Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Хабибуллина, Нелли Фамзуловна

• Хабибуллина, Нелли Фамзуловна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хабибуллина, Нелли Фамзуловна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Мембранные белки и формирование их пространственной структуры in vitro.

1.2. Бесклеточные белоксинтезирующие системы.

1.3. Продукция мембранных белков в бесклеточных системах синтеза.

1.4. Модификация N- и С-концевых последовательностей мембранных белков для повышения уровня бесклеточного синтеза и эффективности очистки.

1.5. Тирозинкиназы семейства рецепторов эпидермапьного фактора роста человека.

1.6. Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы человека.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1. Реактивы и ферменты.

2.1.2. Штаммы.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур.

2.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

2.2. Методы.

2.2.1. Общие молекулярно-генетические методы.

2.2.1.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

2.2.1.2. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.1.3.Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, выделение ДНК из агарозного геля и лигирование.

2.2.2. Получение генетических конструкций.

2.2.2.1. Получение генетических конструкций, содержащих ген ТМ-ЕгЬВЗ.

2.2.2.2. Получение генетических конструкций, содержащих ген укороченного мускаринового ацетилхолинового рецептора Ml типа.

2.2.2.2.1. Конструирование гена укороченного варианта М1-мАХР.

2.2.2.2.2. Конструирование генетических последовательностей, кодирующих варианты М1-мАХР с различными iV-концевыми последовательностями.

2.2.2.2.3. Получение генетической конструкциирЕТ22Ъ(+)/Т7-таг- М1-мАХР.

2.2.2.2.4. Получение генетической конструкциирЕТ22Ъ(+)/Б-таг-М1-мАХР.

2.2.2.2.5. Получение экспрессирующих вектороврЕТ22Ъ(+)/ЕБК-таг-М1-мАХР.

2.2.3. Продукция мембранных белков в бесклеточной системе на основе экстракта S30 Escherichia coli.

2.2.3.1. Выделение экстракта S30 из Е. coli.

2.2.3.2. Синтез белка в бесклеточной системе на основе экстракта S30 из Е. coli.

2.2.4. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН.

2.2.5. Вестерн-блоттинг.

2.2.6. Гель-фильтрация.

2.2.7. Анализ белковых препаратов методом КД-спектроскопии.

2.2.8. Ренатурация ТМ-ЕгЬВЗ из осадка PC.

2.2.9. Солюбилизация М1-мАХР с различными ^-концевыми последовательностями из осадка РС

2.2.10. Солюбилизация мутантного укороченного варианта М1-мАХР из осадка РС.

2.2.11. Встраивание М1-мАХР в липосомы.

2.2.12. Анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР.

2.2.13. Выделение ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР, синтезированных в присутствии детергентов, из реакционной смеси.

2.2.14. Выделение белка, ассоциированного с липид-белковыми нанодисками.

2.2.15. Химическое кросс-сшивание ТМ-ЕгЬВЗ по свободным аминогруппам.

2.2.16. Исследование лиганд-связывающей активности М1-мАХР, встроенного в липид-белковые нанодиски, с помощью спектроскопии ЯМР.

2.2.17. Получение ЯМР-спектров ТМ-ЕгЬВЗ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Бесклеточная продукция трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека

3.1.1. Мутагенез ТМ-ЕгЬВЗ человека.

3.1.2. Оптимизация бесклеточной белоксинтезирующей системы для продукции ТМ-ЕгЬВЗ.

3.1.3. Выделение и очистка ТМ-ЕгЬВЗ из осадка реакционной смеси.

3.1.4. Пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл ДФХ, переход "мономер-димер".

3.1.5. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл детергентов.

3.1.6. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии бицелл и липосом.

3.1.7. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии лпид-белковых нанодисков.

3.2. Бесклеточная продукция мускаринового ацетилхолинового рецептора М1 типа.

3.2.1. Дизайн гена М1 -мАХР.

3.2.2. Бесклеточный синтез М1-мАХР с различными iV-концевыми партнерами.

3.2.3. Синтез ESR-таг-Ш-мАХР в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов.

3.2.4. Синтез ESR-Tar-Ml-мАХР в присутствии липид-белковых нанодисков.

3.2.5. Ренатурация ESR-Tar-Ml-мАХР из осадка реакционной смеси.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков»

Мембранные белки (МБ) человека являются перспективными мишенями для разработки новых фармакологических препаратов. Для создания лекарственных средств, обладающих высокой селективностью по отношению к мембранным рецепторам определенного типа, необходимо знание пространственной структуры рецептора-мишени. Несмотря на огромную важность для фундаментальных и прикладных исследований, в настоящее время МБ остаются малоизученными. Трудности, возникающие при структурно-функциональных исследованиях МБ, обусловлены рядом факторов. Во-первых, системы клеточной экспрессии в большинстве случаев не могут обеспечить продукцию МБ в нативной конформации в количествах, необходимых для структурных исследований. Применение гетерологичных систем, основанных на использовании бактериальных клеток, позволяет решить проблему количественного выхода МБ, однако часто приводит к агрегации молекул целевого белка и накоплению его в виде нерастворимых "телец включения". В этом случае для "восстановления" нативной конформации белковой молекулы требуется разработка процедуры ренатурации, эффективность которой часто невелика. Во-вторых, для стабилизации функционально активной конформации МБ требуется использование специальных мембраномоделирующих сред (мембранных миметиков), при этом выбор оптимального окружения для исследования конкретной белковой молекулы может представлять собой сложную и чрезвычайно трудоемкую задачу.

В последнее время для продукции МБ все чаще применяются бесклеточные белоксинтезирующие системы (ББС). Эти системы содержат все необходимые компоненты для протекания процессов транскрипции и трансляции iti vitro: ДНК, содержащую ген целевого белка, ДНК-зависимую РНК-полимеразу, факторы транскрипции и трансляции, молекулы тРНК, рибосомы, аминокислоты, нуклеотиды и энергетические субстраты. 8

Возможность синтеза белков как про-, так и эукариотического происхождения делает ББС универсальным инструментом для решения многих задач современной молекулярной биологии и биотехнологии. Выходы целевых белков в таких системах достигают нескольких миллиграммов с 1 миллилитра реакционной смеси (PC), что позволяет получать МБ в препаративных количествах. Помимо этого, в ББС можно осуществлять синтез белков, токсичных для живых клеток. Открытый характер ББС делает возможным добавление в PC различных компонентов и кофакторов, что в некоторых случаях позволяет получать белки в нативной конформации. Так, например, для продукции МБ в растворимой форме в PC добавляют мембранные миметики, такие как мицеллы детергентов, липид-детергентные бицеллы, липосомы, липид-белковые нанодиски (ЛБН) и др. Кроме того, ББС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований, например, методами ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, разработка новых подходов для эффективной продукции МБ с использованием ББС является актуальной задачей молекулярной биологии и открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований и практического применения этих фармакологически важных молекул.

Цель работы

Целью работы являлись разработка эффективных бесклеточных белоксинтезирующих систем на основе экстракта S30 Escherichia coli, а также изучение возможности применения различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков) для продукции МБ в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной, для их последующих структурно-функциональных исследований.

Объектами исследования являлись трансмембранный (ТМ) домен рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека (ТМ-ЕгЬВЗ), включающий одну

ТМ-спираль, и мускариновый ацетилхолиновый рецептор М1 типа человека, содержащий семь ТМ-спиралей (М1-мАХР), относящийся к семейству рецепторов, сопряженных с в-белком (вРСЯ).

Основные задачи исследования

1) Разработать бесклеточные белоксинтезирующие системы для эффективной продукции ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в количествах, достаточных для структурных и функциональных исследований.

2) Подобрать мембраномоделирующие среды, обеспечивающие синтез ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной.

3) Методами ЯМР-спектроскопии провести сравнительный анализ пространственной структуры ТМ-ЕгЬВЗ в различных мембраномоделирующих средах (мицеллы, бицеллы, липид-белковые нанодиски).

4) Подобрать условия очистки и ренатурации М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.

5) Провести анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.

Научная новизна и практическая значимость работы

Все результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1) Разработаны ББС для эффективной продукции ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР как в виде осадка РС, так и в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков (ЛБН).

2) Впервые методами ЯМР-спектроскопии определена пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл додецилфосфохолина (ДФХ), и установлено, что димеризация домена происходит по мотиву, не типичному для рецепторных тирозинкиназ семейства ЕгЬВ.

3) На примере TM-ErbB3 проведен сравнительный анализ эффективности бесклеточного синтеза МБ в растворимом и структурированном виде в присутствии различных мембранных миметиков. С использованием КД- и ЯМР-спектроскопии, а также кросс-сшивающих реагентов показано, что в окружении мицелл, бицелл и ЛБН ТМ-ЕгЬВЗ формирует спиральные структуры, способные к димеризации.

4) На примере ТМ-ЕгЫЗЗ показана возможность проведения прямых структурных исследований МБ, котрансляционно встроенных в бицеллы и ЛБН, методами ЯМР-спектроскопии.

5) Показано, что использование в качестве iV-концевых партнеров TV-концевого фрагмента бактериородопсина грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR-таг), TV-концевого фрагмента рибонуклеазы А (S-таг) и белка Mistic из Bacillus subtilis позволяет увеличить выход М1-мАХР в 10 - 72 раза до уровня 0.5 - 3.6 мг с 1 мл PC.

6) Осуществлен бесклеточный синтез М1-мАХР в присутствии ЛБН. Наличие правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка М1-мАХР, котрансляционно встроенного в ЛБН, подтверждено методом ЯМР-спектроскопии путем наблюдения специфического взаимодействия с антагонистом рецептора телензепином.

7) Разработаны протоколы солюбилизации и очистки М1-мАХР из осадка PC, а также ренатурации рецептора в смешанных мицеллах додецилмальтозид/холестерил гемисукцинат (ДДМ/ХГС). Показано наличие специфического взаимодействия М1-мАХР в составе мицелл ДДМ/ХГС с телензепином.

Результаты диссертационной работы могут быть интересны как с точки зрения фундаментальной науки, так и для прикладных разработок в области биотехнологии, фармакологии и медицины, например, при создании оптимальных протоколов продукции интегральных МБ. Кроме того, в перспективе, использование результатов работы может быть полезным для

11 создания лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний и расстройств нервной системы, связанных с дисфункциями рецепторных тирозинкиназ и мАХР.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Хабибуллина, Нелли Фамзуловна

выводы

1. Разработаны эффективные бесклеточные белоксинтезирующие системы на основе экстракта S30 Е. coli для продукции спиральных мембранных белков: трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека (ТМ-ЕгЬВЗ) и мускаринового ацетилхолинового рецептора человека (М1-мАХР). Показано, что добавление мембраномоделирующих сред в реакционную смесь позволяет синтезировать ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в растворимой форме.

2. Определена пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в мембраномоделирующем окружении мицелл додецилфосфохолина. Показано, что гомодимеризация ТМ-ЕгЬВЗ происходит по отличному от других рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB структурному мотиву.

3. Проведено сравнение влияния различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом, липид-белковых нанодисков) на синтез ТМ-ЕгЬВЗ в растворимой и структурированной форме. Показано, что котрансляционное встраивание домена ТМ-ЕгЬВЗ в бицеллы и нанодиски, содержащие насыщенные липиды, приводит к формированию структуры ТМ-ЕгЬВЗ, близкой к структуре домена в мицеллах додецилфосфохолина. Показано, что при котрансляционном встраивании ТМ-ЕгЬВЗ в нанодиски, содержащие ненасыщенные липиды, происходит разрушение (слияние) нанодисков.

5. Проведено сравнение влияния различных TV-концевых партнеров на эффективность бесклеточного синтеза М1-мАХР. Показано, что оптимальным партнером для продукции рецептора является TV-концевой фрагмент (6 а.о.) бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum.

6. Показано, что при котрансляционном встраивании М1-мАХР в нанодиски, содержащие насыщенные липиды, происходит образование комплексов, способных специфически взаимодействовать с селективным агонистом телензепином, что указывает на формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка рецептора.

7. Разработаны протоколы солюбилизации и очистки М1-мАХР из осадка реакционной смеси, а также ренатурации рецептора в смешанных мицеллах додецилмальтозид/холестерил гемисукцинат. Показано наличие специфического взаимодействия ренатурированного рецептора с телензепином, что указывает на формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка.

БЛАГОДАРНОСТИ

Глубоко и искренне благодарю своих научных руководителей к.б.н., с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Екатерину Назымовну Люкманову и д.б.н., профессора кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Дмитрия Александровича Долгих. Хочу поблагодарить заведующего Отделом биоинженерии и декана Биологического факультета МГУ академика Михаила Петровича Кирпичникова за предоставленную возможность выполнения диссертационной работы в Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН. Выражаю свою глубокую признательность сотрудникам Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН к.ф.-м.н. Константину Сергеевичу Минееву и к.ф-м.н. Захару Олеговичу Шенкареву, а также руководителю Лаборатории профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву за неоценимую помощь в исследовании полученных белков методами ЯМР-спектроскопии.

Выражаю свою искреннюю благодарность за помощь, ценные советы к.х.н., с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Людмиле Николаевне Шингаровой и к.х.н. Вульфсону Андрею Николаевичу. Кроме того, за ценные советы, помошь, теплоту и предоставление плазмидных векторов говорю большое спасибо к.б.н., с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Ладе Евгеньевне Петровской. Благодарю студентов МФТИ Дмитрия Кульбацкого, Кристину Капицкую и Ивана Бутенко за оказание посильной помощи в работе и создание теплой рабочей обстановки. Также хочу поблагодарить всех сотрудников Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН за внимание и поддержку.

Выражаю свои благодарность и признательность к.б.н., с.н.с. Лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН Владимиру Анатольевичу Широкову за неоценимую помощь и советы при выполнении работы, а также хочу поблагодарить заведующего Лабораторией механизмов биосинтеза белка академика Александра

110

Сергеевича Спирина за предоставленную возможность выделять экстракт S30 из Е. coli на базе его Лаборатории.

Выражаю благодарность сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ее руководителю д.ф-м.н. Константину Вольдемаровичу Шайтану за своевременную помощь в решении организационных вопросов, возникавших во время выполнения диссертационной работы.

Сердечно благодарю своих родных и друзей, которые поддерживали меня и были рядом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты диссертационной работы демонстрируют возможность применения бесклеточных белоксинтезирующих систем для продукции МБ различной топологии. В ходе исследования были разработаны эффективные системы для продукции мембранного домена тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека, содержащего одну ТМ-спираль, а также мускаринового ацетилхолинового рецептора человека М1 типа, имеющего в своем составе семь ТМ-спиралей. Кроме того, была изучена возможность применения различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, липид-детергентных бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков) для продукции ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной.

Методами ЯМР-спектроскопии была определена пространственная структура димера ТМ-ЕгЬВЗ в окружении мицелл ДФХ. Был проведен сравнительный анализ структуры ТМ-ЕгЬВЗ, котрансляционно встроенного в различные мембраномоделирующие среды. Было показано, что при встраивании в бицеллы и нанодиски формируется пространственная структура домена, близкая к наблюдаемой в мицеллах ДФХ.

Было показано, что М1-мАХР, котрансляционно встроенный в нанодиски, либо реконструированный из осадка реакционной смеси в смешанные мицеллы ДДМ/ХГС, способен специфически взаимодействовать с селективным антагонистом рецептора телензепином. Таким образом, в окружении этих мембраномоделирующих сред происходит формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка рецептора.

Представленная работа показывает, что бесклеточные белоксинтезирующие системы в сочетании с применением подходящих мембраномоделирующих сред являются эффективным инструментом для продукции препаратов МБ в растворимой и структурированной форме для структурных и функциональных исследований этих молекул.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хабибуллина, Нелли Фамзуловна, 2012 год

1. Fink A., Sal-Man N., Gerber D., Shai Y. Transmembrane domains interactions within the membrane milieu: Principles, Advances and Challenges // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V.l 818. № 4. P. 974983.

2. Henderson R. The structure of the purple membrane from Halobacterium halobium: analysis of the x-ray diffraction pattern // Journal of molecular biology. 1975. V. 93. № 2. P. 123-138.

3. Финкелыптейн А., Птицын О. Физика белка // Книжный дом Университет, Москва. 2005.

4. Chothia С., Levitt М., Richardson D. Structure of proteins: packing of alpha-helices and pleated sheets // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1977. V. 74. № 10. P. 4130-4134.

5. Popot J.L., Engelman D.M. Membrane protein folding and oligomerization: the two-stage model // Biochemistry. 1990. V. 29. № 17. P. 40314037.

6. Engelman D., Chen Y., Chin C.-N., Curran A., Dixon A., Dupuy A., Lee A., Lehnert U., Matthews E., Reshetnyak Y., Senes A., Popot J.-L. Membrane protein folding: beyond the two stage model // FEBS letters. 2003. V. 555. № 1.1. P. 122-125.

7. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein // Journal of molecular biology. 1982. V. 157. № 1. P. 105132.

8. Von Heijne G. Membrane protein structure prediction. Hydrophobicity analysis and the positive-inside rule // Journal of molecular biology. 1992. V. 225. № 2. P. 487-494.

9. Jones D., Taylor W., Thornton J. A mutation data matrix for transmembrane proteins // FEBS letters. 1994. V. 339. № 3. P. 269-275.

10. Arkin I.T. Statistical analysis of predicted transmembrane a-helices // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology. 1998. V. 1429, № 1. P. 113-128.

11. Arkin I., Adams P., MacKenzie K., Lemmon M., Brunger A., Engelman D. Structural organization of the pentameric transmembrane alpha-helices of phospholamban, a cardiac ion channel // The EMBO Journal. 1994. V. 13. № 20. P. 4757-4764.

12. Partridge A.W., Therien A.G., Deber C.M. Polar mutations in membrane proteins as a biophysical basis for disease // Peptide Science. 2002. V. 66. № 5. P. 350-358.

13. Zhou F., Cocco M., Russ W., Brunger A., Engelman D. Interhelical hydrogen bonding drives strong interactions in membrane proteins // Nature Structural Biology. 2000. V. 7. № 2. P. 154-160.

14. Curran A.R., Engelman D.M. Sequence motifs, polar interactions and conformational changes in helical membrane proteins // Current Opinion in Structural Biology. 2003. V. 13. № 4. P. 412-417.

15. Zhou F.X., Merianos H.J., Brunger A.T., Engelman D.M. Polar residues drive association of polyleucine transmembrane helices // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. V. 98. № 5. P. 2250-2255.

16. Gratkowski H., Lear J.D., DeGrado W.F. Polar side chains drive the association of model transmembrane peptides // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. V. 98. № 3. P. 880-885.

17. MacKenzie K.R., Prestegard J.H., Engelman D.M. A transmembrane helix dimer: structure and implications // Science. 1997. V. 276. № 5309. P. 131133.

18. Russ W.P., Engelman D.M. The GxxxG motif: A framework for transmembrane helix-helix association // Journal of Molecular Biology. 2000. V. 296. №3. P. 911-919.

19. Mendrola J.M., Berger M., King M., Lemmon M. The single transmembrane domains of ErbB receptors self-associate in cell membranes // Journal of Biological Chemistry. 2002. V. 277. № 7. P. 4704-4712.

20. Escher C., Cymer F., Schneider D. Two GxxxG-like motifs facilitate promiscuous interactions of the human ErbB transmembrane domains // Journal of Molecular Biology. 2009. V.389. № 1. P. 10-16.

21. Stanley A.M., Fleming K.G. The transmembrane domains of ErbB receptors do not dimerize strongly in micelles // Journal of Molecular Biology. 2005. V. 347. № 4. P. 759-772.

22. Schneider D., Engelman D.M. Motifs of two small residues can assist but are not sufficient to mediate transmembrane helix interactions // Journal of Molecular Biology. 2004. V. 343. № 4. P. 799-804.

23. Bocharov E., Mayzel M., Volynsky P., Mineev K., Tkach E., Ermolyuk

24. Y., Schulga A., Efremov R., Arseniev A. Left-handed dimer of EphA2114transmembrane domain: helix packing diversity among receptor tyrosine kinases // Biophysical Journal. 2010. V. 98. № 5. P. 881-889.

25. Kahn T.W., Sturtevant J.M., Engelman D.M. Thermodynamic measurements of the contributions of helix-connecting loops and of retinal to the stability of bacteriorhodopsin // Biochemistry. 1992. V. 31. № 37. P. 8829-8839.

26. Hunt J., Rath P., Rothschild K., Engelman D. Spontaneous, pH-dependent membrane insertion of a transbilayer a-helix // Biochemistry. 1997. V. 36. №49. P. 5177-15192.

27. Hunt J., Earnest T., Bousche O., Kalghatgi K., Reilly K., Horvath C., Rothschild K., Engelman D. A biophysical study of integral membrane protein folding // Biochemistry. 1997. V. 36. № 49. P. 15156-15176.

28. Duong M.T., Jaszewski T.M., Fleming K.G., MacKenzie K.R. Changes in apparent free energy of helix-helix dimerization in a biological membrane due to point mutations // Journal of Molecular Biology. 2007. V. 371. № 2. P. 422-434.

29. Smith S., Eilers M., Song D., Crocker E., Ying W., Groesbeek M., Metz G., Ziliox M., Aimoto S. Implications of threonine hydrogen bonding in the glycophorin A transmembrane helix dimer // Biophysical Journal. 2002. V. 82. № 5. P. 2476-2486.

30. Call M.E., Schnell J.R., Xu C., Lutz R.A., Chou J.J., Wucherpfennig K.W. The Structure of the Transmembrane Dimer Reveals Features Essential for Its Assembly with the T Cell Receptor // Cell. 2006. V. 127. № 2. P. 355-368.

31. Call M.E., Wucherpfennig K.W., Chou J.J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex // Nature Immunology. 2010. V. 11. № 11. P. 1023-1029.

32. Anbazhagan V., Munz C., Tome L., Schneider D. Fluidizing the Membrane by a Local Anesthetic: Phenylethanol Affects Membrane Protein Oligomerization // Journal of Molecular Biology. 2010. V. 404. № 5. P. 773-777.

33. Holt A., Killian J.A. Orientation and dynamics of transmembrane peptides: the power of simple models // European Biophysics Journal. 2010. V. 39. №4. P. 609-621.

34. Cymer F., Veerappan A., Schneider D. Transmembrane helix-helix interactions are modulated by the sequence context and by lipid bilayer properties // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V. 1818. № 4. P. 963973.

35. Guignard L., Ozawa K., Pursglove S.E, G.Otting; Dixon N.E. NMR analysis of in vitro-synthesized proteins without purification: a high-throughput approach // FEBS Letters. 2002. V. 524. № 1-3. P. 159-162.

36. Spirin A.S., Baranov V.I., Ryabova L.A., Ovodov S.Y., Alakhov Y.B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield // Science. 1988. V. 242. № 4882. P. 1162.

37. Kim D.M., Choi C.Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane // Biotechnology progress. 1996. V. 12. № 5. P. 645-649.

38. Спирин A.C. Молекулярная биология. Рибосомы и биосинтез белка // Издательский центр "Академия". Москва. 2011. С. 95.

39. Cymer F., Schneider D. Transmembrane helix-helix interactions involved in ErbB receptor signaling // Cell Adhesion & Migration. 2010. V. 4. № 2. P. 299-312.

40. Fernández С., Wüthrich К. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles // FEBS Letters. 2003. V. 555. № l.P. 144-150.

41. Franzin C., Gong X., Thai K., Yu J., Marassi F. NMR of membrane proteins in micelles and bilayers: the FXYD family proteins // Methods. 2007. V. 41. №4. P. 398-408.

42. Berrier C., Park K.-H., Abes S., Bibonne A., Betton J.-M., Ghazi A. Cell-free synthesis of a functional ion channel in the absence of a membrane and in the presence of detergent // Biochemistry. 2004. V. 43. № 39. P. 12585-12591.

43. Klammt C., Schwarz D., Lohr F., Schneider B., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein // FEBS Journal. 2006. V. 273. № 18. P. 4141-4153.

44. Junge F., Schneider B., Reckel S., Schwarz D., Dotsch V., Bernhard F. Large-scale production of functional membrane proteins // Cellular and Molecular Life Sciences. 2008. V. 65. № 11. P. 1729-1755.

45. Sobhanifar S., Reckel S., Junge F., Schwarz D., Kai L., Karbyshev M., Lohr F., Bernhard F., Dotsch V. Cell-free expression and stable isotope labelling strategies for membrane proteins // Journal of Biomolecular NMR. 2010. V. 46. № l.P. 33-43.

46. Hovijitra N., Wuu J., Peaker B., Swartz J. Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes // Biotechnology and Bioengineering. 2009. V. 104. № l.P. 40-49.

47. Moritani Y., Nomura S., Morita I., Akiyoshi K. Direct integration of cell-free-synthesized connexin-43 into liposomes and hemichannel formation // FEBS Journal. 2010. V. 277. № 16. P. 3343-3352.

48. Wuu J.J., Swartz J.R. High yield cell-free production of integral membrane proteins without refolding or detergents // Biochimica et Biophysica Acta

49. BBA)-Biomembranes. 2008. V. 1778. № 5. P. 1237-1250.118

50. Park K.H., Billon-Denis E., Dahmane T., Lebaupain F., Pucci B., Breyton C., Zito F. In the cauldron of cell-free synthesis of membrane proteins: playing with new surfactants // New Biotechnology. 2011. V. 28. № 3. P. 255-261.

51. Bayburt T.H.,. Sligar S.G. Single-molecule height measurements on microsomal cytochrome P450 in nanometer-scale phospholipid bilayer disks // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002. V. 99. № 10. P. 67256730.

52. Ritchie T., Grinkova Y.V., Bayburt T.H., Denisov I.G., Zolnerciks J.K., Atkins W.M., Sligar S.G. Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs // Methods in Enzymology. 2009. V. 464. P. 211-231.

53. Bayburt T.H., Sligar S.G. Membrane protein assembly into Nanodiscs // FEBS Letters. 2010. V. 584. № 9. P. 1721-1727.

54. Leitz A.J., Bayburt T.H., Barnakov A.N., Springer B.A., Sligar S.G. Functional reconstitution of beta 2-adrenergic receptors utilizing self-assembling Nanodisc technology // Biotechniques. 2006. V. 40. № 5. P. 601.

55. Katzen F., Peterson T.C., Kudlicki W. Membrane protein expression: no cells required // Trends in Biotechnology. 2009. V. 27. № 8. P. 455-460.

56. Yang J., Cirico T., Katzen F., Peterson T.C., Kudlicki W. Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs // BMC biotechnology. 2011. V. 11. № 57. P. 1-8.

57. Schwarz D., Dötsch V., Bernhard F. Production of membrane proteins using cell-free expression systems // Proteomics. 2008. V. 8. № 19. P. 3933-3946.

58. Staunton D., Schlinkert R., Zanetti G., Colebrook S.A., Campbell I.D. Cell-free expression and selective isotope labelling in protein NMR // Magnetic Resonance in Chemistry. 2006. V. 44. V.S1. P. S2-S9.

59. Morita E., Shimizu M., Ogasawara T., Endo Y., Tanaka R., Kohno T. A novel way of amino acid-specific assignment in 1H-15N HSQC spectra with a wheat germ cell-free protein synthesis system // Journal of Biomolecular NMR. 2004. V. 30. № 1. P. 37-45.

60. Ozawa K., Dixon N., Otting G. Cell-free synthesis of 15N-labeled proteins for NMR studies // IUBMB Life. 2005. V. 57. № 9. P. 615-622.

61. Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., Bernhard F. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins // European Journal of Biochemistry. 2004. V. 271. № 3. P. 568-580.

62. Ozawa K., Wu P., Dixon N., Otting G. 15N-Labelled proteins by cell-free protein synthesis //FEBS Journal. 2006. V. 273. № 18. P. 4154-4159.

63. Etezady-Esfarjani T., Hiller S., Villalba C., Wuthrich K. Cell-free protein synthesis of perdeuterated proteins for NMR studies // Journal of Biomolecular NMR. 2007. V. 39. № 3. P. 229-238.

64. Hall M., Gabay J., Débarbouillé M., Schwartz M. A role for mRNA secondary structure in the control of translation initiation // Nature. 1982. V. 295. P. 616-618.

65. Staunton D., Schlinkert R., Zanetti G., Colebrook S., Campbell I. Cellfree expression and selective isotope labelling in protein NMR // Magnetic Resonance In Chemistry. 2006. V. 44. P. S2-S9.

66. Roosild T., Greenwald J., Vega M., Castronovo S., Riek R., Choe S. NMR structure of Mistic, a membrane-integrating protein for membrane protein expression// Science. 2005. V. 307. № 5713. P. 1317.

67. Sassenfeld H.M., Brewer S.J. A polypeptide fusion designed for the purification of recombinant proteins // Nature Biotechnology. 1984. V. 2. № 1. P. 76-81.

68. Bucher M.H., Evdokimov A.G., Waugh D.S. Differential effects of short affinity tags on the crystallization of Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2002. V. 58. №3. P. 392-397.

69. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Applied microbiology and biotechnology. 2003. V. 60. № 5. P. 523-533.

70. Blommel P.G., Fox B.G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease // Protein expression and purification. 2007. V. 55. № 1. P. 53-68.

71. Arnau J., Lauritzen C., Petersen G.E., Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins // Protein Expression and Purification. 2006. V. 48. P. 1-13.

72. Sun Q., Chen L., Cao L., Fang L., Chen C., Hua Z. An improved strategy for high-level production of human vasostatin 120-180 // Biotechnol. Prog. 2005. V. 21. P. 1048-1052.

73. Karpeisky M.Y., Senchenko V.N., Dianova M.V., Kanevsky V.Yu. Formation and properties of S-protein complex with S-peptide-containing fusion protein // FEBS Letter. 1994. V. 339. № 3. P. 209-212.

74. Kim J.S., Raines R.T. A misfolded but active dimer of bovine seminal ribonuclease // European Journal of Biochemistry. 1994. V. 224. № l.P. 109-114.

75. Chen L., Merzlyakov M., Cohen T., Shai Y., Hristova K. Energetics of ErbB 1 transmembrane domain dimerization in lipid bilayers // Biophysical Journal. 2009. V. 96. № 11. P. 4622-4630.

76. Baulida J., Kraus M., Alimandi M., Di Fiore P., Carpenter G. All ErbB receptors other than the epidermal growth factor receptor are endocytosis impaired // Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271. № 9. p. 5251.

77. Tao R.H., Maruyama I.N. All EGF (ErbB) receptors have preformed homo-and heterodimeric structures in living cells // Journal of Cell Science. 2008. V. 121. № 19. 3207-3217.

78. Hellyer N.J., Cheng K., Koland J.G. ErbB3 (HER3) interaction with the p85 regulatory subunit of phosphoinositide 3-kinase // Biochemical Journal. 1998. V.333.Pt3.P. 757.

79. Yarden Y., Sliwkowski M.X. Untangling the ErbB signalling network // Nat Rev Mol Cell Biol. 2001. V. 2. № 2. P. 127-137.

80. Bennasroune A., Fickova M., Gardin A, Dirrig-Grosch S., Aunis D, Cremel G., Hubert P. Transmembrane peptides as inhibitors of ErbB receptor signaling // Molecular biology of the cell. 2004. V. 15. № 7. P. 3464-3474.

81. Beerli R.R., Hynes N.E. Epidermal growth factor-related peptides activate distinct subsets of ErbB receptors and differ in their biological activities // Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271. № 11. P. 6071-6076.

82. Bouyain S., Longo P., Li S., Ferguson K., Leahy D. The extracellular region of ErbB4 adopts a tethered conformation in the absence of ligand // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005. V. 102. № 42. P. 1502415029.

83. Burgess A., Cho H., Eigenbrot C., Ferguson K., Garrett T., Leahy D., Lemmon M., Sliwkowski M., Ward C., Yokoyama S. An open-and-shut case? Recent insights into the activation of EGF/ErbB receptors // Molecular cell. 2003. V. 12. № 3. P. 541-552.

84. Cho H.S., Leahy D.J. Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether // Science. 2002. V. 297. № 5585. P. 1330.

85. Cho H., Mason K., Ramyar K., Stanley A., Gabelli S., Denney D.Jr, Leahy D. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab // Nature. 2003. V. 421. № 6924. P. 756-760.

86. Ferguson K., Berger M., Mendrola J., Cho H.-S., Leahy D., Lemmon M. EGF activates its receptor by removing interactions that autoinhibit ectodomain dimerization // Molecular cell. 2003. V. 11. № 2. P. 507-517.

87. Bagossi P., Horvath G., Vereb G., Szollosi J., Tozser J. Molecular modeling of nearly full-length ErbB2 receptor // Biophysical Journal. 2005. V. 88. №2. P. 1354-1363.

88. Sweeney C., Carraway K.L. Negative regulation of ErbB family receptor tyrosine kinases // British journal of cancer. 2004. V. 90. № 2. P. 289-293.

89. Bocharov E.V., Mineev K.S., Volynsky P.E., Ermolyuk Y.S., Tkach E.N. , Sobol A.G., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor

90. ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state // Journal of Biological Chemistry. 2008. V. 283. № 11. P. 6950.

91. Zhang H., Berezov A., Wang Q., Zhang G., Drebin J., Murali R., Greene M. ErbB receptors: from oncogenes to targeted cancer therapies // Journal of Clinical Investigation. 2007. V. 117. № 8. P. 2051.

92. Sorkin A., Goh L.K. Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs // Experimental cell research. 2009. V.315. № 4. P. 683-696.

93. Smith S., Smith C., Shekar S., Peersen O., Ziliox M., Aimoto S. Transmembrane interactions in the activation of the Neu receptor tyrosine kinase // Biochemistry. 2002. V. 41. № 30. P. 9321-9332.

94. Kasprzyk P.G., Song S.U., Di Fiore P.P., King C.R. Therapy of an animal model of human gastric cancer using a combination of anti-erbB-2 monoclonal antibodies // Cancer research. 1992. V. 52. № 10. P. 2771-2776.

95. Hedhli N., Russell K.S. Cytostatic drugs, neuregulin activation of erbB receptors, and angiogenesis // Current hypertension reports. 2010. V. 12. P. 411417.

96. Citri A., Alroy I., Lavi S., Rubin C., Xu W., Grammatikakis N.,

97. Patterson C., Neckers L., Fry D., Yarden Y. Drug-induced ubiquitylation and126degradation of ErbB receptor tyrosine kinases: implications for cancer therapy // The EMBO Journal. 2002. V. 21. № 10. P. 2407-2417.

98. Hynes N.E., Lane H.A. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors //Nature Reviews Cancer. 2005. V. 5. № 5. P. 341-354.

99. Hsieh A., Moasser M. Targeting HER proteins in cancer therapy and the role of the non-target HER3 // British journal of cancer. 2007. V. 97. № 4. P. 453-457.

100. Sithanandam G., Anderson L. The ERBB3 receptor in cancer and cancer gene therapy // Cancer gene therapy. 2008. V. 15. № 7. P. 413-448.

101. Tebben A., Schnur D. Beyond rhodopsin: G protein-coupled receptor structure and modeling incorporating the beta2-adrenergic and adenosine A (2A) crystal structures // Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2011. V. 672. P. 359-386.

102. Erlenbach I., Kostenis E., Schmidt C., Hamdan F., Pausch M., Wess J. Functional expression of Ml, M3 and M5 muscarinic acetylcholine receptors in yeast // Journal of neurochemistry. 2001. V. 77. № 5. P. 1327-1337.

103. Levey A.I., Stormann T.M., Brann M.R. Bacterial expression of human muscarinic receptor fusion proteins and generation of subtype-specific antisera // FEBS Letters. 1990. V. 275. № 1-2. P. 65-69.

104. Wess J. Muscarinic Acetylcholine Receptor Knockout Mice: Novel Phenotypes and Clinical Implications // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. V. 44. P. 423-450.

105. Bee M.S., Hulme E.C. Functional analysis of transmembrane domain 2 of the Ml muscarinic acetylcholine receptor // Journal of Biological Chemistry. 2007. V. 282. №44. 32471.

106. Hulme E., Lu Z., Saldanha J., Bee M. Structure and activation of muscarinic acetylcholine receptors // Cholinergic mechanisms: function and dysfunction. 2004. V. 8. P.55.

107. Ishii M., Kurachi Y. Muscarinic acetylcholine receptors // Current pharmaceutical design. 2006. V. 12. № 28. P. 3573-3581.

108. Resende R.R., Adhikari A. Cholinergic receptor pathways involved in apoptosis, cell proliferation and neuronal differentiation // Cell Commun Signal. 2009. V. 7. P. 20.

109. Hegde S.S., Mammen M., Jasper J.R. Antimuscarinics for the treatment of overactive bladder: current options and emerging therapies // Current Opinion in Investigational Drugs. 2004. V. 5. № 1. P. 40-49.

110. Hegde S.S. Muscarinic receptors in the bladder: from basic research to therapeutics // British journal of pharmacology. 2006. V. 147. № S2. P. S80-S87.

111. Racke K., Matthiesen S. The airway cholinergic system: physiology and pharmacology // Pulmonary pharmacology & therapeutics. 2004. V. 17. № 4. P. 181-198.

112. Bartus R.T. On neurodegenerative diseases, models, and treatment strategies: lessons learned and lessons forgotten a generation following the cholinergic hypothesis // Experimental Neurology. 2000. V. 163. № 2. P. 495-529.

113. Román G.C. Cholinergic dysfunction in vascular dementia // Current psychiatry reports. 2005. V. 7. № 1. P. 18-26.

114. Messer Jr W.S. Cholinergic agonists and the treatment of Alzheimer's disease // Current topics in medicinal chemistry. 2002. V. 2. № 4. P. 353-358.

115. Maeda S., Lameh J., Mallet W.G., Philip M., Ramachandran J., Sadee W. Internalization of the Hml muscarinic cholinergic receptor involves the third cytoplasmic loop //FEBS Letters. 1990. V. 269. № 2. P. 386-388.

116. Lu Z.L., Saldanha J.W., Hulme E.C. Transmembrane Domains 4 and 7 of the Ml Muscarinic Acetylcholine Receptor Are Critical for Ligand Binding and the Receptor Activation Switch // Journal of Biological Chemistry. 2001. V. 276. № 36. P. 34098-34104.

117. Ward S.D., Curtis C.A., Hulme E.C. Alanine-scanning mutagenesis of transmembrane domain 6 of the Ml muscarinic acetylcholine receptor suggests that Tyr381 plays key roles in receptor function // Molecular pharmacology. 1999. V. 56. №5. P. 1031-1041.

118. Kaye R., Saldanha J., Lu Z.-L., Hulme E. Helix 8 of the Ml Muscarinic Acetylcholine Receptor: Scanning Mutagenesis Delineates a G Protein Recognition Site // Molecular pharmacology. 2011. V. 79. № 4. P. 701-709.

119. Kukkonen A., Perakyla M., Akerman K., Nasman J. Muscarinic toxin 7 selectivity is dictated by extracellular receptor loops // Journal of Biological Chemistry.2004. V. 279. № 49. P. 50923.

120. Espinoza-Fonseca L.M., Trujillo-Ferrara J.G. Identification of multiple allosteric sites on the Ml muscarinic acetylcholine receptor // FEBS Letters. 2005. V. 579. № 30. P. 6726-6732.

121. Espinoza-Fonseca L.M., Trujillo-Ferrara J.G. The existence of a second allosteric site on the Ml muscarinic acetylcholine receptor and its implications for drug design // Bioorganic & medicinal chemistry letters. 2006. V. 16. № 5. P. 12171220.

122. Peng J., Vaidehi N., Hall S., Goddard III W. The predicted 3D structures of the human Ml muscarinic acetylcholine receptor with agonist or antagonist bound // ChemMedChem. 2006. V. 1. № 8. P. 878-890.

123. Espinoza-Fonseca L., Pedretti A., Vistoli G. Structure and dynamics of the full-length Ml muscarinic acetylcholine receptor studied by molecular dynamics simulations // Archives of biochemistry and biophysics. 2008. V. 469. № l.P. 142150.

124. Kruse A., Hu J., Pan A., Arlow D., Rosenbaum D., Rosemond E., Green H., Liu T., Chae P., Dror R., Shaw D., Weis W., Wess J., Kobilka B. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor // Nature. 2012. V. 482. № 7386. P. 552-556.

125. Haga K., Kruse A., Asada H., Yurugi-Kobayashi T., Shiroishi M.,

126. Zhang C., Weis W., Okada T., Kobilka B., Haga T., Kobayashi T. Structure of the130human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist // Nature. 2012. V. 482. №7386. P. 547-551.

127. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // Journal of Molecular Biology. 1983. V. 166. № 4. P. 557-580.

128. Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems // Annual review of genetics. 1973. V. 7. № 1. P. 267-287.

129. Spirin A.S. Cell-free translation system // Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York. 2002.

130. Spirin A.S., Swartz J.R. Cell-Free Protein Synthesis Systems: Historical Landmarks, Classification, and General Methods // Cell-Free Protein Synthesis. 2008. P. 1-34.

131. Schagger H., Von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Analytical biochemistry. 1987. V. 166. № 2. P. 368-379.

132. Enami I., Satoh K., Katoh S. Crosslinking between the 33 kDa extrinsic protein and the 47 kDa chlorophyll-carrying protein of the PSII reaction center core complex // FEBS Letters. 1987. V. 226. № 1. P. 161-165.

133. Wittekind M., Muller L. HNCACB, a high-sensitivity 3D NMR experiment to correlate amide-proton and nitrogen resonances with alpha- and betacarbon resonances in proteins // J Magn Reson. 1993. V. Ser B. 101. P. 201-205.

134. Kay L.E., Ikura M., Tschudin R., Bax A. 3-Dimensional triple-resonance NMR spectroscopy of isotopically enriched proteins // J. Magn. Reson. 1990. V. 89. P. 496-514.

135. Bax A., Clore G.M., Gronenborn A.M. ^^H correlation via isotropic mixing of 13C magnetization: a new three-dimensional approach for assigning !H and 13C spectra of 13C-enriched proteins // J. Magn. Reson. 1990. V. 88. P. 425.

136. Davis A., Keeler J., Laue E.D., Moskau D. Experiments for recording pure absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field gradients // J. Magn. Reson. 1992. V. 98. P. 207-216.

137. Kuboniwa H., Grzesiek S., Delaglio F., Bax A. Measurement of HN-H alpha J couplings in calcium-free calmodulin using new 2D and 3D water-flip-back methods // J Biomol NMR. 1994. V. 4. № 6. P. 871-878.

138. Archer S.J., Ikura M., Torchia D.A., Bax A. An alternative 3D NMR technique for correlating backbone 15N with side chain H beta resonances in larger proteins //J. Magn. Reson. 1991. V. 95. P. 636-641.

139. Stuart A., Borzirelli K., Withka J., Palmer A. Compensation for Variations in 1H-13C Scalar Coupling Constants in Isotope filtered NMR experiments // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 5346-5347.

140. Marion D., Ikura M., Tschudin R., Bax A. Rapid recording of 2D NMR-spectra without phase cycling—application to the study of hydrogen-exchange in proteins // J. Magn. Reson. 1989. V. 85. P. 393-399.

141. Kay L.E., Keifer P., Saarinen T. Pure absorption gradient enhanced heteronuclear single quantum correlation spectroscopy with improved sensitivity // J Am Chem Soc. 1992. V. 114. P. 10663-10665.

142. Piotto M, Saudek V, Sklenar V. Gradient-tailored excitation for singlequantum NMR spectroscopy of aqueous solutions // J Biomol NMR. 1992. V. 2. № 6. P. 661-665.

143. Hiller S., Wider G., Etezady-Esfarjani Т., Horst R., Wuthrich K. Managing the solvent water polarization to obtain improved nmr spectra of large molecular structures // J Biomol NMR. 2005. V. 32. № 1. P. 61-70.

144. Fulton D.B., Hrabal R., Ni F. Gradient-enhanced TOCSY experiments with improved sensitivity and solvent suppression // J. Biomolecular NMR. 1996. V. 8. P. 213-218.

145. Keller R.L.J, Wutrich K. Optimizing the process of nuclear magnetic resonance spectrum analysis and computer aided resonance assignment // Diss. Eth. № 15947 (www.nmr.ch). (Диссертация на соискание степени доктора естественных наук).

146. Guntert P., Mumenthaler С., Wutrich К. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA // J. Mol. Biol. 1997. V. 273. P. 283-298.

147. Klammt C., Schwarz D., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free production of integral membrane proteins on a preparative scale // Methods in Molecular Biology. 2007. V. 375. P. 57-78.

148. Goerke A.R., Swartz J.R. Development of cell-free protein synthesis platforms for disulfide bonded proteins // Biotechnology and bioengineering. 2008. V. 99. №2. P. 351-367.

149. Yu T.Y., Raschle Т., Hiller S., Wagner G. Solution NMR spectroscopic characterization of human VDAC-2 in detergent micelles and lipid bilayer nanodiscs // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 2012. V. 1818. № 6. P. 1562-1569.

150. Isaksson L., Enberg J., Neutze R., Goran Karlsson B., Pedersen A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis // Protein expression and purification. 2012. V. 82. № 1. P. 218-225.

151. Thompson A., Liu J., Chun E., Wacker D., Wu H., Cherezov V., Stevens R. GPCR stabilization using the bicelle-like architecture of mixed sterol-detergent micelles // Methods. 2011. V. 55. P. 310-317.

152. Rosenbaum D., Rasmussen S., Kobilka B. The structure and functions of G-protein-coupled receptors // Nature. 2009. V. 459. № 7245. P. 356- 363.