Механизмы влияния белков, секретируемых мезенхимными стволовыми клетками, на дифференцировку фибробластов в миофибробласты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Кулебякина Мария Александровна

• Кулебякина Мария Александровна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Кулебякина Мария Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Цель и задачи исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Степень достоверности полученных результатов

Апробация работы

Личный вклад автора в проведение исследования

Публикации

Основные положения, выносимые на защиту

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Клеточные механизмы репаративной регенерации тканей

Дифференцировка фибробластов в миофибробласты

Сигнальные пути, регулирующие дифференцировку фибробластов в миофибробласты

Канонический сигнальный путь TGF-P

Канонический сигнальный путь WNT

Сигнальный путь NF-kB

Канонический сигнальный путь NOTCH

Роль МСК в регуляции процессов заживления ткани

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры

Сбор кондиционированной среды и получение фракций секретома МСК

Анализ траекторий наночастиц

Моделирование дифференцировки фибробластов в миофибробласты

Иммуноцитохимическое окрашивание

Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле

Измерение концентрации белка

Вестерн-блоттинг и иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на мембране

Приготовление образцов пептидов для протеомного анализа

Хромато-масс-спектрометрический анализ

Биоинформатическая обработка данных хромато-масс-спектрометрического анализа

Выделение тотальной РНК

ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле

Выделение ядерной фракции белков из культуры фибробластов

Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ

Разделение на фракции растворимых белков и внеклеточных везикул влияет на способность секретома МСК подавлять дифференцировку фибробластов в миофибробласты in vitro

Фракция растворимых белковых факторов секретома МСК обогащена белками, способными регулировать канонические сигнальные пути TGF-P, Wnt и Notch

Экспрессия регуляторов сигнальных путей TGF-P, Wnt и Notch, которыми обогащена фракция растворимых белковых факторов секретома МСК,

повышена в небольшой субпопуляции МСК жировой ткани, сокращающейся в

профибротических условиях

Фракция растворимых белков секретома МСК подавляет канонический сигнальный путь Wnt в фибробластах

Белок DKK3 в составе фракции растворимых белковых факторов секретома МСК подавляет канонический сигнальный путь Wnt в фибробластах и препятствует дифференцировке фибробластов в миофибробласты

Тотальная фракция белков секретома МСК обогащена белками, активирующими сигнальный путь ОТ-кВ

Тотальная фракция белков секретома МСК активирует сигнальный путь №-кВ в фибробластах

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ADAM - дизинтегрин и металлопротеиназа (сокр. от a Disintegrin And Metalloproteinase)

AKR1C3 - альдокеторедуктаза 1-го семейства, член C3 (Aldo-Keto Reductase family 1 member C3)

ALIX - белок X, взаимодействующий с [продуктом] гена 2, связанного с апоптозом (Apoptosis-Linked gene 2 Interacting protein X)

CD - кластер дифференцировки (Cluster of Differentiation)

CD74-ICD - внутриклеточный домен CD74 (CD74-IntraCellular Domain)

DAPI - 4',6-диаминидино-2-фенилиндол

DKK3 - связанный с Диккопфом белок-3

dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфат

GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

HIF-1a - фактор, индуцируемый гипоксией-1 альфа

HSP70 - белок теплового шока 70 (HSP70)

IL-1a(P) - интерлейкин 1 альфа (бета)

ISLR - белок суперсемейства иммуноглобулинов, содержащих богатый лейцином повтор (Immunoglobulin Superfamily containing Leucine-rich Repeat protein)

LAMA2 - субъединица альфа-2 ламинина (LAMinin subunit Alpha-2)

LAP - латентно-ассоциированный пептид

LEF - фактор, связывающий лимфоидный энхансер (lymphoid enhancer-binding factor)

LRP - белок, подобный рецептору липопротеинов низкой плотности (low-density lipoprotein receptor-related protein)

LTBP-1 - белок, связывающий латентный TGF-P, -1 (Latent-Transforming growth factor beta-Binding Protein 1)

MAGP - ассоциированный с микрофибриллами гликопротеин (Microfibril-Associated GlycoProtein)

MAML - белок-коактиватор транскрипции, подобный белку Mastermind (MAsterMind-Like protein)

MFAP4 - ассоциированный с микрофибриллами белок 4 (MicroFibril-Associated Protein)

MIF - фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (Macrophage migration inhibitory factor)

mTORC2 - комплекс 2 мишени рапамицина у млекопитающих (mammalian target of rapamycin complex 2)

Mw - молекулярная масса (Molecular weight)

NF-kB - транскрипционный ядерный фактор kappa B (Nuclear Factor kappa B)

NOV - продукт сверхэкспрессируемого гена нефробластомы (Nephroblastoma OVerexpressed)

NICD - внутриклеточный домен Notch (Notch IntraCellular Domain) PMSF - фенилметилсульфонилфторид

RBPJ - (Recombination signal Binding Protein for immunoglobulin kappa J region; белок, связывающий сигнал рекомбинации для иммуноглобулина каппа-области)

SDF-1 - фактор стромальных клеток 1 (Stromal cell-Derived Factor 1)

SMAD - Sma и матери против декапентаплегического гомолога 3 (Sma and Mothers Against Decapentaplegic homolog 3)

TCF - Т-клеточный фактор (T-cell factor)

TGF-P - трансформирующий фактор роста бета

TpRI, TpRII - TGF-P-рецептор I и II типа, соответственно

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотреитол

МСК - мезенхимные стволовые клетки

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор

КС-МСК - тотальная фракция белков секретома МСК

ВКМ - внеклеточный матрикс

РФ-МСК - фракция растворимых белковых факторов секретома МСК

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией

ПЦР - полимеразная цепная реакция Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ТСБТ - Трис-буферный раствор с добавлением детергента Твин 20 (Tris-Buffered Saline Tween-20)

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

В настоящее время фиброз-ассоциированные заболевания являются причиной почти пятой части всех случаев смертности в мире [1]. В контексте развития таких заболеваний фиброз представляет собой патологический процесс, при котором здоровая ткань замещается рубцовой, что способно приводить к утрате тканями и органами своих функций. Ключевым патогенетическим звеном развития фиброза большинства тканей является избыточное образование миофибробластов - клеток, вносящих основной вклад в формирование рубцовой ткани - преимущественно из резидентных фибробластов [2]. В связи с этим, поиск механизмов регуляции дифференцировки фибробластов в миофибробласты представляет собой важную задачу современной биологии и биомедицины.

Мезенхимные стволовые клетки (МСК), согласно последним данным, играют важнейшую роль в регуляции и координации всех клеточных процессов, происходящих в строме. При этом значительная часть данных эффектов МСК обусловлена продукцией ими биологически активных белковых факторов. Показано, что белки, секретируемые МСК, способны стимулировать ангиогенез и прорастание нейритов, регулировать функционирование иммунных клеток, формировать и ремоделировать внеклеточный матрикс (ВКМ) [3]. Данные литературы свидетельствуют о том, что МСК за счёт паракринных механизмов способны также препятствовать избыточному образованию миофибробластов из фибробластов [4], однако роль растворимых белковых факторов, секретируемых МСК, в этом процессе не установлена. В связи с этим, актуальной задачей является исследование роли растворимых белковых факторов, секретируемых МСК, в регуляции процесса дифференцировки фибробластов в миофибробласты, а также изучение молекулярных механизмов этого влияния.

Цель и задачи исследования

Целью работы является установление роли растворимых белковых факторов, секретируемых МСК, в регуляции процессов дифференцировки фибробластов в миофибробласты.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

1. Охарактеризовать фракцию растворимых белковых факторов секретома МСК жировой ткани человека методом протеомного анализа.

2. Установить белки, которыми обогащены фракции секретома МСК жировой ткани, обладающие различной выраженностью антифибротического эффекта в in vitro модели дифференцировки фибробластов в миофибробласты.

3. Определить сигнальные пути, с которыми способны взаимодействовать белки, выявленные в составе фракций секретома МСК.

4. Проверить влияние фракций секретома МСК на изменение экспрессии генов-мишеней предсказанных сигнальных путей при дифференцировке фибробластов в миофибробласты.

Научная новизна исследования

В настоящей работе впервые был проведён сравнительный протеомный анализ фракций секретома МСК, различающихся по способности препятствовать дифференцировке фибробластов в миофибробласты in vitro, и установлены белки, потенциально вносящие вклад в различие биологических эффектов данных фракций. Обнаружено, что фракция растворимых белковых факторов секретома МСК обогащена регуляторами сигнальных путей Wnt, TGF-P и Notch и что данная фракция подавляет канонический сигнальный путь Wnt в фибробластах. Впервые установлено, что белок DKK3 в составе фракции растворимых белковых факторов, секретируемых МСК, необходим для ингибирования данной фракцией канонического сигнального пути Wnt в фибробластах и подавления их

дифференцировки в миофибробласты. Впервые установлено, что тотальная фракция секретома МСК активирует сигнальный путь ОТ-кВ в фибробластах.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе выполнения работы был описан механизм антифибротического действия фракции растворимых белковых факторов секретома МСК, связанный с паракринной регуляцией дифференцировки фибробластов в миофибробласты. Полученные в данной работе результаты также указывают на необходимость контроля в составе секретома МСК компонентов, активирующих в клетках-мишенях провоспалительные сигнальные пути, что особенно важно при разработке терапевтических подходов с использованием секретома этих клеток. Результаты исследования могут быть использованы для разработки новых подходов к лечению заболеваний, ключевым звеном патогенеза которых является дифференцировка фибробластов в миофибробласты, таких как фибротические заболевания, а также некоторых заболеваний, связанных с образованием хронических язв.

Методология и методы исследования

Методологические подходы исследования включают в себя анализ существующих данных литературы и степени разработанности темы, формулировку цели исследования, исходя из известных паракринных эффектов МСК в процессах заживления повреждённой ткани, а также постановку задач с учётом обоснованности применения существующих методологических подходов. В диссертационном исследовании использованы методы биохимии и молекулярной биологии, а также клеточной биологии и биоинформатики.

Степень достоверности полученных результатов

Научные результаты диссертационного исследования обладают высокой степенью достоверности, что подтверждается достаточной выборкой, воспроизводимостью результатов измерений, а также согласованностью результатов, полученных с использованием различных методов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы влияния белков, секретируемых мезенхимными стволовыми клетками, на дифференцировку фибробластов в миофибробласты»

Апробация работы

Апробация работы была проведена на кафедре биохимии и регенеративной биомедицины Факультета фундаментальной медицины Медицинского научно-образовательного института МГУ имени М.В. Ломоносова. Результаты работы были представлены на всероссийских и международных конференциях, включая The 45th FEBS Congress, V и VI Национальные конгрессы по регенеративной медицине, Международную научную конференцию студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», XXXIV зимнюю молодежную научную школу "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 12-ю международную конференцию "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", 3-ю международную конференцию "Системная биология и системная физиология: регуляция сложных биологических систем", Международную научную конференцию молодых ученых в рамках Площадки открытых коммуникаций OpenBio-2024, Всероссийскую научную конференцию с международным участием «Биохимия человека 2024». Доклад по результатам работы получил II место в секции «Биохимические основы фармакологии» на конференции «Биохимия человека 2024»; доклад с основными результатам работы был признан лучшим в секции "Фундаментальная медицина" конференции OpenBio-2024.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автору принадлежит основная роль в анализе данных литературы, формулировке целей и постановке задач исследования, планировании и проведении экспериментов, статистической обработке полученных данных, а также в подготовке публикаций по теме исследования.

Публикации

По теме диссертации было опубликовано 5 статей в рецензируемых изданиях, индексируемых Scopus и Web of Science.

Список публикаций по теме диссертации в рецензируемых изданиях, индексируемых Scopus и Web of Science:

1. Kulebyakina M., Basalova N., Butuzova D., Arbatsky M., Chechekhin V., Kalinina N., Tyurin-Kuzmin P., Kulebyakin K., Klychnikov O., Efimenko A. Balance between pro- and antifibrotic proteins in mesenchymal stromal cell secretome fractions revealed by proteome and cell subpopulation analysis // International Journal of Molecular Sciences. - 2024. - V. 25, №1. - P. 290.

2. Eremichev R., Kulebyakina M., Alexandrushkina N., Nimiritsky P., Basalova N., Grigoryeva O., Egiazaryan M., Dyikanov D., Tkachuk V., Makarevich P. Scar-free healing of endometrium: Tissue-specific program of stromal cells and its induction by soluble factors produced after damage // Frontiers in Cell and Developmental Biology. -2021. - V. 9. - P.616893.

3. Grigorieva O., Basalova N., Dyachkova U., Novoseletskaya E., Vigovskii M., Arbatskiy M., Kulebyakina M., Efimenko A. Modeling the profibrotic microenvironment in vitro: Model validation // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2024. - V. 733. - P. 150574.

4. Grigorieva O., Vigovskiy M., Dyachkova U., Basalova N., Aleksandrushkina N., Kulebyakina M., Zaitsev I., Popov V., Efimenko A. Mechanisms of endothelial-to-mesenchymal transition induction by extracellular matrix components in pulmonary fibrosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2021. V. 171, №4. P. 523531.

5. Grigorieva O., Basalova N., Vigovskiy M., Arbatskiy M., Dyachkova U., Kulebyakina M., Kulebyakin K., Tyurin-Kuzmin P., Kalinina N., and Efimenko A. Novel potential markers of myofibroblast differentiation revealed by single-cell rna sequencing analysis of mesenchymal stromal cells in profibrotic and adipogenic conditions // Biomedicines. - 2023. - V. 11, № 3. - P. 840.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фракция секретома МСК человека, обогащенная растворимыми белками, препятствует дифференцировке фибробластов кожи человека в миофибробласты in vitro сильнее, чем тотальная фракция секретома.

2. Тотальная фракция секретома МСК обогащена белками, способными активировать транскрипционный фактор NF-kB, и при добавлении к фибробластам в модели миофибробластной дифференцировки in vitro активирует NF-кВ-зависимый сигнальный путь.

3. Фракция растворимых белков секретома МСК обогащена белками, способными регулировать дифференцировку фибробластов в миофибробласты посредством влияния на канонический сигнальный путь Wnt. Эта фракция снижает базальный уровень активации канонического сигнального пути Wnt в фибробластах кожи человека в модели миофибробластной дифференцировки in vitro.

4. Белок DKK3 в составе фракции растворимых белков секретома МСК вносит значимый вклад в подавление дифференцировки фибробластов в миофибробласты in vitro.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Клеточные механизмы репаративной регенерации тканей

Заживление большинства тканей после повреждения имеет общие закономерности и представляет собой сложный многоэтапный процесс, регулируемый как местными, так и системными факторами, в котором участвуют резидентные (находящиеся в ткани), а также привлеченные к месту повреждения клетки. В нем принято выделять несколько этапов, или фаз, в зависимости от преобладающих клеточных событий [5-7]. На рис. 1 приведена последовательность данных фаз с указанием их длительности и основных эффекторных клеток.

Изменение числа клеток в месте повреждения

Фазы заживления повреждения

Рисунок 1. Последовательность этапов (фаз) заживления ткани после повреждения (по [6] и [7], с изм.). Пояснения в тексте. Стрелками отмечены процессы дифференцировки клеток.

В первые минуты (фаза гемостаза) происходит активация тромбоцитов, их дегрануляция и образование тромбоцитарного сгустка. Вещества, высвобождаемые при этом тромбоцитами, стимулируют миграцию других типов

клеток в область повреждения, а также активацию, пролиферацию и дифференцировку этих клеток [6,7]. За фазой гемостаза следует фаза воспаления, начинающаяся при появлении в области повреждения клеток иммунной системы [6-8]. Так, привлеченные нейтрофилы обеспечивают уничтожение патогенов за счёт фагоцитоза, секреции протеаз, продукции активных форм кислорода и других механизмов. Моноциты, мигрировавшие в место повреждения, дифференцируются в макрофаги, которые осуществляют фагоцитоз патогенов и клеточного дебриса. Все указанные типы иммунных клеток секретируют факторы роста, ферменты и хемокины, вызывающие дополнительное привлечение других клеток к месту повреждения, стимулирующие эпителизацию раны, ангиогенез, пролиферацию стромальных клеток и продукцию ими компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) [6,8,9].

Следующим этапом заживления ткани является фаза пролиферации, основные эффекторные клетки которой представлены фибробластами. В зоне повреждения фибробласты активируются, пролиферируют и секретируют компоненты ВКМ. Большая часть фибробластов при ранозаживлении дифференцируется в миофибробласты, которые тоже откладывают ВКМ, а также контрактируют (стягивают) его за счёт своей высокой сократительной способности [10,11]. Помимо этого, в пролиферативной фазе также активно происходит ангиогенез и реэпителизация раневой поверхности [7]. Фазу пролиферации постепенно сменяет фаза ремоделирования, в которую происходит реогранизация компонентов новообразованной ткани, изменение укладки отложенного ВКМ и реваскуляризация [7].

Дифференцировка фибробластов в миофибробласты

При заживлении ткани резидентные фибробласты дифференцируются в миофибробласты - клетки, обладающие высокой секреторной активностью выраженными сократительными способностями. Несмотря на то, что миофибробласты могут образовываться из различных типов клеток (клетки эндотелия, перициты, гладкомышечные клетки, клетки эпителия и др.), основным

источником миофибробластов при заживлении большинства тканей является миофибробластная дифференцировка резидентных фибробластов [2,12]. Она запускается различными профибротическими (трансформирующий фактор роста бета 1, тромбоцитарный фактор роста) и провоспалительными (интерлейкин 1 бета, интерлейкин 6) стимулами, а также изменением жёсткости ВКМ (рис. 2) [2,13,14].

Рисунок 2. Схема фенотипических изменений, сопровождающих процесс дифференцировки фибробластов в миофибробласты (по [15], с изм.). TGF-P1 -трансформирующий фактор роста бета 1, Т№-а - фактор некроза опухоли альфа, PDGF - тромбоцитарный фактор роста, ГЬ-1р - интерлейкин 1 бета, ГЬ-6 -интерлейкин 6.

Дифференцировка фибробластов в миофибробласты сопровождается рядом фенотипических изменений, схематически отображенных на рис. 2. Так, в фибробластах начинает экспрессироваться альфа-гладкомышечный актин - белок цитоскелета, характерный для многих клеток, обладающих сократительным фенотипом. Альфа-гладкомышечный актин далее встраивается в особый тип фибрилл, называемых стресс-фибриллами. На поверхности клеток интегрины перераспределяются и формируют фокальные контакты, обеспечивающие связь

ВКМ с актиновым цитоскелетом (в первую очередь, со стресс-фибриллами). Помимо этого, в данных клетках возрастает экспрессия генов белков ВКМ (таких как коллаген I и III типа, фибронектин, ламинин). Образованные миофибробласты, таким образом, способны откладывать большое количество ВКМ, прикрепляться к нему и за счёт высокой сократительной способности стягивать ВКМ, уменьшая площадь раневой поверхности и сообщая формирующейся рубцовой ткани механическую прочность [11,15-17].

Нарушение регуляции дифференцировки фибробластов в миофибробласты при заживлении повреждённых тканей приводит к различным патологическим состояниям. Сниженное образование миофибробластов существенно замедляет процесс ранозаживления и способно приводить к образованию хронических язв [18]. Избыточное образование миофибробластов из фибробластов может приводить к развитию фиброза - патологического состояния, при котором здоровая функциональная ткань замещается рубцовой тканью, что постепенно приводит к утрате органами своих функций [2,11,13,14].

Сигнальные пути, регулирующие дифференцировку фибробластов в миофибробласты

Канонический сигнальный путь TGF-p

К трансформирующим факторам роста бета (ТСЕ-Р) относятся три белка -TGF-P1, TGF-p2 и TGF-p3. Данные белки являются высококонсервативными у позвоночных животных, имеют высокое структурное сходство между собой и запускают внутриклеточную сигнализацию через одни и те же рецепторы (Трш и ТрЯН, TGF-P-рецептором I и II типа, соответственно). Различия между данными тремя белками заключаются преимущественно в их сродстве к рецепторам, паттерне экспрессии в организме и, следовательно, в регулируемых ими процессах. Так, трансформирующий фактор роста бета-1 (TGF-P1) экспрессируется во многих типах клеток взрослого организма, регулирует обновление тканей, функционирование иммунных клеток и многие процессы, связанные с заживлением ткани после повреждения, включая дифференцировку

фибробластов в миофибробласты. К основным эффектам TGF-P2 можно отнести регуляцию развития сердца и лёгких в эмбриогенезе, а также сдерживание избыточной пролиферации Т-лимфоцитов; TGF-рЭ регулирует развитие дыхательной системы и нёба в эмбриогенезе, а также стимулирует миграцию эпителиальных клеток при заживлении кожных ран [19-21].

Белок-предшественник TGF-pi секретируется разными типами клеток, в том числе фибробластами, макрофагами, тромбоцитами, лимфоцитами и клетками эпителия. Секретированный предшественник TGF-pi связывается с т. н. латентно-ассоциированным пептидом (LAP) и компонентами ВКМ и, таким образом, оказывается задепонированным внутри ВКМ [22]. При повреждении ткани пептид LAP подвергается протеолитическому расщеплению под воздействием матриксных металлопротеиназ, а ВКМ механически растягивается клетками, контактирующими с ним через интегрины, что приводит к высвобождению TGF-pi и образованию его активной формы, способной запускать внутриклеточную сигнализацию [22,23]. Активная форма TGF-pi связывается с находящимся на поверхности клеток-мишеней TGF-P-рецептором II типа, который впоследствии образует комплекс с TGF-P-рецептором I типа и фосфорилирует его по остатку тирозина, инициируя внутриклеточные сигнальные события [2]. Схема канонического сигнального пути, запускаемого TGF-P приведена на рис. 3. Фосфорилирование TGF-PRI приводит к его активации и способности катализировать фосфорилирование эффекторных белков - SMAD2 и SMAD3 - по остаткам серина и треонина в них. Фосфорилированные SMAD2 и SMAD3 образуют гетеротримерный комплекс с белком SMAD4, после чего транслоцируются в ядро и удерживаются в нём [2,24]. В ядре комплекс белков SMAD связывается с располагающимися в промоторах генов-мишеней последовательностями ДНК, носящими название SBE (Smad Binding Elements) [2,25]. Отметим, что связывание белков SMAD с данными последовательностями, как правило, слабое и требует стабилизации с участием других белков (факторов транскрипции); кроме того, белки SMAD могут также связываться с ДНК не напрямую, а опосредованно через некоторые транскрипционные факторы [25].

После связывания с ДНК комплексы SMAD привлекают к данному участку хроматина различные коактиваторы и корепрессоры, которые, в свою очередь, изменяют структуру хроматина, что приводит к изменению экспрессии генов [2,25].

Рисунок 3. Канонический сигнальный путь TGF-P1 (по [24], с изм.). Связывание ТОБ-р1 приводит к образованию комплекса рецепторов TGF-P I типа (TGF-pRI) и II типа (TGF-pRЛ) и фосфорилированию TGF-pRI, который после этого фосфорилирует и активирует белки SMAD2 и SMAD3. Активированные SMAD2 и SMAD3 связываются с белком SMAD4, перемещаются в ядро и регулируют экспрессию генов-мишеней данного сигнального пути. а-ГМА - альфа-гладкомышечный актин.

Активация канонического сигнального пути TGF-P в фибробластах приводит к возрастанию экспрессии генов альфа-гладкомышечного актина, коллагена I типа, тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ и фактора роста соединительной ткани [26,27]. К генам, экспрессию которых канонический сигнальный путь TGF-P подавляет в фибробластах, относятся транскрипционный фактор TCF7L2 (Transcription Factor 7 Like 2) и PDGFRa (Platelet-Derived Growth Factor Receptor Alpha), снижение экспрессии которого сопровождает дифференцировку фибробластов в миофибробласты [28].

Канонический сигнальный путь WNT

Канонический сигнальный путь Wnt, или сигнальный путь Wnt/бета-катенина - высококосервативный сигнальный путь, регулирующий многие процессы дифференцировки клеток как во время эмбрионального развития организма, так и в постнатальный период [29,30]. К основным компонентам данного сигнального пути можно отнести: семейство секретируемых белков Wnt, которые выполняют роль лигандов и активируют данный сигнальный путь; рецепторные белки Frizzlled и их корецепторы Lrp; бета-катенин - ключевой внутриклеточный посредник данного сигнального пути. Сигнальные события, происходящие при активации канонического пути Wnt, приведены на рис. 4. В отсутствие активации сигнального пути Wnt новосинтезирующиеся молекулы бета-катенина входят в состав т.н. разрушающего комплекса (destruction complex), состоящего, помимо бета-катенина, из аксина, выполняющего в данном комплексе функцию скаффолда, белка аденоматозного полипоза толстой кишки (APC), обеспечивающего привлечение и удержание бета-катенина, а также из киназы гликогенсинтазы-3 бета (GSK-3P) и казеинкиназы 1 (CK1) [31-33]. Бета-катенин, вошедший в состав этого комплекса, фосфорилируется казеинкиназой -1 и, таким образом, оказывается праймированным для последующего фосфорилирования в нём трёх остатков серина киназой гликогенсинтазы [34], в результате которого у молекулы бета-катенина формируется фосфодегрон -белковый мотив, обеспечивающий связывание бета-катенина с убиквитинлигазой

[33,35]. Следующее за этим убиквитилирование бета-катенина направляет его на деградацию в протеасому (рис. 4А).

Рисунок 4. Схема канонического сигнального пути Wnt у человека. (по Patel et al 2019, c изм.) А. В отсутствие сигналов от Wnt бета-катенин взаимодействует с разрушающим комплексом, направляющим бета-катенин на путь протеасомной деградации. Транскрипционный фактор семейства TCF/LEF связан с корепрессором TLE, подавляющим экспрессию генов-мишеней данного сигнального пути. Б. Активация канонического сигнального каскада Wnt приводит к фосфорилированию белка Dishevelled (DVL) и корецептора LRP, за которым следует высвобождение бета-катенина из разрушающего комплекса, накопление бета-катенина в цитозоле и его транслокация в ядро. В ядре бета-катенин связывается с транскрипционным фактором TCF/LEF и способствует активации транскрипции целевых генов.

Связывание лиганда Wnt с рецептором Frizzled способствует кластеризацию Frizzled с его корецептором Lrp. Далее комплекс Frizzled-LRP привлекает казеинкиназу 1 эпсилон, которая затем фосфорилирует белок Dishevelled,

находящийся рядом с Frizzled [30,31,33,36]. Фосфорилированние Dishevelled и вхождение его в комплекс в Frizzled способствует кластеризации молекул LRP на мембране и их последующему фосфорилированию (катализируемому казеинкиназой-1 гамма). Это приводит к рекрутированию аксина, несущего на себе разрушающий комплекс, к данному рецепторному комплексу [31,33]. После этого белок Dishevelled ингибирует казеинкиназу-3 в составе разрушающего комплекса, что подавляет весь процесс направления бета-катенина на путь протеасомной деградации [30]. Бета-катенин высвобождается из разрушающего комплекса без формирования фосфодегрона; таким образом, активация сигнального пути Wnt прекращает деградацию бета-катенина. Это приводит к накоплению бета-катенина в цитоплазме и к его транслокации в ядро.

В ядре бета-катенин связывается с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF (Т-клеточный фактор, T-cell factor/ фактор, связывающий лимфоидный энхансер, lymphoid enhancer-binding factor) [37]). В фибробластах преобладающими белками данного семейства являются TCF7L2 и TCF7L1; кроме этого, в отдельных случаях возникает индуцибельная экспрессия белков LEF1 и TCF7 [28]. В отсутствие бета-катенина TCF/LEF связан с транскрипционным корепрессором TLE (Transducin-Like Enhancer of split), гомологом белка Groucho дрозофилы (рис. 4А) [32,38]. Бета-катенин вытесняет TLE из комплекса TLE-TCF/LEF и способствует привлечению к TCF/LEF дополнительных коактиваторов транскрипции (таких как CBP, p300 и Pygopus), в результате чего активируется транскрипция целевых генов, в частности, c-Myc, Ccndl и Axin2, продукты которых регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток [39,40].

Канонический сигнальный каскад Wnt является важнейшим регулятором дифференцировки фибробластов в миофибробласты. Неоднократно показано, что индукция этого сигнального пути в фибробластах посредством добавления рекомбинантных белков Wnt (в частности, Wnt-1 и Wnt-3a) приводит к дифференцировке этих клеток в миофибробласты [41,42]. И, напротив, ингибирование канонического сигнального каскада Wnt подавляет

дифференцировку фибробластов в миофибробласты как in vitro, так и в модели фиброза in vivo [43].

Сигнальный путь NF-kB

Множество провоспалительных сигнальных каскадов приводят к активации транскрипционного фактора NF-kB (энхансер легкой цепи ядерного фактора каппа активированных В-клеток), который регулирует ряд важных клеточных процессов, в частности, воспалительные реакции, клеточный рост и апоптоз [44]. К членам семейства NF-kB относятся белки p50, p52, p65 (RelA), RelB и c-Rel [45]. Белки NF-kB высококонсервативны и встречаются от представителей типа Стрекающие до дрозофилы и человека [46]. Согласно данным литературы, в фибробластах экспрессируются все пять вышеперечисленных белков [47,48]. Транскрипционный фактор NF-kB функционирует в виде гомо- или гетеродимерных комплексов, образованных указанными белками [45,49]. В фибробластах пребладает гетеродимер p65/p50, а также гомодимер из двух p65-субъединиц [50]. Хорошо известно, что NF-kB связывает консенсусную последовательность ДНК (5'-GGGPurNNNPurCC-3', где Pur - пурин, Pir -пиримидин, N - пурин либо пиримидин), называемую сайтом kB, располагающуюся в промоторной и/или энхансерной областях генов-мишеней [51]. Связывание конкретного сайта kB, определяющее возможность регуляции того или иного гена транскрипционным фактором NF-kB, зависит, помимо состояния хроматина, от субъединичного состава транскрипционного фактора NF-kB, а также от посттрансляционных модификаций субъединиц в его составе (в первую очередь, от фосфорилирования) [52,53]. Помимо сайта kB, выделяют также полуконсенсусную последовательнось связывания NF-kB 5'-GGGPurNNPir NNN-3' (располагающуюся, в частности, в промоторах генов CCND1 и CCR7) [51], а также несколько неконсенсусных сайтов связывания NF-kB, обнаруженных в последние годы [54].

К стимулам, активирующим NF-kB, относятся сигналы от цитокинов (таких как интерлейкин-1 альфа (IL-1а), IL-1P, TNF-а), продукты чужеродной

генетической информации (в первую очередь, бактерий и вирусов), а также ряд внутриклеточных стимулов: гипоксия, активные формы кислорода, сигналы стресса эндоплазматического ретикулума [55]. В отсутствие активирующих сигналов NF-kB находится в цитоплазме клеток в секвестрированной (связанной и ввиду этого неактивной) форме. Секвестрирование NF-kB осуществляют белки семейства IkB (inhibitor of kB) за счёт своих доменов, содержащих анкириновые повторы [56]. Помимо IkB, NF-kB может быть секвестрирован белками p100 и p105 (являющимися предшественниками белков p52 и p50, соответственно), в С-концевом участке молекул которых которые также расположен домен, содержащий анкириновые повторы [57]. Действие на клетку провоспалительных стимулов приводит к тому, что киназы семейства IkB фосфорилируют белки, секвестрирующие NF-kB, в результате чего эти белки диссоциируют из комплекса с NF-kB и направляются на путь процессинга (в случае белков p100 и p105) либо протеасомной деградации (рис. 5). У освободившегося NF-kB оказывается демаскирован сигнал ядерной локализации, благодаря чему NF-kB транслоцируется в ядро, где регулирует экспрессию генов [57]. Как правило, транслокации освободившегося NF-kB предшествуют посттрансляционные модификации субъединиц в его составе [58].

К факторам, образующимся при заживлении тканей и способным активировать сигнальный путь NF-kB в фибробластах, относятся молекулярные фрагменты, ассоциированные с повреждениями (Damage-associated molecular patterns, DAMPs) и патоген-ассоциированные молекулярные фрагменты (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), активные формы кислорода (в первую очередь, H2O2), провоспалительные цитокины и факторы роста (IL-ip, TNF-a, TGF-P, эпидермальный фактор роста), а также изменение состава (в частности, увеличение содержания фибронектина и коллагена I типа) и жёсткости ВКМ [59-61].

Рисунок 5. Схема активации сигнального пути NF-kB внешними для клетки стимулами (по [57], с изм). Сигналы от рецепторов, опосредуемые киназами TAK1 либо NIK, приводят к высвобождению транскрипционного фактора NF-kB (представленного, как правило, гетеродимерами p50/RelA, p50/c-Rel, p52/RelB либо гомодимером p50/p50) и его транслокации в ядро, где NF-kB регулирует экспрессию генов-мишеней.

При недостаточном уровне активации NF-kB в фибробластах наблюдается уменьшение эффективности их дифференцировки в миофибробласты, а также снижение выживаемости образующихся миофибробластов, необходимых для заживления поврежденной ткани [62,63]. Избыточная активация NF-kB в фибробластах приводит к повышенному образованию миофибробластов из

фибробластов и, как следствие, к чрезмерному отложению ими ВКМ и замещению функциональной ткани на фиброзную (рубцовую) [60,64,65].

Канонический сигнальный путь NOTCH

Канонический сигнальный путь Notch регулирует пролиферацию, дифференцировку клеток и выбор клеточной судьбы [66,67]. Этот высококонсервативный сигнальный путь примечателен тем, что и рецепторы, и канонические лиганды данного пути представлены мембранными белками, а запуск сигнализации осуществляется в результате контакта двух соседних клеток, при котором лиганд, экспонированный на мембране одной клетки, взаимодействует с рецептором Notch на другой клетке [68].

У млекопитающих семейство Notch состоит из четырех рецепторов Notch (Notch 1-4), экспрессируемых в зависимости от конкретного типа клеток и стадии развития организма [66,68]. На фибробластах показана экспресссия двух рецепторов Notch - Notchl и Notch3 [69]. Канонические лиганды Notch у млекопитающих представлены пятью белками (мембранно-заякоренные белки Jagged 1 и 2, а также трансмембранные белки DLL- (Delta-подобные белки, Deltalike) 1, 3 и 4), общим свойством которых является наличие DSL-домена (Delta/Serrate/LAG-2 domain), имеющего в своем составе бета-складчатый слой и необходимого для связывания этих лигандов с рецепторами Notch [68,70]. Помимо этого, выделяют также неканонические лиганды Notch, названные так из-за отличного от канонических лигандов строения (в частности, из-за отсутствия DSL-домена). К ним относятся ряд трансмембранных (например, DLK1 (Delta-like non-canonical Notch ligand 1), DNER (Delta/Notch-like EGF-related receptor)), заякоренных в мембране (некоторые белки из семейства контактинов) и секретируемых белков (таких как фактор роста соединительной ткани, продукт сверхэкспрессируемого гена нефробластомы (NOV), гликопротеины-1 и -2, ассоциированные с микрофибриллами (MAGP-1 и MAGP-2), тромбоспондин-2 и др.) [70]. Отметим, что деление лигандов на канонические и неканонические, по всей видимости, никак не отражает их способность активировать канонический

сигнальный путь Notch: так, неканонические лиганды Notch MAGP-1 and MAGP-2, согласно литературе, способны активировать канонический сигнальный путь Notch в клетках-мишенях [71].

Активация Notch обычно требует связывания между рецептором Notch и лигандом Notch, экспонированным на двух соседних клетках. Взаимодействие с лигандом приводит к запуску двух последовательных реакций протеолитического расщепления рецептора Notch: сначала - расщепление внеклеточного участка, катализируемое металлопротеазой семейства ADAM (сокращение от A Disintegrin And Metalloproteinase; в подавляющем большинстве случаев, включая Notch-сигналинг в фибробластах, первую реакцию гидролиза Notch катализирует ADAM10), затем - расщепление внутриклеточного участка, катализируемое гамма-секретазным комплексом (а именно гетеротетрамерным комплексом пресенилина 1 (PS1), энхансера пресенелина 2 (Pen2), Aph-1 гомолога A (Aphla) и никастрина) с высвобождением внутриклеточного домена Notch (NICD), который, имея в своем составе сигнал ядерной локализации (NLS), перемещается в ядро [72,73]. Там он взаимодействует с транскрипционным фактором CSL, который у позвоночных представлен белком RBPJk (Recombination Signal Binding Protein For Immunoglobulin Kappa J Region; белок, связывающий сигнал рекомбинации для иммуноглобулина каппа-области). В отсутствие сигнала от канонического пути Notch CSL (RBPJk) связан с репрессорным комплексом CoR и деацетилазами гистонов и функционирует как транкскрипционный репрессор [67]. Взаимодействие NICD с RBPJk приводит к диссоциации последнего от комплекса CoR и гистоновых деацетилаз и к связыванию с RBPJk коактиваторов транскрипции, таких как белки MAML (коактиватор, подобный белку Mastermind), в результате чего образуется комплекс, активирующий транскрипцию генов. Таким образом, внутриклеточный домен Notch, переместившись в ядро, активирует транскрипцию своих генов-мишеней, тем самым опосредуя множество биологических эффектов [66,68,74]. Схема активации канонического сигнального пути NOTCH приведена на рис. 6.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кулебякина Мария Александровна, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Mutsaers H.A.M. et al. The impact of fibrotic diseases on global mortality from 1990 to 2019 // J. Transl. Med. 2023. Vol. 21, № 1. P. 818.

2. Dees C., Chakraborty D., Distler J.H.W. Cellular and molecular mechanisms in fibrosis // Exp. Dermatol. 2021. Vol. 30, № 1. P. 121-131.

3. Kalinina N. et al. Characterization of secretomes provides evidence for adipose-derived mesenchymal stromal cells subtypes // Stem Cell Res. Ther. 2015. Vol. 6, № 1. P. 221.

4. Basalova N. et al. Secretome of Mesenchymal Stromal Cells Prevents Myofibroblasts Differentiation by Transferring Fibrosis-Associated microRNAs within Extracellular Vesicles // Cells. 2020. Vol. 9, № 5. P. 1272.

5. Шмакова Т.В., Кананыхина Е.Ю., Большакова Г.Б. Клеточные механизмы безрубцового заживления кожи млекопитающих. // Научно-практический рецензируемый журнал Клиническая и экспериментальная морфология. 2019. Vol. 8, № 2. P. 5-11.

6. Ярец Ю.И. Острый и хронический раневой процесс: патогенетические особенности. // Медико-биологические проблемы жизнедеятельности. 2016. № 2. P. 21-34.

7. Guillamat-Prats R. The Role of MSC in Wound Healing, Scarring and Regeneration // Cells. 2021. Vol. 10, № 7. P. 1729.

8. Soehnlein O. et al. Neutrophils as protagonists and targets in chronic inflammation // Nat. Rev. Immunol. 2017. Vol. 17, № 4. P. 248-261.

9. Werner S., Grose R. Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines // Physiol. Rev. 2003. Vol. 83, № 3. P. 835-870.

10. Chipev C.C. et al. Myofibroblast phenotype and apoptosis in keloid and palmar fibroblasts in vitro // Cell Death Differ. 2000. Vol. 7, № 2. P. 166-176.

11. Caplan A.I. MSCs: The Sentinel and Safe-Guards of Injury: MSCs as injury responders // J. Cell. Physiol. 2016. Vol. 231, № 7. P. 1413-1416.

12. Kalinina N.I. et al. Mesenchymal stem cells in tissue growth and repair // Acta Naturae. 2011. Vol. 3, № 4. P. 30-37.

13. Kis K., Liu X., Hagood J.S. Myofibroblast differentiation and survival in fibrotic disease // Expert Rev. Mol. Med. 2011. Vol. 13. P. e27.

14. Gyorfi A.H., Matei A.-E., Distler J.H.W. Targeting TGF-P signaling for the treatment of fibrosis // Matrix Biol. 2018. Vol. 68-69. P. 8-27.

15. Hinz B. et al. Recent Developments in Myofibroblast Biology // Am. J. Pathol. 2012. Vol. 180, № 4. P. 1340-1355.

16. Gabbiani G., Ryan G.B., Majno G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction // Experientia. 1971. Vol. 27, № 5. P. 549-550.

17. Tai Y. et al. Myofibroblasts: Function, Formation, and Scope of Molecular Therapies for Skin Fibrosis // Biomolecules. 2021. Vol. 11, № 8. P. 1095.

18. Cialdai F., Risaliti C., Monici M. Role of fibroblasts in wound healing and tissue remodeling on Earth and in space // Front. Bioeng. Biotechnol. 2022. Vol. 10. P. 958381.

19. Roberts A.B., Sporn M.B. Differential expression of the TGF-P isoforms in embryogenesis suggests specific roles in developing and adult tissues // Mol. Reprod. Dev. 1992. Vol. 32, № 2. P. 91-98.

20. Kubiczkova L. et al. TGF-P - an excellent servant but a bad master // J. Transl. Med. 2012. Vol. 10, № 1. P. 183.

21. Flanders K.C. et al. Quantitation of TGF-P proteins in mouse tissues shows reciprocal changes in TGF-P 1 and TGF-P3 in normal vs neoplastic mammary epithelium // Oncotarget. 2016. Vol. 7, № 25. P. 38164-38179.

22. Horiguchi M., Ota M., Rifkin D.B. Matrix control of transforming growth factor-function // J. Biochem. (Tokyo). 2012. Vol. 152, № 4. P. 321-329.

23. Robertson I.B. et al. Latent TGF-P-binding proteins // Matrix Biol. 2015. Vol. 47. P. 44-53.

24. Tie Y. et al. TGF-beta signal transduction: biology, function and therapy for diseases // Mol. Biomed. 2022. Vol. 3, № 1. P. 45.

25. Hill C.S. Transcriptional Control by the SMADs // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2016. Vol. 8, № 10. P. a022079.

26. Meng X., Nikolic-Paterson D.J., Lan H.Y. TGF-ß: the master regulator of fibrosis // Nat. Rev. Nephrol. 2016. Vol. 12, № 6. P. 325-338.

27. Shi X. et al. Transforming Growth Factor-ß Signaling in Fibrotic Diseases and Cancer-Associated Fibroblasts // Biomolecules. 2020. Vol. 10, № 12. P. 1666.

28. Contreras O. et al. TGF-ß-driven downregulation of the transcription factor TCF7L2 affects Wnt/ß-catenin signaling in PDGFRa+ fibroblasts // J. Cell Sci. 2020. Vol. 133, № 12. P. jcs242297.

29. Burgy O., Königshoff M. The WNT signaling pathways in wound healing and fibrosis // Matrix Biol. 2018. Vol. 68-69. P. 67-80.

30. Griffin M.F. et al. The role of Wnt signaling in skin fibrosis // Med. Res. Rev. 2022. Vol. 42, № 1. P. 615-628.

31. Barker N. The Canonical Wnt/ß-Catenin Signalling Pathway // Wnt Signaling / ed. Vincan E. Totowa, NJ: Humana Press, 2008. Vol. 468. P. 5-15.

32. Liu J. et al. Wnt/ß-catenin signalling: function, biological mechanisms, and therapeutic opportunities // Signal Transduct. Target. Ther. 2022. Vol. 7, № 1. P. 3.

33. Albrecht L.V., Tejeda-Munoz N., De Robertis E.M. Cell Biology of Canonical Wnt Signaling // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2021. Vol. 37, № 1. P. 369-389.

34. McCubrey J.A. et al. Multifaceted roles of GSK-3 and Wnt/ß-catenin in hematopoiesis and leukemogenesis: opportunities for therapeutic intervention // Leukemia. 2014. Vol. 28, № 1. P. 15-33.

35. Holt L.J. Regulatory modules: Coupling protein stability to phopshoregulation during cell division // FEBS Lett. 2012. Vol. 586, № 17. P. 2773-2777.

36. Hanakova K. et al. Comparative phosphorylation map of Dishevelled 3 links phospho-signatures to biological outputs // Cell Commun. Signal. 2019. Vol. 17, № 1. P. 170.

37. Hrckulak D. et al. TCF/LEF Transcription Factors: An Update from the Internet Resources // Cancers. 2016. Vol. 8, № 7. P. 70.

38. Jennings B.H., Ish-Horowicz D. The Groucho/TLE/Grg family of transcriptional co-repressors // Genome Biol. 2008. Vol. 9, № 1. P. 205.

39. Städeli R., Hoffmans R., Basler K. Transcription under the Control of Nuclear Arm/ß-Catenin // Curr. Biol. 2006. Vol. 16, № 10. P. R378-R385.

40. Ramakrishnan A.-B., Cadigan K.M. Wnt target genes and where to find them // F1000Research. 2017. Vol. 6. P. 746.

41. Akhmetshina A. et al. Activation of canonical Wnt signalling is required for TGF-ß-mediated fibrosis // Nat. Commun. 2012. Vol. 3, № 1. P. 735.

42. Wei J. et al. Wnt/ß-catenin signaling is hyperactivated in systemic sclerosis and induces Smad-dependent fibrotic responses in mesenchymal cells // Arthritis Rheum.

2012. Vol. 64, № 8. P. 2734-2745.

43. Huang S. et al. DKK1 Ameliorates Myofibroblast Differentiation in Urethral Fibrosis in Vivo and in Vitro by Regulating the Canonical Wnt Pathway // Int. J. Med. Sci. 2023. Vol. 20, № 12. P. 1631-1643.

44. Герштейн Е.С. et al. Ключевые компоненты NF-kB-сигнального пути в опухолях больных раком молочной железы. // Вестник российских университетов.

2013. Vol. 18, № 6. P. 3292-3297.

45. Liu T. et al. NF-kB signaling in inflammation // Signal Transduct. Target. Ther. 2017. Vol. 2, № 1. P. 17023.

46. Gilmore T.D. Introduction to NF-kB: players, pathways, perspectives // Oncogene. 2006. Vol. 25, № 51. P. 6680-6684.

47. Beauchef G. et al. The p65 Subunit of NF-kB Inhibits COL1A1 Gene Transcription in Human Dermal and Scleroderma Fibroblasts through Its Recruitment on Promoter by Protein Interaction with Transcriptional Activators (c-Krox, Sp1, and Sp3) // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287, № 5. P. 3462-3478.

48. Fullard N. et al. The c-Rel Subunit of NF-kB Regulates Epidermal Homeostasis and Promotes Skin Fibrosis in Mice // Am. J. Pathol. 2013. Vol. 182, № 6. P. 21092120.

49. Sun S.-C., Chang J.-H., Jin J. Regulation of nuclear factor-KB in autoimmunity // Trends Immunol. 2013. Vol. 34, № 6. P. 282-289.

50. Martin E.W. et al. Assaying Homodimers of NF-kB in Live Single Cells // Front. Immunol. 2019. Vol. 10. P. 2609.

51. Mulero M.C. et al. Genome reading by the NF-kB transcription factors // Nucleic Acids Res. 2019. Vol. 47, № 19. P. 9967-9989.

52. Hochrainer K., Racchumi G., Anrather J. Site-specific Phosphorylation of the p65 Protein Subunit Mediates Selective Gene Expression by Differential NF-kB and RNA Polymerase II Promoter Recruitment // J. Biol. Chem. 2013. Vol. 288, № 1. P. 285-293.

53. Brignall R. et al. Considering Abundance, Affinity, and Binding Site Availability in the NF-kB Target Selection Puzzle // Front. Immunol. 2019. Vol. 10. P. 609.

54. Bacher S. et al. Regulation of Transcription Factor NF-kB in Its Natural Habitat: The Nucleus // Cells. 2021. Vol. 10, № 4. P. 753.

55. May M.J., Ghosh S. Rel/NF-KB and IkB proteins: an overview // Semin. Cancer Biol. 1997. Vol. 8, № 2. P. 63-73.

56. Oeckinghaus A., Ghosh S. The NF-kB Family of Transcription Factors and Its Regulation // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2009. Vol. 1, № 4. P. a000034-a000034.

57. Sun S.-C. The non-canonical NF-kB pathway in immunity and inflammation // Nat. Rev. Immunol. 2017. Vol. 17, № 9. P. 545-558.

58. Hayden M.S., Ghosh S. Shared Principles in NF-kB Signaling // Cell. 2008. Vol. 132, № 3. P. 344-362.

59. Morgan M.J., Liu Z. Crosstalk of reactive oxygen species and NF-kB signaling // Cell Res. 2011. Vol. 21, № 1. P. 103-115.

60. Talbott H.E. et al. Wound healing, fibroblast heterogeneity, and fibrosis // Cell Stem Cell. 2022. Vol. 29, № 8. P. 1161-1180.

61. Guo Q. et al. NF-kB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications // Signal Transduct. Target. Ther. 2024. Vol. 9, № 1. P. 53.

62. Best K.T. et al. NF-kB activation persists into the remodeling phase of tendon healing and promotes myofibroblast survival // Sci. Signal. 2020. Vol. 13, № 658. P. eabb7209.

63. Rai V., K. Agrawal D. Role of Transcription Factors and MicroRNAs in Regulating Fibroblast Reprogramming in Wound Healing // J. Bioinforma. Syst. Biol. 2023. Vol. 06, № 02.

64. Kendall R.T., Feghali-Bostwick C.A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators // Front. Pharmacol. 2014. Vol. 5.

65. Antar S.A. et al. Fibrosis: Types, Effects, Markers, Mechanisms for Disease Progression, and Its Relation with Oxidative Stress, Immunity, and Inflammation // Int. J. Mol. Sci. 2023. Vol. 24, № 4. P. 4004.

66. Sachan N. et al. Notch signalling: multifaceted role in development and disease // FEBS J. 2024. Vol. 291, № 14. P. 3030-3059.

67. Andersen P. et al. Non-canonical Notch signaling: emerging role and mechanism // Trends Cell Biol. 2012. Vol. 22, № 5. P. 257-265.

68. Дергилев К.В. et al. Сигнальный путь Notch-терапевтическая мишень для регуляции репаративных процессов в сердце. // Терапевтический архив. 2018. Vol. 90, № 12. P. 112-121.

69. Wei K., Nguyen H.N., Brenner M.B. Fibroblast pathology in inflammatory diseases // J. Clin. Invest. 2021. Vol. 131, № 20. P. e149538.

70. D'Souza B., Meloty-Kapella L., Weinmaster G. Canonical and Non-Canonical Notch Ligands // Current Topics in Developmental Biology. Elsevier, 2010. Vol. 92. P. 73-129.

71. Miyamoto A. et al. Microfibrillar Proteins MAGP-1 and MAGP-2 Induce Notch1 Extracellular Domain Dissociation and Receptor Activation // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 15. P. 10089-10097.

72. Kovall R.A. et al. The Canonical Notch Signaling Pathway: Structural and Biochemical Insights into Shape, Sugar, and Force // Dev. Cell. 2017. Vol. 41, № 3. P. 228-241.

73. Zhao G. et al. y-Secretase Composed of PS1/Pen2/Aph1a Can Cleave Notch and Amyloid Precursor Protein in the Absence of Nicastrin // J. Neurosci. 2010. Vol. 30, № 5. P. 1648-1656.

74. Condorelli A.G. et al. Notch-ing up knowledge on molecular mechanisms of skin fibrosis: focus on the multifaceted Notch signalling pathway // J. Biomed. Sci. 2021. Vol. 28, № 1. P. 36.

75. Sanalkumar R., Dhanesh S.B., James J. Non-canonical activation of Notch signaling/target genes in vertebrates // Cell. Mol. Life Sci. 2010. Vol. 67, № 17. P. 2957-2968.

76. Borggrefe T., Oswald F. The Notch signaling pathway: Transcriptional regulation at Notch target genes // Cell. Mol. Life Sci. 2009. Vol. 66, № 10. P. 1631-1646.

77. Zhou B. et al. Notch signaling pathway: architecture, disease, and therapeutics // Signal Transduct. Target. Ther. 2022. Vol. 7, № 1. P. 95.

78. Acar A. et al. Inhibition of Wnt signalling by Notch via two distinct mechanisms // Sci. Rep. 2021. Vol. 11, № 1. P. 9096.

79. Shin H.M. et al. Notch1 augments NF-kB activity by facilitating its nuclear retention // EMBO J. 2006. Vol. 25, № 1. P. 129-138.

80. Masuda S. et al. Notch1 oncoprotein antagonizes TGF-p/Smad-mediated cell growth suppression via sequestration of coactivator p300 // Cancer Sci. 2005. Vol. 96, № 5. P. 274-282.

81. Luo K. Signaling Cross Talk between TGF-p/Smad and Other Signaling Pathways // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2017. Vol. 9, № 1. P. a022137.

82. Hong W. et al. Epithelial and interstitial Notch1 activity contributes to the myofibroblasts phenotype and fibrosis // Cell Commun. Signal. 2019. Vol. 17, № 1. P. 145.

83. Zmorzynski S. et al. The Significance of NOTCH Pathway in the Development of Fibrosis in Systemic Sclerosis // Ann. Dermatol. 2019. Vol. 31, № 4. P. 365.

84. Dees C. et al. Notch signalling regulates fibroblast activation and collagen release in systemic sclerosis // Ann. Rheum. Dis. 2011. Vol. 70, № 7. P. 1304-1310.

85. Huang S. et al. Effects of a gamma-secretase inhibitor of notch signalling on transforming growth factor ß1-induced urethral fibrosis // J. Cell. Mol. Med. 2021. Vol. 25, № 18. P. 8796-8808.

86. Dees C. et al. Activation of notch1 signaling in fibroblasts is sufficient to induce fibrosis and activates a network of profibrotic signaling cascades // Scientific Abstracts. BMJ Publishing Group Ltd and European League Against Rheumatism, 2024. P. 287.1287.

87. Hu B. et al. Mesenchymal Deficiency of Notch1 Attenuates Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis // Am. J. Pathol. 2015. Vol. 185, № 11. P. 3066-3075.

88. Orbay H., Tobita M., Mizuno H. Mesenchymal Stem Cells Isolated from Adipose and Other Tissues: Basic Biological Properties and Clinical Applications // Stem Cells Int. 2012. Vol. 2012. P. 1-9.

89. Sagaradze G.D. et al. Mesenchymal Stromal Cells as Critical Contributors to Tissue Regeneration // Front. Cell Dev. Biol. 2020. Vol. 8. P. 576176.

90. Lara-Barba E. et al. Role of microRNA Shuttled in Small Extracellular Vesicles Derived From Mesenchymal Stem/Stromal Cells for Osteoarticular Disease Treatment // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. P. 768771.

91. Rajool Dezfuly A., Safaee A., Salehi H. Therapeutic effects of mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles' miRNAs on retinal regeneration: a review // Stem Cell Res. Ther. 2021. Vol. 12, № 1. P. 530.

92. Tang J. et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: a regulator and carrier for targeting bone-related diseases // Cell Death Discov. 2024. Vol. 10, № 1. P. 212.

93. Zhang X. et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles: Roles in Tumor Growth, Progression, and Drug Resistance // Stem Cells Int. 2017. Vol. 2017. P. 1-12.

94. Qiu G. et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles affect disease outcomes via transfer of microRNAs // Stem Cell Res. Ther. 2018. Vol. 9, № 1. P. 320.

95. Sisa C. et al. Mesenchymal Stromal Cell Derived Extracellular Vesicles Reduce Hypoxia-Ischaemia Induced Perinatal Brain Injury // Front. Physiol. 2019. Vol. 10. P. 282.

96. Casado-Díaz A., Quesada-Gómez J.M., Dorado G. Extracellular Vesicles Derived From Mesenchymal Stem Cells (MSC) in Regenerative Medicine: Applications in Skin Wound Healing // Front. Bioeng. Biotechnol. 2020. Vol. 8. P. 146.

97. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

98. Candiano G. et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis // ELECTROPHORESIS. 2004. Vol. 25, № 9. P. 13271333.

99. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1979. Vol. 76, № 9. P. 4350-4354.

100. Nowacki F.C. et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni // J. Extracell. Vesicles. 2015. Vol. 4, № 1. P. 28665.

101. Tyanova S., Temu T., Cox J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics // Nat. Protoc. 2016. Vol. 11, № 12. P. 23012319.

102. Schaab C. et al. Analysis of High Accuracy, Quantitative Proteomics Data in the MaxQB Database // Mol. Cell. Proteomics. 2012. Vol. 11, № 3. P. M111.014068.

103. Tyanova S. et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data // Nat. Methods. 2016. Vol. 13, № 9. P. 731-740.

104. Ashburner M. et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology // Nat. Genet. 2000. Vol. 25, № 1. P. 25-29.

105. The Gene Ontology Consortium et al. The Gene Ontology knowledgebase in 2023 // GENETICS / ed. Baryshnikova A. 2023. Vol. 224, № 1. P. iyad031.

106. Roncaglia P. et al. The Gene Ontology (GO) Cellular Component Ontology: integration with SAO (Subcellular Anatomy Ontology) and other recent developments // J. Biomed. Semant. 2013. Vol. 4, № 1. P. 20.

107. Jassal B. et al. The reactome pathway knowledgebase // Nucleic Acids Res. 2019. P. gkz1031.

108. Raudvere U. et al. g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update) // Nucleic Acids Res. 2019. Vol. 47, № W1. P. W191-W198.

109. Ye J. et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction // BMC Bioinformatics. 2012. Vol. 13, № 1. P. 134.

110. Nakao S. et al. Tumor necrosis factor a (TNF-a)-induced prostaglanding E2 release is mediated by the activation of cyclooxygenase-2 (COX-2)transcription via NFkB in human gingival fibroblasts // Mol. Cell. Biochem. 2002. Vol. 238, № 1/2. P. 11-18.

111. Kogan-Sakin I. et al. Prostate stromal cells produce CXCL-1, CXCL-2, CXCL-3 and IL-8 in response to epithelia-secreted IL-1 // Carcinogenesis. 2009. Vol. 30, № 4. P. 698-705.

112. Tian B. et al. Analysis of the TGFß-induced program in primary airway epithelial cells shows essential role of NF-KB/RelA signaling network in type II epithelial mesenchymal transition // BMC Genomics. 2015. Vol. 16, № 1. P. 529.

113. Bukong T.N. et al. Versican: a novel modulator of hepatic fibrosis // Lab. Invest. 2016. Vol. 96, № 3. P. 361-374.

114. Baarsma H.A. et al. Activation of WNT / ß-Catenin Signaling in Pulmonary Fibroblasts by TGF-ß1 Is Increased in Chronic Obstructive Pulmonary Disease // PLoS ONE / ed. Eickelberg O. 2011. Vol. 6, № 9. P. e25450.

115. Königshoff M. et al. Functional Wnt Signaling Is Increased in Idiopathic Pulmonary Fibrosis // PLoS ONE / ed. Schmidt H.H.H.W. 2008. Vol. 3, № 5. P. e2142.

116. Sobel K. et al. Wnt-3a-activated human fibroblasts promote human keratinocyte proliferation and matrix destruction // Int. J. Cancer. 2015. Vol. 136, № 12. P. 27862798.

117. Syed F., Bayat A. Notch signaling pathway in keloid disease: Enhanced fibroblast activity in a J agged-1 peptide-dependent manner in lesional vs. extralesional fibroblasts // Wound Repair Regen. 2012. Vol. 20, № 5. P. 688-706.

118. Pupo M. et al. GPER activates Notch signaling in breast cancer cells and cancer-associated fibroblasts (CAFs) // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2014. Vol. 46. P. 56-67.

119. Grigorieva O. et al. Modeling the profibrotic microenvironment in vitro: Model validation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2024. Vol. 733. P. 150574.

120. Novoseletskaya E. et al. Mesenchymal Stromal Cell-Produced Components of Extracellular Matrix Potentiate Multipotent Stem Cell Response to Differentiation Stimuli // Front. Cell Dev. Biol. 2020. Vol. 8. P. 555378.

121. Zheng G.X.Y. et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells // Nat. Commun. 2017. Vol. 8, № 1. P. 14049.

122. Longobardi E., Blasi F. Overexpression of PREP-1 in F9 Teratocarcinoma Cells Leads to a Functionally Relevant Increase of PBX-2 by Preventing Its Degradation // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 40. P. 39235-39241.

123. Snelling S. et al. Dickkopf-3 is upregulated in osteoarthritis and has a chondroprotective role // Osteoarthritis Cartilage. 2016. Vol. 24, № 5. P. 883-891.

124. Zhang K. et al. Islr regulates canonical Wnt signaling-mediated skeletal muscle regeneration by stabilizing Dishevelled-2 and preventing autophagy // Nat. Commun. 2018. Vol. 9, № 1. P. 5129.

125. Yuzuriha A. et al. Extracellular laminin regulates hematopoietic potential of pluripotent stem cells through integrin ß1-ILK-ß-catenin-JUN axis // Stem Cell Res. 2021. Vol. 53. P. 102287.

126. Suresh S. et al. The matricellular protein CCN3 regulates NOTCH1 signalling in chronic myeloid leukaemia: NOTCH1-CCN3 signalling in CML // J. Pathol. 2013. Vol. 231, № 3. P. 378-387.

127. Aubert A. et al. Latent TGF-ß Activation Is a Hallmark of the Tenascin Family // Front. Immunol. 2021. Vol. 12. P. 613438.

128. Xu J. et al. Exogenous DKK-3/REIC inhibits Wnt/ß-catenin signaling and cell proliferation in human kidney cancer KPK1 // Oncol. Lett. 2017.

129. Yu B. et al. A Cytokine-Like Protein Dickkopf-Related Protein 3 Is Atheroprotective // Circulation. 2017. Vol. 136, № 11. P. 1022-1036.

130. Nakamura R.E. et al. Identification of two novel activities of the Wnt signaling regulator Dickkopf 3 and characterization of its expression in the mouse retina // BMC Cell Biol. 2007. Vol. 8, № 1. P. 52.

131. Nakamura R.E.I., Hackam A.S. Analysis of Dickkopf3 interactions with Wnt signaling receptors // Growth Factors. 2010. Vol. 28, № 4. P. 232-242.

132. Zhou Q. et al. A Positive Feedback Loop of AKR1C3-Mediated Activation of NF-kB and STAT3 Facilitates Proliferation and Metastasis in Hepatocellular Carcinoma // Cancer Res. 2021. Vol. 81, № 5. P. 1361-1374.

133. Kucia M. et al. CXCR4-SDF-1 Signalling, Locomotion, Chemotaxis and Adhesion // J. Mol. Histol. 2003. Vol. 35, № 3. P. 233-245.

134. Lantner F. et al. CD74 induces TAp63 expression leading to B-cell survival // Blood. 2007. Vol. 110, № 13. P. 4303-4311.

135. Li Q.-L. et al. The role of CD74 in cardiovascular disease // Front. Cardiovasc. Med. 2023. Vol. 9. P. 1049143.

136. Pan Z. et al. MFAP4 deficiency alleviates renal fibrosis through inhibition of NF-kB and TGF-ß/Smad signaling pathways // FASEB J. 2020. Vol. 34, № 11. P. 14250-14263.

137. Gnecchi M. et al. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair // Mesenchymal Stem Cells / ed. Gnecchi M. New York, NY: Springer New York, 2016. Vol. 1416. P. 123-146.

138. Maacha S. et al. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stromal Cells in Angiogenesis // Stem Cells Int. 2020. Vol. 2020. P. 1-12.

139. Alvites R. et al. Mesenchymal Stem/Stromal Cells and Their Paracrine Activity— Immunomodulation Mechanisms and How to Influence the Therapeutic Potential // Pharmaceutics. 2022. Vol. 14, № 2. P. 381.

140. Li M., Chen H., Zhu M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system // Front. Neurosci. 2022. Vol. 16. P. 1068114.

141. Chen N., Chen C.-C., Lau L.F. Adhesion of Human Skin Fibroblasts to Cyr61 Is Mediated through Integrin a6ß1 and Cell Surface Heparan Sulfate Proteoglycans // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, № 32. P. 24953-24961.

142. Kawano Y., Kypta R. Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway // J. Cell Sci. 2003. Vol. 116, № 13. P. 2627-2634.

143. Ferrari N. et al. Dickkopf-3 links HSF1 and YAP/TAZ signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts // Nat. Commun. 2019. Vol. 10, № 1. P. 130.

144. Mao B., Niehrs C. Kremen2 modulates Dickkopf2 activity during Wnt/lRP6 signaling // Gene. 2003. Vol. 302, № 1-2. P. 179-183.

145. Mourtada J. et al. The Multifaceted Role of Human Dickkopf-3 (DKK-3) in Development, Immune Modulation and Cancer // Cells. 2023. Vol. 13, № 1. P. 75.

146. Krupnik V.E. et al. Functional and structural diversity of the human Dickkopf gene family // Gene. 1999. Vol. 238, № 2. P. 301-313.

147. Wang M.M. Notch signaling and Notch signaling modifiers // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011. Vol. 43, № 11. P. 1550-1562.

148. Sakamoto K. et al. The Nephroblastoma Overexpressed Gene (NOV/ccn3) Protein Associates with Notch1 Extracellular Domain and Inhibits Myoblast Differentiation via Notch Signaling Pathway // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 33. P. 29399-29405.

149. Liu J. et al. Notch Signaling in the Regulation of Stem Cell Self-Renewal and Differentiation // Current Topics in Developmental Biology. Elsevier, 2010. Vol. 92. P. 367-409.

150. Hori K., Sen A., Artavanis-Tsakonas S. Notch signaling at a glance // J. Cell Sci. 2013. P. jcs.127308.

151. Wells R.G., Kruglov E., Dranoff J.A. Autocrine release of TGF-P by portal fibroblasts regulates cell growth // FEBS Lett. 2004. Vol. 559, № 1-3. P. 107-110.

152. Teicher B.A., Fricker S.P. CXCL12 (SDF-1)/CXCR4 Pathway in Cancer // Clin. Cancer Res. 2010. Vol. 16, № 11. P. 2927-2931.

153. Cloutier M., Fortin J.-S., Thibodeau J. The transmembrane domain and luminal C-terminal region independently support invariant chain trimerization and assembly with MHCII into nonamers // BMC Immunol. 2021. Vol. 22, № 1. P. 56.

154. Martin-Ventura J.L. et al. Increased CD74 expression in human atherosclerotic plaques: contribution to inflammatory responses in vascular cells // Cardiovasc. Res. 2009. Vol. 83, № 3. P. 586-594.

155. Luo Y. et al. Macrophage migration inhibitory factor in the pathogenesis of leukemia (Review) // Int. J. Oncol. 2021. Vol. 59, № 2. P. 62.

156. Gil-Yarom N. et al. CD74 is a novel transcription regulator // Proc. Natl. Acad. Sci. 2017. Vol. 114, № 3. P. 562-567.

157. Mizuno M. et al. Canonical NF-kB p65, but Not p105, Contributes to IL-1p-Induced IL-8 Expression in Cardiac Fibroblasts // Front. Immunol. 2022. Vol. 13. P. 863309.

158. Zhang Y. et al. Macrophage migration inhibitory factor activates the inflammatory response in joint capsule fibroblasts following post-traumatic joint contracture // Aging. 2021. Vol. 13, № 4. P. 5804-5823.

159. Behnke J. et al. Signal-peptide-peptidase-like 2a (SPPL2a) is targeted to lysosomes/late endosomes by a tyrosine motif in its C-terminal tail // FEBS Lett. 2011. Vol. 585, № 19. P. 2951-2957.

160. Zhu S. et al. Plasma Exosomal AKR1C3 mRNA Expression Is a Predictive and Prognostic Biomarker in Patients with Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer // The Oncologist. 2022. Vol. 27, № 11. P. e870-e877.

161. Hou J. et al. TNF-a-induced NF-kB activation promotes myofibroblast differentiation of LR-MSCs and exacerbates bleomycin-induced pulmonary fibrosis // J. Cell. Physiol. 2018. Vol. 233, № 3. P. 2409-2419.

162. Wangler S. et al. Uncovering the secretome of mesenchymal stromal cells exposed to healthy, traumatic, and degenerative intervertebral discs: a proteomic analysis // Stem Cell Res. Ther. 2021. Vol. 12, № 1. P. 11.

163. Tyurin-Kuzmin P.A., Hayashi Y., Kulebyakin K. Editorial: Functional heterogeneity of stem cells // Front. Cell Dev. Biol. 2023. Vol. 11. P. 1179911.

164. Chechekhin V. et al. Alpha1A- and Beta3-Adrenoceptors Interplay in Adipose Multipotent Mesenchymal Stromal Cells: A Novel Mechanism of Obesity-Driven Hypertension // Cells. 2023. Vol. 12, № 4. P. 585.

165. Chechekhin V.I. et al. Noradrenaline and serotonin-dependent sensitization of MSCs to noradrenaline // MethodsX. 2024. Vol. 12. P. 102587.

166. Arellano M.Y.G. et al. Role of Mesenchymal Stem/Stromal Cells (MSCs) and MSC-Derived Extracellular Vesicles (EVs) in Prevention of Telomere Length Shortening, Cellular Senescence, and Accelerated Biological Aging // Bioengineering. 2024. Vol. 11, № 6. P. 524.