Формирование активного фотопротеинового комплекса на примере обелина и акворина и их мутантных форм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Еремеева, Елена Владимировна

• Еремеева, Елена Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Еремеева, Елена Владимировна

1.1. 1.2.

ГЛАВА 2.

2.1. 2.2.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Са2+-регулируемые фотопротеины и перспективы использования собственной флуоресценции белков для их изучения

Са -регулируемые фото протеины

Пространственная структура Са -регулируемых фотопротеинов

Возможные пути формирования 2-гидроперокси-целентеразина

Механизм биолюминесценции Са -регулируемых фотопротеинов

Спектральные свойства ароматических аминокислот и собственная флуоресценция белков

Тушение собственной флуоресценции и ее использование для изучения свойств белков

Использование собственной флуоресценции для изучения биолюминесцентных белков

Материалы и методы

Олигонуклеотид-направленный мутагенез

Приготовление компетентных клеток Е. coli XLI-Blue и BL21 Gold и их трансформация плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК

Культивирование клеток Е. coli, выделение и очистка белков

2.5. Изучение кинетики активации апофотопротеинов

2.6. Измерение собственной флуоресценции апофотопротеинов

2.7. Измерение удельной биолюминесцентной активности

2.8. Метод остановленной струи (stopped-flow)

2.9. Измерение спектральных характеристик апофотопротеинов и их мутантных форм

2.10. Реактивы

ГЛАВА 3.

ГЛАВА 4.

Исследование регенерации обелина и акворина из апофотопротеина, целентеразина и молекулярного кислорода

Собственная флуоресценция апообелина и апоакворина

Вклад каждого остатка триптофана в собственную флуоресценцию апообелина

Тушение собственной флуоресценции апофотопротеинов акриламидом

Тушение собственной флуоресценции апообелина и апоакворина целентеразином и определение кажущихся констант диссоциации соответствующих комплексов

Кинетика формирования активного фотопротеинового комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода

Исследование роли отдельных аминокислотных остатков (His 175, Туг 190 и Тгр179) в образовании активного фотопротеинового комплекса

4.1. Выделение и очистка мутантных форм обелина и акворина

4.2. Относительная биолюминесцентная активность мутантов обелина и акворина

4.3. Люциферазоподобная и фотопротеиновая биолюминесцентные активности мутантов

О 44.4. Са -независимая люминесценция мутантов обелина

4.5. Спектры поглощения мутантов акворина и обелина

4.6. Кинетика биолюминесценции мутантов акворина и обелина

4.7. Спектры биолюминесценции мутантов акворина и обелина

4.8. Спектры флуоресценции Са -разряженных мутантов акворина и обелина

4.9. Константы диссоциации комплекса апофотопротеин-целентеразин и константы скорости образования активного фотопротеинового комплекса мутантов обелина

4.10. Функциональная роль остатков His и Туг в формировании активного фотопротеинового комплекса

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование активного фотопротеинового комплекса на примере обелина и акворина и их мутантных форм»

Биолюминесценция представляет собой хемилюминесцентную реакцию, в которой происходит окисление субстрата «люциферина», катализируемое специфическим ферментом «люциферазой». Люциферины и люциферазы разных организмов являются соединениями различной структуры, поэтому это скорее собирательное и функциональное понятие, чем структурно-химическое. Несмотря на то, что биолюминесценция была открыта более 100 лет назад, интерес ученых к изучению этого явления не только не ослабевает, но и возрастает. Главным образом это обусловлено тем, что в настоящее время биолюминесцентные белки нашли широкое аналитическое применение в различных областях. Поскольку свет с помощью современных регистрирующих приборов может быть измерен с высокой чувствительностью, методы с использованием биолюминесцентных

1 о белков позволяют измерять вещества даже ниже 10" моля. В настоящее время биолюминесцентные методы широко используются в клеточной биологии и экологии для мониторинга внутриклеточных процессов и загрязнения окружающей среды, соответственно, а также в медицинской диагностике. Спектр биолюминесцентных методов с каждым годом растет, так как постоянно возникают все новые и новые области их приложения.

Биолюминесценция — явление, широко представленное в природе и присущее многим организмам в различных филогенетических ветвях: от бактерий до рыб. Широко распространены виды, использующие в качестве субстрата биолюминесцентной реакции целентеразин [Thompson et al., 1997]: это мягкий коралл Renilla, креветки Oplophorus, медузы Periphylla, копеподы Gaussia и Metridia, остракоды Conchoecia, цефалоподы Vampyroteuthis и другие. Наиболее изученными белками, использующими целентеразин в качестве субстрата, являются Са -регулируемые фотопротеины, ответственные за свечение ряда морских кишечнополостных организмов.

Все Са -регулируемые фотопротеины, исследованные к настоящему времени, демонстрируют высокую степень гомологии как аминокислотных последовательностей, так и пространственных структур. Фотопротеины являются односубъединичными белками (~22 кДа), содержащими три Са -связывающих центра «EF-hand» типа, характерные для семейства «EF-hand» I

Са -связывающих белков. Фотопротеины представляют собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апофотопротеина и молекулы органического субстрата — преактивированного кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентеразина), который прочно, но нековалентно связан с белком [Shimomura, Johnson, 1978; Head et al., 2000; Liu et al., 2003]. Связывание ионов кальция с фотопротеином, приводящее к изменению конформации белка, запускает реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина, в результате которой образуется целентерамид в возбужденном состоянии и С02- Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта света.

Предыдущие исследования фотопротеинов были направлены в основном на изучение механизма биолюминесценции, и в данной области достигнут значительный прогресс [Shimomura, 2006; Высоцкий и др., 2006; Vysotski, Lee, 2004; Vysotski, Lee, 2007]. Однако, несмотря на широкое применение рекомбинантных фотопротеинов, процесс формирования активного фермент-субстратного комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода все еще очень слабо изучен и его молекулярный механизм по-прежнему остается загадкой.

Выяснение молекулярного механизма формирования активного фотопротеинового комплекса, безусловно, имеет и фундаментальное, и прикладное значение, так как является необходимым шагом в понимании механизма биолюминесценции и, в перспективе, будет способствовать существенному повышению эффективности аналитического применения фотопротеинов, в особенности при их использовании в качестве репортерных молекул in vivo.

Целью представленной работы являлось исследование процесса образования активного Са -регулируемого фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода, а также функциональной роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фотопротеинов в этом процессе.

Выполнение данного исследования требовало решения ряда экспериментальных задач. Было необходимо:

1. Исследовать кинетические характеристики образования активного фотопротеинового комплекса на примере формирования активного обелина и акворина из апобелка, целентеразина и молекулярного кислорода и разработать математическую модель, описывающую этот процесс.

2. Для выявления функциональной роли аминокислот целентеразин-связывающей полости в формировании активного фотопротеина методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получить мутанты обелина и акворина с заменами Hisl75, Тгр179 и Туг190 на остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей, выделить мутантные белки в гомогенном виде и изучить их основные физико-химические свойства.

При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:

1. Образование активного фотопротеинового комплекса является двухстадийным процессом, в котором первый этап соответствует формированию комплекса между апофотопротеином и целентеразином и занимает миллисекунды. Вторая стадия соответствует конвертации связанного целентеразина в 2-гидропероксицелентеразин и занимает от нескольких десятков минут до нескольких часов в зависимости от состояния апобелка и условий инкубации с субстратом, что свидетельствует о том, что данная стадия является лимитирующей в образовании активного фотопротеина.

2. Согласно предложенному механизму образования активного фото протеинового комплекса, His 175 выполняет функцию переносчика протона от N7-aTOMa азота на С2-атом углерода целентеразина, а Туг 138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома углерода, необходимое для образования 2-гидропероксицелентеразина.

Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию механизма образования активного фотопротеинового комплекса. Кроме того, полученные результаты могут найти применение в прикладных исследованиях. К примеру, возможность управлять процессом образования активного фотопротеинового комплекса чрезвычайно важна для использования фотопротеинов в качестве репортерных молекул in vivo, так как фотопротеины экспрессируются внутри клетки-мишени в форме апобелков и там же конвертируются в форму активного фотопротеина инкубацией с экзогенным целентеразином.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект № 22.2), Интеграционного проекта СО РАН № 2, грантов РФФИ № 09-04-12022-офим и № 09-04-13686-офиц.

Результаты диссертационной работы докладывались на Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Сан-Диего, США, 2006; Шанхай, Китай, 2008; Лион, Франция, 2010), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, департамента биохимии Университета Вагенингена

Вагенинген, Нидерланды) и Национальной лаборатории Биомакромолекул Института биофизики Китайской академии наук (Пекин, Китай).

По результатам исследования опубликована 1 статья в рецензируемом журнале и 1 статья в сборнике материалов Международного симпозиума по Биолюминесценции и Хемилюминесценции.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Еремеева, Елена Владимировна

выводы

1. Определен вклад каждого из шести остатков триптофана в собственную флуоресценцию апофотопротеинов на примере апообелина с использованием мутантов с заменами остатков триптофана на фенилаланин. Показано, что наибольший вклад в собственную флуоресценцию апофотопротеинов вносят Тгр92 (40%), Тгр179 (20%) и Trpl 14 (20%), боковые цепи которых направлены внутрь целентеразин-связывающей полости.

2. Показано, что степень тушения флуоресценции триптофанов апообелина и апоакворина зависит от концентрации целентеразина. Это позволило впервые определить кажущиеся константы диссоциации комплекса с целентеразином для апоакворина (1,2 ± 0,12 мкМ) и апообелина (0,2 ± 0,04 мкМ).

3. Установлено, что связывание целентеразина с апофотопротеинами происходит в течение нескольких миллисекунд. Так как связывание занимает миллисекунды, а формирование активного фотопротеинового комплекса из апобелка, целентеразина и кислорода занимает несколько десятков минут, сделано заключение, что лимитирующим этапом реакции является образование 2-гидропероксицелентеразина.

4. Предложена математическая модель, описывающая процесс формирования активного фотопротеинового комплекса. Данная модель позволила оценить константу скорости реакции для образования 2-гидропероксицелентеразина из целентеразина и молекулярного кислорода в активном центре обелина (11,0 ± 0,4 М^сек"1) и определить энергию активации этого процесса (45,0 кДж/моль).

5. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 36 мутантов акворина и обелина с заменами Hisl75, Тгр179 и Туг190 на аминокислотные остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей. Все мутантные белки выделены в гомогенном виде и охарактеризованы. Показано, что все мутации His 175, Тгр 179 и Туг 190 приводят к снижению биолюминесцентной активности и скорости образования активного фотопротеинового комплекса.

6. Предложен механизм образования активного фотопротеинового комплекса, согласно которому His 175 участвует в образовании целентеразина, протонированного по С2-атому, выполняя функцию переносчика протона от N7-aTOMa, а Туг138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома целентеразина, необходимое для последующего образования его 2-гидроперокси-производного.

7. Установлено, что, несмотря на высокую идентичность аминокислотных последовательностей, а также сходство пространственных структур обелина и акворина, аналогичные замены His 175, Тгр 179 и Туг190 в этих фотопротеинах в ряде случаев по-разному отражаются на биолюминесцентных свойствах. Это свидетельствует о том, что акворин и обелин, несмотря на высокую гомологию, в ответ на связывание кальция могут претерпевать различные конформационные переходы, приводящие, например, к разной кинетике биолюминесцентного ответа или различной чувствительности к ионам кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена изучению процесса образования активного Са -регулируемого фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода, а также функциональной роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фотопротеинов в этом процессе.

Образование активного фотопротеинового комплекса является двухстадийным процессом, в котором первый этап соответствует формированию комплекса между апофотопротеином и целентеразином, занимая миллисекунды. На второй стадии происходит конвертация связанного целентеразина в 2-гидропероксицелентеразин, занимающая от нескольких десятков минут до нескольких часов в зависимости от состояния апобелка и условий инкубации с субстратом, что свидетельствует в пользу того, что именно эта стадия является лимитирующей при образовании активного фотопротеина.

В результате проведенных экспериментов была впервые исследована собственная флуоресценция апофотопротеинов и определены константы диссоциации комплекса апофотопротеин-целентеразин для апообелина и апоакворина. На основе предложенной математической модели, описывающей формирование активного фотопротеинового комплекса, были оценены константы скорости этого процесса для обелина и ряда его мутантов. Адекватность предложенной модели подтверждается хорошим соответствием энергии активации фотопротеинового комплекса, рассчитанной с ее помощью, с величиной энергии активации, полученной с помощью квантово-химических вычислений.

Для выявления аминокислотных остатков целентеразин-связывающей полости, играющих важную роль в процессе образования активного фотопротеинового комплекса, методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза были получены мутанты обелина и акворина с заменами His 175,

Tip 179 и Туг 190 на остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей. На основании изучения полученных мутантов предложена гипотеза об образовании активного фотопротеинового комплекса, отражающая роль некоторых аминокислотных остатков в этом процессе. Согласно гипотезе, His 175 участвует не только в стабилизации 2-гидропероксицелентеразина, но и в процессе образования целентеразина, протонированного по С2-атому, играя роль переносчика протона от N7-атома. Остаток Туг 138 поляризует С2-Н связь, обеспечивая тем самым позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома целентеразина, необходимое для последующего эффективного образования 2-гидроперокиси-производного.

Таким образом, полученные в данной работе результаты позволили пролить свет на процесс образования активного фотопротеинового комплекса и могут найти применение в прикладных исследованиях, в частности для использования фотопротеинов в качестве репортерных молекул in vivo.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. Е.С. Высоцкому, а также моим коллегам из лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Еремеева, Елена Владимировна, 2010 год

1. Бондарь B.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / B.C. Бондарь, К.П. Трофимов, Е.С. Высоцкий // Биохимия. - 1992. - Т. 57. - С. 1481-1490.

2. Высоцкий, Е.С. Выделение и очистка Са -зависимого фотопротеина — обелина из гидроидных полипов Obelia longissima / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В.Н. Летунов // Биохимия. 1989. - Т. 54. - С. 965-973.

3. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40, №3. - С. 404 - 417.

4. Илларионов, В.А. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / В.А. Илларионов, С.В. Маркова, B.C. Бондарь, Е.С. Высоцкий, И.И. Гительзон // Докл. Акад. наук. 1992. - Т. 326. - С.911-913.

5. Ababou, A. On the involvement of electron transfer reactions in the fluorescence decay kinetics heterogeneity of proteins / A. Ababou, E. Bombarda // Protein Sci. 2001. - V. 10. - P. 2102-2113.

6. Adams, P.D. Intramolecular quenching of tryptophan fluorescence by the peptide bond in cyclic hexapeptides / P.D. Adams, Y. Chen, К. Ma, M. Zagorski, F.D. Sonnichsen, M.L. McLaughlin, M.D. Barkley // J. Am. Chem. Soc. 2002. - V. 124. - P. 9278-9286.

7. Adman, E.T. Structural features of azurin at 2.1 К resolution / E.T. Adman, L.H. Jensen//Isr. J. Chem. 1981. - V. 21. -P.8-12.

8. Akyol, Z. Apo-calmodulin binds with its C-terminal domain to the N-methyl-D-aspartate receptor NR1 CO region / Z. Akyol, J.A. Bartos, M.A. Merrill, L.A. Faga, O.R. Jaren, M.A. Shea, J.W. Hell // J. Biol. Chem. -2004. V. 279. - P. 2166-2175.

9. Allen, D.G. Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration a calcium independent component / D.G. Allen, J.R. Blinks,

10. F.G. Prendergast // Science. 1977. - V. 195. - P. 996-998.

11. Ballew, R.M. Direct observation of fast protein folding: the initial collapse of apomyoglobin / R.M. Ballew, J. Sabelko, M. Gruebele // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 5759-5764.

12. Bollen, YJ.M. Last in, first out: the role of cofactor binding in flavodoxin folding / YJ.M. Bollen, S.M. Nabuurs, W.J.H. van Berkel, C.P.M. van Mierlo // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 7836-7844.

13. Boyer, M. Quantitative characterization of the interaction between purified human estrogen receptor a and DNA using fluorescence anisotropy / M. Boyer, N. Poujol, E. Margeat, C.A. Royer // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28.-P. 2494-2502.

14. Burstein, E.A. Luminescence of protein chromophores / E.A. Burstein // In Model studies: science and technology results. 1976. - V. 6: Biophysics,1. VINITI, Moscow.

15. Callis, F.R. Quantitative prediction of fluorescence quantum yields for tryptophan in proteins / F.R. Callis, T. Liu // J. Phys. Chem. B. 2004. - V. 108.-P. 4248-4259.

16. Campbell, A. K. Extraction, purification and properties of obelin, the calcium -activated protein from the hydroid Obelia geniculata / A.K. Campbell//Biochem.- 1974.-V. 143.-P. 411-418.

17. Canet, D. High-sensitivity fluorescence anisotropy detection of protein-folding events: application to a-lactalbumin / D. Canet, K. Doering, C.M. Dobson, Y. Dupont // Biophys, J. 2001. - V. 80. - P. 1996-2003.

18. Chen, R.F. Fluorescence quantum yield of tryptophan and tyrosine / R.F. Chen // Anal. Lett. 1967. - V. 1 - P. 35-42.

19. Chen, Y. The peptide bond quenches indole fluorescence / Y. Chen, B. Liu, H.-T. Yu, M.D. Barkley // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 92719278.

20. Chen, Y. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins / Y. Chen, M.D. Barkley // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 9976-9982.

21. Cherednikova, E.Yu. Quenching of tryptophan fluorescence of firefly luciferase by substrates / E.Yu. Cherednikova, A.Yu. Chikishev, E.I. Dementieva, O.V. Kossobokova, N.N. Ugarova // J. Photochem. Photobiol., B.-2001.-V. 60.-P. 7-11.

22. Chudinova , E.A. Fluorescence of tryptophan residues in firefly luciferases and enzyme-substrate complexes / E.A. Chudinova, E.I. Dementieva, L.Yu. Brovko, A.P. Savitskii, N. N. Ugarova // Biochemistry (Moscow). 1999. -V. 64.-P. 1097-1103.

23. Conti, E. Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming enzymes / E. Conti, N. P. Franks, P. Brick // Structure. 1996.-V. 4.-P. 287-298.

24. Cormier, MJ. Evidence for similar biochemical requirements forbioluminescence among the coelenterates / M. J. Cormier, K. Hori, Y.D. Karkhanis, J.M. Anderson, J.E. Wampler, J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1973. -V. 81. - P. 291-297.

25. Dement'eva, E.I. Inactivation of Luciola mingrelica firefly luciferase by guanidinium chloride and its reactivation / E.I. Dement'eva, L.G. Maloshenok, N.N. Ugarova // Moscow University Chem. Bull. 2000. - V. 55.-P. 23-28.

26. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92F obelin mutant / L. Deng, E.S. Vysotski, Z.-J. Liu, S.V. Markova, N.P. Malikova, J. Lee, J. Rose, B.-C. Wang // FEBS Lett. 2001. - V. 506. - P. 281-285.

27. Eckenhoff, R.G. Cooperative binding of inhaled anesthetics and ATP to firefly luciferase / R.G. Eckenhoff, J.W. Tanner, P.A. Liebman // Proteins. -2001.-V. 42.-P. 436-441.

28. Edelhoch, H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins / H. Edelhoch // Biochemistry. 1967. - V. 6. - P. 1948-1954.

29. Eftink, M.R. Indole fluorescence quenching studies on proteins and model systems: use of the inefficient quencher succinimide / M.R. Eftink, C.A. Ghiron // Biochemistry. 1984. -V. 23. - P. 3891-3899.

30. Eftink, M.R. Fluorescence techniques for studying protein structure / M.R. Eftink // Methods Biochem. Anal. 1990. - V. 35. - P. 117-129.

31. Eftink, M.R. Fluorescence quenching: theory and applications / M.R. Eftink // In Topics in fluorescence spectroscopy, Principles. Ed. J.R. Lakowicz -1991.-V. 2.-P. 53-126.

32. Eftink, M.R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions / M.R. Eftink // Methods Enzymol. -1997.-V. 278.-P. 221-257.

33. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. -V. 1. - P. 301-305.

34. Floehlich, P.M. Fluorescence quenching of indoles by amides / P.M. Floehlich, K. Nelson // J. Phys. Chen. 1978. - V. 82. - P. 2401-2403.

35. Gilmanshin, R. Structures of apomyoglobin's various acid-destabilized forms / R. Gilmanshin, M. Gulotta, R.B. Dyer, R.H. Callender // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 5127-5136.

36. Goto, T. Chemistry of bioluminescence / T. Goto // Pure Appl. Chem. -1968.-V. 17.-P. 421-441.

37. Goto, T. Cypridina bioluminescence. IV. Synthesis and chemiluminescence of 3,7-dihydroimidazol,2-a.pyrazin-3-one and its 2-methyl derivative / T. Goto, S. Inoue, S. Sugiura// Tetrahedron Lett. 1968. - P. 3873-3876.

38. Gryczynski, I. Lifetime distributions and anisotropy decays of indole fluorescence in cyclohexane/ethanol mixtures by frequency-domain fluorometry / I. Gryczynski, W. Wiczk, M.L. Johnson, J.R. Lakowicz // Biophys. Chem.- 1988.-V. 32.-P. 173-185.

39. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 A resolution // J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura // Nature. -2000. V. 405. - P. 372-376.

40. Hori, K. Renilla luciferin as the substrate for calcium induced photoprotein bioluminescence. Assignment of luciferin tautomers in aequorin and mnemiopsis / K. Hori, J.M. Anderson, W.W. Ward, M.J. Cormier // Biochemistry. 1975. -V. 14. - P. 2371-2376.

41. Hori, K. Structure of native Renilla reniformis luciferin / K. Hori, H. Charbonneau, R.C. Hart, M.J. Cormier // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1977. V. 74. - P. 4285-^4287.

42. Illarionov B.A. Sequence of the cDNA encoding the Ca(2+)"activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima / B.A. Illarionov, V.S. Bondar, V.A. Illarionova, E.S. Vysotski.// Gene. 1995. -V. 153. — P.273—274.

43. Illarionov B.A. Recombinant obelin: Cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator / B. A. Illarionov,

44. A. Frank, V.A. Illarionova, V. S. Bondar, E.S. Vysotski, J.R. Blinks // Methods of enzymology. 2000. - V. 305. - P. 223-249.

45. Imai, Y. Fluorescence properties of phenolate anions of coelenteramide analogues: the light-emitter structure in aequorin bioluminescence / Y. Imai, T. Shibata, S. Maki, S. Niwa, M. Ohashi, T. Hirano // Photochem. Photobiol. A.-2001.-V. 146.-P. 95-107.

46. Inouye S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescent protein aequorin / S. Inouye, M. Noguchi, Y. Sakaki, Y. Takagi, T. Miyata, S. Iwanaga, T. Miyata, F.I. Tsuji // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82.-P. 3154-158.

47. Inouye S. Expression of apoaequorin complementary DNA in Escherichia coli. / S. Inouye, Y. Sakaki, Y. Goto, F.H. Tsuji // Biochemistry. 1986. -V. 25.-P. 8425-8429.

48. Inouye S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)"activated photoprotein, clytins / S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. — V. 11.— P.343-346.

49. Ireland J.F. Acid-base properties of electronically excited states of organic molecules / J.F. Ireland, P.A.H. Wyatt // Adv. Phys. Org. Chem. 1976. -V. 12.-P. 131-221.

50. Jones, B.E. Local and global dynamics during the folding of Escherichia coli dihydrofolate reductase by time-resolved fluorescence spectroscopy / B.E. Jones, J.M. Beechem, C.R. Matthews // Biochemistry. 1995. - V. 24. - P. 1867-1877.

51. Kozlov, A.G. Stopped-flow studies of the kinetics of single-stranded DNA binding and wrapping around the Escherichia coli SSB tetramer / A.G. Kozlov, T.M. Lohman // Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 6032-6044.

52. Kretsinger, R. H. Carp muscle calcium binding protein. II. Structure determination and general description / R.H. Kretsinger, C.E. Nockolds // J. Biol. Chem.- 1973. V. 248. - P. 3313-3326.

53. Kurose, K. Bioluminescence of the calcium-binding photoprotein aequorin after cysteine modification / K. Kurose, S. Inouye, Y. Sakaki, F.I. Tsuji // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 80-84.

54. Laemli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 / U.K. Laemli // Nature. 1970. - V. 227. - P. 68685.

55. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2006. 3rd Ed., Springer, Singapore.

56. Lewis J.C. Bioluminescence and Secondary Structure Properties of Aequorin Mutants Produced for Site-Specific Conjugation and Immobilization / J.C. Lewis, J.J. Lopez-Moya, S. Daunert // Bioconjugate Chem. 2000. - V. 11. - P. 65-70.

57. Li, Z. Spectral properties of Trpl82, Trpl94, and Trp250 on the alpha subunit of bacterial luciferase / Z. Li, N. Valkova, E. Meighen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -V. 263. - P. 820-824.

58. Liu, Z.J. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J. Rose, J. Lee, B.-C. Wang // Protein Sci. 2000. - V.9. P. 2085-2093.

59. Loewenthal, R. Fluorescence spectrum of barnase: contributions of three tryptophan residues and a histidine-related pH dependence / R. Loewenthal, J. Sancho, A.R. Fersht // Biochemistry. 1991. -V. 30. - P. 6775-6779.

60. Madvar A.R. Implication of a critical residue (Glul75) in structure and function of bacterial luciferase / A.R. Madvar, S. Hosseinkhani, K. Khajeh, B. Ranjbar, A. Asoodeh // FEBS Lett. 2005. - V. 579. - P. 4701-4706.

61. Malikova, N. P. Spectral tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, S.V. Markova, E.S. Vysotski, J. Lee //FEBS Lett. -2003. -V. 554. P. 184-188.

62. McCapra, F. The chemiluminescence of Cypridina analogue / F. McCapra, Y.C. Chang// Chem. Commun. 1967. - P. 1011-1012.

63. Mori, K. Real light emitter in the bioluminescence of the calcium-activated photoproteins aequorin and obelin: light emission from the singlet-excited state of coelenteramide phenolate anion in a contact ion pair / K. Mori, S.

64. Maki, H. Niwa, H. Ikeda, Т. Hirano // Tetrahedron. 2006. - V. 62. - P. 6272-6288.

65. Morin, J. G. Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates / J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1971. -V. 77.-P. 305-312.

66. Morin, J. G. Coelenterate bioluminescence / J. G. Morin; edited by L. Muscatine, H. M. Lenhoff // Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. New York: Academic press, 1974. - P. 397—438.

67. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, F.I. Tsuji // FEBS Lett. -1992.-V. 301.-P. 197-201.

68. Ohmiya Y. Bioluminescence of the Ca binding photoprotein, aequorin, after histidine modification / Y. Ohmiya, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. -V. 320.-P. 267-70.

69. Ohmiya, Y. Mass spectrometric evidence for a disulfide bond in aequorin regeneration / Y. Ohmiya, S. Kurono, M. Ohashi, T.F. Fagan, F.I. Tsuji // FEBS Lett. 1993. -V. 332. - P. 225-228.

70. Ohmiya, Y. Shining the light: the mechanism of the bioluminescence reaction of calcium-binding photoproteins / Y. Ohmiya, T. Hirano // Chem. Biol. 1996. - V. 3. - P. 337-347.

71. Pace, C.N. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein / C.N. Pace, F. Vajdos, L. Fee, G. Grimsley, T. Gray // Protein Sci. -1995.-V. 11.-P. 2411-2423.

72. Prasher D. Cloning and expression of the cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein / D. Prasher, R.O. McCann, M.J.

73. Cornier // Biochem.Biophys.Res.Commun. 1985. - V. 126. - P.1259-1268.

74. Raja, S.M. Localization and environment of tryptophans in soluble and membrane-bound states of a pore-forming toxin from Staphylococcus aureus / S.M. Raja, S.S. Rawat, A. Chattopadhyay, A.K. Lala // Biophys J. 1999. -V. 76.-P. 1469-1479.

75. Sambrook J. Molecular Cloning. A laboratory manual // J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - V. 2.

76. Sandalova, T.P. Model of the active site of firefly luciferase / T. P. Sandalova, N. N. Ugarova // Biochemistry (Moscow). 1999. - V. 64. - P. 962-967.

77. Shimomura, O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea / O. Shimomura, F. H. Johnson, Y. Saiga // J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V. 59.-P. 223-239.

78. Shimomura O. Extraction, purification and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from hydromedusan, Halistaura / O. Shimomura, F.H. Johnson, Y. Saiga//J. Cell Сотр. Physiol. 1963. -V. 62. -P.9-15.

79. Shimomura O. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / O. Shimomura, F.H. Johnson // Bioluminescence in progress. Princeton, 1966. -P.495-521.

80. Shimomura, O. Regeneration of the photoprotein aequorin / O. Shimomura , F.H. Johnson //Nature. 1975. -V. 256. - P. 236-238.

81. Shimomura, O. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. -V. 75. - P. 2611-2615.

82. Shimomura, O. The relative rate of aequorin regeneration from apoaequorin and coelenterazine analogues / O. Shimomura, Y. Kishi, S. Inouye // Biochem. J. 1993. - V. 296. - P.549-551.

83. Shimomura, О. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine / O. Shimomura, K. Teranishi // Luminescence. 2000. — V. 15.-P. 51-58.

84. Shimomura, O. Bioluminescence: Chemical Principles and Methods / O. Shimomura. Singapore: World Scientific Publishing Co., 2006. - p. 470.

85. Steiner R.A. Structural basis for cofactor-independent dioxygenation of N-heteroaromatic compounds at the a/p-hydrolase fold // R.A. Steiner, H.J. Janssen, P. Roversi, A.J. Oakley, S. Fetzner // PNAS. 2010. - V. 107. - P. 657-662.

86. Stewart, J. J. Optimization of parameters for semiempirical methods IV: extension of MNDO, AMI, and PM3 to more main group elements / J.J Stewart//J. Mol. Model.- 2004. -V. 10.-P. 155-164.

87. Strynadka, N. C. J. Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins / N. C. J. Strynadka, M.N.G. James // Annu. Rev. Biochem. 1989. - V. 58. - P. 951-998.

88. Szabo, A.G. Conformational heterogeneity of the copper binding site in azurin / A.G. Szabo, T.M. Stepanik, D.M. Wayner, N.M. Young // Biophys. J. 1983. - V. 41. - P. 233-244.

89. Szittner, R. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium / R. Szittner, E. Meighen // J. Biol. Chem. 1990. -V. 265. - P. 16581-16587.

90. Terwilliger, T.C. The structure of melittin / T.C. Terwilliger, D. Eisenberg // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. -V.6016-6022.

91. Thomson, C.M. The widespread occurrence and tissue distribution of the imidazolopyrazine luciferins / C.M. Thomson, P.J. Herring, A.K. Campbell // J. Biolum. Chemilum. 1997. - V. 12. - P. 87-91.

92. Tomilin F.N. Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation / F.N. Tomilin, L.U. Antipina, E.V. Eremeeva, S.G. Ovchinnikov, E.S. Vysotski//Luminescence. -2010. -V. 25. P. 210-211.

93. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca -binding photoproteins of the Hydrozoa / F.I. Tsuji, Y, Ohmiya, T.F. Fagan, H. Toh, S. Inouye // Photochem. Photobiol. 1995. -V. 62. - P. 657-661.

94. Ugarova, N.N. Interaction of firefly luciferase with substrates and their analogs: a study using fluorescence spectroscopy methods / N.N. Ugarova // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. - V. 7. - P. 218-227.

95. Ulrich, A. Mapping the interface between calmodulin and MARCKS-related protein by fluorescence spectroscopy / A. Ulrich, A.A.P. Schmitz, T. Braun, T. Yuan, H.J. Vogel, G. Vergeres // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -V. 97.-P. 5191-5196.

96. Usami, K. Low-temperature photooxygenation of coelenterate luciferin analog synthesis and proof of 1,2-dioxetanone as luminescence intermediate / K. Usami, M. Isobe // Tetrahedron. 1996. - V. 52. - P. 12061-12090.

97. Vysotski E.S. Preparation and X-ray crystallographic analysis of recombinant obelin crystals diffracting to beyond 1.1 A. / E. S. Vysotski, Z.J. Liu, J. Rose, B.C. Wang, J. Lee //Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. -2001.-V. 57.-P. 1919-1921.

98. Vysotski, E.S. Ca -regulated photoproteins: structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. -2004.-V. 37.-P. 405^115.

99. Ward, W.W. Properties of mnemiopsin and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. / W.W. Ward, H.H. Seliger//Biochemistry. 1974.-V. 13.-P.l500-1510.