Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Парамонов, Александр Сергеевич

• Парамонов, Александр Сергеевич
• кандидат физико-математических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Парамонов, Александр Сергеевич

Список иллюстраций

Список таблиц

Введение б

Глава 1. Обзор литературы

§ 1. Исследование структуры мембранных белков. Мембран омоделирующие среды.

1.1. Общие сведения о мембранных белках.

1.2. Метод ЯМР н его применение к мембранным белкам

1.3. Свойства различных типов мембранных миметиков

§ 2. Липид-белковые нанодиски.

2.1. Липопротеины плазмы крови млекопитающих

2.2. Структура и свойства ЛБН.

2.3. Использование ЛБН для солюбилизации мембранных белков и пептидов.

2.4. ЛБН в ЯМР-спектроскопии высокого разрешения

§ 3. Потенциал-зависимые ионные каналы.

3.1. Общая схема строения катионных каналов.

3.2. Классификация каналов.

3.3. Принципы потенциал-зависимой активации.

Глава 2. Материалы и методы

§ 1. Полз^чение объектов исследования и реактивы.

1.1. Получение Антиамебина I.

1.2. Наработка и выделение ВСД-КуАР

1.3. Реактивы.

1.4. Получение ЛБН в комплексе с ВСД-КуАР и ААМ I

§ 2. Экспериментальные методики.

2.1. Подбор условий для структурных ЯМР-исследований ВСД-КуАР.

2.2. Исследование ААМ I и ВСД-КуАР в комплексе с ЛБН

2.3. Анализ размера частиц.

2.4. Структурные исследования ВСД-КуАР.

2.5. Определение динамических характеристик ВСД-КуАР

2.6. Расчет химических сдвигов.

Глава 3. Результаты и обсуждение

§ 1. Подбор мембраномоделирующей среды.

§ 2. ЛБН в качестве мембраномоделирующей среды

2.1. Исследование ААМ-1 в комплексе с ЛБН методом ЯМР

2.2. ЯМР-исследование ВСД-КуАР в комплексе с ЛБН

§ 3. Структура ВСД-КуАРв мицеллах.

3.1. Отнесение сигналов

3.2. Вторичная структура ВСД-КуАР в мицеллах.

3.3. Данные о пространственной структуре ВСД-КуАР

3.4. Расчет химических сдвигов.

3.5. Выводы о структуре ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО

§ 4. Внутримолекулярная динамика ВСД-КуАР в мицеллах

ДФХ/ЛДАО

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии»

Актуальность темы. Исследование строения и функций мембранных белков — одна из наиболее актуальных задач современной биофизики. Важным классом мембранных белков являются потенциал-зависимые ка-тионные (К+, Са2+) каналы. Они участвуют во многих жизненноважных клеточных процессах, включая регуляцию осмотического баланса, возбудимость мембран, передачу нервного импульса [1], н присутствуют в клетках практически всех организмов — от бактерий и архей до человека [2]. Ключевым структурным элементом в механизме действия потенциал-зависимых каналов являются их вольт-сенсорные домены (ВСД), которые отвечают за потенциал-зависимую активацию, реагируя на изменения трансмембранного потенциала конформационными перестройками [3,4].

Изучение структуры катионных каналов и их ВСД интересно по ряду причин. Во-первых, это может помочь в понимании общих принципов протекания потенциал-чувствительных процессов в клетке [4]. Так, структуры, гомологичные ВСД катионных каналов, были обнаружены в белках с принципиально отличной функцией и строением. В частности, потенциал-зависимые протонные каналы млекопитающих функционируют в виде димера субъединиц, имеющих строение, схожее с ВСД [5]. Потенциал-зависимая фосфатаза, обнаруженная у асцидий, имеет ВСД, ковалентно связанный с цитоплазматическим ферментативным доменом [б]. Во-вторых, знание структуры ВСД необходимо для исследований, направленных на создание новых лекарственных препаратов. Известно, что мутации в генах К+, Са2+ каналов являются причиной некоторых наследственных заболеваний человека [7]. ВСД ионных каналов являются мишенью для различных токсинов животного и растительного происхождения, блокирующих потенциал-зависимую активацию [8]. Это открывает перспективы создания новых лекарственных средств, действие которых направлено на модуляцию процесса потенциал-зависимой активации [9].

Объектом исследования в данной диссертационной работе являлся вольт-сенсорный домен потенциал-зависимого К+-канала КуАР (ВСД

KvAP) из термофильной архебактерии Aeropyrum pernix. Имеющиеся на сегодняшний день структурные данные о ВСД-KvAP достаточно противоречивы. Три известные кристаллические структуры, полученные при разных условиях кристаллизации, сильно отличаются друг от друга [10,11]. Было высказано предположение, что важную роль в стабилизации структуры ВСД-KvAP играет мембранное окружение — только плоская бислойная мембрана может обеспечивать нативную конформацию домена [11]. Полученные методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) данные свидетельствуют, что структура изолированного ВСД-KvAP в бислойной мембране близка к структуре ВСД в составе полноразмерного канала в открытом состоянии [12,13].

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — один из наиболее мощных методов структурного анализа. Он позволяет определять не только пространственную структуру изучаемых белков, но и их внутримолекулярную динамику [14]. Для изучения мембранных белков этим методом требуется применение сред, моделирующих биологическую мембрану [15]. Используемые в настоящее время мембраномоделирующие среды (в основном, мицеллы детергентов) не во всех случаях обеспечивают сохранение нативной структуры исследуемого белка. Таким образом, выбор мембраномоделирующей среды является актуальной проблемой для современных ЯМР-исследований [16].

В литературе имеются данные о свойствах принципиально новой среды для солюбилизации мембранных белков — так называемых липид-белковых нанодисков (JIBH) [17]. Нанодиски представляют собой фрагмент плоского липидного бислоя (~160 фосфолипидов), гидрофобные края которого экранированы от растворителя двумя молекулами амфифильного белка MSP (фрагмента аполипопротеина A-I из липопротеинов высокой плотности плазмы крови человека). Ранее JIBH успешно применялись в исследованиях мембранных белков различными методами. Было показано, что ЛБЫ по своим свойствам наилучшим образом соответствуют биологической мембране и способны сохранять многие мембранные белки в нативном функциональном состоянии [18]. Однако, примеров использования ЛБН для структурных ЯМР-исследований мембранных белков на сегодняшний день нет.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурных и динамических характеристик изолированного ВСД-КуАР методами ЯМР высокого разрешения. Данная цель подразумевает решение следующих задач:

1. Подбор мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований ВСД-КуАР, обеспечивающей наилучшее качество ЯМР-спектров и сохраняющей структуру белка, наиболее близкую к нативной.

2. Получение отнесения сигналов ВСД-КуАР в гетероядерных ЯМР-спектрах.

3. Идентификация элементов вторичной структуры ВСД-КуАР по данным ЯМР.

4. Получение данных о пространственной структуре белка.

5. Определение характеристик внутримолекулярной динамики ВСД-КуАР.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые:

1. Показана применимость ЛБН, созданных на основе липопротеинов высокой плотности человека, в качестве мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований мембранных белков и пептидов.

2. Предложен новый метод подбора мембраномоделирующей среды на основании сравнения спектров ЯМР изучаемого белка в различных средах со спектрами в ЛБН.

3. Показана и исследована зависимость структуры ВСД-КуАР от состава мембраномоделирующей среды.

4. Получено практически полное отнесение сигналов ЯМР атомов основной цепи и большей части -атомов ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1).

5. Определена вторичная структура ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1). Получены данные о его пространственной структуре.

6. Определены характеристики внутримолекулярной подвижности ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1). Проведено сравнение существующих моделей потенциал-зависимой актива^ ции канала с полученными данными.

В данной работе разработан и успешно применен новый подход к определению пригодности мембраномоделирующих сред для ЯМР-спектроскопии мембранных белков, который предполагает сопоставление спектров белка в тестируемых детергентах и в ЛБН. Доказательство сохранения солюбилизированным белком нативной структуры является одной из основных проблем в современных исследованиях. Таким образом, данный подход может найти широкое применение в ЯМР-исследованиях мембранных белков.

Полученные в работе значения химических сдвигов сигналов ядер 1Н, 13С, 15К в спектрах ЯМР ВСД-КуАР могут служить отправной точкой при его дальнейших структурно-динамических исследованиях, например, для получения структуры с высоким разрешением. Кроме того, отнесение сигналов основной цепи необходимо для исследования механизмов взаимодействия КуАР с токсинами или для скрининга прототипов лекарственных средств, модулирующих потенциал-зависимую активацию.

Полученные данные о внутримолекулярной динамике ВСД-КуАР позволяют снять некоторые противоречия между разными моделями потенциал-зависимой активации канала КуАР.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Парамонов, Александр Сергеевич

Выводы

1. Показано, что липид-белковые мембранные нанодиски применимы в качестве мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований мембранных белков и пептидов.

2. Результаты анализа корреляционных ЯМР спектров ВСД-КуАР показали, что конформация изолированного ВСД-КуАР в растворе зависит от состава мембраномоделирующей среды. Структуры ВСД-КуАР в нанодисках различного состава и в мицеллах цвиттерионных детергентов схожи друг с другом и значительно отличаются от структуры в мицеллах анионных детергентов.

3. Методом ЯМР определена вторичная структура ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО и охарактеризована его пространственная структура. Наблюдаемая в мицеллах конформация соответствует структуре нативного вольт-сепсорного домена в открытом состоянии канала.

4. Данные по релаксации ядер позволили установить характер внутримолекулярной подвижности ВСД-КуАР в мицеллах. Участки молекулы в районе межспиральной петли 81-82 и спиралей Э23 и 845 совершают "быстрые" движения в диапазоне пс-нс, спиральная шпилька 83Ь-84 относительно стабильна в этом диапазоне времен. Для всех сегментов белка в регионе межспиральных контактов характерно наличие "медленных" обменных движений в мкс-мс диапазоне.

5. Сопоставление полученных данных о динамике ВСД-КуАР в мицеллах с известными моделями потенциал-зависимой активации кати-онных каналов показало, что наиболее вероятный характер конфор-мационных перестроек при активации канала соответствует модели, в которой спирали ЭЗЪ и Э4 перемещаются в мембране как единый структурный элемент.

Благодарности

Хочу выразить искреннюю признательность и благодарность своим научным руководителям Арсеньеву A.C. и Шенкареву 3.0. за помощь и поддержку, неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Благодарю весь коллектив лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН за помощь в проведении экспериментов и плодотворные обсуждения.

Также хочу поблагодарить сотрудников лаборатории инженерии белка Шингарову JI.H., Люкманову E.H. и руководителя УНЦ ИБХ РАН Овчинникову Т.В. за проделанный ими большой труд по получению образцов для исследования, без которых выполнение данной работы было бы невозможным.

Благодарю сотрудников отдела структурной биологии Соболя А.Г., Самсонову О.В., Чупина В.В. за помощь в проведении дополнительных экспериментов.

Выражаю свою благодарность сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ИБХ РАН Долгих Д.А., Шайтану К.В. и Ефремову Р.Г. за содействие и доброжелательное отношение во время моего обучения в аспирантуре.

Работа выполнена при поддержке РФФИ и гранта Президента РФ.

Заключение

Приведенные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что структуры ВСД-КуАР в мицеллах цвиттерпонных (незаряженных) детергентов и в ЛБН близки друг к другу. Использование мембрано-моделирующей среды на основе детергентов ДФХ/ЛДАО позволило получить отнесение сигналов основной цепи ВСД-КуАР и определить его вторичную структуру. Также была охарактеризована пространственная структура белка. Коиформацня ВСД-КуАР в мицеллах оказалась в значительной степени схожа с установленной ранее методом РСА структурой изолированного ВСД-КуАР. Предшествующие ЭПР-исследования полноразмерного КуАР и его изолированного ВСД в составе липидных везикул в отсутствие трансмембранного потенциала показали, что эта кристаллическая структура соответствует нативному ВСД в открытом состоянии канала. Следовательно, динамические характеристики, наблюдаемые методом ЯМР в настоящем исследовании также могут быть экстраполированы и к полноразмерному каналу, что позволяет сделать предположения относительно роли наблюдаемых движений в потенциал-зависимой активации.

Так, быстрые движения в пс-нс диапазоне времен характерны для межспиральной петли 81-82, спиралей Э23 и Э45 (Рис. 26). В то же время связка спиралей 83Ь-84 относительно стабильна в данном диапазоне времен. Это говорит в пользу модели потенциал-зависимой активации, в которой шпилька 83Ь-84 (так называемая "потенциал-чувствительная лопасть") перемещается относительно других спиралей (81-82), что сопровождается конформационпыми перестройками в районе 823-83а. Подвижность Э45 возможно обеспечивает изгиб в районе 11е131-А^133, происходящий при активации канала. В то же время, полученные данные противоречат моделям, в которых перемещение спирали Э4 сопряжено с конформационными перестройками в ЭЗЬ.

Наиболее интересным свойством внутримолекулярной динамики ВСД-КуАР является наличие медленных (мкс-мс) обменных движений в области контакта спиралей. Эти движения затрагивают все остатки из спиралей Б1, Э2, БЗ, Б4, находящиеся вблизи межспирального солевого мостика Авр62-А^133. Эти флуктуации указывают на возможность совершения спиралями высокоамплитудных скользящих движений относительно друг друга в процессе потенциал-зависимой активации канала.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Парамонов, Александр Сергеевич, 2009 год

1. B. Hille, 1.n channels of Excitable Membranes, Sinauer, Sunderland, MA, 2001.

2. C. Derst, A. Karschin, Evolutionary link between prokaryotic and eukaryotic K-f- channels, J.Exp. Biol. 201 (Pt 20) (1998) 2791-2799.

3. S. I. Borjesson, F. Blinder, Struct ure, function, and modification of the voltage sensor in voltage-gated ion channels, Cell. Biochem. Biophys. 52 (3) (2008) 149-174.

4. K. J. Swartz, Sensing voltage across lipid membranes, Nature 456 (7224) (2008) 891-897.

5. I. S. Ramsey, M. M. Moran, J. A. Chong, D. E. Clapham, A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain, Nature 440 (7088) (2006) 1213-1216.

6. Y. Murata, H. Iwasaki, M. Sasaki, K. Inaba, Y. Okamura, Phosphoinositide phosphatase activity coupled to an intrinsic voltage sensor, Nature 435 (7046) (2005) 1239-1243.

7. F. M. Ashcroft, Ion channels and disease, Academic Press, 2000.

8. Y. Li-Smerin, K. J. Swartz, Gating modifier toxins reveal a conserved structural motif in voltage-gated Ca2+ and K+ channels, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95 (15) (1998) 8585-8589.

9. A. A. Alabi, M. I. Bahamonde, H. J. Jung, J. I. Kim, K. J. Swartz, Portability of paddle motif function and pharmacology in voltage sensors, Nature 450 (7168) (2007) 370-375.

10. Y. Jiang, A. Lee, J. Chen, V. Rata, M. Cadene, B. T. Chait, R. MacKinnon, X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel, Nature 423 (6935) (2003) 33-41.

11. S.-Y. Lee, A. Lee, J. Chen, R. MacKinnon, Structure of the KvAP voltage-dependent K+ channel and its dependence on the lipid membrane, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102 (43) (2005) 15441-15446.

12. L. G. Cuello, D. M. Cortes, E. Perozo, Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer, Science 306 (5695) (2004) 491-495.

13. S. Chakrapani, L. G. Cuello, D. M. Cortes, E. Perozo, Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer, Structure 16 (3) (2008) 398-409.

14. J. Cavanagh, W. J. Fairbrother, A. G. Palmer, N. J. Skelton, M. Ranee, Protein NMR spectroscopy: principles and practice, Academic Press, 2007.

15. G. D. Henry, B. D. Sykes, Methods to study membrane protein structure in solution, Methods. Enzymol. 239 (1994) 515-535.

16. C. R. Sanders, F. Sonnichsen, Solution NMR of membrane proteins: practice and challenges, Magn. Reson. Chem. 44 Spec No (2006) S24-S40.

17. Т. H. Bayburt, Y. V. Grinkova, S. G. Sligar, Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins, Nano Letters 2 (8) (2002) 853-856.

18. A. Nath, W. M. Atkins, S. G. Sligar, Applications of phospholipid bilayer nanodiscs in the study of membranes and membrane proteins, Biochemistry 46 (8) (2007) 2059-2069.

19. P. Геинис, Биомембраны: Молекулярная структура и функции, М.:Мир, 1997.

20. М. G. Paulick, С. R. Bertozzi, The glycosylphosphatidylinositol anchor: a complex membrane-anchoring structure for proteins, Biochemistry 47 (27) (2008) 6991-7000.

21. S. H. White, W. C. Wimley, Membrane protein folding and stability: physical principles, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28 (1999) 319365.

22. K. Seshadri, R. Garemyr, E. Wallin, G. von Heijne, A. Elofsson, Architecture of beta-barrel membrane proteins: analysis of trimeric porins, Protein. Sci. 7 (9) (1998) 2026-2032.

23. E. Wallin, G. von Heijne, Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms, Protein. Sci. 7 (4) (1998) 1029-1038.

24. R. B. Russell, D. S. Eggleston, New roles for structure in biology and drug discovery, Nat. Struct. Mol. Biol. 7 Suppl (2000) 928-930.

25. H. Michel, International Tables for Crystallography, Vol. F, Kluwer Academic Publishers, 2001, Ch. 4.2, pp. 94-100.

26. N. Grigorieff, T. A. Ceska, K. H. Downing. J. M. Baldwin. R. Henderson, Electron-crystallographic refinement of the structure of bacteriorhodopsin, J. Mol. Biol. 259 (3) (1996) 393-421.

27. M. S. Weiss, G. E. Schidz, Structure of porin refined at 1.8 A resolution, J. Mol. Biol. 227 (2) (1992) 493-509.

28. S. H. White, The progress of membrane protein structure determination, Protein. Sci. 13 (7) (2004) 1948-1949.

29. K. Wüthrich, NMR of proteins and nucleic acids, Wiley-Interscience, 1986.

30. M. Sattler, J. Schleucher, C. Griesinger, Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients, Prog. NMR. Spcct. 34 (2) (1999) 93-158.

31. B. T. Farmer, R. A. Venters, Assignment of aliphatic side-chain 1HN/15N resonances in perdeuterated proteins, J. Biomol. NMR. 7 (1) (1996) 59-71.

32. K. H. Gardner, L. E. Kay, The use of 2H, 13C, 15N multidimensional NMR to study the structure and dynamics of proteins, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 27 (1998) 357-406.

33. D. S. Wishart, B. D. Sijkes, Chemical shifts as a tool for structure determination, Methods. Énzymol. 239 (1994) 363-392.

34. P. Güntert, C. Mumenthaler, K. Wüthrich, Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA, J. Mol. Biol. 273 (1) (1997) 283-298.

35. N. Tjandra, J. G. Omichinski, A. M. Gronenborn, G. M. Clore, A. Bax, Use of dipolar 1H-15N and 1H-13C couplings in the structure determination of magnetically oriented macromolecules in solution, Nat. Struct. Mol. Biol. 4 (9) (1997) 732-738.

36. C. Hilty, G. Wider, C. Fernández, K. Wüthrich, Membrane protein-lipid interactions in mixed micelles studied by NMR spectroscopy with the use of paramagnetic reagents, Chembiochcm 5 (4) (2004) 467-473.

37. K. Pervushin, R. Riek, G. Wider, K. Wüthrich, Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy (TROSY) for NMR Studies of Aromatic Spin Systems in 13C-Labeled Proteins, J. Am. Chem. Soc. 120 (25) (1998) 6394-6400.

38. R. Riek, G. Wider, K. Pervushin, K. Wüthrich, Polarization transfer by cross-correlated relaxation in solution NMR with very large molecules, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96 (9) (1999) 4918-4923.'

39. R. H. Fillingame, 0. Y. Dmitriev, Structural model of the transmembrane Fo rotary sector of H+-transporting ATP synthase derived by solution NMR and intersubunit cross-linking in situ, Biochim. Biophys. Acta. 1565 (2) (2002) 232-245.

40. G. G. Privé, Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins, Methods 41 (4) (2007) 388-397.

41. R. Kakehashi, T. Takeda, H. Maeda, Effects of micellar charge density on the coefficient of the Corrin-Harkins relation, J. Colloid. Interface. Sci. 253 (1) (2002) 238-240.

42. Y. Imaishi, R. Kakehashi, T. Nezu, H. Maeda, Dodecyldimethylamine Oxide Micelles in Solutions without Added Salt, J. Colloid. Interface. Sci. 197 (2) (1998) 309-316.

43. A. Helenius, D. R. McCaslin, E. Fries, C. Ta,nford, Properties of detergents, Methods. Enzymol. 56 (1979) 734-749.

44. J. C. Steele, C. Tanford, J. A. Reynolds, Determination of partial specific volumes for lipid-associated proteins, Methods. Enzymol. 48 (1978) 11-23.

45. K. R. MacKenzie, J. H. Prestegard, D. M. Engelman, A transmembrane helix dimer: structure and implications, Science 276 (5309) (1997) 131— 133.

46. J. Lauterwein, C. Bosch, L. R. Brown, K. Wiithrich, Physicochemical studies of the protein-lipid interactions in melittin-containing micelles, Biochim. Biophys. Acta. 556 (2) (1979) 244-264.

47. A. L. Parrill, Lysophospholipid interactions with protein targets, Biochim. Biophys. Acta. 1781 (9) (2008) 540-546.

48. P. Huang, Q. Liu, G. A. Scarborough, Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, Anal. Biochem. 259 (1) (1998) 8997.

49. R. S. Prosser, F. Evanics, J. L. Kitevski, M. S. Al-Abdul-Wahid, Current applications of bicelles in NMR studies of membrane-associated amphiphiles and proteins, Biochemistry 45 (28) (2006) 8453-8465.

50. C. R. Sanders, B. J. Hare, K. Howard, J. H. Prestegard, Magneticlly oriented phospholipid micelles as tool for the study of membrane-associated molecules, Prog. NMR. Spect. 26 (1994) 421-444.

51. C. Tribet, R. Audebert, J. L. Popot, Amphipols: polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 93 (26) (1996) 15047-15050.

52. M. Zoonens, L. J. Catoire, F. Giusti, J.-L. Popot, NMR study of a membrane protein in detergent-free aqueous solution, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 102 (25) (2005) 8893-8898.

53. C. R. Babu, P. F. Flynn, A. J. Wand, Preparation, characterization, and NMR spectroscopy of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids, J. Biomol. NMR. 25 (4) (2003) 313-323.

54. Z. Shi, R. W. Peterson, A. J. Wand, New reverse micelle surfactant systems optimized for high-resolution NMR spectroscopy of encapsulated proteins, Langmuir 21 (23) (2005) 10632-10637.

55. S. M. Yu, D. T. McQuade, M. A. Quirin, C. P. Hackenberger, M. P. Krebs, A. S. Polans, S. H. Gellman, An improved tripod amphiphile for membrane protein solubilization, Protein. Sei. 9 (12) (2000) 2518-2527.

56. M. J. Theisen, T. B. Potocky, D. T. McQuade, S. H. Gellman, M. L. Chiu, Crystallization of bacteriorhodopsin solubilized by a tripod amphiphile, Biochim. Biophys. Acta. 1751 (2) (2005) 213-216.

57. Z. Wu, AI. A Wagner, L. Zheng, J. S. Parks, J. M. Shy, J. D. Smith, V. Gogonea, S. L. Hazen, The refined structure of nascent HDL reveals a key functional domain for particle maturation and dysfunction, Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (9) (2007) 861-868.

58. P. J. Dolphin, Lipoprotein metabolism and the role of apolipoproteins as metabolic programmers, Can. J. Biochem. Cell. Biol. 63 (8) (1985) 850869.

59. J. P. Segrest, M. K. Jones, A. E. Klon, G. J. Sheldahl, M. Hellinger, H. D. Loof, S. C. Haruey, A detailed molecular belt model for apolipoprotein AI in discoidal high density lipoprotein, J. Biol. Chem. 274 (45) (1999) 31755-31758.

60. A. E. IQon, M. K. Jones, J. P. Segrest, S. C. Harvey, Molecular belt models for the apolipoprotein A-I Paris and Milano mutations, Biophys. J. 79 (3) (2000) 1679-1685.

61. R. J. Cushley, M. Okon, NMR studies of lipoprotein structure, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31 (2002) 177-206.

62. D. P. Rogers, L. M. Roberts, J. Lebowitz, G. Datta, G. M. Anantharamaiah, J. A. Engler, C. G. Brouillette, The lipid-free structure of apolipoprotein A-I: effects of amino-terminal deletions, Biochemistry 37 (34) (1998) 11714-11725.

63. D. W. Borhani, D. P. Rogers, J. A. Engler, C. G. Brouillette, Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94 (23) (1997) 12291-12296.

64. R. T. Nolte, D. Atkinson, Conformational analysis of apolipoprotein A-I and E-3 based on primary sequence and circular dichroism, Biophys. J. 63 (5) (1992) 1221-1239.

65. V. Koppaka, L. Silvestro, J. A. Engler, C. G. Brouillette, P. H. Axelsen, The structure of human lipoprotein A-I. Evidence for the "belt" model, J. Biol. Chem. 274 (21) (1999) 14541-14544.

66. W. S. Davidson, G. M. Hilliard, The spatial organization of apolipoprotein A-I on the edge of discoidal high density lipoprotein particles: a mass specrometry study, J. Biol. Chem. 278 (29) (2003) 2719927207.

67. R. A. G. D. Silva, G. M. Hilliard, J. Fang, S. Macha, W. S. Davidson, A three-dimensional molecular model of lipid-free apolipoprotein A-I determined by cross-linking/mass spectrometry and sequence threading, Biochemistry 44 (8) (2005) 2759-2769.

68. M. J. Thomas, S. Bhat, M. G. Sorci-Thomas, The use of chemical cross-linking and mass spectrometry to elucidate the tertiary conformation of lipid-bound apolipoprotein A-I, Curr. Opin. Lipidol. 17 (3) (2006) 214220.

69. S. E. Panagotopulos, E. M. Horace, J. N. Maiorano, W. S. Davidson, Apolipoprotein A-I adopts a belt-like orientation in reconstituted high density lipoproteins, J. Biol. Chem. 276 (46) (2001) 42965-42970.

70. D. D. 0. Martin, M. S. Budamagunta, R. O. Ryan, J. C. Voss, M. N. Oda, Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein, J. Biol. Chem. 281 (29) (2006) 20418-20426.

71. H. Li, D. S. Lyles, M. J. Thomas, W. Pan, M. G. Sorci-Thomas, Structural determination of lipid-bound ApoA-I using fluorescence resonance energy transfer, J. Biol. Chem. 275 (47) (2000) 37048-37054.

72. Y. Li, A. Z. Kijac, S. G. Sligar, C. M. Rienstra, Structural analysis of nanoscale self-assembled discoidal lipid bilayers by solid-state NMR spectroscopy, Biophys. J. 91 (10) (2006) 3819-3828.

73. C. E. Matz, A. Jonas, Micellar complexes of human apolipoprotein AI with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions, J. Biol. Chem. 257 (8) (1982) 4535-4540.

74. I. G. Denisov, Y. V. Grinkova, A. A. Lazarides, S. G. Sligar, Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size, J. Am. Chem. Soc. 126 (11) (2004) 3477-3487.

75. T. H. Baybnrt, S. G. Sligar, Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers, Protein. Sci. 12 (11) (2003) 2476-2481.

76. A. Y. Shih, I. G. Denisov, J. C. Phillips, S. G. Sligar, K. Schulten, Molecular dynamics simulations of discoidal bilayers assembled from truncated human lipoproteins, Biophys. J. 88 (1) (2005) 548-556.

77. T. H. Bayburt; Y. V. Grinkova, S. G. Sligar, Assembly of single bactcriorhodopsin trimers in bilayer nanodiscs, Arch. Biochem. Biophys. 450 (2) (2006) 215-222.

78. A. J. Leitz, T. H. Bayburt, A. N. Barnakov, B. A. Springer, S. G. Sligar, Functional reconstitution of Beta2-adrenergic receptors utilizing self-assembling Nanodisc technology, Biotechniques 40 (5) (2006) 601-2, 604, 606, passim.

79. T. H. Bayburt, S. G. Sligar, Singlc-molecule height measurements on microsomal cytochrome P450 in nanometer-scale phospholipid bilayer disks, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99 (10) (2002) 6725-6730.

80. B. J. Baas, I. G. Denisov, S. G. Sligar, Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment, Arch. Biochem. Biophys. 430 (2) (2004) 218-228.

81. T. Boldog, S. Grimme, M. Li, S. G. Sligar, G. L. Hazelbauer, Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103 (31) (2006) 11509-11514.

82. A. L. Hodgkin, A. F. Huxley, A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve, J. Physiol. 117 (4) (1952) 500-544.

83. M. Noda. T. Ikeda, H. Suzuki, H. Takeshima, T. Takahashi, M. Kuno, S. Numa, Expression of functional sodium channels from cloned cDNA, Nature 322 (6082) (1986) 826-828.

84. T. Tanabe, H. Takeshima, A. Mikarni, V. Flockerzi, H. Takahashi, K. Kangawa, M. Kojima, H. Matsuo, T. Hirose, S. Numa, Primary structure of the receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle, Nature 328 (6128) (1987) 313-318.

85. B. L. Tenvpel, D. M. Papazian, T. L. Schwarz, Y. N. Jan, L. Y. Jan, Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila, Science 237 (4816) (1987) 770-775.

86. D. A. Doyle, J. M. Cabral, R. A. Pfuetzner, A. Kuo, J. M. Gulbis, S. L. Cohen, B. T. Chait, R. MacKinnon, The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity, Science280 (5360) (1998) 69-77.

87. F. H. Yu, W. A. Catterall, The VGL-chanome: a protein superfamily specialized for electrical signaling and ionic homeostasis, Sci. STKE 2004 (253) (2004) rel5.

88. Y. Kubo, T. J. Baldwin, Y. N. Jan, L. Y. Jan, Primary structure and functional expression of a mouse inward rectifier potassium channel, Nature 362 (6416) (1993) 127-133.

89. R. Mannikko, F. Elinder, H. P. Larsson, Voltage-sensing mechanism is conserved among ion channels gated by opposite voltages, Nature 419 (6909) (2002) 837-841.

90. M. Noda, S. Shimizu, T. Tanabe, T. Takai, T. Kayano, T. Ikeda, H. Takahashi, H. Nakayama, Y. Kanaoka, N. Minamino, Primary structure of Electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence, Nature 312 (5990) (1984) 121-127.

91. H. R. Guy, P. Seetharamulu, Molecular model of the action potential sodium channel, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 83 (2) (1986) 508-512.

92. W. A. Catterall, Molecular properties of voltage-sensitive sodium channels, Annu. Rev. Biochem. 55 (1986) 953-985.

93. Z. Lu, A. M. Klem, Y. Ramu, Coupling between voltage sensors and activation gate in voltage-gated K-f- channels, J. Gen. Physiol. 120 (5) (2002) 663-676.

94. Z. Lu, A. M. Klem, Y. Ramu, Ion conduction pore is conserved among potassium channels, Nature 413 (6858) (2001) 809-813.

95. S. C. Kohout, M. H. Ulbrich, S. C. Bell, E. Y. Isacoff, Subunit organization and functional transitions in Ci-VSP, Nat. Struct. Mol. Biol. 15 (1) (2008) 106-108.

96. S.-Y. Lee, R. MacKinnon, A membrane-access mechanism of ion channel inhibition by voltage sensor toxins from spider venom, Nature 430 (6996) (2004) 232-235.

97. F. Tombola, M. H. Ulbrich, E. Y. Isacoff.\ The voltage-gated proton channel Hvl has two pores, each controlled by one voltage sensor, Neuron 58 (4) (2008) 546-556.

98. P. M. Vassilev, T. Scheuer, W. A. Catterall, Identification of an intracellular peptide segment involved in sodium channel inactivation, Science 241 (4873) (1988) 1658-1661.

99. D. E. Patton, J. W. West, W. A. Catterall, A. L. Goldin, Amino acid residues required for fast Na(+)-channel inactivation: charge neutralizations and deletions in the III-IV linker, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 89 (22) (1992) 10905-10909.

100. L. J. Hayward, R. H. Broiun, S. C. Cannon, Slow inactivation differs among mutant Na channels associated with myotonia and periodic paralysis, Biophys. J. 72 (3) (1997) 1204-1219.

101. J. F. Zhang, P. T. Ellinor, R. W. Aldrich, R. W. Tsien, Molecular determinants of voltage-dependent inactivation in calcium channels, Nature 372 (6501) (1994) 97-100.

102. L. Heginbotham, Z. Lu, T. Abramson, R. MacKinnon, Mutations in the K+ channel signature sequence, Biophys. J. 66 (4) (1994) 1061-1067.

103. C. Charlier, N. A. Singh, S. G. Ryan, T. B. Lewis, B. E. Reus, R. J. Leach, M. Leppert, A pore mutation in a novel KQT-like potassium channel gene in an idiopathic epilepsy family, Nat. Genet. 18 (1) (1998) 53-55.

104. C. M. Armstrong, F. Bezanilla, Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels, Nature 242 (5398) (1973) 459-461.

105. N. E. Schoppa, K. McCormack, M. A. Tanouye, F. J. Sigworth, The size of gating charge in wild-type and mutant Shaker potassium channels, Science 255 (5052) (1992) 1712-1715.

106. S. K. Aggarwal, R. MacKinnon, Contribution of the S4 segment to gating charge in the Shaker K+ channel, Neuron 16 (6) (1996) 1169-1177.

107. C. A. Ahem, R. Horn, Specificity of charge-carrying residues in the voltage sensor of potassium channels, J. Gen. Physiol. 123 (3) (2004) 205216.

108. Y. Li-Smerin, D. H. Hackos, I(. J. Swartz, alpha-helical structural elements within the voltage-sensing domains of a K(+) channel, J. Gen. Physiol. 115 (1) (2000) 33-50.

109. S. A. Seoh, D. Sigg, D. M. Papazian, F. Bezanilla, Voltage-sensing residues in the S2 and S4 segments of the Shaker K+ channel, Neuron 16 (6) (1996) 1159-1167.

110. V. Ruta, R. MacKinnon, Localization of the voltage-sensor toxin receptor on KvAP, Biochemistry 43 (31) (2004) 10071-10079.

111. S. B. Long, X. Too, E. B. Campbell, R. MacKinnon, Atomic structure of a voltage-dependent K+ channel in a lipid membrane-like environment, Nature 450 (7168) (2007) 376-382.

112. S. B. Long, E. B. Cam,pbell, R. Mackinnon, Crystal structure of a mammalian voltage-dependent Shaker family K+ channel, Science 309 (5736) (2005) 897-903.

113. S. B. Long, E. B. Campbell, R. Mackinnon, Voltage sensor of Kvl.2: structural basis of electromechanical coupling, Science 309 (5736) (2005) 903-908.

114. V. Ruta, Y. Jiang, A. Lee, J. Chen, R. MacKinnon, Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel, Nature 422 (6928) (2003) 180-185.

115. G. Yellen, The voltage-gated potassium channels and their relatives, Nature 419 (6902) (2002) 35-42.

116. M. Vamvouka, J. Cieslak, N. V. Eps, W. Hubbell, A. Gross, The structure of the lipid-embedded potassium channel voltage sensor determined by double-electron-electron resonance spectroscopy, Protein. Sci. 17 (3) (2008) 506-517.

117. M. Laine, M. chin A Lin, J. P. A. Bannister, W. R. Silverman, A. F. Mock, B. Roux, D. M. Papazian, Atomic proximity between S4 segment and pore domain in Shaker potassium channels, Neuron 39 (3) (2003) 467-481.

118. D. M. Papazian, X. M. Shao, S. A. Seoh, A. F. Mock, Y. Huang, D. H. Wainstock, Electrostatic interactions of S4 voltage sensor in Shaker K+ channel, Neuron 14 (6) (1995) 1293-1301.

119. N. Yang, R. Horn, Evidence for voltage-dependent S4 movement in sodium channels, Neuron 15 (1) (1995) 213-218.

120. D. M. Starace, E. Stefani, F. Bezanilla, Voltage-dependent proton transport by the voltage sensor of the Shaker K+ channel, Neuron 19 (6) (1997) 1319-1327.

121. S. Sokolov, T. Scheuer, W. A. Catterall, Ion permeation through a voltage- sensitive gating pore in brain sodium channels having voltage sensor mutations, Neuron 47 (2) (2005) 183-189.

122. D. Schmidt, Q.-X. Jiang, R. MacKinnon, Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors, Nature 444 (7120) (2006) 775-779.

123. V. Jogini, B. Roux, Dynamics of the Kvl.2 voltage-gated K-f- channel in a membrane environment, Biophys. J. 93 (9) (2007) 3070-3082.

124. Z. A. Sands, M. S. P. Sansom, How does a voltage sensor interact with a lipid bilayer? Simulations of a potassium channel domain, Structure 15 (2) (2007) 235-244.

125. J. A. Freites, D. J. Tobias, G. von Heijne, S. H. White, Interface connections of a transmembrane voltage sensor, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102 (42) (2005) 15059-15064.

126. Y. Ramu, Y. Xu, Z. Lu, Enzymatic activation of voltage-gated potassium channels, Nature 442 (7103) (2006) 696-699.

127. R. B. Darnian, A. A. Ivy, V. Ketty, R. O. Blaustein, Constraints on voltage sensor movement in the shaker K+ channel, J. Gen. Physiol. 128 (6) (2006) 687-699.

128. L. D. Islas, F. J. Sigworth, Electrostatics and the gating pore of Shaker potassium channels, J. Gen. Physiol. 117 (1) (2001) 69-89.

129. L. R. Phillips, M. Milescu, Y. Li-Smerin, J. A. Mindell, J. I. Kim, K. J. Swartz, Voltage-sensor activation with a tarantula toxin as cargo, Nature 436 (7052) (2005) 857-860.

130. M. Milescu, J. Vobecky, S. H. Roh, S. II. Kim, H. J. Jung, J. I. Kim, K. J. Swartz, Tarantula toxins interact with voltage sensors within lipid membranes, J. Gen. Physiol. 130 (5) (2007) 497-511.

131. B. Chanda, 0. K. Asamoah, R. Blunck, B. Roux, F. Bezanilla, Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement, Nature 436 (7052) (2005) 852-856.

132. Y. Jiang, V. Ruta, J. Chen, A. Lee, R. MacKinnon, The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ channel, Nature 423 (6935) (2003) 42-48.

133. V. Ruta, J. Chen, R. MacKinnon, Calibrated measurement of gating-eharge arginine displacement in the KvAP voltage-dependent K+ channel, Cell 123 (3) (2005) 463-475.

134. N. Yang, A. L. George, R. Horn, Molecular basis of charge movement in voltage-gated sodium channels, Neuron 16 (1) (1996) 113-122.

135. F. V. Campos, B. Chanda, B. Roux, F. Bezanilla, Two atomic constraints unambiguously position the S4 segment relative to SI and S2 segments in the closed state of Shaker K channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (19) (2007) 7904-7909.

136. G. M. Clayton, S. Altieri, L. Heginbotham, V. M. Unger, J. H. Morais-Cabral, Structure of the transmembrane regions of a bacterial cyclic nucleotide-regulated channel, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 105 (5) (2008) 1511-1515.

137. R. D. Keynes, F. Elinder, The screw-helical voltage gating of ion channels, Proc. Biol. Sci. 266 (1421) (1999) 843-852.

138. D. Papazian, F. Bezanilla, How Does an Ion Channel Sense Voltage?, News. Physiol. Sci. 12 (5) (1997) 203-210.

139. A. Cha, G. E. Snyder, P. R. Selvin, F. Bezanilla, Atomic scale movement of the voltage-sensing region in a potassium channel measured via spectroscopy, Nature 402 (6763) (1999) 809-813.

140. B. Chanda, O. K. Asamoah, R. Blunck, B. Roux, F. Bezanilla, Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement, Nature 436 (7052) (2005) 852-856.

141. B. E. Cohen, M. Grabe. L. Y. Jan, Answers and questions from the KvAP structures, Neuron 39 (3) (2003) 395-400.

142. J. E. Masse, R. Keller, AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic, J. Magn. Reson. 174 (1) (2005) 133151.

143. D. H. Wu, A. D. Chen, C. S. Johnson, An Improved Diffusion-Ordered Spectroscopy Experiment Incorporating Bipolar-Gradient Pulses, J. Magn. Reson. 115 (1) (1995) 260-264.

144. C. S. Johnson, Diffusion ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy: principles and applications, Prog. NMR. Spect. 34 (3-4) (1999) 203-256.

145. J. J. Chou, J. L. Baber, A. Bax, Characterization of phospholipid mixed micelles by translational diffusion, J. Biomol. NMR. 29 (3) (2004) 299-308.

146. D. Lee, C. Hilty, G. Wider, K. Wiithrieh, Effective rotational correlation times of proteins from NMR relaxation interference, J. Magn. Reson. 178 (1) (2006) 72-76.

147. S. Grzesiek, A. Bax, Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein, J. Magn. Reson. 96 (2) (1992) 432-440.

148. L. E. Kay, G. Y. Xu, T. Yamazaki, Enhanced-Sensitivity Triple-Resonance Spectroscopy with Minimal H20 Saturation, J. Magn. Reson. 109 (1) (1994) 129-133.

149. D. R. Muhandiram, L. E. Kay, Gradient-Enhanced Triple-Resonance Three-Dimensional NMR Experiments with Improved Sensitivity, J. Magn. Reson. 103 (3) (1994) 203-216.

150. M. Salzmann, G. Wider, K. Pervushin, K. Wiithrich, Improved sensitivity and coherence selection for 15N,1H.-TR0SY elements in triple resonance experiments, J. Biomol. NMR. 15 (2) (1999) 181-184.

151. T. Diercks, M. Coles, H. Kessler, An efficient strategy for assignment of cross-peaks in 3D heteronuclear NOESY experiments, J. Biomol. NMR. 15 (2) (1999) 177-180.

152. R. Harris, E. Becker, S. C. de Menezes, R. Goodfellow, P. Granger, NMR Nomenclature: Nuclear Spin Properties and Conventions for Chemical Shifts. IUPAC Recommendations 2001, Solid State Nucl. Magn. Reson. 22 (4) (2002) 458-483.

153. J. M. Kneller, M. Lu, C. Bracken, An effective method for the discrimination of motional anisotropy and chemical exchange, J. Am. Chem. Soc. 124 (9) (2002) 1852-1853.

154. G. Lipari, A. Szabo, Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 1. Theory and range of validity, J. Am. Chem. Soc. 104 (17) (1982) 4546-4559.

155. P. Dosset, J. G. Hus, M. Blackledge, D. Marion, Efficient analysis of macromolecular rotational diffusion from heteronuclear relaxation data, J. Biomol. NMR. 16 (1) (2000) 23-28.

156. Y. Shen, А. Вал:, Protein backbone chemical shifts predicted from searching a database for torsion angle and sequence homology, J. Biomol. NMR. 38 (4) (2007) 289-302.

157. A. Ortega, J. G. de la Torre, Hydrodynamic properties of rodlike and disklike particles in dilute solution, J. Chem. Phys. 119 (18) (2003) 99149919.

158. H. Duclohier, H. Wroblewski, Voltage-dependent pore formation and antimicrobial activity by alamethicin and analogues, J. Membr. Biol. 184 (1) (2001) 1-12.

159. A. 0. O'Reilly, B. A. Wallace, The peptaibol antiamoebin as a model ion channel: similarities to bacterial potassium channels, J. Pept. Sci. 9 (1112) (2003) 769-775.

160. L. R. Brown, C. Bosch, K. Wiithrich, Location and orientation relative to the micelle surface for glucagon in mixed micelles with dodecylphosphocholine: EPR and NMR studies, Biochim. Biophys. Acta. 642 (2) (1981) 296-312.

161. T. Asakura, K. Taoka, M. Demura, M. P. Williamson, The relationship between amide proton chemical shifts and secondary structure in proteins, J. Biomol. NMR. 6 (3) (1995) 227-236.

162. C. E. Johnson, F. A. Bovey, Calculation of Nuclear Magnetic Resonance Spectra of Aromatic Hydrocarbons, J. Chem. Phys. 29 (5) (1958) 10121014.

163. D. A. Case, Calibration of ring-current effects in proteins and nucleic acids, J. Biomol. NMR. 6 (4) (1995) 341-346.