Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Шулепко, Михаил Анатольевич

• Шулепко, Михаил Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шулепко, Михаил Анатольевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ТОКСИНОВ И НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА.

1.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

1.2. Механизм активации канала нАХР.

1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора.

1.4. Нейротоксины из яда змей.

1.5. Взаимодействие лигандов нАХР с рецептором и ацетилхолин-связывающим белком.

1.5.1. Структура лиганд-связывающего сайта ацетилхолин-связывающего белка.

1.5.2. Взаимодействие агонистов нАХР с ацетилхолин-связывающим белком.

1.5.3. Взаимодействие антагонистов с нАХР и с ацетилхолин-связывающим белком.

Глава 2. ПОЛУЧЕНИЕ а-НЕЙРОТОКСИНОВ IN VITRO.

2.1. Введение.

2.2. Продукция нейротоксинов в виде гибридных белков в E.coli.

2.3. «Прямая» экспрессия генов нейротоксинов в E.coli.

2.4. Секреция неротоксинов в E.coli.

ЧАСТЬ II. ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Материалы.

3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

3.1.2. Штаммы.

3.1.3. Плазмидные вектора.

3.1.4. Питательные .среды для роста бактериальных культур.

3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

3.2. Методы.

3.2.1.Общие молекулярно-генетические методы.

3.2.2. Конструирование химерных длинных а-нейротоксинов.

3.2.3. Экспрессия генов химерных токсинов в секретирующей конструкции.

3.2.4. Выделение и очистка секретируемых нейротоксинов.

3.2.5. Анализ локализации рекомбинантных белков.

3.2.6. Получение конструкций для бактериальной продукции «слабого» токсина WTX

3.2.7. Секреция «слабого» токсина.

3.2.8. Продукция «слабого» токсина в виде слитной полипептидной цепи с тиоредоксином.

3.2.9. Выделение и очистка гибридного белка.

3.2.10. Продукция «слабого» токсина в виде тел включения в клетках Е. coli.

3.2.11. Отмывание телец включения.

3.2.12. Очистка «слабого» токсина из тел включения.

3.2.13. Ренатурация*«слабого» токсина.

3.2.14. ВЭЖХ нейротоксинов.

3.2.15. Методы структурных исследований.

3.2.15.1. Спектры 'Н-ЯМР.

3.2.15.2. Получение двумерных и трехмерных гетероядерных ЯМР-спектров.

3.2.16. Методы биологических исследований. f 3.2.16.1. Ингибирование химерными а-нейротоксинами ионных токов в ооцитах

Xenopus laevis.

3.2.16.2. Взаимодействие рекомбинантного \¥ТХ с мембранами из электрического органа ската Т-огрес1о саНАэгшса.

3.2.16.3. Взаимодействие рекомбинантного \\ГГХ с клетками СТ^Сь трансфецированными а7нАХР человека.

3.2.17. Моделирование химерных нейротоксинов и их комплексов с нАХР.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Исследование влияния точечной замены АЫЬуэ в центральной петле длинных анейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР аЗр2 типа.

4.1.1. Конструирование химерных длинных а-нейротоксинов.

4.1.2. Биосинтез, выделение и очистка ]МТП/1 и 1МТП/1[А29К].

4.1.3. Анализ физико-химических свойств 1чГГП/1 и НТПЯ[А29К].

4.1.4. Исследование пространственной структуры химерных а-нейротоксинов.

4.1.5. Исследование биологической активности химерных токсинов.

4.1.6. Моделирование комплексов химерных токсинов с нАХР.

4.2. Структурно-функциональные исследования «слабого» токсина и его мутантных форм.

4.2.1. Экспрессирующие конструкции для продукции «слабого» токсина.

4.2.2. Биосинтез «слабого» токсина и его мутантных форм.

4.2.3. Ренатурация «слабого» токсина из телец включения.

4.2.4. Анализ рекомбинантного «слабого» токсина.

4.2.5. Анализ пространственной структуры рекомбинантного «слабого» токсина.

4.2.6. Исследование биологической активности «слабого» токсина.

4.2.7. Конструирование и исследование биологической активности мутантных вариантов «слабого» токсина.

4.2.8. ЯМР-анализ влияния точечных мутаций «слабого» токсина на конформационную гетерогенность.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование лиганд-рецепторных взаимодействий на примере никотинового ацетилхолинового рецептора и токсинов из яда змей»

Актуальность темы. Изучение лиганд-рецепторных взаимодействий является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биологии и биофизики. Эти взаимодействия играют центральную роль во многих процессах, таких как гормональная регуляция, межклеточная сигнализация, транспорт биомолекул, передача нервного импульса и др.

Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов, и является одним из наиболее распространенных рецепторов центральной и периферической нервных систем млекопитающих. В зависимости от локализации рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса: мышечные и нейрональные. а-Нейротоксины яда змей известны как высокоспецифичные конкурентные ингибиторы нАХР. Эти белки имеют характерную «трехпетельную» Р-структуру, стабилизированную 4-5 дисульфидными связями. Небольшие размеры и жесткая структура делают а-нейротоксины удобными инструментами для исследования свойств нАХР. Со структурной точки зрения а-нейротоксины из яда змей можно подразделить на 3 класса: короткие, длинные и «необычные» нейротоксины. Короткие и длинные а-нейротоксины эффективно ингибируют нАХР мышечного типа, однако только длинные а-нейротоксины с пятой дисульфидной связью в центральной петле эффективно взаимодействуют с нАХР нейронального типа. Мишенями действия «необычных» токсинов с пятой дисульфидной связью, локализованной в 1\[-концевой петле, выступают как мышечные нАХР, так и нейрональные нАХР, а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, относящиеся к семейству в-белок сопряженных рецепторов.

Изучение механизмов, лежащих в основе взаимодействия а-нейротоксин/нАХР, представляет интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и необходимо для создания новых лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний нервной системы, связанных с дисфункциями нАХР.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось получение методами генной и белковой инженерии а-нейротоксинов длинного и «необычного» типов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов, а также выявление структурных детерминант, важных для взаимодействия этих токсинов с различными подтипами нАХР. Основные задачи исследования.

1. Получить гены химерных длинных а-нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII) путем введения в последовательность NTII дополнительных аминокислотных остатков, и «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX, weak toxin), относящегося к классу «необычных» токсинов.

2. Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантных а-нейротоксинов, их мутантных и изотопно-меченых вариантов. Наработать рекомбинантные а-нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченые варианты в необходимых для исследования количествах. Провести физико-химический анализ рекомбинантных белков.

3. Исследовать биологические свойства химерных длинных а-нейротоксинов. Изучить специфичность химерных длинных а-нейротоксинов по отношению к нейрональным нАХР а7 и a3ß2 типов.

4. Исследовать биологическую активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному и нейрональному нАХР а7 типа. Идентифицировать аминокислотные остатки мутантных вариантов WTX, которые важны для взаимодействия с различными типами нАХР.

5. Исследовать влияние конформационной гетерогенности в молекуле WTX на функциональную активность.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1. На примере химерных длинных а-нейротоксинов впервые исследовано влияние точечной мутации Ala/Lys в центральной петле длинных а-нейротоксинов на взаимодействие с нейрональным нАХР a3ß2 типа.

2. Впервые разр'аботана эффективная система продукции «слабого» токсина из яда Naja kaouthia. Впервые разработаны протоколы выделения и очистки рекомбинантного WTX.

3. Впервые получены мутантные формы WTX, выявлены аминокислотные остатки токсина, важные для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального типов.

4. Впервые получен 15М-меченный WTX и проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах токсина.

5. Впервые изучено влияние точечных мутаций WTX на конформационную гетерогенность молекулы токсина.

Данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, будут интересны не только с точки зрения фундаментальной науки, но, в перспективе, также могут быть применены для разработки лекарственных препаратов, имитирующих свойства лигандов нАХР.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Шулепко, Михаил Анатольевич

выводы

1. Получены гены химерных длинных а-нейротоксинов, созданных на основе нейротоксина II из яда Naja oxiana (NTII), путем введения в центральную петлю NTII дополнительных аминокислотных остатков, а также гены «слабого» токсина из яда Naja kaouthia (WTX), относящегося к классу «необычных» токсинов, и его мутантных вариантов. Разработанные эффективные схемы биосинтеза, выделения и очистки позволили наработать рекомбинантные а-нейротоксины, их мутантные и изотопно-меченные варианты в необходимых для исследования количествах.

2. Показано, что химерные а-нейротоксины, полученные на основе NTII, приобрели способность взаимодействовать с нАХР а7 типа, что подтвердило ключевую роль центральной петли длинных а-нейротоксинов в селективном взаимодействии с этим рецептором. Показано, что замена Ala/Lys в центральной петле длинных а-нейротоксинов не приводит к возникновению активности по отношению к нАХР a3ß2 типа.

3. Исследована биологическая активность рекомбинантного WTX и его мутантных вариантов по отношению к мышечному нАХР и нейрональному нАХР а7 типа.

Показано, что:

- удаление дополнительной дисульфидной связи в N-концевой петле WTX увеличивает его сродство к рецепторам обоих типов;

- остаток ТфЗб важен только для взаимодействия с нАХР мышечного типа;

- cis-trans изомерия пептидной связи Arg32-Pro33 в молекуле WTX, как и наличие остатка Рго7, не оказывает значительного влияния на биологическую активность токсина;

- заряженные остатки А^31 и А^32 центральной петли токсина важны для взаимодействия с нАХР мышечного и нейронального а7 типа, при этом замена обоих остатков аргинина приводит к селективной потере активности по отношению к нейрональному нАХР а7 типа.

4. Методами спектроскопии ЯМР проведено полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах 15М-меченого аналога \¥ТХ. Изучено влияние точечных мутаций \\ТХ на конформационную гетерогенность токсина, обусловленную ш-Кат изомерией пептидной связи А^32-Рго33.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и искреннюю признательность своим научным руководителям к.б.н. Екатерине Назымовне Люкмановой и профессору д.б.н. Дмитрию Александровичу Долгих, а также декану Биологического факультета МГУ академику Михаилу Петровичу Кирпичникову, которые обеспечили возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывали всевозможную помощь и поддержку и проявляли неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН к.ф-м.н. Захару Олеговичу Шенкареву и к.ф-м.н. Александру Сергеевичу Парамонову, а также руководителю лаборатории профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву за неоценимую помощь в исследовании полученных белков методами ЯМР-спектроскопии.

Выражаю свою искреннюю признательность руководителю лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН, член-корреспонденту РАН Виктору Ионовичу Цетлину, а также сотрудникам лаборатории д.х.н. Игорю Евгеньевичу Кашеверову и д.б.н. Юрию Николаевичу Уткину за огромную помощь в исследовании биологических свойств и тестировании активностей полученных белков.

Приношу свою глубокую благодарность Даниэлю Бертрану, профессору кафедры нейробиологии медицинского факультета Центрального медицинского университета, Женева, Швейцария.

Хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории инженерии белка ИБХ РАН за поддержку и дружелюбие, неизменно помогавшее мне на всем пути выполнения диссертационной работы.

Отдельную благодарность хочу выразить сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ее руководителю д.ф-м.н. Константину Вольдемаровичу Шайтану за своевременную помощь и внимание, оказываемое во время выполнения диссертационной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в диссертационной работе результаты демонстрируют важное значение аминокислотных остатков, расположенных в петлевых участках а-нейротоксинов для селективного взаимодействия с никотиновыми ацетилхолиновыми рецептороми. В рамках работы на примере полученных химерных а-нейротоксинов было подтверждено, что различие в специфичности действия а-нейротоксинов из ядов змей на нАХР а7 типа обусловлено аминокислотными остатками, расположенными на конце центральной петли токсинов. В то же время за взаимодействие а-нейротоксинов с другими типами нАХР могут быть ответственны и другие участки молекул токсинов. Так химерный токсин, >Ш1/1[А29К], полученный с целью проверить теорию [134] о том, что замена А1а/ЬуБ в центральной петле длинных а-нейротоксинов приводит к возникновению активности по отношению к нАХР а3|32 типа, не приобрел способности к специфическому взаимодействию с этим рецептором. На основе данных, полученных в результате работы по сайт-направленному мутагенезу "слабого" нейротоксина \¥ТХ, было показано, что кроме остатков центральной петли, другие аминокислотные остатки, также могут иметь важное значение для взаимодействия как с нейрональным, так и с мышечным нАХР.

Результаты диссертационной работы указывают на возможность создания новых пептидных молекул, селективно действующих на отдельные подтипы мембранных рецепторов, что имеет фундаментальное и практическое значение для современной медицины и фармакологии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шулепко, Михаил Анатольевич, 2009 год

1. Hucho F., Weise C., Ligand-Gated Ion Charm ells. Angew Chem, 2001. 40: p. 3100-3116.

2. Gotti C., Moretti M., Gaimarri A., Zanardi A., Clementi F., Zoli M., Heterogeneity and complexity of native brain nicotinic receptors. Biochem Pharmacol, 2007. 74(8): p. 1102-11.

3. Nashmi R., Lester .H., CNS localization of neuronal nicotinic receptors. J Mol Neurosci, 2006. 30(1-2): p. 181-4.

4. McKay B.E., Placzek A.N., Dani J. A., Regulation of synaptic transmission and plasticity by neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Biochem Pharmacol, 2007. 74(8): p. 1120-33.

5. Martin-Ruiz C.M., Haroutunian V.H., Long P., Young A.H., Davis K.L., Perry E.K., Court J.A., Dementia rating and nicotinic receptor expression in the prefrontal cortex in schizophrenia. Biol Psychiatry, 2003. 54(11): p. 1222-33. '

6. Scheffer LE., Bhatia K.P., Lopes-Cendes I., Fish D.R., Marsden C.D., Andermann F., Andermann E., Desbiens R., Cendes F., Manson J.I., Autosomal dominant frontal epilepsy misdiagnosed as sleep disorder. Lancet, 1994. 343(8896): p. 515-7.

7. Hogg R.C. and Bertrand D., Regulating the regulators: the role of nicotinic acetylcholine receptors in human epilepsy. Drug News Perspect, 2003. 16(5): p. 261-6.

8. Moulard B., Picard F., Hellard S., Agulhon C,.Weiland S., Favre I., Bertrand S., Malafosse A., Bertrand D., Ion channel variation causes epilepsies. Brain Res Brain Res Rev, 2001. 36(2-3): p. 275-84.

9. Hogg R.C. and Bertrand D., Neuronal nicotinic receptors and epilepsy, from genes to possible therapeutic compounds. Bioorg Med Chem Lett, 2004. 14(8): p. 18.59-61.

10. Hogg R.C. and Bertrand D., Neuroscience. What genes tell us about nicotine addiction. Science, 2004. 306(5698): p. 983-5.

11. Changeux, J.P., Nicotinic receptors and nicotine addiction. C R Biol, 2009. 332(5): p. 421-5.

12. Dohrman D.P. and Reiter C.K., Ethanol modulates nicotine-induced upregulation ofnAChRs. Brain Res, 2003. 975(1-2): p. 90-8.

13. Shen X.M., Ohno K., Tsujino A., Brengman J.M., Gingold M., Sine S.M., Engel A.G., Mutation causing severe myasthenia reveals functional asymmetry of AChR signature cystine loops in agonist binding and gating. J Clin Invest, 2003. 111(4): p. 497-505.

14. Sine S.M., Ohno K., Bouzat C., Auerbach A., Milone M., Pruitt J.N., Engel A.G., Mutation of the acetylcholine receptor alpha subunit causes a slow-channel myasthenic syndrome by enhancing agonist binding affinity. NEURON, 1995. 15(1): p. 229-39.

15. Weiland S., Bertrand D. and Leonard S., Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: from the gene to the disease. Behav Brain Res, 2000. 113(1-2): p. 43-56.

16. Martin-Ruiz C.M., Lee M., Perry R.H., Baumann M., Court J.A., Perry E.K., Molecular analysis of nicotinic receptor expression in autism. Brain Res Mol Brain Res, 2004.' 123(1 -2): p. 81-90.

17. Hogg R.C., Raggenbass M., Bertrand D., Nicotinic acetylcholine receptors: from structure to brain function. Rev Physiol Biochem Pharmacol, 2003. 147: p. 1-46.

18. Egleton R.D., Brown K.C., Dasgupta P., Angiogenic activity of nicotinic acetylcholine receptors: implications in tobacco-related vascular diseases. Pharmacol Ther, 2009. 121(2): p. 205-23.

19. Changeux J.P. and Taly A., Nicotinic receptors, allosteric proteins and medicine. Trends Mol Med, 2008.14(3): p. 93-102.

20. Changeux J.P. and Edelstein S.J., Allosteric mechanisms of signal transduction. Science, 2005. 308(5727): p. 1424-8.

21. Tsetlin VI., Hucho F., Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications FEBS lett, 2004. 557 p. 9-13

22. Lai R. and Yu L., Atomic force microscopy of cloned nicotinic acetylcholine receptor expressed in Xenopus oocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(15): p. 7280-4.

23. Rigler P., Ulrich W.P., Hovius R., Downscaling Fourier transform infrared spectroscopy to the micrometer and nanogram scale: secondary stmcture of serotonin and acetylcholine receptors. Biochemistry, 2003. 42(47): p. 14017-22. "

24. Schapira M., Abagyan R. and Totrov M., Structural model of nicotinic acetylcholine receptor isotypes bound to acetylcholine and nicotine. BMC Struct Biol, 2002. 2: p. 1.

25. Unwin, N., The nicotinic acetylcholine receptor of the Torpedo electric ray. J Struct Biol, 1998.121(2): p. 181-90.

26. Unwin, N.,. Structure and action of the nicotinic acetylcholine receptor explored by electron microscopy. FEBS lett, 2003. 555(1): p. 91-5.

27. Unwin N., Miyazawa A., Li J., Fujiyoshi Y., Activation of the nicotinic acetylcholine receptor involves a switch in conformation of the alpha subunits. J Mol Biol, 2002. 319(5): p. 1165-76.

28. Wise D.S., Schoenborn B.P. and Karlin A., Structure of acetylcholine receptor dimer determined by neutron scattering and electron microscopy. J Biol Chem; 1981. 256(8): p. 4124-6.

29. Wise D.S., Wall J. and Karlin A., Relative locations of the beta and delta chains of the acetylcholine receptor determined by electron microscopy of isolated receptor (rimer. J Biol Chem, 1981. 256(24): p. 12624-7.

30. Yao Y., Wang J., Viroonchatapan N., Samson A., Chill J., Rothe E., Anglister J., Wang Z.Z., Yeast expression and NMR analysis of the extracellular domain of muscle nicotinic acetylcholine receptor alpha subunit. J Biol Chem, 2002. 277(15): p. 12613-21.

31. Fischer M.^Corringer P.J., Schott K., Bâcher A., Changeux J. P., A method for soluble overexpression of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor extracellular domain. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(6): p. 3567-70.

32. Mishina M., Structure and function of the nicotinic acetylcholine receptor. Seikagaku, 1986. 58(10): p. 1275-91.

33. Tank D.W., Huganir R.L., Greengard P., Webb W.W., Patch-recorded single-channel currents of the purified and reconstituted Torpedo acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1983. 80(16): p. 5129-33.

34. Unwin N., Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A resolution J Mol Biol, 2005. 346(4): p. 967-8

35. Anand R., Conroy, Schoepfer W.G., Whiting R., Lindstrom P., J. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors expressed in Xenopus oocytes have a pentameric quaternary structure. J Biol Chem, 1991. 266(17): p. 11192-8.

36. Boorman J.P., Groot-Kormelink P.J. and Sivilotti L.G., Stoichiometry of human recombinant neuronal nicotinic receptors containing the b3 subunit expressed in Xenopus oocytes. J Physiol, 2000. 529 Pt 3: p. 565-77.

37. Groot-Kormelink P.J., Boorman J.P. and Sivilotti L.G., Formation of functional alpha3beta4alpha5 human neuronal nicotinic receptors in Xenopus oocytes: a reporter mutation approach. Br J Pharmacol, 2001. 134(4): p. 789-96.

38. Groot-Kormelink P.J., Luyten W., Colquhoun H., Sivilotti L.G., A reporter mutation approach shows incorporation of the "orphan " subunit beta3 into a functional nicotinic receptor. J Biol Chem, 1998. 273(25): p. 15317-20.

39. Ramirez-Latorre J., Yu C.R., Qu X., Perin F., Karlin A., Role L., Functional contributions of alpha5 subunit to neuronal acetylcholine receptor channels. Nature, 1996. 380(6572): p. 347-51.

40. Corringer, P.J., Le Novere N. and Changeux J.P., Nicotinic receptors at the amino acid level. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2000. 40: p. 431-58.

41. McGehee D.S. and Role L.W., Physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors expressed by vertebrate neurons. Annu Rev Physiol, 1995. 57: p. 521-46.

42. Galzi J.L. and Changeux J.P., Neuronal nicotinic receptors: molecular organization and regulations. Neuropharmacology, 1995. 34(6): p. 563-82.

43. Huganir R.L. and Greengard P., Regulation of neurotransmitter receptor desensitization by protein phosphorylation. NEURON, 1990. 5(5): p. 55567.

44. Beroukhim R. and Unwin N., Three-dimensional location of the main immunogenic region of the acetylcholine receptor. NEURON, 1995. 15(2): p. 323-31.

45. Unwin, N., Acetylcholine receptor channel imaged in the open state. Nature, 1995. 373(6509): p. 37-43.

46. Miyazawa A., Fujiyoshi Y., Stowell M., Unwin N., Nicotinic acetylcholine receptor at'4.6 A resolution: transverse tunnels in the channel wall. J Mol Biol, 1999. 288(4): p. 765-86.

47. Miyazawa A., Fujiyoshi Y. and Unwin N., Structure and gating mechanism of the acetylcholine receptor pore. Nature, 2003. 423(6943): p. 949-55.

48. West A.P., Bjorkman P.J., Dougherty D.A., Lester H.A., Expression and circular dichroism studies of the extracellular domain of the alpha submit of the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem, 1997. 272(41): p. 25468-73. "

49. Brejc K., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van Der Oost J., Smit A.B., Sixma T.K., Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. Nature, 2001. 411(6835): p. 269-76.

50. Celie P.H., van Rossum-Fikkert S.E., van Dijk W.J., Brejc K., Smit A.B., Sixma T.K., Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures. NEURON, 2004. 41(6): p. 907-14.

51. Ulens C., Hogg R.C., Celie P.H., Bertrand D., Tsetlin V., Smit A.B., Sixma T.K., Structural determinants of selective alpha-conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(10): p. 3615-20.

52. Costa V., Nistri A., Cavalli A., Carloni P., A structural model of agonist binding to the alpha3beta4 neuronal nicotinic receptor. Br J Pharmacol, 2003.140(5): p. 921-31.

53. Tasneem A., Iyer L.M., Jakobsson E., Aravind L., Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol, 2005. 6(1):.p. R4.

54. Kasai M., Changeux J.P., Monnerie L., In vitro interaction of 1-anilino 8 naphthalene sulfonate with excitable membranes isolated from the electric organ of Electrophorus electricus. Biochem Biophys Res Commun, 1969. 36(3): p. 420-7.

55. Miledi R., Molinoff P, Potter L.T., Isolation of the cholinergic receptor protein of Torpedo electric tissue. Nature, 1971. 229(5286): p. 554-7.

56. Lindstrom J., Nicotinic acetylcholine receptors in health and disease. Mol Neurobiol, 1997. 15(2): p. 193-222.

57. Chang C.C., Looking back on the discovery of alpha-bungarotoxin. J Biomed Sci, 1999. 6(6): p. 368-75.

58. Lee C.Y., Chemistry and pharmacology of polypeptide toxins in snake venoms. Annu Rev Pharmacol, 1972. 12: p. 265-86.

59. Chang., The action of snake venoms on nerve and muscle Snake venoms, Handbook vf experimental pharmacology 1979.Vol. 52 Berlin: SpringerVerlag; p. 309-376.

60. Karlsson., Chemistry of protein toxins in snake venom Snake venoms, Handbook of experimental pharmacology 1979. Vol. 52159-212.

61. Rowan E.G., What does beta-bungarotoxin do at the neuromuscidar junction? Toxicon, 2001. 39(1): p. 107-18.

62. Yang, Structure-function relationship of phospholipase A2 from snake venoms. J Toxicol Toxin Rev., 1994.

63. Cervenansky C, Harvey D.F., Karlsson A.L., Fasciculins,anticholinesterase toxins from mamba venoms: biochemistry and pharmacology. Harvey AL, editor. Snake toxins., 1991: p. p. 303-321.

64. Chiappinelli V.A., Weaver W.R., McLane K.E., Conti-Fine B.M., Fiordalisi J.J., Grant G.A., Binding of native kappa-neurotoxins and site-directed mutants to nicotinic acetylcholine receptors. Toxicon, 1996. 34(11-12): p. 1243-56.

65. Bradley K.N., Muscarinic toxins from the green mamba. Pharmacol Ther, 2000. 85(2): p. 87-109.

66. Jerusalinsky D., Kornisiuk E., Alfaro P., Quillfeldt J., Ferreira A., Rial V.E., Duran R.C, Ervenansky C., Muscarinic toxins: novel pharmacological tools for the muscarinic cholinergic system. Toxicon, 2000. 38(6): p. 747-61.

67. Dutton J.L. and Craik D.J., alpha-Conotoxins: nicotinic acetylcholine receptor antagonists as pharmacological tools and potential drag leads. Curr Med Chem, 2001. 8(4): p. 327-44.

68. Mcintosh J.M., Gardner S., Luo S., Garrett J.E., Yoshikami D., Conns peptides: novel probes for nicotinic acetylcholine receptor structure and function. Eur J Pharmacol, 2000. 393(1-3): p. 205-8.

69. Mcintosh J.M., Santos A.D, Olivera B.M., Conus peptides targeted to specific nicotinic acetylcholine receptor subtypes. Annu Rev Biochem, 1999. 68: p: 59-88.

70. Kini R.M., Molecular moulds with multiple missions: functional sites in three-finger toxins. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2002. 29(9): p. 815-22.

71. Menez A., Functional architectures of animal toxins: a clue to drug design? Toxicon, 1998. 36(11): p. 1557-72.

72. Servent D., Menez. A., Snake neurotoxins that interact with nicotinic acetylcholine receptors. 2001. Vol. 1.: p. p. 385-425.

73. Tsetlin V., 'Snake venom alpha-neurotoxins and other 'three-finger'proteins. Eur J Biochem, 1999. 264(2): p. 281-6.

74. Hodgson W.C., Wickramaratna J.C., In vitro neuromuscidar activity of snake venoms. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2002. 29(9): p. 807-14.

75. Menez A., Servent D., Gasparini S., The binding sites of animal toxins involve two components: a clue for selectivity, evolution and design of proteins? Menez A, editor. Perspectives in molecular toxinology, 2002: p. 175-200.

76. Endo T, Tamiya N., Structure-function relationships of postsynaptic neurotoxins from snake venoms. In: Harvey AL, editor. Snake toxins., 1991: p. 165-222.

77. Nirthanan S., Gopalakrishnakone P., Gwee M.C., Khoo H.E., Kini R.M., Non-conventional toxins from Elapid venoms. Toxicon, 2003. 41(4): p. 397407.

78. Fruchart-Gaillard C., Mourier G., Marquer C., Menez A., Servent D., How three-finger-fold toxins interact with various cholinergic receptors. J Mol Neurosci, 2006. 30(1-2): p. 7-8.

79. Chicheportiche R., Vincent J.P., Kopeyan C., Schweitz H., Lazdunski M., Structure-function relationship in the binding of snake neurotoxins to the torpedo membrane receptor. Biochemistry, 1975. 14(10): p. 2081-91.

80. Mebs D. and Claus I., Amino acid sequences and toxicities of snake venom components, in Shake toxins, A.L. Harvey, Editor. 1991, Pergamon Press: New York. p. 425-447.

81. Kim, H.S. and N. Tamiya, Amino acid sequences of two novel long-chain neurotoxins from the venom of the sea snake Laticaudci colubrina. Biochem J, 1982. 207(2): p. 215-23.

82. Fleming T.J., O'HUigin C. and Malek T.R., Characterization of two novel Ly-6 genes. Protein sequence and potential structural similarity to alpha-bungarotoxin and other neurotoxins. J Immunol, 1993. 150(12): p. 5379-90.

83. Gumley T.P., McKenzie I.F. and Sandrin M.S., Tissue expression, structure and function of the murine Ly-6 family of molecules. Immunol Cell Biol, 1995. 73(4); p." 277-96.

84. Hanninen A., Jaakkola I., Salmi M., Simell O., Jalkanen S., Ly-6C regulates endothelial adhesion and homing of CD8(+) T cells by activating integrin-dependent adhesion pathways. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(13): p. 6898-903.

85. Miwa J.M., Ibanez-Tallon I., Crabtree G.W., Sanchez R., Sali A., Role L.W., Heintz N., lynxl, an endogenous toxin-like modulator of nicotinic acetylcholine receptors in the mammalian CNS. NEURON, 1999. 23(1): p. 105-14.

86. Ibanez-Tallon I., Miwa J.M., Wang H.L., Adams N.C., Crabtree G. W., Sine S.M., Heintz N., Novel modulation of neuronal nicotinic acetylcholine receptors by association with the endogenous pro to toxin lynxl. NEURON, 2002.33(6): p. 893-903.

87. Choo Y.M., Lee B.H., Lee K.S., Kim B.Y., Li J., Kim J.G., Lee J.H., Sohn H.D., Nah S.Y., Jin B.R., Pr-lynxl, a modidator of nicotinic acetylcholine receptors in the insect. Mol Cell Neurosci, 2008. 38(2): p. 224-35.

88. Bouadjar B., Benmazouzia S., Prud'homme J.F., Cure S., Fischer J., Clinical and genetic studies of 3 large, consanguineous, Algerian families with Mai de Meleda. "Arch Dermatol, 2000. 136(10): p. 1247-52.

89. Arredondo' J., Chernyavsky A.I., Webber R.J., Grando S.A., Biological effects of SLURP-1 on human keratinocytes. J Invest Dermatol, 2005. 125(6): p. 1236-41.

90. Tsuji H., Okamoto K., Matsuzaka Y., Iizuka H., Tamiya G., Inoko H., SLURP-2, a novel member of the human Ly-6 superfamily that is up-regulated in psoriasis vulgaris. Genomics, 2003. 81(1): p. 26-33.

91. Arredondo J., Chernyavsky A.I., Jolkovsky D.L., Webber R.J., Grando S.A., SLURP-2: A novel cholinergic signaling peptide in human mucocutaneous epithelium. J Cell Physiol, 2006. 208(1): p. 238-45.

92. Patrick H.N., Celie P.H., van Rossum-Fikkert S.E., Willem J., van Dijk, Brejc K., Smit A.B. and Sixma T.K., Nicotine and Carbamylcholine Binding to Nicotinic Acetylcholine Receptors as Studied in AChBP Crystal Structures NEURON, 2004. 41: p. 907-914.

93. Hansen S.B., Huxford T., Marchot P., Taylor P. and^Bourne Y., Structures of Aplysia AChBP complexes with nicotinic agonists and antagonists reveal distinctive binding interfaces and conformations. The EMBO Journal, 2005 24(20) p. 3635-3646.

94. Tsetlin V.I.", Hucho F., Nicotinic acetylcholine recptor at atomic resolution. Curr opin Pharmacol 2009. 9(3): p. 306-10.

95. Marinou M. and Tzartos S.J., Identification of regions involved in the binding of alpha-bungarotoxin to the human alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor using synthetic peptides. Biochem J, 2003. 372(Pt 2): p. 543-54.

96. Neumann £)., Barchan D., Safran A., Gershoni J.M., Fuchs S., Mapping of the alpha-bungarotoxin binding site within the alpha subunit of the acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83(9): p. 3008-11.

97. Gotti C., Frigerio F., Bolognesi M., Longhi R., Racchetti G., Clementi F., Nicotinic acetylcholine receptor: a structural model for alpha-subunitpeptide 188-201, the putative binding site for cholinergic agents. FEBS lett, 1988. 228(1): p. 118-22.

98. Bourne Y., Talley T.T., Hansen S.B., Taylor P., Marchot P., Crystal structure of a Cbtx-AChBP complex reveals essential interactions between snake alpha-neurotoxins and nicotinic receptors. EMBO J, 2005. 24(8): p. 1512-22.

99. Jacobsen R.B., DelaCruz R.G., Grose J.H., Mcintosh J.M., Yoshikami D., Olivera B.M., Critical residues influence the affinity and selectivity of alpha-conotoxin MI for nicotinic acetylcholine receptors. Biochemistry, 1999. 38(40): p. 13310-5.

100. Luo S., Nguyen T.A., Cartier G.E., Olivera B.M., Yoshikami D., Mcintosh J.M., Single-residue alteration in alpha-conotoxin PnIA switches its nAChR subtype selectivity. Biochemistiy, 1999. 38(44): p. 14542-8.

101. Hogg R.C.; Hopping G., Alewood P.F., Adams D.J., Bertrand D., Alpha-conotoxins PnIA and AlOLJPnIA stabilize different states of the alpha7-L247T nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem, 2003. 278(29): p. 26908-14.

102. Dellisanti C.D., Yao Y., Stroud J.C., Wang Z.Z., Chen L., Crystal structure of the extracellular domain of nAChR alpha 1 bound to alpha-bungarotoxin at 1.94 A resolution. NatNeurosci, 2007. 10(8): p. 953-62.

103. Mordvintsev D.Y., Polyak Y.L., Kuzmin D.A., Levtsova O.V., Tourleigh Y.V., Utkin Y., Shaitan K.V., Tsetlin V.I., Computer modeling of binding of diverse weak toxins to nicotinic acetylcholine receptors. Comput Biol Chem, 2007. 31(2): p. 72-81.

104. Sorensen H.P. and Mortensen K.K., Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol, 2005. 115(2): p. 113-28.

105. Berndt C., Lillig C.H. and Holmgren A., Thioredoxins and glutaredoxins as facilitators of protein folding. Biochim Biophys Acta, 2008. 1783(4): p. 64150.

106. McCoy J. and La Ville E., Expression and purification of thioredoxin fusion proteins. CurrProtoc Protein Sci, 2001. Chapter 6: p. Unit 6 7.

107. Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A., Structure, function and evolution of glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily. Biochem J, 2001. 360(1): p. 1-16.

108. Inouye S. and Sahara Y., Expression and purification of the calcium binding photoprotein mitrocomin using ZZ-domain as a soluble partner in E. coli cells. Protein Expr Purif, 2009.

109. Marston F.A., The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem J, 1986. 240(1): p. 1-12.

110. LaVallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L., Schendel P.F., McCoy J.M., A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y), 1993. 11(2): p. 187-93.

111. Kapust R.B., Tozser J., Copeland T.D., Waugh D.S., The PГ specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 294(5): p. 949-55.

112. Tan S., Wu W., Liu J., Kong Y., Pu Y., Yuan R., Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence. Protein Expr Purif, 2002. 25(3): p. 430-6.

113. Messens J. and Collet J.F., Pathways of disulfide bond formation in Escherichia coli. Int J Biochem Cell Biol, 2006. 38(7): p. 1050-62.

114. Bowden G.A., and Georgiou G., Folding and aggregation of beta-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli. J Biol Chem, 1990. 265(28): p. 16760-6. >

115. Rosenthal J.A., Hsu S.H., Schneider D., Gentile L.N., Messier N.J., Vaslet C.A., Hawrot E., Functional expression and site-directed mutagenesis of a synthetic gene for alpha-bungarotoxin. J Biol Chem, 1994. 269(15): p. 11178-85.

116. Li J., Zhang H., Liu J., Xu K., Novel genes encoding six kinds of three-finger toxins in Ophiophagus hannah (king cobra) and function characterization of two recombinant long-chain neurotoxins. Biochem J, 2006. 398(2): p. 23342.

117. Gong N., Armugam A. and Jeyaseelan K., Postsynaptic short-chain neurotoxins from Pseudonaja textilis. cDNA cloning, expression and protein characterization. Eur J Biochem, 1999. 265(3): p. 982-9.

118. Hsieh H.C., Kumar Т.К. and Yu C., Cloning, over expression, and characterization of cobrotoxin. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 320(4): p. 1374-81.

119. Antil S., Servent D. and Menez A., Variability among the sites by which curaremimetic toxins bind to torpedo acetylcholine receptor, as revealed byidentification of the functional residues of alpha-cobratoxin. J Biol Chem, 1999. 274(49): p. 34851-8.

120. Wang Y., Jing L. and Xu K., A unique approach for high level expression and production of a recombinant cobra neurotoxin in Escherichia coli. J Biotechnol, 2002. 94(3): p. 235-44.

121. Chang L., Lin J., Wu P., Chang C., Hong E., cDNA sequence analysis and expression • of kappa-bungarotoxin from Taiwan banded krait. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 230(1): p. 192-5.

122. Schein C.H., Noteborn M.H., Biotechnology (N Y), 1988. 6(3): p. 291-295.

123. Young H.S., Herbette L.G. and Skita V., Alpha-bungarotoxin binding to acetylcholine receptor membranes studied by low angle X-ray diffraction. Biophys J, 2003. 85(2): p. 943-53.

124. Chang L.S., Chen K.C., Wu B.N., Lin S.K., Wu P.F., Hong Y.R., Yang C. C., Expression and mutagenesis studies of cobrotoxin from Taiwan cobra. Biochem Biophys Res Commun, 1999. 263(3): p. 652-6.

125. Fiordalisi J. J., al-Rabiee R., Chiappinelli V.A., Grant G.A., Affinity of native kappa-bungarotoxin and site-directed mutants for the muscle nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry, 1994. 33(44): p. 12962-7.

126. Bocharov E.V., Lyukmanova E.N., Ermolyuk Ya.S., Shulga A.A., Pluzhnikov K.A., Dolgikh DA., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S., Resonance Assignment ofljC 15N-Labeled Snake Neurotoxin II from Naja oxiana. Appl. Magn. Res., 2003. 24: p. 247-254.

127. Bullock W.O., Fernande. J.M., Sort J.M., XLI-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection Biotechniques, 1987. 5: p. 376-378.

128. Studier F.W. and Moffatt B.A., Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol, 1986. 189(1): p. 113-30.174.175.176.177.178. 179

129. Hanahan D., Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol, 1983. 166(4): p. 557-80.