Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Коммер, Айгар Акселович

• Коммер, Айгар Акселович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коммер, Айгар Акселович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Первые бесклеточные системы трансляции.

1.1.1. Открытие синтеза белка в клеточных экстрактах.

1.1.2. Трансляция экзогенных матриц.

1.2. Прокариотические и эукариотические типы бесклеточных систем экспрессии.

1.2.1. Экстракт Е. col!.

1.2.2. Экстракт зародышей пшеницы (WGE).

1.2.3. Лизат ретикулоцитов кролика (RRL).

1.3. Форматы бесклеточных систем.

1.3.1. «Batch» формат.

1.3.2. Длительно работающие системы.

1.3.3. Бесклеточные системы непрерывного потока (CFCF).

1.3.4. Бесклеточные системы с непрерывным обменом (CECF).

1.3.5. «Чистая» система Уэда.

1.3.6. Искусственная клетка.

1.4. Матрицы для бесклеточных систем.

1.4.1. Структура прокариотической матрицы.

1.4.2. Трансляция безлидерных мРНК.

1.4.3. Кодоновый контекст.

1.4.4. Редкие ко доны.

1.4.5. Использование сигнальных пептидов.

1.4.6. Стабилизация матриц.

1.4.7. Одновременная экспрессия разных генов.

1.5. Экстракты Е. coli.

1.5.1. Генетика.

1.5.2. Выращивание клеток для приготовления бесклеточных экстрактов.

1.5.3. Приготовление экстракта.

1.6. Увеличение продуктивности бесклеточных систем.

1.6.1. Mg2+и фосфат.

1.6.2. Другие соли.

1.6.3. Нуклеотиды.

1.6.4. Аминокислоты.

1.6.5. Стабилизирующие компоненты.

1.6.6. Другие факторы.

1.6.7. Обеспечение системы энергией.

1.6.8. Соотношение объёма реакционной смеси и её поверхности.

1.7. Применение бесклеточных систем.

1.7.1. Включение неприродых аминокислот.

1.7.2. Применение бесклеточного синтеза для решения структуры белка.

1.7.3. Синтез антибактериальных пептидов.

1.7.4. Синтез мембранных белков.

1.7.5. Другие примеры использования бесклеточных систем.

1.8. Сворачивание белка.

1.8.1. Влияние температуры на сворачивание белка.

1.8.2. Влияние лигандов на сворачивание белка.

1.8.3. Синтез белков с диульфидными мостиками.

1.8.4. Влияние молекулярных шаперонов на сворачивание синтезируемого белка.

1.8.5. Влияние детергентов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Котрансляционное связывание гема полипептидными цепями а-глобина, синтезируемыми в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика.

2.2. Котрансляционное связывание гема цепями а-глобина, синтезируемыми в отсутствие свободных молекул гемоглобина.

2.3. Связывание гема незавершенными растущими цепями а-глобина.

2.4. Связывание гема на рибосомах с короткими растущими цепями а-глобина.

2.5. Зависимость связывания гема от длины незавершенных растущих цепей а-глобина.

2.6. Формирование структуры гем-связывающего центра глобина.

2.7. Препаративный синтез проинсулина человека в бесклеточной системе.

2.8. Синтез проинсулина человека в присутствии детергентов.

2.9. Определение активности проинсулина по активации рецептора инсулина.

МАТЕРИАЛЫ.

3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Получение мРНК а-глобина.

3.2. Получение меченого гемина.

3.3. Расщепление мРНК а-глобина рибонуклеазой Н.

3.4. Получение мРНК а86, гомогенной по З'-концевой последовательности.

3.5. Трансляция в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика.

3.6. Бесклеточный синтез белка в экстракте из зародышей пшеницы.

3.7. Центрифугирование в градиенте сахарозы.

3.8. Оптимизация условий бесклеточного синтеза проинсулина.

3.9. Синтез проинсулина в препаративном масштабе.

3.10. Анализ формирования дисульфидных связей в проинсулине.

3.10.1. Приготовление хелирующей сефарозы.

3.10.2. Очистка проинсулина, содержащего гексагистидиновый тракт, с помощью металл-хелатной хроматографии.

3.10.3. Гидролиз синтезированного проинсулина протеазой V8.

3.11. Препаративный синтез проинсулина без гистидинового тракта.

3.12. Протеолиз синтезированного проинсулина для получения инсулина.

3.13. Определение активности инсулина по способности активировать рецептор.

3.14. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

3.14.1. Анализ белков с молекулярной массой более б кДа.

3.14.2. Анализ А и В цепей инсулина.

3.14.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.14.4. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Котрансляционное формирование функционально активных белков в процессе трансляции в бесклеточных системах»

Приобретение белком уникальной пространственной структуры является необходимым условием осуществления его биологической функции. Сворачивание белка остаётся самым непонятным в настоящее время этапом в процессе передачи наследственной информации от ДНК к функциональному белку. Механизм этого процесса и управляющие им законы не выяснены, несмотря на разнообразные экспериментальные и теоретические подходы, применяемые для его изучения и моделирования. Пристальный интерес к этой проблеме вызван не только её фундаментальной значимостью, но и важностью понимания механизмов сворачивания для медицины и биотехнологии. Сейчас известно, что многие наследственные заболевания связаны с мутациями, нарушающими сворачивание какого-либо белка. В частности, с нарушением сворачивания коллагена связаны многие болезни соединительной ткани (Baum and Brodsky 1999). К болезням, вызванным неправильным сворачиванием белков, относят также так называемые «прионовые заболевания» (Kelly 1998). Очевидна также важность знания закономерностей сворачивания белков для белковой инженерии и биотехнологии. Известно, что сверхпродукция целевых белков в клетках-продуцентах часто увеличивает уровень ошибок сворачивания, что приводит к образованию «телец включения». Это является серьёзным ограничением в получении больших количеств биологически активных рекомбинантных белков в условиях их суперпродукции.

Наиболее актуальны в решении проблемы сворачивания экспериментальные работы, в которых сворачивание белков исследуется в условиях максимального приближения к природной ситуации, к сворачиванию синтезированных de novo белков в клетках и бесклеточных экстрактах. Настоящая работа направлена на изучение сворачивания синтезированного de novo белка и определению этапа биосинтеза, на котором синтезируемая полипептидная цепь приобретает пространственную структуру нативного биологически активного белка. Подходы к исследованию сворачивания белка разнообразны и многочисленны. Однако подавляющее большинство этих исследований относится к сворачиванию полноразмерных полипептидных цепей в нативную структуру, когда в качестве исходного состояния цепи выступает полностью или частично денатурированный белок. Главным инструментом нашего исследования послужили бесклеточные системы трансляции, являющиеся хорошей моделью для изучения сворачивания белка в клетке, но допускающие значительно большую свободу для вмешательства и анализа, чем сама клетка.

В настоящее время принято считать, что котрансляционное сворачивание многодоменного белка происходит подоменно {Netzer and Hart! 1997), т.е. пространственная структура каждого домена формируется только после его синтеза и появления из рибосомы. Следствием этой концепции является вывод о посттрансляционном сворачивании однодоменных белков. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы выяснить, возможно ли формирование незавершенным однодоменным белком, находящимся на рибосоме, пространственной структуры, идентичной или близкой соответствующей части нативной структуры правильно свёрнутого домена.

В нашей работе были поставлены следующие задачи: 1) определить, связывают ли растущие цепи а-глобина человека гемин, добавленный в бесклеточную систему трансляции; 2) выяснить, могут ли растущие полипептиды связывать свободный гем, не находящийся в составе эндогенного гемоглобина; 3) определить, по достижении какой длины растущие полипептиды приобретают компетентность к специфичному связыванию гема; 4) выяснить, можно ли синтезировать в бактериальной бесклеточной системе функционально активный белок, содержащий дисульфидные связи - проинсулин человека; 5) подобрать условия синтеза, при которых сворачивание проинсулина в нативную структуру происходит с высоким выходом.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Коммер, Айгар Акселович

выводы

1. Обнаружено, что меченый гем избирательно связывается с рибосомами, синтезирующими глобин в бесклеточных системах трансляции ретикулоцитов кролика и зародышей пшеницы. Сделан вывод о приобретении полипептидными цепями специфической пространственной структуры, необходимой для связывания гема, в ходе их синтеза {котрансляционное сворачивание).

2. С помощью трансляции а-глобиновых мРНК, укороченных с З'-конца и лишенных стоп-кодона, выявлено, что способность связывать гем отсутствует у синтезируемых рибосомой глобиновых полипептидов длиной 75 аминокислотных остатков и менее и возникает по достижении растущей цепью длины 86 остатков и более.

3. Поскольку специфическое связывание гема возможно лишь при участии Е и F спиралей гем-связывающего кармана (остатки 52-71 и 80-89, соответственно) в строго определенной ориентации, сделан вывод о котрансляционном формировании вторичной и третичной структуры этого кармана на рибосоме в непосредственной близости от пептидил-трансферазного центра.

4. На примере проинсулина человека продемонстрирована возможность синтеза функционально активного белка, содержащего дисульфидные связи, в бактериальной бесклеточной системе.

5. Показано, что замедление синтеза проинсулина в бесклеточной системе путем понижения температуры и снижения концентрации ряда компонентов системы, а также присутствие некоторых детергентов, может приводить к увеличению доли правильно свёрнутых молекул синтезируемого белка.

Приношу глубокую и искреннюю благодарность моему учителю и научному руководителю академику Александру Сергеевичу Спирину. Глубоко признателен Вячеславу Адамовичу Колбу, Марату Миратовичу Юсупову и Игорю Александровичу Крашенинникову за обучение, столь пригодившееся мне в научной работе.

От всего сердца благодарен Славе Колбу за многолетнюю дружбу и поддержку, всестороннюю помощь в течение всей моей работы, за инициирование процесса защиты и неоценимую помощь в написании, обсуждении и редактировании материалов диссертации, а также за выполнение огромного объёма организационной работы перед защитой диссертации.

Особая благодарность моему другу Антону Комару, совместно с которым мы работали в трудные девяностые годы и получили все результаты по котрансляционному сворачиванию глобина.

Отдельная благодарность моей супруге Ирине Дашковой. Вместе с ней была выполнена работа по бесклеточному синтезу проинсулина, и эта работа не появилась бы без её помощи и поддержки, особенно в написании диссертации.

Искренне благодарен моим коллегам Славе Колбу, Максиму Светлову, Володе Широкову, Кириллу Шишову и всему составу лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН за всестороннюю помощь в работе и добрые, дружеские отношения. Столь же признателен коллегам по кафедре молекулярной биологии МГУ Виктору Васильевичу Асееву и Ивану Алексеевичу Аджубею за дружескую поддержку и помощь.

Глубоко благодарен В.Д. Васильеву, К.С. Василенко, A.T. Гудкову, А.Б. Четверину, И.А. Крашенинникову и А.В. Шишкову за интерес к моей работе и плодотворные дискуссии.

Хотел бы поблагодарить моих близких друзей за огромный вклад, внесённый в настоящую работу на эмоциональном и моральном уровне. Я очень признателен: Славе Колбу, Ларисе Николаевой, Серёже Яралову, Кате Бестужевой, Кириллу и Наташе Шишовым.

Приношу благодарность, моим оппонентам - за взятый ими на себя труд, К.В. Шишову -за организационную помощь, С. Хаустову-за редактирование автореферата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коммер, Айгар Акселович, 2008 год

1. Бони, И. В. (2006). "Разнообразие молекулярных механизмов инициации трансляции упрокариот." Молекулярная биология 40(4): 658-68.

2. Колб, В. А., А. А. Коммер, А. С. Спирин (1987). "Существует ли канал для синтезируемогона рибосоме пептида? Мечение транслирующих рибосом атомарным тритием." Докл. АН СССР 296: 1497-1501.

3. Коммер, А. А,, И. Г. Дашкова, Р. С. Есипов, А. И. Мирошников, А. С. Спирин (2005).

4. Получение функционально активного проинсулина человека в бесклеточной системе трансляции," Доклады Академии Наук 401: 696-700.

5. Коробко, В. Г., Е. Ф. Болдырева, Л. Н. Шингарова, А. И. Мирошников, В. Г. Гавриков, А. В.

6. Agashe, V. R., S. Guha, Н. С. Chang, P. Genevaux, М. Hayer-Hartl, М. Stemp, С. Georgopoulos,

7. F. U. Hart), J. М. Barral (2004). "Function of trigger factor and DnaK in multidomain protein folding: increase in yield at the expense of folding speed." Cell 117(2): 199-209.

8. Ahn, J. H., C. Y. Choi, D. M. Kim (2005). "Effect of energy source on the efficiency oftranslational termination during cell-free protein synthesis." Biochem Biophys Res Commun 337(1): 325-9.

9. Ahn, J. H.( H. S. Chu, T. W. Kim, I. S. Oh, C. Y. Choi, G. H. Hahn, C. G. Park, D. M. Kim (2005).

10. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions." Biochem Biophys Res Commun 338(3): 1346-52.

11. Ahn, J. H., M. Y. Hwang, К. H. Lee, C. Y. Choi, D. M. Kim (2007). "Use of signal sequences as anin situ removable sequence element to stimulate protein synthesis in cell-free extracts." Nucleic Acids Res 35(4): e21.

12. Alakhov, Y. В., V. I. Baranov, S. I. Ovodov, L. A. Ryabova, A. S. Spirin (1995). Method ofpreparing polypeptides in cell-free translation system. United States Patent. 5478730.

13. Ali, M., H. Suzuki, T. Fukuba, X. Jiang, H. Nakano, T. Yamane (2005). "Improvements in thecell-free production of functional antibodies using cell extract from protease-deficient Escherichia coli mutant." J Biosci Bioeng 99(2): 181-6.

14. Anderson, C. W., J. W. Straus, B. S. Dudock (1983), "Preparation of a cell-free proteinsynthesizing system from wheat germ." Methods Enzymol 101: 635-44.

15. Anfinsen, С. B. (1973). "Principles that govern the folding of protein chains." Science181(96): 223-30.

16. Antonini, E. and M. Brunori (1971). Hemoglobin and myoglobin in their reactions withligands. Frontiers of biology. A. Neuberger and E. L. Tatum. Amsterdam,, North-Holland Publishing Company. 21:436.

17. Bain, J. D., C. Switzer, A. R. Chamberlin, S. A. Benner (1992). "Ribosome-mediatedincorporation of a non-standard amino acid into a peptide through expansion of the genetic code." Nature 356(6369): 537-9.

18. Baranov, V. I., N. V. Belitsina, A. S. Spirin (1979). "The use of columns with matrix-boundpolyuridylic acid for isolation of translating ribosomes." Methods Enzymol 59: 382-97.

19. Baranov, V. I., I. Morozov, S. A. Ortlepp, A. S. Spirin (1989). "Gene expression in a cell-freesystem on the preparative scale." Gene 84(2): 463-6.

20. Baranov, V. I. and A. S. Spirin (1993). "Gene expression in cell-free system on preparativescale." Methods Enzymol 217: 123-42.

21. Baum, J. and B. Brodsky (1999). "Folding of peptide models of collagen and misfolding indisease." Curr Opin Struct Biol 9(1): 122-8.i

22. Belitsina, N. V., M. A. Glukhova, A. S. Spirin (1979). "Elongation factor G-promotedtranslocation and polypeptide elongation in ribosomes without GTP cleavage: use of columns with matrix-bound polyuridylic acid." Methods Enzymol 60: 761-79.

23. Bergman, L. W. and W. M. Kuehl (1979). "Formation of an intrachain disulfide bond onnascent immunoglobulin light chains." J Biol Chem 254(18): 8869-76.

24. Bernabeu, C. and J. A. Lake (1982). "Nascent polypeptide chains emerge from the exitdomain of the large ribosomal subunit: immune mapping of the nascent chain." Proc Natl Acad Sci U S A 79(10): 3111-5.

25. Betton, J. M. (2003). "Rapid translation system (RTS): a promising alternative forrecombinant protein production." Curr Protein Pept Sci 4(1): 73-80.

26. Birjukov, S. V., P. N. Simonenko, V. A. Shirokov, S. G. Majorov, A. S. Spirin (2003). Methodfor synthesis of polypeptides in cell-free systems. United States Patent. #6,518,058 Bl.

27. Birjukov, S. V., P. N. Simonenko, V. A. Shirokov, A. S. Spirin (2004). Method for synthesis ofpolypeptides in cell-free systems. United States Patent. #6,783,957 Bl.

28. Blobel, G. and D. D. Sabatini (1970). "Controlled proteolysis of nascent polypeptides in ratliver cell fractions. I. Location of the polypeptides within ribosomes." J Cell Biol 45(1): 130-45.

29. Borsook, H. (1950). "Protein turnover and incorporation of labeled amino acids into tissueproteins in vivo and in vitro." Physiol Rev 30(2): 206-19.

30. Boyer, M. E., J. A. Stapleton, J. M. Kuchenreuther, C. W. Wang, J. R. Swartz (2008). "Cell-freesynthesis and maturation of FeFe. hydrogenases." Biotechnol Bioeng 99(1): 59-67.

31. Bucci, E. (1981). "Preparation of isolated chains of human hemoglobin." Methods Enzymol76: 97-106.

32. Buchberger, В., W. Mutter, A. Roder (2002). Matrix reactor: A new scalable reactor principlefor cell-free protein expression. Cell-free translation systems. A. S. Spirin. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag: 121-28.

33. Busso, D., R. Kim, S. H. Kim (2003). "Expression of soluble recombinant proteins in a cell-freesystem using a 96-well format." J Biochem Biophys Methods 55(3): 233-40.

34. Busso, D., R. Kim, S. H. Kim (2004). "Using an Escherichia coli cell-free extract to screen forsoluble expression of recombinant proteins." J Struct Funct Genomics 5(1-2): 69-74.

35. Calhoun, К. A. and J. R. Swartz (2005a). "An economical method for cell-free proteinsynthesis using glucose and nucleoside monophosphates." Biotechnol Prog 21(4): 114653.

36. Calhoun, K. A, and J. R. Swartz (2005b). "Energizing cell-free protein synthesis with glucosemetabolism." Biotechnol Bioeng90(5): 606-13.

37. Calhoun, K. A. and J. R. Swartz (2006). "Total amino acid stabilization during cell-free proteinsynthesis reactions." J Biotechnol 123(2): 193-203.

38. Carmel, G. and J. W. Coulton (1991). "Internal deletions in the FhuA receptor of Escherichiacoli K-12 define domains of ligand interactions." J Bacteriol 173(14): 4394-403.

39. Chekulayeva, M. N., О. V. Kurnasov, V. A. Shirokov, A. S. Spirin (2001). "Continuousexchange cell-free protein-synthesizing system: synthesis of HIV-1 antigen Net." Biochem Biophys Res Commun 280(3): 914-7.

40. Chen, H., Z. Xu, P. Cen (2006). "High-level expression of human beta-defensin-2 gene withrare codons in E. coli cell-free system." Protein Pept Lett 13(2): 155-62.

41. Chen, H., Z. Xu, N. Xu, P. Cen (2005). "Efficient production of a soluble fusion proteincontaining human beta-defensin-2 in E. coli cell-free system." J Biotechnol 115(3): 30715.

42. Chen, W., J. Helenius, I. Braakman, A. Helenius (1995). "Cotranslational folding and calnexinbinding during glycoprotein synthesis." Proc Natl Acad Sci U S A 92(14): 6229-33.

43. Chumpolkulwong, N., K. Sakamoto, A. Hayashi, F. Iraha, N. Shinya, N. Matsuda, D. Kiga, A.

44. Urushibata, M. Shirouzu, K. Oki, T. Kigawa, S. Yokoyama (2006). "Translation of 'rare' codons in a cell-free protein synthesis system from Escherichia coli." J Struct Funct Genomics 7(1): 31-6.

45. Clemens, M. J. (1984). Translation of Eukaryotic Messenger RNA in Cell-Free Extracts.

46. Transcription and translation : a practical approach. B. D. Hames and S. J. Higgins. Oxford ; Washington, D.C., IRL Press: 231-270.

47. Conti, E., L. F. Lloyd, J. Akins, N. P. Franks, P. Brick (1996). "Crystallization and preliminarydiffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis." Acta Crystallogr D Biol Crvstalloer 52(Pt 4): 876-8.

48. Cowley, D. J. and R. B. Mackin (1997). "Expression, purification and characterization ofrecombinant human proinsulin." FEBS Lett 402(2-3): 124-30.

49. Craik, C. S., S. R. Buchman, S. Beychok (1981). "02 binding properties of the product of thecentral exon of beta-globin gene." Nature 291(5810): 87-90.

50. Davis, J., D. Thompson, G. S. Beckler (1996). "Large scale dialysis cell-free system,"

51. Pro mega Notes Mae. 56:14-21.

52. Dawson, R. M. C., D. C. Elliott, W. H. Elliot, К. M. Jones (1990). Data for Biochemical

53. Research. New York, Oxford University Press.48. de Prat Gay, G., J. Ruiz-Sanz, J. L. Neira, F. J. Corrales, D. E. Otzen, A. G. Ladumer, A. R.

54. Fersht (1995). "Conformational pathway of the polypeptide chain of chymotrypsininhibitor-2 growing from its N terminus in vitro. Parallels with the protein folding pathway." J Mol Biol 254(5): 968-79.

55. De Sanctis, G., G. Falcioni, F. Polizio, A. Desideri, B. Giardina, F. Ascoli, M. Brunori (1994).

56. Demidov, V. V. (2004). Get it cell-free! Innovative technologies for high-throughput proteinexpression in vitro. Modem Drug Discovery. Washington D.C., American Chemical Society: 61-5.

57. Donis-Keller, H. (1979). "Site specific enzymatic cleavage of RNA." Nucleic Acids Res 7(1):179.92.

58. Endo, Y., Т. Oka, K. Ogata, Y. Natori (1993). "Production of dihydrofolate reductase by animproved continuous flow cell-free translation system using wheat germ extract." Tokushima J Exp Med 40(1-2): 13-7.

59. Endo, Y., S. Otsuzuki, K. Ito, K. Miura (1992). "Production of an enzymatic active proteinusing a continuous flow cell-free translation system." J Biotechnol 25(3): 221-30.

60. Fermi, G., M. F. Perutz, B. Shaanan, R. Fourme (1984). "The crystal structure of humandeoxyhaemoglobin at 1.74 A resolution." J Mol Biol 175(2): 159-74.

61. Fink, A. L. (1999). "Chaperone-mediated protein folding." Physiol Rev 79(2): 425-49.

62. Forster, A. C., Z. Tan, M. N. Nalam, H. Lin, H. Qu, V. W. Cornish, S. C. Blacklow (2003).

63. Programming peptidomimetic syntheses by translating genetic codes designed de novo." Proc Natl Acad Sci U S A 100(11): 6353-7.

64. Frydman, J., H. Erdjument-Bromage, P. Tempst, F. U. Hartl (1999). "Co-translational domainfolding as the structural basis for the rapid de novo folding of firefly luciferase." Nat Struct Biol 6(7): 697-705.

65. Frydman, J., E. Nimmesgern, K. Ohtsuka, F. U. Hartl (1994). "Folding of nascent polypeptidechains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones." Nature 370(6485): 111-7.

66. Gale, E. F. and J. P. Folkes (1954). "Effect of nucleic acids on protein synthesis and aminoacid incorporation in disrupted staphylococcal cells." Nature 173(4417): 1223-7.

67. Ganoza, M. С., C. Cunningham, R. M. Green (1985). "Isolation and point of action of a factorfrom Escherichia coli required to reconstruct translation." Proc Natl Acad Sci U S A 82(6): 1648-52.

68. Georgopoulos, C. and W. J. Welch (1993). "Role of the major heat shock proteins asmolecular chaperones." Annu Rev Cell Biol 9: 601-34.

69. Gesteland, R. F. (1966). "Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of

70. Escherichia coli." J Mol Biol 16(1): 67-84.

71. Gething, M. J. and J. Sambrook (1992). "Protein folding in the cell." Nature 355(6355): 3345.

72. Gilmore, R., M. C. Coffey, G. Leone, K. McLure, P. W. Lee (1996). "Co-translationaltrimerization of the reovirus cell attachment protein." EMBO J 15(11): 2651-8.

73. Green, R. H., B. R. Glick, M. C. Ganoza (1985). "Requirements for in vitro reconstruction ofprotein synthesis." Biochem Biophys Res Commun 126(2): 792-8.

74. Gurevich, V. V., I. D. Pokrovskaya, T. A. Obukhova, S. A. Zozulya (1991). "Preparative in vitromRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases." Anal Biochem 195(2): 207-13.

75. Hanes, J. and A. Pluckthun (1997). "In vitro selection and evolution of functional proteins byusing ribosome display." Proc Natl Acad Sci U S A 94(10): 4937-42.

76. Hardesty, В., R. Arlinghaus, J. Schaeffer, R. S. Schweet (1963). "Hemoglobin andpolyphenylalanine synthesis with reticulocyte ribosomes." Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28: 215-22.

77. Hartl, F. U. (1996). "Molecular chaperones in cellular protein folding." Nature 381(6583):571.9.

78. Hecht, S. M., B. L. Alford, Y. Kuroda, S. Kitano (1978). ""Chemical aminoacylation" oftRNA's." J Biol Chem 253(13): 4517-20.

79. Henshaw, E. C. and R. Panniers (1983). "Translational systems prepared from the Ehrlichascites tumor cell." Methods Enzymol 101: 616-29.

80. Hirao, I., T. Ohtsuki, T. Fujiwara, T. Mitsui, T. Yokogawa, T. Okuni, H. Nakayama, K. Takio, T.

81. Yabuki, T. Kigawa, K. Kodama, T. Yokogawa, K. Nishikawa, S. Yokoyama (2002). "An unnatural base pair for incorporating amino acid analogs into proteins." Nat Biotechnol 20(2): 177-82.

82. Hirao, I., S. Yoshizawa, K. Miura (1993). "Stabilization of mRNA in an Escherichia coli cellfree translation system." FEBS Lett 321(2-3): 169-72.

83. Hohsaka, T. and M. Sisido (2002). "Incorporation of non-natural amino acids into proteins."

84. CurrOpin Chem Biol 6(6): 809-15.

85. Ishihara, G., M. Goto, M. Saeki, K. Ito, T. Hori, T. Kigawa, M. Shirouzu, S. Yokoyama (2005).

86. Expression of G protein coupled receptors in a cell-free translational system using detergents and thioredoxin-fusion vectors." Protein Expr Purif 41(1): 27-37.

87. Ishikawa, К., K. Sato, Y. Shima, I. Urabe, T. Yomo (2004). "Expression of a cascading geneticnetwork within liposomes." FEBS Lett 576(3): 387-90.

88. Jackson, R. and T. Hunter (1970). "Role of methionine in the initiation of haemoglobinsynthesis." Nature 227(5259): 672-6.

89. Jackson, R. J. and T. Hunt (1983). "Preparation and use of nuclease-treated rabbitreticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA." Methods Enzymol 96: 50-74.

90. Jewett, M. C. and J. R. Swartz (2004a). "Rapid expression and purification of 100 nmolquantities of active protein using cell-free protein synthesis." Biotechnol Prog 20(1): 102-9.

91. Jewett, M. C. and J. R. Swartz (2004b). "Mimicking the Escherichia coli cytoplasmicenvironment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis." Biotechnol Bioeng 86(1): 19-26.

92. Jiang, X., К. Oohira, Y. Iwasaki, H. Nakano, S. Ichihara, T. Yamane (2002). "Reduction ofprotein degradation by use of protease-deficient mutants in cell-free protein synthesis system of Escherichia coli." J Biosci Bioeng 93(2): 151-6.

93. Jiang, X., Y. Ookubo, I. Fujii, H. Nakano, T. Yamane (2002). "Expression of Fab fragment ofcatalytic antibody 6D9 in an Escherichia coli in vitro coupled transcription/translation system." FEBSLett 514(2-3): 290-4.

94. Josephson, К., M. C. Hartman, J. W. Szostak (2005). "Ribosomal synthesis of unnaturalpeptides." J Am Chem Soc 127(33): 11727-35.

95. Kang, S. H., D. M. Kim, H. J. Kim, S. Y. Jun, K. Y. Lee, H. J. Kim (2005). "Cell-free production ofaggregation-prone proteins in soluble and active forms." Biotechnol Prog 21(5): 1412-9.

96. Kang, S. H., T. J. Oh, R. G. Kim, T. J. Kang, S. H. Hwang, E. Y. Lee, C. Y. Choi (2000). "Anefficient cell-free protein synthesis system using periplasmic phosphatase-removed S30 extract." J Microbiol Methods 43(2): 91-6.

97. Keller, E. B. and J. W. Littlefield (1957). "Incorporation of C14-amino acids intoribonucleoprotein particles from the Ehrlich mouse ascites tumor." J Biol Chem 224(1): 13-30.

98. Keller, E. B. and P. C. Zamecnik (1956). "The effect of guanosine diphosphate andtriphosphate on the incorporation of labeled amino acids into proteins." J Biol Chem 221(1): 45-59.

99. Kelly, J. W. (1998). "The alternative conformations of amyloidogenic proteins and theirmulti-step assembly pathways." Curr Opin Struct Biol 8(1): 101-6.

100. Kemmler, W., J. D. Peterson, D. F. Steiner (1971). "Studies on the conversion of proinsulin toinsulin. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B." J Biol Chem 246(22): 6786-91.

101. Keum, J. W., J. H. Ahn, C. Y. Choi, К. H. Lee, Y. C. Kwon, D. M. Kim (2006). "The presence of acommon downstream box enables the simultaneous expression of multiple proteins in an E. coli extract." Biochem Biophys Res Commun 350(3): 562-7.

102. Kiga, D., K. Sakamoto, K. Kodama, T. Kigawa, T. Matsuda, T. Yabuki, M. Shirouzu, Y. Harada,

103. Kigawa, Т., Т. Matsuda, Т. Yabuki, S. Yokoyama (2008). Bacterial cell-free system for highlyefficient protein synthesis. Cell-free protein synthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 83-97.

104. Kigawa, Т., Y. Muto, S. Yokoyama (1995). "Cell-free synthesis and amino acid-selectivestable isotope labeling of proteins for NMR analysis." J Biomol NMR 6(2): 129-34.

105. Kigawa, Т., Т. Yabuki, Y. Yoshida, M. Tsutsui, Y. Ito, T. Shibata, S. Yokoyama (1999). "Cell-freeproduction and stable-isotope labeling of milligram quantities of proteins." FEBS Lett 442(1): 15-9.

106. Kigawa, Т., E. Yamaguchi-Nunokawa, K. Kodama, T. Matsuda, T. Yabuki, N. Matsuda, R.1.hitani, O. Nureki, S. Yokoyama (2001). "Selenomethionine incorporation into a protein by cell-free synthesis." J Struct Funct Genomics 2(1): 29-35.

107. Kigawa, Т. and S. Yokoyama (1991). "A continuous cell-free protein synthesis system forcoupled transcription-translation." J Biochem 110(2): 166-8.

108. Kiho, Y. and A. Rich (1964). "Induced Enzyme Formed on Bacterial Polyribosomes." Proc Natl1. Acad Sci U S A 51:111-8.

109. Kim, D. M. and C. Y. Choi (1996). "A semicontinuous prokaryotic coupledtranscription/translation system using a dialysis membrane." Biotechnol Prog 12(5): 645-9.

110. Kim, D. M., C. Y. Choi, J. H. Ahn, T.-W. Kim, N.-Y. Kim, l.-S. Oh, C.-G. Park (2006).

111. Development of a Rapid and Productive Cell-free Protein Synthesis System." Biotechnol. Bioprocess Eng. 11: 235-39.

112. Kim, D. M., T. Kigawa, C. Y. Choi, S. Yokoyama (1996). "A highly efficient cell-free proteinsynthesis system from Escherichia coli." Eur J Biochem 239(3): 881-6.

113. Kim, D. M. and J. R. Swartz (1999). "Prolonging cell-free protein synthesis with a novel ATPregeneration system." Biotechnol Bioeng 66(3): 180-8.

114. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2000a). "Oxalate improves protein synthesis by enhancing ATPsupply in a cell-free system derived from Escherichia coli." Biotechnol. Lett. 22:1537-42.

115. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2000b). "Prolonging cell-free protein synthesis by selectivereagent additions." Biotechnol Prog 16(3): 385-90.

116. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2001). "Regeneration of adenosine triphosphate fromglycolytic intermediates for cell-free protein synthesis." Biotechnol Bioeng 74(4): 30916.

117. Kim, D. M. and J. R. Swartz (2004). "Efficient production of a bioactive, multiple disulfidebonded protein using modified extracts of Escherichia coli." Biotechnol Bioeng 85(2): 122-9.

118. Kim, J., P. G. Klein, J. E. Mullet (1991). "Ribosomes pause at specific sites during synthesisof membrane-bound chloroplast reaction center protein Dl." J Biol Chem 266(23): 14931-8.

119. Kim, R. G. and C. Y. Choi (2000). "Expression-independent consumption of substrates incell-free expression system from Escherichia coli." J Biotechnol 84(1): 27-32.

120. Kim, R. G. and C. Y. Choi (2001). "Expression-independent consumption of substrates incell-free expression system from Escherichia coli." J Biotechnol 84(1): 27-32.

121. Kim, T. W., J. W. Keum, I. S. Oh, C. Y. Choi, H. C. Kim, D. M. Kim (2007). "An economical andhighly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source." J Biotechnol 130(4): 389-93.

122. Kim, T. W., J. W. Keum, I. S. Oh, C. Y. Choi, C. G. Park, D. M. Kim (2006). "Simple proceduresfor the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system." J Biotechnol 126(4): 554-61.

123. Kim, T. W., D. M. Kim, C. Y. Choi (2006). "Rapid production of milligram quantities ofproteins in a batch cell-free protein synthesis system." J Biotechnol 124(2): 373-80.

124. Klammt, С., F. Lohr, В. Schafer, W. Haase, V. Dotsch, H. Ruterjans, C. Glaubitz, F. Bernhard2004). "High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins." Eur J Biochem 271(3): 568-80.

125. Klammt, C., D. Schwarz, F. Lohr, B. Schneider, V. Dotsch, F. Bernhard (2006). "Cell-freeexpression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein." Febs J 273(18): 4141-53.

126. Knapp, K. G., A. R. Goerke, J. R. Swartz (2007). "Cell-free synthesis of proteins that requiredisulfide bonds using glucose as an energy source." Biotechnol Bioeng 97(4): 901-8.

127. Knapp, K. G. and J. R. Swartz (2004). "Cell-free production of active E. coli thioredoxinreductase and glutathione reductase." FEBS Lett 559(1-3): 66-70.

128. Knapp, K. G. and J. R. Swartz (2007). "Evidence for an additional disulfide reductionpathway in Escherichia coli." J Biosci Bioeng 103(4): 373-6.

129. Kodama, K., S. Fukuzawa, H. Nakayama, T. Kigawa, K. Sakamoto, T. Yabuki, N. Matsuda, M.

130. Shirouzu, K. Takio, K. Tachibana, S. Yokoyama (2006). "Regioselective carbon-carbon bond formation in proteins with palladium catalysis; new protein chemistry by organometallic chemistry." Chembiochem 7(1): 134-9.

131. Ко lb, V. A., E. V. Makeyev, A. Kommer, A. S. Spirin (1995). "Cotranslational folding ofproteins." Biochem Cell Biol 73(11-12): 1217-20.

132. Kolb, V. A., E. V. Makeyev, A. S. Spirin (1994). "Folding of firefly luciferase duringtranslation in a cell-free system." Embo J 13(15): 3631-7.

133. Kolb, V. A., E. V. Makeyev, A. S. Spirin (2000). "Co-translational folding of an eukaryoticmultidomain protein in a prokaryotic translation system." J Biol Chem 275(22): 16597601.

134. Komar, A. A., A. Kommer, I. A. Krasheninnikov, A. S. Spirin (1993). "Cotranslational hemebinding to nascent globin chains." FEBS Lett 326(1-3): 261-3.

135. Komar, A. A., A. Kommer, I. A. Krasheninnikov, A. S. Spirin (1997). "Cotranslational foldingof globin." J Biol Chem 272(16): 10646-51.

136. Krasheninnikov, I. A., A. A. Komar, I. A. Adzhubei (1991). "Nonuniform size distribution ofnascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a contranslational protein-folding model." J Protein Chem 10(5): 445-53.

137. Krogh, A., B. Larsson, G. von Heijne, E. L. Sonnhammer (2001). "Predicting transmembraneprotein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes." J Mol Biol 305(3): 567-80.

138. Kudlicki, W., J. Chirgwin, G. Kramer, B. Hardesty (1995). "Folding of an enzyme into anactive conformation while bound as peptidyl-tRNA to the ribosome." Biochemistry 34(44): 14284-7.

139. Kudlicki, W., G. Kramer, B. Hardesty (1992). "High efficiency cell-free synthesis of proteins:refinement of the coupled transcription/translation system." Anal Biochem 206(2): 38993.

140. Kuem, J. W., T. W. Kim, C. G. Park, C. Y. Choi, D. M. Kim (2006). "Oxalate enhances proteinsynthesis in cell-free synthesis system utilizing 3-phosphoglycerate as energy source." J Biosci Bioeng 101(2): 162-5.

141. Kung, H. F„ B. Redfield, В. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears, H. Weissbach (1977). "DNAdirected in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors." J Biol Chem 252(19): 6889-94.

142. Kung, H. F., B. Redfield, H. Weissbach (1979). "DNA-directed in vitro synthesis of betagalactosidase. Purification and characterization of stimulatory factors in an ascites extract." J Biol Chem 254(17): 8404-8.

143. Kuruma, У., K. Nishiyama, Y. Shimizu, M. Muller, T. Ueda (2005). "Development of aminimal cell-free translation system for the synthesis of presecretory and integral membrane proteins." Biotechnol Prog 21(4): 1243-51.

144. Kwon, Y. C., G. H. Hahn, К. M. Huh, D. M. Kim (2008). "Synthesis of functional proteinsusing Escherichia coli extract entrapped in calcium alginate microbeads." Anal Biochem 373(2): 192-6.

145. Lamborg, M. R. and P. C. Zamecnik (1960). "Amino acid incorporation into protein byextracts of E. coli." Biochim Biophys Acta 42: 206-11.

146. Lee, К. H., H. A. Joung, J. H. Ahn, К. O. Kim, I. S. Oh, Y. B. Shin, M. G. Kim, D. M. Kim (2007).

147. Real-time monitoring of cell-free protein synthesis on a surface plasmon resonance chip." Anal Biochem 366(2): 170-4.

148. Leutzinger, Y. and S. Beychok (1981). "Kinetics and mechanism of heme-induced refoldingof human alpha-globin." Proc Natl Acad Sci U S A 78(2): 780-4.

149. Li, H., M. Inoue, T. Yabuki, M. Aoki, E. Seki, T. Matsuda, E. Nunokawa, Y. Motoda, A.

150. Kobayashi, T. Terada, M. Shirouzu, S. Koshiba, Y. J. Lin, P. Guntert, H. Suzuki, Y. Hayashizaki, T. Kigawa, S. Yokoyama (2005). "Solution structure of the mouse enhancer of rudimentary protein reveals a novel fold." J Biomol NMR 32(4): 329-34.

151. Lin, L., G. N. DeMartino, W. C. Greene (1998). "Cotranslational biogenesis of NF-kappaBp50 by the 26S proteasome." CeN 92(6): 819-28.

152. Littlefield, J. W., E. B. Keller, J. Gross, P. C. Zamecnik (1955). "Studies on cytoplasmicribonucleoprotein particles from the liver of the rat." J Biol Chem 217(1): 111-23.

153. Liu, D. V., J. F. Zawada, J. R. Swartz (2005). "Streamlining Escherichia coli S30 extractpreparation for economical cell-free protein synthesis." Biotechnol Prog 21(2): 460-5.

154. Lockard, R. E., B. Alzner-Deweerd, J. E. Heckman, J. MacGee, M. W. Tabor, U. L.

155. RajBhandary (1978). "Sequence analysis of 5'32P. labeled mRNA and tRNA using polyacrylamide gel electrophoresis." Nucleic Acids Res 5(1): 37-56.

156. Luisi, P. L. (2002). "Toward the engineering of minimal living cells." Anat Rec 268(3): 20814.

157. Maeda, Т., M. Inoue, S. Koshiba, T. Yabuki, M. Aoki, E. Nunokawa, E. Seki, T. Matsuda, Y.

158. Makeyev, E. V., V. A. Kolb, A. S. Spirin (1996). "Enzymatic activity of the ribosome-boundnascent polypeptide." FEBS Lett 378(2): 166-70.

159. Malkin, L. I. and A. Rich (1967). "Partial resistance of nascent polypeptide chains toproteolytic digestion due to ribosomal shielding." J Mol Biol 26(2): 329-46.

160. Marcus, A., D. Efron, D. P. Weeks (1974). "The wheat embryo cell-free system." Methods1. Enzvmol 30(0): 749-54.

161. Marcus, A., B. Luginbill, J. Feeley (1968). "Polysome formation with tobacco mosaic virus

162. RNA." Proc Natl Acad Sci U S A 59(4): 1243-50.

163. Martemyanov, К. A., V. A. Shirokov, О. V. Kurnasov, A. T. Gudkov, A. S. Spirin (2001). "Cellfree production of biologically active polypeptides: application to the synthesis of antibacterial peptide cecropin." Protein Expr Purif 21(3): 456-61.

164. Martin, G. A., R. Kawaguchi, Y. Lam, A. DeGiovanni, M. Fukushima, W. Mutter (2001).

165. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system." Biotechniques 31(4): 948-50, 952-3.

166. Matsuura, Т., H. Yanagida, J. Ushioda, I. Urabe, T. Yomo (2007). "Nascent chain, mRNA, andribosome complexes generated by a pure translation system." Biochem Biophys Res Commun 352(2): 372-7.

167. Maurer, P., A. Moratzky, C. Fecher-Trost, V. Flockerzi, U. Lenk, T. Sommer, C. Volzing, R.

168. Zimmermann (2003). Cell-free synthesis of membrane proteins on a preparative scale. Cell-free protein expression. J. R. Swartz. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag: 133-39.

169. McCarthy, J. E., W. Sebald, G. Gross, R. Lammers (1986). "Enhancement of translationalefficiency by the Escherichia coli atpE translational initiation region: its fusion with two human genes." Gene 41(2-3): 201-6.

170. McLaren, R. S., S. F. Newbury, G. S. Dance, H. C. Causton, C. F. Higgins (1991). "mRNAdegradation by processive 3'-5' exoribonucleases in vitro and the implications for prokaryotic mRNA decay in vivo." J Mol Biol 221(1): 81-95.

171. McQuillen, K., R. B. Roberts, R. J. Britten (1959). "Synthesis of Nascent Protein by

172. Ribosomes in Escherichia Coli." Proc Natl Acad Sci U S A 45(9): 1437-47.

173. Merrick, W. C. (1983). "Translation of exogenous mRNAs in reticulocyte lysates." Methods1. Enzvmol 101:606-15.

174. Michel-Reydellet, N., K. Calhoun, J. Swartz (2004). "Amino acid stabilization for cell-freeprotein synthesis by modification of the Escherichia coli genome." Metab Eng 6(3): 197203.

175. Michel-Reydellet, N., К. Woodrow, J. Swartz (2005). "Increasing PCR fragment stability andprotein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts." J Mol Microbiol Biotechnol 9(1): 26-34.

176. Morita, E. H., T. Sawasaki, R. Tanaka, Y. Endo, T. Kohno (2003). "A wheat germ cell-freesystem is a novel way to screen protein folding and function." Protein Sci 12(6): 121621.

177. Mouat, M. F. (2000). "Dihydrofolate influences the activity of Escherichia coli dihydrofolatereductase synthesised de novo." Int J Biochem Cell Biol 32(3): 327-37.

178. Mullet, J. E., P. G. Klein, R. R. Klein (1990). "Chlorophyll regulates accumulation of theplastid-encoded chlorophyll apoproteins CP43 and D1 by increasing apoprotein stability." Proc Natl Acad Sci U S A 87(11): 4038-42.

179. Murtas, G., Y. Kuruma, P. Bianchini, A. Diaspro, P. L. Luisi (2007). "Protein synthesis inliposomes with a minimal set of enzymes." Biochem Biophys Res Commun 363(1): 12-7.

180. Nemetz, C., S. Wessner, S. Krupka, M. Watzele, W. Mutter (2002). Cell-free expression ofsoluble human erythropoietin. Cell-free translation systems. A. S. Spirin. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag: 157-163.

181. Netzer, W. J. and F. U. Hartl (1997). "Recombination of protein domains facilitated by cotranslational folding in eukaryotes." Nature 388(6640): 343-9.

182. Nicola, A. V., W. Chen, A. Helenius (1999). "Co-translational folding of an alphavirus capsidprotein in the cytosol of living cells." Nat Cell Biol 1(6): 341-5.

183. Nirenberg, M. W. (1963). "Cell-free protein synthesis directed by messenger RNA."1. Methods Enzvmol. 6:17-23.

184. Nirenberg, M. W. and J. H. Matthaei (1961). "The dependence of cell-free protein synthesisin E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides." Proc Natl Acad Sci U S A 47:1588-602.

185. Nishimura, N., Y. Kitaoka, A. Mimura, Y. Takahara (1993). "Continuous protein synthesissystem with Escherichia coli S30 extract containing endogenous T7 RNA polymerase." Biotechnol. Lett. 15: 785-90.

186. Nishimura, N., Y. Kitaoka, M. Niwano (1995). "Cell-free system derived from heat-shocked

187. Escherichia coli: Synthesis of enzyme protein possessing higher specific activity." J. Ferment. Bioeng. 79:131-35.

188. Noireaux, V. and A. Libchaber (2004). "A vesicle bioreactor as a step toward an artificialcell assembly." Proc Natl Acad Sci U S A 101(51): 17669-74.

189. Noren, C. J., J. Spencer, S. J. Anthony-Cahill, M. C. Griffith, P. G. Schultz (1989). "A generalmethod for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins." Science 244(4901): 182-8.

190. Oberholzer, Т., К. H. Nierhaus, P. L. Luisi (1999). "Protein expression in liposomes."

191. Biochem Biophys Res Commun 261(2): 238-41.

192. Ohashi, H., Y. Shimizu, B. W. Ying, T. Ueda (2007). "Efficient protein selection based onribosome display system with purified components." Biochem Biophys Res Commun 352(1): 270-6.

193. Olins, P. O. and S. H. Rangwala (1989). "A novel sequence element derived frombacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli." J Biol Chem 264(29): 16973-6.

194. Palmiter, R. D., J. Gagnon, K. A. Walsh (1978). "Ovalbumin: a secreted protein without atransient hydrophobic leader sequence." Proc Natl Acad Sci U S A 75(1): 94-8.

195. Pavlov, M. Y. and M. Ehrenberg (1996). "Rate of translation of natural mRNAs in anoptimized in vitro system." Arch Biochem Biophys 328(1): 9-16.

196. Pelham, H. R. and R. J. Jackson (1976). "An efficient mRNA-dependent translation systemfrom reticulocyte lysates." Eur J Biochem 67(1): 247-56.

197. Peters, Т., Jr. and L. K. Davidson (1982). "The biosynthesis of rat serum albumin. In vivostudies on the formation of the disulfide bonds." J Biol Chem 257(15): 8847-53.

198. Peterson, E. A. and D. M. Greenberg (1952). "Characteristics of the amino acidincorporating system of liver homogenates." J Biol Chem 194(1): 359-75.

199. Phillips, D. (1967). "The hen egg-white lysozyme molecule." Proc Natl Acad Sci U S A 57(2):484.95.

200. Pratt, J. M. (1984). Coupled transcription translation in prokaryotic cell-free systems.

201. Transcription and translation : a practical approach. B. D. Hames and S. J. Higgins. Oxford ; Washington, D.C., IRL Press: 179-209.

202. Qi, H., Y. Shimizu, T. Ueda (2007). "Ribosomal protein SI is not essential for the transtranslation machinery." J Mol Biol 368(3): 845-52.

203. Ramaswamy, К., H. Saito, H. Murakami, K. Shiba, H. Suga (2004). "Designer ribozymes:programming the tRNA specificity into flexizyme." J Am Chem Soc 126(37): 11454-5.

204. Rich, A., J. Warner, H. M. Goodman (1963). "The structure and function of polyribosomes."

205. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28: 269-85.

206. Roberts, В. E. and В. M. Paterson (1973). "Efficient translation of tobacco mosaic virus RNAand rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ." Proc Natl Acad Sci USA70(8): 2330-4.

207. Roberts, R. В., Ed. (1958). Microsomal Particles and Protein Synthesis. New York,1. Pergamon Press.

208. Ryabova, L., E. Volianik, O. Kurnasov, A. Spirin, Y. Wu, F. R. Kramer (1994). "Coupledreplication-translation of amplifiable messenger RNA. A cell-free protein synthesis system that mimics viral infection." J Biol Chem 269(2): 1501-5.

209. Ryabova, L. A., D. Desplancq, A. S. Spirin, A. Pluckthun (1997). "Functional antibodyproduction using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones." Nat Biotechnol 15(1): 79-84.

210. Ryabova, L. A., I. Morozov, A. S. Spirin (1998). "Continuous-flow cell-free translation,transcription-translation, and replication-translation systems." Methods Mol Biol 77: 179-93.

211. Ryabova, L. A., S. A. Ortlepp, V. I. Baranov (1989). "Preparative synthesis of globin in acontinuous cell-free translation system from rabbit reticulocytes." Nucleic Acids Res 17(11): 4412.

212. Ryabova, L. А., О. M. Selivanova, V. I. Baranov, V. D. Vasiliev, A. S. Spirin (1988). "Does thechannel for nascent peptide exist inside the ribosome? Immune electron microscopy study." FEBS Lett 226(2): 255-60.

213. Ryabova, L. A., L. M. Vinokurov, E. A. Shekhovtsova, Y. B. Alakhov, A. S. Spirin (1995).

214. Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems." Anal Biochem 226(1): 184-6.

215. Sambrook, J., E. F. Fritsch, T. Maniatis (1989). Molecular cloning : a laboratory manual.

216. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

217. Sawasaki, Т., Y. Hasegawa, M. Tsuchimochi, N. Kamura, T. Ogasawara, T. Kuroita, Y. Endo2002). "A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products." FEBS Lett 514(1): 102-5.

218. Sawasaki, Т., Т. Ogasawara, R. Morishita, Y. Endo (2002). "A cell-free protein synthesissystem for high-throughput proteomics." Proc Natl Acad Sci USA 99(23): 14652-7.

219. Schagger, H. and G. von Jagow (1987). "Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa." Anal Biochem 166(2): 368-79.

220. Schweet, R., H. Lamfrom, E. Allen (1958). "The Synthesis of Hemoglobin in a Cell-Free

221. System." Proc Natl Acad Sci U S A 44(10): 1029-35.

222. Selmer, M. and A. Liljas (2008). "Exit biology: battle for the nascent chain." Structure 16(4):498.500.

223. Shimizu, Y., A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa, T. Ueda (2001). "Cellfree translation reconstituted with purified components." Nat Biotechnol 19(8): 751-5.

224. Shimizu, Y., Y. Kuruma, B. W. Ying, S. Umekage, T. Ueda (2006). "Cell-free translationsystems for protein engineering." FebsJ 273(18): 4133-40.

225. Shine, J. and L. Dalgarno (1974). "The З'-terminal sequence of Escherichia coli 16Sribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites." Proc Natl AcadSciUSA 71(4): 1342-6.

226. Shirokov, V. A., A. Kommer, V. A. Kolb, A. S. Spirin (2007). "Continuous-exchange proteinsynthesizing systems." Methods Mol Biol 375:19-55.

227. Shishkov, A. V., E. S. Filatov, E. F. Simonov, M. S. Unukovich, V. I. Gol'danskii (1976).

228. Preparation of tritium-labeled biologically active compounds." Dokl Akad Nauk SSSR 228(5): 1237-9.

229. Siekevitz, P. (1952). "Uptake of radioactive alanine in vitro into the proteins of rat liverfractions." J Biol Chem 195(2): 549-65.

230. Sitaraman, K., D. Esposito, G. Klarmann, S. F. Le Grice, J. L. Hartley, D. K. Chatterjee (2004).

231. A novel cell-free protein synthesis system." J Biotechnol 110(3): 257-63.

232. Smith, W. P., P. C. Tai, B. D. Davis (1978). "Interaction of secreted nascent chains withsurrounding membrane in Bacillus subtilis." Proc Natl Acad Sci U S A 75(12): 5922-5.

233. Spirin, A. S. (1991). Cell-free protein synthesis bioreactor. Frontiers in Bioprocessing II P.

234. Todd, S. K. Sikdar and M. Beer. Washington, D.C, American Chemical Society: 1-43.

235. Spirin, A. S. (2002). Cell-free translation systems. Berlin, Heidelberg, New York, Springer1. Verlag.

236. Spirin, A. S. (2004). "High-throughput cell-free systems for synthesis of functionally activeproteins." Trends Biotechnol 22(10): 538-45.

237. Spirin, A. S., V. I. Baranov, L. A. Ryabova, S. Y. Ovodov, Y. B. Alakhov (1988). "A continuouscell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield." Science 242(4882): 1162-4.

238. Spirin, A. S. and J. R. Swartz (2008). Cell-free protein synthesis systems: historicallandmarks, classification, and general methods. Cell-free protein synthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 1-34.

239. Svetlov, M. S., A. Kommer, V. A. Kolb, A. S. Spirin (2006). "Effective cotranslational foldingof firefly luciferase without chaperones of the Hsp70 family." Protein Sci 15(2): 242-7.

240. Tate, C. G. (2001). "Overexpression of mammalian integral membrane proteins forstructural studies." FEBS Lett 504(3): 94-8.

241. Tissieres, A., D. Schlessinger, F. Gros (1960). "Amino Acid Incorporation into Proteins by

242. Escherichia Coli Ribosomes." Proc Natl Acad Sci USA 46(11): 1450-63.

243. Tohda, H., N. Chikazumi, T. Ueda, K. Nishikawa, K. Watanabe (1994). "Efficient expressionof E. coli dihydrofolate reductase gene by an in vitro translation system using phosphorothioate mRNA." J Biotechnol 34(1): 61-9.

244. Udagawa, Т., Y. Shimizu, T. Ueda (2004). "Evidence for the translation initiation ofleaderless mRNAs by the intact 70 S ribosome without its dissociation into subunits in eubacteria." J Biol Chem 279(10): 8539-46.

245. Ueda, T. (2008). The constructive approach for cell-free translation. Cell-free proteinsynthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 35-50.

246. Ueda, Т., H. Tohda, N. Chikazumi, F. Eckstein, K. Watanabe (1991). "Phosphorothioatecontaining RNAs show mRNA activity in the prokaryotic translation systems in vitro." Nucleic Acids Res 19(3): 547-52.

247. Ugarov, V. I., I. Morozov, G. Y. Jung, A. B. Chetverin, A. S. Spirin (1994). "Expression andstability of recombinant RQ-mRNAs in cell-free translation systems." FEBS Lett 341(1): 131-4.

248. Uzawa, Т., A. Yamagishi, T. Ueda, N. Chikazumi, K. Watanabe, T. Oshima (1993). "Effects ofpolyamines on a continuous cell-free protein synthesis system of an extreme thermophile, Thermus thermophilus." J. Biochem. (Jpn.) 114: 732-34.

249. Vinarov, D. A., B. L. Lytle, F. C. Peterson, E. M. Tyler, B. F. Volkman, J. L. Markley (2004).

250. Cell-free protein production and labeling protocol for NMR-based structural proteomics." Nat Methods 1(2): 149-53.

251. Voloshin, A. M. and J. R. Swartz (2005). "Efficient and scalable method for scaling up cellfree protein synthesis in batch mode." Biotechnol Bioeng 91(4): 516-21.

252. Voloshin, A. M. and J. R. Swartz (2008). Large-scale batch reactions for cell-free proteinsynthesis. Cell-free protein synthesis : methods and protocols. A. S. Spirin and J. R. Swartz. Weinheim, Wiley-VCH: 207-235.

253. Volyanik, E. V., A. Dalley, I. A. McKay, I. Leigh, N. S. Williams, S. A. Bustin (1993). "Synthesisof preparative amounts of biologically active interleukin-6 using a continuous-flow cell-free translation system." Anal Biochem 214(1): 289-94.

254. Vorderwulbecke, S., G. Kramer, F. Merz, T. A. Kurz, T. Rauch, B. Zachmann-Brand, B. Bukau,

255. E. Deuerling (2004). "Low temperature or GroEL/ES overproduction permits growth of Escherichia coli cells lacking trigger factor and DnaK." FEBS Lett 559(1-3): 181-7.

256. Wada, Т., M. Shirouzu, T. Terada, Y. Ishizuka, T. Matsuda, T. Kigawa, S. Kuramitsu, S. Y.

257. Park, J. R. Tame, S. Yokoyama (2003). "Structure of a conserved CoA-binding protein synthesized by a cell-free system." Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59(Pt 7): 1213-8.

258. Wang, L., A. Brock, B. Herberich, P. G. Schultz (2001). "Expanding the genetic code of

259. Escherichia coli." Science 292(5516): 498-500.

260. Wang, S., H. Sakai, M. Wiedmann (1995). "NAC covers ribosome-associated nascent chainsthereby forming a protective environment for regions of nascent chains just emerging from the peptidyl transferase center." J Cell Biol 130(3): 519-28.

261. White, S. H. (2004). "The progress of membrane protein structure determination." Protein1. Sci 13(7): 1948-9.

262. Wiedmann, В., H. Sakai, T. A. Davis, M. Wiedmann (1994). "A protein complex required forsignal-sequence-specific sorting and translocation." Nature 370(6489): 434-40.

263. Winnick, T. (1950). "Studies on the mechanism of protein synthesis in embryonic andtumor tissues. II. Inactivation of fetal rat liver homogenates by dialysis, and reactivation by the adenylic acid system." Arch Biochem 28(3): 338-47.

264. Winter, J., H. Lilie, R. Rudolph (2002). "Renaturation of human proinsulin-a study onrefolding and conversion to insulin." Anal Biochem 310(2): 148-55.

265. Winterhalter, К. H., C. loppolo, E. Antonini (1971). "Distribution of heme in systemscontaining heme-free and heme-bound hemoglobin chains." Biochemistry 10(20): 37905.

266. Woodrow, К. A., I. O. Airen, J. R. Swartz (2006). "Rapid expression of functional genomiclibraries." J Proteome Res 5(12): 3288-300.

267. Woodrow, K. A. and J. R. Swartz (2007). "A sequential expression system for highthroughput functional genomic analysis." Proteomics 7(21): 3870-9.

268. Wuu, J. J. and J. R. Swartz (2008). "High yield cell-free production of integral membraneproteins without refolding or detergents." Biochim Biophys Acta.

269. Xu, Z., H. Chen, X. Yin, N. Xu, P. Cen (2005). "High-level expression of soluble human betadefensin-2 fused with green fluorescent protein in Escherichia coli cell-free system." Appl Biochem Biotechnol 127(1): 53-62.

270. Yabuki, Т., Т. Kigawa, N. Dohmae, K. Takio, T. Terada, Y. Ito, E. D. Laue, J. A. Cooper, M.

271. Kainosho, S. Yokoyama (1998). "Dual amino acid-selective and site-directed stable-isotope labeling of the human c-Ha-Ras protein by cell-free synthesis." J Biomol NMR 11(3): 295-306.

272. Yabuki, Т., Y. Motoda, K. Hanada, E. Nunokawa, M. Saito, E. Seki, M. Inoue, T. Kigawa, S.

273. Yokoyama (2007). "A robust two-step PCR method of template DNA production for high-throughput cell-free protein synthesis." J Struct Funct Genomics 8(4): 173-91.

274. Yamamoto, Y. I., H. Nagahori, S. Yao, S. T. Zhang, E. Suzuki (1996). "Hollow fiber reactor forcontinuous flow cell-free protein production." J. Chem. Eng. Jpn. 6:1047-50.

275. Yamane, Т., Y. Ikeda, T. Nagasaka, H. Nakano (2005). "Enhanced cell-free protein synthesisusing a S30 extract from Escherichia coli grown rapidly at 42 degrees С in an amino acid enriched medium." Biotechnol Prog 21(2): 608-13.

276. Yamasaki, К., T. Kigawa, M. Inoue, M. Tateno, T. Yamasaki, T. Yabuki, M. Aoki, E. Seki, T.

277. Matsuda, Y. Tomo, N. Hayami, T. Terada, M. Shirouzu, A. Tanaka, M. Seki, K. Shinozaki, S. Yokoyama (2005). "Solution structure of an Arabidopsis WRKY DNA binding domain." Plant Cell 17(3): 944-56.

278. Yang, J., G. Kanter, A. Voloshin, R. Levy, J. R. Swartz (2004). "Expression of active murinegranulocyte-macrophage colony-stimulating factor in an Escherichia coli cell-free system." Biotechnol Prog 20(6): 1689-96.

279. Yang, J., K. Kobayashi, H. Nakano, J. Tanaka, T. Nihira, Y. Yamada, T. Yamane (1999).

280. Modulator-mediated synthesis of active lipase of Pseudomonas sp. 109 by Escherichia coli cell-free coupled transcription/translation system." J Biosci Bioeng 88(6): 605-9.

281. Yin, G. and J. R. Swartz (2004). "Enhancing multiple disulfide bonded protein folding in acell-free system." Biotechnol Bioeng 86(2): 188-95.

282. Ying, B. W., H. Taguchi, M. Kondo, T. Ueda (2005). "Co-translational involvement of thechaperonin GroEL in the folding of newly translated polypeptides." J Biol Chem 280(12): 12035-40.

283. Ying, В. W., H. Taguchi, H. Ueda, Т. Ueda (2004). "Chaperone-assisted folding of a singlechain antibody in a reconstituted translation system." Biochem Biophvs Res Commun 320(4): 1359-64.

284. Ying, B. W., H. Taguchi, T. Ueda (2006). "Co-translational binding of GroEL to nascentpolypeptides is followed by post-translational encapsulation by GroES to mediate protein folding." J Biol Chem 281(31): 21813-9.

285. Yip, Y. К., M. Waks, S. Beychok (1972). "Influence of prosthetic groups on protein foldingand subunit assembly. I. Conformational differences between separated human alpha-and beta- globins." J Biol Chem 247(22): 7237-44.

286. Yokoyama, S. (2003). "Protein expression systems for structural genomics andproteomics." Curr Opin Chem Biol 7(1): 39-43.

287. Yoshida, A., S. Watanabe, J. Morris (1970). "Initiation of rabbit hemoglobin synthesis:methionine and formylmethionine at the N-terminal." Proc Natl Acad Sci U S A 67(3): 1600-7.

288. Yu, M., J. Souaya, D. A. Julin (1998). "The 30-kDa C-terminal domain of the RecB protein iscritical for the nuclease activity, but not the helicase activity, of the RecBCD enzyme from Escherichia coli." Proc Natl Acad Sci U S A 95(3): 981-6.

289. Yu, W., K. Sato, M. Wakabayashi, T. Nakaishi, E. P. Ko-Mitamura, Y. Shima, I. Urabe, T.

290. Yomo (2001). "Synthesis of functional protein in liposome." J Biosci Bioeng 92(6): 590-3.

291. Yusupov, M. M. and A. S. Spirin (1988). "Hot tritium bombardment technique for ribosomesurface topography." Methods Enzvmol 164:426-39.

292. Zarucki-Schulz, Т., С. Jerez, G. Goldberg, H. F. Kung, К. H. Huang, N. Brot, H. Weissbach1979). "DNA-directed in vitro synthesis of proteins involved in bacterial transcription and translation." Proc Natl Acad Sci U S A 76(12): 6115-9.

293. Zawada, J. and J. Swartz (2005). "Maintaining rapid growth in moderate-density

294. Escherichia coli fermentations." Biotechnol Bioeng 89(4): 407-15.

295. Zawada, J. and J. Swartz (2006). "Effects of growth rate on cell extract performance in cellfree protein synthesis." Biotechnol Bioeng 94(4): 618-24.

296. Zick, Y., M. Kasuga, C. R. Kahn, J. Roth (1983). "Characterization of insulin-mediatedphosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system." J Biol Chem 258(1): 75-80.

297. Zubay, G. (1973). "In vitro synthesis of protein in microbial systems." Annu Rev Genet 7:267.87.