Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/Nodal и Wnt в эмбриональном развитии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Ерошкин, Федор Михайлович

• Ерошкин, Федор Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ерошкин, Федор Михайлович

Оглавление

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Общие принципы эмбриональной индукции. Нейральная индукция

2.2. Сигнальный каскад TGF-P

2.2.1. Суперсемейство TGF-J3

2.2.2. Каскад Activin/Nodal

2.2.3..Внеклеточная регуляция Activin-каскада

2.2.4. Рецепторы Activin

2.2.5. Регуляция рецепторов Activin

2.2.6. Регуляция сигнального каскада Activin через белки Smad

2.2.7. Гены-мишени Smad2 каскада

2.2.8. Smad-независимый сигнальный путь Activin и перекрестное действие рецепторов

2.2.9. Роль Activin и TGF-|3 в канцерогенезе

2.2.10. Activin и стволовые клетки

2.2.11. Каскад BMP

2.2.12. Функции BMP

2.2.13. Внеклеточная регуляция ВМР-каскада

2.2.14. Внутриклеточная регуляция ВМР-каскада

2.2.15. Гены-мишени Smadl- (BMP-) каскада

2.3. Сигнальный каскад Wnt

2.3.1. Классификация активностей Wnt лигандов

2.3.2. Канонический путь Wnt (Wnt/(3-Catenin)

2.3.3. Планарная клеточная полярность (PCP)

2.3.4. Неканонический Wnt/Ca2+ путь

2.3.5. Секреция Wnt и внеклеточные регуляторы

2.3.6. Wnt-индуцированные клеточные ответы

2.4. Эволюционное происхождение сигнальных каскадов TGF-(3 и Wnt

2.5. Взаимодействие сигнальных каскадов в раннем развитии Xenopus

2.6. Регионализация нервной трубки в ходе эмбриогенеза

2.7. Семейство белков Noggin

2.7.1 Функциональная роль Noggin

2.7.2. Структура Noggin

2.7.3. Noggin как ингибитор BMP

2.7.4. Белок Noggin человека (HNoggin)

2.7.5. Мутации гена Noggin

3. Полученные результаты

3.1. Клонирование и анализ последовательностей новых белков семейства Noggin

3.2. Изучение локализации экспрессии генов Noggin в раннем развитии шпорцевой лягушки

3.3. Изучение эффектов эктопической экспрессии генов Nogginl и -2 в раннем развитии шпорцевой лягушки

3.4. Изучение эффективности трансляции мРНК генов Nogginl и -2 в эмбрионах шпорцевой лягушки

3.5. Изучение лиганд-связывающих свойств белков Nogginl и -2

3.6. Nogginl и Noggin2 способны ингибировать активность Activin/Nodal- и Wnt-каскадов в живых эмбрионах

3.7. Nogginl и Noggin2 способны влиять на онтогенетические процессы, контролируемые Activin/Nodal- и Wnt- каскадами в эмбрионах

3.8. Активность Noggin2, но не Nogginl, необходима для нормального эмбрионального развития Xenopus

3.9. Ингибирование Activin-каскада посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур

4. Обсуждение результатов

4.1. TGF-p лиганды (помимо BMP) и Wnt являются мишенями белков семейства Noggin

4.2. Ингибирование Activin-, BMP- и Wnt-каскадов посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур

5. Выводы

6. Материалы и методы

6.1. Материалы

6.1.1 Реактивы

6.1.2. Ферментные препараты

6.1.3. Лабораторное оборудование

6.1.4. Лабораторные животные

6.1.5. Буферы и растворы

6.1.6. Микробиологические среды

6.1.7. Предоставленные штаммы

6.1.8. Предоставленные плазмиды

6.2. Методы

6.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)

6.2.2. Электрофорез в агарозном геле

6.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля

6.2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

6.2.5. Достройка 3"-конца двухцепочечных молекул ДНК

6.2.6. Отщепление выступающего 3" - конца двухцепочечных молекул ДНК

6.2.7. Лигирование молекул ДНК

6.2.8. Трансформация клеток Escherichia coli

6.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий Escherichia coli

6.2.10. Изготовление плазмидных ДНК конструкций

6.2.11. Транскрипция in vitro

6.2.12. Получение зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis

6.2.13. Синтез белков в ооцитах или зародышах Xenopus laevis

6.2.14. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ

6.2.15. Иммуноблот (Western Blotting)

6.2.16. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vivo с помощью метода коиммунопреципитации

6.2.17. Блокирование трансляции эндогенных мРНК при помощи микроинъекций синтетических антисмысловых олигонуклеотидов

6.2.18. Фиксация зародышей

6.2.19. Гибридизация in situ на целых эмбрионах шпорцевой лягушки

6.2.20. Синтез дигоксигенин-меченной антисмысловой РНК для проведения гибридизации in situ

6.2.21. Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки

6.2.22. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)

6.2.23. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) в реальном времени

6.2.24. Измерение люциферазной активности специфических репортеров

8. Список сокращений

7. Благодарности

143

9. Список использованной литературы

145

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/Nodal и Wnt в эмбриональном развитии»

1. Введение

Одной из важнейших задач современной биологии развития является поиск и изучение факторов, обеспечивающих индукционные взаимодействия клеток и тканей в ходе эмбриогенеза. Секретируемый белок Noggin (Nogginl) является первым идентифицированным белковым фактором, участвующим в первичной эмбриональной индукции. Он был открыт Ричардом Харландом в 1992 г. у шпорцевой лягушки Xenopus как нейральный индуктор, продуцируемый шпемановским организатором. Nogginl способен связывать белки одной из субгрупп цитокинов TGF-(3, а именно Bone Morphogenetic Proteins (BMP) (Smith and Harland, 1992). Действуя вне клетки, BMP индуцирует ассоциацию специфических рецепторных серин-треониновых киназ I и II типа, что приводит к внутриклеточному фосфорилированию цитоплазматических белков Smadl/5/8, которые в паре со Smad4 мигрируют в ядро и регулируют ранскрипцию специфических генов-мишеней (Shi and Massague, 2003). Так как Noggin препятствует связыванию BMP с рецепторами (Groppe et al., 2002), это приводит к ингибированию сигнального пути, опосредованного Smadl/5/8. Благодаря этой функции, Nogginl, будучи эктопически экспрессирован в вентральной части эмбриона Xenopus, способен индуцировать вторичные оси, лишенные голов. В нормальном развитии Nogginl играет ключевую роль в различных процессах, включая индукцию нервной ткани и скелетной мускулатуры в раннем эмбриогенезе (Smith and Harland, 1992), развитие хрящей (Botchkarev et al., 1999) и дифференцировку волосяных фолликулов (Brunei et al., 1998; Botchkarev et al., 1999; Shi and Massague, 2003). Во многих экспериментальных системах, например, при изучении стволовых или раковых клеток, Nogginl используется в качестве искусственного ингибитора BMP-каскада. Считается общепризнанным, что Nogginl не является антагонистом для другой субгруппы лигандов TGF-J3, Activin/Nodal/TGFbeta, которые связываются с другими серин-треонин киназными рецепторами и регулируют транскрипцию другого набора генов-мишеней через внутриклеточный белок-посредник Smad2/3 (Branford and Yost, 2002). Известно, что ингибирование этого сигнального пути необходимо для правильной разметки

мезодермы при гаструляции (Piccolo et al., 1999), развития переднего мозга (Meno et al., 2001) и установления право-левой ассимметрии (Grande and Patel, 2009).

Помимо "классического" Noggin 1, у позвоночных были найдены две других группы белков семейства Noggin, Noggin2 и Noggin4 (Furthauer et al., 1999; Fletcher et al., 2004; Eroshkin et al., 2006). Биологическая функция была показана в экспериментах только для Noggin2, который экспрессируется специфически в зачатке конечного мозга эмбрионов Xenopus и Danio. На основании этих данных было предположено, что Noggin2 может, по большей части, дублировать ВМР-антагонистическую функцию Nogginl (Furthauer et al., 1999). Однако, по нашему предположению, значительные различия в первичной структуре белков Noggin, которые принадлежат к разным белковым подсемействам (Eroshkin et al., 2006), и различающиеся паттерны их экспрессии указывают на возможные различия в репертуаре связываемых ими белков и предполагают различную биологическую функцию.

В связи с этим, задача настоящей работы - изучение механизмов функционирования данных белков и их роли в ранней тканевой дифференцировке - представляется весьма актуальной, как с точки зрения получения новых фундаментальных знаний, так и ввиду необходимости создания новых генно-инженерных продуктов для специфичного управления процессами жизнедеятельности и дифференцировки клеток.

Особенностью данной работы является использование в качестве основной экспериментальной модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus. Данная модель признается одной из наиболее перспективных для изучения механизмов реализации генетической информации в раннем эмбриогенезе и, кроме этого, представляет собой удобную тест-систему, позволяющую исследовать процессы in vivo.

2. Обзор литературы

2.1 Общие принципы эмбриональной индукции. Нейральная индукция

Эмбриональная индукция — взаимодействие между частями развивающегося организма у многоклеточных животных. Явление было открыто в 1901 году при изучении образования зачатка хрусталика глаз у зародышей земноводных. При удалении зачатка глаза линза не возникала. Зачаток глаза, пересаженный на бок зародыша, вызывал образование линзы из эктодермы, которая в норме должна была дифференцироваться в эпидермис кожи.

Гипотезу о механизме дифференцировки, получившем название эмбриональной индукции, на основании экспериментальных данных выдвинули Шпеман и Мангольд в 1924 году. Согласно этой гипотезе, существуют определенные клетки, которые действуют как организаторы на другие, подходящие для этого клетки. В условиях отсутствия клеток-организаторов такие клетки пойдут по другому пути развития, отличном от того, в котором они развивались бы в присутствии организаторов. Г. Шпеман и его сотрудница X. Мангольд открыли у зародышей амфибий «организатор». Решающий эксперимент был проведен Хильдой Мангольд в 1921 году. Она вырезала кусочек ткани из дорсальной губы бластопора гаструлы гребенчатого тритона (Triturus cristatus) со слабопигментированным зародышем, и пересадила ее в вентральную область другой гаструлы близкого вида, тритона обыкновенного (Т. vulgaris), зародыш которого характеризуется обильной пигментацией. Эта естественная разница в пигментации позволила различить в химерном зародыше ткани донора и реципиента. Клетки дорсальной губы при нормальном развитии образуют хорду и мезодермальные сомиты (миотомы). После пересадки у гаструлы-реципиента из тканей трансплантата развивалась вторая хорда и миотомы. Над ними из эктодермы реципиента возникала новая дополнительная нервная трубка. В итоге это привело к образованию осевого комплекса органов второго головастика на том же зародыше (Spemann and Mangold, 1924) (рис.1).

(А)

(В)

Рис. 1. Схема экспериментов Шпемана и Мангольд.

Однако индукция, открытая Шпеманом и Мангольд, у эмбрионов амфибий не является самой ранней в ходе эмбриогенеза. Ньюкуп (№егг\¥коор, 1973) брал у зародыша тритона клетки из крыши бластоцеля и помещал их вблизи богатых желтком вегетативных клеток дна бластоцеля, и из этих анимальных клеток развивались не производные эктодермы, а мезодермальная ткань. Поскольку в норме мезодерму образуют анимальные клетки, которые прилежат к предшественникам энтодермы, то вегетативные бластомеры оказывают влияние на прилежащие клетки, побуждая их дифференцироваться в мезодермальные ткани. Эта индукция называется ньюкуповской, а дорсальные вегетативные клетки — соответственно ньюкуповским организатором.

Изучение феномена индукции позволило сформулировать некоторые закономерности. Некоторые индукторы более или менее специфичны в определении судьбы индуцируемой ткани. Об этом свидетельствуют следующие опыты. Если пересадить спинную губу ранней гаструлы, то индуцируется развитие структур переднего мозга (головной индуктор), если же пересадить дорсальную губу поздней гаструлы, то развиваются спинной мозг и мезодермальные ткани (т.н.

И

туловищный индуктор, рис.2).

\

Оогез! 1|р

\/г

0 * О-

МшдаЛотс!

Рис.2. Результат пересадки раннего (А) и позднего (Б) организаторов.

Было показано также, что наиболее сильное нейрализующее влияние оказывает фракция нуклеопротеинов, а мезодермализующим индуктором оказался белок. Если имплантировать оба эти индуктора в виде смеси клеток или смеси веществ, то получаются хорошо развитые зародыши. Другие индукторы действуют как неспецифические пусковые механизмы, как бы высвобождая ответ, уже детерминированный в клетках индуцируемой ткани. Было показано, что, например, слуховой пузырек выступает не только в роли индуктора слухового аппарата, но и является активатором различных морфогенетических процессов. Его пересадка в область боковой линии эмбриона тритона влечет за собой индукцию конечности. Конечность можно индуцировать также пересадкой носовой плакоды или гипофиза. Легче всего добавочные конечности индуцируются в области боковой линии, но они могут быть получены и на брюшной стороне. Эти примеры указывают на то, что специфический ответ зависит не столько от индуктора, сколько от реагирующей области.

Способность эмбрионального материала реагировать на различного рода влияния изменением своей презумптивной судьбы получила название компетенции. Установлено, например, что компетенция к образованию нервной системы у амфибий затрагивает всю эмбриональную эктодерму и возникает с момента начала гаструляции. К концу гаструляции эта компетенция прекращается. Таким образом, изменение хода развития возможно лишь в том случае, если область компетенции к образованию некоторой закладки шире, чем область, из

которой она в норме развивается, а также если индукционное действие происходит в определенный интервал онтогенетического развития.

Говард Хольцер (Нокгег, 1968) выделил два основных типа тканевых взаимодействий. К первому типу относятся пермиссивные (разрешающие) взаимодействия. При этом отвечающая ткань потенциально готова к экспрессии и нуждается только в определенных условиях, которые разрешили бы экспрессию ее признаков. Большинство индукций являются пермиссивными, т.е. индуктор лишь осуществляет запуск процесса, исход которого уже предопределен свойствами самой ткани. Другой тип тканевых взаимодействий - инструктивные взаимодействия. При такого рода взаимодействиях изменяется тип отвечающей ткани. К такому типу индукции относится способность хорды индуцировать формирование будущих клеток дна нервной трубки. На сигнал со стороны хорды способны реагировать все клетки нервной трубки, но индуцируются только ближайшие к хорде. Другие будут дифференцироваться в ином направлении. Кроме того, если у зародыша удалить хорду, то клетки, дающие при нормальном развитии дно будущей нервной трубки, будут дифференцироваться по другому типу, а если зародышу имплантировать дополнительную хорду сбоку от нервной трубки, то эта новая хорда индуцирует вторичный набор клеток дна будущей нервной трубки. Поэтому хорду называют тканью, действующей инструктивно.

Кроме того, различают гетерономную и гомономную виды индукции. К гетерономной относят случаи, подобные описанному, при которых один фрагмент зародыша индуцирует иной орган (хордомезодерма индуцирует появление нервной трубки и всего зародыша в целом). Гомономная индукция заключается в том, что индуктор побуждает окружающий материал к развитию в том же направлении, что и он сам. Например, область нефротома, пересаженная другому зародышу, способствует развитию окружающего материала в сторону формирования головной почки, а прибавление в культуру фибробластов сердца маленького кусочка хряща влечет за собой процесс образования хряща.

Еще Шпеманом было показано, что инактивированные нагреванием ткани организатора сохраняют индуцирующую активность и среда из-под изолированного организатора также индуцирует эктодерму. Организатор присутствует у зародышей всех позвоночных животных. В 30-е гг. исследователи

пытались установить природу индуцирующего действия. Вскоре выяснилось, что разнообразные убитые ткани, вытяжки из самых различных тканей беспозвоночных и позвоночных животных, а также растений, несколько классов химических соединений (белки, нуклеопротеины, стероиды и даже неорганические вещества) могут вызывать индукцию. Таким образом была установлена химическая природа организаторов. Однако попытки идентифицировать молекулы индуктора оказывались безуспешными. Спустя некоторое время после экспериментов Шпемана интерес к индуктору ослаб, и природа индукционных сигналов долго оставалась неясной (Cooke et al. 1987).

Ситуация изменилась, когда в экспериментальной эмбриологии стали широко применяться молекулярно-биологические методы, позволившие выявить молекулярные события, лежащие в основе явления нейральной индукции (Hemmati-Brivanlou and Melton 1992; Hemmati-Brivanlou et al. 1994; Hemmati-Brivanlou and Melton 1994). Были описаны молекулы с прямой нейрализующей активностью, т. е. способные индуцировать образование нейральных структур в эктодерме без сопутствующего образования мезодермы. Первой такой молекулой стал белок Noggin, открытый Ричардом Харландом в 1992 г. (Smith and Harland 1992). Вскоре были открыты Chordin (Sasal et al. 1995; Piccolo et al. 1996) и Follistatin (Hemmati-Brivanlou et al. 1994; Bauer et al. 1998). Первое время эти молекулы рассматривались как непосредственные индукторы, т.е лиганды, действие которых приводит к формированию нейральной ткани. Однако эта гипотеза не могла убедительно объяснить целый ряд наблюдений, например, нейрализацию компетентной эктодермы под действием очень многих неспецифических агентов (Wilson and Hemmati-Brivanlou 1997), а также образование нервной ткани - даже без сигналов организатора - из клеток анимальной эктодермы, реаггрегировавших после диссоциации in vitro (Godsave and Slack 1989; Grunz and Tacke 1989; Slack et al. 1989). Впоследствии выяснилось, что они работают скорее как ингибиторы сигнального каскада BMP (см. ниже). Кроме того, стало понятно, что этот ингибиторный механизм нейрогенеза, по-видимому, высоко консервативен в самых разных типах Metazoa - от членистоногих до позвоночных (Ferguson and Anderson 1992; Piccolo et al. 1996). Одновременно было показано, что диссоциированная эктодерма, в норме

образующая эпидермис, в отсутствие сигналов организатора дает начало нейроэктодерме (Grunz and Tacke 1989). Эти данные говорят о том, что нейральная индукция является результатом подавления сигнального каскада TGF-ß (см. ниже). Эти выводы подтверждаются тем фактом, что экспрессия доминантно-негативных рецепторов фактора Activin приводит к нейрализации эктодермы у Xenopus (Hemmati-Brivanlou and Melton 1994).

Факторы BMP могут подавлять сигналы, индуцирующие нейрализацию и восстанавливать эпидермальные потенции диссоциированных эктодермальных эксплантатов (Wilson and Hemmati-Brivanlou 1995). Наконец, установлено, что такие факторы, как Noggin (Zimmerman et al. 1996), Chordin, Follistatin, Cerberus (Bouwmeester et al. 1996) и ХпгЗ (Xenopus nodal related 3) (Glinka et al. 1996) подавляют активность BMP в межклеточном пространстве. Все эти данные позволили сформулировать общепринятую, но до сих пор дискутируемую модель нейральной индукции по умолчанию, в которой нейральная индукция рассматривается как результат подавления BMP-сигнализации в эмбриональной эктодерме. В отсутствие межклеточных сигналов эктодермальные клетки дифференцируются в нейроэктодерму. Обобщенная схема ключевых экспериментов, подтверждающих модель по умолчанию, представлена на рис.3. Более подробно молекулярные механизмы раннего развития Xenopus будут рассмотрены в разделе 2.5.

Интактные

+ доминант-негативные рецепторы активина

Диссоциированные

ООаО0^ OD "соа о^О С?

ол^а с?

>5ч

+ BMPs

Эпидермальные

Передне-нейральные

Передне-нейральные

Эпидермальные

Рис.3. Модель нейральной индукции "по умолчанию" у Xenopus laevis. Анимальные шапочки бластулы (стадия 9) эктодермы Xenopus при изолированной культивации развиваются в эпидермис. Напротив, диссоциированные эктодермальные эксплантаты, культивируемые более 5 часов, в отсутствие экзогенных факторов нейрализуются. Аналогично, целые эксплантаты, обработанные доминантно-негативными рецепторами активина или другими BMP-сигнальными факторами, приобретают нейральные потенции. BMP может восстанавливать эпидермальные потенции в эксплантатах после диссоциации (Munoz-Sanjuan and А 2001)._

2.2 Сигнальный каскад TGF-ß

2.2.1 Суперсемейство TGF-ß

Некоторые опухолевые клетки секретируют факторы, которые при добавлении в среду позволяют фибробластам расти в суспензии, тогда как нормальные фибробласты могут расти только при условии, что они прикрепляются к твердой поверхности. Такие факторы получили название трансформирующих ростовых факторов (TGF, Transforming Growth Factors, TGF). TGF-ß (Transforming Growth Factor ß) - суперсемейство белков, контролирующих пролиферацию, клеточную дифференцировку и многие другие процессы в различных типах клеток. Свое название белок TGF-ß получил из-за своей способности к злокачественной трансформации клеток in vitro (Roberts et al. 1980). Суперсемейство TGF-бета включает более 40 различных белков, сгруппированных в несколько подсемейств. В него входят TGF-ß {sensu stricto), Activin, BMP, Inhibin, Nodal, а также другие родственные им белки, контролирующие разнообразные процессы, происходящие в течение эмбриогенеза, клеточного роста и дифференцировки тканей (Harrison, Wiater et al. 2004).

Два функционально различных TGF-ß каскада играют важнейшую роль в раннем развитии позвоночных: Activin/Nodal- каскад, который преимущественно индуцирует образование дорсальной мезодермы, и BMP-каскад, вентрализующий экто- и мезодерму. И Activin, и B-Vgl, активированная форма Vgl, могут индуцировать образование дорсальной мезодермы и эндодермы в анимальных шапочках эксплантов, а также могут способствовать образованию второй оси тела (при экспрессии на вентральной части зародыша) (Thomsen and Melton 1993). У Xenopus Nodal-подобные белки Xnrl, Xnr2, Xnr4 (от Xenopus Nodal-Related) способны дорсализовать эксплантаты маргинальной зоны (Jones et al. 1995).

Лиганды BMP вентрализуют дорсальную мезодерму и подавляют нейральную потенцию закладывающейся эктодермы. Прерывание сигнального каскада BMP на вентральной стороне зародыша путем оверэкспрессии доминантно-негативных BMP-рецепторов или BMP-связывающих белков

индуцирует возникновение вторичной оси тела и нейрализует анимальные шапочки (Faure, Lee et al. 2000). Более подробно молекулярные механизмы раннего развития Xenopus будут рассмотрены в разделе 2.5.

Все лиганды TGF-ß синтезируются первоначально как предшественники, состоящие из N-концевого пропептида и С-концевого зрелого пептида (ten Dijke and Arthur 2007). При этом дисульфидные межмолекулярные сшивки есть как на про-пептиде, так и на зрелом пептиде. В процессе секреции в экзоцитозных гранулах предшественник разрезается на зрелый пептид и пропептид, который с этих пор называется Latency-Associated Peptide (LAP). LAP остается нековалентно связан со зрелым пептидом, участвуя в его фолдинге во время экзоцитоза. Также LAP участвует в аккумулировании лигандов TGF-ß на межклеточном матриксе через ковалентную связь с LTBP (Latent TGF-ß Binding Protein) и белками межклеточного матрикса. Освобождение лиганда из этого многокомпонентного комплекса осуществляется рядом протеаз, включая эластазу, BMPl/Tolloid протеазы (они разрезают LTBP) и матриксные металлопротеазы, такие как ММР2 (разрезают LAP) (ten Dijke and Arthur 2007).

Функция LAP как временного ингибитора лиганда не характерна для целого ряда представителей семейства. Пропептиды Nodal, BMP-4 и -7 регулируют стабильность лиганда и его процессинг, включая деградацию в лизосомах (Degnin et al. 2004; Le Good et al. 2005).

Связывание лиганда рецептором приводит к фосфорилированию серин/треониновой киназой рецептора внутриклеточных белков-посредников. Генетические исследования, проведенные на С. elegans и Drosophila позволили идентифицировать эти медиаторы, которые были названы sma и Mothers against dpp (Mad). Позже эти многочисленные белки были объединены в общее семейство Smad. (Derynck, Zhang et al. 1998)

У млекопитающих обнаружено 8 Smad, которые на основании структуры и функций разделяются на три группы:

1. Receptor-regulated Smads (R-Smads) связываются с серин/треониновой киназой рецепторов типа I и активируются фосфорилированием. Так, Smadl, -5, и -8 опосредуют сигнальный каскад BMP, a Smad2 и -3 опосредуют сигнальный каскад Activin/Nodal/TGF-ß.

2. Co-SmacTы (Smad4) связываются с R-Smad'aMH, и всоставе гетеромерных комплексов перемещаются в ядро, где взаимодействуют с другими транскрипционными факторами и регулируют транскрипцию генов-мишеней.

3. Наконец, Smad6 и Smad7 взаимодействуют с R-Smad и Co-Smad и называются inhibitory Smads (I-Smads).

Кроме Smad-регулируемого управления каскадом, возможны и другие пути влияния на сигнал от рецепторов - например, МАР-киназа, активируемая BMP и TGF-P в определенных клеточных типах (Mulder 2000; Faure, Lee et al. 2000).

Итак, Smadl, Smad5 и Smad8 специфически осуществляют передачу BMP сигнала, в то время как Smad2 и Smad3 опосредуют Activin- и TGF-P сигналы. В ответ на стимуляцию лигандом рецептор за счет киназной активности фосфорилирует Smad по одному из двух последних сериновых остатков, что необходимо для трансдукции TGF-|3 сигнала (Macias-Silva, Hoodless et al. 1998). Smad2 регулирует (с помощью ДНК-связывающих белков FAST-1, HNF, р53 и пр.) экспрессию дорсальных и мезодермальныйх генов (Chen et al. 1997). Как Smads 1, 5 и 8 регулируют специфические транскрипционные изменения, характерные для индукции вентральной мезодермы, не вполне ясно (Faure et al. 2000).

Далее каскады Activin и BMP будут рассмотрены по отдельности.

2.2.2. Каскад Activin/Nodal

Мономер белков TGF-ß состоит из 110-140 а.о. и имеет компактную структуру из четырех антипараллельных ß-складчатых слоев и трех стабильных дисульфидных связей. Эти связи формируют так называемый цистиновый узел, относительно устойчивый к денатурации. Дополнительный N-концевой цистеин вкаждом мономере соединяет мономеры TGF-ß в гомо- и гетеродимеры. Прототипические изоформы белков TGF-ß (TGF- ßl, ß2 и ß3), а также группа белков Ingibin-ß, включающая активин и ингибин, имеют 9 консервативных цистеиновых связей, 8 из которых образуют внутримолекулярные сшивки, а одна — межмолекулярный цистеиновый мостик. Ingibin-alpha, BMP и GDF имеют 7 подобных оснований, где 6 образуют цистиновый узелок, а одна — межрмолекулярный мост. Можно также выделить lefty, GDF3, GDF9 и BMP 15А, которые имеют по 6 цистеиновых оснований: они не образуют ковалентных димеров, что позволяет, например, белку lefty образовывать нековалентные комплексы с Nodal и Cripto, ингибируя Nodal-сигнализацию (Chen and Shen 2004). Образование димеров играет большую роль в регуляции действия белков TGF-ß засчет образования разнообразных гетеродимеров, которые могут функционально довольно сильно отличаться от соответствующих гомодимеров (Kahlem and Newfeld 2009).

Белок Activin является димером и представлен изоформами А и В (см. рис.4). Он секретируется в виде неактивного пробелка, который затем путем ограниченного протеолиза активируется во внеклеточном пространстве субтилизин-подобными пробелок-конвертазами (Bassi et al. 2005; Antenos et al. 2008). При этом освобождается зрелая, С-концевая часть белка. Сигнальный каскад Activin активируется связыванием этого лиганда с двумя типами трансмембранных рецепторов с серин/треонин киназной активностью: типа II (ActRII и ActRIIB) и типа I (Activin receptor-Like Kinase 4 (ALK4) и пр.). ActRII/IIB и ALK4 -трансмембранные белки, внеклеточные домены которых обладают лиганд-связывающей активностью, а внутриклеточные домены - серин/треонин-киназной активностью (Chen et al. 2002). Рецепторы Activin типа II являются основными

Activin-связывающими белками, и им присуща высокая аффинность связывания Activin при отсутствии рецепторов типа I (Mathews and Vale 1991).

Class Complex Dinier subunits

1 2

Inhibin Inhibin A Inhibin В a Pa a Рб

Activin A Pa Pa

Activin Activin AB Pa Pb

Activin В Рб Рб

Inhibin A

X

Inhibin В

Activin А

Pa

a

Pa С

Activin AB

□ « 3 Рв

С

□ Pa

□ Pe

Activin В

' . ' Po

J Рв

I

Схематическая диаграмма одномерной структуры Inhibin и Activin. Черной линией обозначены дисульфидные связи.

|Рис.4. субъедиинчный состав белков Activin и inhibin.

Рецепторы Activin типа I (ALK.4) не способны связывать Activin в отсутствие рецепторов типа II. В рецеиторном комплексе активированная киназа рецептора типа II фосфорилирует ALK4 по регуляторному GS домену (глицин- и серин-богатый сегмент па проксимальной мембранной стороне киназного домена), и это фосфорилированис приводит к активации киназы ALK4 (Attisano et al. 1996).

Активированный ALK4 связывается и затем фосфорилирует группу цитоплазматических белков Smad (Smad2/3), которые являются частью системы гранедукции пост-рецепторного сигнала (см. выше) (Derynck et al. 1998). Рецепторы II типа представляют собой основные лиганд-связывающие рецепторы, а комплексы лиганд/тии IIR способствуют взаимодействию с типом I. I тип рецепторов фосфорилируется и активируется киназой рецептора типа И. Регуляция каскада обычно осуществляется с помощью Smad-белков, но существует также Smad-независимый путь, осуществляемый при участии МАРК, который также активируется через рецепторы Activin.

Smad2/3-зависимый каскад может активироваться, помимо белков Activin и TGF-ß, целым рядом лигандов, экспрессирующихся как в ходе эмбрионального развития, так и тканях взрослого организма. Это такие белки, как Derriere, GDF3/8/11, Myostatin, Nodal, Vgl и др. У млекопитающих найден единственный представитель гена Nodcü, а у Xenopus идентифицировано 6 гомологов - Xnrl-Хпгб. Хпг5 и Хпгб экспрессируются на стадии бластулы, а Xnrl, Xnr2 и Хпг4 - во время гаструляции. ХпгЗ, несмотря на высокую в целом степень гомологии с

другими Nodal-подобными белками, обладает принципиально иными свойствами. Отстутствие седьмого консервативного остатка цистеина в N-концевом регионе, а также некоторые другие особенности строения ХпгЗ делают его неспособным активировать Smad2/3-3aBHCHMbm каскад. Вместо этого он является ингибитором BMP, и, предположительно, активирует конвергентное растяжение, действуя на рецептор FGF (Yokota et al. 2003; Haramoto et al. 2004; Haramoto et al. 2006).

Такие белки, как glial cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF), persephin (PSPN), neurturin (NRTN) и artemin (ARTN), относящиеся супсрсемейству TGF-f3, играют важную роль в функционировании головного мозга и в некоторых биологических процессах. Однако они действуют через принципиально другие рецепторы; при этом для активации требуется участие TGF-p (Ernsberger 2008).

Общий принцип работы TGF-P каскада привдена на рис.5.

Tolloid

Noggin Chordin Follistatin CAN family

cell

membrane

^Smad6/7¡

Smad4 J ^ [ Smad4 )

(smurf) j,

1

Target genes

Target genes

Рис.5. Схема каскада TGF-p. Связывание лиганда приводит к активации ссрин/треоиии киназных рецепторов, которые, при участии белков SARA фосфорилируют внутриклеточные белки-посредники Smad - Smadl/5 для BMP каскада и и Smad 2/3 для Activin/Nodal каскада. Белки Smad в комплексе со Smad4 транслоцируются в ядро, где активируют экспрессию генов-мишеней._

2.2.3. Внеклеточная регуляция Activin-каскада

Активин-зависимый каскад может регулироваться на каждом этапе трансдукции сигнала. Один из наиболее распространеных и значимых способов, в т.ч. и в эмбриогенезе - модуляция связывания лигандов с рецепторами во внеклеточном пространстве. Follistatin, пропептид Myostatin и эктодомен рецептора препятствует действию Activin, как и ряд других факторов.

Follistatin (FST) - растворимый внеклеточный белок, высокоаффинно связывающий Activin и блокирующий его способность связываться с рецептором и инициировать каскад (Welt et al. 2002). Follistatin является цистеин-богатым белком, не гомологичным факторам семейства TGF-p. Структурные исследования выявили, что две молекулы Follistatin окружают Activin и закрывают две трети а.о., участвующих в связывании с рецепторами II и I типа (Harrington et al. 2006). Follistatin связывает и ингибирует не только Activin, но также BMP, myostatin и GDF11 (Iemura et al. 1998; Hill et al. 2002). Интересно, что Follistatin дрозофилы связывает не BMP, а только Activin лиганды (Pentek et al. 2009). Мыши, нокаутные по гену Follistatin, демонстрируют аномалии опорно-двигательного аппарата, отражающие некорректную регуляцию Activin, myostatin и GDF11 (Matzuk et al. 1995). Follistatin-родственный ген (FLRG, FoLlistatin-Related Gene,) связывает такой же репертуар белков, как и Follistatin, но содержит два фоллистатиновых домена, тогда как сам Follistatin содержит три таких домена. Несмотря на функциональную вырожденность, транскрипция Follistatin и FLRG регулируется по-разному (Tsuchida et al. 2000).

Inhibirf ы, которые объединяет с Activin наличие (3-субъединицы (см. рис.4), также являются членами суперсемейства TGF-p; они взаимодйствуют с бетагликаном, в комплексе с которым связывается с рецепторами Activin типа II, тем самым блокируя доступ Activin к сигнальному комплексу (Lewis et al. 2000). Псевдо-рецептор BAMBI (BMP and Activin membrane-bound inhibitor) также может связывать Activin (и BMP) с образованием нефункциональных комплексов с рецептором типа II, тем самым блокируя передачу сигнала, действуя как природный аналог трункированного рецептора (Onichtchouk et al. 1999).

Cerberus является секретируемым белком, экспрессирующимся в передней энтодерме. Его примечательным свойством является способность индуцировать в эмбрионах Xenopus эктопические головы без формирования туловищных структур (Bouwmeester et al. 1996). Открытие Cerberus обнаружило самый ранний энтодермальный индуктивный сигнал, определяющий развитие головы. Впоследствие важная роль антериорной висцеральной энтодермы была подтверждена на модели эмбрионов мыши (Beddington and Robertson 1999). Cerberus связывает и ингибирует белки Nodal, BMP и Wnt-8 (Piccolo et al. 1999). C-концевой фрагмент (т.н. Cerberus-short, Cer-S), несущий цистиновый узел, связывает и ингибирует только белки семейства Nodal (Xnr). Это свойство делает такую искусственную конструкцию удобным инструментом для изучения Nodal-каскада. Например, при помощи Cer-S было выяснено, что индукция дорсальной и вентральной мезодермы осуществляется посредством градиента белков Xnr, секретируемых энтодермой (Agius et al. 2000). У Xenopus Cerberus необходим для индукции головы - анти-Cer-MO блокируют ее развитие (Kuroda et al. 2004). У мышей, нокаутных по Cerberus, не наблюдаются ранних изменений фенотипа, как и в случает нокаута по гену другого белка-ингибитора Nodal-каскада, Lefty-J, который также экспрессируется в антериорной висцеральной энтодерме (Meno et al. 1997). Однако, у двойных мутантов сег-1-/-; lefty-1Ч- развитие передней части эмбриона было сильно нарушено из-за избыточной активности Nodal-каскада (Perea-Gomez et al. 2002; Yamamoto et al. 2004). В куриных эмбрионах гомолог Cerberus экспрессируется в гипобласте (эквивалент антериорной висцеральной энтодермы мыши) и предотвращает формирование туловищных структур в области проспективной головной нейроэктодермы посредством ингибирования Nodal-каскада (Bertocchini and Stern 2002).

Также стоит упомянуть GPI-заякоренный мембранный белок Cripto, который может выступать в роли антагониста Activin, связываясь с ActRII и блокируя доступность ALK4. Cripto - член семейства белков EGF-CFC (от Epidermal Growth Factor и Cripto, Frl-1 and Cryptic domain). Семейство EGF-CFC состоит из GPI-заякоренных белков и включает человеческий и мышиный Cripto и Cryptic, Xenopus FRL-1 и one-eyed pinhead (oep) Danio (Shen and Schier 2000). Генетические исследования рыбы Danio и мыши показали, что белки EGF-CFC необходимы для

формирования мезодермы и эндодермы, кардиогенеза и установления право-левой ассиметрии во время развития эмбриона. Нокаутные по Cripto эмбрионы мыши не формируют эмбриональную мезодерму (Shen and Schier 2000).

Подобно Activin, члены семейства Nodal и GDF-1/Vgl способны активировать сигнал через рецепторы Activin ActRII/IIB и ALK4. Однако, в отличие от Activin, этим лигандам суперсемейства TGF-ß требуются Cripto или родственные белки EGF-CFC для образования комплексов с рецепторами типа II и типа I и активации сигнального каскада. Было показано, что Cripto связывает Nodal через свой EGF-подобный домен, a ALK4 - через свой CFC домен. Также было показано, что Cripto может формировать комплекс с Activin и ActRII/IIB.

Чтобы показать, что Cripto препятствует связыванию Activin и ALK4 и объединению ALK4 и ActRII/IIB, был использован метод ковалентного перекрёстного сшивания. Посредством нарушения взаимодействия Activin и ALK4, Cripto, видимо, предотвращает фосфорилирование ALK4 киназой ActRII/IIB и блокирует последующий сигнальный каскад (Shen and Schier 2000).

2.2.4. Рецепторы Activin

Сигналы Activin передаются через два типа рецепторов трансмембранной серин/треонин-киназных рецепторов, рецепторов Activin типа I и типа II в клетках-мишенях (Tsuchida et al. 2008). Интересно то, что с рецепторами Activin могут также взаимодействовать другие белки семейства TGF-ß, такие как Myostatin, фактор роста и дифференцировки 11 (GDF11) и Nodal. Myostatin является цитокином скелетных мышц и регулирует их массу. GDF11 структурно подобен Myostatiny и вовлечен в нейрогенез в спинном мозге и обонятельной луковице. Также GDF11 регулирует развитие почки и эндокринной системы поджелудочной железы. Nodal играет важную роль в разметке эмбриона на ранних этапах во время индукции мезодермы и эндодермы (Tsuchida et al. 2009).

Рецептор типа II Activin A ACVR2 или ActRIIA является трансмембранной серин/треониновой киназой. Также был открыт и второй рецептор типа II Activin ACVR2B или ActRIIB. Подобно рецепторам типа II, рецепторы типа I обладают серин/треонин киназным доменом. Однако, в отличие от рецепторов типа II,

рецепторы типа I имеют уникальный GS-домен вблизи внутриклеточных околомембранных областей. Аминокислотная последовательность петли L45 рецепторов типа I, расположенная между киназными субдоменами IV и V, отвечает за специфичность взаимодействия с белками Smad, что определяет специфичность подгруппы Activin/TGF-ß (ALK4, 5, 7), и отличает ее от BMP-подгруппы (ALK1, 2, 3, 6) (Feng and Derynck 2005). ALK4 известен как рецептор типа IB Activin ACVR1B или ActRIB, тогда как ALK7 известен как рецептор Activin типа I ACVR1C. ALK4 и ALK7 являются рецепторами типа I для Activin и Nodal, a ALK4 и ALK5 являются рецепторами для Myostatin и GDF11 (Тsuchida et al. 2008). Когда Activin связываются с ActRIIA или ActRIIB, рецепторы типа I связываются с комплексом лиганд/ActRII, и GS-домены рецепторов типа I фосфорилируются киназами ActRII. Activin/TGF-ß-специфичные Smad (Smad2 и Smad3) фосфорилируются активированными рецепторами типа I. В случае Nodal для полной активации необходимы ко-рецептор Cripto и соответствующие факторы (Shen 2007). Cripto способствует сигнализации Nodal посредством образования комплекса с Nodal и с рецептором Activin. Интересно, что Cripto при избыточной экспрессии может также действовать как фактор, подавляющий действие Activin (Gray et al. 2003).

2.2.5. Регуляция рецепторов Activin

Рецепторы Activin взаимодействуют также с факторами SARA (Smad Anchor for Receptor Activation) - белками, содержащий домен FYVE, взаимодействующими как с рецепторами типа I, так и со Smad2/3.

Формирование комплекса из рецепторов Activin, SARA и Smad является важным событием для сигнального каскада Activin/TGF-ß. Рецепторы типа II Activin (ActRIIA и ActRIIB) несут аминокислотную последовательность, взаимодействующую с С-концом белка PSD-95/Discs-large /ZO-1 (PDZ) (Тsuchida et al. 2008). Это свойство является уникальным для рецепторов семейства TGF-ß. ARIP - белки, взаимодействующие с рецепторами Activin (ARIPs = Activin-Receptor Interacting Proteins), у которых есть домены PDZ. Они связываются с С-концом ActRII и регулируют сигнальный каскад Activin. ARIP1 несет несколько

доменов WW и PDZ, осуществляющих белок-белковые взаимодействия и регулирует локализацию рецепторов Activin, негативно регулируя каскад (Shoji et al. 2000). ARIP-1 необходим для активации рецептора Ы-метил-О-аспартата (NMDA) в нейронах гиппокампа и известен также как синаптический структурный белок, S-SCAM (Iida et al. 2007). Последние исследования показали, что Activin индуцирует продолжительную активацию рецептора NMDA посредством ARIP1 в парагиппокампальных нейронах (Kurisaki et al. 2008). ARIP2 - это маленький белок, который несет один домен PDZ. Имеется несколько изоформ сплайсинга ARIP2 и, в зависимости от изформы, ARIP2 либо усиливает, либо подавляет действие Activin (Liu et al. 2006). Методом gene trapping был идентифицирован RasGAP-связывающий белок Dok-1, который действует как адаптерная молекула при Activin-индуцированном апоптозе B-клеток. Dok-1 взаимодействует одновременно с рецепторами Activin и Smad. Стимулирование Activin индуцирует взаимодействие между Dok-1 и Smad3 (Yamakawa et al. 2002).

Трансмембранный белок TMEPAI (TransMembrane Prostate Androgen-Induced, также известный как PMEPA1, STAG1, ERG 1.2 и N4wbp4), является внутриклеточным негативным регулятором TGF-ß каскада. TMEPAI блокирует фосфорилирование белков R-Smad активированным рецептором. Он физически взаимодействует с R-Smad, конкурируя за их связывание с SARA. Оверэкспрессия TMEPAI в культуре клеток ингибирует TGF-ß-индуцированную экспрессию ингибитора активатора плазминогена 1, c-myc, JunB и ингибиторов циклин-зависимых киназ; оверэкспрессия TMEPAI в ранних эмбрионах Xenopus блокирует формирование мезодермы (Watanabe et al. 2010) (рис.6).

Рис.6. Схема ингибирования каскада белком ТМЕРА1. Внутриклеточный домен

ТМЕРА1 связывается с белками Я-Бшас!, предотвращая их фосфорилирование активированным рецепторным комплексом.

2.2.6. Регуляция сигнального каскада Activin через белки Smad

Сигнальный каскад Srnad2/3 в цитоплазме и ядре строго контролируется. Smad2/3 содержат N-концсвой ДНК-связывающий МШ домен и С-концевой рецепторно-регулируемый МН2 домен (МН - от Mad Homology). В нефосфорилированном состоянии МН1 и МН2 связываются друг с другом внутримолекулярным образом и взаимно иигибиругот соответствующие функции. L45 петли рецепторов типа I непосредственно взаимодействует с доменом МН2 рецепторно-регулируемого Smad (R-Smad) и определяет специфичность в отношении Smad. Рецепторы типа I фосфорилируют Smad по двум С-концевым сериновым остаткам. R-Smad, Co-Smad и I-Smad постоянно перемещаются между цитоплазмой и ядром; фосфорилирование R-Smad, за счет конформационных изменений белка, нарушает взаимодействие МН1 и МН2, что позволяет связаться с Co-Smad. Кроме того, фосфорилирование обнажает аминокислоты сигнала ядерной локализации (NLS, от Nuclear Localization Signal), что запускает механизм ядерного аккумулирования димера R-Smad и Co-Smad.

Модуляция сигнального каскада Activin может осуществляться на уровне белков Smad. Так, РРМ1А может действовать как С-концевая фосфатаза Smad (Lin et al. 2006). Области линкера между доменами МН1 и МН2 Smad фосфорилируются посредством МАР-киназы (МАРК). Это фосфорилирование усиливает связывание Smad убиквитин-лигазой, что приводит к его убиквитинилированию и деградации (Nakano et al. 2009).

Убиквитинилирование с последующим расщеплением в протеасоме регулирует сигнал от Activin/TGF-p. Убиквитин-лигазы ЕЗ типа НЕСТ - Smad-убиквитин регуляторный фактор 1 (Smurfl) и Smurf2 - вовлечены в деградацию Smad. Smurfl и Smurf2 связываются с рецепторами семейства TGF-p через ингибирующие Smad (Smad6 и Smad7), индуцируя их убиквитин-зависимую деградацию (Tsuchida et al. 2009).

2.2.7. Гены-мишени Smad2 каскада

Белки Smad обладают ДНК-связывающей активностью за счет МН1 домена. Однако для полной активации генов-мишеней Smad связывается с набором ДНК-связывающих кофакторов, таких как СВР/р300, TGIF, c-Ski и Evi-1 (Massague and Gomis 2006). Это взаимодействие определяет транскрипцию, типоспецифическую для клетки, и демонстрирует сложность сигнального каскада Activin/TGF-p. Ряд транскрипционных факторов, включая белки р53, FAST-1, forkhead, отдельные представители семейства bHLH, семейства API, некоторые гомеодоменные белки и ядерные рецепторы, действуют как Smad-взаимодействующие транскрипционные факторы. Будучи активированы, комплексы Smad используют набор дополнительных транскрипционных активаторов или репрессоров для регулирования генов-мишеней. Негативная регуляция по принципу обратной связи посредством ингибиторных Smad, Smad6 и Smad7, является важной отключающей системой для сигнального каскада Activin и TGF-P в целом (Massague and Gomis 2006).

Репертуар генов-мишеней Activin/Nodal/TGF-P каскада (и, соответственно, регулируемые им процессы) обширен и зависит от дополнительных факторов. В качестве примеров непосредственных генов-мишеней Smad2-каскада,

участвующих в эмбриональном развитии, можно привести такие гены, как Brachyury, Casanova (Sox 17), FoxA2 (Hnf3(3), GATA6, Goosecoid, Frizzled 8b, Lefty, Pitx и др. (Dickmeis et al. 2001; Saka and Smith 2007; Guzman-Ayala et al. 2009). Гены-мишени, регулирующие пролиферацию клеток, отдельно рассмотрены ниже.

2.2.8. Smad-независимый сигнальный путь Activin и перекрестное действие рецепторов

В дополнение к каноническому пути Smad, существует также Smad-независимый сигнальный каскад Activin. Например, Activin негативно регулирует гипофизарный транскрипционный фактор Pit-1 через р38 МАРК-зависимый Smad-независимый путь (de Guise et al. 2006). Независимо от Smad4, ActRIB/Smad2 действует как активатор канонического пути сигнального каскада Wnt. После активации Smad2 взаимодействует с Tcf4, (3-Catenin и коактиватором рЗОО, усиливая транскрипционную активность p-Catenin/Tcf4 за счет активности гистон-ацетилтрансферазы рЗОО. В данном случае активация транскрипции посредством Smad2 не зависит от Smad-связывающего цис-элемента на ДНК (Hirota et al. 2008). Таким образом, сигнальный Smad-независимый путь Activin и перекрестное действие рецепторов повышают сложность сигнального каскада Activin/TGF-p.

2.2.9. Роль Activin и TGF-B в канцерогенезе.

Роль TGF-P (в широком смысле) в канцерогенезе огромна, поэтому полное и систематическое описание современного состояния вопроса выходит далеко за рамки настоящего литературного обзора (и в качественном, и в количественном смысле). Однако ввиду важности необходимо отметить основные свойства TGF-p и Activin в отношении раковых клеток.

Несмотря способность TGF-0 к злокачественной трансформации клеток, вскоре после его открытия была обнаружена его антипролиферативная активность (Roberts et al. 1985). Дальнейшие исследования выявили двоякую роль TGF-(3 как в регуляции пролиферации, так и во многих других биологических процессах, таких как эмбриональное развитие и поддержание тканевого гомеостаза взрослого

организма. Действие TGF-ß кардинальным образом зависит от типа клеток и/или стадии развития. Подавление роста раковых клеток является одним из биологических эффектов Activin на ранних стадиях развития опухоли. Активация каскада Activin (через подавление Crypto) блокирует рост клеток рака груди (Adkins et al. 2003). Мутации у различных участников сигнального каскада, приводящие к потере функции, обнаружены в различных видах раковых клеток человека. Например, соматические мутации в гене ACVR1B были обнаружены в опухолях поджелудочной железы, а мутации Smad4 были обнаружены в опухолях прямой кишки и поджелудочной железы (Hahn et al. 1996). Все известные мутации, однако, затрагивают рецепторы и Smad. Для раковых клеток характерна оверпродукция и оверсекреция TGF-ß лигандов.

Антиканцерогенная активность TGF-ß связана с его антипролиферативным и апоптогенным действием. Активация соответствующего каскада приводит к аресту клеточного цикла в Gl фазе. Активация каскада приводит к транскрипционной репрессии с-Мус (Pietenpol et al. 1990) и к гипофосфорилированному состоянию pRb (белок ретинобластомы) (Laiho et al. 1990). Данным каскадом непосредственно регулируются некоторые участники клеточного цикла. Так, каскад TGF-ß/Activin активирует транскрипцию ингибиторов клеточного цикла семейств Ink4 и Kip/Cip. В эпителиальных клетках непосредствеными транскрипционными мишенями являются pl5Ink4B (Hannon and Beach 1994) и p21Cipl (Datto et al. 1995), а в гематопоэтических клетках - p57Kip2 (Scandura et al. 2004). Кроме того, как недавно было показано, Nodal стимулирует экспрессию антипролиферационного циклина G2 (CCNG2). При этом активированный Smad2 формирует комплекс с транскрипционным фактором Fox03a на промоторе CCNG2 (Fu and Peng 2011).

Апоптогенное действие TGF-ß опосредуется такими его непосредственными генами-мишенями, как TIEG1 (TGF-ß-inducible early response gene-1), сигнальный фактор GADD45ß, Bim (Bcl-2 homology domain-only factor), DAPK (the death-associated protein kinas) и фосфолипид-фосфатаза SHIP. Эти гены являются проапоптотическими и так или иначе активируют каспазо-зависимую гибель клетки. Кроме того, TGF-ß каскад выполняет проапоптотическую функцию посредством белка Daxx (адаптор Fas-рецептора), который напрямую связывается с

TpRII и вызывает активацию JNK (c-Jun N-terminal kinase) при стимуляции TGF-(3 (Perlman et al. 2001).

Если на ранних стадиях канцерогенеза TGF-p действует как опухолевый супрессор, то на поздних стадиях его действие связано с увеличением инвазивности раковых клеток и их способности к метастазированию. Долгое время было загадкой, почему опухолевые клетки активно продуцируют биоактивный TGF-P, который является ингибитором роста. В искусственных моделях активация (или обработка клеток) на поздних стадиях канцерогенеза TGF-J3 резко усиливает способность к метастазированию, а обработка антителами к TGF-J3 эту способность подавляет (Chang et al. 1993). Исследования роли TGF-P выяснили, что его онкогенное действие связано как с самими раковыми клетками, так и с окружающим их внеклеточным матриксом, клетками окружающей опухоль стромы, включая фибробласты и иммунные клетки, и, наконец, с клетками кровеносных сосудов.

Одним из ключевых событий при метастазировании является эпителиально-мезенхимальный переход. TGF-P-индуцированный эпителиально-мезенхимальный переход сопровождается снижением уровня экспрессии таких генов как специфические кератины, Е-кадгерин и ZO-1, и повышением уровня мезенхимальных маркеров - фибронектина, Fspl, виментина и гладкомышечного а-актина. Интересно, что активация BMP-каскада не вызывает эпителиально-мезенхимальный переход; более того, BMP может индуцировать обратный процесс (мезенхимально-эпителиальный переход) в фиброзных клетах почки и в клетках, претерпевших эпителиально-мезенхимальный переход (Zeisberg et al. 2005). BMP действует антагонистически по отношению к TGF-P (Saika et al. 2006).

TGF-P индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход на транскрипционном уровне. Генами-мишенями TGF-P-каскада, помимо прочих, являются транскрипционные факторы Id2 и Id3. BMP-специфические Smad активируют транскрипцию Id2 и Id3 в эпителиальных клетках, тогда как Activin/TGF-P-специфические Smad ее подавляют. Продолжительная репрессия Id2 и Id3 приводит к подавлению экспрессии Е-кадгерина и ZO-1 и вызывает эпителиально-мезенхимальный переход (Kowanetz et al. 2004). Репрессия Id2 освобождает Е12/Е47 bHLH факторы, так что они связываются с промотором Е-

кадгерина и подавляют его экспрессию (Kondo et al. 2004). Помимо генов Id2 и Id3, TGF-ß-индуцированный эпителиально-мезенхимальный переход опосредуется такими генами как Snail, Slug (транскрипционные факторы типа цинковых пальцев), ZEB1, ZEB2 (гомеодомен и цинковые пальцы), Е12/Е47, Twist (bHLH белки) и LEF-1 (HMG-содержащие белки) (Peinado et al. 2004). Сходный набор транскрипционных факторов участвует в образовании нервного гребня в эмбриогенезе позвоночных (Aybar et al. 2003), что является вариантом эпителиально-мезенхимального перехода. Другим примером эпителиально-мезенхимального перехода в нормальном эмбриогенезе является образование колбовидных клеток под действием Activin/Nodal сигналов в ходе гаструляции (см. ниже).

TGF-ß усиливает инвазивность раковых клеток, индуцируя транскрипцию NET1 (фактор нуклеотидного обмена, guanine exchange factor), что активирует Rho-ГТФазу и приводит к реорганизации цитоскелета и увеличению клеточной подвижности (Shen et al. 2001). Кроме того, TGF-ß индуцирует экспрессию некоторых тропомиозинвых генов Smad- и р38 МАРК-зависимым образом, что также приводит к увеличению клеточной подвижности (за счет увеличения сократимости цитоскелета) и, соответственно, к усилению инвазивности (Bakin et al. 2004).

TGF-ß способен индуцировать ангиогенез (при раке простаты и в некоторых других опухолях) за счет активации экспрессии VEGF (васкулярного эндотелиального ростового фактора), основного индуктора ангиогенеза (Benckert et al. 2003). Однако, действие TGF-ß и Activin на ангиогенез носит двоякий характер. В некоторых раковых клетках (при раке желчного пузыря, гепатомы, кожной карциномы и др.) TGF-ß и Activin вызывают транскрипционную репрессию VEGF и активируют экспрессию антиангиогенного белка TSP1 (Тромбоспондин-1) (Schwarte-Waldhoff et al. 2000).

Несмотря на то, что роль в канцерогенезе факторов BMP не столь обширна, как TGF-ß и Activin, белки этого семейства также принимают участие в формировании и прогрессии некоторых опухолей. Высокий уровень секретируемых BMP отмечен для многих агрессивных опухолей кости и карцином пищевода. Уровень секретируемых BMP коррелирует при этом со степенью

злокачественности (Laitinen et al. 1997; Raida et al. 1999). Секреция BMP-6 клетками карциномы простаты определяет инвазивность при метастазировании. Высокий уровень секреции ВМР-7 клетками аденокарциномы простаты обеспечивает инвазивность и защиту от апоптоза (Yang et al. 2005). ВМР-2 в большом количестве продуцируется клетками карциномы легких; при этом он стимулирует рост опухоли путем активации Smadl/5 и его гена-мишени Id 1 (Langenfeld et al. 2006). Таким образом, детекция различных белков суперсемейства TGF-ß в опухолевых тканях сможет помочь прогнозировать ход болезни на продвинутых ее стадиях.

2.2.10. Activin и стволовые клетки

Работы по культивированию и дифференцировке стволовых клеток являются важной и плодотворной областью современной экспериментальной биологии. Накоплено немало важных результатов, поэтому их описание в рамках настоящего литературного обзора невозможно. Тем не менее, будет уместным изложить данные, полученные на эмбрионах шпорцевой лягушки - не основной модели для подобного рода исследований, но имеющей непосредственное отношение к настоящей работе (в том числе и в методологическом плане).

Наиболее значимые результаты были получены в ходе изучения клеток недифференцированной анимальной эктодермы эмбрионов Xenopus, т.н. анимальных шапочек (animal caps). Анимальные шапочки часто используются для тестирования нейрализующего и мезодерма-индуцирующих свойств различных белков (т.н. animal cap assay). Комбинация воздействий различных факторов позволяет получить из них широкий спектр тканей.

Интересно, что ActivinA способен трансформировать ткань анимальных шапочек не только в ткани мезодермального типа, как это можно было бы предположить, исходя из его природной роли, но и в некоторые эндо- и эктодермальные производные в зависимости от концентраций ActivinA (Okabayashi and Asashima 2003; Asashima et al. 2008). Как было показано, дозозависимый эффект при этом опосредуется абсолютным числом лиганд-связанных рецепторов, а не соотношением связанных и свободных рецепторов (Dyson and Gurdon 1998).

Когда анимальные шапочки обрабатывались ActivinA в концентрации 0.5-1.0 нг/мл, то они дифференцировались в клетки вентральной мезодермы, включая мезенхимальные и гематопоэтические. Обработка ActivinA в концентрации 5-10 нг/мл приводила к возникновению мышечных клеток, а в концентрации 50-100 нг/мл - к индукции хорды. Дозы ActivinA, превышающие 100 нг/мл, приводили к дифференцировке анимальных шапочек в эндодермальные клетки (Okabayashi and Asashima 2003; Asashima et al. 2008).

Комбинация воздействия ActivinA с другими веществами значительно расширяет спектр тканей, получаемых из анимальных шапочек. Так, сочетание действия ActivinA в концентрации 100 нг/мл с ретиноевой кислотой приводило к индукции клеток пронефроса (Moriya et al. 1993). Функциональность полученной таким образом ткани была подтверждена имплантацией в развивающиеся эмбрионы (Chan et al. 1999). Временная задержка при обработке ретиноевой кислотой в подобных экспериментах приводила к возникновению не почечной ткани, а ткани пожелудочной железы (Moriya et al. 2000). Диссоциация клеток с последующей аггрегацией в сочетании с воздействием 100 нг/мл ActivinA приводила к возникновению сердечных структур, в которых были зафиксированы характерные пульсации. Пересадка такой ткани в эмбрионы с удаленным сердечным зачатком приводила к развитию нормальных взрослых животных (Ariizumi et al. 2003). Использование т.н. "сэндвичей" из анимальной шапочки и вентральной краевой зоны приводило к возникновению глазных структур, включая хрусталик и сетчатку (Sedohara et al. 2003). Общая схема описываемых экспериментов приведена на рис.7.

atypical normal epidermis treatment

additional treatment

blood island

muscle

endodermal cells

ActivinA (ng/ml)

(D&R +Sd)

pancreas]

Retinoic Acid

(M)

(time-lag)

Рис.7. Схема экспериментов по полунению различных тканей из анимальиых шапочек Хепория под действием АсПуш в т.ч. в комбинации с некоторыми другими факторами. (АзазЫшас^ЛООВ)^_

Подходы, разработанные на модели анимальиых шапочек Хепирт, оказались полезными при индукции различных типов клеток и тканей из эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, см. обзор (АяаБЬптш е1 а1. 2008).

2.2.11. Каскад BMP

Белки BMP, как и Activin, синтезируются в виде белков-предшественников. Секретированные димеры BMP активируют сигнальный каскад, связываясь с серин/треонин-киназными рецепторами I и II типа (см. рис.3). Рецепторы типа II после связывания с лигандом фосфорилируют рецепторы типа I. Рецепторы типа I активируют внутриклеточные белки Smadl (Smadl, Smad5 и Smad8) путем фосфорилирования, и это определяет специфику внутриклеточного ответа. Исследования BMP-рецепторов млекопитающих выявили 7 различных рецепторов типа I и 5 рецепторов типа II.

2.2.12. Функции BMP

Первые открытые BMP были примечательны способностью к стимуляции образования костей и хряща in vivo в мышечной ткани (Urist 1965). BMP инициируют внутрихрящевое образование кости, когда мезенхимальные стволовые клетки дифференцируются в хондроциты, которые формируют хрящевые структуры, впоследствии замещающиеся костной тканью. Белки BMP также участвуют в качестве локальных факторов регуляции дифференцировки остеобластов. BMP регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток, хемотаксис и апоптоз, а также контролируют фундаментальные процессы эмбриогенеза, такие как дорсо-вентральную и лево-правую разметку, нейрогенез, разметку мезодермы и развитие множества органов (почек, легких, зубов, амниона, половых желез) (Hogan 1996).

BMP-белки (также входящие в суперсемейство TGF-|3), как и Activin, стимулируют клетки-мишени путем связывания с комплексом поверхностных клеточных рецепторов двух типов: типа I (ALK2, ALK3, ALK6) и типа II (BMPRII, ActRII, ActRIIB). Однако ВМР-2 и ВМР-4 имеют более высокую аффинность к рецепторам типа I по сравнению с рецепторами типа II. Эти различия подчеркивают многообразие и тонкую регуляцию сигнальных каскадов, осуществляемых при участии членов суперсемейства TGF-p. Помимо собственно

BMP, данный каскад активируется также белками ADMP (Anti-Dorsalizing Morphogenetic Protein) и GDF (Growth and Differenciation Factors). Рецепторы ActRII обладают широкой специфичностью. Но, хотя ActRII - рецептор высокой аффинности и для Activin, и для ВМР-7, он, как и BMPRII, обладает низкой аффинностью к ВМР-2 (Greenwald et al. 2003).

2.2.13. Внеклеточная регуляция ВМР-каскада

На внеклеточном уровне каскад ВМР регулируется целым рядом секретируемых белков: Chordin, Chordin-подобные (chordin-like) белки, Noggin, Follistatin, FSRP, sclerostin, белки семейства DAN/Cerberus, Gremlin и др.

Chordin является крупным белком (примерно 1000 а.о.) и несет в своем составе четыре цистеин-богатых домена (CR1 - CR4, от Cysteine-Rich) размером около 70 а.о. каждый (Larrain et al. 2000). Кристаллическая структура Chordin или CR не известна, но предполагается наличие цистинового узла (Avsian-Kretchmer and Hsueh 2004). CR-повторы, также называемые факторами фон Виллебранда С (von Willebrand factor С domains, vWF-C), также имеются у большого количества внеклеточных белков, большинство из которых участвует в регуляции ВМР- или TGF-P-сигналов. Это CTGF (Connective Tissue Growth Factor), проколлагены, Amnionless, Chordin-like/Ventroptin/Neuralin-1 и -2, CRIM-1 (Cysteine-Rich Motor neuron protein), Nel (белок нервной ткани, содержащий EGF-подобные домены), Nel-like 1 и 2, Keilin и Crossveinless-2 (Garcia Abreu et al. 2002). Chordin экспрессируется на дорсальной стороне эмбриона Xenopus, определяя дорсо-вентральную разметку зародыша (см. ниже). Генетический нокаут гена Chordin у мыши вызывает вентрализацию гаструлы, однако, у очень небольшого процента эмбрионов. У них наблюдается уменьшение размеров нервной трубки и увеличение аллантоиса (Bachiller et al. 2003). У большей части эмбрионов chd~/~ нервная система формируется нормально, но они погибают при рождении. Аномалии у chd-/~ мышей напоминают синдром Ди Джорджи человека, вызванный отсутсвием экспрессии Chordin в глоточной энтодерме на поздних эмбриональных стадиях (Bachiller et al. 2003). У эмбрионов мышей, генетически нокаутированных по гену Noggin, гаструляция и формирование нервной пластинки

проходят нормально, но на поздних стадиях развития наблюдаются тяжелые нарушения скелетогенеза (McMahon et al. 1998). Мышиные эмбрионы, мутантные по гену HNF3P, у которых не развивается гензеновский узелок, на стадии гаструлы не экспрессируют ни Chordin, ни Noggin, однако формируют нервную пластинку (Klingensmith et al. 1999). Поскольку эти два антагониста ВМР нужны для развития нервной пластинки, они должны экспрессироваться на более ранних стадиях, до экспрессии HNF3p. Действительно, у двойных мутантов chordin:noggin отсутствует переднемозговой пузырь, передняя часть хорды, а также наблюдается рандомизация право-левой асимметрии сердца (Bachiller et al. 2000). Таким образом, считается что Chordin и Noggin выполняют вырожденниые функции и необходимы для определения всех трех осей развивающегося эмбриона мыши.

У Xenopus подавление функций Chordin было осуществлено при помощи антисмысловых МО (Oelgeschlager et al. 2003). Полученный в результате этих экспериментов фенотип оказался сходным с фенотипом мутантных Danio -chordino (Schulte-Merker et al. 1997): уменьшенный размер нервной пластинки, и разрастание вентральной мезодермы. Необходимость Chordin для нормального развития Xenopus подтверждается целым рядом экспериментов. Например, дорсализующий эффект LiCl (стабилизирующий B-Catenin, см.ниже) полностью блокируется анти-Chd-MO. Те же МО блокируют индукционную способность эксплантатов дорсальной губы бластопора (Oelgeschlager et al. 2003). Предполагается, что для активности организатора необходим целый набор анти-ВМР-агентов, и потеря функции одного их них (Chordin) вызывает серьезные последствия (Oelgeschlager et al. 2003).

Гомологами Chordin являются Chordin-подобные (CHL, от CHordin-Like) белки (Chordin-like/Ventroptin/Neuralin-1 и -2). По пространственному и временному паттерну экспрессии они отличаются от самого Chordin - они экспрессируются преимущественно в мезенхимальных клетках, что указывает на неперекрывающиеся функции в развитии. В развитии мышиных эмбрионов наблюдается экспрессия CHL в сомитах, нервной пластинке, в дерматоме и в мезенхиме почек конечностей. Высокий уровень экспрессии отмечен в развивающихся скелетных структурах - в костях конечностей, ключицы, свода черепа, позвонков и ребер. У взрослых мышей CHL экспрессируется в мозге,

легких, почках и семенниках. Кроме того, экспрессия CHL в нескелетных мезенхимальных клетках отмечена в большей части соединительных тканей у взрослых животных (Nakayama et al. 2001).

Другой группой BMP-связывающих белков являются представители семейства DAN/Cerberus. Они обладают сходным структурным мотивом, но различаются по индукторным свойствам (Hsu et al. 1998; Pearce et al. 1999). Домен, гомологичный у белков этого семейства назван сап-доменом и содержит консенсусную последовательность CX6QX6CX6NX2CXGXCXSX3PX(8-13)CX2CXPX8XLXCX(15-18)СХХ (Pearce et al. 1999). Представителями этого семейства являются DAN, cerberus, gremlin, Dte, PRDC (Protein Related to DAN and Cerberus, DAN- и Cerberus-родственный белок). Считается, что DAN, Cerberus и Gremlin ингибируют BMP по такому же механизму, как Noggin и Chordin, напрямую связываясь с лигандами и тем самым блокируя их взаимодействие с соответствующими рецепторами (Hsu et al. 1998). Cerberus, в отличие от DAN и gremlin, ингибирует также Nodal и Wnt (см. разделы 2.2.2 и 2.2.4).

Ген DAN изначально был обнаружен как транскрипт, экспрессия которого подавлена в трансформированных src крысиных фибробластах, и поэтому был так назван (от "Differential screening-selected gene Aberrant in Neuroblastoma") (Ozaki and Sakiyama 1993). Затем выяснилось, что DAN вовлечен в осевую разметку эмбриона Xenopus: его оверэкспрессия нейрализует эктодерму и дорсализует вентральную мезодерму (Hsu et al. 1998). В ходе эмбриогенеза у Xenopus и мыши DAN экспрессируется в краниальных плакодах и сомитах, а позже - в конечностях и лицевой мезенхиме (Stanley et al. 1998; Eimon and Harland 2001). Известно, что ингибирование BMP в этих регионах критично для нормального развития. Во взрослом организме DAN экспрессируется практически во всех тканях, включая легкие, печень, мозг, желудок, кишечник и селезенку. Эмбрионы мышей, генетически нокаутированные по гену DAN, не обнаруживают никаких аномалий (Dionne et al. 2001). У мышей, гетегозиготных по тещ Noggin и гомозиготных (-/-) по DAN, наблюдается превращение последнего поясничного позвонка с правой стороны в крестцовый, что указывает на роль этих генов в специфической регуляции сигналов BMP и GDF при право-левой и передне-задней разметке поясничного отдела (Dionne et al. 2001). Белок DAN связывает ВМР-2 in vitro (Hsu

et al. 1998), однако взаимодействие DAN и различных TGF-J3 лигандов в физиологических условиях остаются невыясненным. ВМР-2, -4, и -7, скорее всего, не являются физиологическими мишенями DAN. С большей вероятностью такой мишенью является родственный ВМР-2/4/7 белок GDF-5 (Dionne et al. 2001).

Gremlin (он же drm, от Down-Regulated in Mos-transformed cells) был открыт в ходе дифференциального скринига трансформированных клеток как потенциальный ингибитор прогрессии злокачественных опухолей (Topol et al. 1997). Вскоре Gremlin был обнаружен при поиске генов, способных к индукции вторичных осей у Xenopus (Hsu et al. 1998). Однако, в норме он не экспрессируется на стадии ранней гаструлы, что предполагает его участие в осевой разметке эмбриона на более поздних стадиях развития. Экспрессия Gremlin в клетках нервного гребня начинается у Xenopus со стадии хвостовой почки. Экспрессия Gremlin в ходе эмбриогенеза у мыши наблюдается в нервной трубке и начинается со стадии сомитов. Позднее он экспрессируется в дорсальной и вентральной мезенхиме почек конечностей, сначала в дорсальном проксимальном домене, а затем в проксимальной интердигитальной зоне (Pearce et al. 1999). Показано, что Gremlin играет ключевую роль в развитии конечностей у мыши (Zuniga et al. 1999) и птиц (Merino et al. 1999b). Рост и пространственная разметка конечностей у позвоночных контролируется взаимным влиянием постериорной мезенхимы (поляризующий регион) и апикальным эктодермальным гребнем, которые являются источниками Shh и FGF соответственно. Shh-сигнал модулирует экспрессию FGF в апикальном гребне. FGF-сигнал, в свою очередь, регулирует активность поляризующего региона (петля обратной связи Shh/FGF4). Поскольку BMP подавляет активность FGF, Gremlin регулирует обратную связь Shh/FGF4. Помимо эмбриональной активности, высокий уровень экспрессии Gremlin был отмечен в некоторых тканях взрослого организма (крысы) - мозге, селезенке, почках и семенниках, приэтом особенно высокий уровень экспрессии наблюдался в терминально дифференцированных клетках, что предполагает специфическую роль Gremlin поддержании нормальной организации тканей (Topol et al. 1997; Topol et al. 2000a; Topol et al. 2000b). Предполагалось, что синдром Ленца (Cenani-Lenz syndrome, CLS) связан с мутацией в гене Gremlin, однако впоследствии это предположение не подтвердилось (Bacchelli et al. 2001).

Помимо вышеуказанных белков, к представителями семейства DAN/Cerberus относятся также Dante (Pearce et al. 1999) и PRDC (Protein Related to DAN and Cerberus, белок родственный DAN и Cerberus) (Minabe-Saegusa et al. 1998).

Важным белком-антагонистом BMP является Sclerostin. Он был найден в результате позиционного клонирования при поиске генов, сцепленных со склеростозом (Balemans et al. 2001; Brunkow et al. 2001). Из-за отсутствия CAN-домена он не относится к семейству DAN/Cerberus, хотя и несет консервативные остатки цистеина и глицина, необходимые для образования структуры типа цистинового узла. В ходе эмбриогенеза он экспрессируется в нервной трубке, почках конечностей, кровеносных сосудах и в различных окостеневающих хрящах (Ohyama et al. 2004). Несмотря на некоторую гомологию с ВМР-5 и -6 (но не с ВМР-2 и -4), предполагалось, что Sclerostin действует как ингибитор BMP, подобно белкам семейства DAN/Cerberus; однако, по последним данным, при физиологических условиях он действует как ингибитор Wnt-каскада, связывая LRP5/6, см. обзор (ten Dijke et al. 2008). Мутации в гене SOST связаны со склеростозом и синдром Ван-Бюхема.

Follistatin и FLRG связывают, помимо Activin, белки BMP и GDF (см. выше). BAMBI также может связывать BMP с образованием нефункциональных комплексов с рецептором типа II, тем самым блокируя данный каскад (см. выше), (Onichtchouk et al. 1999).

2.2.14. Внутриклеточная регуляция BMP-каскада

I-Smad (Smad6 и Smad7) негативно регулируют Activin/Nodal и BMP каскады, как взаимодействуя с фосфорилированным рецептором I типа, предотвращая тем самым фосфорилирование R-Smad, так и путем конкуренции со Smad4 за формирование комплексов (Itoh et al. 2001). Экспрессия Smad6 и Smad7 индуцируется различными внешними стимулами, в том числе EGF (эпидермальный ростовой фактор) и различными членами суперсемейства TGF-P (TGF-(3, Activin и ВМР-7), что предполагает наличие петли отрицательной обратной связи (Nakao et al. 1997; Massague and Gomis 2006).

Белки Smurf, Smurfl и Smurf2 (см.выше) являются ЕЗ-убиквитин лигазами и способствуют селективной деградации активированных рецепторов I типа (Ebisawa et al. 2001) и белков Smad (Zhang et al. 2001).

2.2.15. Гены-мишени Smadl- (BMP-) каскада

Важными для раннего эмбриогенеза генами-мишенями BMP являются гены Vent (Vent-l и Vent-2) и гены семейств Dix и Msx. В раннем эмбриогенезе Xenopus гены Vent, действуя взаимно антагонистично по отношению к гомеобоксному гену Goosecoid (gsc), определяют дорсо-вентральную разметку зародыша (Sander et al. 2007). Пан-нейральные гены Sox2 и Sox3 активируются в ответ на ингибирование BMP сигнала, независимо от FGF сигнала. Однако для поддержания их экспрессии FGF сигнал необходим. Экспрессия Sox2 и Sox3 ингибируется Vent-l и Vent-2. Таким образом, Vent-l и Vent-2 регулируют размер нервной пластинки (Rogers et al. 2008; Rogers et al. 2009). Позже гены Vent принимают участие в раннем развитии кровеносной системы Xenopus, которая является производной вентральной мезодермы (Маепо 2003).

Гены семейств Dix и Msx также опосредуют сигнал BMP-каскада. В эмбриогенезе Xenopus гены Dix {DIT) экспрессируются в производных передней эктодермы с умеренным уровнем BMP-сигнала. Они регулируют пространственную разметку нервной пластинки и развитие вентрального переднего мозга, в частности, формирование сенсорных нейронов. Эти гены контролируют развитие краниального нервного гребня (и черепа), присоски, ушных и обонятельных плакод и глаз (Papalopulu and Kintner 1993; Fernandez et al. 1998; Kaji and Artinger 2004; Levi et al. 2006; Paina et al. 2011).

Т.н. Dix-код играет ключевую роль в правильном формировании жаберных дуг у позвоночных, см. обзор (Depew et al. 2005). Паттерны экспрессии генов семейства Dix при этом частично перекрываются, что несколько напоминает характер экспрессии ЯШГ-генов. Таким образом они "транслируют" градиент ВМР-сигнала в позиционную информацию клетки относительно дорсо-вентральной оси (Depew et al. 2005).

¡российская

государственная I библиотека

Гены Msx у Xenopus также экспрессируются в вентральной части эмбриона на ранних стадиях; их оверэкспрессия приводит к вентрализации эмбриона (Suzuki et al. 1997). Гены Msxl и Msx2 регулируют границы нервной трубки и необходимы для формирования нервного гребня (Khadka et al. 2006). На более поздних стадиях они участвуют в интердигитальном апоптозе при формировании конечностей (Merino et al. 1999а) и (совместно с Dix и другими генами) в формировании черепа (Levi et al. 2006).

2.3. Сигнальный каскад Wnt

Сигнальный каскад Wnt является эволюционно древним путем, который регулирует различные ключевые события клеточной дифференцировки, миграции клеток, полярности клеток и органогенеза в ходе эмбрионального развития. Белки Wnt представлены обширным семейством с весьма сложными каскадами, функциями и биологическими проявлениями.

Само название «Wnt» произошло от совмещения названия гена Drosophila wingless (бескрылая) и названия гомолога позвоночных животных, integrated или int-1 (интегрированный). Дело в том, что ген wingless был первоначально идентифицирован в 1976 Sharma и Chopra как рецессивная мутация, нарушующая развитие крыльев и жужжалец у Drosophila melanogaster (Sharma and Chopra 1976). Позже он был охарактеризован как ген сегментной полярности у Drosophila melanogaster, который функционирует во время эмбриогенеза и в процессе формирования конечностей в течение метаморфоза (Baker 1987). У позвоночных были идентифицированы гены INT рядом с несколькими интегративными сайтами вируса опухоли молочной железы мышей (mouse mammary tumor virus - MMTV) (Nusse and Varmus 1982; Nüsse et al. 1984). Int-1 и wingless гены гомологичны, т.е. имеют общее эволюционное происхождение.

Мутации гена wingless гена дрозофилы найдены у бескрылых мушек, тогда как опухоли, вызываемые MMTV, несут копии вируса, интегрированного в геном и усиливающего продукцию одного из нескольких Wnt генов. Впоследствии выяснилось, что Wnt представляют класс секретируемых морфогенетических лигандов, чрезвычайно важных в установлении паттерна развития тела практически у всех изученных многоклеточных организмов. Ключевые компоненты сигнального пути прекрасно сохранены в эволюции от самых древних представителей многоклеточных до человека - вплоть до функциональной взаимозаменяемости гомологичных белков таких разных организмов, как кишечнополостные и позвоночные, см., например, (Hobmayer et al. 2000).

Так как сигнальные каскады, которые играют ключевую роль при эмбриональном развитии, жестко регулируются, то экспрессия генов Wnt и их антагонистов сильно ограничена, как по времени, так и в пространстве во время

развития (Yamaguchi 2001). Нарушения регуляции ЖиМсаскада приводят к катастрофическим последствиям для развития эмбриона.

Белки Wnt являются секретируемыми гликопротеинами, которые связываются с N-концевым внеклеточным цистеин-богатым доменом рецепторов семейства Frizzled (Fz), из которых десять Fz обнаружены у человека. Fz -интегральный белок, несущий семь трансмембранных петель и являющийся топологическим гомологом G-белок-связывающих рецепторов. Для корректного взаимодействия Wnt и Fz также необходимы корецепторы. В частности, белок LRP5/6 необходим для трансдукции Wnt сигнала и способен модулировать канонический каскад Wnt (Не et al. 2004).

Один из ключевых уровней регулирования сигнального каскада Wnt — внеклеточный. Он осуществляется целым набором секретируемых антагонистов Wnt. После связывания Wnt и рецепторного комплекса сигнал переключается на цитоплазматический фосфопротеин Dishevelled (Dsh/Dvl). Dsh способен непосредственно взаимодействовать с Fz. На уровне Dsh сигнал Wnt разветвляется, по трем функционально различным каскадам: каноническому (через fí-Catenin), планарной клеточной полярности (РСР, от Planar Cell Polarity) и Wnt/Ca2+ (см. ниже). В передаче сигнала неканонического Wnt каскада важную роль играет корецептор Ryk (Lu et al. 2004). Однако еще остается неясным, как именно Dsh регулирует передачу сигнала и обеспечивает переключение между каждым из этих путей (Komiya and Habas 2008).

2.3.1. Классификация активностей Wnt лигандов

Канонический и неканонические Wnt-каскады запускаются разным набором Wnt-лигандов. Результаты исследований, проведенных на клетках кожи человека и на эмбрионах Xenopus, показывают, что, исходя из эффектов белков Wnt, их можно подразделить на два класса. Первый класс - Wnt, индуцирующие образование оси тела. Все белки Wnt этого класса способны к злокачественной трансформации культуры клеток млекопитающих и к индуцированию образования второй нейральной оси тела у эмбрионов Xenopus. Wnt этого первого класса кодируются у мышей генами Wnt-1, -За и -7а, а у Xenopus - генами Xwnt-1, -За, -8 и -8Ь.

Второй класс Wnt - неспособный к трансформации Wnt-5a класс. Этот класс не способен и индуцировать образование второй оси в эмбрионах Xenopus. Wnt этого класса включают в себя белки, кодируемые генами Wnt-4 и -5а у мыши и Xenopus. Химерные белки, созданные сочетанием элементов генов Xwnt-8 (первый класс Wnt-белков) и Xwnt-5A (второй класс Wnt-белков) и затем использованные для индукции второй оси у эмбрионов Xenopus, демонстрируют, что различие в активностях двух классов Wnt определяются С-концевым участком этих белков.

2.3.2. Канонический путь Wnt (Wnt/P-Catenin)

Канонический путь впервые был охарактеризован в процессе исследования дрозофилы. Множественные исследования, проведенные на позвоночных животных, привели к идентификации базовой молекулярной структуры каскада (Рис.8).

Ключевым событием активации канонического пути Wnt является аккумуляция внутриклеточного белка B-Catenin и его перемещение в ядро. В отсутствие Wnt-лиганда цитоплазматический B-Catenin деградируется комплексом разрушения, который содержит Axin, АРС (Adenomatosis Polyposis Coli), фосфатазу 2А (РР2А), киназу синтазы гликогена 3 (GSK3P) и казеинкиназу 1а (СК1а). Фосфорилирование B-Catenin этим комплексом (посредством GSK3P) ведет к его убиквитинилированию и последующему протеолитическому разрушению в протеасоме. Связывание Wnt с рецепторным комплексом, состоящим из Fz и LRP5/6, инициирует ряд событий, которые разрушают комплекс APC/Axin/GSK3, таким образом препятствуя деградации B-Catenin (Gordon and Nusse 2006). Связывание Wnt с комплексом Fz/LRP5/6 вызывает мембранную транслокацию ключевого негативного регулятора каскада Axin, который присоединяется к консервативной последовательности цитоплазматического домена LRP5/6. Важно отметить, что стимулирование Wnt также регулирует стабильность Axin. При активации каскада происходит дефосфорилирование и понижение цитоплазматического уровня Axin. После мембранной транслокации Axin его связывание с LRP5/6 усиливается посредством фосфорилирования LRP5/6, что обеспечивается либо СК1у, либо GSK3. Важным моментом является

то, что СК1 и GSK3, возможно, играют противоположные роли на двух уровнях сигнального каскада: на уровне LRP5/6 их влияние положительное, в то время, как на уровне B-Catenin, их роли отрицательные (Zeng et al. 2008; del Valle-Perez et al. 2011).

No Wnt #Wnt

Target genes

Рис.8. Схема канонического каскада Wnt. Слева показан статус основных участников каскада в отсутствие лиганда. Активность деградационного комплекса APC/Axin/GSK3p приводит к деградации P-Catenin. Справа показаны события, происходящие в результате связывания Wnt-лиганда с рецептором Fz. Деградационный комплекс перемещается к мембране и ингибируется, в результате чего p-Catenin стабилизируется и активирует транскрипцию генов-мишеней в ядре. По (Komiya and Habas 2008).

В результате этих событий P-Catenin-деструктивный комплекс ингибируется, пул эндоплазматического P-Catenin стабилизируется, и молекулы p-Catenin оказываются в состоянии поступать в ядро. В ядре фосфорилированный p-Catenin взаимодействует с транскрипционными факторами семейства TCF/LEF, вытесняя с них транскрипционные корепрессоры TLE/Groucho, способствуя специфичной экспрессии генов (Komiya and Habas 2008).

Непосредственными генами-мишенями канонического Wnt-каскада являются (у человека,) металлопротеазы матрикса (ММР2, ММРЗ, ММР7, и ММР9), cyclin Dl, Сох-2, c-myc, c-jun, Fra-1, VEGFR и т.д. (Liu et al. 2010). Гены-мишени канонического и РСР Wnt-путей включают металлопротеазы матрикса, существенные для ремоделирования ткани и количество которых увеличено в инвазивных раковых опухолях, что может служить дополнительным доказательством вовлечения передачи сигналов Wnt в возникновение рака.

Помимо прочего, необходимо отметить, что канонический Wnt-каскад может быть активирован целым рядом низкомолекулярных соединений. Самым простым и известным веществом являются ионы лития, которые способны ингибировать GSK3p. Благодаря этому свойству хлорид лития нередко используется при исследованиях канонического Wnt каскада, например см. (Vonica et al. 2000).

2.3.3. Планарная клеточная полярность (РСР)

Планарной клеточной полярностью называется поляризация клеток в плоскости эпителиального пласта, т.е. перпендикулярная апикально-базальной полярности. Сам феномен планарной полярности был открыт на Drosophila, при изучении ориентации волосков на крыльях и щетинок на теле мухи (Bridges СВ, Brehme KS. 1944). Сам термин был предложен Lawrence и Shelton, которые изучали формирование сетчатки (Lawrence and Shelton 1975). В дальнейшем выяснилось, что сходные молекулярно-биологические механизмы играют ключевую роль в таких разных процессах, как гаструляционные движения и нейруляция, детерминация лево-правой оси, формирование сердца, внутреннего уха, гениталий и некоторых других органов (см. обзор (Wansleeben and Meijlink 2011)). Самым ранним и важным процессом, регулируемым данным каскадом, является конвергентное растяжение (convergent extension) в клеточных пластах при гаструляции (рис. 9). Сигнальный путь планарной клеточной полярности включает Frizzled и Dishevelled, но не белки Axin комплекса.

Рис.9. Схема перестройки клеточного пласта в ходе конвергентного растяжения.

У Xenopus основным рецептором Wnt/PCP пути является, по-видимому, Frizzled 7 (Fz7). Он способен непосредственно связывать Wntll, а его доминантно-негативная и конститутивно-активная формы способны ингибировать или, соответственно, активировать Wnt/PCP каскад (Djiane et al. 2000). Кроме того, различные трункированные формы Dishevelled способны активировать или ингибировать данный каскад. Так, в экспериментах на Danio было показано, что оверэкспрессия полноразмерного Dishevelled приводит к сильной дорсализации эмбрионов (вследствие активации канонического каскада), тогда как его N-концевая трункированная форма способна полностью восстановить мутантный фенотип sib (мутация гомолога Wntll) (Heisenberg et al. 2000). Активация Dishevelled приводит к активации таких малых G-белков, как RhoA, Rac and Cdc42, способных напрямую регулировать архитектуру цитоскелета (Hall 1998) (рис.10). Взаимодействие между Dsh и RhoA опосредуется белком Daaml, который способен связываться с обоими этими белками (Habas et al. 2001). В итоге, активация Wnt/PCP пути приводит к асимметричной локализации внутриклеточных белков, таких как Van Gogh (Vang), Prickle (Pk), Fz, Dsh, Flamingo (Fmi) и Diego (Dgo) (y Drosophila, у позвоночных Van Gogh-Like 1 (Vangll), Vangl2, Fzd3, Fzd6, Dvll, Dvl2, Celsrl-3). При этом Vang и Pk оказываются локализованными на проксимальной стороне клетки, a Fz, Dsh и Dgo - на дистальной (рис. 11).

Wnt11/S!b Wnt5a/Ppt

I

f

Cytoskeletal Target Genes Polarization

I

Convergent Extension

Рис. 10. Рецептор ¥г активирует, при участии белков ОбЬ и Оаат 1, протеин-киназ К Но А и Яок„ что проводит к перестройке цитоскслета. Справа показана предполагаемая активация транскрипции генов под действием Сёс42 и ЛЧК. По (Тас1а et а1. 2002)._

Рис.11. Ассимметричноая локализация белков Wnt/PCP каскада у Drosophila (слева) и у позвоночных, в данном примере мыши (справа). Гомологичные белки выделены одинаковым цветом. По (Wanslceben and Meijlink 2011). _____

Долгое время оставалось загадкой, каким образом происходит передача поляризующего сигнала от клетки к клетке в эпителиальном пласте (Tada et al. 2002). В настоящее время этот механизм изучен: трансмембранный белок Fmi, локализованный на дистальной и проксимальной стороне, опосредует межклеточные взаимодействия с помощью гомофильных взаимодействий, a Vang гетерофильно взаимодействует с внеклеточным доменом Fz (рис. 11) (Wu and Mlodzik 2008).

2.3.4. Неканонический Wnt/Ca2+ путь

Второе направление неканонического пути передачи сигнала Wnt обозначается как путь Wnt/Ca2+ , и, хотя этот путь некоторыми элементами похож на PCP, он имеет четкие отличия, которые дают основания для представления его как отдельного каскада (Рис.12). Путь Wnt/Ca2+ был обнаружен, когда выяснили, что некоторые Wnt и Fz могут стимулировать внутриклеточное высвобождение Са2+ из эндоплазматического ретикулума, и это зависит от G-белков. Колебания уровня Са2+ были зарегистрированы в гаструлирующих эмбрионах шпорцевой лягушки Xenopus и Danio, где, как предполагается, они играют ключевую роль в образовании структур на ранних этапах эмбриогенеза. Wnt5a, Wntl 1 и Fz2 (RFz-2) способны к внутриклеточному высвобождению Са2+, не влияя при этом на стабильность B-Catenin. Высвобождение кальция при избыточной экспрессии Wnt5a или RFz-2 в эмбрионах Danio подавляют коклюшный токсин и а-субъедица трансдуцина, которые препятствуют передаче сигнала G-белком. Эти сообщения показывают, что Wnt/Fz-сигналинг приводит к высвобождению внутриклеточного Са2+ посредством тримерных G-белков. Высвобождение кальция и его внутриклеточное аккумулирование активирует несколько Са2+ -чувствительных белков, включая киназу белка С (РКС) и кальций/кальмодулин (calcium/calmodulin)-3aBHCHMyio киназу II (CamKII) (Komiya and Habas 2008).

Рис.12. Схема сигнального пути Wnt/Ca2+. Активация рецептора и белка-посредника Dsh (при участииО-белков) приводит к активации фосфолипазы С (PLC), и образующийся в результате инозитол-3-фосфат стимулирует внутриклеточное высвобождение ионов Са2+. Кроме того, активированный Dsh блокирует активность фосфодиэстеразы PDE, которая препятствует высвобождению Са2+. Повышенный уровень Са2+ активирует CamKl 1 и кальцинейрин, которые действуют на дифференцировку клеток. Диацилглицерол (DAG) активирует CDC42, который регулирует разделение тканей и клеточные движения при гаструляции. По (Komiya and Habas 2008)._

2.3.5. Секреция Wnt и внеклеточные регуляторы

Литанды Wnt сильно модифицируются перед транспортировкой и выходом во внеклеточную среду. Показано, что в эндоплазматической сети Wnt гликозилируются по положениям Asnll4, Asnl20, Asn311 и Asn325, а также пальмитоилируются по положению Cysl04. Белки Wnt, мутантные по сайту пальмитоилирования, не способны связываться с рецептором Fz. Следовательно, пальмитоилирование играет огромную роль в функционировании каскада Wnt. Отсутствие гликозилирования, судя по всему, не отражается на функциях Wnt, но без него не осуществляется его корректная секреция (Kurayoshi et al. 2007). Продукт гена porcupine играет важную роль в пальмитоилировании белков Wnt (Tanaka et al. 2002; Komekado et al. 2007; Kurayoshi et al. 2007), а их секреция регулируется продуктами генов wntless и evenness interrupted (Bartscherer et al. 2006; Kim et al. 2009; Korkut et al. 2009).

Для позвоночных описаны различные секретируемые белки, которые могут модулировать Wnt-каскад. Во внеклеточном матриксе обнаружен ряд секретируемых белков, которые связываются с Wnt и предотвращают их взаимодействие либо с Fz, либо с LRP5/6, тем самым ингибируя каскад Wnt. Такими белками являются, например, Dickkopf (Dkk), Wnt-ингибиторный фактор (WIF), растворимые Frizzled-родственные белки (sFRP), Cerebrus, Frzb и Wise и др. Каждый из этих ингибиторов строго регулируется в процессе эмбриогенеза и предназначен для создания градиента или ограничения сигнального каскада Wnt для корректного формирования структур.

К белкам, связывающим непосредственно Wnt лиганды, относятся Cerberus, Klotho, WIF и представители семейства sFRP. Последние обеспечивают паракринную регуляцию Wnt каскада; нарушение их экспрессии связано с онкогенезом и воспалительными процессами. У человека найдено пять представителей семейства sFRP (sFRPl-sFRP5). Они являются растворимыми секретируемыми белками; кроме того, для sFRPl и sFRP4 существует мембранно-связанные варианты. Для ингибирования Wnt критическую роль играют их CRD-(Cysteine-Rich Domain) и С-концевые домены (Bhat et al. 2007). Они способны

ингибировать как канонический, так и неканонические (PCP Wnt/Ca2+) каскады (Dann et al. 2001). Интересно, что в отсутствие Wnt лигандов sFRPl способен активировать канонический каскад in vitro (Lopez-Rios et al. 2008). Интересным ингибитором является Wnt3-связывающий белок Klotho, который был идентифицирован как антивозрастной белок (Kuro-o et al. 1997; Liu et al. 2007). Wnt inhibitory factor (WIF) содержит Wnt-связывающий WIF-домен, пять EGF-подобных и короткий гидрофобный домен (Hsieh et al. 1999). Он связывает Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt7a, Wnt9a, и Wntll и участвует, также как и Dkk-1, в петле обратной связи, подавляя экспрессию Miz-1 и с-Мус, что приводит к активации экспрессии WIF при формировании хрящей (Surmann-Schmitt et al. 2009).

Одним из главных ингибиторов Wnt каскада в ходе раннего эмбриогенеза является Cerberus. Он был открыт как высоко представленная организатор-специфическая молекула (Bouwmeester et al. 1996). Он экспрессируется в передней эндодерме, включая шпемановский организатор, и обладает уникальным свойством индуцировать при эктопической экспрессии вторичные головы, без формирования туловищных осевых структур. Последние зависят от функционирования Nodal и Wnt каскадов, тогда как индукция головы требует одновременного подавления Wnt и BMP каскадов (Glinka et al. 1997). Cerberus связывает лиганды всех трех каскадов (см.выше, раздел 2.2.1). Природный аналог Cer-S, С-концевого фрагмента белка, связывающего только Nodal лиганды, может образовываться in vivo путем ограниченного протеолиза; предполагается, что такой протеолиз может регулировать ингибиторную активность Cerberus в отношении Wnt каскада (Piccolo et al. 1999). Xcer лягушки родственен мышиному mCerl, однако mCerl не влияет на Wnt каскад; является ли он настоящим ортологом Хсег, не вполне ясно (Belo et al. 2000). Помимо Xcer у Xenopus был также идентифицирован другой Cerberus-подобный белок, Coco, способный ингибировать Wnt каскад (Bell et al. 2003).

Ингибирование Wnt каскада за счет связывания с корецептором LRP5/6 осуществляют такие секретируемые белки, как SÖST (Sclerostin), Mesd и DKK (Dickkopf). Белок APCDD1 также связывается с LRP5/6, но внутри клетки. Трансмембранные белки Kremen (Krml/2) регулируют экспозицию LRP5/6 на поверхности клетки, модулируя Wnt каскад (Hassler et al. 2007). Sclerostin

ингибирует Wnt каскад, связываясь с LRP5 (см. раздел 2.2.3). Его активность, как и активность sFRPl, модулируется гепарином (Veverka et al. 2009).

Белок Mesd ингибирует Wnt каскад двояким образом. В эндоплазматическом ретикулюме он функционирует как шаперон, способствуя правильному фолдингу не только LRP5/6, но и рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (Herz and Marschang 2003; Hsieh et al. 2003). Вне клетки он действует более специфично, связываясь с внеклеточным доменом LRP5/6, но не рецепторов ЛПНП (Li et al. 2005; Lu et al. 2010). Однако способ его влияния на Wnt каскад остается неясным (Hassler et al. 2007; Lu et al. 2010).

Ингибитор сериновых протеаз A3K (SERPINA3K) ингибирует Wnt каскад, связываясь с LRP6 и предотвращая димеризацию с Fzd (Zhang et al. 2010). Наряду с другим ингибитором Wnt каскада, Nucleoredoxin, он демонстрирует антитоксический эффект. Предполагается, что эти белки играют важную роль в защите клетки от свободных радикалов и участвуют в регуляции Wnt каскада при окислительном стрессе (Chen et al. 2009).

Белки семейства DKK (Dickkopf) являются, пожалуй, самыми распространенными и хорошо изученными ингибиторами Wnt каскада и включают в себя четыре секретируемых цистеин-богатых белка. Исходно они были открыты как молекулы, способные индуцировать полные (т.е. с головами) вторичные оси у Xenopus, будучи ко-инъецированы вместе с доминантно-негативной формой BMP рецептора (Glinka et al. 1998). Все они несут сайты связывания Wnt-лигандов и Kremen. Предполагается, что aHTH-LRP5/6 эффект DKK зависит от Kremen. В отсутствие DKK-1 белки Kremen связываются с LRP5/6 и стимулируют каскад. В присутствие DICK Kremen блокирует передачу сигнала (Мао and Niehrs 2003; Hassler et al. 2007). Предполагается, что Krm2 может оказывать либо активирующее, либо ингибирующее влияние на Wnt каскад в зависимости от микроокружения (Hassler et al. 2007). DKK-1, -2 и -4 являются ингибиторами Wnt каскада, тогда как DKK3 его активирует (Nakamura et al. 2007). В ходе раннего развития Xenopus Dkk-1 экспрессируется в передней эндомезодерме, где локализуется область головного индуктора. Dkk-1 блокирет как ранние, так и поздние эффекты Wnt; его оверэкспрессия вызывает фенотип "увеличенной головы" (Glinka et al. 1998). У мышей, нокаутных по гену Dkk-1, отсутствуют

головные структуры (Mukhopadhyay et al. 2001). Неканонический Wnt/PCP путь, запускающий конвергентное растяжение при гаструляции, может быть ингибирован с помощью доминантно-негативного Fz, но не Dkk-1 или доминантно-негативного LRP6 (Semenov et al. 2001). Таким образом, LRP5/6- опосредованный эффект Dkk-1 является, по-видимому, специфическим только для Wnt/ß-Catenin пути.

Интересным открытием недавнего времени можно считать идентификацию новых факторов, например Norrin и R-Spondin, которые могут активировать Wnt каскад, связываясь с рецептором LRP5/6. Norrin активирует канонический Wnt/ß-Catenin каскад, но блокирует Activin/Nodal и BMP каскады; некоторые его мутантные формы способны активировать Wnt, но теряют способность ингибировать Activin/Nodal и BMP каскады, что, по-видимому, является причиной наследственной болезни Норри (Xu et al. 2004). R-Spondin активирует и канонический, и Wnt/PCP каскад (Glinka et al. 2011).

2.3.6. Wnt-индуцированные клеточные ответы

Канонический Wnt-каскад играет ключевую роль в различных биологических процессах.

1. Канцерогенез. Разнообразные нарушения Wnt-каскада являются причиной многочисленных раковых заболеваний; подробное рассмотрение его роли в канцерогенезе выходит за рамки настоящего обзора. Здесь будет уместно лишь отметить некоторые факты. Wnt-1 является онкогеном, участвующим в развитии рака молочной железы (Nusse and Varmus 1982). APC был впервые охарактеризован как ген-супрессор злокачественных опухолей прямой кишки. (Polakis 1997). Мутации в человеческом гене AXIN1 приводят к развитию карциномы печени (Clevers 2000). Wnt5A, который препятствует активацию каскада другими Wnt, вероятно может быть супрессором опухолей, так как показано, что у мутантных по Wnt5A мышей развивается лимфонеоплазия (Liang et al. 2003). Также показано, что члены SFRP-семейства эпигенетически инактивируются при раке прямой кишки. (Suzuki et al. 2004). Так как SFRP могут

связывать и инактивироватъ прекращение экспрессии ЭР ЯР может

увеличивать активность "Ми в онкогенезе.

2. Эмбриогенез. В процессе индивидуального развития Хепорш канонический \¥г^-каскад выполняет двойственную функцию.

а) Ранняя активация. При оплодотворении происходит кортикальный сдвиг, который определяет вентральную сторону будущего зародыша. Соответственно, на стороне, противоположной точке проникновения спсрматозиода возникают сначала ньюкуповский, а затем шпемановский организаторы, что определяется активностью канонического УЛИ-каскада. Таким образом, ранняя активация определяет дорсо-вентральную полярность зародыша.

б) Поздняя активация. После гаструляции \Viit выступает в роли морфогена, определяющего (наряду с ретиноевой кислотой и РОБ) антериорно-постериорную разметку эмбриона. При этом \¥Щ-лиганды обладают выраженным каудализирующим эффектом, см. рис.13.

А. Гаструла

Б. Головастик

Wnt

хвост туловище голова

' А

Wnt signaling

Рис. 13. Схема действия канонического Wnt-каскада на ранних (Л) и поздних (Б) стадиях развития. На (А) пунктиром показана граница между эктодермой (оранжевая) и мезэндо дермой (желтая). ANE, антериорная нейроэктодерма; PME, постериорная мезэндодерма (зеленая). (Б) Градиент Wnt снижается от постсриорной стороны эмбриона (Р) к антсриорной (А). По (Sokol 2011)._

3. Направление роста аксонов

Неканонический каскад Wnt может направлять рост аксонов, в частности аксонов в corpus callosum конечного мозга, соматически-сенсорных нейронов спинного мозга и аксонов кортикоспинального тракта. Например, коммисуральные соматически-сенсорные нейроны растущего спинного мозга после пересечения средней линии направляются градиентом Wnt4, который в этом случае выступает в роли хемоаттрактанта и действует через Frizzled рецепторы (Lyuksyutova et al. 2003). Wnt5a действует как хеморепеллент в процессе роста нейронов кортикоспинального тракта, при этом для удлинения аксонных выростов требуется Ryk, но не Fz-рецепторы, тогда как в выборе направления роста участвуют и Ryk, и Fz (Li et al. 2010).

4. Стволовые клетки

Многочисленные иссследования показывают, что Wnt/P-Catenin каскад играет ключевую роль в функционировании эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток у различных классов позвоночных животных. Считается, что Wnt необходим для поддержания стволовых клеток в недифференцированном состоянии, спецификации мезэндодермальной линии и предотвращения нейроэктодермальной дифференцировки, например, см. (Ten Berge et al. 2011). Однако роль роль Wnt лигандов и рецепторов в поддержании плюрипотентности остается предметом дискуссий (Wend et al. 2010). Большинство компонентов Wnt каскада участвуют в других клеточных процессах. Например, GSK3(3 фосфорилирует целый ряд белков и модулирует сигнальные каскады, не имеющие отношения к Wnt/P-Catenin пути (MacDonald et al. 2009). По-видимому, при самообновлении и поддержании плюрипотентности синергично действуют два молекулярных процесса -стабилизация P-Catenin и инактивация TCF3. P-Catenin играет роль структурного белка (а не транскрипционного кофактора) для ключевого гена - фактора плюрипотентности ОСТ4. TCF3 связывается с промоторами генов-мишеней вместе с Oct4, Sox2 и Nanog (Cole et al. 2008). Поддержание компетентности к дифференцировке под действием внешних факторов контролируется противоположным действием TCF3, TCF1 и других факторов плюрипотентности

(Soko! 2011; Watanabe and Dai 2011). Роль Wnt и P-Catenin в функционировании стволовых клеток схематично приведена на рис. 14.

А

Without Wnt

Б

Tarosi gene

+ Wnt

( it-cat : T#rf

_ Target q- -

В

/

+ Wnt

+ Wnt

ял )

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ерошкин, Федор Михайлович, 2012 год

9. Список использованной литературы

1. Adamska, M., Degnan, S.M., Green, K.M., Adamski, M., Craigie, A., Larroux, C., and Degnan, B.M. 2007. Wnt and TGF-beta Expression in the Sponge Amphimedon queenslandica and the Origin of Metazoan Embryonic Patterning. PloS one 2(10).

2. Adamska, M., Larroux, C., Adamski, M., Green, K., Lovas, E., Koop, D., Richards, G.S., Zwafink, C., and Degnan, B.M. 2010. Structure and expression of conserved Wnt pathway components in the demosponge Amphimedon queenslandica. Evolution & Development 12(5): 494-518.

3. Adkins, H.B., Bianco, C., Schiffer, S.G., Rayhom, P., Zafari, M., Cheung, A.E., Orozco, O., Olson, D., De Luca, A., Chen, L.L., Miatkowski, K., Benjamin, C., Normanno, N., Williams, K.P., Jarpe, M., LePage, D., Salomon, D., and Sanicola, M. 2003. Antibody blockade of the Cripto CFC domain suppresses tumor cell growth in vivo. J Clin Invest 112(4): 575-587.

4. Agius, E., Oelgeschlager, M., Wessely, O., Kemp, C., and De Robertis, E.M. 2000. Endodermal Nodal-related signals and mesoderm induction in Xenopus. Development (Cambridge, England) 127(6): 1173-1183.

5. Amaya, E., Musci, T.J., and Kirschner, M.W. 1991. Expression of a Dominant Negative Mutant of the Fgf Receptor Disrupts Mesoderm Formation in Xenopus Embryos. Cell 66(2): 257-270.

6. Antenos, M., Zhu, J., Jetly, N.M., and Woodruff, T.K. 2008. An activin/furin regulatory loop modulates the processing and secretion of inhibin alpha- and betaB-subunit dimers in pituitary gonadotrope cells. The Journal of biological chemistry 283(48): 3305933068.

7. Arendt, D. and Nubler-Jung, K. 1994. Inversion of dorsoventral axis? Nature 371(6492): 26.

8. Ariizumi, T., Kinoshita, M., Yokota, C., Takano, K., Fukuda, K., Moriyama, N., Malacinski, G.M., and Asashima, M. 2003. Amphibian in vitro heart induction: a simple and reliable model for the study of vertebrate cardiac development. The International journal of developmental biology 47(6): 405-410.

9. Asashima, M., Michiue, T., and Kurisaki, A. 2008. Elucidation of the role of activin in organogenesis using a multiple organ induction system with amphibian and mouse undifferentiated cells in vitro. Development, growth & differentiation 50 Suppl 1: S35-45.

10. Attisano, L., Wrana, J.L., Montalvo, E., and Massague, J. 1996. Activation of signalling by the activin receptor complex. Molecular and cellular biology 16(3): 1066-1073.

11. Avsian-Kretchmer, O. and Hsueh, A.J. 2004. Comparative genomic analysis of the eight-membered ring cystine knot-containing bone morphogenetic protein antagonists. Molecular endocrinology (Baltimore, Md 18(1): 1-12.

12. Aybar, M.J., Nieto, M.A., and Mayor, R. 2003. Snail precedes slug in the genetic cascade required for the specification and migration of the Xenopus neural crest. Development (Cambridge, England) 130(3): 483-494.

13. Bacchelli, C., Goodman, F.R., Scambler, P.J., and Winter, R.M. 2001. Cenani-Lenz syndrome with renal hypoplasia is not linked to FORMIN or GREMLIN. Clinical genetics 59(3): 203-205.

14. Bachiller, D., Klingensmith, J., Kemp, C., Belo, J.A., Anderson, R.M., May, S.R., McMahon, J.A., McMahon, A.P., Harland, R.M., Rossant, J., and De Robertis, E.M. 2000. The organizer factors Chordin and Noggin are required for mouse forebrain development. Nature 403(6770): 658-661.

15. Bachiller, D., Klingensmith, J., Shneyder, N., Tran, U., Anderson, R., Rossant, J., and De Robertis, E.M. 2003. The role of chordin/Bmp signals in mammalian pharyngeal development and DiGeorge syndrome. Development (Cambridge, England) 130(15): 3567-3578.

16. Baker, N.E. 1987. Molecular cloning of sequences from wingless, a segment polarity gene in Drosophila: the spatial distribution of a transcript in embryos. The EMBO journal 6(6): 1765-1773.

17. Bakin, A.V., Safina, A., Rinehart, C., Daroqui, C., Darbary, H., and Helfinan, D.M. 2004. A critical role of tropomyosins in TGF-beta regulation of the actin cytoskeleton and cell motility in epithelial cells. Molecular biology of the cell 15(10): 4682-4694.

18. Balaskas, N., Ribeiro, A., Panovska, J., Dessaud, E., Sasai, N., Page, K.M., Briscoe, J., and Ribes, V. 2012. Gene Regulatory Logic for Reading the Sonic Hedgehog Signaling Gradient in the Vertebrate Neural Tube. Cell 148(1-2): 273-284.

19. Balemans, W., Ebeling, M., Patel, N., Van Hul, E., Olson, P., Dioszegi, M., Lacza, C., Wuyts, W., Van Den Ende, J., Willems, P., Paes-Alves, A.F., Hill, S., Bueno, M., Ramos, F.J., Tacconi, P., Dikkers, F.G., Stratakis, C., Lindpaintner, K., Vickery, B., Foernzler, D., and Van Hul, W. 2001. Increased bone density in sclerosteosis is due to the deficiency of a novel secreted protein (SOST). Human molecular genetics 10(5): 537543.

20. Bartscherer, K., Pelte, N., Ingelfmger, D., and Boutros, M. 2006. Secretion of Wnt ligands requires Evi, a conserved transmembrane protein. Cell 125(3): 523-533.

21.Bassi, D.E., Fu, J., Lopez de Cicco, R., and Klein-Szanto, A.J. 2005. Proprotein convertases: "master switches" in the regulation of tumor growth and progression. Molecular carcinogenesis 44(3): 151-161.

22. Bauer, H., Meier, A., Hild, M., Stachel, S., Economides, A., Hazelett, D., Harland, R.M., and Hammerschmidt, M. 1998. Follistatin and noggin are excluded from the zebrafish organizer. Developmental biology 204(2): 488-507.

23. Beddington, R.S. and Robertson, E.J. 1999. Axis development and early asymmetry in mammals. Cell 96(2): 195-209.

24. Bell, E., Munoz-Sanjuan, I., Altmann, C.R., Vonica, A., and Brivanlou, A.H. 2003. Cell fate specification and competence by Coco, a maternal BMP, TGFbeta and Wnt inhibitor. Development (Cambridge, England) 130(7): 1381-1389.

25. Belo, J.A., Bachiller, D., Agius, E., Kemp, C., Borges, A.C., Marques, S., Piccolo, S., and De Robertis, E.M. 2000. Cerberus-like is a secreted BMP and nodal antagonist not essential for mouse development. Genesis 26(4): 265-270.

26. Belyavsky, A., Vinogradova, T., and Rajewsky, K. 1989. PCR-based cDNA library construction: general cDNA libraries at the level of a few cells. Nucleic acids research 17(8): 2919-2932.

27. Benckert, C., Jonas, S., Cramer, T., Von Marschall, Z., Schafer, G., Peters, M., Wagner, K., Radke, C., Wiedenmann, B., Neuhaus, P., Hocker, M., and Rosewicz, S. 2003. Transforming growth factor beta 1 stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human cholangiocellular carcinoma cells. Cancer research 63(5): 10831092.

28. Bertocchini, F. and Stern, C.D. 2002. The hypoblast of the chick embryo positions the primitive streak by antagonizing nodal signaling. Developmental cell 3(5): 735-744.

29. Bhat, R.A., Stauffer, B., Komm, B.S., and Bodine, P.V. 2007. Structure-function analysis of secreted frizzled-related protein-1 for its Wnt antagonist function. Journal of cellular biochemistry 102(6): 1519-1528.

30. Blumberg, B., Bolado, J., Moreno, T.A., Kintner, C., Evans, R.M., and Papalopulu, N. 1997. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural patterning. Development (Cambridge, England) 124(2): 373-379.

31. Botchkarev, V.A., Botchkareva, N.V., Roth, W., Nakamura, M., Chen, L.H., Herzog, W., Lindner, G., McMahon, J.A., Peters, C., Lauster, R., McMahon, A.P., and Paus, R. 1999. Noggin is a mesenchymally derived stimulator of hair-follicle induction. Nature cell biology 1(3): 158-164.

32. Bouwmeester, T., Kim, S., Sasai, Y., Lu, B., and De Robertis, E.M. 1996. Cerberus is a head-inducing secreted factor expressed in the anterior endoderm of Spemann's organizer. Nature 382(6592): 595-601.

33. Brunei, L.J., McMahon, J.A., McMahon, A.P., and Harland, R.M. 1998. Noggin, cartilage morphogenesis, and joint formation in the mammalian skeleton. Science (New York, AT 280(5368): 1455-1457.

34. Brunkow, M.E., Gardner, J.C., Van Ness, J., Paeper, B.W., Kovacevich, B.R., Proll, S., Skonier, J.E., Zhao, L., Sabo, P.J., Fu, Y., Alisch, R.S., Gillett, L., Colbert, T., Tacconi, P., Galas, D., Hamersma, H., Beighton, P., and Mulligan, J. 2001. Bone dysplasia sclerosteosis results from loss of the SOST gene product, a novel cystine knot-containing protein. American journal of human genetics 68(3): 577-589.

35. Candia, A.F., Watabe, T., Hawley, S.H., Onichtchouk, D., Zhang, Y., Derynck, R., Niehrs, C., and Cho, K.W. 1997. Cellular interpretation of multiple TGF-beta signals: intracellular antagonism between activin/BVgl and BMP-2/4 signaling mediated by Smads. Development (Cambridge, England) 124(22): 4467-4480.

36. Chan, T.C., Ariizumi, T., and Asashima, M. 1999. A model system for organ engineering: transplantation of in vitro induced embryonic kidney. Die Naturwissenschaften 86(5): 224-227.

37. Chang, C. and Harland, R.M. 2007. Neural induction requires continued suppression of both Smadl and Smad2 signals during gastrulation. Development (Cambridge, England) 134(21): 3861-3872.

38. Chang, H.L., Gillett, N., Figari, I., Lopez, A.R., Palladino, M.A., and Derynck, R. 1993. Increased transforming growth factor beta expression inhibits cell proliferation in vitro, yet increases tumorigenicity and tumor growth of Meth A sarcoma cells. Cancer research 53(18): 4391-4398.

39. Chen, C.H. and Shen, M.M. 2004. Two modes by which lefty proteins inhibit Nodal signaling. Current Biology 14(7): 618-624.

40. Chen, X., Weisberg, E., Fridmacher, V., Watanabe, M., Naco, G., and Whitman, M. 1997. Smad4 and FAST-1 in the assembly of activin-responsive factor. Nature 389(6646): 85-89.

41. Chen, Y., Hu, Y., Zhou, T., Zhou, K.K., Mott, R., Wu, M., Boulton, M., Lyons, T.J., Gao, G., and Ma, J.X. 2009. Activation of the Wnt pathway plays a pathogenic role in diabetic retinopathy in humans and animal models. The American journal of pathology 175(6): 2676-2685.

42. Chen, Y.G., Lui, H.M., Lin, S.L., Lee, J.M., and Ying, S.Y. 2002. Regulation of cell proliferation, apoptosis, and carcinogenesis by activin. Experimental biology and medicine (Maywood, NJ 227(2): 75-87.

43. Chomczynski, P. and Sacchi, N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry 162(1): 156-159.

44. Clevers, H. 2000. Axin and hepatocellular carcinomas. Nature genetics 24(3): 206-208.

45. Cole, M.F., Johnstone, S.E., Newman, J.J., Kagey, M.H., and Young, R.A. 2008. Tcf3 is an integral component of the core regulatory circuitry of embryonic stem cells. Genes & development 22(6): 746-755.

46. Cooke, J., Smith, J.C., Smith, E.J., and Yaqoob, M. 1987. The organization of mesodermal pattern in Xenopus laevis: experiments using a Xenopus mesoderm-inducing factor. Development (Cambridge, England) 101(4): 893-908.

47. Cox, W.G. and HemmatiBrivanlou, A. 1995. Caudalization of neural fate by tissue recombination andbFGF. Development (Cambridge, England) 121(12): 4349-4358.

48. Dann, C.E., Hsieh, J.C., Rattner, A., Sharma, D., Nathans, J., and Leahy, D.J. 2001. Insights into Wnt binding and signalling from the structures of two Frizzled cysteine-rich domains. Nature 412(6842): 86-90.

49. Darras, S., Gerhart, J., Terasaki, M., Kirschner, M., and Lowe, C.J. 2011. beta-Catenin specifies the endomesoderm and defines the posterior organizer of the hemichordate Saccoglossus kowalevskii. Development (Cambridge, England) 138(5): 959-970.

50. Datto, M.B., Li, Y., Panus, J.F., Howe, D.J., Xiong, Y., and Wang, X.F. 1995. Transforming growth factor beta induces the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 through a p53-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92(12): 5545-5549.

51. de Guise, C., Lacerte, A., Rafiei, S., Reynaud, R., Roy, M., Brue, T., and Lebrun, J.J. 2006. Activin inhibits the human Pit-1 gene promoter through the p38 kinase pathway in a Smad-independent manner. Endocrinology 147(9): 4351-4362.

52. De Robertis, E.M. and Kuroda, H. 2004. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual review of cell and developmental biology 20: 285-308.

53. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., and Christian, J.L. 2004. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular biology of the cell 15(11): 5012-5020.

54. del Valle-Perez, B., Arques, O., Vinyoles, M., de Herreros, A.G., and Dunach, M. 2011. Coordinated Action of CK1 Isoforms in Canonical Wnt Signaling. Molecular and cellular biology 31(14): 2877-2888.

55. Depew, M.J., Simpson, C.A., Morasso, M., and Rubenstein, J.L. 2005. Reassessing the Dlx code: the genetic regulation of branchial arch skeletal pattern and development. Journal of anatomy 207(5): 501-561.

56. Derynck, R., Zhang, Y., and Feng, X.H. 1998. Smads: transcriptional activators of TGF-beta responses. Cell 95(6): 737-740.

57. Dickmeis, T., Aanstad, P., Clark, M., Fischer, N., Herwig, R., Mourrain, P., Blader, P., Rosa, F., Lehrach, H., and Strahle, U. 2001. Identification of nodal signaling targets by array analysis of induced complex probes. Dev Dyn 222(4): 571-580.

58. Dionne, M.S., Skarnes, W.C., and Harland, R.M. 2001. Mutation and analysis of Dan, the founding member of the Dan family of transforming growth factor beta antagonists. Molecular and cellular biology 21(2): 636-643.

59. Djiane, A., Riou, J., Umbhauer, M., Boucaut, J., and Shi, D. 2000. Role of frizzled 7 in the regulation of convergent extension movements during gastrulation in Xenopus laevis. Development (Cambridge, England) 127(14): 3091-3100.

60. Duboc, V., Lapraz, F., Saudemont, A., Bessodes, N., Mekpoh, F., Haillot, E., Quirin, M., and Lepage, T. 2010. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development (Cambridge, England) 137(2): 223235.

61. Duboc, V. and Lepage, T. 2008. A conserved role for the nodal signaling pathway in the establishment of dorso-ventral and left-right axes in deuterostomes. Journal of experimental zoology 310(1): 41-53.

62. Duboc, V., Rottinger, E., Lapraz, F., Besnardeau, L., and Lepage, T. 2005. Left-right asymmetry in the sea urchin embryo is regulated by nodal signaling on the right side. Developmental cell 9(1): 147-158.

63. Dyson, S. and Gurdon, J.B. 1998. The interpretation of position in a morphogen gradient as revealed by occupancy of activin receptors. Cell 93(4): 557-568.

64. Ebisawa, T., Fukuchi, M., Murakami, G., Chiba, T., Tanaka, K., Imamura, T., and Miyazono, K. 2001. Smurfl interacts with transforming growth factor-beta type I

receptor through Smad7 and induces receptor degradation. The Journal of biological chemistry 276(16): 12477-12480.

65. Echelard, Y., Epstein, D.J., St-Jacques, B., Shen, L., Mohler, J., McMahon, J.A., and McMahon, A.P. 1993. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell 75(7): 1417-1430.

66. Economides, A.N., Liu, X., Gannon, F.H., Shore, E.M., Wang, X., Elover, G., Shiram, K.B., Fytros-Sirabian, E.K., Fandl, J.P., Ryan, T.E., Bailesy, K.M., Kaplan, F.S., Kimble, R., and Stahl, N. 1999. Noggin inhibits BMP-2 mediated de novo bone formation in vivo. Bone 24(4): 429-429.

67. Eimon, P.M. and Harland, R.M. 2001. Xenopus Dan, a member of the Dan gene family of BMP antagonists, is expressed in derivatives of the cranial and trunk neural crest. Mechanisms of development 107(1-2): 187-189.

68. Ekker, S.C., Ungar, A.R., Greenstein, P., Vonkessler, D.P., Porter, J.A., Moon, R.T., and Beachy, P.A. 1995. Patterning Activities of Vertebrate Hedgehog Proteins in the Developing Eye and Brain. Current Biology 5(8): 944-955.

69. Ernsberger, U. 2008. The role of GDNF family ligand signalling in the differentiation of sympathetic and dorsal root ganglion neurons. Cell and Tissue Research 333(3): 353-371.

70. Faure, S., Lee, M.A., Keller, T., ten Dijke, P., and Whitman, M. 2000. Endogenous patterns of TGFbeta superfamily signaling during early Xenopus development. Development (Cambridge, England) 127(13): 2917-2931.

71. Fekany-Lee, K., Gonzalez, E., Miller-Bertoglio, V., and Solnica-Krezel, L. 2000. The homeobox gene bozozok promotes anterior neuroectoderm formation in zebrafish through negative regulation of BMP2/4 and Wnt pathways. Development (Cambridge, England) 127(11): 2333-2345.

72. Feng, X.H. and Derynck, R. 2005. Specificity and versatility in tgf-beta signaling through Smads. Annual review of cell and developmental biology 21: 659-693.

73. Ferguson, E.L. and Anderson, K.V. 1992. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell 71(3): 451-461.

74. Fernandez, A.S., Pieau, C., Reperant, J., Boncinelli, E., and Wassef, M. 1998. Expression of the Emx-1 and Dlx-1 homeobox genes define three molecularly distinct domains in the telencephalon of mouse, chick, turtle and frog embryos: implications for the evolution of telencephalic subdivisions in amniotes. Development (Cambridge, England) 125(11): 2099-2111.

75. Finnerty, J.R., Pang, K., Burton, P., Paulson, D., and Martindale, M.Q. 2004. Origins of bilateral symmetry: Hox and dpp expression in a sea anemone. Science (New York, NY 304(5675): 1335-1337.

76. Fu, G. and Peng, C. 2011. Nodal enhances the activity of Fox03a and its synergistic interaction with Smads to regulate cyclin G2 transcription in ovarian cancer cells. Oncogene 30(37): 3953-3966.

77. Garcia Abreu, J., Coffmier, C., Larrain, J., Oelgeschlager, M., and De Robertis, E.M. 2002. Chordin-like CR domains and the regulation of evolutionarily conserved extracellular signaling systems. Gene 287(1-2): 39-47.

78. Gerhart, J., Pfautz, J., Neely, C., Elder, J., DuPrey, K., Menko, A.S., Knudsen, K., and George-Weinstein, M. 2009. Noggin producing, MyoD-positive cells are crucial for eye development. Developmental biology 336(1): 30-41.

79. Glinka, A., Delius, H., Blumenstock, C., and Niehrs, C. 1996. Combinatorial signalling by Xwnt-11 and Xnr3 in the organizer epithelium. Mechanisms of development 60(2): 221-231.

80. Glinka, A., Dolde, C., Kirsch, N., Huang, Y.L., Kazanskaya, O., Ingelfmger, D., Boutros, M., Cruciat, C.M., and Niehrs, C. 2011. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-Catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO reports 12(10): 1055-1061.

81. Glinka, A., Wu, W., Delius, H., Monaghan, A.P., Blumenstock, C., and Niehrs, C. 1998. Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction. Nature 391(6665): 357-362.

82. Glinka, A., Wu, W., Onichtchouk, D., Blumenstock, C., and Niehrs, C. 1997. Head induction by simultaneous repression of Bmp and Wnt signalling in Xenopus. Nature 389(6650): 517-519.

83. Godsave, S.F. and Slack, J.M. 1989. Clonal analysis of mesoderm induction in Xenopus laevis. Developmental biology 134(2): 486-490.

84. Gong, Y.Q., Krakow, D., Marcelino, J., Wilkin, D., Chitayat, D., Babul-Hirji, R., Hudgins, L., Cremers, C.W., Cremers, F.P.M., Brunner, H.G., Reinker, K., Rimoin, D.L., Cohn, D.H., Goodman, F.R., Reardon, W., Patton, M., Francomano, C.A., and Warman, M.L. 1999. Heterozygous mutations in the gene encoding noggin affect human joint morphogenesis. Nature genetics 21(3): 302-304.

85. Gordon, M.D. and Nusse, R. 2006. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. The Journal of biological chemistry 281(32): 2242922433.

86. Grande, C. and Patel, N.H. 2009. Nodal signalling is involved in left-right asymmetry in snails. Nature 457(7232): 1007-1011.

87. Gray, P.C., Harrison, C.A., and Vale, W. 2003. Cripto forms a complex with activin and type II activin receptors and can block activin signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100(9): 5193-5198.

88. Greenwald, J., Groppe, J., Gray, P., Wiater, E., Kwiatkowski, W., Vale, W., and Choe, S. 2003. The BMP7/ActRII extracellular domain complex provides new insights into the cooperative nature of receptor assembly. Molecular cell 11(3): 605-617.

89. Gritsman, K., Zhang, J.J., Cheng, S., Heckscher, E., Talbot, W.S., and Schier, A.F. 1999. The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling. Cell 97(1): 121132.

90. Groppe, J., Greenwald, J., Wiater, E., Rodriguez-Leon, J., Economides, A.N., Kwiatkowski, W., Affolter, M., Vale, W.W., Belmonte, J.C., and Choe, S. 2002. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature 420(6916): 636-642.

91. Grunz, H. and Tacke, L. 1989. Neural differentiation of Xenopus laevis ectoderm takes place after disaggregation and delayed reaggregation without inducer. Cell Differ Dev 28(3): 211-217.

92. Guzman-Ayala, M., Lee, K.L., Mavrakis, K.J., Goggolidou, P., Norris, D.P., and Episkopou, V. 2009. Graded Smad2/3 activation is converted directly into levels of target gene expression in embryonic stem cells. PloS one 4(1): e4268.

93. Habas, R., Kato, Y., and He, X. 2001. Wnt/Frizzled activation of Rho regulates vertebrate gastrulation and requires a novel Formin homology protein Daaml. Cell 107(7): 843-854.

94. Hahn, S.A., Schutte, M., Hoque, A.T., Moskaluk, C.A., da Costa, L.T., Rozenblum, E., Weinstein, C.L., Fischer, A., Yeo, C.J., Hruban, R.H., and Kern, S.E. 1996. DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science (New York, NY 271(5247): 350-353.

95. Hall, A. 1998. Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science (New York, NY 279(5350): 509-514.

96. Hannon, G.J. and Beach, D. 1994. pl5INK4B is a potential effector of TGF-beta-induced cell cycle arrest. Nature 371(6494): 257-261.

97. Haramoto, Y., Takahashi, S., and Asashima, M. 2006. Two distinct domains in proregion of Nodal-related 3 are essential for BMP inhibition. Biochemical and biophysical research communications 346(2): 470-478.

98. Haramoto, Y., Tanegashima, K., Onuma, Y., Takahashi, S., Sekizaki, H., and Asashima, M. 2004. Xenopus tropicalis nodal-related gene 3 regulates BMP signaling: an essential role for the pro-region. Developmental biology 265(1): 155-168.

99. Haremaki, T., Tanaka, Y., Hongo, I., Yuge, M., and Okamoto, H. 2003. Integration of multiple signal transducing pathways on Fgf response elements of the Xenopus caudal homologue Xcad3. Development (Cambridge, England) 130(20): 4907-4917.

100. Harrington, A.E., Morris-Triggs, S.A., Ruotolo, B.T., Robinson, C.V., Ohnuma, S., and Hyvonen, M. 2006. Structural basis for the inhibition of activin signalling by follistatin. The EMBO journal 25(5): 1035-1045.

101. Hassler, C., Cruciat, C.M., Huang, Y.L., Kuriyama, S., Mayor, R., and Niehrs, C. 2007. Kremen is required for neural crest induction in Xenopus and promotes LRP6-mediated Wnt signaling. Development (Cambridge, England) 134(23): 4255-4263.

102. He, X., Semenov, M., Tamai, K., and Zeng, X. 2004. LDL receptor-related proteins 5 and 6 in Wnt/beta-Catenin signaling: arrows point the way. Development (Cambridge, England) 131(8): 1663-1677.

103. Heisenberg, C.P., Tada, M., Rauch, G.J., Saude, L., Concha, M.L., Geisler, R., Stemple, D.L., Smith, J.C., and Wilson, S.W. 2000. Silberblick/Wntll mediates convergent extension movements during zebrafish gastrulation. Nature 405(6782): 76-81.

104. Hemmati-Brivanlou, A., Kelly, O.G., and Melton, D.A. 1994. Follistatin, an antagonist of activin, is expressed in the Spemann organizer and displays direct neuralizing activity. Cell 77(2): 283-295.

105. Hemmati-Brivanlou, A. and Melton, D.A. 1992. A truncated activin receptor inhibits mesoderm induction and formation of axial structures in Xenopus embryos. Nature 359(6396): 609-614.

106. -. 1994. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell 77(2): 273-281.

107. Henry, J.Q., Perry, K.J., and Martindale, M.Q. 2010. beta-Catenin and Early Development in the Gastropod, Crepidula fomicata. Integrative and Comparative Biology 50(5): 707-719.

108. Henry, J.Q., Perry, K.J., Wever, J., Seaver, E., and Martindale, M.Q. 2008. beta-Catenin is required for the establishment of vegetal embryonic fates in the nemertean, Cerebratulus lacteus. Developmental biology 317(1): 368-379.

109. Herz, J. and Marschang, P. 2003. Coaxing the LDL receptor family into the fold. Cell 112(3): 289-292.

110. Hill, J.J., Davies, M.V., Pearson, A.A., Wang, J.H., Hewick, R.M., Wolfman, N.M., and Qiu, Y. 2002. The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. The Journal of biological chemistry 277(43): 40735-40741.

111. Hirota, M., Watanabe, K., Hamada, S., Sun, Y., Strizzi, L., Mancino, M., Nagaoka, T., Gonzales, M., Seno, M., Bianco, C., and Salomon, D.S. 2008. Smad2 functions as a co-activator of canonical Wnt/beta-Catenin signaling pathway independent of Smad4 through histone acetyltransferase activity of p300. Cellular signalling 20(9): 1632-1641.

112. Hobmayer, B., Rentzsch, F., and Holstein, T.W. 2001. Identification and expression of HySmadl, a member of the R-Smad family of TGFbeta signal transducers, in the diploblastic metazoan Hydra. Development genes and evolution 211(12): 597-602.

113. Hobmayer, B., Rentzsch, F., Kuhn, K., Happel, C.M., von Laue, C.C., Snyder, P., Rothbacher, U., and Holstein, T.W. 2000. WNT signalling molecules act in axis formation in the diploblastic metazoan Hydra. Nature 407(6801): 186-189.

114. Hogan, B.L. 1996. Bone morphogenetic proteins in development. Current opinion in genetics & development 6(4): 432-438.

115. Hsieh, J.C., Kodjabachian, L., Rebbert, M.L., Rattner, A., Smallwood, P.M., Samos, C.H., Nusse, R., Dawid, I.B., and Nathans, J. 1999. A new secreted protein that binds to Wnt proteins and inhibits their activities. Nature 398(6726): 431-436.

116. Hsieh, J.C., Lee, L., Zhang, L., Wefer, S., Brown, K., DeRossi, C., Wines, M.E., Rosenquist, T., and Holdener, B.C. 2003. Mesd encodes an LRP5/6 chaperone essential for specification of mouse embryonic polarity. Cell 112(3): 355-367.

117. Hsu, D.R., Economides, A.N., Wang, X., Eimon, P.M., and Harland, R.M. 1998. The Xenopus dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular cell 1(5): 673-683.

118. Hwang, C.H., Guo, D.Y., Harris, M.A., Howard, O., Mishina, Y., Gan, L., Harris, S.E., and Wu, D.K. 2010. Role of Bone Morphogenetic Proteins on Cochlear Hair Cell Formation: Analyses of Noggin and Bmp2 Mutant Mice. Developmental Dynamics 239(2): 505-513.

119. Iemura, S., Yamamoto, T.S., Takagi, C., Uchiyama, H., Natsume, T., Shimasaki, S., Sugino, H., and Ueno, N. 1998. Direct binding of follistatin to a complex of bone-morphogenetic protein and its receptor inhibits ventral and epidermal cell fates in early Xenopus embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(16): 9337-9342.

120. Iida, J., Ishizaki, H., Okamoto-Tanaka, M., Kawata, A., Sumita, K., Ohgake, S., Sato, Y., Yorifuji, H., Nukina, N., Ohashi, K., Mizuno, K., Tsutsumi, T., Mizoguchi, A., Miyoshi, J., Takai, Y., and Hata, Y. 2007. Synaptic scaffolding molecule alpha is a scaffold to mediate N-methyl-D-aspartate receptor-dependent RhoA activation in dendrites. Molecular and cellular biology 27(12): 4388-4405.

121. Itoh, F., Asao, H., Sugamura, K., Heldin, C.H., ten Dijke, P., and Itoh, S. 2001. Promoting bone morphogenetic protein signaling through negative regulation of inhibitory Smads. The EMBO journal 20(15): 4132-4142.

122. Jones, C.M., Kuehn, M.R., Hogan, B.L., Smith, J.C., and Wright, C.N. 1995. Nodal-related signals induce axial mesoderm and dorsalize mesoderm during gastrulation. Development (Cambridge, England) 121(11): 3651-3662.

123. Kahlem, P. and Newfeld, S.J. 2009. Informatics approaches to understanding TGFbeta pathway regulation. Development (Cambridge, England) 136(22): 3729-3740.

124. Kaji, T. and Artinger, K.B. 2004. dlx3b and dlx4b function in the development of Rohon-Beard sensory neurons and trigeminal placode in the zebrafish neurula. Developmental biology 276(2): 523-540.

125. Khadka, D., Luo, T., and Sargent, T.D. 2006. Msxl and Msx2 have shared essential functions in neural crest but may be dispensable in epidermis and axis formation in Xenopus. The International journal of developmental biology 50(5): 499-502.

126. Kim, H., Cheong, S.M., Ryu, J., Jung, H.J., Jho, E.H., and Han, J.K. 2009. Xenopus Wntless and the retromer complex cooperate to regulate XWnt4 secretion. Molecular and cellular biology 29(8): 2118-2128.

127. Kirsch, T., Sebald, W., and Dreyer, M.K. 2000. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat Struct Biol 7(6): 492-496.

128. Klingensmith, J., Ang, S.L., Bachiller, D., and Rossant, J. 1999. Neural induction and patterning in the mouse in the absence of the node and its derivatives. Developmental biology 216(2): 535-549.

129. Knecht, A.K. and Harland, R.M. 1997. Mechanisms of dorsal-ventral patterning in noggin-induced neural tissue. Development (Cambridge, England) 124(12): 24772488.

130. Komekado, H., Yamamoto, H., Chiba, T., and Kikuchi, A. 2007. Glycosylation and palmitoylation of Wnt-3a are coupled to produce an active form of Wnt-3a. Genes Cells 12(4): 521-534.

131. Komiya, Y. and Habas, R. 2008. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis 4(2): 68-75.

132. Kondo, M., Cubillo, E., Tobiume, K., Shirakihara, T., Fukuda, N., Suzuki, H., Shimizu, K., Takehara, K., Cano, A., Saitoh, M., and Miyazono, K. 2004. A role for Id in the regulation of TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transdifferentiation. Cell death and differentiation 11(10): 1092-1101.

133. Korkut, C., Ataman, B., Ramachandran, P., Ashley, J., Barria, R., Gherbesi, N., and Budnik, V. 2009. Trans-synaptic transmission of vesicular Wnt signals through Evi/Wntless. Cell 139(2): 393-404.

134. Kowanetz, M., Valcourt, U., Bergstrom, R., Heldin, C.H., and Moustakas, A.

2004. Id2 and Id3 define the potency of cell proliferation and differentiation responses to transforming growth factor beta and bone morphogenetic protein. Molecular and cellular biology 24(10): 4241-4254.

135. Kumburegama, S., Wijesena, N., Xu, R., and Wikramanayake, A.H. 2011. Strabismus-mediated primary archenteron invagination is uncoupled from Wnt/beta-Catenin-dependent endoderm cell fate specification in Nematostella vectensis (Anthozoa, Cnidaria): Implications for the evolution of gastrulation. EvoDevo 2(1): 2.

136. Kurayoshi, M., Yamamoto, H., Izumi, S., and Kikuchi, A. 2007. Post-translational palmitoylation and glycosylation of Wnt-5a are necessary for its signalling. The Biochemical journal 402(3): 515-523.

137. Kurisaki, A., Inoue, I., Kurisaki, K., Yamakawa, N., Tsuchida, K., and Sugino, H. 2008. Activin induces long-lasting N-methyl-D-aspartate receptor activation via scaffolding PDZ protein activin receptor interacting protein 1. Neuroscience 151(4): 1225-1235.

138. Kuro-o, M., Matsumura, Y., Aizawa, H., Kawaguchi, H., Suga, T., Utsugi, T., Ohyama, Y., Kurabayashi, M., Kaname, T., Kume, E., Iwasaki, H., Iida, A., Shiraki-Iida, T., Nishikawa, S., Nagai, R., and Nabeshima, Y.I. 1997. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature 390(6655): 45-51.

139. Kuroda, H., Wessely, O., and De Robertis, E.M. 2004. Neural induction in Xenopus: requirement for ectodermal and endomesodermal signals via Chordin, Noggin, beta-Catenin, and Cerberus. PLoS Biol 2(5): E92.

140. Kurth, T. 2005. A cell cycle arrest is necessary for bottle cell formation in the early Xenopus gastrula: integrating cell shape change, local mitotic control and mesodermal patterning. Mechanisms of development 122(12): 1251-1265.

141. Kusserow, A., Pang, K., Sturm, C., Hrouda, M., Lentfer, J., Schmidt, H.A., Technau, U., von Haeseler, A., Hobmayer, B., Martindale, M.Q., and Holstein, T.W.

2005. Unexpected complexity of the Wnt gene family in a sea anemone. Nature 433(7022): 156-160.

142. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(5259): 680-685.

143. Laiho, M., DeCaprio, J.A., Ludlow, J.W., Livingston, D.M., and Massague, J. 1990. Growth inhibition by TGF-beta linked to suppression of retinoblastoma protein phosphorylation. Cell 62(1): 175-185.

144. Laitinen, M., Jortikka, L., Halttunen, T., Nevalainen, J., Aho, A.J., Marttinen, A., and Lindholm, T.S. 1997. Measurement of total and local bone morphogenetic protein concentration in bone tumours. International orthopaedics 21(3): 188-193.

145. Lamb, T.M., Knecht, A.K., Smith, W.C., Stachel, S.E., Economides, A.N., Stahl, N., Yancopolous, G.D., and Harland, R.M. 1993. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science (New York, AT262(5134): 713-718.

146. Lan, L., Vitobello, A., Bertacchi, M., Cremisi, F., Vignali, R., Andreazzoli, M., Demontis, G.C., Barsacchi, G., and Casarosa, S. 2009. Noggin elicits retinal fate in Xenopus animal cap embryonic stem cells. Stem cells (Dayton, Ohio) 27(9): 2146-2152.

147. Larrain, J., Bachiller, D., Lu, B., Agius, E., Piccolo, S., and De Robertis, E.M. 2000. BMP-binding modules in chordin: a model for signalling regulation in the extracellular space. Development (Cambridge, England) 127(4): 821-830.

148. Lawrence, P.A. and Shelton, P.M. 1975. The determination of polarity in the developing insect retina. Journal of embryology and experimental morphology 33(2): 471-486.

149. Le Good, J.A., Joubin, K., Giraldez, A.J., Ben-Haim, N., Beck, S., Chen, Y., Schier, A.F., and Constam, D.B. 2005. Nodal stability determines signaling range. Current Biology 15(1): 31-36.

150. Lengfeld, T., Watanabe, H., Simakov, O., Lindgens, D., Gee, L., Law, L., Schmidt, H.A., Ozbek, S., Bode, H., and Holstein, T.W. 2009. Multiple Wnts are involved in Hydra organizer formation and regeneration. Developmental biology 330(1): 186-199.

151. Levi, G., Mantero, S., Barbieri, O., Cantatore, D., Paleari, L., Beverdam, A., Genova, F., Robert, B., and Merlo, G.R. 2006. Msxl and Dlx5 act independently in development of craniofacial skeleton, but converge on the regulation of Bmp signaling in palate formation. Mechanisms of development 123(1): 3-16.

152. Lewis, K.A., Gray, P.C., Blount, A.L., MacConell, L.A., Wiater, E., Bilezikjian, L.M., and Vale, W. 2000. Betaglycan binds inhibin and can mediate functional antagonism of activin signalling. Nature 404(6776): 411-414.

153. Li, L., Hutchins, B.I., and Kalil, K. 2010. Wnt5a Induces Simultaneous Cortical Axon Outgrowth and Repulsive Turning Through Distinct Signaling Mechanisms. Science signaling 3(147).

154. Li, Y., Chen, J., Lu, W., McCormick, L.M., Wang, J., and Bu, G. 2005. Mesd binds to mature LDL-receptor-related protein-6 and antagonizes ligand binding. Journal of cell science 118(Pt 22): 5305-5314.

155. Liang, H., Chen, Q., Coles, A.H., Anderson, S.J., Pihan, G., Bradley, A., Gerstein, R., Jurecic, R., and Jones, S.N. 2003. Wnt5a inhibits B cell proliferation and functions as a tumor suppressor in hematopoietic tissue. Cancer Cell 4(5): 349-360.

156. Lin, X., Duan, X., Liang, Y.Y., Su, Y., Wrighton, K.H., Long, J., Hu, M., Davis, C.M., Wang, J., Brunicardi, F.C., Shi, Y., Chen, Y.G., Meng, A., and Feng, X.H. 2006. PPM1A functions as a Smad phosphatase to terminate TGFbeta signaling. Cell 125(5): 915-928.

157. Liu, H., Fergusson, M.M., Castilho, R.M., Liu, J., Cao, L., Chen, J., Malide, D., Rovira, II, Schimel, D., Kuo, C.J., Gutkind, J.S., Hwang, P.M., and Finkel, T. 2007. Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging. Science (New York, NY317(5839): 803-806.

158. Liu, P., Yang, J.B., Pei, J., Pei, D.Q., and Wilson, M.J. 2010. Regulation of MT1-MMP Activity by beta-Catenin in MDCK Non-Cancer and HT1080 Cancer Cells. Journal of Cellular Physiology 225(3): 810-821.

159. Liu, Z.H., Tsuchida, K., Matsuzaki, T., Bao, Y.L., Kurisaki, A., and Sugino, H. 2006. Characterization of isoforms of activin receptor-interacting protein 2 that augment activin signaling. The Journal of endocrinology 189(2): 409-421.

160. Logan, C.Y., Miller, J.R., Ferkowicz, M.J., and McClay, D.R. 1999. Nuclear beta-Catenin is required to specify vegetal cell fates in the sea urchin embryo. Development (Cambridge, England) 126(2): 345-357.

161. Lopez-Rios, J., Esteve, P., Ruiz, J.M., and Bovolenta, P. 2008. The Netrin-related domain of Sfrpl interacts with Wnt ligands and antagonizes their activity in the anterior neural plate. Neural development 3: 19.

162. Lu, W., Yamamoto, V., Ortega, B., and Baltimore, D. 2004. Mammalian Ryk is a Wnt coreceptor required for stimulation of neurite outgrowth. Cell 119(1): 97-108.

163. Lu, W.Y., Liu, C.C., Thottassery, J.V., Bu, G.J., and Li, Y.H. 2010. Mesd Is a Universal Inhibitor of Wnt Coreceptors LRP5 and LRP6 and Blocks Wnt/beta-Catenin Signaling in Cancer Cells. Biochemistry 49(22): 4635-4643.

164. Luxardi, G., Marchal, L., Thome, V., and Kodjabachian, L. 2010. Distinct Xenopus Nodal ligands sequentially induce mesendoderm and control gastrulation movements in parallel to the Wnt/PCP pathway. Development (Cambridge, England) 137(3): 417-426.

165. Lyuksyutova, A.I., Lu, C.C., Milanesio, N., King, L.A., Guo, N., Wang, Y., Nathans, J., Tessier-Lavigne, M., and Zou, Y. 2003. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science (New York, NY 302(5652): 19841988.

166. MacDonald, B.T., Tamai, K., and He, X. 2009. Wnt/beta-Catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental cell 17(1): 9-26.

167. Macdonald, R., Barth, K.A., Xu, Q.L., Holder, N., Mikkola, I., and Wilson, S.W. 1995. Midline Signaling Is Required for Pax Gene-Regulation and Patterning of the Eyes. Development (Cambridge, England) 121(10): 3267-3278.

168. Maeno, M. 2003. Regulatory signals and tissue interactions in the early hematopoietic cell differentiation in Xenopus laevis embryo. Zoolog Sci 20(8): 939-946.

169. Mao, B. and Niehrs, C. 2003. Kremen2 modulates Dickkopf2 activity during Wnt/LRP6 signaling. Gene 302(1-2): 179-183.

170. Marcelino, J., Sciortino, C.M., Romero, M.F., Ulatowski, L.M., Ballock, R.T., Economides, A.N., Eimon, P.M., Harland, R.M., and Warman, M.L. 2001. Human disease-causing NOG missense mutations: Effects on noggin secretion, dimer formation, and bone morphogenetic protein binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98(20): 11353-11358.

171. Martin, B.L. and Kimelman, D. 2009. Wnt Signaling and the Evolution of Embryonic Posterior Development. Current Biology 19(5): R215-R219.

172. Martindale, M.Q. and Hejnol, A. 2009. A Developmental Perspective: Changes in the Position of the Blastopore during Bilaterian Evolution. Developmental cell 17(2): 162-174.

173. Massague, J. and Gomis, R.R. 2006. The logic of TGFbeta signaling. FEBS Lett 580(12): 2811-2820.

174. Mathews, L.S. and Vale, W.W. 1991. Expression cloning of an activin receptor, a predicted transmembrane serine kinase. Cell 65(6): 973-982.

175. Matus, D.Q., Pang, K., Marlow, H., Dunn, C.W., Thomsen, G.H., and Martindale, M.Q. 2006. Molecular evidence for deep evolutionary roots of bilaterality in animal development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(30): 11195-11200.

176. Matzuk, M.M., Lu, N., Vogel, H., Sellheyer, K., Roop, D.R., and Bradley, A. 1995. Multiple defects and perinatal death in mice deficient in follistatin. Nature 374(6520): 360-363.

177. McMahon, J.A., Takada, S., Zimmerman, L.B., Fan, C.M., Harland, R.M., and McMahon, A.P. 1998. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes & development 12(10): 14381452.

178. Meno, C., Ito, Y., Saijoh, Y., Matsuda, Y., Tashiro, K., Kuhara, S., and Hamada, H. 1997. Two closely-related left-right asymmetrically expressed genes, lefty-1 and lefty-2: their distinct expression domains, chromosomal linkage and direct neuralizing activity in Xenopus embryos. Genes Cells 2(8): 513-524.

179. Merino, R., Ganan, Y., Macias, D., Rodriguez-Leon, J., and Hurle, J.M. 1999a. Bone morphogenetic proteins regulate interdigital cell death in the avian embryo. Annals of the New York Academy of Sciences 887: 120-132.

180. Merino, R., Rodriguez-Leon, J., Macias, D., Ganan, Y., Economides, A.N., and Hurle, J.M. 1999b. The BMP antagonist Gremlin regulates outgrowth, chondrogenesis and programmed cell death in the developing limb. Development (Cambridge, England) 126(23): 5515-5522.

181. Miller, J.R., Rowning, B.A., Larabell, C.A., Yang-Snyder, J.A., Bates, R.L., and Moon, R.T. 1999. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of Dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology 146(2): 427-437.

182. Minabe-Saegusa, C., Saegusa, H., Tsukahara, M., and Noguchi, S. 1998. Sequence and expression of a novel mouse gene PRDC (protein related to DAN and cerberus) identified by a gene trap approach. Development, growth & differentiation 40(3): 343-353.

183. Mine, N., Anderson, R.M., and Klingensmith, J. 2008. BMP antagonism is required in both the node and lateral plate mesoderm for mammalian left-right axis establishment. Development (Cambridge, England) 135(14): 2425-2434.

184. Moos, M., Jr., Wang, S., and Krinks, M. 1995. Anti-dorsalizing morphogenetic protein is a novel TGF-beta homolog expressed in the Spemann organizer. Development (Cambridge, England) 121(12): 4293-4301.

185. Moriya, N., Komazaki, S., and Asashima, M. 2000. In vitro organogenesis of pancreas in Xenopus laevis dorsal lips treated with retinoic acid. Development, growth & differentiation 42(2): 175-185.

186. Moriya, N., Uchiyama, H., and Asashima, M. 1993. Induction of Pronephric Tubules by Activin and Retinoic Acid in Presumptive Ectoderm of Xenopus-Laevis. Development Growth & Differentiation 35(2): 123-128.

187. Mukhopadhyay, M., Shtrom, S., Rodriguez-Esteban, C., Chen, L., Tsukui, T., Gomer, L., Dorward, D.W., Glinka, A., Grinberg, A., Huang, S.P., Niehrs, C., Izpisua Belmonte, J.C., and Westphal, H. 2001. Dickkopfl is required for embryonic head induction and limb morphogenesis in the mouse. Developmental cell 1(3): 423-434.

188. Muller, F., Albert, S., Blader, P., Fischer, N., Hallonet, M., and Strahle, U. 2000. Direct action of the Nodal-related signal Cyclops in induction of sonic hedgehog in the ventral midline of the CNS. Development (Cambridge, England) 127(18): 3889-3897.

189. Munoz-Sanjuan, I. and A, H.B. 2001. Early posterior/ventral fate specification in the vertebrate embryo. Developmental biology 237(1): 1-17.

190. Nakamura, R.E., Hunter, D.D., Yi, H., Brunken, W.J., and Hackam, A.S. 2007. Identification of two novel activities of the Wnt signaling regulator Dickkopf 3 and characterization of its expression in the mouse retina. BMC cell biology 8: 52.

191. Nakano, A., Koinuma, D., Miyazawa, K., Uchida, T., Saitoh, M., Kawabata, M., Hanai, J., Akiyama, H., Abe, M., Miyazono, K., Matsumoto, T., and Imamura, T. 2009. Pinl down-regulates transforming growth factor-beta (TGF-beta) signaling by inducing degradation of Smad proteins. The Journal of biological chemistry 284(10): 6109-6115.

192. Nakao, A., Afrakhte, M., Moren, A., Nakayama, T., Christian, J.L., Heuchel, R., Itoh, S., Kawabata, M., Heldin, N.E., Heldin, C.H., and ten Dijke, P. 1997. Identification of Smad7, a TGFbeta-inducible antagonist of TGF-beta signalling. Nature 389(6651): 631-635.

193. Nakayama, N., Han, C.E., Scully, S., Nishinakamura, R., He, C., Zeni, L., Yamane, H., Chang, D., Yu, D., Yokota, T., and Wen, D. 2001. A novel chordin-like protein inhibitor for bone morphogenetic proteins expressed preferentially in mesenchymal cell lineages. Developmental biology 232(2): 372-387.

194. Niehrs, C. 2010. On growth and form: a Cartesian coordinate system of Wnt and BMP signaling specifies bilaterian body axes. Development (Cambridge, England) 137(6): 845-857.

195. Nieuwkoop, P.D. 1999. The neural induction process; its morphogenetic aspects. The International journal of developmental biology 43(7): 615-623.

196. Nusse, R., van Ooyen, A., Cox, D., Fung, Y.K., and Varmus, H. 1984. Mode of proviral activation of a putative mammary oncogene (int-1) on mouse chromosome 15. Nature 307(5947): 131-136.

197. Nusse, R. and Varmus, H.E. 1982. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell 31(1): 99-109.

198. Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., and De Robertis, E.M. 2003. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell 4(2): 219-230.

199. Ohyama, Y., Nifuji, A., Maeda, Y., Amagasa, T„ and Noda, M. 2004. Spaciotemporal association and bone morphogenetic protein regulation of sclerostin and osterix expression during embryonic osteogenesis. Endocrinology 145(10): 4685-4692.

200. Okabayashi, K. and Asashima, M. 2003. Tissue generation from amphibian animal caps. Current opinion in genetics & development 13(5): 502-507.

201. Oliverio, M., Digilio, M.C., Versacci, P., Dallapiccola, B., and Marino, B. Shells and heart: are human laterality and chirality of snails controlled by the same maternal genes? American journal of medical genetics 152A(10): 2419-2425.

202. Onai, T., Yu, J.K., Blitz, I.L., Cho, K.W.Y., and Holland, L.Z. 2010. Opposing Nodal/Vgl and BMP signals mediate axial patterning in embryos of the basal chordate amphioxus. Developmental biology 344(1): 377-389.

203. Onichtchouk, D., Chen, Y.G., Dosch, R., Gawantka, V., Delius, H., Massague, J., and Niehrs, C. 1999. Silencing of TGF-beta signalling by the pseudoreceptor BAMBI. Nature 401(6752): 480-485.

204. Ozaki, T. and Sakiyama, S. 1993. Molecular cloning and characterization of a cDNA showing negative regulation in v-src-transformed 3Y1 rat fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(7): 2593-2597.

205. Paina, S., Garzotto, D., DeMarchis, S., Marino, M., Moiana, A., Conti, L., Cattaneo, E., Perera, M., Corte, G., Calautti, E., and Merlo, G.R. 2011. Wnt5a Is a Transcriptional Target of Dlx Homeogenes and Promotes Differentiation of Interneuron Progenitors In Vitro and In Vivo. Journal ofNeuroscience 31(7): 2675-2687.

206. Paine-Saunders, S., Viviano, B.L., Economides, A.N., and Saunders, S. 2002. Heparan sulfate proteoglycans retain Noggin at the cell surface: a potential mechanism for shaping bone morphogenetic protein gradients. The Journal of biological chemistry 277(3): 2089-2096.

207. Pang, K., Ryan, J.F., Baxevanis, A.D., and Martindale, M.Q. 2011. Evolution of the TGF-beta Signaling Pathway and Its Potential Role in the Ctenophore, Mnemiopsis leidyi. PloS one 6(9).

208. Papalopulu, N. and Kintner, C. 1993. Xenopus Distal-less related homeobox genes are expressed in the developing forebrain and are induced by planar signals. Development (Cambridge, England) 117(3): 961-975.

209. Pearce, J.J., Penny, G., and Rossant, J. 1999. A mouse cerberus/Dan-related gene family. Developmental biology 209(1): 98-110.

210. Peinado, H., Portillo, F., and Cano, A. 2004. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis. The International journal of developmental biology 48(5-6): 365-375.

211. Pentek, J., Parker, L., Wu, A., and Arora, K. 2009. Follistatin preferentially antagonizes activin rather than BMP signaling in Drosophila. Genesis 47(4): 261-273.

212. Perea-Gomez, A., Vella, F.D., Shawlot, W., Oulad-Abdelghani, M., Chazaud, C., Meno, C., Pfister, V., Chen, L., Robertson, E., Hamada, H., Behringer, R.R., and Ang,

S.L. 2002. Nodal antagonists in the anterior visceral endoderm prevent the formation of multiple primitive streaks. Developmental cell 3(5): 745-756.

213. Perlman, R., Schiemann, W.P., Brooks, M.W., Lodish, H.F., and Weinberg, R.A. 2001. TGF-beta-induced apoptosis is mediated by the adapter protein Daxx that facilitates JNK activation. Nature cell biology 3(8): 708-714.

214. Piccolo, S., Agius, E., Leyns, L., Bhattacharyya, S., Grunz, H., Bouwmeester, T., and De Robertis, E.M. 1999. The head inducer Cerberus is a multifunctional antagonist of Nodal, BMP and Wnt signals. Nature 397(6721): 707-710.

215. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., and De Robertis, E.M. 1996. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell 86(4): 589-598.

216. Pietenpol, J.A., Holt, J.T., Stein, R.W., and Moses, H.L. 1990. Transforming growth factor beta 1 suppression of c-myc gene transcription: role in inhibition of keratinocyte proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87(10): 3758-3762.

217. Polakis, P. 1997. The adenomatous polyposis coli (APC) tumor suppressor. Biochim Biophys Acta 1332(3): F127-147.

218. Raida, M„ Sarbia, M., Clement, J.H., Adam, S., Gabbert, H.E., and Hoffken, K. 1999. Expression, regulation and clinical significance of bone morphogenetic protein 6 in esophageal squamous-cell carcinoma. International journal of cancer 83(1): 38-44.

219. Reber-Muller, S., Streitwolf-Engel, R, Yanze, N., Schmid, V., Stierwald, M., Erb, M., and Seipel, K. 2006. BMP2/4 and BMP5-8 in jellyfish development and transdifferentiation. The International journal of developmental biology 50(4): 377-384.

220. Reese, D.E., Hall, C.E., and Mikawa, T. 2004. Negative regulation of midline vascular development by the notochord. Developmental cell 6(5): 699-708.

221. Reinhardt, B., Broun, M., Blitz, I.L., and Bode, H.R. 2004. HyBMP5-8b, a BMP5-8 orthologue, acts during axial patterning and tentacle formation in hydra. Developmental biology 267(1): 43-59.

222. Rentzsch, F., Guder, C., Vocke, D., Hobmayer, B., and Holstein, T.W. 2007. An ancient chordin-like gene in organizer formation of Hydra. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104(9): 3249-3254.

223. Reversade, B. and De Robertis, E.M. 2005. Regulation of ADMP and BMP2/4/7 at opposite embryonic poles generates a self-regulating morphogenetic field. Cell 123(6): 1147-1160.

224. Roberts, A.B., Anzano, M.A., Wakefield, L.M., Roche, N.S., Stern, D.F., and Sporn, M.B. 1985. Type beta transforming growth factor: a bifunctional regulator of cellular growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82(1): 119-123.

225. Roberts, A.B., Lamb, L.C., Newton, D.L., Sporn, M.B., De Larco, J.E., and Todaro, G.J. 1980. Transforming growth factors: isolation of polypeptides from virally and chemically transformed cells by acid/ethanol extraction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77(6): 3494-3498.

226. Rogers, C.D., Archer, T.C., Cunningham, D.D., Grammer, T.C., and Casey, E.M. 2008. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Developmental biology 313(1): 307-319.

227. Rogers, C.D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D.D., and Casey, E.S. 2009. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mechanisms of development 126(1-2): 42-55.

228. Saika, S., Ikeda, K., Yamanaka, O., Flanders, K.C., Ohnishi, Y., Nakajima, Y., Muragaki, Y., and Ooshima, A. 2006. Adenoviral gene transfer of BMP-7, Id2, or Id3

suppresses injury-induced epithelial-to-mesenchymal transition of lens epithelium in mice. American journal ofphysiology 290(1): C282-289.

229. Saina, M., Genikhovich, G., Renfer, E., and Technau, U. 2009. BMPs and chordin regulate patterning of the directive axis in a sea anemone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(44): 18592-18597.

230. Saka, Y. and Smith, J.C. 2007. A mechanism for the sharp transition of morphogen gradient interpretation in Xenopus. BMC developmental biology 7: 47.

231. Sander, V., Reversade, B., and De Robertis, E.M. 2007. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent 1/2 self-regulate Xenopus patterning. The EMBO journal 26(12): 2955-2965.

232. Sasal, Y., Lu, B., Steinbelsser, H., and De Robertis, E.M. 1995. Regulation of neural induction by the Chd and Bmp-4 antagonistic patterning signals in Xenopus. Nature 378(6555): 419.

233. Saudemont, A., Haillot, E., Mekpoh, F., Bessodes, N., Quirin, M., Lapraz, F., Duboc, V., Rottinger, E., Range, R, Oisel, A., Besnardeau, L., Wincker, P., and Lepage, T. 2010. Ancestral Regulatory Circuits Governing Ectoderm Patterning Downstream of Nodal and BMP2/4 Revealed by Gene Regulatory Network Analysis in an Echinoderm. PLoS genetics 6(12).

234. Saxen, L. and Toivonen, S. 1961. The two-gradient hypothesis in primary induction. The combined effect of two types of inductors mixed in different ratios. Journal of embryology and experimental morphology 9: 514-533.

235. Scandura, J.M., Boccuni, P., Massague, J., and Nimer, S.D. 2004. Transforming growth factor beta-induced cell cycle arrest of human hematopoietic cells requires p57KIP2 up-regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(42): 15231-15236.

236. Schier, A.F., Neuhauss, S.C., Harvey, M., Malicki, J., Solnica-Krezel, L., Stainier, D.Y., Zwartkruis, F., Abdelilah, S., Stemple, D.L., Rangini, Z., Yang, H., and Driever, W. 1996. Mutations affecting the development of the embryonic zebrafish brain. Development (Cambridge, England) 123: 165-178.

237. Schier, A.F. and Shen, M.M. 2000. Nodal signalling in vertebrate development. Nature 403(6768): 385-389.

238. Schneider, S., Steinbeisser, H., Warga, R.M., and Hausen, P. 1996. beta-Catenin translocation into nuclei demarcates the dorsalizing centers in frog and fish embryos. Mechanisms of development 57(2): 191-198.

239. Schneider, S.Q. and Bowerman, B. 2007. beta-Catenin asymmetries after all animal/vegetal-oriented cell divisions in Platynereis dumerilli embryos mediate binary cell-fate specification. Developmental cell 13(1): 73-86.

240. Schulte-Merker, S., Lee, K.J., McMahon, A.P., and Hammerschmidt, M. 1997. The zebrafish organizer requires chordino. Nature 387(6636): 862-863.

241. Schwarte-Waldhoff, I., Volpert, O.V., Bouck, N.P., Sipos, B., Hahn, S.A., Klein-Scory, S., Luttges, J., Kloppel, G., Graeven, U., Eilert-Micus, C., Hintelmann, A., and Schmiegel, W. 2000. Smad4/DPC4-mediated tumor suppression through suppression of angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(17): 9624-9629.

242. Sedohara, A., Komazaki, S., and Asashima, M. 2003. In vitro induction and transplantation of eye during early Xenopus development. Development, growth & differentiation 45(5-6): 463-471.

243. Semenov, M.V., Tamai, K., Brott, B.K., Kuhl, M., Sokol, S., and He, X. 2001. Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6. Curr Biol 11(12): 951961.

244. Sharma, R.P. and Chopra, V.L. 1976. Effect of the Wingless (wgl) mutation on wing and haltere development in Drosophila melanogaster. Developmental biology 48(2): 461-465.

245. Shen, M.M. 2007. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development (Cambridge, England) 134(6): 1023-1034.

246. Shen, M.M. and Schier, A.F. 2000. The EGF-CFC gene family in vertebrate development. Trends Genet 16(7): 303-309.

247. Shen, X., Li, J, Hu, P.P., Waddell, D„ Zhang, J., and Wang, X.F. 2001. The activity of guanine exchange factor NET1 is essential for transforming growth factor-beta-mediated stress fiber formation. The Journal of biological chemistry 276(18): 15362-15368.

248. Shiotsugu, J., Katsuyama, Y., Arima, K., Baxter, A., Koide, T., Song, J., Chandraratna, R.A.S., and Blumberg, B. 2004. Multiple points of interaction between retinoic acid and FGF signaling during embryonic axis formation. Development (Cambridge, England) 131(11): 2653-2667.

249. Shoji, H., Tsuchida, K., Kishi, H., Yamakawa, N., Matsuzaki, T., Liu, Z., Nakamura, T., and Sugino, H. 2000. Identification and characterization of a PDZ protein that interacts with activin type II receptors. The Journal of biological chemistry 275(8): 5485-5492.

250. Sive, H.L., Grainger, R. M., Harland, R. M. 1994. Early development ofXenopus laevis. Cold spring harbor.

251. Slack, J.M., Darlington, B.G., Gillespie, L.L., Godsave, S.F., Isaacs, H.V., and Paterno, G.D. 1989. The role of fibroblast growth factor in early Xenopus development. Development (Cambridge, England) 107 Suppl: 141-148.

252. Smith, W.C. and Harland, R.M. 1992. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell 70(5): 829-840.

253. Smith, W.C., Knecht, A.K., Wu, M., and Harland, R.M. 1993. Secreted noggin protein mimics the Spemann organizer in dorsalizing Xenopus mesoderm. Nature 361(6412): 547-549.

254. Sokol, S.Y. 2011. Maintaining embryonic stem cell pluripotency with Wnt signaling. Development (Cambridge, England) 138(20): 4341-4350.

255. Stanley, E., Biben, C., Kotecha, S., Fabri, L., Tajbakhsh, S., Wang, C.C., Hatzistavrou, T., Roberts, B., Drinkwater, C., Lah, M., Buckingham, M., Hilton, D., Nash, A., Mohun, T., and Harvey, R.P. 1998. DAN is a secreted glycoprotein related to Xenopus cerberus. Mechanisms of development 77(2): 173-184.

256. Steinmetz, P.R., Zelada-Gonzales, F., Burgtorf, C., Wittbrodt, J., and Arendt, D. 2007. Polychaete trunk neuroectoderm converges and extends by mediolateral cell intercalation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104(8): 2727-2732.

257. Surmann-Schmitt, C., Widmann, N., Dietz, U., Saeger, B., Eitzinger, N, Nakamura, Y., Rattel, M., Latham, R., Hartmann, C., von der Mark, H., Schett, G., von der Mark, K., and Stock, M. 2009. Wif-1 is expressed at cartilage-mesenchyme interfaces and impedes Wnt3a-mediated inhibition of chondrogenesis. Journal of cell science 122(Pt 20): 3627-3637.

258. Suzuki, A., Ueno, N., and Hemmati-Brivanlou, A. 1997. Xenopus msxl mediates epidermal induction and neural inhibition by BMP4. Development (Cambridge, England) 124(16): 3037-3044.

259. Suzuki, H., Watkins, D.N., Jair, K.W., Schuebel, K.E., Markowitz, S.D., Chen, W.D., Pretlow, T.P., Yang, B., Akiyama, Y., Van Engeland, M., Toyota, M., Tokino, T., Hinoda, Y., Imai, K., Herman, J.G., and Baylin, S.B. 2004. Epigenetic inactivation of

SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer. Nature genetics 36(4): 417-422.

260. Tada, M., Concha, M.L., and Heisenberg, C.P. 2002. Non-canonical Wnt signalling and regulation of gastrulation movements. Seminars in cell & developmental biology 13(3): 251-260.

261. Tanaka, K., Kitagawa, Y., and Kadowaki, T. 2002. Drosophila segment polarity gene product porcupine stimulates the posttranslational N-glycosylation of wingless in the endoplasmic reticulum. The Journal of biological chemistry 277(15): 12816-12823.

262. Ten Berge, D., Kurek, D., Blauwkamp, T., Koole, W., Maas, A., Eroglu, E., Siu, R.K., and Nusse, R. 2011. Embryonic stem cells require Wnt proteins to prevent differentiation to epiblast stem cells. Nature cell biology 13(9): 1070-U1088.

263. ten Dijke, P. and Arthur, H.M. 2007. Extracellular control of TGFbeta signalling in vascular development and disease. Nature reviews 8(11): 857-869.

264. ten Dijke, P., Krause, C., de Gorter, D.J., Lowik, C.W., and van Bezooijen, R.L. 2008. Osteocyte-derived sclerostin inhibits bone formation: its role in bone morphogenetic protein and Wnt signaling. The Journal of bone and joint surgery 90 Suppll: 31-35.

265. Thisse, B., Wright, C.V.E., and Thisse, C. 2000. Activin- and Nodal-related factors control antero-posterior patterning of the zebrafish embryo. Nature 403(6768): 425-428.

266. Thomsen, G.H. and Melton, D.A. 1993. Processed Vgl protein is an axial mesoderm inducer in Xenopus. Cell 74(3): 433-441.

267. Topol, L.Z., Bardot, B., Zhang, Q., Resau, J., Huillard, E., Marx, M., Calothy, G., and Blair, D.G. 2000a. Biosynthesis, post-translation modification, and functional characterization of Drm/Gremlin. The Journal of biological chemistry 275(12): 87858793.

268. Topol, L.Z., Marx, M., Laugier, D., Bogdanova, N.N., Boubnov, N.V., Clausen, P.A., Calothy, G., and Blair, D.G. 1997. Identification of drm, a novel gene whose expression is suppressed in transformed cells and which can inhibit growth of normal but not transformed cells in culture. Molecular and cellular biology 17(8): 4801-4810.

269. Topol, L.Z., Modi, W.S., Koochekpour, S., and Blair, D.G. 2000b. DRM/GREMLIN (CKTSF1B1) maps to human chromosome 15 and is highly expressed in adult and fetal brain. Cytogenetics and cell genetics 89(1-2): 79-84.

270. Tsuchida, K., Arai, K.Y., Kuramoto, Y., Yamakawa, N., Hasegawa, Y., and Sugino, H. 2000. Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-beta family. The Journal of biological chemistry 275(52): 40788-40796.

271. Tsuchida, K., Nakatani, M., Hitachi, K., Uezumi, A., Sunada, Y., Ageta, H., and Inokuchi, K. 2009. Activin signaling as an emerging target for therapeutic interventions. Cell Commun Signal 7: 15.

272. Tsuchida, K., Nakatani, M., Uezumi, A., Murakami, T., and Cui, X. 2008. Signal transduction pathway through activin receptors as a therapeutic target of musculoskeletal diseases and cancer. EndocrJ 55(1): 11-21.

273. Ulloa, F. and Marti, E. 2010. Wnt Won the War: Antagonistic Role of Wnt over Shh Controls Dorso-Ventral Patterning of the Vertebrate Neural Tube. Developmental Dynamics 239(1): 69-76.

274. Urist, M.R. 1965. Bone: formation by autoinduction. Science (New York, NY 150(698): 893-899.

275. Veverka, V., Henry, A.J., Slocombe, P.M., Ventom, A., Mulloy, B., Muskett, F.W., Muzylak, M., Greenslade, K., Moore, A., Zhang, L., Gong, J., Qian, X., Paszty, C., Taylor, R.J., Robinson, M.K., and Carr, M.D. 2009. Characterization of the structural

features and interactions of sclerostin: molecular insight into a key regulator of Wnt-mediatedbone formation. The Journal of biological chemistry 284(16): 10890-10900.

276. Villanueva, S., Glavic, A., Ruiz, P., and Mayor, R. 2002. Posteriorization by FGF, Wnt, and retinoic acid is required for neural crest induction. Developmental biology 241(2): 289-301.

277. Vonica, A., Weng, W., Gumbiner, B.M., and Venuti, J.M. 2000. TCF is the nuclear effector of the beta-Catenin signal that patterns the sea urchin animal-vegetal axis. Developmental biology 217(2): 230-243.

278. Wansleeben, C. and Meijlink, F. 2011. The Planar Cell Polarity Pathway in Vertebrate Development. Developmental Dynamics 240(3): 616-626.

279. Warren, S.M., Brunet, L.J., Harland, R.M., Economides, A.N., and Longaker, M.T. 2003. The BMP antagonist noggin regulates cranial suture fusion. Nature 422(6932): 625-629.

280. Watanabe, K. and Dai, X. 2011. A WNTer Revisit: New Faces of beta-Catenin and TCFs in Pluripotency. Science signaling 4(193).

281. Watanabe, Y., Itoh, S., Goto, T., Ohnishi, E., Inamitsu, M., Itoh, F., Satoh, K., Wiercinska, E., Yang, W.W., Shi, L., Tanaka, A., Nakano, N, Mommaas, A.M., Shibuya, H., ten Dijke, P., and Kato, M. 2010. TMEPAI, a Transmembrane TGF-beta-Inducible Protein, Sequesters Smad Proteins from Active Participation in TGF-beta Signaling. Molecular cell 37(1): 123-134.

282. Weaver, C., Farr, G.H., Pan, W.J., Rowning, B.A., Wang, J.Y., Mao, J.H., Wu, D.Q., Li, L., Larabell, C.A., and Kimelman, D. 2003. GBP binds kinesin light chain and translocates during cortical rotation in Xenopus eggs. Development (Cambridge, England) 130(22): 5425-5436.

283. Welt, C., Sidis, Y., Keutmann, H., and Schneyer, A. 2002. Activins, inhibins, and follistatins: from endocrinology to signaling. A paradigm for the new millennium. Experimental biology and medicine (Maywood, NJ 227(9): 724-752.

284. Wend, P., Holland, J.D., Ziebold, U., and Birchmeier, W. 2010. Wnt signaling in stem and cancer stem cells. Seminars in cell & developmental biology 21(8): 855-863.

285. Wessely, O., Agius, E., Oelgeschlager, M., Pera, E.M., and De Robertis, E.M. 2001. Neural induction in the absence of mesoderm: beta-Catenin-dependent expression of secreted BMP antagonists at the blastula stage in Xenopus. Developmental biology 234(1): 161-173.

286. Wikramanayake, A.H., Hong, M., Lee, P.N., Pang, K., Byrum, C.A., Bince, J.M., Xu, R.H., and Martindale, M.Q. 2003. An ancient role for nuclear beta-Catenin in the evolution of axial polarity and germ layer segregation. Nature 426(6965): 446-450.

287. Wikramanayake, A.H., Huang, L., Dayal, S., and Klein, W. 1998a. Wnt signaling is required for gastrulation and aboral ectoderm formation in the sea urchin embryo. Developmental biology 198(1): 182-182.

288. Wikramanayake, A.H., Huang, L., and Klein, W.H. 1998b. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(16): 9343-9348.

289. Wilson, P.A. and Hemmati-Brivanlou, A. 1995. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature 376(6538): 331-333.

290. -. 1997. Vertebrate neural induction: inducers, inhibitors, and a new synthesis. Neuron 18(5): 699-710.

291. Windsor, P.J. and Leys, S.P. 2010. Wnt signaling and induction in the sponge aquiferous system: evidence for an ancient origin of the organizer. Evolution & Development 12(5): 484-493.

292. Wu, J. and Mlodzik, M. 2008. The frizzled extracellular domain is a ligand for Van Gogh/Stbm during nonautonomous planar cell polarity signaling. Developmental cell 15(3): 462-469.

293. Xu, Q., Wang, Y., Dabdoub, A., Smallwood, P.M., Williams, J., Woods, C., Kelley, M.W., Jiang, L., Tasman, W., Zhang, K., and Nathans, J. 2004. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptorpair. Cell 116(6): 883-895.

294. Yamaguchi, T.P. 2001. Heads or tails: Wnts and anterior-posterior patterning. CurrBiol 11(17): R713-724.

295. Yamakawa, N., Tsuchida, K., and Sugino, H. 2002. The rasGAP-binding protein, Dok-1, mediates activin signaling via serine/threonine kinase receptors. The EMBO journal 21(7): 1684-1694.

296. Yamamoto, M., Beppu, H., Takaoka, K., Meno, C., Li, E., Miyazono, K., and Hamada, H. 2009. Antagonism between Smadl and Smad2 signaling determines the site of distal visceral endoderm formation in the mouse embryo. The Journal of cell biology 184(2): 323-334.

297. Yamamoto, M., Saijoh, Y., Perea-Gomez, A., Shawlot, W., Behringer, R.R., Ang, S.L., Hamada, H., and Meno, C. 2004. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature 428(6981): 387-392.

298. Yokota, C., Kofron, M., Zuck, M., Houston, D.W., Isaacs, H., Asashima, M., Wylie, C.C., and Heasman, J. 2003. A novel role for a nodal-related protein; Xnr3 regulates convergent extension movements via the FGF receptor. Development (Cambridge, England) 130(10): 2199-2212.

299. Zeisberg, M., Shah, A.A., and Kalluri, R. 2005. Bone morphogenic protein-7 induces mesenchymal to epithelial transition in adult renal fibroblasts and facilitates regeneration of injured kidney. The Journal of biological chemistry 280(9): 8094-8100.

300. Zeng, X., Huang, H., Tamai, K., Zhang, X., Harada, Y., Yokota, C., Almeida, K., Wang, J., Doble, B., Woodgett, J., Wynshaw-Boris, A., Hsieh, J.C., and He, X. 2008. Initiation of Wnt signaling: control of Wnt coreceptor Lrp6 phosphorylation/activation via frizzled, dishevelled and axin functions. Development (Cambridge, England) 135(2): 367-375.

301. Zhang, B., Abreu, J.G., Zhou, K., Chen, Y., Hu, Y., Zhou, T., He, X., and Ma, J.X. 2010. Blocking the Wnt pathway, a unifying mechanism for an angiogenic inhibitor in the serine proteinase inhibitor family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107(15): 6900-6905.

302. Zhang, Y., Chang, C., Gehling, D.J., Hemmati-Brivanlou, A., and Derynck, R. 2001. Regulation of Smad degradation and activity by Smurf2, an E3 ubiquitin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98(3): 974-979.

303. Zimmerman, L.B., De Jesus-Escobar, J.M., and Harland, R.M. 1996. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell 86(4): 599-606.

304. Zuniga, A., Haramis, A.P., McMahon, A.P., and Zeller, R. 1999. Signal relay by BMP antagonism controls the SHH/FGF4 feedback loop in vertebrate limb buds. Nature 401(6753): 598-602.

Переплетено «Цифровичок» [phone]; [phone] www.cfr.ru ; [e-mail]