Изучение роли остатков цистеина в функционировании люциферазы светляков Luciola mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Модестова, Юлия Александровна

• Модестова, Юлия Александровна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Модестова, Юлия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Свойства люциферазы светляков

2.1.1. Гомология люцифераз светляков

2.1.2. Кинетические свойства различных люцифераз светляков

2.1.3. Термостабильность различных типов люцифераз светляков

2.2. Свойства остатков цистеина и их роль в функционировании ферментов

2.2.1. Функции остатков цистеина в молекулах белков ]

2.2.2. Химическая модификация остатков цистеина

2.2.3. Спонтанное окисление остатков цистеина

2.3. Роль остатков цистеина в молекуле люцифераз светляков

2.4. Олигомерная структура люциферазы светляков. Модель диссоциативной термоинактивации

2.4.1. Особенности олигомерных белков

2.4.2. Олигомерная структура люцифераз светляков

2.4.3. Модель диссоциативной инактивации люциферазы

2.5. Влияние Шв-тага на свойства различных ферментов

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Вещества и реагенты

3.2. Штаммы и плазмиды

3.3. Аппаратура

3.4. Методики проведения экспериментов

3.4.1. Методы работы с ДНК

3.4.2. Сайт-направленный мутагенез

3.4.3. Выделение и очистка люциферазы

3.4.4. Изучение свойств люциферазы

3.4.5. Получение конъюгатов на основе люциферазы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Конервативность и топология остатков цистеина в молекулах люцифераз жуков-светляков

4.2. Получение и свойства мутантных форм люциферазы светляков Ь. тт%геИса с единичными заменами С62Б, С146в и С164в

4.2.1. Получение плазмид, кодирующих мутантные люциферазы

4.2.2. Выделение и очистка исходной люциферазы и её мутантных форм

4.2.3. Каталитические свойства и спектры биолюминесценции исходной люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм

4.2.4. Собственная флуоресценция исходной люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм

4.2.5. Термоинактивация исходной люциферазы светляков L. mingrelica и её мутантных форм

4.3. Получение и свойства рекомбинантной люциферазы, содержащей His^-Tar на С-конце молекулы, и её мутантных форм

4.3.1. Получение мутантных плазмид на основе плазмиды pETL

4.3.2. Выделение и очистка WT-His люциферазы и мутантных форм, полученных на её основе

4.3.3. Физико-химические свойства мутантных люцифераз, полученных на основе WT-His

4.3.4. Спектры биолюминесценции WT-His люциферазы и её мутантных форм

4.3.5. Кинетика термоинактивации люциферазы WT-His и её мутантных форм

4.3.6. Определение свободных SH-групп остатков цистеина в молекуле WT-His люциферазы

4.4. Сайт-направленный мутагенез остатка С146 в молекуле термостабильного мутанта 4TS люциферазы светляков

4.4.1. Получение, выделение и очистка мутантной формы люциферазы 4TS, содержащей поверхностный остаток С146 (4TS-C)

4.4.2. Получение конъюгатов люциферазы светляков 4TS-C с бычьим сывороточным альбумином (BSA)

4.4.3. Оптимизация условий получения конъюгатов

4.4.4. Стабильность люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA при различных температурах

4.4.5. Каталитические свойства люциферазы 4TS-C и её конъюгата с BSA

4.4.6. Сравнение свойств конъюгатов ферментов 4TS и 4TS-C с BSA

5. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение роли остатков цистеина в функционировании люциферазы светляков Luciola mingrelica методом сайт-направленного мутагенеза»

Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7) катализирует окисление люциферина кислородом воздуха в присутствии АТР и Mg2+ [1]. Высокая специфичность люцифераз и высокий квантовый выход биолюминесцентной реакции обуславливают широкое биоаналитическое применение данного фермента [2] и постоянный научный интерес к изучению его структуры и функций [3].

Интересной особенностью люциферазы является наличие большого числа свободных остатков Cys, состав которых в молекуле фермента варьируется в широком диапазоне для люцифераз светляков разных видов. Остатки Cys являются наиболее реакционноспособными среди остатков белков. В составе фермента они могут выполнять разнообразные функции: поддерживать третичную структуру белка за счёт образования дисульфидных связей; принимать непосредственное участие в каталитической реакции в качестве нуклеофила; координировать ионы металлов-кофакторов в центре связывания фермента. Роль свободных остатков Cys, не входящих в состав активного центра, также велика: они могут играть ключевую роль на разных этапах фолдинга фермента, формировать межмолекулярные S-S-связи; участвовать в реакциях обратимого окисления, которые играют важную роль в регуляторных процессах в клетке.

Роль остатков цистеина в функционировании люцифераз в настоящее время остаётся неясной. Было показано, что хотя остатки Cys не входят в состав активного центра люциферазы, их мутагенез влияет на активность и стабильность данного фермента [4,5]. Так, было показано, что замена всех 4-х остатков Cys в люциферазе Photinus pyralis на Ser приводит к резкому падению ферментативной активности (до 6,5%), кроме того прослеживается существенное взаимовлияние между данными остатками [4]. Подобный эксперимент был проведён и для люциферазы L. mingrelica: были получены её мутантные формы, содержащие единичные замены остатков 82, 260 и 393 (соответствующие трём остаткам Cys в люциферазе Photinus pyralis) на Ala [5]. Введённые замены привели к некоторому ухудшению констант связывания люциферазы с субстратами, в то же время замена Cys393Ala привела к двукратной стабилизации фермента при температурах 5-35°С.

Самопроизвольное окисление белков является одной из существенных проблем фармацевтической и биоаналитической технологии [6]. Остатки Cys наиболее подвержены данному процессу. Полное или частичное исключение остатков Cys из состава молекулы люциферазы может способствовать решению этой проблемы.

До недавнего времени в качестве основного метода очистки люциферазы светляков использовали метод ионно-обменной хроматографии. Данный метод являлся многостадийным, трудоёмким, протяжённым во времени и сопровождался значительной инактивацией фермента на каждой стадии процесса. Введение His-тага в структуру люциферазы позволяет существенно упростить процедуру получения фермента за счёт использования металло-хелатной хроматографии. Ранее вопрос о влиянии His-тага на свойства люциферазы в литературе не рассматривался, однако существуют публикации, указывающие на возможность существенного изменения свойств фермента за счёт введения His-тага в состав его молекулы [7-10].

Данная работа посвящена изучению функции неконсервативных остатков Cys в молекуле люциферазы светляков Lucióla mingrelica и выяснению возможности исключения данных остатков из структуры молекулы с целью снятия эффекта окислительной инактивации фермента.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Катализ», Модестова, Юлия Александровна

5. ВЫВОДЫ

1. Показано, что основную роль в процессе окислительной инактивации WT люциферазы светляков L. mingrelica играют остатки Cysl46 и Cysl64, поскольку мутации этих остатков приводят к тому, что уменьшается различие в скоростях инактивации фермента в отсутствие и в присутствии дитиотреитола.

2. Показано, что введение С-концевого His-тага изменяет свойства люциферазы и ее мутантов: уменьшается сродство к субстратам; термоинактивация протекает в одну стадию, в то время как для WT люциферазы и ее мутантов термоинактивация протекает в две стадии. Выдвинута гипотеза о влиянии His-тага на олигомерное состояние люциферазы.

3. Показано, что из всех изученных мутаций остатков цистеина наибольший эффект стабилизации как для WT люциферазы, так и для люциферазы с С-концевой шестигистидиновой последовательностью достигается при введении замены C146S. Так, мутация C146S увеличила стабильность WT-His люциферазы в два раза при 37°С и в 1,5 раза - при 42°С.

4. Обнаружено взаимовлияние мутаций остатков Cys62 и Cysl64: введение двойной замены снижает уровень экспрессии и удельную активность люциферазы, ухудшает каталитические параметры и стабильность мутантов. Данные эффекты не наблюдаются при введении единичных замен по этим остаткам. Выдвинута гипотеза о том, что одновременная замена данных остатков приводит к изменению взаимного расположения a-спиралей, в состав которых входят остатки Cys62 и Cysl64.

5. Показано, что замена остатка Cys86 в молекуле люциферазы с С-концевой шестигистидиновой последовательностью приводит к резкому падению уровня экспрессии фермента, его удельной активности, ухудшению каталитических параметров и стабильности. Выдвинута гипотеза о том, что замена остатка Cys86 на Ser приводит к исчезновению водородной связи, скрепляющей петлю полипептидной цепи, локализованную вблизи активного центра.

6. Показано, что конъюгация люциферазы с биоспецифичными белками с участием SH-групп фермента протекает преимущественно за счет сульфгидрильной группы остатка Cysl46.

Заключение

На основании проведенного литературного обзора можно отметить, что в общем случае для белков нехарактерно наличие большого числа свободных остатков цистеина на поверхности белковой глобулы и в приповерхностной зоне. Это связано с высокой реакционной способностью сульфгидрильных групп остатков цистеина, которая определяет особую роль данных остатков в функционировании молекул белков, но при этом делает возможным протекание побочных реакций, неблагоприятных для сохранения активной конформации белковой глобулы. Необходимость предотвращения протекания нежелательных химических реакций с участием данных остатков (в частности, спонтанного окисления SH-групп) является важной биотехнологической задачей.

В то же время высокая реакционная способность остатков цистеина делает их удобным инструментом для проведения химической конъюгации, поскольку, в отличие от аминогрупп, также отличающихся высокой реакционной способностью, редко встречающиеся на поверхности белков сульфгидрильные группы позволяют осуществлять направленную конъюгацию.

В отличие от большинства белков люцифераза светляков L. mingrelica содержит большое количество свободных остатков цистеина, часть из которых находится вблизи поверхности и потенциально доступна действию растворителя. Роль остатков цистеина в молекулах различных люцифераз светляков изучалась и ранее, однако достоверно удалось установить только тот факт, что данные остатки не входят в активный центр белка и не участвуют в поддержке структуры фермента. В то же время тот факт, что их химическая модификация и мутагенез приводят к существенным изменениям свойств люцифераз, указывает на их большое значение для функционирования фермента.

Изучение роли остатков цистеина в молекуле люциферазы светляков L. mingrelica позволит вычленить ключевые для её функционирования остатки цистеина и таким образом определит возможность стабилизации данного фермента путем исключения остатков цистеина из его структуры и возможность расширения биотехнологического применения люциферазы за счёт проведения направленной конъюгации по её доступным сульгидрильным группам. Для изучения роли остатков цистеина в молекуле люциферазы был выбран метод сайт-направленного мутагенеза, позволяющий исключить активные остатки цистеина из состава молекулы, не осуществляя химические модификации и не внося дополнительные изменения в структуру белка.

До недавнего времени единственной используемой формой люциферазы была рекомбинантная люцифераза светляков дикого типа, которая нарабатывалась в клетках Е. coli на основе системы экспрессии бактериальной люциферазы, и очистка которой

43 проводилась методом ионно-обменной хроматографии. В настоящее время для увеличения выхода данного фермента и упрощения процедуры очистки за счёт перехода к использованию металло-хелатной хроматографии в структуру люциферазы была введена шестигистидиновая последовательность (ЬПз-таг), и был осуществлён переход к использованию более эффективной экспрессионной плазмиды рЕТЪ7. Ранее вопрос о влиянии НПз-тага на свойства люциферазы в литературе практически не рассматривался, однако он является важным, поскольку существуют публикации, указывающие на возможность существенного изменения свойств фермента за счёт введения Шв-тага в состав его молекулы. Таким образом, изучение влияния С-концевой шестигистидиновой последовательности на свойства люциферазы Ь. тт^геИса также является актуальной задачей.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Вещества и реагенты

Для генно-инженерных работ использовали следующие реагенты: рестриктазы Nhel («Fermentas», Литва), BamHI, Ври 141, Sali, Xhol («СибЭнзим», Россия); Pfu Turbo ДНК-полимеразу («Stratagene», США), TaqSE ДНК-полимеразу («СибЭнзим», Россия); смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов («СибЭнзим», Россия); Т4 ДНК-лигазу («Fermentas», Литва); минеральное масло («ICN», США); агарозу (Type I-A: Low ЕЕО) («Sigma», США); бромистый этидий («Amresco», США); ДНК-маркеры для электрофореза («СибЭнзим», Россия). Олигонуклеотиды для проведения ПЦР были синтезированы в компании «Синтол», Россия.

Для приготовления буферных растворов и бактериальных сред использовали: бакто-триптон и дрожжевой экстракт (Sigma, США); уксусную кислоту, соляную кислоту, ацетат аммония, перегнанные этиловый спирт, глицерин и диметилсульфоксид (Реахим ос. ч.); натриевую соль ампициллина, Тритон Х-100, неонол-10, натриевую соль АТР («ICN», США, «Sigma», США), трис-(оксиметил)-аминометан, ЭДТА, MgSC>4, BSA («Sigma», США); люциферин светляков («Люмтек», Россия); дитиотреитол («ICN», США); МпСЬ, PIPES (пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновая) кислота) («Sigma», США); NaCI, моногидрат глюкозы («Хеликон», Россия); лимонную кислоту, ацетат калия, цитрат натрия («Реахим», ос.ч.); неорганические соли («Союзхимреактив», Россия).

Все растворы готовили с использованием высокоочищенной дистиллированной деионизованной воды, полученной на установке Milli-Q («Millipore», Франция) или WaterPro Plus («LabConco», США).

Для хроматографии и гель-фильтрации использовали сефадекс G-25, сефадекс G-50, DEAE-сефарозу («Pharmacia», Швеция).

Состав сред и растворов, использовавшихся для культивирования клеток, приведён в таблице 5. 1 M раствор сульфата магния и 2 M раствор глюкозы стерилизовали фильтрованием через бактериальный фильтр 0,22 мкм. Растворы LB, SOB, ZY, 20xNPS, 50x5052 стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм в течение 30 мин. После автоклавирования к средам SOB и SOC добавляли стерильные растворы MgCh и глюкозы соответственно до необходимой концентрации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Модестова, Юлия Александровна, 2012 год

1. Deluca М. Firefly luciferase. Н Advances in enzymology and related areas of molecular biology. 1976. V. 44. P. 37-68.

2. Viviani V.R., Ohmiya Y. Beetle Luciferases: Colorful Lights on Biological Processes and Diseases. II Photoproteins in bioanalysis / Eds. Daunert S., Deo S.K. Wiley-VCH. Weinheim. 2006. P. 49-63.

3. Fraga H. Firefly luminescence: a historical perspective and recent developments. II Photochem Photobiol Sci. 2008. V. 7. № 2. P. 146-158.

4. Kumita J.R., Jain L., Safroneeva E., Woolley G.A. A cysteine-free firefly luciferase retains luminescence activity. II Biochemical and biophysical research communications. 2000. V. 267. № l.P. 394-397.

5. Дементьева Е.И., Железнова E.E., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Физико-химические свойства рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica и ее мутантных форм. И Биохимия. 1996. Т. 61. №. 1. С. 152-158.

6. Li S., Schoneich С., Borchardt R.T. Chemical instability of protein pharmaceuticals: Mechanisms of oxidation and strategies for stabilization. II Biotechnol Bioeng. 1995. V. 48. № 5. P. 490-500.

7. Amor-Mahjoub M., Suppini J.P., Gomez-Vrielyunck N., Ladjimi M. The effect of the hexahistidine-tag in the oligomerization of HSC70 constructs. II J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2006. V. 844. № 2. P. 328-334.

8. Freydank A.-C., Brandt W., Drager B. Protein structure modeling indicates hexahistidine-tag interference with enzyme activity. II Proteins. 2008. V. 72. № 1. P. 173-183.

9. Вотчицева Ю.А., Ефременко E.H., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Свойства гексагистидин-содержащей органофосфатгидролазы.11 Биохимия. 2006. Т. 76. № 2. С. 216-222.

10. Ugarova N.N. Luciferase of Luciola mingrelica fireflies. Kinetics and regulation mechanism. II Journal of bioluminescence and chemiluminescence. 1989. У. 4. № 1. P. 406-418.

11. Ando Y., Niwa K., Yamada N., Enomoto Т., Irie Т., Kubota H., Ohmiya Y., Akiyama H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission II Nature Photonics. 2007. V. 2, № 1. P. 44^7.

12. Seliger H.H., McElroy W.D. Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. II Archives of biochemistry and biophysics. 1960. V. 88. P. 136-141.

13. Woods W.A., Hendrickson H. Jr., Mason J., Lewis S.M. Energy andpredation costs of firefly courtship signals. II Am Nat. 2007. V. 170. № 5. P. 702-708.

14. H. H. Угарова, Л. Г. Малошенок, И. В. Упоров, М. И. Кокшаров. Спектры биолюминесценции нашивной и мутантной люцифераз светляков как функция рН И Биохимия. 2008. Т. 70. № 11. С. 1534-1540.

15. Wood K.V. The chemical mechanism and evolutionary development of beetle bioluminescence II Photochemistry and Photobiology. 1995. V. 62. № 4. P. 662-673.

16. Conti E., Franks N.P., Brick P. Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes. II Structure. 1993. 1996. V. 4. № 3. P. 287298.

17. Oba Y., Tanaka K., Inouye S. Catalytic properties of domain-exchanged chimeric proteins between firefly luciferase and Drosophila fatty Acyl-CoA synthetase CG6178. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. V. 70. № 11. P. 2739-2744.

18. Oba Y., Iida K., Inouye S. Functional conversion of fatty acyl-CoA synthetase to firefly luciferase by site-directed mutagenesis: a key substitution responsible for luminescence activity. IIFEBS letters. 2009. V. 583. № 12. P. 2004-2008.

19. Oba Y., Ojika M., Inouye S. Firefly luciferase is a bifunctional enzyme: ATP-dependent monooxygenase and a long chain fatty acyl-CoA synthetase. II FEBS letters. 2003. V. 540. № 1-3. P. 251-254.

20. Ayabe K., Zako Т., Ueda H. The role of firefly luciferase C-terminal domain in efficient coupling of adenylation and oxidative steps. II FEBS letters. 2005. V. 579. № 20. P. 4389-4394.

21. Branchini B.R., Murtiashaw M.H., Magyar R.A., Anderson S.M. The role of lysine 529, a conserved residue of the acyl-adenylate-forming enzyme superfamily, in firefly luciferase. II Biochemistry. 2000. V. 39. № 18. P. 5433-5440.

22. Conti E., Lloyd L.F., Akins J., Franks N.P., Brick P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. II Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1996. V. 52. № 4. P. 876-878.

23. Nakatsu Т., Ichiyama S., Hiratake J., Saldanha A., Kobashi N., Sakata K., Kato H. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. И Nature. 2006. V. 440. № 7082. P. 372-376.

24. Conti E., Stachelhaus Т., Marahiel M.A., Brick P. Structural basis for the activation of phenylalanine in the non-ribosomal biosynthesis of gramicidin S. II EMBO J. 1997. V. 16. № 14. P. 4174-4183.

25. Сандалова Т.П., Угарова H.H. Модель активного центра светляковой люциферазы. II Биохимия. 1999. Т. 64. С. 1143-1150.

26. Ugarova N.N., Brovko L.Y. Protein structure and bioluminescent spectra for firefly bioluminescence. II Luminescence. 2002. V. 17. № 5. P. 321-330.

27. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Zimmer M. Site-directed mutagenesis of histidine 245 in firefly luciferase: a proposed model of the active site. II Biochemistry. 1998. V. 37. № 44. P. 15311-15319.

28. Viviani V.R. The origin, diversity, and structure function relationships of insect luciferases. II Cell Мої Life Sci. 2002. V. 59. № 11. P. 1833-1850.

29. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Portier N.C. The role of active site residue arginine 218 in firefly luciferase bioluminescence. II Biochemistry. 2001. V. 40. № 8. P. 2410-2418.

30. Branchini B.R., Southworth T.L., DeAngelis J.P., Roda A., Michelini E. Luciferase from the Italian firefly Luciola italica: molecular cloning and expression. II Comp Biochem Physiol В Biochem Мої Biol. 2006. V. 145. № 2. P. 159-167.

31. Hattori N., Kajiyama N., Maeda M., Murakami S. Mutant luciferase enzymes from fireflies with increased resistance to benzalkonium chloride. II Biosci Biotechnol Biochem. 2002. V. 66. № 12. P. 2587-2593.

32. Squirrell D.J., Lowe C.R., White P.J., Murray J.A.H. Mutant luciferases // United States Patent No 6171808. 1992.

33. Угарова Н.Н., Малошенок Л.Г., Упоров И.В. Каталитические свойства и спектры биолюминесценции рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica с точечными мутациями вне активного центра II Биохимия. 2002. Т. 43. № 6. Р. 359362.

34. Ohmiya Y., Ohba N., Toh H., Tsuji F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the luciferases from the Japanese fireflies, Pyrocoelia miyako and Hotaria parvula. II Photochem Photobiol. 1995. V. 62. № 2. P. 309-313.

35. Kajiyama N., Nakano E. Thermo stabilization offirefly luciferase by a single amino acid substitution at position 217. II Biochemistry. 1993. V. 32. № 50. P. 13795-13799.

36. Kitayama A., Yoshizaki H., Ohmiya Y., Ueda H., Nagamune T. Creation of a thermostable firefly luciferase with pH-insensitive luminescent color. II Photochem Photobiol. 2003. V. 77. № 3. P. 333-338.

37. Kitayama A., Yoshizaki H., Ohmiya Y., Ueda H., Nagamune T. Creation of a thermostable firefly luciferase with pH-insensitive luminescent color. II Photochem Photobiol. 2003. V. 77. № 3. P. 333-338.

38. Tisi L.C., White P.J., Squirrell D.J., Murphy M.J., Lowe C.R., Murray J.A.H. Development of a thermostable firefly luciferase II Analytica Chimica Acta. V. 457. № 1. P. 115-123.

39. Squirrell D.J., Murphy M.J. Luciferase labelling method: letter 5837465 USA. 1997.

40. Kajiyama N., Nakano E. Enhancement of thermostability of firefly luciferase from Luciola lateralis by a single amino acid substitution. II Biosci Biotechnol Biochem. 1994. V. 58. №6. P. 1170-1171.

41. Лундовских И.А., Дементьева Е.И., Угарова H.H. Кинетика и механизм термоинактивации рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica II Вестник Московского Университета. 2000. Т. 41. № 6. С. 362-366.

42. Kadokura Н., Katzen F., Beckwith J. Protein disulfide bond formation in prokaryotes. II Annu Rev Biochem. 2003. V. 72. P. 111-135.

43. Maattanen P., Kozlov G., Gehring K., Thomas D.Y. ERp57 and PDI: multifunctional protein disulfide isomerases with similar domain architectures but differing substratepartner associations. II Biochem Cell Biol. 2006. V. 84. № 6. P. 881-889.

44. Kella N.K., Kang Y.J., Kinsella J.E. Effect of oxidative sulfitolysis of disulfide bonds of bovine serum albumin on its structural properties: a physiochemical study. II J Protein Chem. 1988. V. 7. № 5. P. 535-548.

45. Falk A., Rask L. Expression of a zeatin-O-glucoside-degrading beta-glucosidase in Brassica napus. II Plant physiology. 1995. V. 108. № 4. P. 1369-1377.49.