Регуляция остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека с помощью молекул siРНК, направленных на ген киназы гликогенсинтазы-3β тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Галицына Елена Валерьевна

• Галицына Елена Валерьевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Галицына Елена Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сигнальные пути остеогенной дифференцировки

1.1.1. Основные сигнальные пути остеогенной дифференцировки

1.1.2. Индукторы остеогенной дифференцировки

1.2. Участие GSK3P в остеогенной дифференцировке и ее ингибирование

1.2.1. GSK30 - ингибитор путей остеогенной дифференцировки

1.2.2. Ингибиторы GSK30

1.3. Механизм РНК-интерференции

1.3.1. РНК-интерференция и разнообразие малых

интерферирующих РНК

1.3.2. Биогенез и механизм действия малых интерферирующих РНК

1.4. Применение искуственно синтезированных молекул микроРНК и siРНК

1.5. Нокдаун генов с помощью молекул siРНК

1.6. Доставка нулеиновых кислот

1.6.1. Особенности доставки б1РНК in vitro и in vivo

1.6.2. Модификации молекул siРНК

1.6.3. Системы доставки нуклеиновых кислот

1.7. Остеопластические материалы

1.7.1. Остеопластические материалы на основе коллагена

1.8. Модель для исследования остеогенной дифференцировки in vitro

1.9. Заключение по данным литературы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клеточные модели и культуральные среды

2.1.1. Получение, культивирование и характеристика культур ММСК

2.2. Разработка эффективной системы нокдауна гена GSK3ft с помощью молекул siРНК на клеточной линии HEK

2.2.1. Биоинформатические методы анализа. Дизайн последовательностей siРНК GSK30

2.2.2. Выбор флуоресцентной метки в составе контрольной молекулы siРНК

2.2.3. Оценка эффективности трансфекции

2.3. Оптимизация методики трансфекции ММСК ЖТ человека с помощью молекул siРНК. Выбор цитосовместимой и эффективной концентрации молекул siРНК и трансфекционного агента в составе полиплексов

2.3.1. Выбор цитосовместимой концентрации молекул siРНК и трансфекционного агента в составе полиплексов

2.3.2. Выбор эффективной концентрации молекул siРНК и трансфекционного агента в составе полиплексов

2.3.3. Выбор эффективной системы доставки siРНК

2.4. Оценка эффективности нокдауна гена GSK3p и остеоиндуктивных свойств молекул siРНК GSK3p в культурах ММСК ЖТ

2.4.1. Оценка экспрессии гена-ингибитора GSK3в и генов-маркеров остеогенной дифференцировки

2.4.2. Получение клеточных лизатов

2.4.3. Определение активности щелочной фосфатазы

2.4.4. Определение количества ионов кальция

2.5. Разработка остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами

siРНК GSK3P

2.5.1. Получение коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами siРНК

2.5.2. Исследование кинетики высвобождения молекул siРНК, имрегнированных в коллаген-фибронектиновый гидрогель

2.5.3. Оценка эффективности доставки молекул siРНК, импрегнированных в коллаген-фибронектиновый гидрогель

2.5.4. Оценка биосовместимости остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами siРНК-К и siРНК GSK3P

2.5.5. Оценка остеоиндуктивных свойств коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами siРНК GSK3p

2.6. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА Э. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение, культивирование и характеристика культур ММСК

3.1.1. Получение культур ММСК и их культивирование

3.1.2. Оценка клоногенности культур ММСК

3.1.3. Характеристика иммунофенотипа культур ММСК

3.1.4. Хондрогенная дифференцировка ММСК

3.1.5. Оценка остеоиндуктивного потенциала культур ММСК

3.2. Разработка эффективной системы нокдауна гена GSK3в с помощью молекул б1РНК на клеточной линии НЕК

3.2.1. Биоинформатические методы анализа. Дизайн последовательностей siРНК GSK3P

3.2.2. Выбор флуоресцентной метки в составе контрольной молекулы siРНК

3.2.3. Анализ эффективности нокдауна гена GSK3p в клеточной линии НЕК

3.3. Оптимизация методики трансфекции ММСК ЖТ человека с помощью молекул siРНК. Выбор цитосовместимой и эффективной концентрации молекул siРНК и трансфекционного агента в составе полиплексов

3.3.1. Оценка цитотоксического действия молекул siРНК-К, siРНК-К- и siРНК GSK3P

3.3.2. Оценка цитотоксического действия трансфекционных агентов

3.3.3. Оценка цитотоксического действия полиплексов, образованных молекулами siРНК-К и трансфекционными агентами

3.3.4. Оценка цитотоксического действия полиплексов, содержащих молекулы siРНК GSK3p

3.3.5. Определение эффективной концентрации молекул siРНК

3.3.6. Цитотоксичность липоплексов/полиплексов, образованных различными трансфекционными агентами и молекулами siРНК в выбранных концентрациях

3.3.7. Выбор эффективной системы доставки siРНК

3.4. Оценка эффективности нокдауна гена GSK3в и остеоиндуктивных свойств молекул siРНК GSK3p в культурах ММСК ЖТ

3.4.1. Оценка эффективности нокдауна гена GSK3в и остеоиндуктивных свойств молекул siРНК GSK3p

3.4.2. Определение активности щелочной фосфатазы и концентрации ионов кальция в культурах ММСК ЖТ при инкубации с siРНК GSK3p

3.5. Разработка остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами

siРНК GSK3P

3.5.1. Получение коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами siРНК

3.5.2. Исследование кинетики высвобождения молекул siРНК, импрегнированных в коллаген-фибронектиновый гидрогель

3.5.3. Оценка эффективности доставки молекул siРНК, импрегнированных в коллаген-фибронектиновый гидрогель

3.5.4. Оценка биосовместимости остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами siРНК-К и siРНК GSK3P

3.5.5. Оценка стеоиндуктивных свойств коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами siРНК GSK3p

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВКМ - внеклеточный матрикс

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислот

дцРНК - двухцепочечная РНК (dsRNA)

кДа - килодальтон

кДНК - комплементарная ДНК

мкг - микрограмм

мл - миллилитр

мм - миллиметр

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки нг - нанограмм нм - нанометр

ПААГ - полиакриламидный гель

пДНК - плазмидная ДНК (plasmid DNA, pDNA)

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени РНК - рибонуклеиновая кислота см - сантиметр

ЭТС - эмбриональной сыворотки теленка

3'-UTR - 3'-нетранслируемая область (3'-untranslated region)

5(6)-FAM - карбоксифлуорофесцеин, 5(6) изомер - флуоресцентный

краситель, применяемый для проточной цитофлуориметрии

(5(6)-carboxyfluorescein)

ACTB - бета-актин (actin beta)

ALPL - щелочная фосфатаза (alkaline phosphatase), маркер остеогенной

дифференцировки

APC - adenomatous polyposis coli

BCL2L2 - B-cell lymphoma (Bcl)-like

BMP-2 - костный морфогенетический белок-2 человека (human bone morphogenetic protein-2)

BMPRs - рецепторы костных морфогенетических белков (bone morphogenetic protein receptors)

BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin) BSP - bone sialoprotein, маркер остеогенной дифференцировки CD-маркеры - маркеры клеточной поверхности (cluster of differentiation markers)

CK1 - casein kinase

COL1 - collagen type 1, маркер остеогенной дифференцировки

DKK1, DKK2 - dickkopf-related protein 1 и 2, соответственно

DPBS - натрий-фосфатный буфер Дульбекко (Dulbecco's phosphate-buffered

saline)

EIF-2 - eukaryotic initiation factor

FGF-2 - фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor 2) FZDs- frizzled family receptors, рецепторы сигнального пути Wnt GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

GSK3P - киназа гликогенсинтазы-3в (glycogen synthase kinase-3P) LEF - lymphoid enhancer factor, транскрипционный фактор, маркер остеогенной дифференцировки

LRPs - low density lipoprotein receptor-related protein, рецепторы сигнального пути Wnt

MKP1 - фосфатаза митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK)

N/P соотношение - соотношение азот/фосфат (отношение положительно

заряженных полимерных аминогрупп трансфекционного агента (N) к

отрицательно заряженным фосфатным группам нуклеиновой кислоты (P))

(N/P ratio - nitrogen (N) to phosphate (P) ratio).

OCN - osteocalcin, маркер остеогенной дифференцировки

OPN - osteopontin , маркер остеогенной дифференцировки

OSX - osterix, транскрипционный фактор, маркер остеогенной дифференцировки

PAMAM - полиамидоамин (polyamidoamine)

PBS - натрий-фосфатный буфер (phosphate-buffered saline)

PE - фикоэритрин (phycoerythrin) - флуоресцентный краситель,

применяемый для проточной цитофлуориметрии

PEI - полиэтиленимин (polyethylenimine)

piPHK - piwi-interacting RNAs

PP2A - протеинфосфатаза 2A (protein phosphatase 2A) rasiPHK - repeat associated small interfering RNAs

RISC - РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RNA-induced silencing complex)

Runx2 - runt-related transcription factor 2, транскрипционный фактор, маркер

остеогенной дифференцировки

Sema4d - semaphorin 4d

sFRP2 - secreted frizzled related protein

siPHK - малые интерферирующие РНК (small interfering RNAs) shPHK - короткие шпилечные РНК (short hairpin RNAs) SOST - sclerostin tasiPHK - trans-acting RNAs

TCF - T-cell factor, транскрипционный фактор, маркер остеогенной дифференцировки

tRFs - фрагменты тРНK (tRNA-derived RNA fragments)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека с помощью молекул siРНК, направленных на ген киназы гликогенсинтазы-3β»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Молекулы малых интерферирующих РНК (siPHK, small interfering RNAs) являются специфичным и эффективным инструментом для регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Уникальная способность распознавать последовательность своих мРНК-мишеней в цитоплазме клетки и вызывать их деградацию обуславливает большой потенциал применения молекул siPHK в изучении механизмов дифференцировки и перепрограммирования клеточных популяций [Hamann A. et al., 2019], а также терапии широкого спектра заболеваний [Gherardini L. et al., 2013; Scarborough R.J., Gatignol A., 2018; Hoy S.M., 2018; Mahmoodi Chalbatani G., et al., 2019; Sheridan C., 2019; Scott L.J., 2020].

Главные преимущества применения молекул siPHK заключаются в их высокой эффективности при низких (пикомолярных) концентрациях, минимальном количестве нецелевых и побочных эффектов [Hu B. et al., 2019; Saw P.E., Song E-W., 2020]. Универсальность механизма их действия позволяет проводить нокдаун практически любых транскриптов мРНК в клетках млекопитающих, в то время как разработка таргетных препаратов на основе ферментативных ингибиторов, представленных малыми молекулами, для терапии заболеваний является очень долгим и финансово затратным процессом [Soucek L., Evan G.I., 2010; Lam J.K. et al., 2015]. По сравнению с прочими антисмысловыми подходами, такими как антисмысловые ДНК-олигонуклеиды и рибозимы, молекулы siPHK более эффективны и обеспечивают эффект в течение длительного периода времени [Bertrand J.R. et al., 2002].

Применение молекул siPHK с целью регуляции остеогенной дифференцировки в настоящее время мало изучено [Rios C.N., 2012; Kawakami Y. et al., 2013; Nguyen M.K., 2014; Jia S. et al., 2014; Liang C. et al., 2015; Ghadakzadeh S. et al., 2017; He Y., Zou L., 2019; Wu Q. et al., 2020]. При этом из литературы известно, что ингибирование экспресии гена киназы

гликогенсинтазы-Sß (GSK3ß) на уровне белка, например, малыми молекулами, приводит к эффективной остеогенной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) in vitro [Gambardella A. et al., 2011; Gilmoura P.S. et al., 2013].

В связи с вышеизложенным, изучение механизмов остеогенной дифференцировки ММСК in vitro путем нокдауна гена GSK3ß с помощью молекул siPHK является актуальной задачей, а получение композиций, содержащих такие молекулы, может быть перспективным подходом для создания новых остеопластических материалов с целью их применения в травматологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Степень разработанности темы исследования

Действие молекул siPHK GSK3ß в качестве регулятора остеогенной дифференцировки ММСК ранее не было изучено.

Положительная регуляция остеогенной дифференцировки стволовых клеток млекопитающих может быть осуществлена как с помощью известных остеоиндукторов - рекомбинантных белков семейств BMP и WNT, дексаметазона, ß-глицерофосфата натрия, L-аскорбиновой кислоты и метаболитов витамина D (кальциферола, кальцитриола) [Beederman M. et al, 2013; James A.W. et al, 2013; Langenbach F., Handschel J., 2013; Ji Y. et al., 2019], так и в результате подавления активности белков или экспрессии генов-ингибиторов остеогенеза малыми молекулами, молекулами микроРНК (microRNA, miRNA) или siPHK [Gambardella A. et al., 2011; Hassan M.Q. et al., 2012; Tzeng S.Y. et al., 2012; Gilmoura P.S. et al., 2013; Wang Q. et al., 2013; Zhang W.B. et al., 2014; Wang Z. et al., 2015; Lin G. et al., 2017; Vishal M. et al., 2017].

Однако, регуляция работы сигнальных путей с помощью вышеперечиленных остеоиндукторов, малых молекул или молекул микроРНК может привести к плейотропным эффектам, так как такие соединения не обладают высокой селективностью; или отсутствию эффекта

из-за изменения конформации целевого белка, а также развитию резистентности [Лебедев Т.Д. и др., 2013; Lam J.K. et al., 2015; Yu A-M. et al., 2019], что практически исключено при применении молекул siPHK [Saw P.E., Song E-W., 2020].

В настоящее время многие препараты на основе молекул siPHK проходят клинические испытания [Hu В., et al., 2019] и два из них уже разрешены для применения в клинике - ONPATTRO® (patisiran) в 2018 году [Hoy S.M., 2018], GIVLAARI™ (givosiran) в 2020 году [Scott L.J., 2020].

Также в литературе имееются данные об использовании биоматериалов на основе гидрогелей различной биологической природы в качестве носителей молекул siPHK [Sarett S.M. et al., 2015; Kowalczewski C.J., Saul J.M., 2015; Ma Z. et al., 2014] и лишь небольшое количество работ посвящено разработке остеопластических материалов на основе компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), присутствующих у человека, и несущих молекулы siPHK, направленные на гены-ингибиторы остеогенной дифференцировки [Kowalczewski C.J., Saul J.M., 2015; Wang Y., 2017].

Цель исследования

Целью исследования является изучение регуляции остеогенной дифференцировки ММСК человека с помощью молекул siPHK GSK3ß.

Задачи исследования

1. Разработать эффективную систему нокдауна гена GSK3ß с помощью молекул siPHK на клеточной линии HEK 293.

2. Оптимизировать условия трансфекции культур MMCK ЖТ человека с помощью молекул siPHK, не направленных ни на один известный ген человека, несущих флуоресцентную метку, и молекул siPHK GSK3ß.

3. Изучить эффективность остеогенной дифференцировки культур MMCK ЖТ человека с помощью трансфекции полиплексами, содержащими молекулы siPHK GSK3ß путем оценки экспрессии генов-маркеров остеогенной дифференцировки RUNX2, BMP-2, ALPL,

ОСИ и ОРИ, активности щелочной фосфатазы и количества ионов Са2+.

4. Разработать протокол получения остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного полиплексами с молекулами siРНК GSK3p.

5. Изучить кинетику высвобождения молекул siРНК, не направленных ни на один известный ген человека, меченых биотином, из коллаген-фибронектинового гидрогеля.

6. Исследовать биосовместимость и способность к клеточной адгезии коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного полиплексами с молекулами siРНК GSK3p.

7. Исследовать остеоиндуктивные свойства коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного полиплексами с молекулами siРНК GSK3p путем оценки экспрессии генов-маркеров остеогенной дифференцировки ЯЦИХ2, ВМР-2, ЛЬРЬ, ОСИ и ОРИ и обосновать возможность его применения для индукции регенерации костной ткани.

Методология и методы исследования

Методологической основой данного исследования являлись работы в области изучения молекулярных основ механизма РНК-интерференции; регуляции сигнальных путей остеогенной дифференцировки; действия малых интерферирующих РНК, малых молекул и остеоиндуктивных белков на экспрессию генов-маркеров и генов-ингибиторов остеогенеза, а также биосовместисмости, способности к клеточной адгезии и остеоиндуктивных свойств природных остеопластических материалов, импрегнированных молекулами малых интерферирующих РНК или остеоиндуктивными белками.

В работе были изучены биосовместимость, остеоиндуктивные свойства и эффективность трансфекции молекул б1РНК как отдельно, так и в

составе остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля в модели ММСК ЖТ человека. Использованы общенаучные эмпирические (наблюдение и описание, эксперимент, сравнение), теоретические (анализ, синтез, обобщение) и специальные методы (изучение литературных источников), молекулярно-генетические методы, молекулярно-цитогенетические методы, цитохимические методы, колориметрические методы, спектральные и оптические методы (световая и флуоресцентная микроскопия и цитофлуориметрия), биоинформатические и статистические методы анализа данных.

Научные положения, выносимые на защиту

1. При трансфекции ММСК ЖТ человека молекулами siPHK, показана большая эффективность агентов на основе катионных полимеров, чем агентов на основе липосом. Оптимальная концентрация молекул siPHK в полиплексах, образованных с помощью линейного PEI с молекулярной массой 25 кДа (1:3), для трансфекции культур ММСК ЖТ человека составляет 50 пмоль/мл.

2. Показана прямая зависимость между концентрациями полиплексов, содержащих молекулы siPHK и PEI (1:3), и эффективностью трансфекции культур ММСК ЖТ человека, которую наблюдали в диапазоне концентраций от 25 до 100 пмоль/мл молекул siPHK и от 1 до 4 мкг/мл PEI.

3. Установлена обратная зависимость между жизнеспособностью культур ММСК ЖТ человека и эффективностью трансфекции полиплексами, содержащих молекулы siPHK и трансфекционные агенты на основе катионных полимеров, которую наблюдали в диапазоне концентраций от 25 до 100 пмоль/мл молекул siPHK и от 1 до 4 мкг/мл PEI (1:2) или от 0,67 до 2,68 мкл/мл TurboFect (1:3).

4. Трансфекция культур ММСК ЖТ человека полиплексами, содержащими молекулы siPHK GSK30, приводит к повышению эффективности их остеогенной дифференцировки.

5. Разработанный остеопластический материал на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированный полиплексами с молекулами siPHK GSK3P, показал высокую биосовместимость и спсособность к клеточной адгезии в модели ММСК ЖТ человека in vitro.

6. Разработанный остеопластический материал на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированный полиплексами с молекулами siPHK GSK3P, продемонстрировал остеоиндуктивные свойства в модели ММСК ЖТ человека in vitro и может быть рекомендован в качестве перспективного материала для применения в области травматологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Научная новизна

Впервые показана эффективность применения разработанных последовательностей молекул siPHK GSK3P для положительной регуляции остеогенной дифференцировки ММСК ЖТ человека in vitro.

Впервые разработана методика получения гидрогеля на основе коллагена и фибронектина, способного к пролонгированному высвобождению молекул siPHK и термоотверждению при 37°С.

Впервые исследованы биосовместимость, способность к клеточной адгезии и остеоиндуктивный потенциал остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного молекулами siPHK GSK3P in vitro.

Теоретическая и практическая значимость

Исследование механизмов дифференцировки ММСK в остеогенном направлении позволит получить больше данных о процессах репаративного остеогенеза для возможности управления этими процессами. Изучение

действия молекул siРНК позволит улучшить понимание их функций, мишеней и возможности применения для направленной дифференцировки ММСК.

Внедрение в клиническую практику остеопластического материала на основе коллаген-фибронектинового гидрогеля, содержащего молекулы siРНК GSK3p в качестве положительного регулятора остеогенной дифференцировки, позволит сократить сроки репаративного остеогенеза у пациентов при хирургических вмешательствах в области травматологии, стоматологии, челюстно-лицевой хирургии или при механических повреждениях костной ткани. По сравнению с другими остеопластическими материалами, применяемыми в настоящее время в регенеративной медицине, данный материал является высокоэффективным, экономически более доступным, удобным и простым в применении для специалиста.

Степень достоверности результатов

Высокая степень достоверности полученных результатов и обоснованности сделанных выводов определяется большим количеством биологических и технических повторов экспериментов. В работе использованы современные молекулярно-генетические, молекулярно-цитогенетические методы и статистические методы исследования. Интерпретация полученных результатов проведена с использованием методов статистической обработки данных. Их достоверность подтверждена методом однофакторного дисперсионного анализа АКОУА с применением критерия Холма-Шидака при сравнении 3-х и более групп и непарного 1;-теста Стьюдента при сравнении 2-х групп. Результаты, полученные автором, свидетельствуют о выполнении поставленных задач, выводы и заключения подкреплены убедительными экспериментальными данными и полностью отражают результаты проведенного исследования. Для теоретического обоснования и сравнительного анализа привлечено большое количество

отечественных и зарубежных источников литературы. Сформулированные в работе выводы соответствуют поставленным цели и задачам исследования.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует формуле для научных специальностей 1.5.7. (03.02.07) - «Генетика (биологические науки)» и 1.5.22. (03.03.04) -«Kлеточная биология (биологические науки)». Дисссертация охватывает проблемы реализации генетической информации (транскрипция, трансляция) на молекулярном и клеточном уровне, механизмы регуляции экспрессии генов и области исследований, описанные в пунктах 7 и 11 паспорта научной специальности «Генетика», а также проблемы изучения закономерностей дифференцировки недифференцированных клеток, их физиологической регенерации и регуляции этих процессов, жизнеспособности клеток при действии химических трансфекционных агентов, молекул siPHK и образованных ими полиплексов, описанные в пунктах 2 и 5 паспорта научной специальности «Kлеточная биология».

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации доложены на всероссийской конференции с международным участием «StemCellBio-2016: фундаментальная наука как основа клеточных технологий», Санкт-Петербург, 2016 год; 23-ей международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2019 год; 3rd Sechenov international biomedical summit (SIBS 2019), Москва, 2019 год; IV Шциональном конгрессе по регенеративной медицине, Москва, 2019 год; международном форуме «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2020.

Pабота одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета

ФБгау «Мгац».

Личное участие автора в выполнении исследования

Автор непосредственно участвовал в постановке целей и задач, выборе методов исследования, разработке всех схем и этапов эксперимента, и их проведении.

Автором выполнен анализ литературы по теме диссертации, осуществлена статистическая обработка полученных данных, сформулированы основные результаты, выводы и написана рукопись. Автор самостоятельно подготовил материалы к публикации в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах.

Публикации

Результаты диссертационной работы представлены в 14 печатных работах, в том числе в 6 статьях, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата биологических наук (4 Scopus и 2 Scopus и Web of Science).

Структура и объем диссертации

Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, применение результатов и научных выводов, список цитируемой литературы. Работа представлена на 181 странице машинописного текста, содержит 8 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает в себя 298 наименований, в том числе 14 отечественных и 284 зарубежных источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Сигнальные пути остеогенной дифференцировки

1.1.1. Основные сигнальные пути остеогенной дифференцировки

Индукция остеогенной дифференцировки может осуществляться с помощью нескольких сигнальных путей: канонического Bone morphogenetic protein (BMP)/Smad Кожевникова МЛ. и др., 2008, Chen G., et al., 2012], неканонического BMP (независимого от Smad), канонического TGF-0/Smad, неканонического TGF-в (независимого от Smad) [Chen G., et al., 2012], канонического Wingless/Integrated (Wntyp-катенин, неканонического кальций-зависимого Wnt (calcium-dependent Wnt, независимого от в-катенина) [Olivares-Navarrete R. et al., 2011], Hedgehog (Hh) [Spinella-Jaegle S. et al., 2001; Suh J.M. et al., 2006] и других.

Основными и наиболее хорошо изученными из перечисленных путей, приводящими к индукции и завершению остеогенной дифференцировки, являются канонические BMP/Smad и WNT/0-катенин. В нескольких исследованиях было выявлено взаимодействие между обоими путями, позволяя предположить, что передача сигналов как по пути BMP, так и по Wnt/в-катенин может синергетически регулировать дифференцировку остеобластов [Schoeman M.A. et al., 2015]. Оба пути активируют экспрессию ключевого транскрипционного фактора Runt-related transcription factor 2 (Runx2), также известного как Core-binding factor alpha 1 (Cbfa1), который, в свою очередь, инициирует экспрессию каскада генов-маркеров, ассоциирующихся с остеогенезом - Alkaline phosphatase (ALPL), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OCN), Osteopontin (OPN), Collagen type 1 (COL1) и других. Кожевникова МЛ. и др., 2008].

1.1.1.1. Канонический сигнальный путь BMP-2/Smad

Связывание внеклеточных лигандов семейства BMP с рецепторами Bone morphogenetic protein receptors (BMPRs) инициирует их киназную активность, обеспечивая фосфорилирование сигнальных молекул Smad1/5/8

и их связывание со Smad4. Образовавшийся комплекс транслоцируется в ядро и инициирует экспрессию гена Runx2. В свою очередь, Runx2 стимулирует экспрессию более позднего маркера остеогенной дифференцировки - гена Osterix (OSX), совместно с которым осуществляется регуляция генов-маркеров, находящихся ниже в генном каскаде [Кожевникова М.Н. и др., 2008].

Smad6/7 выступают отрицательными регуляторными молекулами, контролируя синтез Runx2 через Е3-убиквитинлигазы Smurfl и Smurf2, вызывая его протеосомную деградацию [Vishal M. et al., 2017; Shen R., 2006].

1.1.1.2. Канонический сигнальный путь WNT/fi-катенин

в-катенин является ключевой сигнальной молекулой канонического пути Wnt/в-катенин. В отсутствие сигналов от внеклеточных лигандов Wnt, цитоплазматический в-катенин связан с комплексом деградации, состоящим из киназ GSK3e и Casein kinase 1 (CK1), протеинфосфатазы 2A (PP2A), E3-убиквитинлигазы в-TrCP, Axin и adenomatous polyposis coli (APC) [Stamos J.L., Weis W.I., 2013]. GSK3e и CK1 фосфорилируют в-катенин [Polakis P., 2002], после чего он подвергается убиквитинированию и последующей протеасомной деградации [Hart M. et al., 1999].

При взаимодействии внеклеточных лигандов Wnt с трансмембранными рецепторами Frizzled family receptors (FZDs) и Low density lipoprotein receptor-related proteins (LRPs), происходит активация цитоплазматического белка Dishevelled (DSH), который вместе с рецептором LRP связывается с комплексом деградации, вызывая инактивацию последнего. В результате прекращается фосфорилирование и деградация в-катенина, он накапливается в цитоплазме и транслоцируется в ядро, где в комплексе с транскрипционными факторами T-cell factor/lymphoid enhancer factor (TCF/LEF) активирует экспрессию гена Runx2 [Cadigan K.M. et al., 2006].

Лиганды Dickkopf-related protein 1 и 2 (DKK1, DKK2), Kremen2, Secreted frizzled related protein 2 (sFRP2), Sclerostin (SOST) и другие

препятствуют связыванию белков Wnt с рецепторами на поверхности клетки, предотвращая образование комплекса Frizzled/Wnt/LRP и, таким образом, выступают негативными регуляторами Wnt/ß-катенин сигнального пути [Baron R., Rawadi G., 2007; Carulli C., 2015].

1.1.2. Индукторы остеогенной дифференцировки

Среди 20 членов семейства белков BMP наиболее значимую роль в оссификации играют BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 и BMP-9 [Yang J. et al., 2014]. Нокаут генов BMP-2 и BMP-4 приводит к абсолютной летальности плода, нокаут BMP-7 вызывает скоропостижную смерть после рождения, что подчеркивает исключительную значимость этих факторов [Wang R.N. et al., 2014]. Одним из наиболее эффективных остеоиндукторов является рекомбинантный белок BMP-2, ведение его малых доз способно индуцировать остеогенную дифференцировку in vitro и in vivo [Wang R.N. et al., 2014; Кузнецова В.С. и др., 2019].

Из 19 белков семейства Wnt по меньшей мере 7 могут активировать Wnt/ß-катениновый путь: Wnt 1, 2, 3a, 3b, 4, 8 и 10b [Chen C. et al., 2015]. Наиболее часто в работах используют рекомбинантный Wnt3a, эффективно индуцирующий остеогенную дифференцировку ММСК на ранних стадиях, но не способный полностью подавить адипогенную дифференцировку в этих культурах [Morsczeck С. et al., 2017]. Также известно, что Wnt10b способствует остеогенной дифференцировке in vitro и in vivo и подавлению адипогенеза в культурах ММСК [Bennett C.N. et al., 2005].

Другими известными индукторами остеогенной дифференцировки ММСК являются дексаметазон, ß-глицерофосфат, L-аскорбиновая кислота [Langenbach F., Handschel J., 2013] и метаболиты витамина D: 25-гидроксивитамин D3 (кальциферол) и 1,25-дигидроксивитамин D3 (кальцитриол) [Lou Y-R. et al., 2017; Ji Y. et al., 2019]. Дексаметазон индуцирует экспрессию Runx2 посредством активации транскрипции FHL2/ß-катенина и TAZ (коактиватора транскрипции с PDZ-связыванием,

ß-катенин-подобной молекулы), а также фосфорилирования MKP1 (фосфатазы митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) -1). L-аскорбиновая кислота способствует остеогенной дифференцировке за счет увеличения секреции Coll, что, в свою очередь, приводит к увеличению Coll/a 2 ß 1 интегрин-опосредованной внутриклеточной передачи сигналов. Связывание интегринового лиганда активирует передачу сигналов по пути MAPK и фосфорилирование Runx2. ß-глицерофосфат служит источником фосфатов для гидроксиапатита костной ткани и, действуя подобно эндогенной сигнальной молекуле, индуцирует экспрессию остеогенных генов-маркеров, в том числе OPN и BMP-2 [Langenbach F., Handschel J., 2013]. Витамин D3 индуцирует остеогенную дифференцировку за счет повышения экспрессии гена TAZ [Ji Y. et al., 2019].

Индукция остеогенной дифференцировки также возможна посредством подавления экспрессии генов-ингибиторов остеогенеза. Показано, что ингибирование мРНК гена GSK3ß с помощью малых молекул (AR28, AZD2858, AR79 или AZ13282107) приводит к усилению пролиферации остеобластов, повышению синтеза ß-катенина и экспрессии остеогенных генов-маркеров, таких как Runx2 и других, увеличению объема костной ткани in vivo, а также минерализации ВКМ, гипофосфорилированию ß-катенина, его цитозольной стабилизации и ядерной транслокации in vitro [Gambardella A. et al., 2011; Marsell R. et al., 2012; Gilmoura P.S. et al., 2013; Amirhosseini M. et al., 2018].

Молекулы микроРНК участвуют в позитивной и негативной регуляции остеогенеза на всех этапах передачи сигнала, воздействуя на мРНК лигандов, рецепторов, сигнальных молекул и регуляторов транскрипции, вовлеченных в пути реализации программ дифференцировки. Использование мимик микроРНК-590-5р, приводящих к деградации транскрипта гена SMAD7; микроРНК-29а, направленных на DKK1, Kremen2 и sFRP2; микроРНК-218, таргетными генами которых являются Dkk2, sFRP2 и Sost, а также микроРНК-335-5р, нацеленных на DKK1, способствует остеогенной

дифференцировке in vitro [Kapinas K. et al., 2010; Zhang J. et al., 2011; Hassan M.Q. et al., 2012; Zhang W.B. et al., 2014; Vishal M. et al., 2017].

Подобным образом, экзогенное введение в клетку молекул siPH^ направленных на гены-ингибиторы остеогенеза - PPAR-y, Noggin, GNAS1, Chordin, GSK3ß, B-cell lymphoma (Bcl)-like 2 (BCL2L2) а также гены, участвуют^ в процессах резорбции кости -RANK, Plekho1 или Semaphorin 4d (Sema4d), отособствует остеогенной дифференцировке в моделях in vitro или in vivo [Yang F. et al., 2010; Tzeng S.Y. et al., 2012; Wang Z. et al., 2015; Ghadakzadeh S. et al., 2016].

Однако, регуляция работы сигнальных путей посредством вышеперечиленных остеоиндукторов, малых молекул или молекул микроРНК может привести к плейотропным эффектам, так как такие соединения не обладают высокой селективностью и могут иметь сразу несколько мишеней [Лебедев Т.Д. и др., 2013; Lam J.K. et al., 2015; Yu A-M. et al., 2019]. Эти эффекты практически исключены при применении молекул siPHК [Saw P.E., Song E-W., 2020], являющихся высокоточным инструментом регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.

1.2. Участие GSK3ß в остеогенной дифференцировке и ее

ингибирование

1.2.1. GSK3ß - ингибитор путей остеогенной дифференцировки

Известный ингибитор остеогенной дифференцировки - киназа гликогенсинтазы (GSK3), является серин/треонинкиназой и имеет две изоформы с 98% гомологией в их киназном домене - а и ß. GSK3 регулирует активность гликогенсинтазы и первоначально была идентифицирована как фермент, участвующий в синтезе гликогена. Данная киназа экспрессируется практически во всех типах клеток животных и человека [Embi N. et al., 1980, Takahashi-Yanaga F., 2013; Lal H. et al., 2015].

Позже было показано, что GSK3 участвует в различных биологических процессах, в том числе в эмбриональном развитии, пролиферации клеток и их апоптозе, путях передачи сигналов инсулина, формировании костной ткани и остеокластогенезе, нейрональной функции, онкогенезе, старении, воспалении и других. Нарушение функции GSK3 может вызывать широкий спектр сердечно-сосудистых заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, старение и фиброз миокарда, пролиферация кардиомиоцитов; нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона; а также биполярное растройство и сахарный диабет [Kramer T. et al., 2012; Takahashi-Yanaga F., 2013; Lal H. et al., 2015; Golpich M. et al., 2015; Escott K.J. et al., 2016]. Биоинформатические исследования показали, что 20% протеома человека содержит несколько предполагаемых сайтов фосфорилирования GSK3 [Taelman V.F. et al., 2010], что может приводить к убиквитинированию и протеосомной деградации таких белков. Как сообщается различными исследовательскими группами, GSK3 имеет ряд предполагаемых мишеней в различных типах клеток эукариот, включая insulin receptor substrate 1 (IRS1), в-catenin, Gli1, Gli2 [Takahashi-Yanaga F., 2013; Escott K.J. et al., 2016], Smad1 [Fuentealba L.C. et al., 2007], Smad3 [Guo X. et al., 2008; Lal H. et al., 2015] и другие.

В ходе идентификации действия каждой из изоформ GSK3 установлено, что мыши с нокаутом GSK3ft эмбрионально летальны, тогда как мыши с нокаутом GSK3a жизнеспособны [Hoeflich K.P. et al., 2000]. Тем самым было продемонстрировано, что эти две изоформы не взаимозаменяемы [Beurel E. et al., 2015].

Изоформа GSK3P наиболее активно вовлечена в ингибирование путей передачи сигналов остеогенной дифференцировки BMP и WNT/0-катенин. Известно, что GSK3P в составе комплекса деградации фосфорилирует молекулы Smadl и в-катенин, участвующие в путях BMP и WNT/0-катенин, соответственно, вызывая их последующие убиквитинирование и

протеосомную деградацию [Бие^еаШа Ь.С. й а1., 2007; Оао С. й а1., 2014]. С помощью этого механизма GSK3p контролирует продолжительность активности молекул Smad1, а также транслокацию и накопление молекул в-катенина в ядре, необходимых для активации экспрессии Runx2. Кроме того, GSK3p может непосредственно фосфорилировать Яиих2, подавляя его транскрипционную активность [Kugimiya Б. е! а1., 2007] (рисунок 1).

Рисунок 1 - Схема молекулярных взаимодействий между сигнальными путями BMP, WNT/p-катенин и GSK3P при остеогенной дифференцировке.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Галицына Елена Валерьевна, 2021 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Апарцин Е.К., Кнауэр Н.Ю. Методы доставки генетического материала в клетки и возможности их применения в генной терапии // Гены и клетки. -2016. - Т. 11. № 2. - С. 32-41.

2. Бозо И.Я., Майорова К.С., Дробышев А.Ю. и др. Сравнительная оценка биологической активности ген-активированных остеопластических материалов из октакальциевого фосфата и плазмидных ДНК, несущих гены VEGF и SDF: часть 1 - in vitro // Гены и клетки. - 2016. - Т. 11. № 4. -С. 34-42.

3. Бухарова Т.Б., Леонов Г.Е., Галицына Е.В. и др. Остеогенный потенциал клеток из пульпы молочных зубов до и после криоконсервации: перспективы клеточного банкирования // Гены и клетки. - 2016. - Т. 11. № 4. - с. 43-47. - doi: 10.23868/201903005.

4. Власов Г.П., Тарасенко И.И., Валуева С.В. и др. Гиперразветвленный поли-Ь-лизин, содержащий между точками «ветвления» дополнительные аминокислоты или их олигомеры: синтез и структура // Высокомолекулярные соединения, серия А. - 2005 - Т. 47. №5. - С. 731-739.

5. Вяхирева Ю.В., Филатова А.Ю., Кривошеева И.А. и др. Нокдаун генов с использованием малых интерферирующих РНК // Вестник РГМУ. - 2017. -№3. - С. 18-31.

6. Галицына Е.В., Бухарова Т.Б., Гольдштейн Д.В. Сравнительный анализ эффективности трансфицирующих систем для доставки siPHR! в культуры HEK-293 и ММСК // 23-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», сборник тезисов. - 2019. -С. 85.

7. Деев Р.В., Дробышев А.Ю., Бозо И.Я. Ординарные и активированные остеопластические материалы // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. - 2015. - № 1. - С. 51-69. - doi: 10.32414/0869-8678-2015-151-69.

8. ^жевникова МЛ., Микаелян А.С., Старостин В.И. Молекулярно-генетические основы регуляции остеогенной дифференцировки мезенхимных стромальных клеток // Известия PÄH. Серия биологическая. - 2008. - № 3. -С. 261-271.

9. ^знецова В.С., Васильев А.В., Бухарова Т.Б. и др. Безопасность и эффективность применения морфогенетических белков кости 2 и 7 в стоматологии // Стоматология. - 2019. - № 98(1). - С. 64-69. -doi: 10.17116/stomat20199801184.

10. ^знецова В.С., Васильев А.В., Григорьев Т.Е. и др. Перспективы использования гидрогелей в качестве основы для отверждаемых костнопластических материалов // Стоматология. - 2017. - № 6. - С. 68-74. - doi: 10.17116/stomat201796668-74.

11. Лебедев Т.Д., Спирин П.В., Прасолов В.С. Перенос и экспрессия малых интерферирующих PHK в клетках млекопитающих с помощью лентивирусных векторов // Acta naturae. - 2013. - Т. 5. № 2(17). - С. 7-18.

12. Шдорубова И.А., Бухарова Т.Б., Загоскин Ю.Д. и др. Pазработка костно-пластического материала, импрегнированного плазмидой с геном костного морфогенетического белка-2 // Биотехнология - 2020. -Т. 36. № 4. -С. 59-64. - doi: 10.21519/0234-2758-2020-36-4-59-64 .

13. ^китежо HA., Прасолов В.С. ^вирусные методы доставки и терапевтическое применение малых интерферирующих PHK // Acta naturae. -2013. - Т. 5. № 3(18) - С. 36-56.

14. Pозенкранц А.А., Уласов А.В., Сластникова Т.А. и др. Использование процессов внутриклеточного транспорта для доставки лекарств в заданный компартмент клетки // Биохимия. - 2014. - Т. 79. №. 9. - С. 1148 - 1168.

15. Pуководство 1. Factors influencing transfection efficiency. Transfection techniques and basics // Thermo Fisher Scientific. -https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html.

16. PyKOBogcTBO 2. Lipofectamine® 3 000 // Thermo Fisher Scientific. -https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Flyers/dna-delivery-tools-flyer.pdf.

17. PyK0B0gcTB0 3. METAFECTENE® PRO // Biontex. - http://www.n-genetics.com/file/Manual_METAFECTENE_en.pdf.

18. PyK0B0gcTB0 4. TurboFect // Thermo Fisher Scientific. -http s://assets.fishersci.com/TF S -

Assets/LSG/manuals/MAN0011815_TurboFect_Transfection_Reag_UG.pdf

19. PyK0B0gcTB0 5. Lipofectamine® 3 000 // Thermo Fisher Scientific. -https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/C011690 0-Lipofectamine-3000-App-Notes-Russian.pdf

20. PyK0B0gcTB0 6. Recommended checks and controls for siRNA experiments // Abcam. - https://www.abcam.com/protocols/recommended-checks-and-controls-for-sirna-experiments.

21. PyK0B0gcTB0 7. Controls for RNAi experiments // Thermo Fisher Scientific. - https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/life-science/rnai/synthetic-rnai-analysis/controls-for-rnai-experiments.html.

22. Aagaard L., Rossi J.J. RNAi therapeutics: principles, prospects and challenges // Adv Drug Deliv Rev. - 2007. - Vol. 59(2-3). - 75-86. -doi: 10.1016/j.addr.2007.03.005.

23. Abdul Halim N.S., Fakiruddin K.S., Ali S.A. et al. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell // Int J Mol Sci. - 2014. - Vol. 15(9). - P.15044-15060. -doi: 10.3390/ijms150915044.

24. Abugessaisa I., Shimoji H., Sahin S. et al. FANT0M5 transcriptome catalog of cellular states based on Semantic MediaWiki // Database (Oxford). - 2016. -Article ID: baw105. - P. 1-10. - doi: 10.1093/database/baw105.

25. Ahmadzada T., Reid G., McKenzie D.R. Fundamentals of siRNA and miRNA therapeutics and a review of targeted nanoparticle delivery systems in

breast cancer // Biophys Rev. - 2018. - Vol. 10(1). - P. 69-86. -doi: 10.1007/s12551-017-0392-1.

26. Alexander R., Lodish H., Sun L. MicroRNAs in adipogenesis and as therapeutic targets for obesity // Expert Opin Ther Targets. - 2011. - Vol. 15(5). -P. 623-636. - doi: 10.1517/14728222.2011.561317.

27. Alexandrov V., Feodorova Y., Naimov S. et al. Transfection potential of the serum-free McCoy-Plovdiv cell line // Reports from the Bulgarian Academy of Sciences. - 2015. - Vol. 68(8). - P. 1055-1060.

28. Alexis F., Pridgen E., Molna L.K. et al. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles // Mol Pharm. - 2008. - Vol. 5(4). -P. 505-515. - doi: 10.1021/mp800051m.

29. Amirhosseini M., Madsen R.V., Escott K.J. et al. GSK-3ß inhibition suppresses instability-induced osteolysis by a dual action on osteoblast and osteoclast differentiation // J Cell Physiol. - 2018. - Vol. 233(3). - P. 2398-2408. -doi: 10.1002/jcp.26111.

30. Andersen H., Parhamifar L., Hunter A.C. et al. AFM visualization of sub-50nm polyplex disposition to the nuclear pore complex without compromising the integrity of the nuclear envelope // J Control Release. - 2016. - Vol. 244(Pt A). -P. 24-29. - doi: 10.1016/j.jconrel.2016.11.008.

31. Anderson B.R., Muramatsu H., Nallagatla S. R. et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation // Nucleic Acids Res. - 2010. - Vol. 38(17). - P. 5884-5892. -doi: 10.1093/nar/gkq347.

32. Antoine E.E., Vlachos P.P., Rylander M.N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport // Tissue Eng Part B Rev. - 2014. - Vol. 20(6). - P. 683696. - doi: 10.1089/ten.TEB.2014.0086.

33. Barlian A., Judawisastra H., Alfarafisa N.M. et al. Chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells induced by L-ascorbic

acid and platelet rich plasma on silk fibroin scaffold // Peer J. - 2018. - Vol. 6. - P. e5809. - doi: 10.7717/peerj.5809.

34. Baron R., Rawadi G. Targeting the Wnt/beta-catenin pathway to regulate bone formation in the adult skeleton // Endocrinology. - 2007. - Vol. 148(6). - P. 2635-2643. - doi: 10.1210/en.2007-0270.

35. Basirnejad M., Bolhassani A., Sadat S.M. The distinct role of small heat shock protein 20 on HCV NS3 expression in HEK-293T cell line // Avicenna J Med Biotechnol. - 2018. - Vol. 10(3). - P. 152-157.

36. Bayrak E.S., Mehdizadeh H., Akar B. et al. Agent-based modeling of osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in porous biomaterials // Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. - 2014. - Vol. 2014. - P. 2924-2927. -doi: 10.1109/EMBC.2014.6944235.

37. Beane O.S., Fonseca V.C., Cooper L.L. et al. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells // PLoS One. - 2014. - Vol. 9(12). - Article number: e115963. - P. 1-22 - doi: 10.1371/journal.pone.0115963.

38. Beederman M., Lamplot J.D., Nan G. et al. BMP signaling in mesenchymal stem cell differentiation and bone formation // J Biomed Sci Eng. - 2013. -Vol. 6(8A). - P. 32-52. - doi:10.4236/jbise.2013.68A1004.

39. Behlke M. A. Progress towards in vivo use of siRNAs // Mol Ther. - 2006. -Vol. 13(4). - P. 644-670. - https://doi.org/10.1016/jymthe.2006.01.001.

40. Bennett C.N., Longo K.A., Wright W.S. et al. Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by Wnt10b // Proc Natl Acad Sci USA. - 2005. - Vol. 102(9). - P. 3324-3329. - doi: 10.1073/pnas.0408742102.

41. Benoit D.S., Boutin M.E. Controlling mesenchymal stem cell gene expression using polymer-mediated delivery of siRNA // Biomacromolecules. -2012. - Vol. 13(11). - P. 3841-3849. -doi: 10.1021/bm301294n.

42. Bertrand J.R., Pottier M., Vekris A. et al. Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo // Biochem Biophys Res

Commun. - 2002. - Vol. 296. - P. 1000-1004. - doi: 10.1016/s0006-291x(02)02013-2.

43. Beurel E., Grieco S.F., Jopea R.S. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3): regulation, actions, and diseases // Pharmacol Ther. - 2015. - Vol. 148 - P. 114131. - doi: 10.1016/j.pharmthera.2014.11.016.

44. Biggs M.J., Dalby M.J. Focal adhesions in osteoneogenesis // Proc Inst Mech Eng H. - 2010. - Vol. 224(12). - P. 1441-1453. -doi: 10.1243/09544119JEIM775.

45. Blidner R. A., Hammer R. P., Lopez M. J. et al. Fully 2'-deoxy-2'-fluoro substituted nucleic acids induce RNA interference in mammalian cell culture // Chem Biol Drug Des. - 2007. - Vol. 70(2). - P. 113-122. - doi: 10.1111/j.1747-0285.2007.00542.x.

46. Boeckle S., von Gersdorff K., van der Piepen S. et al. Purification of polyethylenimine polyplexes highlights the role of free polycations in gene transfer // J Gene Med. - 2004. - Vol. 6(10). - P. 1102-1111. - doi: 10.1002/jgm.598.

47. Bonamassa B., Hai L., Liu D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research // Pharm Res. - 2011. - Vol. 28(4). -P. 694-701. - doi: 10.1007/s11095-010-0338-9.

48. Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A. et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine // Proc Natl Acad Sci USA. - 1995. - Vol. 92(16). - P. 7297-7301. -doi: 10.1073/pnas.92.16.7297.

49. Brown R.A., Phillips J.B. Cell responses to biomimetic protein scaffolds used in tissue repair and engineering // Int Rev Cytol. - 2007. - Vol. 262. - P. 75150. - doi: 10.1016/S0074-7696(07)62002-6.

50. Brunner S., Sauer T., Carotta S. et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus // Gene Ther. -2000. - Vol. 7(5). - P. 401-407. - doi: 10.1038/sj.gt.3301102.

51. Buckley C.T., Kelly D.J. Expansion in the presence of FGF-2 enhances the functional development of cartilaginous tissues engineered using infrapatellar fat

pad derived MSCs // J Mech Behav Biomed Mater. - 2012. - Vol. 11 - P. 102111. - doi: 10.1016/j.jmbbm.2011.09.004.

52. Cadigan K.M., Liu Y.I. Wnt signaling: complexity at the surface // J Cell Sci. - 2006. - Vol. 119(Pt.3). - P. 395-402. - doi: 10.1242/jcs.02826.

53. Caffrey D.R., Zhao J., Song Z. et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency // PLoS One. - 2011. -Vol. 6(7). - Article number: e21503. - P. 1-11. - doi: 10.1371/journal.pone.0021503.

54. Carulli C., Luzi E., Macera A., et al. RNA-based therapies for bone diseases. - Chapter 40. - P. 1049-1073. - doi: 10.1016/B978-0-12-405544-5.00040-X // Sen C.K. (ed). MicroRNA in regenerative medicine. - Elsevier Inc. - London; San Diego, CA; Waltham, MA; Kidlington, Oxford. - 2015. - 1288 pages. -doi: 10.1016/C2012-0-02839-6.

55. Chaudhary A., Srivastava S., Garg S. Development of a software tool and criteria evaluation for efficient design of small interfering RNA // Biochem Biophys Res Commun. - 2011. - Vol. 404(1). - P. 313-320. -doi: 10.1016/j.bbrc.2010.11.114.

56. Chen C., Zhao M., Tian A. et al. Aberrant activation of Wnt/ß-catenin signaling drives proliferation of bone sarcoma cells // Oncotarget. - 2015. -Vol. 6(19). - P.17570-17583. - doi:10.18632/oncotarget.4100.

57. Chen G., Deng C., Li Y.P. TGF-ß and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation // Int J Biol Sci. - 2012. - Vol. 8(2). - P. 272288. - doi: 10.7150/ijbs.2929.

58. Chen T., Wang Z., Wang R. et al. Polyethylenimine-DNA solid particles for gene delivery // J Drug Target. - 2007 - Vol. 15(10). - P.714-720. -doi: 10.1080/10611860701637974.

59. Cheng L., Ziegelhoffer P.R., Yang N.S. In vivo promoter activity and transgene expression in mammalian somatic tissues evaluated by using particle bombardment // Proc Natl Acad Sci USA. - 1993. - Vol. 90(10) - P. 4455-4459. -doi: 10.1073/pnas.90.10.4455.

60. Chernikov I.V., Gladkikh D.V., Meschaninova M.I. et al. Cholesterol-containing nuclease-resistant siRNA accumulates in tumors in a carrier-free mode and silences MDR1 gene // Mol Ther Nucleic Acids. - 2017. - Vol. 6. - P. 209220. - doi: 10.1016/j.omtn.2016.12.011.

61. Chernikov I.V., Vlassov V.V., Chernolovskaya E.L. Current development of siRNA bioconjugates: from research to the clinic // Front Pharmacol. - 2019. -Vol. 10 - Article number: 444. - P. 1-25. - doi: 10.3389/fphar.2019.00444.

62. Cheung W.Y., Hovey O., Gobin J.M. et al. Efficient nonviral transfection of human bone marrow mesenchymal stromal cells shown using placental growth factor overexpression // Stem Cells Int. - 2018. - Vol. 2018. - Article ID: 1310904. - P. 1-10. - doi: 10.1155/2018/1310904.

63. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. - 1987. -Vol. 162(1). - P. 156-159. - doi: 10.1006/abio.1987.9999.

64. Cihlar T., Ho E.S. Fluorescence-based assay for the interaction of small molecules with the human renal organic anion transporter 1 // Anal Biochem. -2000. - Vol. 283(1). - P. 49-55. - doi: 10.1006/abio.2000.4633.

65. Cook D.A., Fellgett S.W., Pownall M.E. et al. Wnt-dependent osteogenic commitment of bone marrow stromal cells using a novel GSK3beta inhibitor // Stem Cell Res. - 2014. - Vol 12(2). - P.415-427. - doi: 10.1016/j.scr.2013.10.002.

66. de Carvalho T.G., Pellenz F.M., Laureano A., et al. A simple protocol for transfecting human mesenchymal stem cells // Biotechnol Lett. - 2018. -Vol. 40(3). - P. 617-622. - doi 10.1007/s10529-018-2505-8.

67. de Los Milagros Bassani Molinas M., Beer C., Hesse F. et al. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring // Cytotechnology. - 2014. - Vol. 66(3). - P. 493514. - doi: 10.1007/s10616-013-9601-3.

68. Debnath T., Chelluri L.K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue // Hematol

Transfus Cell Ther. - 2019. - Vol. 41(1). - P. 7-16. -doi: 10.1016/j.htct.2018.05.001.

69. Deleavey G.F., Watts J.K., Alain T. et al. Synergistic effects between analogs of DNA and RNA improve the potency of siRNA-mediated gene silencing // Nucleic Acids Res. - 2010. - Vol. 38(13). - P. 4547-4557. -doi: 10.1093/nar/gkq181.

70. Deshpande S., Deshmukh J., Deshpande S. et al. Vertical and horizontal ridge augmentation in anterior maxilla using autograft, xenograft and titanium mesh with simultaneous placement of endosseous implants // J Indian Soc Periodontol. - 2014. - Vol. 18(5). - P. 661-665. - doi: 10.4103/0972-124X.142469.

71. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells // The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8(4). - P. 315-317.

72. Du X., Wang J., Zhou Q. et al. Advanced physical techniques for gene delivery based on membrane perforation // Drug delivery. - 2018. - Vol. 25(1). -P. 1516-1525. - doi: 10.1080/10717544.2018.1480674.

73. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells // Nature. - 2001. -Vol. 411(6836). - P. 494-498. - doi: 10.1038/35078107.

74. Elkayam E., Parmar R., Brown C.R. et al. siRNA carrying an (E)-vinylphosphonate moiety at the 5 end of the guide strand augments gene silencing by enhanced binding to human Argonaute-2 // Nucleic Acids Res. - 2017. -Vol. 45(6). - P. 3528-3536. - doi: 10.1093/nar/gkw1171.

75. Embi N., Rylatt D.B., Cohen P. Glycogen synthase kinase-3 from rabbit skeletal muscle. Separation from cyclic-AMP-dependent protein kinase and phosphorylase kinase // Eur J Biochem. - 1980. - Vol. 107(2). - P.519-527.

76. Epple M., Ganesan K., Heumann R. et al. Application of calcium phosphate nanoparticles in biomedicine // J Mater Chem. - 2010. - Vol. 20(1). - P. 18-23. -doi: 10.1039/B910885H.

77. Escott K.J., O'Shea P.J. The role of glycogen synthase kinase-3 inhibitors on bone remodeling. - Chapter 13. - P.148-166. - doi: 10.1002/9781118907474.ch13 // Atkinson K. (ed).The biology and therapeutic application of mesenchymal cells.

- John Wiley & Sons, Inc. - Hoboken, New Jersey. - 2016. - 968 pages. -doi: 10.1002/9781118907474.

78. Fan Q., Hu W., Ohta A.T. Light-induced microbubble poration of localized cells // Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. - 2013. - P. 4482-4485. -doi: 10.1109/EMBC.2013.6610542.

79. Fedorov Y., Anderson E.M., Birmingham A. et al. Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype // RNA. - 2006. - Vol. 12(7). - P. 1188-1196.

- doi: 10.1261/rna.28106.

80. Felgner J.H., Kumar R., Sridhar C.N. et al.: Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations // J Biol Chem. - 1994. Vol. 269(4). - P. 2550-2561.

81. Fire A., Xu S., Montgomery M.K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. - 1998.

- Vol. 391(6669). - P. 806-811. - doi: 10.1038/35888.

82. Fischer D., Bieber T., Li Y.X. et al. A novel non-viral vector for DNA delivery based on low molecular weight, branched polyethylenimine: effect of molecular weight on transfection efficiency and cytotoxicity // Pharm Res. - 1999.

- Vol. 16(8) -P. 1273-1279. - doi: 10.1023/a:1014861900478.

83. Fischer D., von Harpe A., Kunath K. et al. Copolymers of ethylene imine and N-(2-hydroxyethyl)-ethylene imine as tools to study effects of polymer structure on physicochemical and biological properties of DNA complexes // Bioconjug Chem. - 2002. - Vol. 13(5). - P. 1124-1133. -doi: 10.1021/bc025550w.

84. Florea B.I., Meaney C., Junginger H.E., et al. Transfection efficiency and toxicity of polyethylenimine in differentiated Calu-3 and nondifferentiated Cos-1 cell cultures // AAPS PharmSci. - 2002. - Vol. 4(3). -Article number: 12. - P. 111. - doi: 10.1208/ps040312.

85. Frank F., Sonenberg N., Nagar B. Structural basis for 5'-nucleotide base-specific recognition of guide RNA by human AGO2 // Nature. - 2010. - Vol. 465(7299). - P. 818-822. - doi: 10.1038/nature09039.

86. Frazao C., McVey C. E., Amblar M. et al. Unravelling the dynamics of RNA degradation by ribonuclease II and its RNA-bound complex // Nature. - 2006. -Vol. 443. - P. 110-114. - doi: 10.1038/nature05080.

87. Fucini R.V., Haringsma H.J., Deng P. et al. Adenosine modification may be preferred for reducing siRNA immune stimulation // Nucleic Acid Ther. - 2012. -Vol. 22. - P. 205-210. - doi: 10.1089/nat.2011.0334.

88. Fuentealba L.C., Eivers E., Ikeda A. et al. Integrating patterning signals: Wnt/GSK3 regulates the duration of the BMP/Smad1 signal // Cell. - 2007. -Vol. 131(5). - P. 980-993. - doi: 10.1016/j.cell.2007.09.027.

89. Fukumoto Y., Obata Y., Ishibashi K. et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine // Cytotechnology. - 2010. - Vol. 62(1). - P. 73-82. - doi: 10.1007/s10616-010-9259-z.

90. Galitsyna E.V., Bukharova T.B., Krivosheeva I.A., et al. Regulation of osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells by glycogen synthase kinase-3ß gene knockdown // 3rd Sechenov international biomedical summit (SIBS 2019). Biomed Hub. - 2019. - Vol. 4(3). - P. 14-15. - doi 10.1159/000502594.

91. Gambardella A., Nagaraju C.K., O'Shea P.J. et al. Glycogen synthase kinase-3a/ß inhibition promotes in vivo amplification of endogenous mesenchymal progenitors with osteogenic and adipogenic potential and their differentiation to the osteogenic lineage // J Bone Miner Res. - 2011. -Vol. 26(4). - P. 811-821. -doi: 10.1002/jbmr.266.

92. Gao C., Xiao G., Hu J. Regulation of Wnt/ß-catenin signaling by posttranslational modifications // Cell Biosci. - 2014. - Vol. 4(1). - Article number: 13. - P. 1-20. - doi: 10.1186/2045-3701-4-13.

93. Gao X., Kim K.S., Liu D. Non-viral gene delivery: what we know and what is next // AAPS J. - 2007. - Vol. 9. - P. E92-E104. - doi: 10.1208/aapsj0901009.

94. Ghadakzadeh S., Hamdy R.C., Tabrizian M. Efficient in vitro delivery of Noggin siRNA enhances osteoblastogenesis // Heliyon. - 2017. - Vol. 3(11) -Article No: e00450. - P. 1-21. - doi: 10.1016/j.heliyon.2017.e00450.

95. Ghadakzadeh S., Mekhail M., Aoude A. et al. Small players ruling the hard game: siRNA in bone regeneration // J Bone Miner Res. - 2016. - Vol. 31(3). -P. 475-487. - doi: 10.1002/jbmr.2816.

96. Ghassemi T., Shahroodi A., Ebrahimzadeh M.H. Current concepts in scaffolding for bone tissue engineering // Arch Bone Jt Surg. - 2018. - Vol. 6(2). -P. 90-99.

97. Gherardini L., Bardi G., Gennaro M. et al. Novel siRNA delivery strategy: a new "strand" in CNS translational medicine? // Cell Mol Life Sci. - 2014. -Vol. 71(1). - P. 1-20. - doi: 10.1007/s00018-013-1310-8.

98. Gilmoura P.S., O'Shea P.J., Faguraa M. et al. Human stem cell osteoblastogenesis mediated by novel glycogen synthase kinase 3 inhibitors induces bone formation and a unique bone turnover biomarker profile in rats // Toxicol Appl Pharmacol. - 2013. - Vol. 272(2). - P. 399-407. -doi: 10.1016/j.taap.2013.07.001.

99. Godbey W.T., Wu K.K., Mikos A.G. Poly(ethyleneimine)-mediated gene delivery affects endothelial cell function and viability // Biomaterials. - 2001. -Vol. 22 (5). - P. 471-480. - doi: 10.1016/s0142-9612(00)00203-9.

100. Golpich M., Amini E., Hemmati F. et al. Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3ß) signaling: Implications for Parkinson's disease // Pharmacol Res. - 2015. - Vol. 97. - P. 16-26. - doi: 10.1016/j.phrs.2015.03.010.

101. Tafer H. Bioinformatics of siRNA design. - P. 477-490. -doi.org/10.1007/978-1-62703-709-9_22 // Gorodkin J., Ruzzo W. L. (eds). RNA sequence, structure, and function: computational and bioinformatic methods. Methods in molecular biology. - Springer (Humana Press). - New York. - 2014. -Vol. 1097. - 533 pages. - doi: 10.1007/978-1-62703-709-9.

102. Graham F.L., Van Der Eb A.J. New technique for assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA // Virology. - 1973. - Vol. 52(2). - P. 456-467. -doi: 10.1016/0042-6822(73)90341-3.

103. Grimm D., Streetz K.L., Jopling C.L. et al. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways // Nature. -2006. - Vol. 441(7092). - P. 537-541. - doi: 10.1038/nature04791.

104. Groth T., Falck P., Miethke R-R. Cytotoxicity of biomaterials - basic mechanisms and in vitro test methods: a review // ALTA. - 1995. - Vol. 23(6). -P. 790-799. - doi: 10.1177/026119299502300609.

105. Guo X., Ramirez A., Waddell D.S. et al. Axin and GSK3- control Smad3 protein stability and modulate TGF- signaling // Genes Dev. - 2008. - Vol. 22(1). - P. 106-120. - doi: 10.1101/gad.1590908.

106. Hahn P., Schmidt C., Weber M. et al. RNA interference: PCR strategies for the quantification of stable degradation-fragments derived from siRNA-targeted mRNAs // Biomol Eng. - 2004. - Vol. 21(3-5). - P. 113-117. -doi: 10.1016/j.bioeng.2004.09.001.

107. Hall A., Lächelt U., Bartek J. et al. Polyplex Evolution: Understanding Biology, Optimizing Performance // Mol Ther. - 2017. - Vol. 25(7). - P. 14761490. - doi: 10.1016/j.ymthe.2017.01.024.

108. Hall A.H., Wan J., Shaughnessy E.E. et al. RNA interference using boranophosphate siRNAs: structure-activity relationships // Nucleic Acids Res. -2004. - Vol. 32 - P. 5991-6000. - doi: 10.1093/nar/gkh936.

109. Hamann A., Nguyen A., Pannier A.K. Nucleic acid delivery to mesenchymal stem cells: a review of nonviral methods and applications // J Biol Eng. - 2019. -Vol. 13. - Article number: 7. - P. 1-16. - doi: 10.1186/s13036-019-0140-0.

110. Hammond S.M. An overview of microRNAs // Adv Drug Deliv Rev. -2015. - Vol. 87. - P. 3-14. - doi: 10.1016/j.addr.2015.05.001.

111. Han X., Fang Q., Yao F. et al. The heterogeneous nature of polyethylenimine-DNA complex formation affects transient gene expression //

Cytotechnology. - 2009. - Vol. 60(1-3). - P. 63-75. - doi: 10.1007/s10616-009-9215-y.

112. Haraszti R.A., Roux L., Coles A.H. et al. 5-Vinylphosphonate improves tissue accumulation and efficacy of conjugated siRNAs in vivo // Nucleic Acids Res. - 2017. - Vol. 45. - P. 7581-7592. - doi: 10.1093/nar/gkx507.

113. Hart M., Concordet J.P., Lassot I. et al. The F-box protein beta-TrCP associates with phosphorylated beta-catenin and regulates its activity in the cell // Curr Biol. - 1999. - Vol. 9(4). - P. 207-210. - doi: 10.1016/s0960-9822(99)80091-8.

114. Hassan M.Q., Maeda Y., Taipaleenmaki H. et al. miR-218 directs a Wnt signaling circuit to promote differentiation of osteoblasts and osteomimicry of metastatic cancer cells // Biol. Chem. - 2012. - Vol. 287(50). - P. 42084-42092.

115. He Y., Zou L. Notch-1 inhibition reduces proliferation and promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells // Exp Ther Med. - 2019. - Vol. 18(3). - P. 1884-1890. - doi: 10.3892/etm.2019.7765.

116. Heller L.C., Cruz Y.L., Ferraro B. et al. Plasmid injection and application of electric pulses alter endogenous mRNA and protein expression in B16.F10 mouse melanomas // Cancer Gene Ther. - 2010. - Vol. 17(12). - P. 864-871. -doi: 10.1038/cgt.2010.43.

117. Herweiger H., Wolff J.A. Gene therapy progress and prospects: Hydrodynamic gene delivery // Gene ther. - 2007. - Vol. 14(2) - P.99-107. -doi: 10.1038/sj .gt.3302891.

118. Ho Y.K., Woo J.Y., Tu G.X.E. et al. A highly efficient non-viral process for programming mesenchymal stem cells for gene directed enzyme prodrug cancer therapy // Sci Rep. - 2020. - Vol. 10(1). - Article number: 14257. - P. 1-14. -doi: 10.1038/s41598-020-71224-2.

119. Ho Y.K., Zhou L.H., Tam K.C. et al. Enhanced non-viral gene delivery by coordinated endosomal release and inhibition of P-tubulin deactylase // Nucleic Acids Res. - 2017. - Vol. 45(6). - Article number: e38. - P. 1-11. -doi: 10.1093/nar/gkw1143.

120. Hoare M., Greiser U., Schu S. et al. Enhanced lipoplex-mediated gene expression in mesenchymal stem cells using reiterated nuclear localization sequence peptides // J Gene Med. - 2010. - Vol. 12. - P. 207-218. -doi: 10.1002/jgm.1426.

121. Höbel S., Aigner A. Polyethylenimine (PEI)/siRNA-mediated gene knockdown in vitro and in vivo // Methods Mol Biol. - 2010. - Vol. 623. - P. 28397. - doi: 10.1007/978-1-60761-588-0_18.

122. Hoeflich K.P., Luo J., Rubie E.A. et al. Requirement for glycogen synthase kinase-3beta in cell survival and NF-kappaB activation // Nature. - 2000. -Vol. 406(6791) - P. 86-90. - doi: 10.1038/35017574.

123. Hornung V., Guenthner-Biller M., Bourquin C. et al. Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7 // Nat Med. - 2005. - Vol. 11(3). - P. 263-270. -doi: 10.1038/nm1191.

124. Hoy S.M. Patisiran: first global approval // Drugs. - 2018. - Vol. 78(15) -P. 1625-1631. - doi: 10.1007/s40265-018-0983-6.

125. Hu B., Weng Y., Xia X-H. et al. Clinical advances of siRNA therapeutics // J Gene Med. - 2019. - Vol. 21(7) - Article number: e3097. - P. 1-14. -doi: 10.1002/jgm.3097.

126. Huang L., Wang Y., Jiang Y. et al. High levels of GSK-3ß signalling reduce osteogenic differentiation of stem cells in osteonecrosis of femoral head // J Biochem. - 2018. - Vol. 163(3) - P. 243-248. - doi: 10.1093/jb/mvx076.

127. Huh J.E., Ko R., Jung H.J. et al. Glycogen synthase kinase 3ß promotes osteogenic differentiation of murine adipose-derived stromal cells // PLoS One. -2013. - Vol. 8(1). - Article number: e54551. - P. 1-10. -doi: 10.1371/journal.pone.0054551.

128. Hunter A.C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity // Adv Drug Deliv Rev. - 2006 -Vol. 58(14). - P. 1523-1531. - doi: 10.1016/j.addr.2006.09.008.

129. Huynh C.T., Nguyen M.K., Naris M. et al. Light-triggered RNA release and induction of hMSC osteogenesis via photodegradable, dual-crosslinked hydrogels // Nanomedicine (Lond). - 2016. - Vol. 11(12). - P. 1535-1550. -doi:10.2217/nnm-2016-0088.

130. International Organization for Standardization (ISO) 10993-5. Biological evaluation of medical devices. Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. - 2009.

131. Jafari M., Soltani M., Naahidi S. et al. Nonviral approach for targeted nucleic acid delivery // Curr Med Chem. - 2012. - Vol. 19(2). - P. 197-208. -doi: 10.2174/092986712803414141.

132. James AW. Review of signaling pathways governing MSC osteogenic and adipogenic differentiation // Scientifica (Cairo). - 2013. - Vol. 2013. - Article ID: 684736. - P. 1-17. - doi: 10.1155/2013/684736.

133. Janas M.M., Jiang Y., Schlegel M.K. et al. Impact of oligonucleotide structure, chemistry, and delivery method on in vitro cytotoxicity // Nucleic Acid Ther. - 2017. - Vol. 27. - P. 11-22. - doi: 10.1089/nat.2016.0639.

134. Ji Y., Zhang P., Xing Y. et al. Effect of 1a, 25-dihydroxyvitamin D3 on the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells and the underlying regulatory mechanism // Int J Mol Med. - 2019. - Vol. 43(1). - P. 167176. - doi: 10.3892/ijmm.2018.3947.

135. Jia S., Yang X., Song W. et al. Incorporation of osteogenic and angiogenic small interfering RNAs into chitosan sponge for bone tissue engineering // Int J Nanomedicine. - 2014. - Vol. 9 - P. 5307-5316. - doi: 10.2147/IJN.S70457.

136. Jinturkar K.A., Rathi M.N., Misra A. Gene delivery using physical methods. - Chapter 3. - P. 83-126. - doi: 10.1016/b978-0-12-384964-9.00003-7 // Misra A. (ed). Challenges in delivery of therapeutic genomics and proteomics. - Elsevier Inc. - London; Burlington, MA - 2011. - 671 pages. - doi: 10.1016/C2010-0-65663-X.

137. Judge A.D., Bola G., Lee A.C. et al. Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo // Mol Ther. - 2006. - Vol. 13. -P. 494-505. - doi:10.1016/j.ymthe.2005.11.002.

138. Judge A.D., Sood V., Shaw J.R. et al. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA // Nat Biotechnol. -2005. - Vol. 23(4). - P. 457-462. - doi: 10.1038/nbt1081.

139. Kafil V., Omidi Y. Cytotoxic impacts of linear and branched polyethylenimine nanostructures in A431 cells // Bioimpacts. - 2011. - Vol. 1(1).

- P. 23-30. - doi: 10.5681/bi.2011.004.

140. Kamal El-Din Mohamed S., Waly N.G., Aboul-Ezz E.H.A. et al. In vitro proliferation of dental pulp stem cells from deciduous teeth // Egypt Dent J. -2017. - Vol. 63(4). - P. 1455-1461.

141. Kapinas K., Kessler C., Ricks T. et al. MiR-29 modulates Wnt signaling in human osteoblasts through a positive feedback loop // Biol Chem. - 2010. -Vol. 285(33). - P. 25221-25231. - doi: 10.1074/jbc.M110.116137.

142. Karra D., Dahm R. Transfection techniques for neuronal cells // J Neurosci.

- 2010. - Vol. 30(18). - P. 6171-6177. - doi:10.1523/JNEUROSCI.0183-10.2010.

143. Kawakami Y., Ii M, Matsumoto T. et al. A small interfering RNA targeting Lnk accelerates bone fracture healing with early neovascularization // Lab Invest. -2013. - Vol. 93(9). - P. 1036-1053. - doi: 10.1038/labinvest.2013.93.

144. Kazimierczak P., Przekora A. Osteoconductive and osteoinductive surface modifications of biomaterials for bone regeneration: a concise review // Coatings.

- 2020. - Vol. 10. - Article number: 971. - P. 1-25.-doi: 10.3390/coatings10100971.

145. Khazanov E., Simberg D., Barenholz Y. Lipoplexes prepared from cationic liposomes and mammalian DNA induce CpG-independent, direct cytotoxic effects in cell cultures and in mice // J Gene Med. - 2006. - Vol. 8(8). - P. 998-1007. -doi: 10.1002/jgm.933.

146. Kim T.K., Eberwine J.H. Mammalian cell transfection: the present and the future // Anal Bioanal Chem. - 2010. - Vol. 397 (8). - P. 3173-3178. -doi: 10.1007/s00216-010-3821-6.

147. Klünder I., Hülser D F. Beta-galactosidase activity in transfected Ltk- cells is differentially regulated in monolayer and in spheroid cultures // Exp Cell Res. -1993. - Vol. 207(1). - P.155-162. - doi: 10.1006/excr.1993.1175.

148. Kowalczewski C.J., Saul J.M. Surface-mediated delivery of siRNA from fibrin hydrogels for knockdown of the BMP-2 binding antagonist Noggin // Acta Biomater. - 2015. - Vol. 25. - P.109-120. - doi:10.1016/j.actbio.2015.07.045.

149. Kramer T., Schmidt B., Lo Monte F. Small-molecule inhibitors of GSK-3: structural insights and their application to Alzheimer's disease models // Int J Alzheimers Dis. - 2012. - Vol. 2012. - Article ID: 381029. - P. 1-32. -doi: 10.1155/2012/381029.

150. Krol J., Sobczak K., Wilczynska U. et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design // J Biol Chem. - 2004. - Vol. 279(40). - P. 42230-42239. - doi: 10.1074/jbc.M404931200.

151. Kugimiya F., Kawaguchi H., Ohba S. et al. GSK-3beta controls osteogenesis through regulating Runx2 activity // PLoS One. - 2007 - Vol 2(9). - Article number: e837. - P. 1-10. - doi: 10.1371/journal.pone.0000837.

152. Kuscu C., Kumar P., Kiran M. et al. tRNA fragments (tRFs) guide Ago to regulate gene expression post-transcriptionally in a Dicer-independent manner // RNA. - 2018. - Vol. 24(8) - P. 1093-1105. - doi:10.1261/rna.066126.118.

153. Lagana A., Veneziano D., Russo F. Computational design of artificial RNA molecules for gene regulation // RNA Bioinformatics. - 2015. - Vol. 1269. -P. 393-412. - doi: 10.1007/978-1-4939-2291-8_25.

154. Lal H., Ahmad F., Woodgett J. et al. The GSK-3 family as therapeutic target for myocardial diseases // Circ Res. - 2015. - Vol. 116(1) - P. 138-149. -doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.303613.

155. Lam J.K., Chow M.Y., Zhang Y. et al. siRNA versus miRNA as therapeutics for gene silencing // Mol Ther Nucleic Acids. - 2015. -Vol. 4(9) - Article number: e252. - P. 1-20. - doi:10.1038/mtna.201.

156. Langenbach F., Handschel J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and ß-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro // Stem Cell Res Ther. - 2013. - Vol. 4(5). Article number: 117. - P. 1-7. -doi: 10.1186/scrt328.

157. Layzer J.M., McCaffrey A.P., Tanner A.K. et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs // RNA. - 2004. - Vol. 10(5). - P. 766-771. -doi: 10.1261/rna.5239604.

158. Lee E.R., Marshall J., Siegel C.S. et al. Detailed analysis of structures and formulations of cationic lipids for efficient gene transfer to the lung // Hum Gene Ther. - 1996. - Vol. 7(14). - P. 1701-1717. - doi: 10.1089/hum.1996.7.14-1701.

159. Lee M., Simon A.D., Stein, C.A. et al. Antisense strategies to inhibit restenosis // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. - 1999. - Vol. 9, P. 487-492. -doi: 10.1089/oli.1.1999.9.487.

160. Lee S.J., Son S., Yhee J.Y. et al. Structural modification of siRNA for efficient gene silencing // Biotechnol Adv. - 2013. - Vol. 31(5). - P. 491-503. -doi: 10.1016/j.biotechadv.2012.09.002.

161. Lee Y.S., Nakahara K., Pham J.W. et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways // Cell. - 2004. -Vol. 117(1). - P. 69-81. - doi: 10.1016/s0092-8674(04)00261-2.

162. Legzdina D., Romanauska A., Nikulshin S., et al. Characterization of senescence of culture-expanded human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells // Int J Stem Cells. - 2016. - Vol. 9(1). - P. 124-136. -doi: 10.15283/ijsc.2016.9.1.124.

163. Li M., Cheng A., Vlassov A. et al. RNA interference (RNAi) is an evolutionarily conserved mechanism for silencing gene expression // Applied Biosystems Inc. - 2008. - TechNotes 15(3).

164. Li S.D., Huang L. Non-viral is superior to viral gene delivery // J Cont release. - 2007. - Vol. 123(3). - P. 181-183. - doi: 10.1016/j.jconrel.2007.09.004.

165. Liang C., Guo B., Wu H. et al. Aptamer-functionalized lipid nanoparticles targeting osteoblasts as a novel RNA interference - based bone anabolic strategy // Nat Med. - 2015. - Vol. 21(3) - P.288-294. - doi: 10.1038/nm.3791.

166. Liang M. H., Chuang D. M. Differential roles of glycogen synthase kinase-3 isoforms in the regulation of transcriptional activation // J Biol Chem. - 2006. -Vol. 281(41). - P. 30479-30484. - doi: 10.1074/jbc.M607468200.

167. Liang M.H., Chuang D.M. Regulation and function of glycogen synthase kinase-3 isoforms in neuronal survival // J Biol Chem. - 2007 - Vol. 282(6). -P. 3904-3917. - doi: 10.1074/jbc.M605178200.

168. Lin G., Liu B., Meng Z. et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3ß in human lung cancer cells // Exp Cell Res. - 2017. -Vol. 352(2). - P. 364-374. - doi: 10.1016/j.yexcr.2017.02.033.

169. Liu X., Wang W., Samarsky D. et al. Tumor-targeted in vivo gene silencing via systemic delivery of cRGD-conjugated siRNA // Nucleic Acids Res. - 2014. -Vol. 42. - P. 11805-11817. - doi: 10.1093/nar/gku831.

170. Loiselle A.E., Lloyd S.A., Paul E.M. et al. Inhibition of GSK-3 beta rescues the impairments in bone formation and mechanical properties associated with fracture healing in osteoblast selective connexin 43 deficient mice // PloS one. -2013. - Vol. 8(11). - Article number: e81399. - P. 1-10 -doi: 10.1371/journal.pone.0081399.

171. Logie C., van Schaik T., Pompe T., et al. Fibronectin-functionalization of 3D collagen networks supports immune tolerance and inflammation suppression in human monocyte-derived macrophages // Biomaterials. - 2021. - Vol. 268. -Article number: 120498. - P. 1-26. - doi: 10.1016/j.biomaterials.2020.120498.

172. Lou Y-R., Toh T.C., Tee Y.H. et al. 25-Hydroxyvitamin D3 induces osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells // Sci Rep. - 2017. -Vol. 7. - Article number: 42816. - P. 1-12. - doi: 10.1038/srep42816.

173. Lv H., Zhang S., Wang B. et al. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery // J Control Release. - 2006. - Vol. 114(1). - P. 100109. - doi: 10.1016/j.jconrel.2006.04.014.

174. Ma Z., Yang C., Song W. et al. Chitosan hydrogel as siRNA vector for prolonged gene silencing // J Nanobiotechnology. - 2014. - Vol. 12. - Article number: 23. - P. 1-9. - doi: 10.1186/1477-3155-12-23.

175. Mahmoodi Chalbatani G., Dana H., Gharagouzloo E. et al. Small interfering RNAs (siRNAs) in cancer therapy: a nano-based approach // Int J Nanomedicine. -2019. - Vol. 14. - P. 3111-3128. - doi: 10.2147/IJN.S200253.

176. Manoharan M., Akinc A., Pandey R. K. et al. Unique gene-silencing and structural properties of 2'-fluoro-modified siRNAs // Angew Chem Int Ed Engl. -2011. - Vol. 50. - P. 2284-2288. - doi: 10.1002/anie.201006519.

177. Marsell R., Sisask G., Nilsson Y. et al. GSK-3 inhibition by an orally active small molecule increases bone mass in rats // Bone. - 2012. - Vol. 50(3). - P. 619627. - doi: 10.1016/j.bone.2011.11.007.

178. Martínez-Peinado P., Pascual-García S., Roche E. et al. Differences of clonogenic mesenchymal stem cells on immunomodulation of lymphocyte subsets // J Immunol Res. - 2018. - Article ID: 7232717. - P. 1-11. -doi: 10.1155/2018/7232717.

179. Matte U., Baldo G., Giugliani R. Non viral gene transfer approaches for lysosomal storage disorders. - Chapter 7. - P. 147-168. - doi: 10.5772/18106 // Yuan X (ed). Non-viral gene therapy. - IntechOpen Limited. - London. - 2011. -696 pages. - doi: 10.5772/1010.

180. McCoy M.G., Seo B.R., Choi S. et al. Collagen I hydrogel microstructure and composition conjointly regulate vascular network formation // Acta Biomater. - 2016. - Vol. 44. - P. 200-208. - doi: 10.1016/j.actbio.2016.08.028.

181. Midoux P., Pichon C., Yaounac J.J. et al. Chemical vectors for gene delivery; a current review on polymers, peptides and lipids containing histidine or imidazole as nucleic acid carriers // Br J Pharmacol. - 2009. - Vol. 157(2) -P. 166-178. - doi: 10.1111/j.1476-5381.2009.00288.x.

182. Minteer D., Marra K.G., Rubin J.P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. - P. 59-71. - doi: 10.1007/10_2012_146 // Weyand B., Dominici M. Hass R. et al. (eds). Mesenchymal stem cells - basics

and clinical application I. - Adv Biochem Eng Biotechnol. - Vol 129. - SpringerVerlag. - Berlin; Heidelberg. - 2013. - 194 pages. - doi: 10.1007/978-3-64235671-1.

183. Moghimi S.M., Symonds P., Murray J.C. et al. A two-stage poly(ethylenimine)-mediated cytotoxicity: implications for gene transfer/therapy // Mol Ther. - 2005. - Vol. 11(6). - P. 990-995. - doi: 10.1016/j.ymthe.2005.02.010.

184. Monnery B.D., Wright M., Cavill R. et al. Cytotoxicity of polycations: Relationship of molecular weight and the hydrolytic theory of the mechanism of toxicity // Int J Pharm. - 2017. - Vol. 521(1-2). - P. 249-258. -doi: 10.1016/j.ijpharm.2017.02.048.

185. Monteys A.M., Spengler R.M., Wan J. et al. Structure and activity of putative intronic miRNA promoters // RNA. - 2010. - Vol 16(3). - P. 495-505. -doi: 10.1261/rna.1731910.

186. Morsczeck C., Reck A., Reichert T.E. WNT3A and the induction of the osteogenic differentiation in adipose tissue derived mesenchymal stem cells // Tissue Cell. - 2017. - Vol. 49(4) - P. 489-494. - doi: 10.1016/j.tice.2017.05.004.

187. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods. -1983. -Vol. 65(1-2). - P. 55-63. - doi: 10.1016/0022-1759(83)90303-4.

188. Mostaghaci B., Loretz B., Lehr C.M. Calcium phosphate system for gene delivery: historical background and emerging opportunities // Curr Pharm Des. - 2016. - Vol. 22(11). - P. 1529-1533. -doi: 10.2174/1381612822666151210123859.

189. Munye M.M., Ravi J., Tagalakis A.D. et al. Role of liposome and peptide in the synergistic enhancement of transfection with a lipopolyplex vector // Sci Rep. -2015. - Vol. 5. - P. 9292. - doi: 10.1038/srep09292.

190. Naciri M., Kuystermans D., Al-Rubeai M. Monitoring pH and dissolved oxygen in mammalian cell culture using optical sensors // Cytotechnology. - 2008. - Vol. 57(3). - P. 245-250. - doi: 10.1007/s10616-008-9160-1.

191. Nakanishi K. Anatomy of RISC: how do small RNAs and chaperones activate Argonaute proteins? // Wiley Interdiscip Rev RNA. - 2016. - Vol. 7(5). -P. 637-660. - doi: 10.1002/wrna.1356.

192. Nayerossadat N., Maedeh T., Ali P.A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery // Adv Biomed Res. - 2012. - Vol. 1(2). - Article number: 27. -P. 1-11. - doi: 10.4103/2277-9175.98152.

193. Needham C.J., Shah S.R., Mountziaris P.M. et al. Modulation of polyplex release from biodegradable microparticles through poly(ethylenimine) modification and varying loading concentration // Pharm Res. - 2014. - Vol. 31(1). - P. 77-85. - doi: 10.1007/s11095-013-1133-1.

194. Neuhaus B., Tosun B., Rotan O. et al. Nanoparticles as transfection agents: a comprehensive study with ten different cell lines // RSC Adv. - 2016. - Vol. 6. -P. 18102-18112. - doi: 10.1039/C5RA25333K.

195. Nguyen M.K., Jeon O., Krebs M.D. et al. Sustained localized presentation of RNA interfering molecules from in situ forming hydrogels to guide stem cell osteogenic differentiation // Biomaterials. - 2014. - Vol. 35(24). -P.6278-6286. -doi: 10.1016/j.biomaterials.2014.04.048.

196. O'Keefe E.P. siRNAs and shRNAs: tools for protein knockdown by gene silencing // Mater Methods. - 2013. - Vol. 3. - Article number: 197. - P. 1-13. -doi: 10.13070/mm.en.3.197.

197. Olivares-Navarrete R., Hyzy S.L., Hutton D.L. et al. Role of non-canonical Wnt signaling in osteoblast maturation on microstructured titanium surfaces // Acta Biomater. - 2011. - Vol. 7(6). - P. 2740-2750. -doi: 10.1016/j.actbio.2011.02.030.

198. Oliveira C., Ribeiro A.J., Veiga F. et al. Review recent advances in nucleic acid-based delivery: from bench to clinical trials in genetic diseases // J Biomed Nanotechnol. - 2016. - Vol. 12(5). - P. 841-862. - doi: 10.1166/jbn.2016.2245.

199. Paddison P.J., Caudy A.A., Bernstein E. et al. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells // Genes Dev. - 2002. -Vol. 16(8). - P. 948-958. - doi: 10.1101/gad.981002.

200. Parisi L., Toffoli A., Ghezzi B., et al. A glance on the role of fibronectin in controlling cell response at biomaterial interface // Jpn Dent Sci Rev. - 2020. -Vol. 56(1). - P. 50-55. - doi:10.1016/j.jdsr.2019.11.002.

201. Parmar R., Willoughby J.L.S., Liu J. et al. 5'-(E)-vinylphosphonate: a stable phosphate mimic can improve the RNAi activity of siRNA-GalNAc conjugates // Chembiochem. - 2016. - Vol. 17(11). - P. 985-989. -doi: 10.1002/cbic.201600130.

202. Pascut D., Bedogni G., Tiribelli C. Silencing efficacy prediction: a retrospective study on target mRNA features // Biosci Rep. - 2015. - Vol. 35(2). -Article number: e00185. - P. 1-8. - doi: 10.1042/BSR20140147.

203. Peacock H., Kannan A., Beal P. A. et al. Chemical modification of siRNA bases to probe and enhance RNA interference // J Org Chem. - 2011. - Vol. 76. -P. 7295-7300. - doi: 10.1021/jo2012225.

204. Perevyazko I.Y., Bauer M., Pavlov G.M. et al. Polyelectrolyte complexes of DNA and linear PEI: formation, composition and properties // Langmuir. - 2012. -Vol. 28(46). - P. 16167-16176. - doi: 10.1021/la303094b.

205. Polakis P. Casein kinase 1: a Wnt'er of disconnect // Curr Biol. - 2002. -Vol. 12(14). - P. R499-R501. - doi: 10.1016/s0960-9822(02)00969-7.

206. Povedailo V.A., Lysenko I.L., Tikhomirov S.A. et al. Fluorescent properties of carboxyfluorescein bifluorophores // J Fluoresc. - 2020. - Vol. 30(3). - P. 629635. - doi: 10.1007/s10895-020-02535-w.

207. Prosser A., Scotchford C., Roberts G. et al. Integrated multi-assay culture model for stem cell chondrogenic differentiation // Int J Mol Sci. - 2019. -Vol. 20(4). - Article number: 951. - P. 1-15. - doi: 10.3390/ijms20040951.

208. Rahimi P., Mobarakeh V.I., Kamalzare S. et al. Comparison of transfection efficiency of polymer-based and lipid-based transfection reagents // Bratisl Lek Listy. - 2018. - Vol. 119(11). - P. 701-705. - doi: 10.4149/BLL_2018_125.

209. Ramamoorth M., Narvekar A. Non viral vectors in gene therapy- an overview // J Clin Diagn Res. - 2015. - Vol. 9(1). - P. GE01-GE06. -doi: 10.7860/JCDR/2015/10443.5394.

210. Rao D.D., Vorhiesa J.S., Senzerabcd N. et al. siRNA vs. shRNA: similarities and differences // Adv Drug Deliv Rev. - 2009. - Vol. 61(9). - P. 746-759. -doi: 10.1016/j.addr.2009.04.004.

211. Rejman J., Bragonzi A., Conese M. Role of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis in gene transfer mediated by lipo- and polyplexes // Mol Ther. - 2005.

- Vol. 12(3). - P. 468-474. - doi: 10.1016/j.ymthe.2005.03.038.

212. Ren Y. Gong W., Xu Q. et al. siRecords: an extensive database of mammalian siRNAs with efficacy ratings // Bioinformatics. - 2006. - Vol. 22(8). -P. 1027-1028. - doi: 10.1093/bioinformatics/btl026.

213. Reynolds N., Dearnley M., Hinton T.M. Polymers in the delivery of siRNA for the treatment of virus infections // Top Curr Chem (Cham). - 2017. -Vol. 375(2). - Article number: 38. - P. 1-42. - doi: 10.1007/s41061-017-0127-6.

214. Riaz M.K., Riaz M.A., Zhang X. et al. Surface functionalization and targeting strategies of liposomes in solid tumor therapy: a review // Int J Mol Sci. -2018. - Vol. 19(1). - Article number: 195. - P. 1-27. -doi: 10.3390/ijms19010195.

215. Rios C.N., Skoracki R.J., Mathur A.B. GNAS1 and PHD2 short-interfering RNA support bone regeneration in vitro and in an in vivo sheep model // Clin Orthop Relat Res. - 2012. - Vol. 470(9). - P. 2541-2553. - doi: 10.1007/s11999-012-2475-4.

216. Robbins M, Judge A, MacLachlan I. siRNA and innate immunity // Oligonucleotides. - 2009. - Vol. 19(2). - P. 89-102. - doi: 10.1089/oli.2009.0180.

217. Robert L., Robert B. Structural glycoproteins of connective tissue: their role in morphogenetic and immunopathology. - P. 240-256. - doi: 10.1007/978-3-642-61932-8_32 // Fricke R., Hartmann F. (eds). Connective tissues. - Springer-Verlag.

- Berlin; Heidelberg. - 1974. - 312 pages. - doi: 10.1007/978-3-642-61932-8.

218. Ruminski S., Pawlos D., Lewandowska-Szumiel M. Expansion of adipose-derived stem cells with FGF2 up-regulates mesenchymal markers and modifies osteogenic differentiation potential // Front Bioeng Biotechnol. - Conference

Abstract: 10th World Biomaterials Congress. - 2016. - Vol. 4. -doi: 10.3389/conf.FBI0E.2016.01.00634.

219. Ryan A.J., Gleeson J.P., Matsiko A. et al. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair // J Anat. - 2015. - Vol. 227(6). - P. 732-745. -doi: 10.1111/joa.12262.

220. Saeed H., Ahsan M., Saleem Z. et al. Mesenchymal stem cells (MSCs) as skeletal therapeutics - an update // J Biomed Sci. - 2016. - Vol. 16(23). - Article number: 41. - P. 1-15. - doi: 10.1186/s12929-016-0254-3.

221. Saito K., Nishida K.M., Mori T. et al. Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome // Genes Dev. - 2006. - Vol. 20(16). - P.2214-2222. -doi: 10.1101/gad.1454806.

222. Sang Y., Xie K., Mu Y. et al. Salt ions and related parameters affect PEI-DNA particle size and transfection efficiency in Chinese hamster ovary cells // Cytotechnology. - 2015. - Vol. 67(1). -P. 67-74. - doi: 10.1007/s10616-013-9658-z.

223. Santiago-Torres J.E., Lovasz R., Bertone A.L. Fetal vs adult mesenchymal stem cells achieve greater gene expression, but less osteoinduction // World J Stem Cells. - 2015. - Vol. 7(1). -P. 223-234. - doi:10.4252/wjsc.v7.i1.223.

224. Sarett S.M., Nelson C.E., Duvall C.L. Technologies for controlled, local delivery of siRNA // J Control Release. - 2015. - Vol. 218. - P. 94-113. -doi: 10.1016/j.jconrel.2015.09.066.

225. Sarinnaphakorn L., Silvio L.Di. Surface-modified titanium to enhance osseointegration in dental implants. - Chapter 23. - P. 572-588. - doi: 10.1533/9781845695477.3.572 // Silvio L.Di. (ed) Cellular response to biomaterials. Woodhead publishing series in biomaterials. - Woodhead Publishing Limited. - Boca Raton, FL; New Delhi - 2009. - 648 pages.

226. Saunders J.T., Schwarzbauer J.E. Fibronectin matrix as a scaffold for procollagen proteinase binding and collagen processing // Mol Biol Cell. -2019. -Vol. 30(17). - P. 2218-2226. - doi: 10.1091/mbc.E19-03-0140.

227. Saw P.E., Song E-W. siRNA therapeutics: a clinical reality // Sci China Life Sci. - 2020. - Vol. 63(4). - P. 485-500. - doi: 10.1007/s11427-018-9438-y.

228. Scarborough R.J, Gatignol A. RNA Interference therapies for an HIV-1 functional cure // Viruses. - 2018. - Vol. 10(1). - Article number: 8. - P. 1-19 -doi: 10.3390/v10010008.

229. Schoeman M.A., Moester M.J., Oostlander A.E. et al. Inhibition of GSK3ß stimulates BMP signaling and decreases SOST expression which results in enhanced osteoblast differentiation // J Cell Biochem. - 2015. - Vol. 116(12). - P. 2938-2946. - doi: 10.1002/jcb.25241.

230. Scholz C., Wagner E. Therapeutic plasmid DNA versus siRNA delivery: common and different tasks for synthetic carriers // J Control Release. - 2012. -Vol. 161(2). - P. 554-565. - doi: 10.1016/j.jconrel.2011.11.014.

231. Schwarz D.S., Tomari Y., Zamore P.D. The RNA-induced silencing complex is a Mg2+-dependent endonuclease // Curr Biol. - 2004. - Vol. 14. -P. 787-791. - doi: 10.1016/j.cub.2004.03.008.

232. Scott L.J. Givosiran: First Approval // Drugs. - 2020 - Vol. 80(3). - P. 335339. - doi: 10.1007/s40265-020-01269-0.

233. Shen R., Chen M., Wang Y.J. et al. Smad6 interacts with Runx2 and mediates Smad ubiquitin regulatory factor 1-induced Runx2 degradation // J Biol Chem. - 2006. - Vol. 281(6). - P. 3569-3576. - doi: 10.1074/jbc.M506761200.

234. Shen W., Liang X.H., Sun H., et al. 2'-Fluoro-modified phosphorothioate oligonucleotide can cause rapid degradation of P54nrb and PSF // Nucleic Acids Res. - 2015. - Vol. 43(9). - P. 4569-4578. - doi: 10.1093/nar/gkv298.

235. Shende P., Ture N., Gaud R.S. et al. Lipid- and polymer-based plexes as therapeutic carriers for bioactive molecules // Int J Pharm. - 2019. -Vol. 558. -P. 250-260. - doi: 10.1016/j.ijpharm.2018.12.085.

236. Sheridan C. PCSK9-gene-silencing, cholesterol-lowering drug impresses // Nat Biotechnol. - 2019. -Vol. 37(12). - P. 1385-1387. - doi: 10.1038/s41587-019-0351-4.

237. Shi B., Xue M., Wang Y. et al. An improved method for increasing the efficiency of gene transfection and transduction // Int J Physiol. Pathophysiol Pharmacol. - 2018. - Vol. 10(2). - P. 95-104.

238. Shim M.S., Kwon Y.M. Controlled delivery of plasmid DNA and siRNA to intracellular targets using ketalized polyethylenimine // Biomacromolecules. -2008. - Vol. 9(2). - P. 444-455. - doi: 10.1021/bm7007313.

239. Shpiz S., Kwon D., Rozovsky Y. et al. rasiRNA pathway controls antisense expression of Drosophila telomeric retrotransposons in the nucleus // Nucleic Acids Res. - 2009. - Vol. 37(1). - P. 268-278. - doi: 10.1093/nar/gkn960.

240. Shyni V., Elisseeff J.H. Hydrogels for musculoskeletal tissue engineering. -P. 95-144. - doi: 10.1007/12_072 // Werner C. (ed). Polymers for regenerative medicine. - Adv Polym Sci. - Vol. 203. - Springer-Verlag. - Berlin; Heidelberg. -2006. - 228 pages. - doi: 10.1007/11604228.

241. Simoes S., Filipe A., Faneca H. et al. Cationic liposomes for gene delivery // Expert Opin Drug Deliv. - 2005. - Vol. 2(2). - P. 237-254. -doi: 10.1517/17425247.2.2.237.

242. Sisask G. et al. Rats treated with AZD2858, a GSK3 inhibitor, heal fractures rapidly without endochondral bone formation. // Bone. - 2013. - Vol. 54. - P. 126132. - doi: 10.1016/j.bone.2013.01.019.

243. Somaiah C., Kumar A., Mawrie D., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells // PLoS One. -2015. - Vol. 10(12). - Article number: e0145068. - P. 1-15. -doi: 10.1371/journal.pone.0145068.

244. Soucek L., Evan G.I. The ups and downs of Myc biology // Curr Opin Genets Dev. - 2010. - Vol. 20(1) - P. 91-95. - doi: 10.1016/j.gde.2009.11.001.

245. Spinella-Jaegle S., Rawad G., Kawai S. et al. Sonic hedgehog increases the commitment of pluripotent mesenchymal cells into the osteoblastic lineage and

abolishes adipocytic differentiation // J Cell Sci. - 2001. - Vol. 114 (Pt 11). -P. 2085-2094.

246. Stamos J.L., Weis W.I. The ß-catenin destruction complex // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2013. - Vol. 5(1). - Article number: a007898. - P. 1-16. -doi: 10.1101/cshperspect.a007898.

247. Stoffels J.M., Zhao C., Baron W. Fibronectin in tissue regeneration: timely disassembly of the scaffold is necessary to complete the build // Cell Mol Life Sci. - 2013. - Vol. 70(22). - P. 4243-4253. - doi: 10.1007/s00018-013-1350-0.

248. Suh J.M., Gao X., McKay J. et al. Hedgehog signaling plays a conserved role in inhibiting fat formation // Cell Metab. - 2006. - Vol. 3(1). - P. 25-34. -doi: 10.1016/j.cmet.2005.11.012.

249. Suk J.S., Suh J., Choy K. et al. Gene delivery to differentiated neurotypic cells with RGD and HIV Tat peptide functionalized polymeric nanoparticles // Biomaterials. - 2006. - Vol. 27(29). - P. 5143-5150. -doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.05.013.

250. Sun X., Zhang N. Cationic polymer optimization for efficient gene delivery // Mini Rev Med Chem. - 2010. - Vol. 10(2). - P. 108-125. -doi: 10.2174/138955710791185109.

251. Sung K.E., Su G., Pehlke C. et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices // Biomaterials. - 2009. - Vol. 30(27). - P. 4833-4841. -doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.05.043.

252. Taelman V.F., Dobrowolski R., Plouhinec J.L. et al. Wnt signaling requires sequestration of glycogen synthase kinase 3 inside multivesicular endosomes // Cell. - 2010 - Vol. 143(7). - P. 1136-1148. - doi: 10.1016/j.cell.2010.11.034.

253. Takahashi-Yanaga F. Activator or inhibitor? GSK-3 as a new drug target // Biochem Pharmacol. - 2013. - Vol. 86(2). - P. 191-199. -doi: 10.1016/j.bcp.2013.04.022.

254. Takasaki S. Selecting effective siRNA target sequences by using Bayes' theorem // Comput Biol Chem. - 2009. - Vol. 33(5). - P. 368-372. -doi: 10.1016/j.compbiolchem.2009.07.009.

255. Takasaki S. Methods for selecting effective siRNA target sequences using a variety of statistical and analytical techniques // Methods Mol Biol. - 2013. -Vol. 942. - P. 17-55. - doi: 10.1007/978-1-62703-119-6_2.

256. Tamm C., Kadekar S., Pijuan-Galito S. et al. Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents // Stem Cell Rev. - 2016.

- Vol. 12(5). - P. 584-591. - doi: 10.1007/s12015-016-9673-5.

257. Thomas P., Smart T.G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins // J Pharmacol Toxicol Methods. - 2005. - Vol. 51(3). -P. 187-200. - doi: 10.1016/j.vascn.2004.08.014.

258. Trivedi A., Miyazawa B., Gibb S. et al. Bone marrow donor selection and characterization of MSCs is critical for pre-clinical and clinical cell dose production // J Transl Med. - 2019. - Vol. 17(1). - Article number: 128. - P. 1-16.

- doi: 10.1186/s12967-019-1877-4.

259. Truss M., Swat M., Kielbasa S.M. et al. HuSiDa - the human siRNA database: an open-access database for published functional siRNA sequences and technical details of efficient transfer into recipient cells. // Nucleic Acids Res. -2005. - Vol. 33 (Database issue). - P. D108-D111. - doi: 10.1093/nar/gki131.

260. Turner J.J., Jones S.W., Moschos S.A. MALDI-TOF mass spectral analysis of siRNA degradation in serum confirms an RNAse A-like activity // Mol Biosyst.

- 2007. - Vol 3(1). - P.43-50. - doi: 10.1039/b611612d.

261. Tzeng S.Y., Hung B.P., Grayson W.L., et al. Cystamine-terminated poly(beta-amino ester)s for siRNA delivery to human mesenchymal stem cells and enhancement of osteogenic differentiation // Biomaterials. - 2012. - Vol. 33(32). -P. 8142-8151. - doi:10.1016/j.biomaterials.2012.07.036.

262. Uchida S., Yanagihara K., Matsui A. et al. mRNA as a tool for gene transfection in 3D cell culture for future regenerative therapy // Micromachines

(Basel). - 2020. - Vol. 11(4). - Article number: 426. - P. 1-9. -doi: 10.3390/mi11040426.

263. Vazquez F., Vaucheret H., Rajagopalan R. et al. Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs // Mol Cell. - 2004. -Vol. 16 (1). - P. 69-79. - doi: 10.1016/j.molcel.2004.09.028.

264. Vert J.P., Foveau N., Lajaunie C. et al. An accurate and interpretable model for siRNA efficacy prediction // BMC Bioinformatics. - 2006. - Vol. 7. - Article number: 520. - P. 1-17. - doi: 10.1186/1471-2105-7-520.

265. Vishal M., Vimalraj S., Ajeetha R. et al. MicroRNA-590-5p stabilizes Runx2 by targeting Smad7 during osteoblast differentiation // J Cell Physiol. -2017. - Vol. 232(2). - P. 371-380. - doi: 10.1002/jcp.25434.

266. Volkov A.A., Kruglova N.S., Meschaninova M.I. et al. Selective protection of nuclease-sensitive sites in siRNA prolongs silencing effect // Oligonucleotides. - 2009. - Vol. 19(2). - P. 191-202. - doi: 10.1089/oli.2008.0162.

267. Wahyudi H., Reynolds A.A., Li Y. et al. Targeting collagen for diagnostic imaging and therapeutic delivery // J Control Release. - 2016. - Vol. 240. -P. 323-331. - doi: 10.1016/j.jconrel.2016.01.007.

268. Wallenstein E.J., Barminko J., Schloss R.S. et al. Serum starvation improves transient transfection efficiency in differentiating embryonic stem cells // Biotechnol Prog. - 2010. - Vol. 26(6). - P. 1714-1723. - doi:10.1002/btpr.472.

269. Wang J., Lu Z., Wientjes M.G. et al. Delivery of siRNA therapeutics: barriers and carriers // AAPS J. - 2010. - Vol. 12(4). - P. 492-503. -doi: 10.1208/s12248-010-9210-4.

270. Wang L.L., Jason A. Burdick J.A. Engineered hydrogels for local and sustained delivery of RNA-interference therapies // Adv Healthc Mater. - 2017. -Vol. 6(1). - Article number: 1601041. - P. 1-33. - doi: 10.1002/adhm.201601041.

271. Wang Q., Cai J., Cai X.H. et al. miR-346 regulates osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by targeting the Wnt/ ß -catenin pathway // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(9) - Article number: e72266. -P. 1-8. - doi: 10.1371/journal.pone.0072266.

272. Wang R.N., Green J., Wang Z. et al. Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in development and human diseases // Genes Dis. - 2014. - Vol. 1(1). -P. 87-105. - doi: 10.1016/j.gendis.2014.07.005.

273. Wang S., Allen N., Vickers T. A. et al. Cellular uptake mediated by epidermal growth factor receptor facilitates the intracellular activity of phosphorothioate-modified antisense oligonucleotides // Nucleic Acids Res. -2018. - Vol. 46. - P. 3579-3594. - doi: 10.1093/nar/gky145.

274. Wang T., Larcher L.M., Ma L. et al. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides // Molecules. - 2018. - Vol. 23(10). - Article number: 2564. - P. 1-15. - doi: 10.3390/molecules23102564.

275. Wang Y., Malcolm D.W., Benoit D.S.W. Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing // Biomaterials. -2017. - Vol. 139. - P.127-138. - doi: 10.1016/j.biomaterials.2017.06.001.

276. Wang Z., Xie Q., Yu Z. et al. A regulatory loop containing miR-26a, GSK3ß and C/EBPa regulates the osteogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells // Sci Rep. - 2015. - Vol. 5 - Article number: 15280 - P. 1-18. -doi: 10.1038/srep15280.

277. Weber L.M., Hayda K.N., Anseth K.S. Cell-matrix interactions improve beta-cell survival and insulin secretion in three-dimensional culture // Tissue Eng Part A. - 2008. - Vol. 14(12). - P. 1959-1968. - doi: 10.1089/ten.tea.2007.0238.

278. Wei X., Shao B., He Z. et al. Cationic nanocarriers induce cell necrosis through impairment of Na(+)/K(+)-ATPase and cause subsequent inflammatory response // Cell Res. - 2015. - Vol. 25(2). - P. 237-253. - doi: 10.1038/cr.2015.9.

279. Williams B.R.G. Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation // Biochem Soc Trans. - 1997. - Vol. 25(2). - P. 509-513. - doi: 10.1042/bst0250509.

280. Wu Q., Wang K., Wang X. et al. Delivering siRNA to control osteogenic differentiation and real-time detection of cell differentiation in human

mesenchymal stem cells using multifunctional gold nanoparticles // J Mater Chem B. - 2020. - Vol. 8(15). - P. 3016-3027. - doi: 10.1039/c9tb02899d.

281. Xiang S., Tong H., Shi Q. et al. Uptake mechanisms of non-viral gene delivery // J Control Release. - 2012. - Vol. 158(3) - P. 371-378. -doi: 10.1016/j.jconrel.2011.09.093.

282. Xu C-F., Wang J. Delivery systems for siRNA drug development in cancer therapy // Asian J Pharm Sci. - 2015. - Vol. 10(1). - P. 1-12. -doi: 10.1016/j.ajps.2014.08.011.

283. Yang F., Cho S.W., Love K. Nanoparticles for siRNA delivery to stem cells for enhanced osteogenesis // 56th Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society. - 2010. - Paper No: 260.

284. Yang J., Shi P., Tu M. et al. Bone morphogenetic proteins: relationship between molecular structure and their osteogenic activity // Food Sci Hum Well. -2014. - Vol. 3(3-4). - P. 127-135. - doi: 10.1016/j.fshw.2014.12.002.

285. Yang T.A., Heiser W.C., Sedivy J.M. Efficient in situ electroporation of mammalian cells grown on microporous membranes // Nucleic Acids Res. - 1995. - Vol. 23(15). - P. 2803-2810. - doi: 10.1093/nar/23.15.2803.

286. Yi R., Qin Y., Macara I.G. et al. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs // Genes Dev. - 2003. -Vol. 17(24). -P. 3011-3016. - doi: 10.1101/gad.1158803.

287. Yin H., Kanasty R.L., Eltoukhy A.A. et al. Non-viral vectors for gene-based therapy // Nat Rev Genet. - 2014. - Vol. 15(8). - P. 541-555. -doi: 10.1038/nrg3763.

288. Yu A-M., Jian C., Yu A.H. et al. RNA therapy: Are we using the right molecules? // Pharmacol Ther. - 2019. -Vol. 196. - P. 91-104. -doi: 10.1016/j.pharmthera.2018.11.011.

289. Yu J-Y., Taylor J., DeRuiter S.L. et al. Simultaneous inhibition of GSK3alpha and GSK3beta using hairpin siRNA expression vectors // Mol Ther. -2003. - Vol. 7(2). - P. 228-236. - doi: 10.1016/s1525-0016(02)00037-0.

290. Yu X., Liang X., Xie H. et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX // Biotechnol Lett. - 2016. -Vol. 38(6). - P. 919-929. - doi: 10.1007/s10529-016-2064-9.

291. Yuan W., Li H. Polymer-based nanocarriers for therapeutic nucleic acids delivery. - Chapter 14. - P.445-460. - doi: 10.1016/B978-0-323-46143-6.00014-2// Andronescu E., Grumezescu A.M. (eds). Nanostructures for drug delivery. Micro and nano technologies. - Elsevier Inc. - Amsterdam; Kidlington, Oxford; Cambridge, MA. - 2017. - 985 pages. - doi: 10.1016/B978-0-323-46143-6.00031-2.

292. Zhang D., Wu X., Chen J. The development of collagen based composite scaffolds for bone regeneration // Bioact Mater. - 2018. - Vol. 3(1). - P. 129-138. doi: 10.1016/j.bioactmat.2017.08.004.

293. Zhang J., Tu Q., Bonewald L.F. et al. Effects of miR-335-5p in modulating osteogenic differentiation by specifically downregulating Wnt antagonist DKK1 // J Bone Miner. Res. - 2011. - Vol. 26(8). - 1953-1963. - doi: 10.1002/jbmr.377.

294. Zhang J.H., Jiao L.Y., Li T.J. et al. GSK-30 suppresses HCC cell dissociation in vitro by upregulating epithelial junction proteins and inhibiting Wnt/p-catenin signaling pathway // J Cancer. - 2017. - Vol. 8(9). - P. 1598-1608. - doi: 10.7150/jca.18744.

295. Zhang S., Zhi D., Huang L. Lipid-based vectors for siRNA delivery // J Drug Target. - 2012. - Vol. 20(9). - P. 724-735. -doi: 10.3109/1061186X.2012.719232.

296. Zhang W.B., Zhong W.J., Wang L. A signal-amplification circuit between miR-218 and Wnt/beta-catenin signal promotes human adipose tissue-derived stem cells osteogenic differentiation // Bone. - 2014. - Vol. 58. - P. 59-66. -doi: 10.1016/j.bone.2013.09.015.

297. Zhu L., Mahato R.I. Lipid and polymeric carrier-mediated nucleic acid delivery // Expert Opin Drug Deliv. - 2010. - Vol. 7(10). - P. 1209-1226. -doi: 10.1517/17425247.2010.513969.

298. Ziello J.E., Huang Y., Jovin I.S. Cellular endocytosis and gene delivery // Mol Med. - 2010. - Vol. 16(5-6). - P. 222-229. -doi: 10.2119/molmed.2009.00101.