Исследование взаимодействия между бактериальными ФМН-редуктазой и люциферазой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Мажуль, Михаил Михайлович

• Мажуль, Михаил Михайлович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мажуль, Михаил Михайлович

3.4. Реактивы

4. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Измерение активности ферментов

а) Лнщефераза

б) FMN-редуктаза

в) NADH:цитохром с-оксидороедуктаза

4.2. Электрофорез в ПААГ

4.3. Нахождение изоэлектрической точки

4.4. Определение молекулярной массы ферментов

4.5. ОЕфвделение белка

4.6. Измерение спектров биолюминесценции

5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ

5.1. Получение бактериальной сульфатаммонийной пасты

5.2. Выделение FMN-редуктазы из V./iscfierí

5.3. Очистка люциферазы из V.fischeri

5.4. Выделение FMN-редуктазы из В.coli

5.5. Выделение обоих ферментов из рекомбинантного

штамма Ж.coli JM109 (рРЗ)

- 4 -

6.СВОЙСТВА FMN-РЕДУКТАЗ

6.1. Свойства PMN-редуктазы из V.fisciwri

6.2. Свойства PMN-рвдуктазы из Ж.coli

7. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЖЩИФЕРАЗЫ И МШ-ИЭДУКТАЗЫ

7.1. Ферменты из Y.fiacheri

7.2. Ферменты из V.lwrveyt и Р.phosphorеш

7.3. Лщифераза из E.coli JM109(pF3) с генами lux AB________99

7.4. Ферменты из E.coli JM109, E.coli «Ш109(рРЗ)

и V.fischerl

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

116

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование взаимодействия между бактериальными ФМН-редуктазой и люциферазой»

- 5 -ВВЕДЕНИЕ

Люминесцентные бактерии открыты в 1875 году Щшюгером, а к 1900 году число описанных видов достигло двадцати, и с тех пор интерес к ним не ослабевает. Люминесцентные бактерии являются группой прокариот, функционально объединяемой способностью излучать видимый невооруженным глазом свет. Распространены они повсеместно. Среди них есть почвенные, пресноводные и морские виды. Экологические ниши, занимаемые морскими люминесцентными бактериями, отличаются особенным разнообразием: есть свободноживущие виды, виды, паразитирующие на морских ракообразных, комменсалы, обитающие в пищеварительном тракте морских рыб и беспозвоночных, и, наконец, симбиотические виды, живущие в специальных световых органах глубоководных рыб и кальмаров

Бактериальная биолюминесценция - это окислительный процесс, сопровождаемый потреблением кислорода. Функционирование люминесцентной системы как альтернативного дыханию потока электронов признется большинством исследователей (Nealson, Hastings, 1979, Hasnings et al., 1985, Nealson, 1993). Обычно они рассматривают биолюминесцентную систему как ответвление от дыхательной электроннотранспортной цепи на уровне восстановленного флавина или восстановленных шфидиннуклеотидов, которые могут, благодаря наличию фермента FMN-редуктазы, участвовать в восстановлении флавина, являющегося одним из субстратов бактериальной люциферзы. Однако до последнего времени сведения о PMN-редуктазе из люминесцентных бактерий недостаточны и противоречивы, но еще меньше их, как ни парадоксально, о PMN-редуктазе из нелюминесцентных бактерий. Очень мало изучена и

возможность котлексообразования между люциферазой и PtóN-редуктазой. Поэтому разрешение этих вопросов являются весьма актуальными.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение новых данных о возможности и механизме взаимодействия бактериальной люциферазы о РШ-редуктазами как из светящихся бактерий, так и из бактерий, не обладающей таким свойством. Задачи нашей работы были следующими:

1. Разработка метода выделения высокоочищенной FMN-редуктазы (NAD (Р )н: PtóN-оксидоредуктазы) из морской люминесцентной бактерии Vibrio fischerí и Escherichia coli.

2. Характеристика свойств мш-редуктазы из V.fischerí и В.coli, и выяснение характера взаимодействия фермента с сбстратами.

3. Исследование взаимодействия двух ферментов: бактериальной люциферазы и РШ-редуктазы из Vibrio fischerí.

4. Выяснение возможности взаимодействие двух ферментов бактериальной люциферазы и РШ-редуктазы, выделенных из люминесцентных бактерий Vibrio fischerí, Vibrio harveyí и Ptvotobacterim phosphoremr цутем образования активного комплекса между этими ферментамии в различных сочетаниях.

5. исследование взаимодействия между люциферазой, выделенной из Vibrio fischerí 6 и из рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109(рРЗ), с клонированными в нем генами 1ш AB Vibrio fischeríг с РШ-редуктазой, шделенной из штамма Escherichia coli JM109.

Научная новизна работы. Получен высокоочищенный препарат РШ-редуктазы. Определены молекулярная масса фермента, его кинетические константы, порядок присоединения субстратов,

взаимодействие с различными акцепторами и ингибиторами, изоэлектрическая точка, оптимум рН, термоустойчивость.

Своими опытами мы впервые показали очень большое (до 100-кратного) стимулирующее действие PMN-редуктазы на реакцию бактериальной люциферазы вследствие образования фермент-ферментного комплекса и определили константу равновесия образовавшегося комплекса. При этом исследования показывают отсутствие изменений как в спектрах эмиссии, так и в константе скорости затухания биолюминесценции.

Практическое значение работы. Практическую значимость имеют сформулированные в работе новые принципы образования фермент-ферментного комплекса между люциферазой и редуктазами, которые, помимо несомненного научного интереса, помогут создать оптимальные бинарные системы для проведения биолюмине сцентного тестирования различных веществ с очень высокой чувствительностью к этим соединениям.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на Всесоюзной научной школе "Биолюминесценция и хемилюминесцентный анализ" (Краснорярск, 1985), VII съезде ВМО (Алма-Ата, 1985), конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990).

- 8 -ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. БИОЛОГИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ 1.1. Общие полжения, таксономия, физиология

Излучать свет свойственно всем живым организмам. По своей природе это свечение является биохемилюмине сценцией. Биолюминесценция, в отличие от биохемилюминесценции, являясь по существу той же хемилюминесценцией, характерна тем, что ее интенсивность на несколько порядков выше и может наблюдаться невооруженным глазом.

Биолюминесценция свойственна небольшому числу организмов, таксономическое положение которых весьма разнообразно: способностью светиться обладают бактерии, грибы, моллюски, кишечнополостные, оболочники, кольчатые черви, динофлагелляты, ракообразные, насекомые, рыбы (Сборн. под ред. Кондратьевой 1984; Harvey, 1952). Главными отличиями биолюминесценции являются наличие у светящихся организмов особой ферментативной системы и высокий квантовый выход реакций, который может превышать 0,1.

Долгое время таксономия люминесцентных бактерий претерпевала постоянные изменения. Ее история изложена в работах (Reichelt, Bauman, 1973, Nealson, Hastings, 1979, Baumann et al., 1980, 1981, Примакова, 1984). Современная систематика этих бактерий, учитывающая данные молекулярно-филогенетических исследований (гомологии ДНК, последовательностей 5S рРНК или I6S рРНК, содержания Г-Ц пар в ДНК, а также иммунологических сравнительных характеристик специфических ферментов (Nearhos, Fuerst, 1987, 1987,Ehlers et al., 1988)), в основном согласуется

с более ранними результатами, полученными посредством нумерической таксономии. В своем обзоре Нильсон и Гастингс высказывают предположение о том, что экология, физиология и эволюция люминесцентных бактерий близко связаны с их ассоциацией с эукариотическими хозяевами (Nealson, Hastings, 1992)

В настоящее время все люминесцентные бактерии отнесены к 4 родам: Vibrio и Phntobacterivm (сем. Vibrionaceae), Alteromonas (4 секция - грам-отрицательные аэробные палочки и кокки) и Xenorhabdus (сем. Enterobacter iacecue) (Baumann, Baumann, 1984; Baumann et al., 1984a,b; Farmer, 1984). Кроме описанного недавно (Jensen et al., 1980) Alteromoms hanedai, являющегося облигатным аэробом, все виды люминесцентных бактерий являются факультативными анаэробами, способными расти в интервале температур от +4°С до +35°С на глюкозе, фруктозе, маннозе, галактозе, глицерине. Представляют собой грамотрицательные подвижные палочки с одним или несколькими полярно расположенными жгутиками.

Подавляющее большинство видов люминесцентных бактерий является морскими обитателями и проявляет специфическую потребность в высокой концентрации ионов натрия в среде для поддержания жизнедеятельности. Все морские виды продуцируют экзохитиназу (Nealson, Hastings, 1979). Распространены они практически повсеместно от тропических до полярных широт, однако встречаются они преимущественно в прибрежных акваториях, лагунах заливах, отдельно живущие клетки не люминесцируют. Однако попадая на подходящий субстрат и образуя колонии, они начинают люминесцировать.

Экологические ниши, занимаемые люминесцентными бактериями, отличаются разнообразием: есть виды, ведущие свободный образ

жизни, вида, паразитирующие на морских ракообразных, кошенсалы, обитающие в пищеварительном тракте морских рыб m беспозвоночных» и» наконец, симбиотические виды, живущие в специальных световых органах глубоководных рыб И кальмаров (Harvey, 1952; Nealson, Has t ings, 1979 ). Единственный наземный вид, т.е. местообитание которого не вода и не водные животные, Xenorhdbdus lumlnescens, ныне Photorhdbûus lumineacem (Boemare et al., 1993), является специфическим симбионтом энтомопатогенных нематод сем. Heterorhabditlûae (Thomas, Poinar, 1979). Основные вида люминесцентных и близких к ним нелюминесцентных бактерий можно свести в следующую таблицу I

Основные вида люминесцентных и близких к ним нелюминесцентных -, бактерий (Nealson, Hastings, 1979)

ВИДЫ Рода Люминесцентные вида Нелюминесцентные вида

Морские Fhotobacterium P. phosphorеш

P.leiognathi

Vibrio V.fiacheri V.angustm

Vtftarveyi V.algtnolitica

V.logei V.pardhamolittca

V.splendida V .angîullarta

V.natriegens

V.ca&ibelli

7. vuinlflea

V.nereida

V.pelagia,

(прдолжение таблицы I)

Виды Рода Люминесцентные виды Нелюмине сцентные вида

Неморские Vibrio Fhotorhabdua Y.choleras albensis P. luminescens Y.choleras el-tor P.nematophilus

Люминесцентные бактерии, относящиеся к различным видам, испускают свет в сине-зеленой области спектра с Ä.ffiax=472-505 нм (Cline, Hastings, 1974; Seliger, MoBlroy, 1965). Кроме того, один из штаммов V.ftscheri у-1 (Ruby, Nealson, 1977) испускает свет с максимумом при 545 нм и плечом при 500 нм. Наиболее яркие штаммы способны излучать свет с интенсивностью 103-104 квант/сек в расчете на клетку (Hastings, Nealson, 1977). Показано, что энергия испускаемая одной клеткой в виде светового излучения составляет величину порядка 5х10-10 мкДж в пересчете на I см2 поверхности клетки за I сек при 510 нм (Harvey, 1952). Таким образом светящаяся бактериальная клетка являетя самым миниатюрным известным источником света.

Установлен®), что изменение различных факторов, таких как температура, pH, солевой состав - не влияют на спектральные характеристики люминесценции, однако могут повлиять на ее интенсивность (iymers, van Sohoevenburg, 1936). Показано, что наблюдаемый изотопный аффект также мало зависит от длины альдегидной цепи и величины pH в пределах 6-9 (Fransisoo et al., 1998).

- 12 -

1.2. Рост и развитие культуры люминесцентных бактерий.

В процессе роста и развития, при периодическом культивировании, культура люминесцентных бактерий проходит ряд стадий, характерных для развития любых бактериальных культур: лаг-период, период экспоненциального роста, период замедленного роста, стационарный период и период отмирания. Общая продолжительность процесса от инокуляции до максимальной величины свечения (10) составляет 8-20 часов, длительность его зависит от вида бактерий и от условий их выращивания, причем динамика интенсивности люминесценции не совпадает с динамикой роста клеток. Пик люминесценции приходится на середину экспоненциальной фазы роста.

Феномен ускоренного нарастания свечения получил название аутоиндукции, а вещество, благодаря которому она происходит -аутоицдуктора (Nealson et al., 1970, Nealson et al., 1977). Предполагается, что это вещество продуцируется клетками и выделяется в среду При накоплении его до определенной концентрации, начинается процесс интенсивного синтеза лщиферазы, собственно и обеспечивающий свечение бактериальных клеток. Аутоиндуктор был выделен и идентифицирован как N- (З-оксогексаноил) -З-амшогидро-2- (ЗН) - фуранон. Определена пороговая концентрация аутоиндуктора в 10~12М. Будучи синтезированным in vitro, это вещество индуцировало биосинтез лщиферазы V. fiscTwrt, но было неактивным в отношении других видов бактерий (Eberhard et al., 1981). Синтез аутоиндуктора блокируется ингибиторами синтеза белка и мРНК. Показано, что аутоиндуктор действует на уровне транскрипции, т.е. наяву индукция синтеза люциферазы (Hastings, Nealson, 1977). В настоящее время у этого объекта обнаружен и другой аутоиндуктор

— N-3-оксогексаноил-ь-гомосерш лактон, который также активирует транскрипцию генов люминесценции (Ulitzur, Dunlap, 1995).

Синтез люциферазы зависит не только от его иадукции, но и от репрессии. Так синтез люминесцентной системы V.Tuarveyi подвержен катаболической репрессии. Глюкоза репрессирует синтез лвдиферазы, а цАМФ снимает эту рецессию (Nealson et al., 1972). Из V.harveyi выделен цАМФ-связывающий белок и показано, что он тедунологически гомологичен белку из E.goU и из некоторых других энтеробактерий.

В связи с этим интересны факты синтеза другого участника люминесцентной системы бактерий - мш-редуктазы, ответственной за синтез восстановленного флавина in vivo. До сих пор не показана ивдуцибельность синтеза РШ-редуктазы. Считается, что все изученные к настоящему времени FMN-редуктазы из различных видов люминесцентных бактерий являются конститутивными ферментами (Gerlo, Charlier, 1975; Watanabe et al., 1975).

1.3. Потребность в кислороде и энергетика

Хотя все морские люминесцентные бактерии - факультативные анаэробы, для роста им необходим кислород, дефицит которого является лимитирующим рост фактором. По влиянию концентрации кислорода на рост и люминесценцию выделяют две группы бактерий: у первой группы, куда относятся У. fi scher i и Р. ¡Яюзрюгеш^ снижение концентрации ведет к замедлению роста, хотя интенсивность свечения может даже возрастать (Nealson et al., 1977). Предполагается, что это связано с высоким сродством люциферазы у этих штаммов к кислороду (Hastings, 1968)

- 14 -

У другой группы, куда входят 7. barveyi и Р. letognathi, снижение концентрации кислорода приводит не только к замедлению роста, но и к ингибированию синтеза лщиферазы. Предполагается, что это отражает различие в среде обитания данных видов (Hastinga et al., 1966).

Потребление кислорода растущей культурой возрастает в фазе замедленного роста на три порядка, причем практически весь этот прирост расходуется на люминесценцию (Karl, Nealson, 1980, Высоцкий, 1980). Считается, что ?. barveyi расходует на люминесценцию до 20% кислорода, потребляемого клеткой, тогда как количественное содержание лщиферазы составляет около 5% всех белков клетки (Hastings, 1965).

Рассматривались энергетические затраты на люминесценцию: у очень ярких штаммов на свечение расходуется до 10% от всей энергии, выделяемой клеткой, для нормальных штаммов - только 0,1% (Karl, Nealson, 1980).

И, наконец, кратко охарактеризуем те виды люминесцентных бактерий, которые мы использовали при проведении экспериментов. Клетки V.fischeri содержат желтый пигмент и имеют форму палочки П мкм) с пучком жгутиков. Характерной особенностью Р.phosphorеж является спосбность расти при 4°С, а при 25°С рост их уже тормозится. V.barveyi - прямые или изогнутые палочки 0,5-0,8 мкм шириной и 1,4-2,6 мкм длиной, не образуют эндоспор или микроцист, в жидкой среде - монотрихии или политрихии с полярными жгутиками. При посеве на агаризованную питательную среду им свойственны мелкие неокрашенные колонии и специфический запах.

- 15 -

2. ЛШИНЕСЦЕТНАЯ СИСТЕМА СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ 2.1. Субстраты люциферазной реакции, ее квантовый выход

Бее люминесцентные бактерии обладают видимым невооруженым глазом свечением только благодаря наличию в них особого фермента - бактериальной люциферазы. Все бактериальные люциферазы (КФ 1.14.14.3, алканаль, РЮШ2:02-оксидоредуктаза (1-гидроксилиру-щая, люминесцирущая)), несмотря на некоторые межвидовые различия, in vitro катализируют одну и ту же реакцию,, сопровождающуюся испусканием света в сине-зеленой области спектра (Hastings et al., 1985):

pmnhg + rcho + 02 -► pmn + rcooh + hgo + hV

Являясь внешней флавиновой монооксигеназой, она катализирует включение одного атома из молекулы кислорода в состав образующейся из алифатического альдегида карбоновой кислоты и восстановление второго до молекулы вода (Hastings, 1978; Suzuki et al., 1983); внешним же донором восстановительных эквивалентов является восстановленный флавин.

Одним из субстратов бактериальной люциферазы является длинноцепочечный алифатический альдегид, окисляющийся в ходе реакции до соответствующей карбоновой кислоты (Dunn et al., 1973; McCapra, Hysert, 1973; Shimomura et al., 1972; Vigny, Iffichelson, 1974). Фермент проявляет широкую специфичность и может использовать в качестве субстрата как предельные, так и непредельные, а также замещенные алифатические альдегиды (Исмаилов и др., 1986; Сахаров и др., 1986; Hastings et al., 1966; Meighen et al., 1981, 1982; Spudich, Hastings, 1963).

Показано, что минимальная длина углеродной цепи,

обеспечивающая субстратные свойства альдегида, зависит от вида бактерий, из котрой выделен фермент, и составляет С8 для люциферазы V.harveyt и V.fischeri (Hastings et al., 19бЗ? 1969) И Cjq для P. phDSptwrem (Meighen, Bartlet, 1980; Watanabe, Nakamura, 1972). Пригодность ненасыщенных и замещенных альдегидов как субстратов зависит от положения кратной связи или заместителя относительно функциональной группы. Так, 2-деценаль, 2-нонин-1-аль, 2,4-гексадиеналь, 3,7-диметилокт-б-еналь (цитро-неллаль), 3,7,11 -триметилдодека ~ 2,6,10-триеналь (фарнезаль) не только неэффективны в биолюминесцентной реакции, но снижают интенсивность и скорость затухания свечения при стандартном анализе активности (Hastings et al., 1966; Spudioh, Hastings, 1963; ). Соединения же, имеющие заместители или кратные связи, значительно удаленные от функциональной группы (9-ундеценаль, 1,10-декандиаль, П-бромундеканаль, полуальдегид этилазелата (этиловый эфир 9-оксононановой кислоты)), полностью пригодны как субстраты люциферазы (Hastings et al., 1966; Spudioh, Hastings, 1963). В качестве субстратов могут служить даже такие сложные соединения, как производные триазинальдегидов, хотя их эффективность примерно в 10 раз ниже, чем н-деканаля (Jocker et al., 1995)

Литературные данные о влиянии структуры используемого в качестве субстрата альдегида на величину максимального свечения (IQ) реакции, катализируемой ферментом из различных источников, носят противоречивый характер. Так, среди ряда насыщенных альдегидов наиболее эффективным субстратом люциферазы V.fyarveyi (Родионова И др., 1988; Ьее, Murphy, 1973; Meighen et al., 1982), так же, как и P.phosptwreum, (Meighen et al., 1982), является тетрадеканаль. Ранее другими исследователями

обнаружено, что для люциферазы V.fuarveyi наиболее эффективным субстратом является деканаль (Hastings et al., 1969). В реакции, катализируемой ферментом из V.fiacberi, наиболее эффективен тетрадеканаль (Hastings et al., 1963).

С увеличением длины углеводородной цепи монотонно растет и сродство лнщиферазы к алифатическим альдегидам . Для фермента из P.ptiQ8ptwreum значение Кю для CjQ, Cj2 и С13-альдегидов составляет 280, 180 и 120 мкМ (Yoshida et al., 1974). Для люциферазы V./С softeri для ряда нормальных насыщенных альдегидов с длиной цепи С8-С16 имеет следующие значения: 30; 15; 10; 3; 1,5; I; 0,75; 0,3 и 0,05 мкМ, соответственно (Spudioh, 1963).

Проявляя высокую специфичность в отношении флавинмононуклеотида, люцифераза способна, хотя и со значительно меньшей эффективностью, утилизировать в качестве субстрата разнообразные аналоги и изомеры флавина (FAS, рибофлавин, изо-РШ, 2-тио-РШ, N-IQ- и 8-замещенные аналоги FMN и др.) (Meighen, MaoKenzie, 1973; Mitchell, Hastings, 1969; Watanabe et al., 1978). Наиболее важным результатом исследований специфичности лшциферазы в отношении флавинов было открытие зависимости спектральных характеристик биолюмине сценции от структуры использованного в качестве субстрата аналога флавина, что позволило авторам (Mitchell, Hastings, 1969) предполагать участие связанного с ферментом флавина в эмиссии.

Соответствующие подсчеты показали, что стехиометрия реакции по субстратам составляет 1:1:1 (Hastings et al., 1985; Ziegler, Baldwin, 1981b), хотя время от времени Ли и соавторы (Lee, 1972; bee, Murphy, 1975; Matheson, bee, 1983) поднимают В литературе вопрос о возможном участии двух молекул восстановленного флавина в каталитическом акте. Наличие одного центра связывания флавина,

продемонстрированное кинетическим методом (Meighen, Hastings, 1971), методом равновесного связывания (Becvar, Hastings, 1975; Beovar et al., 1976a; bee, Murphy, 1975; Watanabe et al., 1974» 1976), а также результаты калориметрических измерений (Mangold, bangerman, 1975), свидетельствующие об окислении I молекулы фяавина в ходе каталитического акта, являются серьезными возражениями против возможного участия 2 молекул фяавина в реакции. Измерения значений квантового выхода люциферазной реакции по отношению к субстратам и ферменту проводились неоднократно, каждый раз с несколько различающимися результатами. По-видимому, основным источником расхождений являлось использование препаратов люциферазы с различными удельными активностями и применение разных световых стандартов -радиоактивного (Hastings, Weber, 1963) или лшинольного (Lee et al., 1966). Подробная сводка по величинам квантовых выходов приведена в обзоре (Hastings, Nealson, 1977). Авторы полагают, что в оптимальных условиях квантовый выход реакции по всем реактантам можно принять равным 0,1 (с риском ошибиться не более чем в 2 раза в ту или иную сторону).

2.2. Применяемые способы измерения активности люциферазы

Из-за высокой аутооксидабельности в растворе одного из субстратов люциферазы - ?МЖ2 (в присутствии 130 мкМ 0Z константа скорости псевдопервого порядка составляет около 10 сек-1 (Hastings et al., 1966)) измерение скорости люциферазной реакции обладает своими особенностями. Одним из наиболее часто используемых способов измерения является электрохимический способ восстановления флавдаа, подучивший название стандартного

(Hastings et al., 1978). Флавин каталитически восстанавливают молекулярным водородом в присутствии платинизированного асбеста. Реакцию инициируют инжектированием из шприца анаэробного раствора рюш2 в уравновешенную с окружающей атмосферой реакционную смесь, содержащую люциферазу и альдегид.

Альтернативным методом восстановления флавина является фотохимический (Hastings et al., 1978). Анаэробный раствор флавина, содержащий в качестве донора восстановительных эквивалентов ЭДТА, облучают видимым светом до исчезновения зеленой флуоресценции, после чего его впрыскивают в смесь, содержащую люциферазу и альдегид. В остальном способ мало отличается от стандартного.

При работе с низкими концентрациями флавина рекамендуется восстанавливать его химическим способом. В качестве восстановителя обычно используется дитионит натрия Na2s2<>4. Существуют различные модификации метода. В одной из них (Meighen, Hastings, 1971) к раствору флавина, содержащему также и люциферазу, добавляют небольшой избыток дитионита натрия. Реакцию инициируют добавлением уравновешенного с окружающей атмосферой раствора альдегида.

Отличительной особеннностыэ всех описанных выше способов измерения активности люциферазы является то, что после инициирования реакции свечение быстро (за время менее I сек) достигает максимального значения IQ, а затем затухает, как считают» некоторые авторы (Hastings, Gibson, 1963; Hastings et al., 1966), по простому экспоненциальному закону с константой скорости первого порядка к, величина которой не зависит от концентрации реактантов. В связи с тем, что fmnh2 подвергается быстрому неферментативному окислению кислородом, принято

считать, что ладифераза в условиях инициирования реакции восстановленным флавином способна совершать только один оборот, и ее можно рассматривать как стехиометрический реактант реакции. Число оборотов фермента, рассчитанное на основании величины константы скорости затухания свечения, составляет таким образом не более 3-10 мин-1 (Hastings, 1975; Hastings, Wealson, 1978). В соответствии с этим рассмотренные выше способы определения активности люциферазы принято объединять под общим названием "однооборотные" (Hastings et al., 1978).

Известно, что in vivo генерация PlSNHg осуществляется за счет ЫА2)(Р)н в реакции, катализируемой Р1Ш-редуктазами (NAD (Р )Н:РШ- оксидоредуктазами). Эти ферменты были обнаружены у многих видов люминесцентных бактерий (Петушков и др., 1983; Duane, Hastings, 1975; Gerlo, Charlier, 1975; Puget, Miohelson, 1972; Watanabe et al., 1975). PMN-редуктазы, по-видимому, способны образовывть прочный комплекс с лкщиферазой, т.к. даже высокоочищенные препарата люциферазы сохраняют способность к NAD(Р)н-зависимой биолюминесценции (Шумихин и др., 1980; Kuwabara et al., 1965; Lee et al., 1974). ЕСТЬ точка зрения, согласно которой фяавин-редуктаза является структурно-функциональным компонентом люминесцентной электроннотранспортной цепи (Данилов, 1979; Данилов, Егоров, 1981).

Эта сопряженная Р1Ш-редуктазная реакция часто используется для измерения скорости люциферазной реакции in vitro. Таким образом, суммарная реакция, катализируемая сопряженной системой оксидоредуктаза-лнщифераза, в дальнейшем обозначаемой как NADH-зависимая люминесцентная электроннотранспортная цепь, может быть записана следующим образом:

nüd(p)h + h+ + fmn —> pmnbu

rcho + ^

ФР

nad(p)+ + rcooh +PMN + hgo + hV

По сути это бинарная система, поскольку при таком способе измерения принимают участие два фермента. Следует отметить, что многие исследователи добавляют в реакционную среду FMN-редуктазу для получения большей интенсивности nad(р)н-зависимого свечения.

Если при однооборотных способах измерения активности мы наблюдаем вспышку, то в полной люминесцентной системе лвдифераза совершает каталитические обороты постоянно. Кинетика биолюминесценции полной люминесцентной системы отлична от описанной ранее: свечение медленно со скоростью dl/dt выходит на стационарный уровень (iQ) и может, в зависимости от концентрации субстратов, оставаться на нем продолжительное время (несколько минут) с последующим медленным затуханием в течение десятков минут. Этот метод очень удобен для выяснения влияния различных химических и физических факторов на люциферазную реакцию.

2.3. Строение фермента

Считается, что все бактериальные люциферазы являются гетеродимерами, образованными аир субъединицами, имеющими, в зависимости от источника фермента, молекулярные массы 40-44 кДа и 35-40 кДа, соответственно (Gunsalus-Miguel et al., 1972; Hastings et al., 1978; Meighen, Bart let, 1980). На основании анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей установлена высокая степень гомологии субъединиц как между

собой, так и у выделенных из различных видов и родов люминесцентных бактерий (Baldwin et al., 1979* 1995; Cohn et al., 1985; Johnston et al.,1986, 1990).

В саду определенных обстоятельств, таких как примат опубликования, интенсивность публикаций в зарубежных периодических изданиях и известность авторов, наибольшее распространение получила точка зрения, согласно которой люцафераза устроена достаточно просто и не содержит в своем составе металлов, простетических групп, неаминокислотных остатков и дисульфидных связей (Cormier, (Dotter, 1964; Hastings et al., 1965; Yoshida, Nakamura, 1973; Фи et al., 1977). В To Же время, Даниловым и соавторами (Данилов, 1979; Данилов, Егоров, 1981) была предложена мультиферментная модель бактериальной лнящферазы, согласно которой в состав фермента входе флавопротеид, железосерусодержащай белок лширедоксин и цитохром Р-450.

Несмотря на высокую степень гомологии субъединиц, в функциональном отношении а и ß субъединици весьма различны. Как установлено в экспериментах по реконструкции химически модифицированных субъединиц лвдиферазы из V.harveyi (Meighen et al., 1971 а,ь), ишнно а субъединица ответственна за связывание восстановленного флавина и катализ. В пользу этого говорят также результаты модификации расположенного на ней остатка His диэтшширокарбонатом (Cousineau, Meißen, 1976).

Похожие выводы были получены при исследовании мутантных лвдифераз с измененной кинетикой реакции (Cline, Hastings, 1972), у которых, как оказалось, мутации затрагивают только а субъединицу. У некоторых из мутантных ферментов были также обнаружены измененные сродство к ВДШ2 или альдегиду и

- 23 -

устойчивость к термоинактивации.

На возможную роль ß субъединицы в функционировании фермента впервые указал Клайн (Cline, 1973), который обнаружил мутант по ß субъединице с пониженным сродством к РМШ2. Позднее в экспериментах по межродовой гибридизации (tóeighen, Bartlet, 1980) было установлено, что люцифераза, содержащая а субъединицу, принадлежащую V.harveyi, и ß, принадлежащую Р.¡Яюзрюгеш, проявляет ферментативную активность с числом оборотов, характерным для источника а субъединицы, и сродством к PMHHg, характерным для источника ß. По другим данным (Almashanu et al., 1996) ß субъединицы из Y. fí scher i и P.leiognathi формируют активный фермент с а субъединицами из V.fischeri, Р. leíognathi и V.harveyi, тогда как ß субъединица из V.harveyi образует активный комплекс с а субъединицей только из V.hnrveyi.

Методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,5 А° показана возможность у люциферазы V.harveyi образовывать 2 ß гомодимер (в отсутствие а субъединицн), с которым может связываться только одна молекула рмш2 . разз и рибофлавин являются плохими субстратами для 2 ß гомодимера ((Panner et al., 1997). Образование 2 ß гомодимера у того же объекта с еще лучшим разрешением (1,95А°) подтверждают и другие исследователи (Rhoden et al., 1997). Тем же методом (при наличии обеих субъединиц) у V.harveyi показано образование комплексов, состоящих из 8 a ß гетеродимеров (Moore, James, 1994; Fisher et al., 1995)

Также важное место при выявлении роли каждой из субъединиц занимают эксперименты по химической модификации люциферазы 2,4-динитрофторбензолом (Welches, Baldwin, 1981) и 1-диазо-2-оксоундеканом (Tu, Henkln, 1983). Было установлено, что степень инактивации фермента коррелировала с модификацией aß

димера, но не одной из субъединиц. Весьма убедительными представляются «данные (Paquatte et al., 1988), согласно которым отдельные аминокислотные остатки, принадлежащие р субъединвде, расположены на расстоянии не более 0,8 нм от остатка a 106-Cys.

2.4. Стадии лвщиферазной реакции, ее интермедиаты

и пути их превращения

Мы не ставим перед собой целью подробное описания интимных деталей, связанных с реакцией бактериальной люциферазы. Остановимся лишь на наиболее существенных моментах, необходимых для объяснения экспериментальных данных. Накоплена обширная литература по вопросу о структуре и путях превращения отдельных интермедиатов лгациферазной реакции (см. обзоры Данилов, Егоров, 1990; Nealson, Hastings, 1977; Ziegler, Baldwin, 1981b; Hastings et al., 1985). Нам представляется возможным суммировать экспериментальный материал в виде следующей схемы:

E-FMNH

♦ 1/2 FMN + 1/2 PMHHg + Е E-FMNHOOH-IL

RC00H

B-FMNH0H

<-г- [*]

медленная релаксация

hv

Представлена схема отдельных каталитических стадий люциферазной реакции (по AbouKhair et al., 1985; Hastings et al., 1985), по которой первоначально происходит связывание FMNHg. Существует также точка зрения, согласно которой связывание альдегида и РЮШ2 с ферментом является неупорядоченным (Holaman, Baldwin, 1983).

В результате взаимодействия люциферазы с Р1ШН2 поисходит образование фермент-субстратного комплекса, обозначаемого как интермедиат I. Скорость этой реакции очень велика (константа скорости второго порядка составляет по крайней мере 2Ч08 М-1'сек-1) (Hastings, Gibson, 1963). Ключевую роль в дальнейших каталитических превращениях играет интермедиат и, образующийся в присутствии кислорода. Подобно I, интермедиат II образуется также очень быстро (Watanabe, Nakamura, 1972). Этот интермедиат является долгоживущим - при 2°С t1/r2 составляет 35 мин, а при -20° —50°С - часы и даже сутки (Hastings et al., 1973). Постулировано, что он представляет собой связанный с люциферазой 4а-гидроперокси-4а,5-дигидрофяавин (bhoste et al., 1980). Интермедиат и проявляет полную биолюминесцентную активность; при смешивании с альдегидом светосумма реакции пропорциональна количеству интермедиата (Becvar et al., 1976b).

Если альдегид отсутствует, интермедиат II подвергается медленному распаду с освобождением стехиометрических количеств FMN и Н202 (Balny, Hastings, 1975; Hastings, Balny, 1975). Реакция, как следует из результатов независимых исследований (Hastings et al., 1979; Watanabe, Nakamura, 1976), ПО-ВИДИМОМУ, является обратимой.

Взаимодействие интермедиата II с альдегидом (по крайней мере, октаналем, деканалем и тетрадеканалем) на начальных этапах

является обратимым (Родионова и др., 1988; Baumstark et al., 1979; Hastings et al., 1966; Lee, Murphy, 1975; Yoshida, Nákanmra, 1974). Высказано предположение (Eberhard, Hastings, 1972), согласно которому нуклеофильная атака пероксифлавиновым интермедиатом карбонильного углерода альдегида приводит к образованию интермедиата ш, или На, являющегося смешанным флавин-альдегидным пероксидом - 4а-пероксдаюлуацеталем.

Последующие превращения интермедиата ill были исследованы спектральными и радиохимическими методами (Shannon et al.» 1978; Presswood, Hastings, 1979; Presswood et al., 1980). Было установлено, что образование эмиттера в возбужденном состояний является многостадийным процессом:

hv

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Мажуль, Михаил Михайлович

выводы

1. Предложен метод выделения выеокоочищенной рдо-редуктазы из морских люминесцентных бактерий Vibrio fischerí, включающий в себя, помимо колоночных стадий на DEAE-Toyopearl и uitrogel АсА-44» нативный препаративный электрофорез в ПМГ. Полученный препарат электрофоретически гомогенен.

2. Охарактеризованы свойства РМЖ-редуктазы из Vibrio fi scher i: методами гель-фильтрации и электрофореза в ПМГ с DS-Na определена молекулярная масса фермента; определены изоэлектричеекая точка, оптимум pH; найдены величины Kffls для NADH, NA'dph, pmn, pad, рибофлавина; изучено отношение фермента к некоторым искусственным акцепторам и ингибиторам.

3. Определен характер взаимодействия фермента с сбстратами и выяснено, что взаимодействие происходит по упорядоченному механизму присоединения субстрата, а не по механизму пинг-понг, как предполагалось ранее.

4. Исследовано взаимодействие двух ферментов: бактериальной люциферазы и РШ-редуктазы из Vibrio fischerí. Обнаружен эффект стимуляции активности люциферазы РШ-редуктазой. Показано, что эти ферменты образуют активный комплекс, проявляя при этом высокое сродство друг к другу, и вычислена константа его диссоциации.

5. Показно, что взаимодействие двух ферментов бактериальной люциферазы и PMN-редуктазы, выделенных из люминесцентных бактерий Vibrio fischeri, Vibrio harveyi и Photóbacterivm ptiosphoreim, происходит с образованием активного комплекса и это имеет место не только внутри каждого вида, но и при "перекрестном варианте." Делается вывод, что активный комплекс между этими ферментами образуется независимо от вида люминесцентных бактерий.

6. Исследовано взаимодействие между лщиферазой, выделенной из Vibrio fischer г и из рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109 (рРЗ) * с клонированными в нем генами 1ш AB V.fischeri, с рщ-редуктазой, выделенной из штамма Escherichia coli JM109. Показано, что РШ-редуктаза может образовывать активный комплекс с люциферазой, из чего следует, что PMN-редуктазы имеют сходные свойства у различных, хотя и таксономически близких, семейств -Vibrionaceae и Enterobacteriaceae.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мажуль, Михаил Михайлович, 1999 год

- 117 -СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баранова H.A., Александрушкина H.A., Егоров Н.С. Культуральные и физиологические свойства лиминесцентных бактерий Fhotöbacterium fiScherl штамм 6//Виол.науки.-1980.-НЛ2.-С.77-79.

2. Баранова H.A., Данилов B.C., Егоров Н.С. NADH-зависимое свечение и эффективность работы люминесцентных систем различных видов морских бактерий//Микробиологя.-1984.-Т.53,Н.2.-С. 896-901.

3. Высоцкий Е.С., Пожидаев А.И., Родичева Э.К. Энергетические соотношения между интенсивностью люминесценции, тепловыделением и интенсивностью дыхания при периодическом культивировании Fhotobacterivm зр.//Биофизика. -1980. -Т. 25 ,Н. 2. -С.365-366.

4. Данилов B.C. О механизме биолюминесценции бактерий// Докл.АН СССР.-I979.-Т.249,Н.2.-С.477-479.

5. Данилов B.C., Егоров Н.С. Мультиферментная модель бактериальной люциферазы//Биоорган.химия.-1981.-Т.7,Н.II.-С. 1605 -1626.

6. Данилов B.C., Егоров Н.С. Бактериальная биолюминесценция. -М. :Изд-во МГУ,-1990.-152с.

7. Исмаилов А.Д., Баранова H.A., Егоров Н.С., Данилов B.C. Электронтранспортные системы Р./СecfverI//Микробиология. -1980. -Т.49,Н.3.-С.377-382.

8. Исмаилов А.Д., Баранова H.A., Данилов B.C., Егоров Н.С. Ингибирование бактериальной люминесценции субстратами цитохрома Р-450//Биохимия. -1981. -Т. 46, Н.2. -С.234-239.

9. Исмаилов А.Д., Ковалев Б.Г., Сахаров Г.Н. Бактериальная люцифераза в качестве биодетектора феромонов насекомых// Биоорг.химия.-1986.- Т.12,Н.5.-С.633-639.

- 118 -

10. Мажу ль М.М., Данилов B.C. Исследование свойств nad(P)H: PMN-оксидоредуктазы из морских люминесцентных бактерий Vibrio fischeri// Биохимия.-1994.-Т. 59.-C.I608-I6I4.

11. Мажуль М.М., Данилов B.C. Влияние ассоциации компонентов бактериальной люминесцентной системы Vibrio fischeri на реакцию люциферазы//Биохимия. -1995. -Т. 60, Н2. -С. I073-IQ8I.

12. Мажуль М.М., Зарубина А.П., Данилов B.C. Влияние PlíN-редуктаз на активность люцифераз из различных штаммов люминесцентных бактерий//Биохимия. -1997. -Т. 62, Н. 2. -С.235-239.

13. Малков Ю.А., Данилов B.C., Егоров Н.С. Действие ингибиторов оксидаз смешанной функции на бактериальную биолиминесценцию//Прикл. биохим. микробиол.-1982.-Т.18,Н.1.-С.76-80.

14. Маниатис Т., Фриг Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клошфование//Москва: Мир, 1984.-480 с.

15. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот//Москва: Наука, 1985.-386 с.

16. Петушков В.Н., Кратасюк Г.А., Родионова Н.С. Фиш A.M., Белобров П.И. Биферментная система NADHrPMN оксидоредуктаза -люцифераза из светящихся бактерий//Биохимия.-1983.-Т.48,Н.6. -С.983-990.

17. Родионова Н.С., Петушков В.Н., Белобров П.И. Кинетические особенности переключения бактериальной люциферазы с одного альдегидного субстрата на другой//Биофизика.-1988.-Т.33, Н. 3.-С.396-400.

18. Сахаров Г.Н., Исмаилов А.Д., Данилов B.C. Температурные зависимости реакции бактериальной люциферазы из Beneckea barveyi и Fhotóbacterium /Сзс?шгС//Биохимия.-1988.-Т.53,Н.6.-С.891-898.

Светящиеся бактерии.-Новосибирск: Наука, 1984.-279с. под.

ред. Е.H.Кондратьевой.

19. Щумихин В.Н. » Данилов B.C.* Егоров Н.С. Некоторые особенности структурно-функциональной организации лициферазы// Шсюрган.ШЮЯ. -I980.-T .6»Н.5. -С.765-772Ю

20. Щумихин В.Н.» Данилов B.C., Егоров Н.С. Бактериальная лвдифераза в реакциях с каталитически »осс*ановленнш* флавинмононуклеотидом//Биофизика. -I98Î. -Т.26#Й. I.-C. 130-133„

21. Шумихин В.Н., Данилов B.C., Малков D.A., Егоров Е.С. Выделение и очистка люциферазы из Fhotôbacterim fiscberi для аналитических целей//Виохюгая. -1980. -Î.45,Н.9. -С.I576-I58I.

22. AbouKhair N.K., Ziegler 11*11. » Baldwin (P.O. Bacterial luciferase: demonstration of a catalytically competent altered conformât ional state following a single turnover// Biochemistry.-1985.-Y.24,N.15--P.3942-3947.

23. Adey G., Wardley-Smith E.B., White B. Mechanism of inhibition of bacterial luoiferase by anaesthetios//bife Soi. -1976. -V.17 >N. 12. -P. 1849-1854.

24. Almashanu S., Gendler I», Hadar R., Kuhn J* Interspecific luoiferase beta subunit hybrids between Vibrio harveyi, Vibrio fischeri and Photobacterium leiognathi/ZProtein Eng.-1996.-V.9,N.9.-P.803-809.

25. Arima K., Oka Ф. Cyanid resustance in Achromobacter, 1. Induced formation of cytochrome ag and its role in cyanide-resistant respiration//J.Bacteriol.-1965.-V.90,N3--P.734-743-

26. Baldwin Ф.О., Ziegler U.K., Powers D.A. Covalent structure of subunits of bacterial luoiferase? HH2-terminal sequence demonstrates subunit homology//Proc.Nat1.Acad.Sei. ШA.-1979. -V. 7 6, N Л 0.-P.4887-4889.

27. Baldwin Т.О., Ziegler M.M. The biochemistry and

- 120 -

molecular bioogy of bacteril bioluminesoence//Chemistry and bioohemistry, V.3.-CRC Press, London.-1990.-P.467-630

28. Baldwin Ï.O., Christopher J.A. Raushel P.M., Sinclair J.P., Ziegler M.M., Pisher A.J., Rayment I. Structure of bacterial lucif erase//Curr. Opin.Struc t .Biol. -1995. -V. 5 • N. 6. -P.798-809.

29. Balny C., Hastings J.W. Fluorescence and bioluminescence of baoterial lue if erase intermediates//Biochemistry.-1975.-V".14, N.21.-P.4719-4723.

30. Baumann L., Baumann P. The marine Gram-negativ eubao t er ia/ /The Procario tes. -S tutgart, Springer Verlag. -1981. -P. 83-181.

31. Baumann P., Baumann L., Bang S., Woolcalis if., J. Réévaluation of the taxonomy of Vibrio, Beneckea and Photobacteriumi Abolition of genus Beneckea //Curr.Microbiol.-1980.-Y.4,N.3.-P.127-132.

32. Baumann P., Baumann L. Genus II. Photobacterium Beijerinok 1889 , 401A37/Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology: 7.1.-Baltimore, -1984.-P.539-545.

33. Baumann P., Furniss A.L., Lee J.V. Genus I. Vibrio Pacini 1854, 411Ai//Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology: V.1.-Baltimore, -1984a.-P.518-538.

34. Bauumann P., Gauthier M.J., Baumann L. Genus Alteromonas Baumann, Baumann, Mandel and Allen 1972, 418A"t7/Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology: V.1.-Baltimore, -1984b.-P.343-352.

35. Baumstark A.L., Cline Ï.W., Hastings J.W. Reversible steps in the reaction of aldehydes with baoterial luciferase intermediates//Arch.Biochem.Biophys. -1979. -V. 193 ,N. 2. -P. 449-455.

36. Becvar J.B., Baldwin T.O., Nicoli M.Z., Hastings J.W.

- 121 -

The flavin stoichiometry of the bacterial bioluminesoenoe reaction//Plavins and flavoproteins .-Amsterdam, -1976a.-P.94-100.

37. Becvar J.E., Hastings J.W. Bacterial luoiferase requires one reduced flavin for light emission//Proo.Natl.Acad.Soi. USA. -1975.-V.72,K.9.-P.3374-3376.

38. Boemare N.B., AKhrust R.J., Slourant R.G. Deoxyribonucleic acid relatedness between Xettorbabdus spp. (Enterobacteriaceae), symbiotic bacteria of entomopathogenio nematodes, with a proposal to transfer Xmiorhabtfus lualn&scens to a new genus, Photorhabdus gen nov.//Intern.J.Syst.Bacteriol. -1994.-V.43,W.2.-P.249-255•

39. Boylan M., Miyamoto C., Wall L., Graham A., Meigen B. Lux C,D and B genes of the Vibrio fischeri luminescence operon for the reductase, transferase, and synthetfse enzymes involved in aldehyde biosynthesis//Photochem.Photobiol.-1989.-V.49. -P. 681-688.

40. Bradford M.if. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Anal. Biochem.-1976.-V.72, N.1/2.-P.248-254.

41. Brolin S.B., Hjerten S. Microassay with the NADH-unduoed light reaction , technique improved by means of purified

enzymes from A. fiscAeri//Mol.Cell.Biochem.-1977.-V.17,N.2.-P.6l-73.

42. Cline T.W., Hastings J.W. Mutationally altered bacterial luoiferase. Implications for subunit functions/ZBiochemistry.-1972.-Y.11,N.18.-P.3359-3370.

43. Cline T.W., Hastings J.W. Mutanted luoif erase with

altered bioluminesoenoe emission spectra//J.Biol.Chem.-1974.~ V.249,N.14.-P.4668-4669.

44. Cohn D.H. Ogden R., Abelson J., Baldwin T., Nealson K., Simon M., Mileham A.J. Cloning of the Vibrio harveyi luo if erase genes: use of a synthetic oligonucleotide probe//Proc.Nat.Acad. Sci. USA.-1983.-Y.80.-P.120-123.

45. Cohn D.H., Mileham A.J., Simon II.J. et al. Nucleotide sequence of the luxA gene of Vibrio harveyi and the complete amino acid sequence of the a subunit of bacterial luoiferase//J.Biol.Chem.-1985.-V.260,N.10.-6139-6146.

46. Cormier if. J., Totter J.R., Rostorfer 9.R. Comparative studies on different bacterial luciferase preparations//Aroh. Biochem. Biophys.-1956.-V.63.-P.414-426.

47. Cormier M.J., Totter .R. Bioluminescence//Ann.Rev. Biochem.: Y.33.-N.Y.,1964.-P.431-458.

48. Cousineau J., Meighen S. Chemical modification of bacterial luciferase with ethoasyformic anhydride: evidence for an essential histidyl residue//Biochemistry.- 1976.- Y.15,N.23.-P.4992-5000.

49. Cox G.B., Newton N.A., Gibsson P., Snoswell A.M., Hamilton J.A. The function of ubiquinone in Escherichia coli//Biochem. J.-1970. -V. 117,N.3.-P.551 -562.

50. Danilov V., Baranova N., Ismailov A., Egorov N. The effect of camphor on bacterial bioluminescence//Eur.J.Appl.Microbiol .Bio technol .-1982.-Y.14,N.1.-P.125-129.

51. DaubnerS.C., AstorgaA.M., Leisman G.B. «Baldwin T.O. Yellow light emission of Vibrio fischeri strain Y-1: Purification and characterization of the energy-accepting yellow

- 123 -

fluorescent pro te in//Proc.Natl.Acad.Soi. USA.-1987.-V.82,N.24.~ P.8912-8916.

52. Dolan K., Greenberg B. Evidence that Gro EL, not sigma 32, is transcriptional regulation of the Vibrio fischeri luminescence genes in Escherichia co 1 i//J. Bac t eriol .-1992,-V. 174.-P.5132-5135.

53. Duane W., Hastings J.W. Flavin mononucleotide reductase of luminous bacteria//llol.Cell.Biochem.-1975*-t.6»li.1 .-P.53-64.

Dunlap P.V. Iron control of the Vibrio fischeri luminescence system in Escherichia col ¿//Arch .Microbiol. -1992. -Y.157.-P.235-241.

54. Dunn D.K., Michaliszyn G.A., Bogacki I.G., Meighen E. Conversion of aldehyde to acid in the bacterial bioluminescent react ion//Biochemis try. -1973. -V. 12,N.24.-P.4911 -4918.

55. Eberhard A., Burlingame A.I». Eberhard C., Kenyon G.L., Nealson K.B., Oppenheimer N.J. Structural identification of autoinducer of Photoacteriam fischeri luciferase//Bioehemistry. -1981.-V.20.-P.2444-2449.

56. Gerhard A., Hastings J.W. A postulated mechanism for the bioluminescent oxidation of reduced flavin mononucleotide// Biochem.Biophys.Res.Commun.-1972.-V.47»lf.2.- P.348-353.

57. Eckstein J.W., Hastings J.W., Ghisla S. tffechanism of bacterial bioluminescence: 4a, 5-dihydroflavin analogs as a model for luciferase hydroperoxide intermediates and the effect of substituents at the 8-position of flavin on luciferase kinetics //Biochemistry.-1993.-V.32.N.2.-P.404-411.

58. Shlers R.U., Wyss U., Stackebrandt E. 16S RNA cataloguing and the phylogenetic position of the genus Xenorhabdus//Syst.Appl. Uicrobiol.-1988.-V.10.-P. 121 -125.

f. - 124 -

59. Engebrecht J., Wealson K., Silverman M. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri//Cell.-1983.-V.32.-P.773-781.

60. Eyisrs G.G., Sohouwenburg K. On the luminescence of bacteria. I. A quantitativ studyof the spectrum of the light emitted by some chemiluminescent reactions//Bnzimologia.-1936.-V.1,N1. -P. 107-119.

61. Parmer J.J., III. Genus Xenorhabdus Thomas and Poinar 1979, 354AL//Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: V.I.Baltimore, 1984.-P.510-511.

62. Pisher A.J., Raushel P.M., Baldwin T.O., Rayment I. Three-dimensional structure of bacterial luciferase from Vibrio harveyi et 2.4 A° resolution//Biochemistry.-1995.-V.34,N.20. -P.6581-6586.

63. Pontecave M., EliassonR., Reichard P. NAD(P)H:Plavin Gxidoreductase of Escherichia col¿//J.Biol.Chem.-1987.-V.262, N.25.-P.12325-12331.

64. Prancisco W.A., Abu-Soud H.M., DelMonte A.J., Singleton D.A., Baldwin T.O., Raushel P.M. Deuterium kinetic isotope effects and the mechanism of the bacterial luciferase reaction// Biochemistry.-1998. -V. 37 ,N.8. -P.2596-2606.

65. Gast R., lee J. Isolation of the in vivo emitter in bacterial bioluminescence//Proc.Natl.Acad.Soi. USA.-1978.-V.75, N.2.-P.833-837.

66. Gerlo S., Charlier J. Identification of NADH-specific and NADPH-specific PMN reductases in Beneckea. harveyi//Jknr. J. Biochem.-1975.-V. 57 ,N. 2.-P.461-467.

67. Gorus P., Scharam B. Application of bio- and chemi-

luminescence in the clinical laboratory//Clin. Chem.-1979.-V. 15, N.4.-P.512-619.

68. Gray K., Greenberg E. Physical and functional maps of the luminescence gene cluster in an auto inducer deficient Vibrio fischeri strain isolated from a squid light organs//J.Bacteriol -1992.-V.174.-P.4384-4390.

69. Grogan D. Interaction of respiration and luminescence in a common marine bacterium//Arch.Microbiol.-1984.-V.137.N.2. -P. 159-162.

70. Gunsalus-Miguel A., Meighen B.A., Nicoli M.Z. et al. Purification and properties of bacterial luoiferases// J.Biol.Chem.-1972.-V.247,N.2.-P.398-404.

71- Gupta 8. C., Potricus-Reese C., Hastings J,W. Mobilization of cloned luciferase genes in Vibrio harveyi luminescence mutant//Arch.Microbiol.-1986.-V.143.-P.325-329.

Harvey B.N. Bioluminescence.-N.Y.: Acad.Press, -1952.-

649p.

72. Hastings J.W. Bioluminescence//Ann.Rev.Biochem.-1968. -V.37.-P.597-630.

73. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence. Light emission in the mixed function oxidation of rduced flavin and fatty aldehyde//CRC Cri t. Rev. Biochem. -1978. -V. 5 • -P. 163-184.

74. Hastings J.W., Baldwin (P.O., Nicoli M.Z. Bacterial luciferase: assay, purification and properties//Meth.Enzymol.: V.57.-N.Y., -1978.-P. 135.-152.

75. Hastings J.W., Balny C. The oxygenated bacterial luciferase-flavin intermediate: reaction products via the light and dark pathways//J.Biol.Chem.-1975.-V.250,N.18.-P.7288-7293.

76. Hastings J.W., Balny C., LePench C., Douzou P. Spectral

- 126 -

properties of an oxygenated luciferase flavin intermediate isolated by low-temperature ehromatography//Proc.Natl.Acad.Sci.

USA. -1973,-V.70,N.12.-P. 3468-3472.

77. Hastings J.W., Gibson Q.H. Intermediates in the bioluminescent oxidation of reduoed flavin mononucleotide// J.Biol.Chem.-1963.-V.238,N.7.-P.2537-2554.

78. Hastings J.W., Gibson Q.H., Priedland J., Spudioh J. Molecular mechanisms in bacterial bioluminescence: on energy storage intermediates and the role of aldehyde in the reaction// Bioluminescence in Progress.-Princeton, 1966.-P. 151 -186.

79. Hastings J.W., Nealson K.H. Bacterial bioluminescence// Ann.Rev.Microbiol.: V.31.-N.Y., 1977.-P.549-595.

80. Hastings J.W., Potricus C.J., Gupta S.C. Kurfurst M., Makemson J.C. Biochemistry and physiology of bioluminescent bacteria//Adv. Microbiol.Physiol.-1985.-V.26.-P.235-291.

81. Hastings J.W., Riley W.H., Massa J. The purification, properties and chemiluminescent quantum yield of bacterial luc iferase//J.Biol.Chem.-1965.-Y.240,N.3.-P.1473-1481.

82. Hastings J.W., Tu S.-C., Becvar J.E., Presswood R.P. Bioluminescence from the reaction of FMN, H^O^ and long chain aldehyde with bacterial luciferase//Photochem.Photobiol.-1979.-Y. 29,N.2.-P.383-387.

83. Hastings J.W., Weber G. Total quantum flux of isotopic sources//J.0pt.Soc.Am.-1963.-V.53,N.12.-P.1410-1415.

84. Hastings J.W., Weber K., Friedland J. et al. Structurally distinct bacterial luoiferases//Biochemistry.-1969.-V.8, N. 12.-P.4681-4689.

85. Hayaschi 0. General properties and biological function

- 127 -

of oxygenases.//In Molecular mechanisms of oxigen activation. N.Y.:Aoad. Press.-1974. -P. 1-28.

86. Holbrook I.B., leaver A.G. //Anal.Biochem.1976.-V.75. -P.634-636.

87. Holzman (P.P., Baldwin £.0. Binding of 2,2-diphenylpro-pylamine at the aldehyde site of bacterial luoiferase increases the affinity of the reduced riboflavin 5'-phosphate site// Biochemistry-- 1981.-V.20,N.19.-P.5524-5529.

88. Holzman T.F., Baldwin T.O. Isolation of bacterial luo if erases by affinity chromatography on 2,2-diphenylpropyl-amine-sepharose: phosphate-mediated binding to an immobilized substrate analogue//Biochemistry.-1982.-V.21,N.24.-P.6194-6201.

89. Holzman T.F., Baldwin 5.0. Reversible inhibition of the bacterial luoiferase catalyzed bioluminesoence reaction by aldehyde substrate: kinetics mechanism and ligand effeots//Bioohemistry.-1983.-V.22,N.12.-P.2838-2846.

90. Inouye S. NAD(P)H-flavin oxidoreductase from Vibrio fischeri ATCC-7744, is a flavoprotein//FEBS Lett.-1994.-V.347. -P.163-168.

91. Jablonski E., DeLuoa M. Purification and properties of the NADH end NADPH-specific PMN oxidreductases from B.harveyi. //Biochemistry.-1977.-V.16,N.13.-P.2932-2936.

92. Jablonski E., DeLuca M. Studies of the control on the luminescence in B. harveyi: Properties of the NADH end NADPH-specific FMN oxidreductases//Biochemi3try.-1978.-V.17, N. 4.-P.672-678.

93. Jensen M.J., (Debo B.M., Baumann P. et al. Characterization of Alteromonas hanedai (sp.nov.), a nonfermentative

luminous species of marine origin//Ciirr.llicrobiol.-1980.-Y.3, N.5.- P.311-315

94. Jockers R., Ziegler T., Shmid R.D. Intereotins between aldehyde derivatives and the aldehyde binding site of bacterial luc if erase//J. Biolumin. Chemilumin.-1995.-Y. 10, N. 1.-P. 21-27»

95. Johnston 5?.C., Rucker B.B., Cochrum L. et al. The nucleotide sequence of the luxA and luxB genes of Xenorhabdus luminescens HM and a comparison of the amino acid sequences of luciferases from four species of bioluminescent bacteria// Biochem. Biophys.Res.Commun.-1990.-V.170,N.2.-P.407-415.

96. Johnston T.C., Thompson R.B., Baldwin T.O. Nucleotide sequence of the luzB gene of Vibrio harveyi and the complete amino acid sequence of the § subunits of bacterial luo iferase//J.Biol.Chem.-1986.-Y.261.-P.4805-4811.

97. Karl D.H. Nealson K H. Regulation of cellular metabolism during synthesis and expression of the luminous system in Beneckea and Fhoto6acte2*ium//J.Gen.liicrobiol.-1980.-Y.117. -P.357-368.

98. Kassai S. Preparation of P-f lav in-bound and P-flavin-free luciferase and P-flavin-bound beta-subunit of luciferase from Photobacterium phosphoreum//J.Biochem. (Tokyo).-1994.-Y. 115,N.4. -P.670-674.

99. Kogure K. Tokuda H. Membrane bioenergetics of halophilic marine bacteria//ISMB IV Proc.-1986.-P.231-237.

100. Koka P., lee J. Separation and structure of the prosthetic group of the blue fluorescence protein from the bioluminescent bacterium Photobacterium phosphoreum//Pro©.Natl. Acad.Soi. USA.-1979.-V.76,N.7.-P.3068-3072.

101. Konishi K., Ouehi M., Kita K., Horikoshi I.

- 129 -

Purificftion and properties of a cytochrome b\f650\Pd complex, a terminal oxidase of the aerobic respiratory chain of P. phosphareum// J. Bioohem. -1986. -V. 994. -P. 1227-1236.

102. Koo J.-Y., Schuster G.B. Chemically initiated electron exchange luminescence. A new chemiluminescent reaction pathway for organic peroxides//J.Am.Chem.Soc.-1977.-V.99.-P.6107.

Kossler P. Physiologische Untersuchungen zur Atmung von Vibrio luminosus Beijerinck//Arch.fur Microbiol.-1968.-V.64,N.2. -P.146-157.

103. Kurfurst M., GhislaS., Hastings J.W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction//Proc.Natl.Acad.Sci. U5A.-1984.~V.81,N.10.-P.2990-2994.

104. Kurfurst M., Macheroux P., Ghisla S., Hastings J.W. Isolation and characterisation of the transient, luciferase-bound flavin-4a-hydroxide in the bacterial luciferase reaction// Biochim.Biophys.Acta.-1987.-V.924,N.1.-P.104-110.

105. Kuwabara S., Cormier M.J., Dure L.S. et al. Crystalline bacterial luciferase from Photobacterium fischeri//Proc.Natl. Acad.Soi. USA.-1965.-V.53,N.4.-.822-828.

106. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4//Nature.-1970.-V.227, N. 5259.-P.680-685.

107. lampinen J., Koivisto L., Wahlsten M.. Mantsala P., Karp M. Expression of luciferase genes from different origins in Bacillus subtilis//Mol. Gen Genet.-1992.-V.232.-P.498-504.

108. lee J. Bacterial bioluminescence. Quantum yields and stoichiometry of the reactants reduced flavin mononucleotide, dodecanal and oxygen and of a product hydrogen

pero:xide//B ioohemis try. -1972. -V. 11 ,N. 18. -P. 3350-3359.

109. Lee J. Sent itizat ion by lumazine proteins of the bioluminescence emission from the reaction of bacterial luciferases//Photochem.Photobiol.-1982. -Y. 36, N6. P.689-697.

Lee J. The mechanism of bacterial bioluminescence// Chemi- and bioluminescence. Marcel Dekker.New-York.-1985. -P.401-437.

110. Lee J., Matheson I.B.C., Muller P., 0'Kane D.J., Yervoort J., Yisser J.W.G. The mechanism of bacterial bioluminescenoe//Chemistry and biochemistry of flavoenzymes. -1990.-NY.-Y.il.-P.109-151.

111. Lee J., Murphy C.L., Paini G.J., Baucom T.L. Bacterial bioluminescence and its application to analytical procedures// Liquid Scintillation Counting. Recent Developments.-N.Y. ,1974.-p.403-420.

112. Lee J., Murphy C.L. Effects of aldehyde carbon chain length and type of lucif erase on the quantum yields of bacterial bioluminescence//Chemiluminescence and Bioluminescence.- N.Y., 1973.-P.381-386.

113. Lee J., Murphy C.L. Bacterial bioluminescence: equilibrium association measurements, quantum yields, reaction kinetics, and overall reaction scheme//Biochemistry.-1975.-Y.14, N.10.-P.2259-2268.

114. Lee J., Wesley A.S., Perguson J.P.,Ill, Seliger H.H. The use of luminol as a standard of photon emission// Bioluminescence in Progress.-Princeton, 1966.-P.35-43.

115. Lhoste J.-M., Pavaudon V., Ghisla S., Hastings J.W. NMR studies of 1^C-4a enriched flavins with luciferase and other

flavoproteins//Flavins and Flavoproteins.-Balt imore,1980.-P.131 -138.

116. Lei B., Liu M., Huang S., Tu S-C. Vibrio harveyi NAD (P )H-f lavin oxidoreductase: cloning, sequencing and overexpress ion of the gene and purification and characterisation of the cloned enzyme//J.Bacteriol.-1994.-V.176.-P.3552-3558.

117. Macheroux P., Schmidt K.U., Steinerstauch P. et al. Purification of the yellow fluoresvent protein from Vibrio fischeri and identity of flavin chromophore//Biochem.Biophys. Res.Commun.-1987.-V.146,N.1 .-P. 101-106.

118 Makemson J.C., Hastings J.W. Luciferase-dependend growth of cytochrome-ltficient Vibrio harveyi//FEHS£> Microb.Bcol. -1986.-V. 38.-P.79-85.

119. Mager H.I.X., Addink R. On the role of some flavins adducts as one-electron donors//Flavins and Flavoproteins.-Berlin,-1984.-P.37.

120. Mager H.I.X., Tu S-C., Chemical aspects of bioluminescence//Pho tochem. Pho tobiol. -1995. -V. 62 ,N. 4. -P. 670-614 -

Mancini J.A., Boyland M., Soli R.R., Graham A.P., Meighen E.A. Cloning and expression of the Pho tobac teri um phosphoreum luminescence system demonstrates unique lux gen organization//J.Biol.Chem.-1988.-V.263.-P.14308-14314.

121. Mangold A., Langerman N. The enthalpy of oxidation of flavin mononucleotide. Temperature dependence of in vitro bacterial luciferase bioluminescence//Arch.Biochem.Biophys.-1975.-V.169,N.1.-P.126-133.

122. Matheson I.B.C., Lee J. Kinetics of bacterial bioluminesoenoe and the fluorescent transient//Pho tochem.

Pho t ob iol. -1983. -V. 38, N. 2. -P. 231 -240.

- 132 -

123. MoCapra P., Hysert D.W. Bacterial bioluminescence -identification of fatty acid as product, its quantum yield and a suggested mechanism//Bioohem.Biophys.Res.Commun.-1973.-V.52, N.1.-P.298-304.

124. MoCapra P., Leeson P.D. Possible mechanism for bacterial bioluminescence and luminol ohemiluminescence//J.Chem. Soo.Chem. Commun.-1979.-7.3,N.1.-P.114-117.

125. McElroy W.D., Seliger H. Origin and evolution of bioluminescenoe//Kasha M., Pullman B. (ed.). Horizons in biochemistry. Academic Press.-New York.-1962.-P.91-101.

126. Meighen E.A. Enzymes and genes from the lux-operons. //Ann.Rev. Microbiol. -1988. -7.42. -P. 151 -176.

Meighen E.A. Molecular biology of bacterial bioluminescence//Microbiol.Rev.-1991.-V.55,N.1.-P.123-142.

127. Meighen E.A., Bartlet I. Complementation of subunits from different bacterial luciferases. Evidence for the role of the p subunit in the bioluminescent mechanism//J.Biol.Chem.-1980.- 7.255» N.23.-P.11181-11187-

128. Meighen E.A., Dunlap P.7. Physiological, biochemical and genetc control of. bacterial bioluminescenoe//Adv.Microb. Physiol.-1992.

129. Meighen E.A., Hastings J.W. Binding site determination from kinetic data: reduced flavin mononucleotide binding to bacterial luc iferase//J.Biol.Chem.-1971.-7.246,N.24.-P.7666-7674.

130. Meighen E.A., MaoKenzie R.E. Flavine specificity of enzyme-substrate intermediates in the bacterial bioluminescent reaction. Structural requirements of the flavine side chain// Biochemistry.-1973.-7.12,N.8.-P.1482-1491.

131. Meighen E.A., Nicoli M.Z., Hastings J.W. Hybridization

- 133 -

of bacterial luciferase with a variant produced by chemical modification//Biochemistry.-1971a.-V.10,N.22.-P.4062-4068.

132. Meighen E.A., Nicoli M.Z., Hastings J.W. Punctional differences of the nonidentical subunits of bacterial luciferase. Properties of native and chemically modified bacterial luciferase//Biochemistry.-1971b.-7.10,N.22.-P.4069- 4073.

133. Meighen B.A., Slessor K.N., Grant G.G. A bioluminescent assay for aldehyde sex pheromones of insects//Experientia.-1981.-V.37,N.6.-P.555-557.

134. Meighen E.A., Slessor K.N., Grant G.G. Development of a bioluminesoence assay for aldehyde pheromones of insects. I. Sensitivity and specificity//J.Chem.Eool.-1982.-Y.8,N.6.-P.911-921.

135. Misushima Sh., Arima K. Mechanism of cyanide resistance in Achromobacter. III. Natur of terminal electron transport system and its sensitivity to oyanid//J .Biochem. Tokyo. -1960. -7. 47 ,N. 6. -P .837-845.

136. Mitchell G., Hastings J.W. The effect of flavin isomers and analogues upon the color of bacterial bioluminesoence//J. Biol.Chem.-1969.-7.244,N.10.-P.2572-2576.

137. Miwa G.T., West S.B., Huang M.-T., iu A.Y.H. Studies on the association of cytochrome P-450 and NADPH-cytochrome c reductase during catalysis in a reconstituted hydroxylating system//J.Biol.Chem.-1979.-V.254.-P.5695-5700.

138. Miyamoto C., Boylan M., Graham A., Meighen B.A. Organization of the lux structural genes of Vibrio harveyi//J. Biol.Chem.-1988.-7.263.-P.13393-13399.

139. Moore S.A., James M.N. Common structural features of the luxP protein and the subunits of bacterial luciferase:

- 134 -

evidence for a (beta alpha)S fold in luciferase//Protein Soi. -1994.-T.3,N.11.-P.1914-1926.

140. Nealson K.H. Isolation, identification and manipulation of luminous bacteria//Meth.Enzymol.-1978-V.57.-P. 153-166.

141. Nealson K.H. Bacterial bioluminescence: Three decades of enlightenment//Naval Research Reviews.-1993.-V.45,N.2.-P. 13-20.

142. Nealson K.H., Eberohard A. Hastings J.W. Catabolite repression of bacterial bioluminescence: functional implications //Proc.Nat.Acad. Sci.USA.-1972.-V.69.P.1073-1076.

143. Nealson K.H., Hastings J.W. Low oxigen is optimal for luciferase synthesisin some bacteria. Ecologioai applications. //Arch. Microbiol.-1977.-V.112.-P.9-16.

144. Nealson K.H., Hastings J.W. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance//Microb.Rev.-1979.-V.43, N.4.-P.496-518.

145. Nealson K.H., Hastings J.W. The luminous bacteria//The Procaryotes. Springer Yerlag.-1992.-V.1.-P.625-639.

146. Nealson K.H., Piatt T., Hastings J.W. The cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system.//J.Bacteriol.-1970.-V.104.-P.313-322.

147. Nearhos S.P., Puerst J. A. Reanalysis of 5S rRNA sequence data for the vibrionaceae with the clustan program suite//Curr.Microbiol. -1987. -V. 15 • -P.329-325.

Oka T., Arima K. Cyanide resistance in Achromohacter. III. Mechanism of cyanide resistance//J.Bacteriol.-1965.-V.52. -P.744-747.

148. O'Kane D.J., Karle 7.A., Lee J. Purification of lumazine proteins from Photobacterium leiognathi and

- 135 -

Photobacterium phosphoreum: bioluminesoenoe propert ies//Bioche-mistry.-1985.-V.24,N.6.-P.1461-1467.

149. O'Kane D.J., Lee J. Purification and properties of lumazine proteins from Photobacterium strains//lleth.Bnzymol.: V. 133.-N.Y.,1986.-P.149-172.

150. Ornstein L., Davis B.J. // Ann. Rev . N. Y. Acad . Sci.-1969.-Y.121.-P.321-403.

151. Paquatte 0., Pried A., Tu S.-C. Delineation of bacterial luoiferase aldehyde site by bifunotional labeling reagents//Arch.Bioohem.Biophys.-1988.-Y.264,N.2.-P.392-399.

152. Presswood R.P., Hastings J.W. Steps in the population of the emitter in the bacterial luoiferase reaction//Photochem. Photobiol.-1979.-V.30,N.1.-P.93-99.

153. Presswood R.P., Shannon P, Spencer R. et al. Effects of deuterium substitution at the C^ carbon of decanal in the bacterial luoiferase reaction//Plavins said flavoproteins.-Tokyo, 1980.-P.155-160.

154- Puget K., Michelson A.M. Studies on bioluminescence. VII. Bacterial NADH:flavin mononucleotide oxidoreductase// Biochimie.-1972.-V.54,N.9.-P.1197-1204.

155. Rauschel P.M., Baldwin T.0. Proposed mechanism for the bacterial bioluminesoenoe reaction involving a dioxirane inter-mediate//Biochem. Biophys .Res. Commun. -1989.-V.164,N.3.-P.1137-1142.

156. Reichelt J.L., Baumann P. Toxonomy of the marine luminous bacteria//Arch. Microbiol.-1973.-V.94,N.4.-P.283-330.

157. Ruby E.G., Nealson K.H. A luminous bacterium that emits yellow light//Science.-1977.-Y.196,N.4298.-P.432-434.

158. Seliger 9.H., McElroy W.D. Light: Physical and

Biological Action.-N.Y.: Academic Press»1965.

159. Seliger H.H. iPhe evolution of bioluminescence in bac teria//Pho t ochem.Photobiol.-1987.-Y.45.-P.291-297.

160. Shannon P., Presswood P., Spencer R. et al. A study of deuterium isotope effects on the bacterial bioluminescence reaction//Mechanisms of Oxidizing Enzymes.-N.Y. ,1978.-P.69-78.

161. Shimomura 0., Johnson P.H., Kohama Y. Reactions involved in bioluminescence systems of Limpet (Latia neritoides) and luminous bac teria//Proc.Nat1.Acad.Sci. USA.-1972.-Y.69»N.8.-P.2086-2089.

162. Sirokman J., Wilson (P., Hastings J.W. A bacterial luoiferase reaction with a negative temperature coefficient attributable to protein-protein interaction//Biochemistry.-1995 -V.34,N.40.-P.13074-13081.

163. Small B.D., Koka P., Lee.J. Lumazine protein from the bioluminescent bacterium Photobacterium phosphoreum//J.Biol. Chem.-1980.-Y.255,N.18.-P.8804-8810.

164. Spudich J.A. The effects and function of aldehyde in the in vitro bioluminescent reaction of Achromobacter fischerii BS thesis//University of Illinois.-Urbana»1963.-63p.

165. Spudich J. A., Hastings J.W. Inhibition of the bioluminescent oxidation of reduced flavin mononucleotide by 2-deoenal//J. Biol. Chem. -1963. -V.238, N. 9. -P.3106-3108.

166. Stewart G., Williams P. Lux genes and applications of bacterial luminescence//J.Gen.Microbiol.-1992.-Y.138. -P.1289-1300

Strehler D.L. Bioluminescence assay: principles and practice//Methods Biochem.Anal.-1968.-Y.16.-P.99-111•

167. Swartzman E., Cao J.G., Miyamoto C., Graham A., Meigen E. Differences in the regulatory signals controlling expression

- 137 -

of the Vibrio lux systems/ZBioluminescence end Chemiluminescence: current status.-1991.-P.27-30.

168. Tanner J.J., Miller M.D., Wilson K.S., Tu S.-C., Krause K.L. Structure of bacterial luciferase beta 2 homodimer: implication for flavin binding//Biochemistry.-1997. -V.36,N.4. -P.665-672.

169. Terpstra W. Evidence for the presence of an unknown factor, active in the light reaction, in preparations of Photobacterium phosphoreum//Biochim.Biophys.Acta.-1962.-Y.60,N3. -P.580-590.

170. Terpstra W. Investigations on the identity of the light-emitting molecule in Photobaeterium phosphoreum//Biochim. Biophys. Ac t a. 1963. -7.75, N3. -P. 355-364.

171. Thoden J.B., Holden H.M., Pisher A.J., Sinclair J.P. Wesenberg G., Baldwin T.O., Rayment I. Structure of the beta 2 homodimer of bacterial luciferase from Vibrio harvey: X-ray analisis of a kinetyic pronein folding trap//Protein Sci.-1997. -V.6,N.1.-P.13-23.

172. Thomas G.M., Poinar G.0.,Jr. A new enthomopathogenic, nematophilic, bioluminescent bacterium, X&norhahdus luminescens sp.nov. (Enterobacteriaceae:Bubacteriales) associated with the terrestrial nematode Heterorhabditis bacteriophora//Int.J.Syst. Bacteriol.-1979.-V.29,N.1.-P.352-360.

173. Thore A. Luminescence in clinical ahalisis//Ann.Clin. Biochem.-1979.-V.16.-P.359-369.

174. Tu S.-C. Isolation and properties of bacterial luciferase-oxygenated flavin intermediate complex with long-chain alcohols//Biochemistry.-1979.-V.18,K.26.-P.5940-5945.

175. Tu S.-C., Baldwin T.O., Becvar J.E., Hastings J.W.

- 138 -

Bacterial luciferase activity does not require a disulfide-di thiol conversion//Arch. Biochem.Biophys. -1977. -7.179, N. 2. -P. 342-348.

176. Tu S.-C., Becvar J. В., Hastings J.W. Kinetic studies on the mechanism of bacterial NAD (P)H:Flavin oxidoreductase// Arch. Biochem.Biophys.-1979.-V.193,N.1.-P.110-116.

177- Tu S.-C., Hastings J.W. Physical interacnion and activity coupling between two enzymes induced by immobilisanion of one//Proc.Nat.Acad.Soi.-1980.-7.77,N.1 .-P.249-252.

178. Tu S.-C., Herikin J. Characterization of the aldehyde binding site of bacterial luciferase by photoaffinity labeling// Biochemistry.-1983.-V.22,N.2.-P.519-523.

179. Tu S.-C., Mager H.I.X. Recent advances in chemical modeling of bacterial bioluminesoence.//Photobiologi. Plenum Press.New-York.-1991.P.319-328.

180. Tu S.-C., Eager H.I.X. Biochemistry of bacterial bioluminesoence//Pho t ochem. Pho t obiol. -1995. -V. 62 ,N. 4. -P.615-624.

181. Ulitzur S. The regulatory control of the bacterial luminescence system - a new view//J.Biolumin.Chemilumin.-1989.~ 7.4.-P.317-325.

182. Ulitzur S., Dunlap P.7. Regulatory circuitry controlling luminescence autoinduction in Vibrio fischeri// Photochem.Photobiol.-1995.-7.62,N.4.-P.625-632.

183. Ulitzur S., Reinhertz A., Hastings J.W. Factors affecting the cellular expression of bacterial luciferase//Arch. Microbiol.-1981.-7.129,N.1.-P.67-71.

184. 7igny A., Michelson A.M. Studies in bioluminesoence. XIII.Bioluminesoence bacterienne: mise en evedence et

- 139 -

identification de product de transformation on de l1aldehyde// Biochimie.-1974.-V.56,N. 1.-P.171-176.

185. Wada M., Kogure K., Ohwada K., Simidu U. Coupling between the respiratory chain and the luminescent system of V. harveyi//J.Gen.Microbiol.-1992.-V.138.-P.1607-1611.

186. Watanabe H., Hastings J.W. Specifities and properties of three reduced pyridine nucleotide flavin mononucleotide reductase coupling to bacterial luciferase B. Harveyi//Mol.Cell. Biochem.-1982.-V.44,N.3.-P.181-187.

187. Watanabe H., Mimura N., Takimoto A., Nakamura T. Luminescence and respiratory activities of Photobacterium phosphoreum//J.Biochem.-1975.-V.77 *N.6.-P.1147-1155.

188. Watanabe T., Nakamura T. Studies on luciferase from Photobacterium phosphoreum. II.Substrate specificity and stoichiometry of the reaction in vitro//J.Biochem.-1972.-V.72,N.3.-P.647-653.

189. Watanabe H., Nakamura T. Studies on luciferase from Photobaeterium phosphoreum. VII. PMN-H^Og initiated bioluminescence and the thermodinamics of the elementary steps of the luciferase reac t ion//J.Biochem.-1976.-V.79,N.3.-P-489-495.

190. Watanabe T., Nakamura T., Matsui K., Kasai K. Interaction of 8-substituted FMN with bacterial luciferase// Flavins and Plavoproteins.-Tokyo,1978.-P.125-130.

191. Watanabe T., Kamita Y., Nakamura T. The terminal oxidase of P. phosphoreum, a novel cytochrome//Biochem.Biophys. Ac ta.-1979 --V.547.-P.70-78.

192. Watanabe T., Tomita G., Nakamura T. Studies on luciferase from Photobaeterium phosphoreum. VI.Stoichiometry and

- 140 -

mode of binding of FlfflHg and 02 to stripped luciferase//J. Biochem.-1974. -Y. 75 ,N. 6. -P. 1249-1255-

193. Watanabe Т., Yoshida K., Takahashi M. et al. Reaction mechanism of bacterial luciferase from Photobacterium phosphoreum/ZPlavins and flavoproteins.-Amsterdam, 1976.-P.62-76.

194. Welches W.R., Baldwin Т.О. Active center studies on bacterial luicferase: modification on the enzyme with 2,4-dini trofluorobenaene//Biochemistry.-1981.-Y.20,N.3.-P.512-517.

195. White B.C. Anaesthetic and enzyme interaction// Molecular Mechanisms in General Anaesthesia.-N.Y.,1974.-P.209-223

196. Wilson 3?., Comments on the mechanisms of chemi- and bioluminescenoe//Photochem.Photobiol.-1995. -V. 62 ,N. 4.-P.601-606.

197. Yamaguchi M., Pujisawa H.J. NADH:cytochrome с reductase from Pseudomonas arvil la//J.Biol. Chem. -1978. -Y.253. N. 24. -P.8848-8853.

198. Yoshida K., Nakamura T. Studies on luicferase from Photobacterium phosphoreum. YII.Interaction with carboxylic acid//J.Bioohem.-1974.-Y.76,Ы.5.-P.985-990.

199. Yoshida K., Takahashi M., Nakamura T. Studies on luciferase from Photobacterium phosphoreum. Y.An enayme-PMN intermediate complex in the bioluminescent reaction//J.Biochem.-1974.-Y .75 ,N. 3.-P.583-589.

200. Zenno S., Saigo K., Kanoh H., Inouye S. Identification of the gene encoding the major NAD(P)H-flavin oxidoreductase of the bioluminescent bacterium Vibrio fischeri ATCC 7744//Journ. Васteriol.-1994.-Y.176,N.12.-P.3536-3543.

201. Ziegler M.M., Baldwin Т.О. Active center studies on bacterial luciferase: modification with methyl

- 141 -

me thane thiosulfonate/ZBioluminescence and Chemilumineseence.-N.Y. ,1981a.-P.155-160.

202. Ziegler M.M. f Baldwin T.O. Biochemistry of bacterial bioluminesoence//Curr.Top.Bioenerg.: Y.12.-N.Y. ,1981b.-P.65-113.