Влияние наследственных мутаций на пространственную структуру и динамику трансмембранного фрагмента белка-предшественника бета-амилоида тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Урбан Анатолий Сергеевич

• Урбан Анатолий Сергеевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Урбан Анатолий Сергеевич

Цель работы

Актуальность работы

Основные задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Апробация результатов работы

Объем и структура диссертации

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Рецепторы I типа и их функциональная димеризация

1.2 Биологическая роль APP

1.3 Протеолитический процессинг APP

1.4 у-секретаза

1.5 Болезнь Альцгеймера и в-амилоид

1.6 Мономер Ав

1.7 Димер Ав

1.8 Олигомеры Ав

1.9 Взаимодействие ТМ домена APP с холестерином

1.10 Семейные мутации в сегменте Ав

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Штаммы Escherichia coli

2.1.2 В екторы и плазмиды

2.1.3 Синтетические олигонуклеотиды

2.1.4 Ферменты

2.1.5 Среды для выращивания микроорганизмов

2.1.6 Реактивы

2.1.7 Буферные системы и растворы

2.1.8 Оборудование

2.2 Методы исследования

2.2.1 Сборка экспрессионных конструкций

2.2.2 Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ

2.2.3 Подбор оптимальных условий бактериальной экспрессии

2.2.4 Культивирование клеток с целью препаративной

наработки белка

2.2.5 Очистка ТМ фрагментов АРР после продукции в бактериях

2.2.6 Бесклеточная экспрессия белка

2.2.7 Очистка белка после экспрессии в бесклеточной системе

2.2.8 Солюбилизация пептидов АРР в мембраноподобном окружении для ЯМР-исследований

2.2.9 Спектроскопия ЯМР

2.2.10 Отнесение ЯМР сигналов

2.2.11 Получение верхних ограничений на расстояния

2.2.12 Получение ограничений на двугранные углы ф и у основной цепи

2.2.13 Расчёт пространственной структуры по данным ЯМР

2.2.14 Исследование ЯМР релаксации

2.2.15 Исследование доступности полипептида растворителю

2.2.16 Спектроскопия кругового дихроизма

2.2.17 Исследование амилоидогенеза с помощью

тиофлавиновой пробы

2.2.18 Исследование взаимодействия пептида с ионами цинка

2.2.19 Исследование взаимодействия ТМ домена АРР с холестерил-гемисукцинатом, холестерином и спин-меченым аналогом холестерина

2.2.20 Молекулярная динамика в явно заданном липидном бислое.. .67 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение трансмембранных фрагментов APP

3.1.1 Бактериальная продукция и очистка ТМ фрагментов APP

3.1.2 Бесклеточная продукция и очистка ТМ фрагментов APP

3.1.3 Солюбилизация пептидов и подбор

мембраномоделирующей среды

3.1.4 Исследование вторичной структуры ТМ доменов с

помощью спектроскопии КД и флуоресцентной спектроскопии

3.1.5 Обсуждение

3.2 ЯМР исследования структуры и динамики APPmc

3.2.1 Общий ЯМР анализ. Отнесение сигналов

3.2.2 Расчёт пространственной структуры APPmc

3.2.3 Изучение взаимодействия APPmc с ионами цинка

3.2.4 Обсуждение

3.3 Исследование взаимодействия ТМ домена APP с холестерином

3.3.1 Взаимодействие APP с холестерином и

холестерил-гемисукцинатом

3.3.2 Взаимодействие APP с 3в-доксил-5а-доксилхолестаном

3.3.3 Обсуждение

3.4 Исследование влияния «Австралийской» мутации на свойства

ТМ домена APP

3.4.1 Исследование методом ЯМР

3.4.2 Проверка результатов с помощью МД моделирования

3.4.3 Обсуждение

ВВЕДЕНИЕ

Мембранные белки представляют около 30% всех белков в живых организмах. Они обеспечивают выполнением большого количества клеточных функций таких как передача сигналов, клеточная адгезия, транспорт веществ. При их участии происходит регуляция большинства биологических процессов — пролиферации, миграции, апоптоза, клеточного цикла. Ввиду их вовлеченности в столь большой спектр физиологических явлений мембранные белки являются мишенями более половины лекарственных препаратов, представленных на рынке. Эти факты порождают понятный интерес к исследованию функций и структуры мембранных белков. Однако, несмотря на огромные усилия прилагаемые научным сообществом и определённые успехи достигнутые в этой области за последнее десятилетие, мембранные белки остаются крайне трудными для изучения объектами. Так, в базе биологических структур PDB структуры мембранных белков составляют лишь около 1% от всех решённых структур. Это связано как со сложностью экспрессии и рефолдинга таких белков, так и с необходимостью создавать мембраноподобное окружение для поддержания нативной структуры и, соответственно, сохранения белка в функциональном состоянии in vitro.

Особый класс мембранных белков составляют битопные мембранные белки, т.е. имеющие одну пронизывающую мембрану трансмембранную (ТМ) спираль и внеклеточную и внутриклеточную части. Многие из них являются рецепторами, участвуя в связывании внешних лигандов и межклеточных взаимодействиях. К примерам можно отнести такие рецепторные тирозинкиназы как рецепторы инсулина, эпителиального фактора роста, фактора роста фибробластов и гормона роста. Среди них также находится предшественник белка в-амилоида, хотя до сих пор нет общепринятого мнения о его функциях как рецептора, он является битопным ТМ белком и по структурной организации напоминает типичный рецептор первого типа. В человеческом геноме закодировано около 1300 генов битопных ТМ белков.

Несмотря на высокую биологическую значимость этих рецепторов, механизмы передачи сигнала ими не полностью понятны. Одним из основных препятствий является отсутствие структур ТМ доменов, которые связывают внеклеточный лиганд-связывающий домен с внутриклеточными сигнальными платформами. На данный момент в базе данных PDB находится лишь около трёх десятков ТМ доменов битопных белков. Практически все они исследованы методом спектроскопии ЯМР. В отличие от вне- и внутриклеточных доменов короткие ТМ спирали с трудом поддаются кристаллизации, даже с использованием столь мощных инструментов как липидные кубические фазы и являются слишком подвижными для исследования методом криоэлектронной микроскопии. Таким образом, спектроскопия ЯМР высокого разрешения является уникальным методом, позволяющим исследовать ТМ домены в мембраномоделирующем окружении [1]. Особенно важно то, что спектроскопия ЯМР позволяет получить детальную информацию о конформации и, что особенно важно, динамике, внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействиях каждого аминокислотного остатка в ТМ домене, так как составляя лишь около 25 аминокислот, в длину он несёт огромную функциональную нагрузку.

Цель работы

Целью данной работы является исследование структурно-динамических характеристик ТМ домена с примембранными регионами белка-предшественника в-амилоида с примембранным и металл-связывающим участками как дикого типа так и его мутантных форм, а также исследование его взаимодействия с холестерином и ионами цинка.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние наследственных мутаций на пространственную структуру и динамику трансмембранного фрагмента белка-предшественника бета-амилоида»

Актуальность работы

Нейродегенеравтивные заболевания по данным ВОЗ являются третьей по распространённости причиной смерти в развитых странах [2]. Большая часть случаев нейродегенеративных заболеваний приходится на болезнь Альцгеймера (БА) и Альцгеймер-подобные патологии. Среди десяти заболеваний, приводящих к наибольшему числу смертей в год БА — единственное для которого не разработаны стратегии позволяющие его вылечить или замедлить прогрессирование, а суммарный моровой экономический ущерб от БА превышает 1 миллиард долларов в год [3].

Болезнь Альцгеймера на сегодня является наиболее распространённым

нейродегенеративным заболеванием. Заболевание характеризуется

накоплением в нервной ткани белковых агрегатов — нейрофибриллярных

клубков, амилоидных бляшек и фибрилл. Именно эти изменения используются

для ранней диагностики БА [4]. Фибриллы состоят из пептидов длины 35-53

аминокислотных остатков, которые являются продуктами протеолиза белка-

предшественника в-амилоида (АРР). Ряд мутаций, ассоциированных с

развитием ранней формы БА находятся в последовательности ТМ домена АРР

[5]. Кроме того, повышенный уровень холестерина также был ассоциирован с

риском развития БА [6]. Несмотря на то, что многие признаки указывают на

вовлеченность бета амилоидных пептидов и АРР, детальный механизм

воздействия этих пептидов на организм до сих пор не известен. Для описания

роли АРР и бета амилоидных пептидов в патогенезе БА необходимо

7

проведение фундаментальных исследований их свойств, включая структурно-динамические исследования ТМ домена АРР дикой и мутантных форм, а также его взаимодействия с холестерином, что и является целью данной работы.

Основные задачи исследования

Для осуществления основной цели данного исследования — проведения структурно-динамических исследований ТМ домена APP и его мутантных форм, а также изучения взаимодействия ТМ домена APP с холестерином были решены следующие задачи:

1. Разработка системы экспрессии в клетках E. coli, а также в бесклеточной системе экспрессии, позволяющей получать изотопно-меченые ТМ домены APP.

2. Получение миллиграммовых количеств изотопно-меченого ТМ домена APP с примембранным и катион-связывающим сайтом, а также его мутантных форм.

3. Подбор мембраномоделирующей среды и метода солюбилизации ТМ домена APP.

4. Получение спектров ЯМР и отнесение сигналов основной цепи и боковых цепей ТМ домена APP с примембранным и катион-связывающим доменами.

5. Исследование взаимодействия APP с примембранным и катион-связывающим доменами с ионами цинка и его влияния на конформацию ТМ спирали и димеризацию.

6. Исследование структурно-динамических характеристик мутантных форм ТМ домена APP.

7. Исследование взаимодействия ТМ домена APP с холестерином.

Научная новизна

В ходе работы были отработаны метода получения миллиграммовых

количеств ТМ доменов APP, в том числе с введением изотопных меток. Это

позволяет проводить исследования взаимодействия таких пептидов с

различными лигандами и влияния условий среда на конформацию ТМ домена.

Определена пространственная структура ТМ домена APP с примембранным и

9

катион-связывающим доменом. Показано, что связывание ионов цинка не влияет на конформацию димера ТМ домена APP. Показано взаимодействие ТМ домена APP с холестерил-гемисукцинатом в мицеллах ДФХ и смешанных бицеллах ДМФХ/ДГФХ и определены остатки, принимающие участие в этом взаимодействии в обеих средах. Впервые описаны отличия ТМ домена L723P от ТМ домена дикого типа на структурно динамическом уровне.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе выполнения данной работы был разработан метод получения миллиграммовых количеств ТМ домена APP с примембранным и катион-связывающим регионами, в том числе с введёнными изотопными метками, что необходимо для проведения структурно-динамических исследований методом спектроскопии ЯМР. Была определена пространственная структура ТМ домена с примембранным и катион связывающим регионами, а также показано взаимодействие катион-связывающего региона с ионами цинка. Также исследовано влияние патогенной мутации L723P, ассоциированной с семейной формой ранней БА, на структурно-динамические свойства ТМ домена APP и определены альтернативные сайты его взаимодействия с холестерином. Вместе эти результаты вносят вклад в исследование фундаментальных основ патогенеза БА и послужат опорой для разработки методов её диагностики и лечения.

Методология и методы исследования

В ходе работы применялись следующие методы:

• Создание экспрессионных конструкций методами генетической инженерии.

• Получение рекомбинантных белков в клетках E. coli и в бесклеточной системе экспрессии, в том числе с введением изотопных меток.

• Выделение и отчистка белков с помощью металл-хелатной аффинной, ионообменной, обращённо-фазовой и гель-фильтрационной хроматографии.

• Солюбилизация ТМ пептидов в мембраномоделирующем окружении.

• Получение одномерных и двух- и трёхмерных гомо- и гетероядерных спектров ЯМР высокого разрешения.

• Анализ спектров ЯМР: отнесение сигналов и получение ограничений на межъядерные расстояния и двугранные углы.

• Расчёт пространственной структуры по данным спектроскопии ЯМР

• Измерение уширения сигналов, вызванного парамагнитной меткой и анализ полученных данных

• Различные биофизические и биохимические методы: гель-электрофорез белков и нуклеиновых кислот, спектрофотометрия, спектроскопия кругового дихроизма.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод получения миллиграммовых количеств ТМ доменов APP, в том числе с введением изотопных меток.

2. Пространственная структура ТМ домена APP с примембранным и катион-связывающим доменом.

3. Взаимодействие ТМ домена APP с примембранным и катион-связывающим доменом с ионами цинка.

4. Структурно-динамические особенности мутантной формы ТМ домена APP L723P.

5. Взаимодействие ТМ домена APP с 3-^-доксил-5-а-доксилхолестаном в мицеллах ДФХ и смешанных бицеллах ДМФХ/ДГФХ.

Апробация результатов работы

По теме диссертации опубликовано 5 статей в российских и международных журналах, индексируемых Web of Science, Scopus, РИНЦ, а также 22 докладов на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертация включает введение, обзор литературы, описание применявшихся материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения и списка литературных источников. Работа изложена на 143 страницах, содержит 44 рисунка и 3 таблицы. Список литературных источников включает 228 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Рецепторы I типа и их функциональная димеризация

а-спиральные мембранные белки являются основным классом мембранных белков. Они принимают участие в ключевых процессах жизнедеятельности клетки, включая биоэнергетику, передача сигнала, ионную проводимость, катализ и многие другие. Такие белки являются мишенью около 50% лекарственных препаратов, присутствующих сегодня на рынке [7]. На данный момент в человеческом геноме описано более 1300 таких белков [8]. Этот класс белков характеризуется наличием гидрофобных участков с ~20-25 аминокислотами, находящихся в а-спиральной конформации которые пронизывают клеточную мембрану. Такие белки бывают простыми — включающими лишь одну или несколько ТМ спиралей, так и представляющими собой большие олигомерные комплексы, состоящие из многих, до десятков, ТМ спиралей.

Механизмы нативного фолдинга спиральных ТМ белков только сейчас начинают изучаться с использованием ансамбля структурных и биологических методов. Особую роль в их фолдинге играет взаимодействие пар ТМ спиралей, и путём изучения комплексов таких белков является разбиение всего белка на пары взаимодействующих спиралей, которые вместе с соединяющими их петлями, внеклеточными и внутриклеточными доменами образуют полную структуру. Взаимодействие между ТМ спиралями представляет большой интерес, потому что оно напрямую определяет биологическую активность мембранных белков, таких как ионные каналы, G-белок сопряжённые рецепторы, рецепторные протеинкиназы, иммунные рецепторы и апоптотические белки. Усиление либо ослабление этих взаимодействий может привести ко многим заболеваниям (порокам развития, онкогенным, нейродегенеративным, иммунные, сердечно-сосудистым и т. д.), которые

связаны с дисфункцией различных тканей в организме человека и создание новых типов препаратов, нацеленных на мембранные белки, требует детальной структурной информации об этом классе объектов.

Функциональная активность битопных белков в основном связана с их латеральной димеризацией, то есть димеризацией ТМ спиралей в плоскости мембраны [9]. Так, большинство рецепторных киназ и иммунных рецепторов являются битопными белками. Они участвуют в передаче сигнала внутрь клетки и активации многих сигнальных каскадов, регулируя пролиферацию, адгезию, дифференцировку и множество других биологических процессов. В данный момент не существует метода, дающего возможность получать структуры высокого разрешения полноразмерных битопных белков. Использованию для этой цели рентгеноструктурного анализа препятствует трудность получения кристаллов мембранных белков, а спектроскопия ЯМР высокого разрешения не позволяет полноценно работать с белками с большим весом и низкой подвижностью в растворе. Кристаллографические методы, которые недавно позволили получить структуры высокого разрешения мультитопных ТМ рецепторов, таких как G-белок сопряжённые рецепторы, не могут быть напрямую применены для изучения гибких доменов битопных рецепторов, имеющих множество функциональных состояний, таких как рецепторные киназы и иммунные рецепторы. Поэтому структурно-динамические свойства внеклеточной, цитоплазматической и мембранной частей битопных белков до сих пор изучаются отдельно. Функциональной единицей рецепторов I типа является комплекс, состоящий из двух или более одинаковых, или разных полипептидных цепей. Каждая полипептидная цепь состоит из нескольких регионов, разделённых мембраной на три ярко выраженных домена: внеклеточный домен, трансмембранный (ТМ) домен и внутриклеточный домен. Самым большим из них является внеклеточный домен, внутриклеточные домены, как правило, имеют меньший размер и менее консервативны. Самым маленьким и наиболее консервативным является ТМ домен, типично состоящий из 25 аминокислотных остатков [10]. Внеклеточные

домены являются глобулярными, растворимыми полипептидами и именно они наиболее хорошо охарактеризованы, в то же время внутриклеточные домены часто проявляют свойства белков с внутренней неупорядоченностью (IDP, intrinsically disordered proteins) [11].

Точный механизм передачи сигнала рецепторами первого типа до сих пор полностью не охарактеризован. По современным представлениям, передача сигнала осуществляется с помощью лиганд-индуцированной гомо- и гетеродимеризации [12,13], а также за счёт переключения мотива димеризации в уже димеризованном рецепторе при связывании лиганда [14,15]. Высокая конформационная подвижность, связанная с таким механизмом активации, позволяет битопным рецепторам за счёт лишь небольших локальных конформационных перестроек приводить к активации больших и сложных клеточных событий. Однако, это же свойство, наряду с присутствием в структуре элементов с очень разными характеристиками — растворимые домены, трансмембранные домены, IDP-подобные домены — делает такие белки крайне сложными объектами для структурных исследований [16], и на данный момент не получено ни одной структуры полноразмерного рецептора первого типа. Ввиду этого при исследовании рецепторов I типа, как правило, в соответствии с подходом «разделяй и властвуй», последовательность белка разделяют на домены каждый из которых исследуется отдельно. В нескольких исследованиях было показано, что ТМ а-спирали сохраняют свой фолд будучи отделёнными от остальных доменов [17-20]. Так как, с механистичной точки зрения, изменение конформационного состояния ТМ домена рецепторов I типа является естественным и единственным способом передачи сигнала с внеклеточной стороны через мембрану, их изучение является абсолютно необходимым для понимания механизмов действия этих рецепторов. В пользу этой точки зрения также свидетельствует наличие большого числа мутаций в ТМ доменах ассоциированных с развитием различных заболеваний [5,21,22].

Несмотря на то, что в базе данных PDB >90% структур получены методами рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии,

почти все известные на данный момент структуры ТМ доменов рецепторов первого типа определены методом спектроскопии ЯМР в растворе. Это объясняется невозможностью кристаллизовать ТМ домены с помощью текущих методов получения кристаллов белков, а также относительной доступностью таких небольших полипептидов для изучения методом спектроскопии ЯМР, при использовании соответствующих мембранных миметиков, обеспечивающих размер частицы миметик+пептид меньше 100 кДа — мицелл, бицелл и липид-белковых нанодисков.

Ряд мономерных структур, полученных методом спектроскопии ЯМР в растворе, представлен на Рисунке 1.

Рисунок 1 Ряд мономерных структур рецепторов I типа. Синим прямоугольником обозначен углеводородный сегмент мембраны толщиной Аминокислотные остатки

гидрофобной природы — серые, полярной — зелёные, положительно заряженные — красные, отрицательно заряженные — синие. Остатки цистеина, глицина и пролина — оранжевые. (Л) мышиный (т) EPOR-TMD (2MXB), (В) EPOR-TMD (2^6), (С) PRLR-TMD (2ШГ), (Э) ГО.-ТМВ (2MFR), (Е) ErbB1-TMD (2N5S), mErbB2-TMD (1ПД), (G) Integrin aI-TMD (2L8S), (Н) Integrin b3-TMD (2RMZ), (I) Integrin aПb-TMD (2К1Л), (Д)

Все структуры состоят из одной основной а-спирали включающей 24-35 аминокислотных остатков. Ряд структур, например, CD4, ЕгЬВ1, тЕгЬЬ2 также включают небольшую примембранную С-концевую а-спираль из 7-10 аминокислотных остатков. Все структуры кроме ТМ домена АРР имеют небольшую кривизну, в то время как АРР имеет трансмембранный изгиб

примерно 30°, вызванный наличием Gly-Gly пары.

Метод ЯМР-спектроскопии в растворе также позволяет определять структуры димеров ТМ доменов. Ряд таких структур представлен на Рисунке 2.

Рисунок 2 Ряд структур гомодимеров ТМ доменов рецепторов I типа. Правозакрученные димеры показаны на двух верхних панелях, а левозакрученные на двух нижних панелях. Синим прямоугольником обозначен углеводородный сегмент мембраны толщиной Аминокислотные остатки гидрофобной природы — серые, полярной — зелёные, положительно заряженные — красные, отрицательно заряженные — синие. Остатки цистеина, глицина и пролина — оранжевые. Стик-диаграммами прорисованы остатки участвующие в межспиральном взаимодействии. (А) APP-TMD (2LZ3), (В) TLR3-TMD (2МК9), (С) GpA-TMD (1АБО), ф) GpA-TMD (2КРБ), (Е) EphA1-TMD (2КШ), (Б) ЕгЬВ1-TMD (2М20), ErЬB1-TMD (2М0В), (Н) ErЬB2-TMD (2.Г№А), (I) ErЬB2-TMD (2N2A), (I)

ErbB4-TMD ^СХ), (К) VEGFR2-TMD (2M59), (L) PDGFR-TMD (2L6W), (M) FGFR3-TMD (2LZL), (К) ErbB3-TMD (2L9U), (О) ff-TMD (2НЛС), (Р) DЛP12-TMD (2L34), (Q) ЛPP-TMD (2LOH), (R) EphЛ2 (2К9У). Адаптировано из [1].

Для ряда исследованных белков было показано существование более одной структуры гомодимера как следствие наличия нескольких потенциально возможных интерфейсов димеризации. Биологическая роль данного явления может сводиться к существованию «активной» и «неактивной» формы димера, соответствующих связанному с лигандом и свободному состоянию соответственно [15]. С начала 2000 годов активно велись работы по изучению свободной энергии димеризации ТМ спираль-спиральных взаимодействий [23-26]. Большая часть работ была направлена на изучение влияния аминокислотных замен на силу димеризации ТМ доменов. Однако, было выяснено, что во многих случаях мутации, приводящие к активации полноразмерного рецептора, не усиливают димеризацию как таковую, но меняют конформацию димера [27-29]. Кроме того, ряд исследований показал, что свойства самой среды мембраны, то есть, её состава и фазового состояния, могут быть важны для процесса димеризации ТМ доменов битопных белков. В самом деле, по сравнению с многоспиральными комплексами, димеры битопных белков имеют большую площадь, экспонированную липидному окружению и, таким образом, мембрана оказываем существенное воздействие на структуру комплекса. Было показано, что димеризация усиливается в гелевой фазе по сравнению с жидкокристаллическим состоянием мембраны [30]. Очевидно, что усиление димеризации в более упорядоченной гелевой фазе является следствием больших потерь свободной энергии при внедрении в неё пептидной спирали, делая более энергетически выгодным димерное состояние с меньшей площадью поверхности. Данный эффект также вызывает присутствие в составе мембраны холестерина: его добавление в мембраномоделирующую среду значительно усиливает способность ТМ спиралей взаимодействовать друг с другом [31,32].

Одним из наиболее интенсивно исследуемых ТМ доменов битопных белков является ТМ домен белка-предшественника в-амилоида ЛРР. Его

мономерная и димерная структуры были получены методом спектроскопии ЯМР в растворе [33,34]. В ТМ домене APP присутствует гептадный мотив I702X3M706X2G709X3A713X2I716X3I720X2I723, димеризация по которому описана в работе [34]. Наряду с ним также присутствует так называемая глициновая молния G700X3G700X3G704X3G708, также характерная для димеров ТМ доменов, ассоциация по которой описана в [35] на основе данных спектроскопии ЯМР в твердом теле. Обе модели димеризации имеют подтверждение на основе биохимических данных и молекулярного моделирования. На данный момент остаётся открытым вопрос о реализации одного из них или обоих мотивов in vivo.

По структурной классификации APP является ТМ белком-рецептором I типа. Ген APP локализован на длинном плече 21 хромосомы и экспрессируется как транскрипт длиной 3,2-3,4 т.п.о. в большом количестве тканей и органов. Наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в печени и головном мозге [36,37]. Ген состоит из 20 экзонов и подвергается альтернативному сплайсингу, приводящему к образованию более 10 изоформ. Изоформа APP695, кодирующая 695-членный полипептид была изолирована исторически первой. APP751 полностью повторяет APP 695 за исключением наличия в ней экзона 7 длиной 168 п.о., который кодирует домен длиной 56 аминокислот гомологичный ингибиторам сериновых протеаз типа Кунитц (KPI). Самая длинная изоформа APP770 также включает экзон 8 длиной 57 п.о. и кодирует 19 аминокислотный домен, имеющий гомологию с антигеном MRC OX-2. Эти три изоформы являются наиболее распространёнными в организме, при этом в нервной системе преобладает изоформа APP695. Структуры отдельных доменов APP были определены в работах [38] для цистин-богатого домена, имеющего сходство с фактором роста (GFLD, growth factor-like domain, 28-123) (РСА), [39] для медь- и цинк-связывающего домена (Cu/Zn-BD, copper/zinc-binding domain, 124-188) (спектроскопия ЯМР), [40] для домена E2 (РСА), [33,41,42] для ТМ домена и C-концевого домена (спектроскопия ЯМР). Модель

полноразмерной внеклеточной части APP построенную на основе данных малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) описана в работе [43].

Большое внимание в последнее время уделяется изучению ТМ домена APP. Действительно, именно его аминокислотная последовательность образует ß-амилоидные пептиды, гиперпродукция которых является отличительной чертой болезни Альцгеймера, кроме того, на эту область вместе с примембранными участками приходится большая часть наследственных мутаций, ассоциированных с ранним развитием болезни.

( U-.

А N-terminal subsiructure

носс

С-terminal substructure

Рисунок 3 Пространственные структуры доменов АРР [44]. Слева направо — домен подобный фактору роста (PDB: 1MWP, структура определена методом рентгеновской кристаллографии); медь-связывающий домен (PDB:1OWT, структура определена методом спектроскопии ЯМР в растворе); Е2-домен (PDB:1RW6, рентгеновская кристаллография); ТМ домен в комплексе с холестерином (PDB:2LOH, спектроскопия ЯМР в растворе).

Характерными особенностями ТМ домена АРР является наличие изгиба в центральной части ТМ спирали, а также наличие примембранной спирали, взаимодействующей с поверхностью липидного бислоя [33], а также N концевого сайта связывания цинка [45].

1.2 Биологическая роль АРР

Гены семейства АРР распространены среди различных таксонов и, по всей видимости, таковые присутствуют у большинства многоклеточных животных [46-48]. Их выраженная эволюционная консервативность указывает

на наличие у соответствующих белков крайне важной функции. Действительно, нокаут гена APL-1, гомолога APP, у С. elegans приводит к летальному фенотипу [49]. Интересно, что жизнеспособность может быть восстановлена экспрессией укороченной формы APL-1, лишённой внутриклеточного домена [50]. Однако, нокаут гена APPL (APP-like protein) у D. melanogater не приводит к летальности, но вызывает нарушения в морфологии синапсов и аномалии в поведении [51]. Следует заметить, что между APP позвоночных и его гомологами у представителей других таксонов есть существенные отличия - у последних отсутствует KPI домен и характерная последовательность Ав, поэтому некоторые исследователи не считают их удачными моделями в точности воспроизводящими функции APP человека [46] (Рисунок 4).

Анализ функций генов семейства APP у человека и других позвоночных осложняется двумя фактами: наличием в геноме до двух гомологов с близкими функциями и сложным протеолитическим процессингом с образованием ряда биологически активных продуктов.

В ходе ряда исследований было выяснено, что гены APP, APLP1 и APLP2 обладают частично перекрывающимися функциями. Так, мыши, нокаутные по гену APP, являются жизнеспособными и фертильными, хотя и демонстрируют сниженную массу тела [52], повышенный уровень меди [53], холестерина и сфинголипидов [54] в тканях мозга, а также ряд неврологических нарушений.

Рисунок 4 Схема строения АРР, APLP1 и APLP2 человека, а также APL-1 нематоды и APPL дрозофилы. Все они содержат домены Е1 и Е2, «кислотный домен» Ас и последовательность YENPTY. HBD - гепарин связывающий домен, KPI - домен, гомологичный ингибиторам протеаз типа Кунитц, CuBD - медь-связывающий домен [55].

В частности, у них уменьшены размер комиссур переднего мозга и наблюдается агенез мозолистого тела, что согласуется с гипотезой об участии APP в прорастании нейритов и формировании аксональных путей [55]. Интересно, что все отклонения полностью устраняются экспрессией укороченной формы APP - APPsa - соответствующей продукту протеолиза белка альфа-секретазой [56], что указывает на важность этого пути процессинга для нормального развития и функционирования нервной системы. Были получены мыши нокаутные по всем трём генам и их комбинациям. Все одиночные нокауты не являются летальными и проявляют фенотип, схожий с наблюдаемым для нокаута APP. Нокауты пар APP/APPL2, APLP1/APLP2 являются летальными [57], но нокаут APP/APLP1 приводит лишь к небольшим аномалиям, сходным с теми, что наблюдаются при одиночном нокауте каждого из генов. Тройной нокаут также является летальным, и, в отличие от других комбинаций генов, ему сопутствуют серьёзные гистологические аномалии - в частности, нарушение миграции предшественников нейронов из

кортикальной пластинки, что подтверждает ключевую роль белков семейства APP в межклеточных взаимодействиях [58]. В совокупности эти данные говорят о сложном взаимодействии продуктов данных генов и их частично перекрывающихся функциях. Ряд экспериментов также указывает на то что функциями АРР является усиление связи клетка-субстрат, нейротрофные и нейро-протективные свойства [59].

Структурные данные также подтверждают роль APP как белка, участвующего в межклеточных взаимодействиях. Так модель, изображённая на Рисунке 5 показывает, что внеклеточный домен APP может формировать транс-и цис-димеры при посредничестве гепарина.

APP имеет структуру характерную для рецепторов I типа. Так, например, с рецепторами семейства Notch его объединяет ещё и сходный механизм протеолитического расщепления [60]. Это является дополнительным аргументом в пользу гипотезы о функционировании APP как белка, обеспечивающего взаимодействие клетки с внешней средой. В ряде работ было установлено наличие биологически значимого взаимодействия полноразмерного APP с различными компонентами внешней среды клетки.

Рисунок 5 Формирование транс- (А) и цис- (Б) димеров внеклеточным доменом АРР (серый и красный) при посредничестве гепарина (зелёный) [43]. Модель получена на

основе данных малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и молекулярного моделирования.

В работе [61] раскрыт механизм увеличения продукции APP под воздействием ионов железа посредством микроРНК mir-346 и элемента IRE (iron-responsive element), находящегося в 5Л нетранслируемой области мРНК APP. Также было показано прямое взаимодействие внеклеточного примембранного участка APP с ионами меди и цинка с микромолярными константами связывания [45,62-64], как и изменение экспрессии, уровня димеризации и путей протеолитического процессинга при связывании с этими металлами [64-66].

A Б

Рисунок 6 Модели комплексов катион-связывающего домена АРР с ионом цинка в отношении 2:1 (А) и 1:1 (Б). Иллюстрации из [63] (А), [45] (Б).

По всей видимости, присутствие избытка ионов цинка приводит к сдвигу

процессинга в сторону более амилоидогенных форм. До сих пор нет

однозначного мнения о биологическом эффекте ионов меди на гомеостаз APP.

Было показано прямое взаимодействие между ТМ доменом APP и

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Урбан Анатолий Сергеевич, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bugge K., Lindorff-Larsen K., Kragelund B.B. Understanding single-pass transmembrane receptor signaling from a structural viewpoint-what are we missing? // FEBS J. 2016. Vol. 283, № 24. P. 4424-4451.

2. The top 10 causes of death [Electronic resource]. URL: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (accessed: 21.04.2020).

3. Alzheimer's Statistics [Electronic resource] // Alzheimers.net. URL: https://www.alzheimers.net/resources/alzheimers-statistics/ (accessed: 22.04.2020).

4. Mormino E.C., Papp K.V. Amyloid accumulation and cognitive decline in clinically normal older individuals: implications for aging and early Alzheimer's disease // J. Alzheimers Dis. JAD. 2018. Vol. 64, № Suppl 1. P. S633-S646.

5. Shea Y.-F. et al. A systematic review of familial Alzheimer's disease: Differences in presentation of clinical features among three mutated genes and potential ethnic differences // J. Formos. Med. Assoc. 2016. Vol. 115, № 2. P. 67-75.

6. Cho Y.Y. et al. Elevated cellular cholesterol in Familial Alzheimer's presenilin 1 mutation is associated with lipid raft localization of ß-amyloid precursor protein // PLOS ONE / ed. Lakshmana M.K. 2019. Vol. 14, № 1. P. e0210535.

7. Arinaminpathy Y. et al. Computational analysis of membrane proteins: the largest class of drug targets // Drug Discov. Today. 2009. Vol. 14, № 23-24. P. 1130-1135.

8. Pahl M.C. et al. Signalling via Single-Pass Transmembrane Proteins // eLS. American Cancer Society, 2013.

9. Bocharov E.V. et al. Helix-helix interactions in membrane domains of bitopic proteins: Specificity and role of lipid environment // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2017. Vol. 1859, № 4. P. 561-576.

10. Zviling M., Kochva U., Arkin I.T. How important are transmembrane helices of bitopic membrane proteins? // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2007. Vol. 1768, № 3. P. 387-392.

11. Haxholm G.W. et al. Intrinsically disordered cytoplasmic domains of two cytokine receptors mediate conserved interactions with membranes // Biochem. J. 2015. Vol. 468, № 3. P. 495506.

12. Brooks A.J. et al. Mechanism of activation of protein kinase JAK2 by the growth hormone receptor // Science. 2014. Vol. 344, № 6185. P. 1249783.

13. Endres N.F. et al. Conformational coupling across the plasma membrane in activation of the EGF receptor // Cell. 2013. Vol. 152, № 3. P. 543-556.

14. Bocharov E.V. et al. Conformational transitions and interactions underlying the function of membrane embedded receptor protein kinases // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2017. Vol. 1859, № 9. P. 1417-1429.

15. Bocharov E.V. et al. Structure elucidation of dimeric transmembrane domains of bitopic proteins // Cell Adhes. Migr. 2010. Vol. 4, № 2. P. 284-298.

16. Matthews E.E., Zoonens M., Engelman D.M. Dynamic helix interactions in transmembrane signaling // Cell. 2006. Vol. 127, № 3. P. 447-450.

17. Popot J.L., Engelman D.M. Membrane protein folding and oligomerization: the two-stage model // Biochemistry. 1990. Vol. 29, № 17. P. 4031-4037.

18. Katragadda M., Alderfer J.L., Yeagle P.L. Assembly of a polytopic membrane protein structure from the solution structures of overlapping peptide fragments of bacteriorhodopsin. // Biophys. J. 2001. Vol. 81, № 2. P. 1029-1036.

19. Manni S. et al. Structural and Functional Characterization of Alternative Transmembrane Domain Conformations in VEGF Receptor 2 Activation // Structure. 2014. Vol. 22, № 8. P. 1077-1089.

20. Lau T.-L. et al. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling // EMBO J. 2009. Vol. 28, № 9. P. 1351-1361.

21. Li E., You M., Hristova K. FGFR3 dimer stabilization due to a single amino acid pathogenic mutation // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 356, № 3. P. 600-612.

22. Jonsson T. et al. A mutation in APP protects against Alzheimer's disease and age-related cognitive decline // Nature. 2012. Vol. 488, № 7409. P. 96-99.

23. Fleming K.G. Standardizing the Free Energy Change of Transmembrane Helix-Helix Interactions // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 323, № 3. P. 563-571.

24. Mineev K.S. et al. NMR-based approach to measure the free energy of transmembrane helix-helix interactions // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2014. Vol. 1838, № 1, Part B. P. 164-172.

25. Merzlyakov M. et al. Transmembrane Helix Heterodimerization in Lipid Bilayers: Probing the Energetics behind Autosomal Dominant Growth Disorders // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 358, № 1. P. 1-7.

26. Yamashita H. et al. Oligomerization-function relationship of EGFR on living cells detected by the coiled-coil labeling and FRET microscopy // Biochim. Biophys. Acta BBA -Biomembr. 2015. Vol. 1848, № 6. P. 1359-1366.

27. Sarabipour S., Hristova K. Effect of the achondroplasia mutation on FGFR3 dimerization and FGFR3 structural response to fgf1 and fgf2: A quantitative FRET study in osmotically derived plasma membrane vesicles // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2016. Vol. 1858, № 7, Part A. P. 1436-1442.

28. Manni S. et al. Structural and Functional Characterization of Alternative Transmembrane Domain Conformations in VEGF Receptor 2 Activation // Structure. 2014. Vol. 22, № 8. P. 1077-1089.

29. Del Piccolo N., Placone J., Hristova K. Effect of Thanatophoric Dysplasia Type I Mutations on FGFR3 Dimerization // Biophys. J. 2015. Vol. 108, № 2. P. 272-278.

30. Anbazhagan V., Schneider D. The membrane environment modulates self-association of the human GpA TM domain—Implications for membrane protein folding and transmembrane signaling // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2010. Vol. 1798, № 10. P. 18991907.

31. Mall S. et al. Self-Association of Model Transmembrane a-Helices Is Modulated by Lipid Structure // Biochemistry. 2001. Vol. 40, № 41. P. 12379-12386.

32. Cristian L., Lear J.D., DeGrado W.F. Use of thiol-disulfide equilibria to measure the energetics of assembly of transmembrane helices in phospholipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. Vol. 100, № 25. P. 14772-14777.

33. Nadezhdin K.D. et al. Structural and dynamic study of the transmembrane domain of the amyloid precursor protein // Acta Naturae. 2011. Vol. 3, № 1. P. 69-76.

34. Nadezhdin K.D. et al. Dimeric structure of transmembrane domain of amyloid precursor protein in micellar environment // FEBS Lett. 2012. Vol. 586, № 12. P. 1687-1692.

35. Mackenzie K.R. Folding and stability of alpha-helical integral membrane proteins // Chem. Rev. 2006. Vol. 106, № 5. P. 1931-1977.

36. Park S.-J. et al. Quantitative Expression Analysis of APP Pathway and Tau Phosphorylation-Related Genes in the ICV STZ-Induced Non-Human Primate Model of Sporadic Alzheimer's Disease // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol. 16, № 2. P. 2386-2402.

37. Tang K. et al. Identification of a novel alternative splicing isoform of human amyloid precursor protein gene, APP639 // Eur. J. Neurosci. 2003. Vol. 18, № 1. P. 102-108.

38. Rossjohn J. et al. Crystal structure of the N-terminal, growth factor-like domain of Alzheimer amyloid precursor protein // Nat. Struct. Biol. 1999. Vol. 6, № 4. P. 327-331.

39. Barnham K.J. et al. Structure of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein copper binding domain. A regulator of neuronal copper homeostasis // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 19. P.17401-17407.

40. Wang Y., Ha Y. The X-ray structure of an antiparallel dimer of the human amyloid precursor protein E2 domain // Mol. Cell. 2004. Vol. 15, № 3. P. 343-353.

41. Beel A.J. et al. Structural Studies of the Transmembrane C-Terminal Domain of the Amyloid Precursor Protein (APP): Does APP Function as a Cholesterol Sensor? T * // Biochemistry. 2008. Vol. 47, № 36. P. 9428-9446.

42. Barrett P.J. et al. The amyloid precursor protein has a flexible transmembrane domain and binds cholesterol // Science. 2012. Vol. 336, № 6085. P. 1168-1171.

43. Gralle M., Ferreira S.T. Structure and functions of the human amyloid precursor protein: The whole is more than the sum of its parts // Prog. Neurobiol. 2007. Vol. 82, № 1. P. 11-32.

44. Reinhard C., Hébert S.S., De Strooper B. The amyloid-ß precursor protein: integrating structure with biological function // EMBO J. 2005. Vol. 24, № 23. P. 3996-4006.

45. Tsvetkov P.O. et al. Minimal Zn(2+) binding site of amyloid-ß // Biophys. J. 2010. Vol. 99, № 10. P. L84-86.

46. Coulson E.J. et al. What the evolution of the amyloid protein precursor supergene family tells us about its function // Neurochem. Int. 2000. Vol. 36, № 3. P. 175-184.

47. Tharp W.G., Sarkar I.N. Origins of amyloid-ß // BMC Genomics. 2013. Vol. 14, № 1. P. 290.

48. Miklós I., Zádori Z. Positive Evolutionary Selection of an HD Motif on Alzheimer Precursor Protein Orthologues Suggests a Functional Role // PLoS Comput. Biol. / ed. Nussinov R. 2012. Vol. 8, № 2. P. e1002356.

49. Ewald C.Y., Raps D.A., Li C. APL-1, the Alzheimer's Amyloid Precursor Protein in Caenorhabditis elegans, Modulates Multiple Metabolic Pathways Throughout Development // Genetics. 2012. Vol. 191, № 2. P. 493-507.

50. Wiese M., Antebi A., Zheng H. Intracellular Trafficking and Synaptic Function of APL-1 in Caenorhabditis elegans // PLoS ONE. 2010. Vol. 5, № 9. P. e12790.

51. Poeck B., Strauss R., Kretzschmar D. Analysis of amyloid precursor protein function in Drosophila melanogaster // Exp. Brain Res. 2012. Vol. 217, № 3-4. P. 413-421.

52. Anliker B., Müller U. The functions of mammalian amyloid precursor protein and related amyloid precursor-like proteins // Neurodegener. Dis. 2006. Vol. 3, № 4-5. P. 239-246.

53. White A.R. et al. Copper levels are increased in the cerebral cortex and liver of APP and APLP2 knockout mice // Brain Res. 1999. Vol. 842, № 2. P. 439-444.

54. Grimm M.O.W. et al. Regulation of cholesterol and sphingomyelin metabolism by amyloid-beta and presenilin // Nat. Cell Biol. 2005. Vol. 7, № 11. P. 1118-1123.

55. Muller U.C., Zheng H. Physiological Functions of APP Family Proteins // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012. Vol. 2, № 2. P. a006288-a006288.

56. Ring S. et al. The Secreted -Amyloid Precursor Protein Ectodomain APPs Is Sufficient to Rescue the Anatomical, Behavioral, and Electrophysiological Abnormalities of APP-Deficient Mice // J. Neurosci. 2007. Vol. 27, № 29. P. 7817-7826.

57. Heber S. et al. Mice with combined gene knock-outs reveal essential and partially redundant functions of amyloid precursor protein family members // J. Neurosci. 2000. Vol. 20, № 21. P. 7951-7963.

58. Herms J. et al. Cortical dysplasia resembling human type 2 lissencephaly in mice lacking all three APP family members // EMBO J. 2004. Vol. 23, № 20. P. 4106-4115.

59. Selkoe D.J. Cell biology of the amyloid beta-protein precursor and the mechanism of Alzheimer's disease // Annu. Rev. Cell Biol. 1994. Vol. 10. P. 373-403.

60. Shih I.-M., Wang T.-L. Notch signaling, gamma-secretase inhibitors, and cancer therapy // Cancer Res. 2007. Vol. 67, № 5. P. 1879-1882.

61. Long J.M. et al. Novel upregulation of amyloid-ß precursor protein (APP) by microRNA-346 via targeting of APP mRNA 5'-untranslated region: Implications in Alzheimer's disease // Mol. Psychiatry. 2019. Vol. 24, № 3. P. 345.

62. Curtain C.C. Alzheimer's Disease Amyloid-beta Binds Copper and Zinc to Generate an Allosterically Ordered Membrane-penetrating Structure Containing Superoxide Dismutase-like Subunits // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 23. P. 20466-20473.

63. Kozin S.A. et al. Zinc-induced dimerization of the amyloid-ß metal-binding domain 1-16 is mediated by residues 11-14 // Mol. Biosyst. 2011. Vol. 7, № 4. P. 1053-1055.

64. Wang C.-Y. et al. Zinc overload enhances APP cleavage and Aß deposition in the Alzheimer mouse brain // PloS One. 2010. Vol. 5, № 12. P. e15349.

65. Gerber H. et al. Zinc and Copper Differentially Modulate Amyloid Precursor Protein Processing by Y-Secretase and Amyloid-ß Peptide Production // J. Biol. Chem. 2017. Vol. 292, № 9. P. 3751-3767.

66. Singh I. et al. Low levels of copper disrupt brain amyloid-ß homeostasis by altering its production and clearance // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013. Vol. 110, № 36. P. 1477114776.

67. Ghosh A.K., Brindisi M., Tang J. Developing ß-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease // J. Neurochem. 2012. Vol. 120, № Suppl 1. P. 71-83.

68. Tamayev R. et al. ß- but not Y-secretase proteolysis of APP causes synaptic and memory deficits in a mouse model of dementia: sAPPß/ß-CTF and not Aß cause memory deficits // EMBO Mol. Med. 2012. Vol. 4, № 3. P. 171-179.

69. Abad-Rodriguez J. Neuronal membrane cholesterol loss enhances amyloid peptide generation // J. Cell Biol. 2004. Vol. 167, № 5. P. 953-960.

70. Epand R.M. Cholesterol and the interaction of proteins with membrane domains // Prog. Lipid Res. 2006. Vol. 45, № 4. P. 279-294.

71. Marenchino M. et al. Dynamics and Cleavability at the alpha-cleavage site of APP(684-726) in different lipid environments // Biophys. J. 2008. Vol. 95, № 3. P. 1460-1473.

72. Richter L. et al. Amyloid beta 42 peptide (Aß42)-lowering compounds directly bind to Aß and interfere with amyloid precursor protein (APP) transmembrane dimerization // Proc. Natl. Acad. Sci. 2010. Vol. 107, № 33. P. 14597-14602.

73. Chow V.W. et al. An Overview of APP Processing Enzymes and Products // Neuromolecular Med. 2010. Vol. 12, № 1. P. 1-12.

74. Zhang Y. et al. APP processing in Alzheimer's disease // Mol. Brain. 2011. Vol. 4, № 1. P. 3.

75. Wolfe M.S. Y-Secretase and Presenilin // Aß Metab. Alzheimer's Dis. 2003. P. 33-47.

76. Xia W. Intramembrane proteolysis by presenilin and presenilin-like proteases // J. Cell Sci. 2003. Vol. 116, № 14. P. 2839-2844.

77. Haapasalo A., Kovacs D.M. The many substrates of presenilin/Y-secretase // J. Alzheimers Dis. JAD. 2011. Vol. 25, № 1. P. 3-28.

78. Grüninger-Leitch F. et al. Substrate and Inhibitor Profile of BACE (ß-Secretase) and Comparison with Other Mammalian Aspartic Proteases // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 7. P.4687-4693.

79. Das U. et al. Activity-induced convergence of APP and BACE-1 in acidic microdomains via an endocytosis-dependent pathway // Neuron. 2013. Vol. 79, № 3. P. 447-460.

80. Tarassishin L. et al. Processing of Notch and amyloid precursor protein by gamma-secretase is spatially distinct // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 49. P. 17050-17055.

81. Wolfe M.S. Structure, mechanism and inhibition of gamma-secretase and presenilin-like proteases // Biol. Chem. 2010. Vol. 391, № 8. P. 839-847.

82. Eggert S. et al. Induced dimerization of the amyloid precursor protein (APP) leads to decreased amyloid-beta protein (Abeta) production // J. Biol. Chem. 2009. P. jbc.M109.038646.

83. Ben Khalifa N. et al. What is the role of amyloid precursor protein dimerization? // Cell Adhes. Migr. 2010. Vol. 4, № 2. P. 268-272.

84. Kimberly W.T. et al. The intracellular domain of the beta-amyloid precursor protein is stabilized by Fe65 and translocates to the nucleus in a notch-like manner // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 43. P. 40288-40292.

85. Shu R. et al. APP intracellular domain acts as a transcriptional regulator of miR-663 suppressing neuronal differentiation // Cell Death Dis. 2015. Vol. 6, № 2. P. e1651.

86. Claasen A.M. et al. Secreted amyloid precursor protein-a upregulates synaptic protein synthesis by a protein kinase G-dependent mechanism // Neurosci. Lett. 2009. Vol. 460, № 1. P. 92-96.

87. Taylor C.J. et al. Endogenous secreted amyloid precursor protein-alpha regulates hippocampal NMDA receptor function, long-term potentiation and spatial memory // Neurobiol. Dis. 2008. Vol. 31, № 2. P. 250-260.

88. Obregon D. et al. Soluble amyloid precursor protein-a modulates ß-secretase activity and amyloid-ß generation // Nat. Commun. 2012. Vol. 3. P. 777.

89. Rice H.C. et al. Secreted amyloid-ß precursor protein functions as a GABA в R1a ligand to modulate synaptic transmission // Science. 2019. Vol. 363, № 6423. P. eaao4827.

90. Nikolaev A. et al. APP binds DR6 to trigger axon pruning and neuron death via distinct caspases // Nature. 2009. Vol. 457, № 7232. P. 981-989.

91. Khan I. et al. Efficient production of a mature and functional gamma secretase protease // Sci. Rep. 2018. Vol. 8.

92. Bai X. et al. An atomic structure of human y-secretase // Nature. 2015. Vol. 525, № 7568. P. 212-217.

93. Zhou R. et al. Recognition of the amyloid precursor protein by human y-secretase // Science. 2019. P. eaaw0930.

94. Bai X. et al. An atomic structure of human y-secretase // Nature. 2015.

95. World Alzheimer Report 2010. 2010.

96. Myers A.J., Goate A.M. The genetics of late-onset Alzheimer's disease // Curr. Opin. Neurol. 2001. Vol. 14, № 4. P. 433-440.

97. Lee S. et al. Rational Design of a Structural Framework with Potential Use to Develop Chemical Reagents That Target and Modulate Multiple Facets of Alzheimer's Disease // J. Am. Chem. Soc. 2014. Vol. 136, № 1. P. 299-310.

98. Григоренко А.П., Рогаев Е.И. Молекулярные основы болезни альцгеймера // Молекулярная Биология. 41. № 2. P. 2007.

99. Maltsev A.V., Bystryak S., Galzitskaya O.V. The role of ß-amyloid peptide in neurodegenerative diseases // Ageing Res. Rev. 2011. Vol. 10, № 4. P. 440-452.

100. Cummings J.L., Kaufer D. Neuropsychiatric aspects of Alzheimer's disease: the cholinergic hypothesis revisited // Neurology. 1996. Vol. 47, № 4. P. 876-883.

101. Hardy J., Allsop D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease // Trends Pharmacol. Sci. 1991. Vol. 12, № 10. P. 383-388.

102. Mudher A., Lovestone S. Alzheimer's disease-do tauists and baptists finally shake hands? // Trends Neurosci. 2002. Vol. 25, № 1. P. 22-26.

103. Lott I.T., Head E. Alzheimer disease and Down syndrome: factors in pathogenesis // Neurobiol. Aging. 2005. Vol. 26, № 3. P. 383-389.

104. Holmes C. et al. Long-term effects of Abeta42 immunisation in Alzheimer's disease: follow-up of a randomised, placebo-controlled phase I trial // Lancet. 2008. Vol. 372, № 9634. P. 216-223.

105. Chun W., Johnson G.V.W. The role of tau phosphorylation and cleavage in neuronal cell death // Front. Biosci. J. Virtual Libr. 2007. Vol. 12. P. 733-756.

106. Barrow C., Small D. Abeta Peptide and Alzheimer's Disease - Celebrating a Century of Research. 2007.

107. Soscia S.J. et al. The Alzheimer's Disease-Associated Amyloid ß-Protein Is an Antimicrobial Peptide // PLoS ONE / ed. Bush A.I. 2010. Vol. 5, № 3. P. e9505.

108. Rauk A. Why is the amyloid beta peptide of Alzheimer's disease neurotoxic? // Dalton Trans. Camb. Engl. 2003. 2008. № 10. P. 1273-1282.

109. Selkoe D.J. Folding proteins in fatal ways // Nature. 2003. Vol. 426, № 6968. P. 900-904.

110. Czasch S., Paul S., Baumgärtner W. A comparison of immunohistochemical and silver staining methods for the detection of diffuse plaques in the aged canine brain // Neurobiol. Aging. 2006. Vol. 27, № 2. P. 293-305.

111. Hane F., Leonenko Z. Effect of Metals on Kinetic Pathways of Amyloid-ß Aggregation // Biomolecules. 2014. Vol. 4, № 1. P. 101-116.

112. Caughey B., Lansbury P.T. P ROTOFIBRILS , P ORES , F IBRILS, AND N EURODEGENERATION : Separating the Responsible Protein Aggregates from The Innocent Bystanders // Annu. Rev. Neurosci. 2003. Vol. 26, № 1. P. 267-298.

113. Crescenzi O. et al. Solution structure of the Alzheimer amyloid ß-peptide (1-42) in an apolar microenvironment: Similarity with a virus fusion domain // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269, № 22. P.5642-5648.

114. Tomaselli S. et al. The a-to-ß Conformational Transition of Alzheimer's Aß-(1-42) Peptide in Aqueous Media is Reversible: A Step by Step Conformational Analysis Suggests the Location of ß Conformation Seeding // ChemBioChem. 2006. Vol. 7, № 2. P. 257-267.

115. Copani A. The underexplored question of ß-amyloid monomers // Eur. J. Pharmacol. 2017. Vol. 817. P. 71-75.

116. Dumurgier J. et al. Cerebrospinal fluid amyloid-ß 42/40 ratio in clinical setting of memory centers: a multicentric study // Alzheimers Res. Ther. 2015. Vol. 7, № 1. P. 30.

117. Janelidze S. et al. CSF Aß42/Aß40 and Aß42/Aß38 ratios: better diagnostic markers of Alzheimer disease // Ann. Clin. Transl. Neurol. 2016. Vol. 3, № 3. P. 154-165.

118. Giuffrida M.L. et al. The Monomer State of Beta-Amyloid: Where the Alzheimer's Disease Protein Meets Physiology // Rev. Neurosci. 2010. Vol. 21, № 2.

119. Lazarevic V. et al. Physiological Concentrations of Amyloid Beta Regulate Recycling of Synaptic Vesicles via Alpha7 Acetylcholine Receptor and CDK5/Calcineurin Signaling // Front. Mol. Neurosci. 2017. Vol. 10.

120. Giuffrida M.L. et al. ß-Amyloid Monomers Are Neuroprotective // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, № 34. P. 10582-10587.

121. Economou N.J. et al. Amyloid ß-Protein Assembly and Alzheimer's Disease: Dodecamers of Aß42, but Not of Aß40, Seed Fibril Formation // J. Am. Chem. Soc. 2016. Vol. 138, № 6. P. 1772-1775.

122. Shigemitsu Y. et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol // Anal. Biochem. 2016. Vol. 498. P. 59-67.

123. Mehrazma B., Rauk A. Exploring Amyloid-ß Dimer Structure Using Molecular Dynamics Simulations // J. Phys. Chem. A. 2019. Vol. 123, № 22. P. 4658-4670.

124. Jin M. et al. Soluble amyloid ß-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration // Proc. Natl. Acad. Sci. 2011. Vol. 108, № 14. P.5819-5824.

125. Müller-Schiffmann A. et al. Amyloid-ß dimers in the absence of plaque pathology impair learning and synaptic plasticity // Brain. 2016. Vol. 139, № 2. P. 509-525.

126. O'Nuallain B. et al. Aß dimers rapidly form stable synaptotoxic protofibrils // J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 2010. Vol. 30, № 43. P. 14411-14419.

127. Sengupta U., Nilson A.N., Kayed R. The Role of Amyloid-ß Oligomers in Toxicity, Propagation, and Immunotherapy // EBioMedicine. 2016. Vol. 6. P. 42-49.

128. Zhao L.N. et al. The Toxicity of Amyloid ß Oligomers // Int. J. Mol. Sci. 2012. Vol. 13, № 6. P. 7303-7327.

129. Chang Y.-J., Chen Y.-R. The coexistence of an equal amount of Alzheimer's amyloid-ß 40 and 42 forms structurally stable and toxic oligomers through a distinct pathway // FEBS J. 2014. Vol. 281, № 11. P. 2674-2687.

130. Walsh D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid ß protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo // Nature. 2002. Vol. 416, № 6880. P. 535.

131. Smith D.G., Cappai R., Barnham K.J. The redox chemistry of the Alzheimer's disease amyloid ß peptide // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2007. Vol. 1768, № 8. P. 1976-1990.

132. Carrillo-Mora P., Luna R., Colin-Barenque L. Amyloid Beta: Multiple Mechanisms of Toxicity and Only Some Protective Effects? // Oxid. Med. Cell. Longev. 2014. Vol. 2014.

133. Limbocker R. et al. Trodusquemine enhances Aß 42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, № 1. P. 225.

134. Kandel N. et al. Membrane Binding and Pore Formation by a Cytotoxic Fragment of Amyloid ß Peptide // J. Phys. Chem. B. 2017. Vol. 121, № 45. P. 10293-10305.

135. Shirwany N.A. et al. The amyloid beta ion channel hypothesis of Alzheimer's disease // Neuropsychiatr. Dis. Treat. P. 16.

136. Serra-Batiste M. et al. Preparation of a Well-Defined and Stable ß-Barrel Pore-Forming Aß42 Oligomer // Amyloid Proteins / ed. Sigurdsson E.M., Calero M., Gasset M. New York, NY: Springer New York, 2018. Vol. 1779. P. 13-22.

137. Di Scala C. et al. Common molecular mechanism of amyloid pore formation by Alzheimer's ß-amyloid peptide and a-synuclein // Sci. Rep. 2016. Vol. 6. P. 28781.

138. Bode D C., Baker M.D., Viles J.H. Ion Channel Formation by Amyloid-ß42 Oligomers but Not Amyloid-ß40 in Cellular Membranes // J. Biol. Chem. 2017. Vol. 292, № 4. P. 14041413.

139. Di Scala C. et al. Mechanism of cholesterol-assisted oligomeric channel formation by a short Alzheimer ß-amyloid peptide // J. Neurochem. 2014. Vol. 128, № 1. P. 186-195.

140. Ambroggio E.E. et al. Surface Behavior and Lipid Interaction of Alzheimer ß-Amyloid Peptide 1-42: A Membrane-Disrupting Peptide // Biophys. J. 2005. Vol. 88, № 4. P. 27062713.

141. Phillips M.C. Apolipoprotein E isoforms and lipoprotein metabolism // IUBMB Life. 2014. Vol. 66, № 9. P. 616-623.

142. Chang T.-Y. et al. Cellular cholesterol homeostasis and Alzheimer's disease // J. Lipid Res. 2017. Vol. 58, № 12. P. 2239-2254.

143. Leduc V., Jasmin-Bélanger S., Poirier J. APOE and cholesterol homeostasis in Alzheimer's disease // Trends Mol. Med. 2010. Vol. 16, № 10. P. 469-477.

144. Di Paolo G., Kim T.-W. Linking lipids to Alzheimer's disease: cholesterol and beyond // Nat. Rev. Neurosci. 2011. Vol. 12, № 5. P. 284-296.

145. Grimm M.O.W. et al. APP Function and Lipids: A Bidirectional Link // Front. Mol. Neurosci. 2017. Vol. 10.

146. Stangl M., Schneider D. Functional competition within a membrane: Lipid recognition vs. transmembrane helix oligomerization // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2015. Vol. 1848, № 9. P. 1886-1896.

147. Di Scala C. et al. Interaction of Alzheimer's ß-Amyloid Peptides with Cholesterol: Mechanistic Insights into Amyloid Pore Formation // Biochemistry. 2014. Vol. 53, № 28. P. 4489-4502.

148. Song Y. et al. Impact of Bilayer Lipid Composition on the Structure and Topology of the Transmembrane Amyloid Precursor C99 Protein // J. Am. Chem. Soc. 2014. Vol. 136, № 11. P. 4093-4096.

149. Nierzwicki L., Czub J. Specific Binding of Cholesterol to the Amyloid Precursor Protein: Structure of the Complex and Driving Forces Characterized in Molecular Detail // J. Phys. Chem. Lett. 2015. Vol. 6, № 5. P. 784-790.

150. Li C.-D. et al. The dynamic binding of cholesterol to the multiple sites of C99: as revealed by coarse-grained and all-atom simulations // Phys. Chem. Chem. Phys. 2017. Vol. 19, № 5. P. 3845-3856.

151. Wood W.G. et al. Cholesterol as a causative factor in Alzheimer's disease: a debatable hypothesis // J. Neurochem. 2014. Vol. 129, № 4. P. 559-572.

152. Mutations | ALZFORUM [Electronic resource]. URL: https://www.alzforum.org/mutations (accessed: 05.11.2019).

153. Dimitrov M. et al. Alzheimer's disease mutations in APP but not y-secretase modulators affect epsilon-cleavage-dependent AICD production // Nat. Commun. 2013. Vol. 4. P. 2246.

154. Chávez-Gutiérrez L. et al. The mechanism of y-Secretase dysfunction in familial Alzheimer disease // EMBO J. 2012. Vol. 31, № 10. P. 2261-2274.

155. Fernandez M.A. et al. Alzheimer Presenilin-1 Mutations Dramatically Reduce Trimming of Long Amyloid -Peptides (A ) by -Secretase to Increase 42-to-40-Residue A // J. Biol. Chem. 2014. Vol. 289, № 45. P. 31043-31052.

156. Dimitrov M. et al. Alzheimer's disease mutations in APP but not y-secretase modulators affect epsilon-cleavage-dependent AICD production // Nat. Commun. 2013. Vol. 4.

157. Li S., Zhang W., Han W. Initial Substrate Binding of y-Secretase: The Role of Substrate Flexibility // ACS Chem. Neurosci. 2017. Vol. 8, № 6. P. 1279-1290.

158. Hemming M.L. et al. Identification of ß-Secretase (BACE1) Substrates Using Quantitative Proteomics // PLoS ONE / ed. Maas S. 2009. Vol. 4, № 12. P. e8477.

159. Kaden D. et al. Novel APP/Aß mutation K16N produces highly toxic heteromeric Aß oligomers // EMBO Mol. Med. 2012. Vol. 4, № 7. P. 647-659.

160. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. 1986. Vol. 189, № 1. P. 113-130.

161. Hoover D.M., Lubkowski J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30, № 10. P. e43.

162. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. Vol. 96, № 1. P. 23-28.

163. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

164. Schägger H. Tricine-SDS-PAGE // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 1. P. 16-22.

165. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures // Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 41, № 1. P. 207-234.

166. Schwarz D. et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems // Nat. Protoc. 2007. Vol. 2, № 11. P. 29452957.

167. Kai L. et al. Systems for the cell-free synthesis of proteins // Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 2012. Vol. 800. P. 201-225.

168. Schwarz D. et al. Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems // Nat. Protoc. 2007. Vol. 2, № 11. P. 29452957.

169. Bocharova O.V. et al. Bacterial and cell-free production of APP671-726 containing amyloid precursor protein transmembrane and metal-binding domains // Biochem. Biokhimiya. 2013. Vol. 78, № 11. P. 1263-1271.

170. Favier A., Brutscher B. Recovering lost magnetization: polarization enhancement in biomolecular NMR // J. Biomol. NMR. 2011. Vol. 49, № 1. P. 9-15.

171. Cavanagh J. et al. Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice. Academic Press, 2010. 916 p.

172. Zhang O. et al. Backbone 1H and 15N resonance assignments of the N-terminal SH3 domain of drk in folded and unfolded states using enhanced-sensitivity pulsed field gradient NMR techniques // J. Biomol. NMR. 1994. Vol. 4, № 6. P. 845-858.

173. Davis A.L. et al. Experiments for recording pure-absorption heteronuclear correlation spectra using pulsed field gradients // J. Magn. Reson. 1969. 1992. Vol. 98, № 1. P. 207-216.

174. Stuart A.C. et al. Compensating for Variations in 1 H- 13 C Scalar Coupling Constants in Isotope-Filtered NMR Experiments // J. Am. Chem. Soc. 1999. Vol. 121, № 22. P. 53465347.

175. Farrow N.A. et al. Backbone dynamics of a free and phosphopeptide-complexed Src homology 2 domain studied by 15N NMR relaxation // Biochemistry. 1994. Vol. 33, № 19. P. 5984-6003.

176. Marion D. et al. Rapid recording of 2D NMR spectra without phase cycling. Application to the study of hydrogen exchange in proteins // J. Magn. Reson. 1969. 1989. Vol. 85, № 2. P. 393-399.

177. Kay L., Keifer P., Saarinen T. Pure absorption gradient enhanced heteronuclear single quantum correlation spectroscopy with improved sensitivity // J. Am. Chem. Soc. 1992. Vol. 114, № 26. P. 10663-10665.

178. Piotto M., Saudek V., Sklenár V. Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions // J. Biomol. NMR. 1992. Vol. 2, № 6. P. 661-665.

179. Keller R. Optimizing the Process of Nuclear Magnetic Resonance Spectrum Analysis and Computer Aided Resonance Assignment // Diss ETH Nr 15947.

180. Wüthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. 1 edition. New York: Wiley-Interscience, 1986. 320 p.

181. Kazimierczuk K., Orekhov V.Yu. A comparison of convex and non-convex compressed sensing applied to multidimensional NMR // J. Magn. Reson. 2012. Vol. 223. P. 1-10.

182. Rule G.S., Hitchens T.K. Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy. Springer, 2006. 543 p.

183. Shen Y. et al. TALOS+: A hybrid method for predicting protein backbone torsion angles from NMR chemical shifts // J. Biomol. NMR. 2009. Vol. 44, № 4. P. 213-223.

184. Güntert P. Automated NMR protein structure calculation // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2003. Vol. 43, № 3-4. P. 105-125.

185. Güntert P., Mumenthaler C., Wüthrich K. Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 273, № 1. P. 283-298.

186. Kay L.E., Torchia D.A., Bax A. Backbone dynamics of proteins as studied by nitrogen-15 inverse detected heteronuclear NMR spectroscopy: application to staphylococcal nuclease // Biochemistry. 1989. Vol. 28, № 23. P. 8972-8979.

187. Hwang T.-L. et al. Application of Phase-Modulated CLEAN Chemical EXchange Spectroscopy (CLEANEX-PM) to Detect Water-Protein Proton Exchange and Intermolecular NOEs // J. Am. Chem. Soc. 1997. Vol. 119, № 26. P. 6203-6204.

188. Kelly S.M., Jess T.J., Price N.C. How to study proteins by circular dichroism // Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1751, № 2. P. 119-139.

189. Whitmore L., Wallace B.A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: Methods and reference databases // Biopolymers. 2008. Vol. 89, № 5. P. 392400.

190. Wolfe L.S. et al. Protein-induced photophysical changes to the amyloid indicator dye thioflavin T // Proc. Natl. Acad. Sci. 2010. Vol. 107, № 39. P. 16863-16868.

191. Munishkina L.A., Fink A.L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2007. Vol. 1768, № 8. P. 1862-1885.

192. Abraham M.J. et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multilevel parallelism from laptops to supercomputers // SoftwareX. 2015. Vol. 1-2. P. 19-25.

193. Lindorff-Larsen K. et al. Improved side-chain torsion potentials for the Amber ff99SB protein force field // Proteins Struct. Funct. Bioinforma. 2010. Vol. 78, № 8. P. 1950-1958.

194. Jorgensen W.L. et al. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water // J. Chem. Phys. 1983. Vol. 79, № 2. P. 926-935.

195. Jämbeck J.P.M., Lyubartsev A.P. Derivation and Systematic Validation of a Refined AllAtom Force Field for Phosphatidylcholine Lipids // J. Phys. Chem. B. 2012. Vol. 116, № 10. P. 3164-3179.

196. Koradi R., Billeter M., Wüthrich K. MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14, № 1. P. 51-55.

197. Ermilova I., Lyubartsev A.P. Extension of the Slipids Force Field to Polyunsaturated Lipids // J. Phys. Chem. B. 2016. Vol. 120, № 50. P. 12826-12842.

198. Bocharov E.V. et al. Left-handed dimer of EphA2 transmembrane domain: Helix packing diversity among receptor tyrosine kinases // Biophys. J. 2010. Vol. 98, № 5. P. 881-889.

199. Bocharov E.V. et al. Spatial structure and pH-dependent conformational diversity of dimeric transmembrane domain of the receptor tyrosine kinase EphA1 // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, № 43. P. 29385-29395.

200. Bocharova O.V. et al. [Expression and purification of a recombinant transmembrane domain amyloid precursor protein associated with Alzheimer's disease] // Bioorg. Khim. 2010. Vol. 36, № 1. P. 105-111.

201. Spirin A.S. et al. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield // Science. 1988. Vol. 242, № 4882. P. 1162-1164.

202. Anliker B., Müller U. The functions of mammalian amyloid precursor protein and related amyloid precursor-like proteins // Neurodegener. Dis. 2006. Vol. 3, № 4-5. P. 239-246.

203. Bocharova O.V. et al. In vitro Conversion of Full-length Mammalian Prion Protein Produces Amyloid Form with Physical Properties of PrPSc // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 346, № 2. P. 645-659.

204. Cunningham F., Deber C.M. Optimizing synthesis and expression of transmembrane peptides and proteins // Methods San Diego Calif. 2007. Vol. 41, № 4. P. 370-380.

205. Zirah S. et al. Structural Changes of Region 1-16 of the Alzheimer Disease Amyloid beta-Peptide upon Zinc Binding and in Vitro Aging // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 4. P. 2151-2161.

206. Ayton S., Lei P., Bush A.I. Metallostasis in Alzheimer's disease // Free Radic. Biol. Med. 2013. Vol. 62. P. 76-89.

207. Lee M.-C. et al. Zinc ion rapidly induces toxic, off-pathway amyloid-ß oligomers distinct from amyloid-ß derived diffusible ligands in Alzheimer's disease: 1 // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2018. Vol. 8, № 1. P. 1-16.

208. Langosch D. et al. Understanding intramembrane proteolysis: from protein dynamics to reaction kinetics // Trends Biochem. Sci. 2015. Vol. 40, № 6. P. 318-327.

209. Itkin A. et al. Structural Characterization of the Amyloid Precursor Protein Transmembrane Domain and Its y-Cleavage Site // ACS Omega. 2017. Vol. 2, № 10. P. 6525-6534.

210. Sato T. et al. A helix-to-coil transition at the epsilon-cut site in the transmembrane dimer of the amyloid precursor protein is required for proteolysis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 5. P. 1421-1426.

211. Scheidt H.A. et al. The Potential of Fluorescent and Spin-labeled Steroid Analogs to Mimic Natural Cholesterol // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 46. P. 45563-45569.

212. Kulig W. et al. Cholesterol under oxidative stress—How lipid membranes sense oxidation as cholesterol is being replaced by oxysterols // Free Radic. Biol. Med. 2015. Vol. 84. P. 30-41.

213. Tang T.-C. et al. Conformational Changes Induced by the A21G Flemish Mutation in the Amyloid Precursor Protein Lead to Increased Aß Production // Structure. 2014. Vol. 22, № 3. P. 387-396.

214. Efremov R.G., Alix A.J.P. Environmental Characteristics of Residues in Proteins: Three-Dimensional Molecular Hydrophobicity Potential Approach // J. Biomol. Struct. Dyn. 1993. Vol. 11, № 3. P. 483-507.

215. Marrink S.J. et al. Cholesterol Shows Preference for the Interior of Polyunsaturated Lipid Membranes // J. Am. Chem. Soc. 2008. Vol. 130, № 1. P. 10-11.

216. Harroun T.A., Katsaras J., Wassall S.R. Cholesterol Is Found To Reside in the Center of a Polyunsaturated Lipid Membrane // Biochemistry. 2008. Vol. 47, № 27. P. 7090-7096.

217. Bocharov E.V. et al. Alternative packing of EGFR transmembrane domain suggests that protein-lipid interactions underlie signal conduction across membrane // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2016. Vol. 1858, № 6. P. 1254-1261.

218. Bocharov E.V. et al. The Conformation of the Epidermal Growth Factor Receptor Transmembrane Domain Dimer Dynamically Adapts to the Local Membrane Environment // Biochemistry. 2017. Vol. 56, № 12. P. 1697-1705.

219. Deyts C., Thinakaran G., Parent A T. APP Receptor? To Be or Not To Be // Trends Pharmacol. Sci. 2016. Vol. 37, № 5. P. 390-411.

220. Song Y. et al. Competition Between Homodimerization and Cholesterol Binding to the C99 Domain of the Amyloid Precursor Protein // Biochemistry. 2013. Vol. 52, № 30. P. 50515064.

221. Dominguez L. et al. Impact of membrane lipid composition on the structure and stability of the transmembrane domain of amyloid precursor protein // Proc. Natl. Acad. Sci. 2016. Vol. 113, № 36. P. E5281-E5287.

222. Audagnotto M. et al. Effect of the Synaptic Plasma Membrane on the Stability of the Amyloid Precursor Protein Homodimer // J. Phys. Chem. Lett. 2016. Vol. 7, № 18. P. 35723578.

223. Mielke S.P., Krishnan V.V. Characterization of protein secondary structure from NMR chemical shifts // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2009. Vol. 54, № 3-4. P. 141-165.

224. Kopan R., Ilagan M.X.G. Y-Secretase: proteasome of the membrane? // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 5, № 6. P. 499-504.

225. D A.L.M. Activity of y -Secretase on Substrates Other than APP // Curr. Top. Med. Chem. 2007.

226. Bolduc D.M. et al. The amyloid-beta forming tripeptide cleavage mechanism of Y-secretase // Elife. 2016. Vol. 5. P. e17578.

227. Chen W. et al. Familial Alzheimer's mutations within APPTM increase Aß42 production by enhancing accessibility of s-cleavage site // Nat. Commun. 2014. Vol. 5, № 1. P. 3037.

228. Bharadwaj P. et al. Role of the cell membrane interface in modulating production and uptake of Alzheimer's beta amyloid protein // Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 2018. Vol. 1860, № 9. P. 1639-1651.