Роль триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Маликова, Наталья Петровна

• Маликова, Наталья Петровна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Маликова, Наталья Петровна

Введение.

Глава 1. Роль триптофановых остатков в биолюминесценции различных систем.

1.1. Люцифераза светляков.

1.2. Бактериальная люцифераза.

1.3. Фотопротеины.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Выделение и очистка белков.

2.2. Биолюминесцентные свойства мутантных белков.

2.3. Реактивы.

Глава 3. Выделение, очистка и характеристика мутантных форм фотопротеина обелина с заменами триптофановых остатков активного центра на фенилаланин.

3.1. Выделение и очистка мутантных форм обелина.

3.2. Активация апобелков синтетическим целентеразином.

3.3. Основные люминесцентные свойства полученных мутантных форм.

3.4. Влияние температуры на биолюминесцентную активность мутантных белков.

3.5. Спектральные характеристики полученных мутантов.

Глава 4. Выделение, очистка и свойства мутантных форм обелина с заменой Тгр 92 на другие аминокислотные остатки.

4.1. Выделение и очистка мутантных белков.

4.2. Активация апобелков синтетическим целентеразином.

4.3. Основные люминесцентные свойства полученных мутантов.

4.4. Влияние температуры на биолюминесцентную активность мутантных форм обелина.

4.5. Спектральные характеристики полученных мутантов.

Глава 5. Гипотеза о механизме формирования эмиттера в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина»

Биолюминесцентная система Са2+-регулируемых фотопротеинов морских кишечнополостных организмов является на сегодняшний день одной из наиболее изученных. Уникальность этих белков состоит в том, что они представляют собой устойчивый фермент-субстратный комплекс из одноцепочечного полипептида (около 20 кДа), целентеразина и кислорода. Присоединение ионов кальция вызывает конформационные перестройки в белке, в результате которых практически мгновенно развивается реакция окислительного декарбоксилирования целентеразина, продуктами которой являются целентерамид, СОг и квант света в голубой области. Гены нескольких фотопротеинов клонированы [Inouye S et al, 1993; Faganet al, 1993; Illarionov et al, 1995; Markova et al, 2002] и получены рекомбинантные белки, свойства которых практически не отличаются от свойств природных белков.

В 2000г. были установлены третичные структуры двух фотопротеинов — акворина из медузы Aequoria victoria [Head et al, 2000] и обелина из гидроидного полипа Obelia longissima [Liu et al, 2000]. Было показано, что в обоих белках целентеразин и кислород локализованы нековалентными связями в виде пероксицелентеразина внутри гидрофобной полости белковой глобулы. Среди аминокислотных остатков, участвующих в локализации пероксицелентеразина в обоих белках находятся 4 триптофановых остатка, образующих «сэндвич»-структуры с ароматическими остатками молекулы целентеразина. Ранее для акворина было показано, что мутирование некоторых триптофановых остатков влияет на устойчивость фотопротеинового комплекса и меняет характеристики его биолюминесцентного свечения [Ohmiya et al, 1992], что указывает на возможность участия этих остатков в формировании структуры молекулыизлучателя. Более детальных исследований этого вопроса как для акворина так и для обелина не проводилось.

В лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН на протяжении нескольких лет ведутся работы по изучению биолюминесцентной системы одного из Са -регулируемых фотопротеинов — обелина из гидроидного полипа Obelia longissima. Накоплены глубокие знания - от определения нуклеотидной последовательности гена, кодирующего этот белок, до установления его третичной структуры [Illarionov et al, 1995; Illarionov et al, 2000; Markova et al, 2001; Liu et al, 2000]. Показана перспективность использования обелина в различных аналитических системах [Illarionov et al, 2000; Frank et al, 1996; Frank et al, 1997; Berestovskaya et al, 1999; Gorokhovatsky et al, 1998].

В результате генно-инженерных работ были сконструированы штаммы-продуценты мутантных белков с заменами триптофановых остатков активного центра молекулы обелина.

Целью данной работы было изучение свойств этих мутантных белков и определение на основе полученных данных роли триптофановых остатков активного центра в биолюминесцентной реакции Са -регулируемого фотопротеина обелина.

Выполнение данного исследования требовало решения следующих задач:

1. Выделить в чистом виде мутантные формы рекомбинантного фотопротеина обелина, имеющие замены по триптофановым остаткам активного центра на фенилаланин, и мутантные формы, имеющие замены по 92-му триптофановому остатку на гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту.

2. Исследовать основные физико-химические свойства полученных мутантных форм рекомбинантного обелина.

3. Выявить механизм формирования молекулы-излучателя на основе исследования влияния произведенных замен на биолюминесцентную функцию мутантных форм обелина.

При решении поставленных задач были получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. 114-й и 135-й триптофановые остатки активного центра обелина, локализованные у 2-гидроксибензильной группы целентеразина, играют важную роль в локализации молекулы целентеразина — их замены приводят к существенному уменьшению способности апобелков образовывать устойчивые фотопротеиновые комплексы и резкому падению специфической активности.

2. 92-й триптофановый остаток обелина локализован у 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина и участвует в формировании структуры молекулы-эмиттера: все замены этого остатка приводят к изменению спектральных характеристик биолюминесценции. Оно связано со сдвигом равновесия между таутомерными формами эмиттера - фенолят-анионом (Х^ах = 475нм) и нейтральной формой (Хщах = 390нм) возбужденной молекулы целентерамида.

3. Предложена гипотеза, Финальной стадией образования эмиттера

•ji биолюминесцентной реакции Са -регулируемых фотопротеинов является перенос протона от 6-п-гидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на His22, скорость которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца Тгр92 и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.

Все результаты данной работы получены впервые и перспективны для использования в фундаментальных и в прикладных исследованиях. Высокая скорость биолюминесцентного ответа и чувствительность к ионам Са в сочетании с разными спектральными характеристиками некоторых полученных мутантных белков позволяют использовать их в качестве датчиков для одновременного изучения кальциевых потоков в различных клеточных органеллах. Использование «цветных» мутантов обелина как меток в иммуноанализе перспективно для одновременного определения нескольких антигенов с регистрацией сигнала на разных длинах волн.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 99-04-48452, № 0204-49419 и Красноярского Фонда Науки № 13G062, а также программы РАН «Физико-химическая биология».

Материалы диссертационной работы докладывались на ХН-м Международном симпозиуме по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж, Великобритания, 2002) и на семинаре лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

По результатам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Маликова, Наталья Петровна

ВЫВОДЫ

1. Впервые выделены в гомогенном виде мутантные белки с заменами триптофановых остатков, локализованных в активном центре обелина, на фенилаланин: W92F, W114F, W135F, W179F, WW92,179FF и WW114,135FF и исследованы их основные физико-химические свойства.

3. Показано, что замены W114—>F, W135—>F существенным образом уменьшают способность апобелков образовывать стабильный фотопротеиновый комплекс, но не приводят к изменениям спектральных характеристик биолюминесценции. Замены W92—»F и W179—>F практически не отражаются на физико-химических свойствах мутантных белков, но существенным образом меняют спектральные характеристики биолюминесценции и ее кинетику. Замена W92—>F, элиминирующая водородную связь между азотом индольного кольца и 6-(р-гидроксифенильной) группой целентеразина, приводит к появлению дополнительной полосы излучения мутантного белка W92F в фиолетовой области спектра (А,тах = 405 нм), ускорению биолюминесцентной реакции (krise = 992 сек"1) более чем в два раза по сравнению с WT обелином и не влияет на чувствительность к ионам кальция.

4. Впервые выделены в гомогенном виде мутантные белки с заменами 92-го триптофанового остатка на аминокислоты, имеющие разные заряды боковой цепи - гистидин, аргинин, лизин и глутаминовую кислоту и исследованы их основные физико-химические свойства. Показано, что все перечисленные замены привели к увеличению вклада фиолетовой полосы в спектре люминесценции в ряду W92H < W92K < W92E < W92R с одновременным падением активности от 99% до 8% по отношению к дикому варианту обелина. Для мутантного белка - W92R вклад фиолетовой полосы составляет более 80%.

5. Результатами исследования физико-химических свойств мутантных форм обелина установлено, что: 114-й и 135-й триптофановые остатки активного центра обелина, локализованные у 2-п-гидроксибензильной группы целентеразина играют важную роль в локализации молекулы целентеразина; 92-й триптофановый остаток обелина, локализованный у 6-п-гидроксифенильной группы целентеразина, участвует в формировании структуры молекулы-эмиттера;

6. Предложена гипотеза, согласно которой финальной стадией образования эмиттера биолюминесцентной реакции Са -регулируемых фотопротеинов является перенос протона от 6-п-гидроксифенильной группы возбужденного целентерамида на His22, скорость которого регулируется водородной связью между атомом азота индольного кольца Тгр92 и 6-п-гидроксифенильной группой целентеразина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Са -регулируемый фотопротеин обелин из гидроидного полипа Obelia longissima как и ряд других фотопротеинов из морских кишечнополостных организмов представляет собой устойчивый фермент-субстратный комплекс, состоящий из одноцепочечного полипептида (22,4 кДа) и пероксицелентеразина, локализованного внутри гидрофобной полости белковой глобулы нековачентными связями. Установленная в 2000г. третичная структура этого белка выявила, что из 6-ти триптофановых остатков его аминокислотной последовательности - 4 находятся в активном центре. Эти остатки являются строго консервативными для всех известных в настоящее время фотопротеинов.

Представленная работа посвящена определению роли триптофановых остатков активного центра молекулы Са2+-регулируемого фотопротеина обелина в его биолюминесцентной реакции.

Для этого с помощью сайт - направленного мутагенеза в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН были сконструированы штаммы-продуценты мутантных форм апообелина с различными заменами триптофановых остатков активного центра. В настоящей работе все мутантные белки были выделены в гомогенном виде и изучены их основные физико-химические свойства. Результаты проведённой работы показали, что триптофановые остатки активного центра участвуют не только в локализации субстрата с образованием устойчивого фотопротеинового комплекса, но и в процессах формирования структуры молекулы — излучателя.

Результаты настоящей работы показали, что некоторые мутантные белки обладают уникальными свойствами. Например, мутантный белок W92F обладает бимодальным спектром излучения (на глаз - фиолетовый) и самой высокой скоростью биолюминесцентного ответа (krise = 992 сек"1, что более чем в два раза выше чем для обелина дикого типа). А мутантный белок

W92R имеет практически мономодальную биолюминесценцию (вклад фиолетовой полосы в спектре составляет более 80%). Эти качества делают их перспективными для использования в качестве датчиков для одновременного изучения кальциевых потоков в разных компартментах клетки. Кроме того, становится возможным применение «цветных» мутантов обелина, например, в качестве меток в иммуноанализе для одновременного определения нескольких антигенов с регистрацией сигнала на разных длинах волн.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. JI.A. Франк, а также к.б.н. Е.С. Высоцкому, к.б.н. С.В. Марковой за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Маликова, Наталья Петровна, 2004 год

1. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике.-М.: "Наука", 1984.- 23с., 35с.

2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по этимологии.- М.: Высшая школа, 1971.-224с.

3. Морозов В.М., Угарова Н.Н. // Биохимия.- 1996.- Т.61.- С. 1068-1072.

4. Сандалова Т.П., Угарова Н.Н. Модель активного центра люциферазы светляков // Биохимия.- 1999.- Т.64.- С. 1143-1150.

5. Чудинова Е.А., Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Савицкий А.П., Угарова Н.Н. Флуоресценция остатков триптофана в люциферазах светляков и их комплексах с субстратами // Биохимия.- 1999.- Т.64.- С.1301-1308.

6. Allen D.G., Blinks J.R., and Prendergast F.G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration—a calcium-independent component // Science.- 1977.- V.195.- P.996-998.

7. Baldwin Т.О., Chen L.H., Chlumsky L.J., Devine J.H., Ziegler M.M. Site-directed mutagenesis of bacterial luciferase: analysis of the «essential» thiol // J. Biolum. Chemilumen.- 1989.- V.4.- P.40-48.

8. Baldwin Т.О., Hastings J.W., Riley P.L. Proteolytic inactivation of the luciferase from the luminous marine bacterum Beneckea harveyi // J. Biol. Chem.- 1978.- V.253.- P.5551-5554.

9. Blinks J.R. Sarcoplasmic reticulum function in intact cells: information from intracellular Ca++ indicators. // In Entman M.L., Van Winkle W.B. editors. The

10. Sarcoplasmic Reticulum in Phisiology, Muscle, Volume II. CRC Press, Boca Raton, FL.- P.73-107.

11. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Helgerson L.C., Zimmer M. Site-directed mutagenesis of firefly luciferase active site amino acids: a proposed model for bioluminescence color // Biochemistry.-1999.- V.38.- P.13223-13230.

12. Cline T.W., Hastings J.W. Mutationally altered bacterial luciferase. Implication for subunit function // Biochemistry.- 1972.- V.l 1.- P.3359-3370.

13. Conti E., Franks N.P., Brick P. Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes // Structure. 1996. -V.4.-P.287-298.

14. DeWet J.R., Wood K.V., DeLuca M., Helinski D.R., Subramani S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells// Mol. Cell. Biol.-1987.- V.7.- P.725-737.

15. Fagan T.F., Ohmiya Y., Blinks J.R., Inouye S., Tsuji F.I. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-binding photoprotein, mitrocomin // FEBS Letters.- 1993.- V.333.- P.301-305.

16. Fisher В., Perry В., Summer I., and Goodenough P. A novel sequential procedure to enhance the renaturation of recombinant protein from Escherichia coli inclusion bodies // Protein Engineering.- 1992.- V.5.- . 593-596.

17. Fisher A.J., Raushel F.M., Baldwin Т.О., Rayment I. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harveyi at 2,4A resolution // Biochemistry.- 1995.- V.34.- P.6581-6586.

18. Fisher A.J., Thompson T.B., Thoden J.B., Baldwin Т.О., Rayment I. The 1. sA resolution cristal structure of bacterial luciferase in low salt conditions // The Journal of Biological Chemistry.- 1996.- V.271.- P.21956-21968.

19. Frank L.A., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996.-V.219.- P.479-484.

20. Gorokhovatsky A.Y., Shaloiko L.A., Bondar V.S., Vysotski, E.S., Maximov J.E., Doehren H., and Alakhov Y.B. Cell-free bioluminescent screening of translation inhibitors // Biotechnol. Appl. Biochem.- 1998.- V.27.- P.259-263.

21. Goto Т., Inouye S., Sugiura S., Nishikawa K., Isobe M., Abe Y. Cypridina bioluminescence V. Structure of emitting species in the luminescence of cypridina luciferin and its related compounds // Tetrahedron Lett.- 1968.-P.4035-4038.

22. Hastings W. Bioluminescence // Cell Physiology Sourcebook. A molecular Approach. Third edition.- 2001.- P. 1115-1131.

23. Hastings J.W., Morin J.G. Calcium-triggered light emission in Renilla. A unitary biochemical scheme for coelenterate bioluminescence // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1969.- V.37.- P.493-498.

24. Head J.F., Inouye S., Teranishi K., Shimomura O. The crystal structure of the photoprotein aeguorin at 2,3A resolution // Nature.- 2000.- V.405.- P.372-376.

25. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Sequence of theIcDNA encoding the Ca -activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima // Gene.- 1995.- V.153.- P.273-274.

26. Illarionov B.A., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R.,. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator// Methods Enzymol. -2000.-V. 227.- P. 1356-.

27. Imai Y., Shibata Т., Maki S., Niwa H., Ohashi M., and Hirano T. // Photochem. Photobiol. A: Chemistry.- 2001.- V.146.- P.95-107.

28. Inouye, S., Noguchi, M., Sakaki, Y., Takagi, Y., Miyata, Т., Iwanaga, S., and Tsuji, F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985.- V. 82, P. 3154-3158.

29. Inouye S., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca -activated photoprotein, clytin // FEBS Letters.- 1993.- V.315.- P.343-346.

30. Johnston T.C., Thompson R.B., Baldwin Т.О. Nucleotide sequence of the lux В gene of Vibrio harveyi and the complete amino acid sequence of the beta subunit of bacterial luciferase // The Journal of Biological Chemistry.- 1986.-V.261.- P.4805-4811.

31. Kretsinger R.H., and Nakayama S. Evolution of EF-hand calcium-modulated proteins. IV. Exon shuffling did not determine the domain compositions of EF-hand proteins // J. Mol. Evol.- 1993.- V.36.- P.477-488.

32. Kurose K., Inouye S., Sakaki Y., Tsuji F.I. Bioluminescence of the Ca2+-binding photoprotein aequorin after cysteine modification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989.- V.86.- P.80-84.

33. Leammli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 // Nature.- 1970.- V. 227.- P. 680-685.

34. Lee C.Y., O'Kane D.J., and Gibson B.G. Dynamic fluorescence properties of bacterial luciferase intermediates //Biochemistry.- 1988.- V.27.- P.4862-4870.

35. Li Zhi, Meighen E.A. Tryptophan 250 on the a subunit plays an important role in flavin and aldehyde binding to bacterial luciferase. Effects of W-)Y mutations on catalytic function // Biochemistry.- 1995.- V.34.- P. 15084-15090.

36. Lin L.Y-C., Sulea Т., Szittner R., Vassilyev V., Purisima E.O., Meighen E.A. Modeling of the bacterial luciferase-flavin mononucleotide complex combining flexible docking with structure-activity data // Protein Science.- 2001.- V.10.-P.1563-1571.

37. Liu Z-J., Vysotski E.S., Chen C-J., Rose J.P., Lee J., Wang B-C. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7A resolution determined directly from its sulfur substructure // Protein Science.- 2000.- V.9.- P.2085-2093.

38. Mager H.I.X., Tu S-C. Chemical aspects of bioluminescence // Photochemistry and Photobiology.- 1995.- Vol.62, №4.- P.607-614.

39. Markova S.V., Vysotski E.S., Blinks J.R., Burakova L.P., Wang B-C., and Lee

40. J. Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning,j iexpression, and comparison of some properties with those of the other Ca -regulated photoproteins // Biochemistry.- 2002.- V.41.- P.2227-2236.

41. Masuda Т., Tatsumi H., Nakano E. Cloning and sequence analysis of cDNA for luciferase of a Japanese firefly, Luciola cruciata // Gene.- 1989.- V.77.-P.265-270.

42. McCapra F., and Chang Y.C. The chemiluminescence of a Cypridina luciferin analogue // Chem. Commun.- 1967.- V.19.- P.1011-1012.

43. Musicki В., Kishi Y., Shimomura O. Structure of the functional part of photoprotein aequorin// J. Chem. Soc., Chem. Commun.- 1986.- P.1566-1568.

44. Nemtseva E.V., Kudryasheva N.S., Leontieva O.V., Ugarova N.N. Red shifts in firefly bioluminescence spectra // In Stanley P.E., Kricka L.J. editors. Bioluminescence and Chemiluminescence. Progress and Current Applications. -2002. P.49-52.

45. Nicoli M.Z., Hastings J.W. Bacterial luciferase. The hydrophobic environment of the reactive sulfhydryl // The Journal of Biological Chemistry.- 1974.-V.249.- P.2393-2396.

46. Nicoli M.Z., Meighen E.A., Hastings J.W. Bacterial luciferase. Chemistry of the reactive sulfhydryl // The Journal of Biological Chemistry.- 1974.- V.249.-P.2385-2392.

47. Nomura M., Inouye S., Ohmiya Y., Tsuji F.I. A C-terminal proline is required for Bioluminescence of the Ca2+-binding photoprotein, aequorin // FEBS Lett.-1991.- V.295.- P.63-66.

48. Ohmiya Y., Ohashi M., Tsuji F.I. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification // FEBS Lett.- 1992.-V.301.- P. 197-201.

49. Ohmiya Y.,Ohba N., Toh., Tsuji F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the luciferases from the Japanese fireflies, Pyrocoelia miyako and Hotaria parvula.// Photochem. Photobiol.- 1995.- V.62.- P. 309-313.1. Л I

50. Ohmiya Y., Tsuji F.I. Bioluminescence of the Ca -binding photoprotein, aequorin, after histidine modification // FEBS Lett.- 1993.- V.320.- P.267-270.

51. Prasher D., McCann R.O., Cormier M.J. Cloning and expression of cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1985.- V. 126.- P. 1259-1268.

52. Sandalova T. A model of the 3D structure of obelin // Protein Folds, a distance-based approach / Eds. H. Bohr, S. Brunak.- CRC Press.- 1996.- P.308-315.

53. Shi P.-Y., Maizels N., and Weiner A.M. Recovery of soluble, active recombinant protein from inclusion bodies // BioTechniques.- 1997.- V. 23,-P. 1036-1038.

54. Shimomura O. Cause of spectral variation in the luminescence of semisynthetic aequorins // Biochem. J.- 1995.- V.306.- P.537-543.

55. Shimomura O., Johnson F.H. Partial purification and properties of the Chaeptopterus luminescence sistem // Bioluminescence in Progress. Eds.

56. Johnson F.H. and Haneda Y.- Princeton University Press, Princeton,N J., 1966.-P.495-521.

57. Shimomura O., Johnson F.H. Peroxidized coelenterazine? The active group in the photoprotein aequorin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1978.- V.75.- P.2611-2615.

58. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell. Сотр. Physiol.- 1962.- V.59.-P.223-240.

59. Shimomura O., Musicki В., Kishi Y. Semi-synthetic aequorins with improved sensitivity to Ca2+ ions // Biochem. J.- 1989.- V.261.- P.913-920.

60. Shimomura O., Musicki В., Kishi Y. Semi-synthetic aequorin. An improved tool for the measurement of calcium ion concentration // Biochem. J.-■ 1988.-V.251.- P.405-410.

61. Shimomura O., and Teranishi K. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine // Luminescence.- 2000,- V.15.- P.51-58.

62. Szittner R., Meighen E.A. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium // J.Biol.Chem.-1990.- V.265.- P.16581-16587.

63. Tatsumu M., Kajiyama N., Nakano E. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of a cDNA clone encoding luciferase of a firefly, Luciola lateralis.//Biochim. Biophis. Acta.- 1992.-V.1331.-P.161-165.

64. Tsuji F.I., Inouye S., Goto Т., Sakaki Y. Site-specific mutagenesis of the calcium-binding photoprotein aequorin // Proc. Natl. Acad.Sci. USA.- 1986.-V.83.- P.8107-8111.

65. Tsuji F.I., Ohmiya Y., Fagan T.F., Toh H., Inouye S. Molecular evolution of the Ca2+-binding photoproteins of the Hydrozoa // Photochemistry and photobiology.- 1995.- V.62.- P.657-661.

66. Ugarova N.N., Brovko L.Yu. Protein structure and bioluminescence spectra for firefly bioluminescence // Luminescence.- 2002.- V.17.- P.321-330.

67. Ugarova N.N., Brovko L.Yu. Protein structure and bioluminescence spectra for firefly bioluminescence // In Stanley P.E., Kricka L.J. editors. Bioluminescence and Chemiluminescence. Progress and Current Applications. 2002. - P.61-66.

68. Van Eerd, J.P. and Takahshi, K. Determination of the complete amino acid sequence of bovine cardiac troponin // C. Biochemistry.- 1976.-V. 15.- P. 1 Hill 80.

69. Vysotski E.S., Liu Z-J., Rose J.P., Wang B-C., Lee J. Preparation and X-ray cristallographic analysis of recombinant obelin cristals diffracting to beyond 1.1 A// Acta Cristallogr.D. Biol.Cristallog.-2001.- V.57.- P.1919-1921.

70. Wnuk. W., Schoechlin, M., and Stein, E.A. Regulation of actomyosin ATPase by a single calcium-binding site on troponin С from crayfish // J. Biol. Chem. -1984.- V. 259.- P. 9017-9023.

71. Xin X., Xi L., Tu S.C. Functional consequences of site-directed mutation of conserved histidyl residues of the bacterial luciferase alpha subunit // Biochemistry.- 1991.- V.30.- P.l 1255-11262.

72. Ye L., Buck L.M., Schaeffer H.J., Leach F.R. Cloning and sequencing of a cDNA for firefly luciferase from Photuris pennsylvanica // Biochim. Biophis. Acta. 1997. - V. - 1339. - P. 39-52.