации персонала.

К сожалению, современные российские медицинские лаборатории в огромной степени оснащены либо морально устаревающими радиоизотопными диагностикумами, либо импортными аналитическими приборами и наборами реактивов. Последнее существенным образом отражается на стоимости анализа и делает отечественное здравоохранение зависимым от импортных поставок и состояния мирового рынка.

В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является чрезвычайно актуальной задачей. Одним из ее решений может стать разработка диагностикумов на основе светоизлучающих белков и, в частности, на основе Са2+-регулируемых фотопротеинов. Это определило направление исследований данной работы, ориентированной на комплексное исследование рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина применительно к биоаналитическим задачам, конечной целью которой является создание на его основе отечественных высокочувствительных надежных и простых для рутинного применения биолюминесцентных диагностикумов для определения социально-важных заболеваний и инфекций.

Целью настоящего исследования было создание биотехнологической основы нового направления молекулярного высокопроизводительного микроанализа с использованием рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его генетически-модифицированных аналогов, в. качестве биолюминесцентных репортеров.

Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач:

1. Разработать высокоэффективную технологию получения рекомбинантного обелина и его мутантных аналогов в высокоочищенном виде.

2. Разработать способы получения производных обелина - химических коньюгатов и генноинженерных химер — с различными биоспецифичными молекулами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров в анализе in vitro.

3. Показать перспективность применения обелиновых репортеров в иммуноанализе и ДНК-зондировании и обосновать конкурентноспособность ' предлагаемого нового направленйя биолюминесцентного молекулярного микроанализа

Цель работы и комплекс задач сформулированы впервые. Их решение обеспечило получение новых фундаментальных знаний по различным аспектам биотехнологии рекомбинантных Са регулируемых фотопротеинов и являются научной основой для практического применения этих белков в различных молекулярно-биологических исследованиях, а также созданию отечественных высокочувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных веществ и инфекционных агентов. Научная новизна.

Впервые проведены комплексные исследования рекомбинантного Са2+-регулируемого фотопротеина обелина как высокочувствительного репортера для биолюминесцентного молекулярного микроанализа.

Разработан эффективный способ получения рекомбинантного обелина в гомогенном виде с выходом около 50% от экспрессированного апобелка. Изучены основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина (спектральные характеристики, параметры биолюминесцентной* реакции, термоинактивации и условия хранения).»

Выявлены закономерности химического модифицирования рекомбинантного обелина действием различных реагентов, направленного на получение его высокоактивных коньюгатов с биоспецифичными молекулами гаптенами, авидином или стрептавидином, иммуноглобулинами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров (меток) в биолюминесцентном микроанализе. Получен и охарактеризован как высокочувствительный биолюминесцентный репортер химерный белок proZZObe, обладающий биолюминесцентной активностью обелина и аффинностью белка А из Stapyilococcus aureus к Fe фрагментам иммуноглобулинов класса G.

Экспериментально обоснована перспективность применения полученных коньюгатов для биолюминесцентного иммуноанализа на примере определения ряда биологически-активных веществ - гормонов, онкомаркеров, инфекционных агентов в сыворотках. Показано, что метки на основе рекомбинантного обелина обеспечивают чувствительность микроанализа, равную или близкую чувствительности радиоизотопного анализа, стабильны при хранении в растворе, замороженном или лиофилизированном виде, обладают низким уровнем шума, просты и безопасны. В отличие от иммуноферментного анализа с колориметрической детекцией продукта, анализ на основе обелинового репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции.

Впервые предложены варианты высокочувствительного двухпараметрического биолюминесцентного микроанализа: одновременного -на основе мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции и последовательного - на основе обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa.

Показано, что коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения биотинилированных олигонуклеотидов. в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера позволяет определять 10~ПМ (10~15 моль) матрицы, что на- порядок выше чувствительности аналогичного кориметрического репортера на базе щелочной фосфатазы.

Практическая значимость

На основе разработанной технологии получения рекомбинантого обелина высокой очистки налажено его мелкооптовое производство. Получение белка занимает в среднем 22-24 часа и может осуществляться специалистом технической квалификации. Этим способом получены ряд различных генетических вариантов обелина, а также рекомбинантные акворин

24" и его варианты, клитин и Са -регулируемый целентеразин-связывающий белок КепШа тиеПеп.

Полученные коньюгаты обелина с биоспецифическими молекулами являются основными компонентами для создания отечественных высокочувствительных биолюминесцентных иммунодиагностикумов и наборов для ДНК-гибридизационного анализа, направленных на выявление социально-важных заболеваний и инфекций.

Предложенные варианты двухпараметрического биолюминесцентного микроанализа позволяют создавать двухпараметрические диагностикумы, а в перспективе - многопараметрические диагностикумы, использование которых существенным образом удешевит и интенсифицирует анализ, а также позволит исключить ошибки разнесенного во времени раздельного определения двух или нескольких антигенов в одном образце сыворотки.

В перспективе разработка биолюминесцентных высокочувствительных и простых для рутинного применения молекулярных диагностикумов на основе рекомбинантного обелина может способствовать решению задачи обеспечения отечественного здравоохранения тест-системами нового поколения.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан эффективный способ получения рекомбинантного Са -регулируемого фотопротеина обелина и его генетических вариантов, позволяющий за 22-24 ч получать высокоочищенный белок силами специалиста технической квалификации.

2. Выявлены закономерности химического модифицирования обелина и предложены способы получения его высокоактивных химических коньюгатов с гаптенами и биоспецифическими белками, пригодных для использования в качестве биолюминесцентных репортеров в молекулярном микроанализе.

3. Экспериментально обоснована перспективность и конкурентноспособность биолюминесцентных репортеров на базе рекомбинантного обелина в иммуно- и ДНК-гибридизационном микроанализе биологически важных веществ.

4. Предложены варианты высокочувствительного двух-параметрического биолюминесцентного микроанализа: одновременного — на основе мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции и последовательного - на основе обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa.

В результате проведенных комплексных исследований разработана биотехнологическая основа для создания отечественных биолюминесцентных диагностикумов социально-важных заболеваний и инфекций. Вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании' и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы и публикации

Основные материалы, изложенные в работе были представлены на Международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и СПИДу (Ленинград, 1991), Симпозиуме по биолюминесценции (Гаваи, США, 1993), на VIII-XV Симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж Великобритания, 1994 г.; Вудсхол США, 1996 г.; Болонья- Италия, 19981 г.; Асиломар США, 2000 г.; Кэмбридж Великобритания, 2002 г.; Йокогама Япония, 2004 г.; Парадиз Пойнт США, 2006, Шанхай Китай 2008 гг.), П-й Международной конференции по клинической хемилюминесценции- (Берлин, 1996), 31-ом Международном. симпозиуме по морской биологии (С.Петербург, 1996), на Международной конференции по инструментальным методам анализа (Патры, Греция, 2007), на Международных конференциях «Фундаментальная наука - медицине» (Новосибирск, 2007, 2008 гг.), на V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

По материалам диссертации опубликовано 57 работ, из которых 18 -статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 10 — статьи в сборниках трудов Международных конференций, 1 заявка на патент, 1— препринт и 27 — тезисы докладов на конференциях.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Франк, Людмила Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана эффективный способ получения рекомбинантного Са2+ -регулируемого апофотопротеина обелина из штамма-суперпродуцента Е.соИ ВЬ2^оМ (рЕТ19-ОЬ8). Разработанный подход успешно использован для выделения ряда мутантных вариантов апообелина и других рекомбинантных целентреразин-связывающих Са - активируемых белков, полученных на основе аналогичной экспрессирующей конструкции. Выход высокоочищенных апобелков составляет 30-45 мг на грамм сырой клеточной пасты.

2. Разработаны эффективные условия получения активированного рекомбинантного обелина дикого типа в практически индивидуальном состоянии с выходом 75-80% от исходного апобелка. Выход активированных мутантных вариантов обелина в тех же условиях зависит от произведенных аминокислотных замен.

3. Рекомбинантный обелин дикого типа обладает физико-химическими свойствами, близкими природному обелину: удельная биолюминесцентная активность: б.ЗхЮ15 кв мг"1; константа спада биолюминесцентного сигнала: к^ = 6.6 с"1; спектральные характеристики свечения: Хтах=482 нм, плечо при А.=390 нм; спектр абсорбции содержит две характерные полосы с Хтах)=280 нм, Е]МГ/МЛ=2.5 и А,тах2=460 нм, Е2мг/мл=0.022. Предел обнаружения рекомбинантного обелина составляет 1 амоль. Белок обладает относительной стабильностью к действию протеаз. Определены условия хранения в растворе, замороженном и лиофилизированном виде без потери биолюминесцентной активности.

4. Разработан,эффективный способ получения коньгатов обелина.с биоспецифичными молекулами4 (гаптенами, иммуноглобулинами, авидином или стрептавидином), позволяющий сохранить 75-80% исходной биолюминесцентной активности белка. Полученные производные стабильны в условиях проведения модельного анализа, при хранении в растворе, а также в замороженном и лиофилизированном виде.

5. На примере твердофазного иммуноанализа ряда биологически важных веществ в сыворотках (гормонов, инфекционных агентов и др.) показано, что полученные коньюгаты обладают чувствительностью равной или близкой радиоизотопной метке, широким линейным диапазоном, низким уровнем шума, безопасны и стабильны в условиях анализа и при хранении. Биолюминесцентная реакция обелиновых меток отличается простотой (надо только добавить раствор Са2+) и высокой скоростью (на измерение стандартного 96-луночного планшета требуется 8 мин).

6. На примере твердофазного иммуноанализа двух гонадотропных гормонов показано, что репортеры на основе мутантных вариантов обелина с измененными характеристиками свечения позволяют одновременно и с высокой чувствительностью определять две мишени в одном образце сыворотки: сигналы от каждой мишени эффективно выделяются с помощью широкополосных оптических фильтров.

7. Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов с использованием двух разных репортеров - обелина и люциферазы МегНсНа с последовательным запуском биолюминесценых реакций. Показано, что применение в качестве «субстрата» люциферазы Са2+-зависимого целентеразин-связывающего белка КепШа позволяет инициировать биолюминесценцию обеих меток ионами Са2+.

8. Коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения биотинилированных олигонуклеотидов в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции и позволяет определять 10~ПМ (10*15 моль) матрицы, что на порядок выше чувствительности аналогичного кориметрического репортеров на базе щелочной фосфатазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена комплексным исследованиям рекомбинантного Са -регулируемого фотопротеина обелина как перспективного белка для использования в качестве биолюминесцентного репортера в аналитических системах in vitro.

Современные методы молекулярной диагностики - иммуноанализ и ДНК-гибридизационный анализ основаны на образовании высокоспецифичных комплексов антиген-антитело или комплексов комплементарных нуклеотидных последовательностей, одна из которых является мишенью. Для выявления этих комплексов используется ряд различных физико-химических методов, основанных на измерении радиоактивного, хемилюминесцентного, колориметрического, флуоресцентного или электрохимического сигнала. В этом ряду все большее внимание привлекают методы, основанные на регистрации светового сигнала, генерируемого светоизлучающими белками — люциферазами. Преимуществом биолюминесцентных систем, по сравнению с хемилюминесцентными, является высокий квантовый выход, позволяющий производить измерения с чувствительностью, близкой или превосходящей чувствительность радиоизотопного анализа. Среди известных на сегодняшний день биолюминесцентных систем особое место занимают кальций-регулируемые фотопротеины кишечнополостных. Эти небольшие (около 20 кДа) односубъединичные белки представляют собой устойчивые комплексы из апобелка и окисленного субстрата — 2-пероксицелентеразина. В аминокислотной последовательности белка находятся 3 кальций-связывающих сайта, присоединение ионов кальция по которым вызывает практически мгновенное декарбоксилирование субстрата с выделением энергии в виде света с квантовым выходом-около 0,25.

Как показывает анализ литературных данных, исследования- по применению одного из наиболее изученных фотопротеинов — акворина. медузы Aequoria victiria, проводимые учеными ряда стран — США, Великобритании; Греции, Италии и других - демонстрируют его перспективность как репортерного белка в исследованиях внутриклеточной динамики кальциевых потоков, а также в молекулярной диагностике. Было показано успешное использование этого белка как в иммуноанализе для определения ряда биологически активных и диагностически важных веществ так и в гибридизационном анализе для тестирования инфекционных агентов, генетического полиморфизма и генетически-модифицированных продуктов. Однако несмотря на то, что к настоящему времени рекомбинантный акворин производится несколькими зарубежными фирмами, стоимость его достаточно велика, а коммерческих препаратов представляющих собой биоспецифические коньюгаты, пригодные в качестве репортеров для производства диагностикумов не существует. Это существенным образом ограничивает перспективы практического использования акворина.

В нашей стране сотрудниками лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН проводятся многолетние исследования другого фотопротеина - обелина гидроидного полипа ОЬеИа 1оп2188та. После клонирования в 1992 году кДНК обелина и получения рекомбинатного аналога этого белка была поставлена задача его всестороннего исследования в том числе и для определения перспективности создания диагностических систем на его основе.

Потребность в создании аналитических систем нового поколения — высокочувствительных, недорогих и простых для рутинного применения - в нашей стране связана с тем, что зачастую медицинские лаборатории производят диагностику либо- с помощью морально устаревающих радиоизотопных методов, либо с помощью дорогостоящих импортных систем. Последнее приводит к зависимости отечественного здравоохранения от внешних поставок и- состояния мирового рынка, что, в. конечном- счете, отражается на качестве жизни,населения.

Таким образом; сформулированная цель исследований — создание биотехнологической основы для использования рекомбинантного Са -регулируемого фотопротеина обелина в качестве репортера для биолюминесцентного микроанализа in vitro и обоснование перспективности и конкурентноспособности биолюминесцентных диагностикумов на базе этого белка — является весьма актуальной.

Для ее достижения было необходимо решить ряд экспериментальных задач и, прежде всего, разработать эффективный способ получения рекомбинантного белка, чтобы обеспечить его доступность для проведения развернутых исследований и возможного практического применения.

Для экспрессии апобелка сотрудниками лаборатории - Б.А. Илларионовым и C.B. Марковой были сконструированы несколько разных штаммов-продуцентов апобелка. Наиболее удачным ' оказался продуцент, сконструированный C.B. Марковой на базе рЕТ системы (Novagen, США) -штамм Е. coli BL21gold (pET19-OL8), который и был использован в данной работе в качестве бактериального источника рекомбинантного белка. В результате проведенных исследований был создан эффективный способ, позволяющий получить высокоочищенный рекомбинантный обелин за относительно короткий промежуток времени - процедура занимает 22-24 часов суммарного времени и может проводиться специалистами технической квалификации. С одного грамма рекомбинантных бактериальных клеток в среднем получается около 25 мг белка высокой очистки. Этого количества достаточно чтобы провести микроанализ в более чем двух тысячах стандартных 96-луночных планшетах.

Разработанный способ позволил наладить мелкооптовое производство этого белка и успешно используется на протяжении почти 10 лет для ополучения не только обелина дикого типа, но и его мутантных вариантов, а также других фотопротеинов и их мутантных форм, полученных на базе той же экспрессирующей системы.

Следующей задачей было получение коньюгатов рекомбинантного обелина с гаптенами и, другими белками, способными образовывать биоспецифические комплексы с анализируемыми молекулами.

Ассортимент современных химических реагентов, предлагаемый рядом фирм (Pierce, Sigma-Aldrich, Uptima и др.) весьма обширен и позволяет выбрать кросс-линкеры, осуществляющие соединение молекул с использованием доступных реакционно-способных групп на их поверхности - -NH2, -SH, -ОН, -СООН. Задачей экспериментатора состоит в том, чтобы подобрать такие условия коньюгирования, которые позволяют максимально сохранить специфическую активность репортерного фермента. Иногда, как это было показано для люциферазы светляка, это становится неразрешимой проблемой. В результате проведенного в работе поиска были найдены условия получения коньюгатов рекомбинантного обелина с минимальными потерями его биолюминесцентной активности, не превышающими 20-30%. При этом был получен набор коньюгатов обелина с различными гаптенами и белками. Как было показано, разработанный универсальный способ получения коньюгатов в принципе позволяет получать коньюгаты с любыми молекулами, обладающими доступными аминогруппами - от аминокислот до иммуноглобулинов.

Другим подходом для получения бифункциональных молекул, обладающих активностью репортерного белка и специфической аффинностью к молекулам-мишеням является конструирование генетически слитых (химерных) белков. С использованием этого подхода в работе был получен функционально активный химерный белок, имеющий в своем составе иммуноглобулин-связывающий фрагмент белка А и обелин. Этот белок является универсальным биолюминесцентным репортером для определения антител. В принципе, его можно использовать для скрининга аффинности вновь полученных антител на определенный антиген. Показана принциальная возможность его использования* и для определения антигенов с помощью сэндвич-иммуноанализа, если для первичной сорбции в системе используются Fab-фрагменты иммуноглобулинов.

Полученные результаты показывают, что при экспрессии апообелина в виде единой полипептидной цепи с другими полипептидами он не теряет способность формировать активный фотопротеиновый комплекс. Таким образом, показана принципиальная возможность конструирования разнообразных химерных белков, обладающих активностью обелина и биоспецифичностыо добавленных полипептидов (например, миниантител), которые без дополнительных модификаций представляют собой биолюминесцентные репортерные белки.

Модельные эксперименты показали, что полученные химические коньюгаты и генетические химеры стабильны при хранении в растворе и лиофилизированном виде и пригодны для использования как биолюминесцентных метки в твердофазном анализе. Это позволило перейти к решению третьей задачи - экспериментальному обоснованию пригодности полученных биолюминесцентных меток для иммуноанализа в сыворотках. В качестве антигенов были исследованы: онкомаркер альфафетопротеин, тиреотропин и гормон щитовидной железы - тироксин (общий и свободная форма), лютеинизирующий и фолликулостимулирующий гормоны. При этом в случае тиреотропина и тироксина были исследованы не только стандартные и контрольные сыворотки, но и сыворотки пациентов, предоставленные сотрудниками диагностического отделения эндокринологического центра Красноярской краевой больницы. Было показано, что результаты радиоизотопного анализа и биолюминесцентного анализа тиреотропина (34 клинических образца) и свободного тироксина (10 клинических образцов) близки.

Возможность биолюминесцентного определения инфекционных агентов в сыворотках, а также в водной среде была показана на примерах иммуноанализа вируса гепатита В и бактерии Shigella sonnei, а также антител к туберкулезному токсину.

В ходе работ был разработан оригинальный- способ- одновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце. В качестве репортеров были использованы мутантные варианты обелина с измененными спектрами биолюминесценции: «фиолетовый», с максимумом при 390 нм и «зеленый», с максимумом при 492 нм. Спектры этих белков имеют низкое перекрывание и это позволяет эффективно разделять их биолюминесцентные сигналы с помощью широкополосных оптических фильтров. Потребность в методах одновременного определения двух мишеней связана с тем, что для правильной диагностики и установлении эффективности назначенной терапии часто необходим одновременный скрининг содержания двух и более веществ. Это особенно характерно для эндокринных заболеваний, где важно не только установить содержание того или иного гормона, но и баланса между ними. Например, для диагностики нарушений функций генеративных органов всегда в паре определяют содержание лютеинизи'рующего (JIT) и фолликуло-стимулирующего (ФСГ) гормонов; при нарушениях работы щитовидной железы всегда в паре определяют ТЗ (трийодтиронин) и Т4 (тироксин), свободные и связанные формы гормонов и т.д. Причем, «раздельное» определение свободных и связанных форм гормонов может вносить существенные искажения в результаты анализа.

В представляемой работе для одновременного определения были исследованы стандартные сыворотки, содержащие смесь лютенизирующего и фолликулостимулирующего гормонов. Полученные результаты показали, что без дополнительной оптимизации условий, при использовании одних и тех же коммерчески доступных антител, значение чувствительности одновременного биолюминесцентного иммуноанализа не уступает таковой раздельного радиоиммуноанализа. При этом одновременный анализ занимает меньшее время и позволяет избежать ошибок разнесенного во времени определения.

Другим предложенным подходом для определения двух антигенов в одном образце является использование в качестве репортеров двух различных биолюминесцентных белков — обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Metridia longa. Обнаруженная возможность применениям в качестве «субстрата» Са2+-зависимого целентеразин-связывающего белка Renilla muelleri позволяет производить запуск биолюминесцентной реакции обоих репортеров ионами кальция.

Отметим, что в состав традиционного иммунодиагностикума на основе колориметрического выявлениякак правило входят 6-7 компонентов (Таблица), часть из которых является нестабильными или агрессивными соединениями. Процедура анализа включает 4 операции. Состав ИФА набора с применением обелина должен включать только 4 компонента и проводиться с помощью 2-х операций. Таким образом предлагаемые биолюминесцентные диагностикумы на основе обелина по составу и количеству операций существенно проще для рутинного применения. Обелиновый репортер позволяет существенно сократить время анализа, поскольку исключается стадия длительного инкубирования с субстратом, а регистрация биолюминесценции обелина от каждой лунки длится всего 5 сек, т.е. на измерение 96-луночного планшета требуется 8 мин.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Франк, Людмила Алексеевна, 2009 год

1. Абелев, Г.И. Альфафетопротеин: биология, биохимия, молекулярная генетика / Г.И. Абелев // Иммунология.- 1994. № 3 - С. 4-10.

2. Бондарь, В. С. Получение, свойства и применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima. / B.C. Бондарь, Е.С. Высоцкий, И.А. Гамалей, А.Б. Каулин. // Цитология 1991. -Т. 33.-№6.-С. 50-58.

3. Бондарь, B.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / B.C. Бондарь, К.П. Трофимов, Е.С. Высоцкий // Биохимия. 1992. - Т.57. - С. 1481-1489

4. Бондарь, B.C. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина / B.C. Бондарь, К.В.Пуртов, Н.П. Маликова, Л.А. Франк, Б.А. Илларионов // Биохимия. — 2001.-Т. 66.-С. 1245-1251.

5. Борисова, В.В. Высокочувствительный и быстрый метод выявления ДНК-фрагментов с использованием фотопротеина обелина как репортера / В.В. Борисова, И.А Пышная, Д.В. Пышный, Л.А. Франк.// Биоорган, химия. -2008. Vol. 34. - Р. 792-798.

6. Вербов, В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа. // Твердофазный иммуноферментный анализ. Сборник научных трудов. Л. Изд. Института им. Пастера. 1988. 160с. С. 3-27

7. Виноградова, O.A. Повышение эффективности гибридизационного анализа путем ограниченной фрагментации ДНК-пробы / O.A. Виноградова, И.А. Пышная, В.Ф. Зарытова, Е.М. Иванова, Д.В. Пышный // Молекуляр. биология 2007. - Т. 41. - № 1. - С. 163-172.

8. Высоцкий, Е.С. Выделение и очистка Са-зависимого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima I Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В.Н. Летунов // Биохимия. 1989.-Т.54. - С. 965-973.

9. Высоцкий, Е.С. Выделение и свойства различных молекулярных форм Ca2 *-активируемого фотопротеина обелина. / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, И.И. Гительзон // Докл. АН СССР. 1991. - Т. 321. - С. 214-217.

10. Ю.Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных. / Е.С. Высоцкий, C.B. Маркова, J1.A. Франк // Молекуляр. Биология. 2006. - Т.40. - № 3. - С. 404-417.

11. П.Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак М.: Мир. 2002. - 589 с.

12. Дегтярев, С.Х. Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции. / С.Х.' Дегтярев, П.А. Белавин, И.Г. Шишкина, В.Ф. Зарытова, Л.П. Гаврюченкова, С.Н. Морозов // Биоорган, химия 1989.-Т. 15.-№ 3. - С. 358-362.

13. Дегранян, P.A. Методическое руководство по проведению контроля качества наборов реагентов для иммуноферментного анализа. / P.A. Дегранян, Н.Ф. Калита, A.C. Роганов -М.: МЗиМП РФ. 1994.

14. Илларионов, Б. А. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima. / Б.А. Илларионов, C.B. Маркова, B.C. Бондарь, Е.С. Высоцкий, И.И. Гительзон. //Докл. АН. 1992.- Т. 326. -№ 5. -С. 911-913.

15. H Лавин, «Эндокринология». М.: Практика, 1999. 1128 с.

16. Микеш Щ. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. Т. 1. М.: Мир. 1982. 400 с.

17. Нго, Т.Т. Иммуноферменный анализ / Т.Т. Нго, Г.М. Ленхофф. М.: Мир, 1988.-445 с.

18. Пузырь, А.П. Получение комплекса наноалмаз-белок-оксид алюминия. / А.П. Пузырь, B.C. Бондарь, П.И. Белобров, A.A. Букаемский // Докл. РАН.- 20001 Т. 373.- С. 408-410.

19. Пышный, Д.В. Выявление однобуквенных замен в амплифицированных фрагментах ДНК путем лигирования тандемов коротких олигонуклеотидов в растворе и на твердофазном носителе./ Д.В.

20. Пышный, JI.M. Скобелыдина, Е.Н. Гущина, И.А. Пышная, И.Г. Шишкина, Г.М. Дымшиц, В.Ф. Зарытова, Е.М. Иванова // Молекуляр. биология. -2000. Т.34. - № 6. - С. 984-997.

21. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1977.-302 с.

22. Франк, JT.A. Са -активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза в иммунологическом микроанализе. / Л.А. Франк, B.C. Бондарь, Н.А. Тюлькова, Е.С. Высоцкий // Препринт №113Б, Красноярск: Изд-во ИФ СО РАН. 1992. - 22с.

23. Франк, Л.А. Синтез конъюгатов Са -регулируемого фото протеина обелина с иммуноглобулинами и их использование в качестве меток в иммуноанализе / Л.А Франк, А.И. Петунин, Е.С. Высоцкий // Биоорган, химия. 2004,- Т. 30.- № 4. - С. 364-368.

24. Франк Л.А. Рекомбинантный фотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima: выделение и использование в иммуноферментном анализе. // Дисс. канд. биол. наук. Красноярск. — 1997а). — 97 с.

25. Франк, Л.А. Са -активируемый фотопротеин обелин как метка в иммуноферментном анализе / Л.А. Франк, Е.С. Высоцкий, А.И. Петунин, А.В. Навдаев. // Иммунология.-1997. -№ 1. С. 55-57.

26. Actor, J.K. A flexible bioluminescent-quantitative polymerase chain reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. / J.K. Actor, J.R. Limor, R.L. Hunter//J. Clin. Lab. Anal. 1999. - Vol. 13.-P. 40-47.

27. Actor, J.K. Bioluminescent quantitation and detection of gene expression during infectious disease. / J.K. Actor // Comb. Chem. High Throug. Screen. -2000.-Vol. 3.- P. 277-288.

28. Ahmed, F.E. Detection of genetically modified organisms in food. / F.E Ahmed // Trends in Biotechnol. 2002 - Vol. 20. No.5. -. P. 215-223

29. Adamczyk, M. Dual analyte detection using tandem flash luminescence / M. Adamczyk, J.A. Moore, K. Shreder // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. - Vol. 12.-P. 395-398.

30. Alard, P. A versatile ELISA-PCR assay for mRNA quantitation from a few cells. / P. Alard, O. Lantz, M. Sebagh, C.F. Calvo, D. Weill, G. Chavanel, A. Senik, B. Charpentier // Biotechniques.— 1993 -Vol. 15. -No.4.-P. 730-737.

31. Allen D.G Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration—a calcium-independent component. / D.G. Allen, J.R. Blinks, F.G. Prendergast // Science 1977. - Vol. 195 (4282). - P. 996-998.

32. Altmann, F. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins / F. Altmann, E. Staudacher, I. B. Wilson, L. März. // Glycoconj. J.- 1999.-Vol. 16.-P. 109-123.

33. Belogurova, N.V. Spectral components of bioluminescence of aequorin and obelin / N.V. Belogurova, N.S. Kudryasheva, R.R. Alieva, A.G. Sizykh // J. Photochem. Photobiol. B. 2008. - Vol. 92. - P. 117-122:

34. Bieniarz, C. Extended length heterobifunctional coupling agents for protein conjugations / C. Bieniarz, V. Husain, G. Barnes, C.A. King, C.J. Welch. // Bioconjugate Chem. -1996 Vo. 6 - P. 88-95.

35. Blinks, J.R. Measurement of Ca++ concentrations in living cells / J.R. Blinks, W.G. Wier, P. Hess, F.G. Prendergast // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1982. -Vol. 40.-P. 1-114.

36. Blinks, J.R. Intracellular Ca2+ measurements / J.R. Blinks. // The Hart and Cardiovascular System. Eds. Fozzard H.A. et al. Raven Press, New York, -1986.-P. 671-701.

37. Borisova, V. V. Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding and applicability for in vitro assay. / V. V. Borisova, L. A. Frank, S. V. Markova, L. P. Burakova, E. S. Vysotski // Photochem. Photobiol. Sci.2008.-Vol. 7.-P. 1025-1031

38. Campbell, A.K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from hydroid Obelia geniculata. / A.K. Campbell. 11 Biochem. J. 1974. -Vol. 143. - P. 411-418

39. Casadei, J. Characterization of a chimeric aequorin molecule expressed in myeloma cells. / J. Casadei, M.J. Powell, J.H. Kenten // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. - Vol. 4. - P. 346-350.

40. Casadei, J. Expression and secretion of aequorin as a chimeric antibody by means of a mammalian expression vector. / J. Casadei, M. J. Powell, J. H. Kenten. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 2047-2051

41. Gingeras, T.R. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics. / T.G. Gingeras, R. Higuchi, L.J. Kricka, Y.M.D. Lo, C.T. Wittner. // Clin. Chem. 2005.-Vol. 51.-P. 661-671.

42. Cormier, M.J. The enzymology and molecular biology of the Ca" -activated photoprotein, aequorin. / M.J. Cormier, D.C. Prasher, M. Longiaru, R.O. McCann. // Photochem.Photobiol. -1989. Vol. 49. - P. 509-512.

43. Christopoulos, T.K. Expression immunoassay. Antigen quantitation using antibodies labeled with enzyme-coding DNA fragments. / T.K. Christopoulos, N.H.L. Chiu // Anal. Chem. 1995. - Vol 67.- P. 4290-4294.rj T

44. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant / L. Deng, E.S. Vysotski, Z.-J. Liu, S.V. Markova, N.P. Malikova, J. Lee, B.-C. Wang // FEBS Lett. 2001. - Vol. 506. -P. 281-285.

45. Deo, S.K. Bioluminescence detection of proteolytic bond cleavage by using recombinant aequorin. / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Anal. Biochem -2000.- Vol. 281.-P. 87-94.

46. Deo, S.K. C-terminal and N-terminal fusions of aequorin with small peptides in immunoassay development. / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Bioconjugate Chem. -2001.- Vol. 12. P. 378-384.

47. Deo, S.K. An immunoassay for Leu-enkephalin based on a C-terminal aequorin-peptide / S.K. Deo, S. Daunert. // Anal. Chem. 2001a).- Vol. 73. -P. 1903-1908.

48. Doleman, L. Bioluminescence DNA hybridization assay for Plasmodium falciparum based on the photoprotein aequorin / L. Doleman, L. Davies, E.A. Moschou, L. Rowe, S. Deo, S. Daunert // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79. - P. 4149-4153.

49. Drake, D. R. Patterns of expression of viral and cytokine gene transcripts during mouse polyoma virus infection. / D. R. Drake, L. Knoepp, J. K. Actor,

50. A. E. Lukacher. // Comb. Chem. High Throug. Screen. 2000. - Vol. 3. - P. 329-341.

51. Elenis, D.S. Quadruple-analyte chemiluminetric hybridization assay. Application to double quantitative competitive polymerase chain reaction. / D.S. Elenis, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos. // Anal. Chem. 2007 - Vol. 79. - No. 24. - P. 9433-9440.

52. Elenis, D.S. Advances in molecular techniques for detection of genetically modified organisms. / D.S. Elenis, D.P. Kalogianni, K. Glynou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos. // Anal. Bioanal. Chem. -2008. Vol. 392. - P. 347-354.

53. Erikaku, T. Bioluminescent immunoassay using a monomeric Fabphotoprotein aequorin conjugate / T. Erikaku, S. Zenno, S. Inouye // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - Vol. 174.-No. 3.-P.1331-1336.

54. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji. //FEBS Lett. 1993. - Vol. 333. - P. 301-305.

55. Ford, C. F. Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins. / C. F. Ford, I. Suominen, C.E. Glatz // Protein Expr. Purif. — 1991. — Vol. 2.-P. 95-107.

56. Feltus, A. Interaction of immobilized avidin with an aequorin-biotin conjugate: an aequorin-linked assay for biotin / A. Feltus, S. Ramanathan, S. Daunert // Anal. Biochem. 1997. - Vol. 254. - P. 62-68

57. Feltus, A. Detection of biotin in individual sea urchin oocytes using a bioluminescence binding assay / A. Feltus, A.L. Grosvenor, R.C. Conover, K.W. Anderson, S. Daunert//Anal. Chem. -2001. Vol. 73. -P. 1403-1407

58. Frank, L.A. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay. / L.A. Frank, V.A. Illarionova, E.S. Vysotski // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996.- Vol. 219. - P. 475-479.

59. Frank, L.A. Bioluminescent immunoassay of thyrotropin and thyroxine using obelin as a label / L.A. Frank, A.I. Petunin, E.S. Vysotski. // Anal. Biochem. -2004. Vol. 305. - P. 240-246.

60. Frank, L. Bioluminescent signal system: bioluminescence immunoassay of pathogenic organisms. / L.Frank, S. Markova, N. Remmel, E. Vysotski, I. Gitelson // Luminescence. 2007. - Vol. 22. - P. 215-220.

61. Friedhoff, P. Quantitative polymerase chain reaction with oligodeoxynucleotide ligation assay/enzyme-linked immunosorbent assay detection. / P. Friedhoff, M. Hahn, H. Wolfes, A. Pingoud // Anal. Biochem. -1993.-Vol. 15.-P. 9-16.

62. Galvan, B. Bioluminescence hybridization assays using recombinant aequorin. Application to the detection of prostate-specific antigen mRNA. / B. Gal van, T.K. Christopoulus // Anal. Chem. 1996. - Vol. 68. - P. 3545-3550.

63. Glynou, K. Affinity capture-facilitated preparation of aequorin-oligonucleotede conjugates for rapid hybridization assays. / K. Glynou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus. // Bioconjugate Chem. 2003.- Vol. 14. - P. 1024-1029.

64. Glynou, K. One-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography. / K. Glynou, P. C.Ioannou, T. K.Christopoulos // Protein Expr. Purif. 2003a). - Vol .27. - P 384-390.

65. Gorokhovatsky, A. Y. Cell-free bioluminescent screening of translation inhibitors. / A. Y. Gorokhovatsky, L.A. Shaloiko, V.S. Bondar, E.S. Vysotski, E.E. Maximov, H. von Doehren, Y.B. Alakhov // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. - Vol. 27. - P. 259-263.

66. Green, N.M. Spectrophotometric determination of avidin and biotin / N.M. Green // Meth. Enzym. 1970. - Vol. 18 - P. 418-424.

67. Guenthner, P.C. Quantitative, competitive PCR assay for HIV-1 using a microplate-based detection system. / P.C. Guenthner, C.E. Hart // Biotechniques. 1998. - Vol. 24. - P. 810-816.

68. Hastings, J.W. Total quantum flux of isotopic sources / J.W. Hastings, G. Weber //J. Opt. Soc. Am. 1963.-Vol. 53.-P.1410-1415.

69. Hastings, J.W. Calcium-triggered light emission in Renilla. A unitary biochemical scheme for coelenterate bioluminescence / J.W. Hastings, J.G.

70. Morin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. Vol. 37. No. 3. - P. 493438.

71. Hastings, J.W. Bioluminescence / J.W. Hastings // In "Cell Physiology". 3rd edition. Ed.: N. Sperelakis. Academic Press. NY. 2001. - P. 1115-1130.

72. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 angstrom resolution. / J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura. // Nature. -2000. Vol. 405. - P. 372-376.

73. Hirano, T. Revision of the structure of the light-emitter in aequorin bioluminescence / T. Hirano, I. Mizoguchi, M. Yamaguchi, F.-Q. Chen, M. Ohashi, Y. Ohmia, F.I. Tsuji // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994.- P. 165-167.

74. Hockney, R.C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli / R.C. Hockney // Trends Biotechnol. 1994 - Vol. 12. - No. 11.-P. 456-463

75. Ho, J. A. Application of liposomal bioluminescent label in the development of a flow injection immunoanalytical system. / J.A. Ho, M.-R. Huang // Anal. Chem. 2005. - Vol. 77. - P. 3431 -3436.

76. Hori, K. Structure and chemical synthesis of a biologically active form of Renilla (Sea Pansy) luciferin. / K. Hori, M.J. Cormier. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1973.-Vol. 70.-P. 120-123.

77. Hori, K. Renilla luciferin as the substrate for calcium induced photoprotein bioluminescence. Assignment of luciferin tautomers in aequorin and mnemiopsin / K. Hori, J.M. Anderson, W.W. Ward, M.J. Cormier // Biochemistry 1975. - Vol. 14. - P.2371-2376.

78. Hori, K. Sructure of native Renilla reniformis luciferin. / K. Hori, H. Charbonneau, R.C. Hart, M.J. Cormier//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. -Vol. 74. - P. 4285-4287.

79. Inouye S. Overexpression and purification of the recombinant Ca -binding photoprotein, aequorin / S. Inouye , S. Aoyama , T. Miyata, F.I. Tsuji, Y. Sakaki. // J. Biochem. 1989. - Vol. 105 .- P .473-477

80. Inouye, S. High-level expression and purification of apoaequorin./ S. Inouye,

81. S. Zenno, Y. Sakaki, F.I. Tsuji. // Protein Expr.Purif.-1991.-Vol.2.-P.122-126.i

82. Inouye, S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca -activated photoprotein, clytin / S. Inouye, F.I. Tsuji. // FEBS Lett. -1993. Vol. 315. -P. 343-346.

83. Inouye, S. Soluble protein expression in E. coli cells using IgG-binding domain of protein A as a solubilizing partner in the cold induced system / S. Inouye, Y. Sahara. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2008. — Vol. 376 — P. 448-453.

84. Inouye, S. Cloning, expression, purification and characterization of an isotype of clytin, a calcium-binding photoprotein from the luminous hydromedusa Clytia gregarium. / S. Inouye // J. Biochem. 2008a).- Vol. 143.- No. 5 - P. 711-717.

85. Inouye, S. Recombinant aequorin with a reactive cysteine residue for conjugation with maleimide-activated antibody. / S. Inouye, J. Sato // Anal. Biochem. 20086). - Vol. 378.- No. 1. - P. 105-107.

86. Jackson, R.J. Lumonometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systematic antibody responses / R.J. Jackson, K. Fujihashi, H. Kiyono, J.R. McGhee // J. Immunol. Meth. 1996. - Vol. 190.-P. 189-197.

87. Jaenicke, R. Folding proteins. / R. Jaenicke, R. Rudolph // In: Protein structure: a practical approach. Ed.: T.E. Creighton. IRL Press. Oxford. — 1995. -P. 191-223.

88. Jones, K. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. / K. Jones, F. Hibbert, M. Keenan // Trends Biotechnol. -1999. -Vol. 17.-P. 477-481.

89. Jue, R. Addition of sulfhydryl groups to Esherichia coli ribosomes by protein modification with 2-iminothiolane (methyl 4-mercaptobutyrimidate). / R. Jue, J.M. Lambert, L.R. Pierce, R.R. Traut. // Biochemistry. 1978. - Vol. 17. - P. 5399-5406.

90. Kakoi, H. Synthesis of 2-amino-3-benzyl-5-(p-hydroxyphenyl) pyrazine. / H. Kakoi // Chem. Pharm. Bull. 2002. -Vol. 50. - P. 301-302.

91. Keenan, M. Highly efficient and flexible total synthesis of coelenterazine / M. Keenan, K. Jones, F. Hibbert// Chem. Commun. -1997. P. 323-324.

92. Keenan, M. Highly efficient and flexible total synthesis of coelenterazine / M. Keenan, K. Jones, Hibbert F. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1997. - P. 323-324.

93. Khanna, M. Multiplex PCR/LDR for detection of K-ras mutations in primary colon tumors. / M. Khanna, P. Park, M. Zirvi, W. Cao, A. Picon, J. Day, P. Paty, F. Barany. // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 27 - 38.

94. Kishi, Y. Cypridina bioluminescence III. Total synthesis of Cypridina luciferin. / Y. Kishi, T. Goto, S. Inoue, S. Sagiura, H. Kishimoto. // Tetrahedron Lett. -1966. Vol. 29. - P. 3445-3450.

95. Konstantinou, J. Genotyping of single nucleotide polymorphisms by primer extension reaction and dual-analyte bio/chemiluminometric assay / J. Konstantinou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos // Anal. Bioanal. Chem. -2007. Vol. 388. - P. 1747-1754.

96. Kopp, P. Perspective: genetic defects in the etiology of congenital hypothyroidism / P. Kopp // Endocrinology. 2002. - Vol. 143. - P. 20192024.

97. Kricka, L.J. Clinical and biochemical applications of luciferases and luciferins. / L.J. Kricka. // Anal. Biochem. 1988. - Vol. 175. - P. 14-21.

98. Krotkiewski, M. Thyroid hormones in the pathogenesis and treatment of obesity / M. Krotkiewski // Eur. J. Pharmacol. 2002. - Vol. 440. - P. 85-98.

99. Kurose, K. Bioluminescence of the Ca2+-binding photoprotein aequorin after cysteine modification / K. Kurose, S. Inouye, Y. Sakaki, F. Tsuji // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1989.-Vol. 86.-No. l.-P. 80-84.

100. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 / U.K. Laemli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685

101. Laios, E. Enzyme-amplified aequorin-based bioluminometric hybridization assays / E. Laios, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus // Anal. Chem 2001. — Vol. 73.-P. 689-692.

102. Laios, E. Novel hybridization assay configurations based on in vitro expression of DNA reporter molecules. / E. Laios, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus // Clin. Biochem. 1998. -Vol. 31. - P. 151-158.

103. Langone, J.J. Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by streptococci and pneumonococci. / J.J. Langone // Adv. Immunol. 1982. - Vol. 32. -P. 157-252.

104. Law, G.H.E. Mutagenesis of solvent-exposed amino acids in Photinus pyralis luciferase improves thermostability and pH-tolerance / G.H.E. Law, O.A. Gandelman, L.C Tisi, C.R. Lowe, J.A.H. Murray // Biochem.J. 2006. - Vol. 397.-P. 305-312.

105. Lewis, J.C. Bioluminescence and secondary structure properties of aequorin mutants produced for site-specific conjugation and immobilization (part I) / J.C. Lewis, J.J. Lopez-Moya, S. Daunert // Bioconjugate Chem. — 2000a). -Vol. 11.-P. 65-70.

106. Lewis, J.C. Photoproteins as luminescenct labels in binding assay./ J.C. Lewis, S. Daunert // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. - Vol. 366.- P. 760-768.

107. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 Ä resolution determined directly from its sulfur substructure. / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J.P. Rose, J. Lee, B.C. Wang // Protein Sci. 2000. - Vol. 9.-P. 2085-2093.

108. Loening, A.M. Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output / A.M. Loening, T.D. Fenn, A.M. Wul, S.S. Gambhir // Protein Eng. Des. Sei. 2006. - Vol. 19. - P. 391-400

109. Lomzov, A.A. Influence of Na2+ and Mg2+ ions on terminal stability of oligonucleotide duplexes / A.A. Lomzov, D.V. Pyshnyi // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. - Vol. 24. - No. 6. - P. 679-680.

110. Malikova, N.P. Structural tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, S.V. Markova, E.S.Vysotski, J. Lee. // FEBS Letters. 2003. - Vol. 554. - P. 184-188.

111. Manukhov, V. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heat-shock proteins / V. Manukhov, G.E. Eroshnikov, M.Yu. Vyssokikh, G.B. Zavilgelsky // FEBS Letters. 1999. -Vol. 448.-P. 265-268.

112. Markova, S.V. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa / S.V. Markova, S. Golz, L.A. Frank, B. Kalthof, E.S. Vysotski. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 3212-3217.

113. Martin, C.S. Quantitation of PCR products with chemiluminescence./ C.S. Martin, L. Butler, I. Bronstein // Biotechniques 1995. - Vol. 18. - No.5. - P. 908-913.

114. Matveev, S.V. Obelin mRNA — a new tool for studies of translation in cellfree systems. / S.V. Matveev, B.A. Illarionov, E.S. Vysotski, V.S. Bondar, S.V. Varkova, Y.B. Alakhov. // Anal. Biochem. 1995. - Vol. 231. - P. 34-39.

115. Mavropoulou, A.K. High-throughput double quantitative competitive polymerase chain reaction for determination of genetically modified organisms. / A.K. Mavropoulou, T. Koraki, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos //Anal. Chem.-2005.-Vol. 77.-P. 4785-4791.

116. Morin, J.G. Biochemistry of the colonial hydroids and other coelenterates. / J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1971. Vol. 77.- No. 3. - P. 305311.

117. Morin, J.G. Coelenterate bioluminescence. / J.G. Morin, // In: Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. Eds: L. Muscatine, H.M. Lenhoff. Acad. Press. NY. 1974. - P. 397-438.

118. Morrison, C. The impact of the PCR plateau phase on quantitative PCR. / C. Morrison, F. Gannon // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - Vol. 1219. - P. 493498.

119. Musicki, B. Structure of the functional part of photoprotein aequorin. / B. Musicki, Y. Kishi, O. Shimomura. // J. Chem.Soc. Chem. Commun. 1986. -P. 1566-1568.

120. Nilsson B, Forsberg G, Hartmanis M. Expression and purification of recombinant insulin-like growth factors from Escherichia coli. // Methods Enzymol.-1991.-Vol. 198.-P. 3-16.

121. Nomura, M. A C-terminal proline is required for bioluminescence of the Ca2+ binding photoprotein, aequorin./ M. Nomura, S. Inouye, Y. Ohmiya, F.I. Tsu i.// FEBS Lett. 1991. - Vol. 295. - P. 63-66

122. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, Tsuji F.I. // FEBS Lett. -Vol. 301.-P. 197-201.

123. Piatak, M. Jr. Quantitative competitive polymerase chain reaction for accurate quantitation of HIV DNA and RNA species. / M.Jr. Piatak, K.C. Luk, B. Williams, J.D. Lifson//Biotechniques. 1993. - Vol. 14.-P. 70-81.

124. Prasher, D.C. Sequence comparison of complementary DNAs encoding aequorin izotypes / D.C Prasher, R.O. McCann, M. Longiaru, M.J. Cormier. // Biochemistry. 1987.-Vol. 26.-No. 5.-P. 1326-1332.

125. Prendergast, F.G. Bioluminescence illuminated / F.G Prendergast F.G. // Nature. 2000.- Vol. 405. - P. 291-293.

126. Reading, N.S. Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability / N.S. Reading, S.D. Aust // Biotechnol. Prog. 2000. - Vol. 16. - P. 326-333.

127. Rudolf, R. In vitro folding of inclusion body proteins / R. Rudolf, H. Lilie // The FASEB Journal. 1996. - Vol. 10. - P. 49-56.

128. Sgoutas, D.S. AquaLite bioluminescence assay of thyrotropin in serum evaluated / D.S. Sgoutas, T.E. Tuten, A.A. Verras, A. Love, E.G. Barton. // Clin. Chem.- 1995.-Vol. 41.-No. 11.-P. 1637-1643.

129. Shimomura, O. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Halistaura. / Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. // J. Cell. Comp. Physiol. 1963. - Vol. 62 - P. 9-15.

130. Shimomura, O. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / O. Shimomura, F.H. Johnson. // In: Bioluminescence in Progress. Eds: F.H. Johnson, Y. Haneda. Princeton University Press. Princeton. NJ. — 1966. — P.495-521/

131. Shimomura, O. Properties of the bioluminescent protein aequorin. / O. Shimomura, F.H. Johnson // Biochemistry. 1969. - Vol: 8. - P. 3991-3997.

132. Shimomura, O. Mechanism of the luminescent intramolecular reaction of aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson H. Morise// Biochemistry. — 1974. — Vol. 13.-P. 3278-3286/

133. Shimomura, O. Regeneration of the photoprotein aequorin. / O. Shimomura, F.H. Johnson//Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 236-239.

134. Shimomura, O. Chemical nature of bioluminescence systems in Coelenterates. / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1975a).-Vol. 72.-P. 1546-1549.

135. Shimomura, O. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978.-Vol. 75.-P. 2611-2615.

136. Shimomura, O. Recombinant aequorin and recombinant semi-synthetic aeguorins. Cellular Ca~ indicators. / O. Shimomura, S. Inouey, B. Musicki, Y. Kisho//Biochem. J. 1990. - Vol. 270. - No. 1. - P. 309-312.

137. Shimomura, O. A short story of aequorin / O. Shimomura. // Biol. Bull.1995.-Vol. 189 .-P. 1-5.

138. Shimomura, O. Cause of spectral variation in the luminescence semisynthetic aequorins / O.Shimomura // Biochem. J. 1995a). - Vol. 306. - P. 537-543.

139. Shimomura, O. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine. / O. Shimomura, K. Teranishi. // Luminescence. — 2000. —Vol 15.-P. 51-58.

140. Siddiqi, A.M. Evaluation of electrochemiluminescence- and bioluminescence-based assays for quantitating specific DNA. / A.M. Siddiqi, V.M. Jennings, M.R. Kidd, J.K. Actor, R.L. Hunter // J. Clin. Lab. Anal.1996.-Vol. 10.-P. 423-431.

141. Singh, S.M. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins / S.M. Singh, A.K. Panda // J. Biosci. Bioeng. 2005 - Vol. 99 - P. 303-310.

142. Smith, D.F. Recombinant aequorin, a bioluminescent signal for molecular-diagnostics / D.F. Smith, N.L. Stults, M.J. Cormier, J.K. Actor // J. Clin. Ligand Assay 1999.-Vol. 22.-P. 158-172.

143. Song, X. Quantitation of Chlamidia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent mirotiter plate assay I X. Song, B.K. Coombes, J.B. Mahony // Comb. Chem. High Throug. Screen. 2000. - Vol. 3.-P. 303-313.

144. Taniguchi, A. Competitive RT-PCR ELISA: a rapid, sensitive and nonradioactive method to quantitate cytokine mRNA / A. Taniguchi, H. Konsaka, D.A. Carson//J. Immunol. Meth. 1994. - Vol. 169. - P. 101-109.

145. Tannous, B.A. Combined flash and"glow-type chemiluminescent reaction for high-througput genotyping of biallelic polymorphism./ B.A. Tannous, M.

146. Verhaegen, T.K. Christopoulos, A. Kourakli // Anal. Biochem. 2003.- Vol. 320. - P. 266-272.

147. Tatsumi, H. Construction of biotinylated firefly luciferases using biotin acceptor peptides / H.Tatsumi, S.Fukuda, M. Kikuchi, Y. Koyama. // Anal. Biochem. 1996. - Vol. 243. - P. 176-180.

148. Teranishi, K. Luminescence of imidazol,2-a.pyrazin-3(7H)-one compounds. / K. Teranishi. // Bioorganic Chem. -2007. Vol. 35. - P. 82-111.

149. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca~ -binding photoproteins of the Hydrozoa. / F.I. Tsuji, Y. Ohmia, T.F. Fafan, H. Toh, S. Inouye. // Photochem. Photobiol. 1995. - Vol. 62. - No. 4 - P. 657-661.

150. Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution / K. Tsuzuki, L. Tricoire, O. Courjean, N. Gibelin, J. Rossier, B. Lamboler. //J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 34324-34331.

151. Verhaegen, M. Bacterial expression of in v/vo-biotinylated aequorin for direct application to bioluminometric hybridization assays / M. Verhaegen, T.K. Christopoulos // Anal. Biochem. 2002. - V. 306. - P. 314-322.

152. Verhaegen, M. Recombinant Gaussia luciferase. Overexpression, purification and analytical application of a bioluminescent reporter for DNA hybridization. / M Verhaegen, T.K. Christopoulos. // Anal Chem. 2002a). Vol. 74. - P. 4378-4385.

153. Vysotski, E.S. Mn2+-activated luminescence of photoprotein obelin. / E.S. Vysotski, C.P. Trofimov, V.S. Bondar, L.A. Frank, S.V. Markova, B.A. Illarionov // Arch. Biochem. Biophys. Vol. 315. - 1995. - P. 92-99.

154. Vysotski, E.S. Ca~ -regulated photoproteins: Structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. 2004. -Vol. 37.-P. 405-415.

155. Ward, W.W. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata / W.W. Ward, H.H. Seliger // Biochemistry. 1974.- Vol. 13. No. 7. - P. 1491-1499.

156. Wiesner, R.J. Quantitative PCR. / R.J. Wiesner, B. Beinbrech, J.C. Riiegg // Nature. 1993. - Vol. 366. - P. 416-423.

157. White, S.R. Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin / S.R. White, T.K. Christopoulos // Nucl. Acids Res. 1999. - Vol. 27. - No. 19. P. e25.

158. White, S.R. Expression immunoassay. / S.R. White, N.H.L. Chui, T.K. Christopoulos // Methods. 2000. - P. 24-32.

159. Wilchek, M. Avidin-biotin technology ten years on: has it lived up to its expectation? / M: Wilchek, E.A. Bayer // TBS. 1989. -Vol. 14. - No. 10. - P. 408-412.

160. Zatta, P.F. A new bioluminescent assay for studies of protein G and protein A binding to IgG and IgM. / P.F. Zatta // J. Biochem. Biophys. Meth. 1996. -Vol. 32.-P. 7-13.

161. Zenno, S. Bioluminescent immunoassay using a fusion protein and the photoprotein aequorin / S. Zenno, S. Inouye // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. -Vol. 171.-P. 169-174.

162. Xiao,' L. Quantitation of RT-PCR amplified cytokine mRNA by aequorin-based bioluminescence immunoassay / L. Xiao, C. Yang, C.O. Nelson, B.P. Holloway, V. Udhayakumar, A.A Lai. // Immunol. Methods. 1996. - Vol. 199.-P. 139-147.