Механизмы реализации регуляторного влияния тнтерлейкина -2 на апоптоз лимфоцитов крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат медицинских наук Сазонова, Елена Викторовна

• Сазонова, Елена Викторовна
• кандидат медицинских наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Сазонова, Елена Викторовна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Интерлейкин-2: строение, функции, механизмы влияния на жизнедеятельность клетки-мишени.

1.2. Молекулярные аспекты регуляции апоптоза,. опосредованного IL-2.

1.3. Механизмы дизрегуляции IL-2 - опосредованного апоптоза.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материал исследования.

2.1.1 Экспериментальный блок исследования.

2.1.2 Клинический блок исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение лимфоцитов крови.

2.2.2. Культивирование лимфоцитов крови.

2.2.3. Оценка продукции интерлейкина-2 лимфоцитами.

2.2.4. Оценка количества лимфоцитов крови, несущих рецептор к LL-2.

2.2.5. Оценка реализации апоптоза лимфоцитов крови.

2.2.6. Оценка количества клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальной мембраны.

2.2.7. Оценка содержания активных форм кислорода в лимфоцитах крови.

2.2.8. Оценка уровня факторов транскрипции и белков-регуляторов апоптоза в лимфоцитах крови.

2.2.9. Статистический анализ результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Исследование IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов.

3.1.1. Особенности реализации программированной гибели лимфоцитов крови при действии рекомбинантного IL-2.

3.1.2. Состояние элементов системы IL-2-IL-2R и особенности реализации апоптотической гибели лимфоцитов при клещевом энцефалите.

3.2. Молекулярные механизмы IL-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов

3.2.1. Исследование количества лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и внутриклеточного содержания активных форм кислорода в условиях культивирования с рекомбинантным IL-2 и при клещевом энцефалите.

3.2.2. Оценка уровня белков семейства Вс1-2 в лимфоцитах. крови в условиях культивирования с рекомбинантным IL-2 и при клещевом энцефалите.

3.2.3. Исследование уровня транскрипционных факторов NFkB, Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21 в лимфоцитах в условиях культивирования с рекомбинантным IL-2 и при клещевом энцефалите.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы реализации регуляторного влияния тнтерлейкина -2 на апоптоз лимфоцитов крови»

Актуальность исследования

К ключевым системам, обеспечивающим стратегию ^ адаптации макроорганизма к постоянно изменяющимся условиям внутренней и внешней среды, относится система иммунитета. Одним из фундаментальных механизмов регулирования иммунных реакций является апоптотическая гибель иммунокомпетентных клеток [Потапнев М.П., 2002], необходимая для установления баланса между их эффективным функционированием, с одной стороны, и своевременным и безопасным удалением — с другой.

Регуляция выживания и гибели иммунокомпетентных клеток осуществляется через цитокиновую сеть, представляющую собой систему клеточных медиаторов и их рецепторов, к числу которых относят игттерфероны, колониестимулирующие факторы, трансформирующие ростовые факторы, хемокины и интерлейкины [Симбирцев А.С., 2004; Prasad T.S. et al., 2009].

Одним из ведущих цитокинов, определяющих жизнедеятельность иммунокомпетентных клеток, является интерлейкин-2 (IL-2), в течение долгого времени известный как ростовой фактор для Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток и фагоцитов, обеспечивающий их функциональную активацию [Сенников С.В. и соавт., 2004; Лебедев JI.P. и соавт., 2007]. К настоящему времени установлено, что модулирующее влияние данного клеточного медиатора на танатогенную программу носит двойственный характер. Для объяснения выбора про- или антиапоптотического пути воздействия IL-2 была предложена теория обратной связи в контроле апоптоза Т-лимфоцитов, согласно которой указанный цитокин вызывает повышение чувствительности Т-лимфоцитов к апоптозу [Потапнев М.П., 2002]. Исход жизни клетки зависит от уровня антигенного и костимулирующего воздействия. В случае его отсутствия экспрессия IL-2 и его клеточного рецептора угнетается. В результате этого клетки подвергаются апоптозу, связанному с нехваткой цитокина. Данный механизм ограничивает иммунный ответ после устранения патогена. При избытке антигенного воздействия может наступить антигениндуцированный апоптоз Т-клеток, обусловленный связыванием антигена с рецептором и опосредованный воздействием на активированный Т-лимфоцит Fas-лиганда и фактора некроза опухоли a [WalczakH. et al., 1997].

Изменение продукции IL-2 и связанное с этим нарушение реализации -о танатогенной программы является причиной многих патологических процессов. Так, избыточная экспрессия IL-2 и IL-2R обнаруживается у большинства опухолевых клеток, потерявших способность к апоптозу, что дает основания рассматривать данный цитокин в качестве одного из факторов малигнизации [Reichert Т.Е. et al., 1998; Eriksen К. et al., 2001]. Высокая интенсивность программированной гибели лимфоцитов, сопровождаемая угнетением продукции IL-2, наблюдается при инфекционной патологии. К примеру, при гепатите С происходит изменение содержания цитозольного Са2+, определяющего активность транскрипционного фактора NFAT и,

1 v соответственно, промотора гена IL-2 [Bergqvist A., Rice С.М., 2001; Jerome K.R., 2008]. При коровьей оспе отмечается блокирование TcR-индуцированной активации NFAT/AP 1 элемента промотора гена IL-2 [Alonso A.S. et al., 2003].

Для моделирования дисбаланса системы IL-2-IL-2R используются различные приемы, к числу которых относятся нокаутирование гена IL-2 и его рецептора, конструирование генов Р- и у-субъединиц IL-2R и др. [Fanzo J.С. et al., 2006]. Доступным методом, позволяющим изучать молекулярные механизмы проведения сигнала от данного рецепторного комплекса, является культивирование лимфоцитарных клеток в присутствии рекомбинантного IL-2. о

Следует признать, что в настоящее время молекулярные ' механизмы дизрегуляции системы IL-2—IL-2R изучены недостаточно, а имеющиеся в литературе данные в рамках обсуждаемой проблемы носят весьма неоднозначный характер. В связи с этим принципиально важным становится исследование молекулярных механизмов IL-2-опосредованных нарушений апоптоза лимфоцитов для поиска новых патогенетически обоснованных технологий управления гибелью клеток. s

Цель исследования: выявить роль и молекулярные механизмы участия интерлейкина-2 в регуляции апоптоза лимфоцитов крови.

Задачи исследования:

1. Установить особенности реализации апоптоза лимфоцитов крови при действии рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro в концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл.

2. Оценить внутриклеточный уровень активных форм кислорода и состояние трансмембранного потенциала митохондрий при интерлейкин-2-зависимой гибели лимфоцитов крови.

3. Определить роль белков семейства Вс1-2, транскрипционных факторов NFkB, Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21 в регуляции апоптоза, опосредованного интерлейкином-2.

4. Провести сравнительную оценку состояния молекулярных механизмов интерлейкин-2-опосредованного апоптоза лимфоцитов при добавлении рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека in vitro и при патологическом процессе, сопровождающемся нарушениями в системе интерлейкина-2 человека (у пациентов с клещевым энцефалитом).

Научная новизна

Получены новые данные фундаментального характера о влиянии интерлейкина-2 на реализацию апоптоза лимфоцитов крови в зависимости от концентрации цитокина и условий культивирования, а также впервые определены молекулярные мишени интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели. Установлено, что рекомбинантный интерлейкин-2 в конечных концентрациях от 0,1 до 1,0 нг/мл дозозависимо оказывает проапоптотическое действие на лимфоциты крови и проявляет протективный эффект в отношении дексаметазониндуцированного апоптоза данных клеток. Показано, что в культуре лимфоцитов у здоровых доноров, инкубированных с

ОД нг/мл рекомбинантного интерлейкина-2, повышено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий на фоне накопления в них активных форм кислорода, снижения уровня антиапоптотических белков-регуляторов Вс1-2 и Bcl-XL, активации транскрипционных факторов NFkB и Р53.

Впервые выявлено, что индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток крови при остром клещевом энцефалите, сопровождающемся повышенной продукцией и сниженной рецепцией лимфоцитами интерлейкина-2, обусловлена участием NFkB, Р53 и митохондриальных факторов (увеличение числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, повышение внутриклеточного уровня активных форм кислорода, дисбаланс белков семейства Вс1-2).

Показана унификация молекулярных механизмов апоптоза иммунокомпетентных клеток как при дисбалансе системы интерлейкина-2 в условиях in vitro, так и при инфекционном процессе (клещевой энцефалит).

Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенного исследования расширяют фундаментальные знания о характере изменений программированной гибели клеток под действием рекомбинантной формы интерлейкина-2 человека в зависимости от его концентрации и состояния клеточного микроокружения. Полученные фактические данные раскрывают молекулярные механизмы интерлейкин-2-опосредованной регуляции апоптотической гибели лимфоцитов, связанные с активацией митохондриального пути и обусловленные участием транскрипционных факторов (NFkB и Р53) и белков семейства Вс1-2. Основные положения исследования могут служить основой для создания молекулярных технологий управления функциями иммунокомпетентных клеток с использованием цитокинов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека оказывает дозозависимые эффекты на реализацию апоптоза иммунокомпетентных клеток:' количество апоптотических клеток в культуре лимфоцитов изменяется однонаправленно с концентрацией цитокина в диапазоне 0,1-1,0 нг/мл и обратнопропорционально его дозе на фоне действия дексаметазона.

2. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при культивировании лимфоцитов крови здоровых доноров с рекомбинантной формой данного цитокина и при клещевом энцефалите сопровождается модуляцией апоптотической гибели лимфоцитов крови, реализующейся при участии митохондриальных факторов, активных форм кислорода, NFkB, Р53 и обусловленной смещением баланса Bcl-2-белков в сторону проапоптотических.

Апробация материалов диссертации

Результаты исследования были доложены и обсуждены на VIII и X Конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2009), ХШ и XV Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007, 2009), IV Объединенном иммунофоруме (Санкт-Петербург, 2008), X Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), XIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), IV Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009).

Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии (разделы «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунной системы», «Воспаление»), фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии»), кафедры морфологии и общей патологии (раздел «Инфекция и иммунитет») ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического" комплекса России на 2007-2012 годы» по темам «Работа по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Японии» (ГК № 02.512.11.2285), «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» (ГК № 02.740.11.0311), а также при финансировании РФФИ «Разработка способов направленной коррекции дизрегуляции пролиферации и апоптоза нормальных и патологически измененных клеток с помощью регуляторных молекул» (№ 09.04.99025) и Совета по грантам при Президенте РФ по государственной поддержке научных исследований молодых российских ученых-докторов наук по теме «Молекулярные механизмы цитокинопосредованной дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по Thl- или ТЪ2-пути» (МД-3842.2009.7) и ведущих научных школ РФ по теме «Роль генетически детерминированной реакции системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 6 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения,

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Сазонова, Елена Викторовна

выводы

1. При культивировании лимфоцитов, полученных у здоровых доноров, с рекомбинантным интерлейкином-2 в дозах 0,1-1,0 нг/мл увеличивается содержание апоптотически измененных клеток пропорционально концентрации цитокина. На фоне глюкокортикоидиндуцированного апоптоза (дексаметазон в дозе 10"4 М) рекомбинантный интерлейкин-2 оказывает антиапоптотический эффект на лимфоциты крови, который также носит дозозависимый характер.

2. Механизмы проапоптотического действия рекомбинантного интсрлейкина-2 на лимфоциты в дозе 0,1 нг/мл обусловлены снижением трансмембранного потенциала митохондрий на фоне внутриклеточного накопления активных форм кислорода, дисбалансом белков семейства Bcl-2 с про- и антиапоптотической функцией (уменьшение уровня Bcl-2, Bcl-XL и Вах, повышение — Bad) и увеличением содержания ингибитора циклинзависимых киназ Р21.

3. Дисбаланс системы интерлейкина-2 при клещевом энцефалите (снижение числа лимфоцитов, презентирующих рецепторы к интерлейкину-2 на фоне повышенной или нормальной продукции цитокина у больных острым клещевым энцефалитом и у пациентов с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита, соответственно) сопровождается индукцией апоптотической гибели лимфоцитов, повышением количества клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий и высоким внутриклеточным уровнем активных форм кислорода.

4. У пациентов с клещевым энцефалитом апоптоз лимфоцитарных клеток крови опосредован смещением баланса белков семейства Вс1~2 в сторону проапоптотических: снижение содержания Bcl-2 и Bcl-XL на фоне отсутствия изменений уровня Вах и Bad.

5. При нарушении в системе интерлейкина-2 и его рецептора как в условиях in it vitro, так и инфекционного процесса (клещевой энцефалит) молекулярные механизмы модуляции апоптотической гибели лимфоцитов являются однотипными и связаны с активацией митохондриального пути апоптоза, а также транскрипционных факторов NFkB и Р53.

Заключение

Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что модулирующее влияние рекомбинантного IL-2 на апоптотическую программу определяется дозой цитокина и условиями культивирования клеток. Установлено, что в культуре лимфоцитов здоровых доноров, инкубированных с рекомбинантным интерлейкином-2, и у больных острым клещевым энцефалитом повышено количество клеток со сниженным трансмембранным потенциалом на фоне накопления в них активных форм кислорода, изменен баланс белков-регуляторов апоптоза в сторону снижения протеинов с антисуицидальной активностью Вс1-2 и Bcl-XL. Показано, что проапоптотический эффект данного цитокина реализуется при участии транскрипционных факторов NFkB и Р53 и ингибитора циклинзависимых киназ Р21.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для нормального функционирования иммунной системы необходимо сохранение равновесия между пролиферацией иммунокомпетентных клеток и их гибелью. Сдвиг этого баланса является одним из факторов развития патологических процессов. Повышенная пролиферация лимфоцитов приводит к развитию опухолевой трансформации и аутоиммунной патологии, в то время как усиление апоптотической гибели клеток сопровождает иммуно;;ефицитные состояния [Elmore S., 2007]. Важную роль в поддержании гомеостаза иммунной системы и в рефляции функций иммунокомпетентных клеток играет цитокиновая сеть [Симбирцев А.С., 2004]. Несмотря на то, что данные биологически активные вещества изучаются уже более 30 лет, до настоящего времени не существует единой теории, способной объяснить все имеющиеся на сегодняшний день сведения об иммунорегуляторных свойствах цитокинов [Потапнев М. П., 2002].

Особое положение среди цитокинов занимает IL-2 благодаря свойственной ему способности оказывать разнонаправленное влияние на апоптоз иммунокомпетентных клеток [Haux J. et al., 1999].

Данная проблема обсуждается с начала 90-х годов XX века. Однако имеющиеся в литературе сведения носят лишь описательный характер, не позволяя сформировать единой теории, объясняющей двойственность эффектов указанного клеточного медиатора.

В связи с вышесказанным настоящее исследование было посвящено выявлению направленности модулирующего эффекта IL-2 на танатогенную программу, зависимости его от дозы цитокина и вскрытию внутриклеточных механизмов проапоптотического действия данного медиатора.

Для создания модели цитокинопосредованного апоптоза in vitro мы воздействовали на культуру лимфоцитов крови, полученных у здоровых доноров, рекомбинантным IL-2 человека в диапазоне доз от 0,015 нг/мл до 1,000 нг/мл, оценивая изменение количества апоптотических клеток в зависимости от концентрации цитокина. Проведенное in vitro исследование показало, что rIL-2 начинает проявлять своё проапоптотическое действие в я отношении лимфоцитарных клеток, когда его уровень в среде культивирования составляет 0,100 нг/мл. При последующем увеличении дозы медиатора отмечалось повышение числа фосфатидилсеринэкспрессирующих лимфоцитов, пропорциональное концентрации цитокина (табл. 2).

Небезынтересно заметить, что в литературе на сегодняшний день не описан дозозависимый характер проапоптотического действия IL-2. В настоящем исследовании было впервые обнаружено, что для реализации апоптозиндуцирующего эффекта rIL-2 на лимфоциты крови в условиях in vitro необходим определенный порог концентрации цитокина. D.J. Stauber et al. [2006] высказывали гипотезу о наличии определенного количества активированных IL-2R на поверхности лимфоцитов, необходимых для индукции пролиферации клеток. Наличие подобного «барьера» действия IL-2 также может быть объяснено строением его рецептора и работой внутриклеточных сигнальных путей [Boytim M.L. et al., 2000; Lindemann M.J., 2003].

Как известно, рецептор IL-2 представлен тремя цепями: а, Р, у. Первая служит основным сайтом связывания для цитокина, остальные - необходимы для сигнальной трансдукции. В то же время установлено, что полный рецептор IL-2Ra/IL-2R[3/IL-2R-y обладает большей аффинностью, чем комплекс IL-2Ra/IL-2Rp [Waldmann Т.А., 1991; Stauber D.J. et al., 2006]. Вполне вероятно, что при концентрациях ниже 0,100 нг/мл rIL-2 связывается с высокоаффинным IL-2R, т.е. сигнальная трансдукция идет в равной степени как с Р-, так и с уцепи. При увеличении концентрации рекомбинантного цитокина выше 0,100 нг/мл начинают активироваться низкоаффинные рецепторы. Кроме того, показано, что IL-2, как активирующий фактор для лимфоцитов, может запускать экспрессию субъединиц IL-2Ra и IL-2Rp, в то время как уровень IL-2Ry значимо не меняется [Espinoza-Delgado J. et al., 1995; Akbaj; A.N. et al., 1996]. Таким образом, с увеличением концентрации IL-2 более 0,100 нг/мл интенсивность сигнального каскада с [3-цепи превышает активность сигнальных путей у-цепи.

Согласно литературным данным, субъединица IL-2R[3 ответственна за активацию внутриклеточных сигнальных путей STAT5, МАР-киназ и протеинкиназы В. Цепь IL-2Ry активирует только путь STAT5 [Leonard W.J., Lin J.X., 2000; Cheng L.E. et al., 2002; Smith K.A., 2006]. Показано, что в реализации проапоптотического эффекта IL-2 основную роль играет Р-цепь и сигнальный путь белков STAT5 в то время как у-цепь, индуцируя PKB/PI3K-путь, напротив, ингибируют IL-2-зависимую индукцию апоптоза [Dai Z. et al., 1999; Van Parijs L. et al., 1999; Cheng L.E. et al., 2002]. Вероятно, что с ростом концентрации цитокина возрастает количество сигнальных белков, активированных р-цепью в лимфоцитах, тем более, что у-цепь также вносит свой вклад за счет индукции STAT5. Таким образом, сигнальный путь STAT-белков может являться наиболее вероятным кандидатом для реализации проапоптотической функции IL-2. Пути с участием МАР-киназ и РКВ необходимы для пролиферации лимфоцитов и реализуют только антиапоптотический эффект IL-2 [Rebollo A. et al., 1999; Kelly Е. et al., 2002; Stahl M. et al., 2002, Lindemann M.J. et al., 2003; Kuhn D.J., Dou'Q.P., 2005]. Димеры STAT5, взаимодействуя с GAS-элементами в области промоторов генов-мишений, изменяют их экспрессию [Leonard W.J., Lin J.X., 2000]. Возможно, что в данных условиях эксперимента в лимфоцитах экспрессия проапоптотических белков превалировала над экспрессией белков-ингибиторов апоптоза. Тем более показано, что IL-2 способен усиливать экспрессию таких проапоптотитческих белков как TRAIL, каспаза-3, DAP (death-associated protein) и STK 17В (серин/треониновая киназа 17В) [Kovanen Р.Е. et al., 2005].

Для изучения антиапоптотического действия rIL-2 клетки культивировали в присутствии синтетического глюкокортикоида (ГК) дексаметазона. Глюкокортикоидные гормоны, обладая иммуносупрессивной активностью, являются естественными индукторами апоптоза для иммунокомпетентных клеток [Angeli A. et al., 1999; Greenstein S. et al., 2002;

Kofler R. et al., 2003; Necela B.M., Cidlowski J.A., 2004; Schmidt S. et al., 2004; Thompson E.B., 2008]. Использование дексаметазона в качестве апоптозиндуцирующего агента для изучения антиапоптотического эффекта IL-2 позволяет интерпретировать результаты, полученные in vitro, в отношении целого организма. В данном исследовании было показано, что дексаметазон обладает выраженным проапоптотическим действием на лимфоциты крови (табл. 3).

В настоящее время выделяют два механизма апоптозиндуцирующего эффекта глюкокортикоидов. Первый основан на способности данных гормонов индуцировать апоптоз через стимуляцию экспрессии генов проапоптотических

-{-О белков Вах, IkB, белков Са "-каналов [Newton R., 2005]. Второй — связан с их ингибирующим влиянием на экспрессию генов клеточного цикла и генов антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-XL, NFkB, АР 1, JNK, ERK, C-myc) [Greenstein S. et al., 2002; Schmidt S. et al., 2004]. Кроме того, комплекс ГК-рецептор может напрямую взаимодействовать с белками NFkB и АР 1, блокируя их активность [Kofler R. et al., 2003].

В результате настоящего исследования было выявлено протективноё действие rIL-2 в отношении ГК-индуцированного апоптоза лимфоцитов (табл. 3). Антиапоптотический эффект исследуемого цитокина известен еще с начала 90-х годов XX века и хорошо описан в литературе [Nieto М.А., Lopez-Rivas А., 1992; Kam J.C. et al., 1993; Estaquier J., Ameisen J.C., 1997]. Однако в нашей работе был впервые показан дозозависимый характер этого явления, механизм которого может быть объяснен увеличением количества активированных IL-2R с повышением дозы цитокина и усилением интенсивности антиапоптотических сигнальных путей в клетке [Lindemann M.J. et al., 2003].

Существует множество причин отмены рекомбинантным IL-2 глюкокортикоидиндуцированного апоптоза. Одна из них — способность данного цитокина запускать пролиферативный каскад по JAK/STAT—, PI3K— или МАРК-сигнальным путям, сходящимся на регуляции экспрессии гена bcl-2, результатом повышения которой является клеточное выживание и пролиферация [Fridman J.S., Lowe S.W., 2003]. В пользу данного предположения свидетельствует описанное в литературе свойство глкжокортикоидов угнетать синтез антиапоптотических [Casale F. et al., 2003] и индуцировать синтез проапоптотических белков семейства Bcl-2 [Han J. et al., 2001; Wang Z. et al., 2003], что, в конечном итоге, приводит к запуску апоптотической программы клетки [Schmidt S. et al., 2004].

В работе A. Angeli et al. [1999] показана способность данного цитокина изменять уровень дексаметазона в клетке за счет усиления экспрессии Р-гликопротеина, задействованного в транспорте глюкокортикоидов и его метаболитов через клеточную мембрану. В то же время Е.В. Thorripson [2008] предложил гипотезу, согласно которой IL-2 нарушает конформацию глюкокортикоидного рецептора, подавляя экспрессию белков hsp90 и р59, необходимых для фолдинга рецептора в цитоплазме. Такие функционально неполноценные рецепторы, связывая молекулу глюкокортикоида, ингибируют её взаимодействие с участками GRE (glucocorticoid response element) в области промотора генов-мишеней [Kofler R.et al., 2003]. Подобный эффект характерен для МАР-киназ Jak3 и Р38, участников IL-2-индуцируемого каскада, фосфорилирующих комплекс ГК-рецептор, приводя к его инактивации [Biola A. et al, 2001; Goleva Е. et al., 2003]. Кроме того, установлено свойство белков STAT5 и АР 1, активируемых под действием IL-2, связываться с поверхностью глюкокортикоидного рецептора, в результате чего становится невозможным его взаимодействие с кофакторами типа Р300/СВР или SRC-la и передача проапоптотического сигнала [Chauhan D. et al., 2002].

Согласно современным представлениям, одним из ведущих аспектов патогенеза ряда заболеваний является обусловленная дисбалансом ключевых цитокинов поляризация иммунного ответа по Thl или Th2-nyra [Кетлинский С.А., 2002]. Чрезмерная активация Thl-лимфоцитов, сопряженная с усилением клеточного иммунитета, приводит к нарушению элиминации аутореактивных клонов лимфоцитов и развитию аутоиммунного процесса [Хаитов P.M., 2001]. Детерминация иммунного ответа по Th2-nym приводит к угнетению

Т-клеточного звена и ускользанию патологически измененных клеток от уничтожения, обеспечивая тем самым формирование и поддержание таких патологических состояний как опухолевый рост и хронический инфекции [Eckels D.D. et al., 1999].

Известно, что исход инфекционного процесса предопределяется результатом взаимодействия вируса и клетки-хозяина и зависит как от вирулентности возбудителя, определяемой совокупным действием его факторов патогенности, так и антиинфекционного потенциала иммунной системы человека, имеющего в своей основе особенности кооперации иммунокомпетентных клеток. При этом функциональный статус звеньев иммунной системы определяется, прежде всего, способностью Т-лимфоцитов продуцировать основные иммунорегуляторные цитокины и экспрессировать соответствующие рецепторы к ним.

Ярким примером процесса, сопровождающегося изменением баланса цитокиновой сети и модуляцией программы гибели клеток, является клещевой энцефалит, представляющий собой одно из самых распространенных природно-очаговых заболеваний [Ратникова Л.И. и соавт., 2002; Наследникова И.О. и соавт., 2007]. Рядом исследователей выявлены значительные изменения системы цитокинов при остром клещевом энцефалите [Пирогова Н.П., Новицкий В.В., 2003]. Так, установлено, что манифестация его лихорадочной формы сопровождается возрастанием продукции мононуклеарными лейкоцитами TNFa, IFNy и оксида азота [Ратникова Л.И. и соавт., 2002; Пирогова Н.П., Новицкий В.В., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2002]. Однако до настоящего времени не оценены молекулярные механизмы участия IL-2 в реализации противовирусного иммунитета при острой клещевой нейроинфекции, а также роль данного медиатора в формировании длительного носительства вируса клещевого энцефалита.

На этом основании в рамках настоящей работы нами была произведена оценка продукции IL-2 и регистрация количества лимфоцитов, несущих рецепторы к IL-2, при клещевом энцефалите. У обследованных больных острым клещевым энцефалитом было выявлено усиление продукции IL-2 (табл. 4), что, на наш взгляд, является проявлением адекватной защитной реакции организма, направленной на элиминацию возбудителя. Как известно, инициация противовирусного иммунитета путем включения специфического иммунного ответа осуществляется за счет взаимодействия Т-лимфоцита с антигенпредставляющей клеткой [Хаитов P.M., 2001]. Сочетание сигналов, поступающих на Т-хелпер через комплекс TCR-CD3 и CD28, приводит к активации клетки, т.е. выходу ее из фазы покоя G0 в фазу клеточного цикла Gi. Основной результат активации Т-лимфоцитов состоит в индукции экспрессии генов ростовых факторов, в частности IL-2, что подготавливает клетку к пролиферации, лежащую в основе любых форм проявления активности лимфоцитов [Хаитов P.M., 2001; Кашкин К.П., 2004].

Сходные данные были получены другими исследователями. Так, показано, что при гепатите С, ВИЧ-инфекции повышено содержание цитозольного Са2+, определяющего активность транскрипционного фактора NFAT и, соответственно, промотора гена IL-2 [Bergqvist A., Rice С.М., 2001; Mogensen Т.Н., Paludan S.R., 2001; Jerome K.R., 2008]. М. Scott et al. [2001] продемонстрировали усиление продукции IL-2 лимфоцитами человека в условиях папилломавирусной инфекции in vitro.

У пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита отмечалось нарушение продукции IL-2 (табл. 4). Сохранение неизменного уровня исследованного цитокина провоспалительного действия, возможно, объясняется недостаточной реактивностью макроорганизма, которая, в свою очередь, обусловливает неэффективность иммунной защиты в ответ на действие инфекта [Хаитов P.M., 2001], становясь одним из факторов, ведущих к хронизации инфекционного процесса [Насырова Р.Ф. и соавт., 2006]. К I примеру, в лаборатории D. Deane et al. [2000] был выделен и охарактеризован новый белок, GM-CSF-ингибиторный фактор (GIF), нарабатываемый при парапоксвирусной инфекции, который, соединяясь с поверхностью IL-2 и

GM-CSF, ингибирует их активность. Кроме того, угнетение продукции IL-2 показано и при кори [Schnorr J. et al., 1997].

При взаимодействии IL-2 с IL-2R сигнал передается на внутриклеточный протеинкиназный комплекс, каскадная активация которого проявляется в апоптогенном или митогенном влиянии цитокина на клетку. В нашем исследовании у всех пациентов с клещевой нейроинфекцией было выявлено снижение количества лимфоцитов, несущих IL-2R (табл. 4).

В настоящее время обсуждаются различные причины снижения концентрации мембраносвязанных форм рецепторов цитокинов в крови. Ведущую роль в этом процессе исследователи отводят шеддингу белков с поверхности клеток в результате деструктивных процессов в плазматической мембране (интенсификация перекисного окисления липидов и, как следствие, — изменение упорядоченности и микровязкости липидного бисло'я мембран, ведущие к модификации их структурных свойств). Подтверждением этого механизма послужило выявленное ранее в нашей лаборатории возрастание микровязкости плазматической мембраны лимфоцитов у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита [Рязанцева Н.В. и соавт., 2002]. Кроме того, возможность усиления шеддинга рецепторов с поверхности клеточных мембран при ряде инфекционных заболеваний подтверждается работами других авторов [Анисимова Н.Ю. и соавт., 2003].

Нарушение представления формы IL-2R лимфоцитами может быть следствием их взаимодействия с неполноценными антигенпрезентирующими клетками, не экспрессирующими костимулирующие молекулы. Это ведет к угнетению секреции цитокинов, ответственных за активацию клеточного звена иммунитета [Фрейдлин И.С., Назаров П.Г., 1999]. При вирусном гепатите В показано, что снижение уровня экспрессии мембранного рецептора для IL-2 на мононуклеарных лейкоцитах играет важную роль в развитии этой инфекции и способствует ее хронизации [Приймяги JI.C. и соавт., 2003]. В работе D.W. Ballardi et al. [1988] сообщалось, что активация белком Tax вируса Т-клеточной лейкемии человека промотора гена IL-2Ra сопряжена с экспрессией клеточного фактора HIVEN86A и его последующим взаимодействием с промоторным регионом IL-2Ra, гомологичным NFkB-связывающему сайту. Описана также способность этого белка активировать фосфатазу кальциневрина, являющегося физиологическим активатором NFAT [Mogensen Т.Н., Paludan S.RV 2001]. Эта гипотеза подтверждается сведениями о том, что присутствие циклоспорина А, специфического ингибитора кальциневрина, отменяет дефосфорилирование и активацию NFAT, индуцированное Tax в HTLV-1 - инфицированных клетках [GoodL. et al., 1997].

Учитывая большое значение IL-2 в реализации апоптоза, нами была проведена количественная оценка апоптотических лимфоцитов у пациентов с клещевым энцефалитом. В проведенном исследовании уровень погибших лимфоцитов в общей популяции лимфоцитарных клеток определяли методом проточной лазерной цитометрии с использованием аннексина V, взаимодействующего с фосфатидилсерином, экспрессия которого увеличивается на ранних стадиях апоптоза, и пропидий йодида, способного проникать в ядро клетки при нарушении целостности мембран данной органеллы. У пациентов с острым клещевым энцефалитом и хронической антигенемией вируса было зарегистрировано обогащение фракции лимфоцитов, подвергшихся апоптотическим изменениям. При этом количество фосфатидилсеринэкспрессирующих лимфоцитов при длительной антигенемии возбудителя было ниже, чем при остро протекающем процессе (табл. 4).

При изучении вирусиндуцированной модуляции апоптоза другими авторами были получены сходные результаты. Так, М.П. Исаева и соавт. [1998], используя высокочувствительную модель (двухсуточные белые мыши), показали, что разные штаммы вируса клещевого энцефалита, различающиеся по источнику изоляции и биологическим свойствам, способны вызывать гибель клеток головного мозга у этих животных путём запуска апоптоза. Имеются данные, что вирус иммунодефицита человека обладает способностью защищать от апоптоза инфицированные клетки, одновременно усиливая его в незараженных клетках [Jerome K.R., 2008]. Антигены вирусов гепатита В и С индуцируют танатогенную программу за счет повышенной продукции лиганда Fas [Chang Z.S. et al., 2003].

Таким образом, полученные в нашей лаборатории фактические данные свидетельствуют, что течение острого клещевого энцефалита характеризуется к одновременным повышением уровня продукции IL-2 и снижением содержания 1Ь-2К-положительных клеток, что сопровождается усилением вовлечения лимфоцитов в процесс апоптоза. В то же время у лиц с хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита отмечается снижение доли 1Ь-2К-презентирующих и апоптотически измененных лимфоцитов на фоне неизменной цитокинпродуцирующей способности (табл. 4).

В связи с актуальностью проблемы длительного вирусоносительства, приводящего к развитию латентных и хронических форм инфекции, а также других заболеваний, сопровождающихся дисбалансом системы IL-2 — IL-2R, не вызывает сомнения необходимость изучения молекулярных механизмов реализации проапоптотического эффекта данного клеточного медиатора. Второй этап настоящей работы был посвящен выявлению клеточных мишеней апоптотического каскада, запускаемого при участии IL-2, на экспериментальной модели IL-2-индуцированного апоптоза и у пациентов с клещевой нейроинфекцией.

Как уже было упомянуто выше, STAT5 является транскрипционным фактором, способным изменять экспрессию большого числа генов. Поэтому предположения о его активации недостаточно для объяснения внутриклеточных механизмов апоптозиндуцирующего действия IL-2. В связи с этим нам было интересно оценить вовлеченность различных внутриклеточных мессенджеров в реализацию IL-2-опосредованного апоптоза.

Общеизвестно, что функциональное состояние клетки зависит от уровня содержания в ней активных форм кислорода (АФК) [Buzek J. et al., 2002; Pastori G.M. et al., 2002], которые используются как посредники при передаче сигнала от мембранных рецепторов на внутриклеточные системы протеинкиназ [Pastori G.M. et al., 2002; Matsuzawa A. et al., 2005]. В литературе описано свойство IL-2 стимулировать присоединение электронов к молекуле кислорода, приводящее к образованию супероксидного аниона (О2"), а также усиливать синтез оксида азота (NO) по Ь-аргинин-ЫО-синтазному пути [Salvemini D. et al., 1998].

Эксперимент, проведенный с рекомбинантным IL-2 в условиях in vitro, показал способность указанного цитокина оказывать проапо^тотический эффект на лимфоциты крови посредством повышения уровня АФК в клетке (рис. 15). Эти результаты в некоторой степени позволяют подтвердить наши предположения о способности IL-2 регулировать внутриклеточный уровень продукции лимфоцитами АФК. Важно подчеркнуть, что полученные нами данные сопоставимы с результатами других исследователей, свидетельствующих о том, что взаимодействие IL-4 со своим рецептором, имеющим общую с IL-2 у-цепь, приводит к Р13К-зависимой активации NAD(P)H оксидаз N0X1 и N0X5 через рецепторассоциированные тирозинкиназы и тирозинфосфатазы, результатом чего является генерация АФК [Matsuzawa A. et al., 2005].

При оценке внутриклеточной продукции АФК лимфоцитами крови у пациентов с клещевой нейроинфекцией выявлено, что величина данного параметра возрастает. При этом более выраженные изменения исследованного показателя отмечаются у пациентов с острым клещевым энцефалитом (рис. 15). Сопоставляя данные проведенных исследований, можно предположить, что при клещевом энцефалите нарушение продукции IL-2 наряду с нарушением экспрессии IL-2-рецепторов лимфоцитарными клетками способствует увеличению внутриклеточного уровня продукции АФК, что проявляется в повышении содержания апоптотических клеток. С другой стороны, возможен обратный вариант, когда увеличение содержания АФК в клетке становится причиной нарушения продукции провоспалительного цитокина на фоне вирусной инфекции [Matsuzawa A. et al., 2005].

Рассматривая механизмы АФК-опосредованного апоптоза клетки, особое внимание следует уделить митохондриям, которые, образуя сложную систему взаимовлияний, являются как мишенями, так и продуцентами данных молекул

Зенков Н.К. и соавт., 2001; Бра М., 2005; Черняк Б.В., 2005; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. Так, показано, что при взаимодействии 02" и NO, наработка которых активируется при участии IL-2, происходит образование пероксинитрита, обладающего способностью усиливать процесс перекисного окисления липидов, инактивировать ферменты дыхательной цепи митохондрий и повышать неспецифическую проницаемость мембран органеллы, приводя к запуску митохондриального пути апоптоза [Matsuzawa A. et al., 2005].

Митохондриальный путь программированной клеточной гибели реализуется за счет повышения проницаемости митохондриальных мембран, что приводит к падению A*F и выходу из органеллы триггеров апоптоза: AIF, Apaf-1, цитохрома с, эндонуклеазы G, Smac (Diablo), Omi (HtrA2) [Проскуряков С. Я. и соавт., 2005; Elmore S., 2007]. Проникновение последних из межмембранного пространства в цитозоль активирует прокаспазу-9, запуская летальную программу гибели клеток [Figueroa S. et al., 2006]. Данный процесс невозможен без открытия пор пермеабилизационного перехода РТР (permeability transition pores) между наружной и внутренней мембранами митохондрий, формирования каналов в наружной мембране, а также митохондриальных апоптозиндуцирующих каналов MAC (mitochondrial apoptosis-inducing channels) — на внутренней [Joza N. et al., 2001; Belizario J. et al., 2007; Jeong S.Y., Seol D.W., 2008]. К раскрытию гигантских пор и снижению потенциала митохондрий приводит индуцированное активными формами кислорода накопление Са2+ [Хансон К.П., 1997]. Церамид также может способствовать падению трансмембранного потенциала путем инактивации К+-каналов митохондриальной мембраны в результате активации тирозинкиназы, фосфорилирующей белки ионного канала [Рыжов С.В., Новиков В.В., 2007]. Снижение ДЧ* обычно рассматривают как одно из ведущих и первых проявлений апоптоза. Кроме того, такой специфичный для апоптоза процесс, как фрагментация ДНК, по всей видимости, происходит именно в клетках со сниженной величиной мембранного потенциала митохондрий [Бойчук С.В., Мустафин И.Г., 2001].

В проведенном нами исследовании было зафиксировано повышение количества лимфоцитов со сниженным значением ДЧ* в лимфоцитарных клетках, полученных у здоровых доноров и подвергнутых воздействию rIL-2 в концентрации 0,100 нг/мл, и у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 16), что дало возможность предположить заинтересованность митохондриального пути апоптоза в реализации проапоптотического действия IL-2.

Интересные данные по этой проблеме получены в лаборатории I. Schmitz et al. [2003], где были идентифицированы два типа клеток по отношению к сигнальным путям, запускаемым при участии CD95. В клетках первого типа, образующихся на ранних стадиях иммунного ответа, индукция апоптоза сопровождается сборкой DISC-комплекса, запускающего активацию каспазы-8. При этом митохондриальный путь апоптоза оказывается заингибированным из-за повышенной экспрессии Bcl-XL, что приводит к устойчивости к CD95-опосредованному апоптозу. Напротив, в клетках 2 типа, характерных для поздней стадии иммунного ответа, активация CD95, реализуемая при участии IL-2, обусловливает расщепление проапоптотического белка Bid, который, транслоцируясь в митохондрию, индуцирует снижение её трансмембранного потенциала, высвобождение апоптогенных факторов и запуск программы гибели клетки [Adrain С., Martin S J., 2001].

Главными регуляторами проницаемости митохондриальных мембран являются белки семейства Bcl-2 [Gustafsson А.В., Gottlieb R.A., 2007]. Система Bcl-2-белков представлена тремя классами, каждый из которых обладает собственной функцией. Проапоптотические мультидоменные белки (Вах, Bale, Bok (Mtd), Bcl-Xs, Boo (Diva), BcI-Gl, Bcl-rambo) являются непосредственными исполнителями в процессах изменения проницаемости митохондриальных мембран. Группа однодоменных «ВНЗ-only» белков (Bik (Nbk), Bad, Bim (Bod), Hrk (DP5), Bcl-Gs, Noxa, Puma (ВсрЗ), Nix, Bnip3, Beclinl, Spike и ITM2BS) ответственна за регуляцию всей системы [Маянский Н.А., 2001; Mayer В., Oberbauer R., 2003]. Антиапоптотические мультидоменные белки (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Bcl-B, Mcl-1, Al (Bfl-1), NR-13) блокируют работу первых двух классов [Gustafsson А.В., Gottlieb R.A., 2007]. Для оценки работы всей системы в эксперименте нами были выбраны представители каждого из трех классов: Bcl-2, Bcl-XL, Вах и Bad.

Исследование, выполненное методом иммуноблоттинга, показало, что при действии 0,100 нг/мл rIL-2 регистрировалось значительное снижение внутрилимфоцитарного содержания белков Bcl-2 и Bcl-XL по сравнению с величиной данных показателей в интактных клетках. Аналогичные изменения были зарегистрированы у пациентов с клещевым энцефалитом (рис. 16, 17).

В физиологических условиях Bcl-2 и Bcl-XL участвуют в обеспечении ионного транспорта за счет взаимодействия с протеинами наружной мембраны митохондрий (в частности, с VDAC). Показано также, что при воздействии стрессовых стимулов исследованные антиапоптотические белки, локализуясь в мембранах митохондрий, закрывают каналы, предотвращая тем самым выход проапоптогенных факторов, таких как цитохром с, Apaf-1, Alb", активные формы кислорода и прокаспазы-2, -3, -9 из межмембранного пространства [Kroemer G., Reed J.C., 2000; Cheng Е.Н. et al., 2001].

Анализ содержания протеина Вах в лимфоцитах, культивированных с rlL-2 в дозе 0,100 нг/мл, показал, что уровень данного проапоптотического белка был вдвое ниже величины аналогичного показателя интактных клеток. Небезынтересно заметить, что у больных острым клещевым энцефалитом и у антигеноносителей данного возбудителя уровень Вах практически не изменялся (рис. 18).

Точный механизм, благодаря которому данные протеины ' регулируют проницаемость мембраны митохондрий, до сих пор неясен. Имеются литературные данные о том, что Bcl-XL способен связываться с уже вышедшим цитохромом С, предотвращая дальнейшую активацию каспаз [Cheng Е.Н. et al., 2001]. Помимо этого, установлено, что Bcl-2 и Bcl-XL могут гетеродимеризоваться с проапоптотическим протеином Вах, тем самым, ингибируя его каналформирующую способность [Brenner С. et al., 2000]. В то же время Вах в ответ на «смертельный» сигнал изменяет свою конформацию и встраивается в мембрану митохондрии с образованием пор.

Важно подчеркнуть, что в присутствии rIL-2 было зарегистрировано двукратное увеличение количества другого апоптотического индуктора Bad, в то время как значения данного показателя у пациентов сй клещевым энцефалитом сохранялись на неизменном уровне (рис. 19). Отсутствие количественных изменений протеина в лимфоцитах крови у инфицированных лиц, вероятно, обусловлено воздействием дополнительных модуляторов апоптотической программы. К примеру, показано, что гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор обладает способностью усиливать накопление фосфоинозитол-3-фосфата в нейтрофилах, приводя к активации фосфоинозитол-3-киназы, обеспечивающей фосфорилирование Bad по остаткам Ser-112 и Ser-136 и повышение накопления данного белка в цитозоле [Cowburn A.S. et al., 2002]. Кроме того, описанный ростовой фактор регулирует уровень Bad на транскрипционном уровне, угнетая экспрессию его мРНК через 4 ч после начала воздействия [Klein J.B. et al., 2000]. Небезынтересно отметить, что влияние на апоптоз фактора некроза опухоли-а, известного как цитокин с проапоптотической направленностью, носит разнонаправленный характер: на ранних стадиях (через 1 ч после добавления в среду инкубации) угнетает фосфорилирование Bad и усиливает его транскрипцию, на поздних (через 20 ч) — оказывает противоположный эффект [Salamone G. et al., 2001]. В целом, подобное влияние характерно для большинства ростовых факторов, к числу которых относят IL-3> IL-7, IL-8, фактор роста нервов, которые, фосфорилируя Bad, индуцируют его связывание с белком 14-3-3, тем самым предотвращая его транслокацию в митохондрию и инактивацию Bcl-2 [Ayllon V. et al., 2000; Li W. et al., 2008]. С другой стороны, нельзя исключать реакционные особенности иммунокомпетентных клеток в условиях инфекционного процесса. Известно, что при флавивирусной инфекции активирован PI3K/AKT сигнальный путь. Это, в свою очередь, приводит к фосфорилированию белка Bad протеинкиназой В (АКТ). С помощью данного механизма поддерживается целостность митохондрий и происходит ингибирование программированной клеточной смерти [Lee С .J. et al., 2005].

Таким образом, результаты настоящего исследования позволяют предположить, что сдвиг равновесия между уровнем про- и антиапоптотических Bcl-2-белков в сторону проапоптотических лежит в основе апоптозиндуцирующего действия rIL-2.

Изменение содержания белков семейства Вс1-2 в лимфоцитах при действии rIL-2 может быть обусловлено изменением экспрессии генов данных белков. Необходимо добавить, что конкретные механизмы регуляции Вс1-2-системы на транскрипционном уровне пока мало изучены. Изменение экспрессии может быть как первичным (под влиянием белков сигнальных путей IL-2), так и вторичным (за счет работы транскрипционных факторов, содержание которых изменяется в ответ на действие IL-2). Первый механизм может быть реализован при участии PKB/PI3K и МАР-киназы. Так, опосредованный данным цитокином Р13К-сигнальный каскад обеспечивает избыточную генерацию АФК [Matsuzawa A. et al., 2005], которые, в свою очередь, активируют накопление церамида [Chiang C.W. et al., 2003]. Данная регуляторная молекула способствует дефосфорилированию антиапоптотического белка Вс1-2 (по остатку серина 70) путем активации протеинфосфатазы РР2А, которая приводит к подавлению функций белка и индукции апоптоза по митохондриальному пути [Ruvolo P.P. et al., 2001; Chaing C.W. et al., 2003]. Дефосфорилирование другого активного сайта Bcl-2 -серина в положении 87 (сайт МАР-киназы) - обеспечивает убиквитинизацию и протеосомальную деградацию данного антиапоптотического протеина [Breitschopf К. et al., 2000]. Механизм вторичного изменения экспрессии генов анализируемых белков может быть реализован при участии транскрипционных факторов NFkB и Р53 [Fridman J. S., Lowe S.W., 2003].

Белок NFkB играет существенную роль в регуляции иммунного ответа, воспалительной реакции, а также в контроле клеточного деления и апоптоза

Pahl H.L., 1999; Haddad J., 2002; Kucharczak J. et.al, 2003; Bonizzi G., Karin M., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. Данный транскрипционный фактор сформирован из нескольких субъединиц p50(NFkBl), р52, p65(RelA), RelB и c-Rel, образующих гомо- и гетеродимеры [Hayden M.S., Ghosh S., 2004]. За проявление специфической активности NFkB: связывание с ДНК, димеризацию, ядерную локализацию, активацию генов-мишеней к* связывание с ингибитором IkB — ответственна р65 (RelA) субъединица, имеющая в своем составе сформированный из 300 аминокислотных остатков (АМК) N-терминальный домен, называемый Rel-гомологичным доменом (RHD) [Saccani S. et al., 2003; Perkins N.D., 2007].

В проведенном нами исследовании было установлено, что культивирование лимфоцитарных клеток, полученных у здоровых лиц, с rIL-2 в проапоптотической дозе, равной 0,100 нг/мл, а также лимфоцитов, взятых у пациентов с клещевым энцефалитом, в полной питательной среде сопровождается статистически значимым повышением содержание свободной субъединицы RelA NFkB (рис. 20). Подобный индуктивный эффект IL-2 был продемонстрирован на трех различных клеточных системах, включая Т-клеточную линию Jurkat, мышиную В-лимфоцитарную BA/F3 и Т-клетки человека [ArimaN. et al., 1992].

По данным литературы, увеличение содержания протеина NFkB может происходить посредством протеинкиназы АКТ/РКВ, которая активируется в ходе взаимодействия IL-2 со своим рецептором [Kelly Е. et al., 2002; Kucharczak J. et al., 2003]. Вторым потенциальным механизмом наблюдаемого эффекта является индуцированная данным клеточным медиатором '" активация МАР-киназ JNK и Р38, которые, в свою очередь, приводят к фосфорилированию М^-регуляторного домена ингибиторного белка 1кВ, его убиквитинизации и деградации в протеасоме. В результате вышеописанных изменений NFkB транслоцируется из цитоплазмы в ядро, запуская экспрессию специфических генов - регуляторов апоптоза [Prasad T.S. et al., 2009].

Большинство авторов рассматривает данный транскрипционный фактор в качестве внутриклеточного вторичного мессенджера, опосредующего передачу пролиферативного сигнала от IL-2 с плазматической мембраны к ядру клетки [Yamamoto Y., Gaynor R.B., 2001; Beyaert R., 2004; Gilmore T.D., 2006; Perkins N.D., 2007]. Так, показана способность NFkB стимулировать гены белков — ингибиторов каспаз c-IAPl, C-IAP2 и IXAP, а также Bcl-XL и гомологов Bcl-2 Al/Bfl-1 и IEX-IL, задействованных в закрытии митохондриальных каналов [Wang C.Y. et al., 1998; Wu M.X. et al., 1998; Yamamoto Y., Gaynor R.B., 2001]. Однако ряд экспериментальных работ показали возможность NFkB-опосредованной активации онкосупрессора Р53, ведущей к транскрипции генов проапоптотических белков [Johnston J.A. et al., 1996; Kelly E. et al., 2002; Мушкамбаров H.H., Кузнецов С.Л., 2003; Kucharczak J. et al., 2003; Prasad T.S. et al., 2009].

Следует подчеркнуть, что к настоящему времени в научных источниках описано несколько моделей молекулярных механизмов активации протеина Р53 путем фосфорилирования. Белок Р53 является субстратом для большого количества киназ: ДНК-зависимой протеинкиназы, казеинкиназы 1-подобных киназ, казеинкиназы 2, PS-киназы (p53-serine-34-kinase), МАР-киназы, а таюке для Raf и ATM (ataxia telangiectasia mutated), представляющих собой сенсоры повреждений ДНК, способные распознавать свободные концы ДНК и фосфорилировать Р53 по Ser-15, препятствуя тем самым его связыванию с белком Mdm2 и последующему транспорту из ядра и деградации [Corbet S.W. et al., 1999]. Ответная реакция на образование Р53 зависит от степени повреждения клеточного генома. Так, при умеренных нарушениях ^происходит остановка клеточного цикла в фазе G] или G2, что позволяет репарировать повреждения и, тем самым, предотвращает появление мутантных и анеуплоидных клеток [Фильченков А.А., 2003].

Помимо этого, IL-2-зависимые сигнальные пути также могут активировать этот белок [Bassiri Н., Carding S.R., 2001]. В качестве одного из возможных механизмов этого процесса можно рассматривать способность данного цитокина индуцировать МАР-киназы JNK и Р38, задействованные в фосфорилировании N-терминального домена Р53 [Kucharczak J. et al., 2003]. В то же время повышение содержания фосфоформы Р53 может быть результатом повреждения ДНК вследствие индуцированного IL-2 накопления АФК [Чанакчи Ч. и соавт., 2005]. Кроме того, возможна, активация транскрипционного фактора Р53 через сфингомиелиназу, запуску которой способствуют АФК [Huwiler A. et al., 2001; Levade Т. et al., 2001; Poppe M. et al., 2002]. Вследствие действия последней, сфингомиелин превращается в сфингозин, который, в свою очередь, увеличивает содержание и активность Р53 через протеинфосфатазу [Breitschopf К. et al., 2000].

В ходе проведенного исследования нами было выявлено снижение содержания нефосфорилированной формы белка Р53 в клетках здоровых лиц, инкубированных с проапоптотической дозой цитокина, а также в лимфоцитах крови, полученных у пациентов с клещевой нейроинфекцией (рис. 21). Это можно объяснить, по-видимому, переходом данного белка в активное, а именно фосфорилированное состояние, поскольку транскрипционный фактор Р53 функционирует только в такой модификации [Burlacu А., 2006].

При активации белок Р53 способен инициировать стимуляцию апоптоза путем индукции синтеза проапоптотических белков и подавления антиапоптотических. Так, с одной стороны, описана способность данной регуляторной молекулы ингибировать антиапоптотические белки семейства Bcl-2, что позволяет объяснить сниженное содержание Bcl-2 и Bcl-XL в данном эксперименте. К примеру, Р53, активируя puma (р53 upregulated modulator apoptosis), приводит к связыванию антиапоптотических протеинов (Bcl-2,

Bcl-XL) [Letai A. et al., 2002; Kuwana Т. et al., 2005], индуцируя, таким образом, выход цитохрома с [Prives С., 1999; Fridman J.S., Lowe S.W., 2003; Burlacu А., 2006]. С другой стороны, Р53 усиливает экспрессию гена bad и формирует на наружной митохондриальной мембране комплексы Bad/P53, способные активировать мультидоменный проапоптотический белок Вак и запускать митохондриальный путь апоптоза [Владимирская Е.Б., 2002; Jiang et al., 2006].

С позиции IL-2-опосредованной активации Р53 могут быть объяснены изменения реализации программированной гибели клеток, обнаруженные при реализации первого этапа настоящего исследования. Так, под контролем Р53 находится белок P66Shc, участвующий в продукции АФК и апоптозе. Показано, что Р66 является редоксчувствительным ферментом, который после активации генерирует митохондриальные АФК как сигнальные молекулы, необходимые для реализации апоптоза, используя при этом восстановительные эквиваленты из митохондриальной электронно-транспортной цепи. В ходе данных реакций Р66 окисляет цитохром С и катализирует восстановление Ог до Н202 [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Активацией данного белка может быть объяснен факт поддержания продукции АФК на высоком уровне как в клетках, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, так и в культуре лимфоцитов после 18-часовой инкубации с rIL-2 [Matsuzawa A. et al., 2005]. Кроме того, активация Р53 может приводить к дисбалансу антиоксидантных ферментативных систем клетки, что является одним из механизмов повышения уровня АФК. Так, показана способность Р53 индуцировать экспрессию Мп2+-супероксиддисмутазы и глутатион-пероксидазы без значимого воздействия на уровень каталазы [Perwez H.S. et al., 2004].

Установлено, что Р53 участвует также во внешнем пути инициации апоптоза, повышая экспессию Fas/CD95 и активируя гены, кодирующие Fas-лиганд и TNFSF6 [Kinyamu Н.К., Archer Т.К., 2003]. Кроме того, Р53 способен сенсибилизировать клетки к лигандам рецепторов смерти, однако, механизм данного явления пока неясен [Petak I. et al., 2000].

Одной из молекулярных мишеней белка Р53 выступает универсальный ингибитор циклинзависимых киназ Р21 (Wafl, Cipl, Sdil), способный приводить к остановке клеточного цикла и запуску программы апоптоза в ответ на различные стрессовые стимулы [Rodriguez R.3 Meuth М., 2006]. Данный протеин напрямую ингибирует активность циклина D/CDK-2 и циклина-E/CDK-4, определяющих прогрессию Gl-фазы клеточного цикла. Кроме того,

Р21 обладает способностью взаимодействовать с пролиферативным ядерным фактором клетки (PCNA) и белком-коактиватором ДНК-полимеразы, обеспечивая регуляцию процесса репликации и восстановление поврежденной ДНК в S-фазу [Gartel A.L., Radhakrishnan S.K., 2005]. Некоторые авторы рассматривают данный белок в роли ингибитора киназы JNK1, задействованной в прогрессии клеточного цикла [Patel R. et al., 1998].

С использованием метода иммуноблоттинга нами было показано, что при культивировании лимфоцитов крови, полученных у здоровых доноров, с рекомбинантным IL-2 внутриклеточное содержание Р21 увеличивалось по сравнению с соответствующим параметром в интактных клетках (рис. 22). Повышение уровня Р21 наряду с Р53, вероятно, свидетельствует о блоке клеточного цикла в поздней Gr и S-фазе, что повышает чувствительность лимфоцитарных клеток к индукции апоптоза [Gartel A.L., Radhakrishnan S.K., 2005].

В современной литературе также описаны пути Р53-независимой активации Р21. К примеру, имеются данные о том, что цитоплазматическая локализация данного протеина ассоциирована с активацией роста клетки. Транслокация в ядро и связывание с транскрипционными факторами NFAT и NF-B индуцирует его активацию, приводя к ингибированию пролиферации лимфоцитов, угнетению экспрессии мРНК циклинов и провоспалительных цитокинов [Khanna А.К. et al., 2006]. В работе W. Fan et al. [1999] показано, что IL-2 способен активировать синтез белка CR6 (Cytokine response 6), гомологичного проапоптотическим факторам Gadd45 и Mydll8, который, в свою очередь, через МАР-киназу МТК1 индуцирует наработку исследуемого транскрипционного фактора. i

Таким образом, полученные нами фактические данные свидетельствуют, что апоптозиндуцирующее действие IL-2 сопряжено с преобладанием проапоптотического влияния Р53 над эффектом NFkB. Одной из причин такого результата может являться внутриядерная конкуренция данных транскрипционных факторов за связывание с коактиваторными молекулами, в качестве которых выступают гистоновые ацетилтрансферазы Р300/СВР и PCAF, количество которых в ядре ограничено [Taha Т.A. et al., 2006].

Т.А. Taha et al. [2006] предложили модель взаимной регуляции уровня данных транскрипционных факторов (рис. 23). накопление вощенеишс нерепарнруемых ростовых рл фывов ДНК факторов

Bnx, Fas, GudiWS, P2JU PIG.v

Bel-2, Bd-xl, Cnlbiiitlm, MmSOD, IAPs

Анании *** усиление, I - ингибирование

Рисунок 23 - Модель взаимной регуляции транскрипционных факторов к

NFkB и Р53 [по данным Т.А. Taha et al., 2006]

Под действием стимулирующего сигнала Р53 транслоцируется в ядро, инициируя транскрипцию генов проапоптотических факторов, включая gadd45 (Growth Arrest and DNA Damage-induced) и p21, экспрессия которых приводит к остановке клеточного цикла. Клетка, в которой произошли генетические изменения, либо гибнет в результате запуска программы апоптоза либо останавливается в G1- или G2-, а иногда в S-фазах. Напротив, постоянные сигналы выживания обусловливают активацию и ядерную транслокацию NFkB и индуцируют синтез антиапоптотических белков, таких как bcl-2, bcl-xl, MnSOD, кальбиндин или ингибиторы апоптотических белков (IAPs). Кроме того, показана способность данного транскрипционного фактора активировать экспрессию циклина D1, позитивного регулятора перехода из G1 в S-фазу клеточного цикла за счет связывания с множественными сайтами на его промоторе [Wang C.Y. et al., 1999; Yamamoto Y., Gaynor R.B., 2001].

Таким образом, оценка молекулярных механизмов IL-2-опосредованного апоптоза показала наличие сложной многокомпонентной реакции клетки в ответ на изменение условий её жизнедеятельности. Нами было выявлено, что индуцированное данным цитокином усиление наработки активных форм кислорода сопровождается активацией транскрипционных факторов, приводящей к изменению профиля экспрессии соответствующих генов. При этом, как показали полученные нами данные, судьба клетки решается на уровне белков семейства Вс1-2. Последние могут изменять свою активность в результате взаимодействия друг с другом, вышестоящими компонентами сигнальных систем, а также окислительной модификации (рис. 24).

В использованной нами модели in vitro молекулярные механизмы реализации апоптотической программы лимфоцитов крови во многом схожи с таковыми при клещевой нейроинфекции. При этом АФК, вероятно, принадлежит роль вторичных мессенджеров, опосредующих активацию факторов транскрипции. Под действием последних происходит индукция синтеза белков, участвующих, в частности, в усилении митохондриальной проницаемости [Matsuzawa A. et al., 2005]. t ~ повышение, I - снижение, - - ингибирование, —> усиление

Рисунок 24 - Молекулярные механизмы про- и антиапоптотического эффекта интерлейкина-2 [по данным J. Kucharczak et al., 2003; A. Matsuzawa et al., 2005; R. Rodriguez, M. Meuth, 2006 и результатам собственных исследований (выделено цветом)]

Важно подчеркнуть, что выявленный факт устранения апоптозиндуцирующего действия IL-2 в присутствии дексаметазона и проявление его антиапоптотического влияния подтверждает гипотезу о том, что эффект данного цитокина определяется физиологическим состоянием клеток. В организме на лимфоциты помимо IL-2 действуют множество различных сигнальных молекул, состав которых и интенсивность действия зависит от степени зрелости клеток, их фенотипа и стадии иммунного ответа. В разных физиологических состояниях в клетках активируются различные сигнальные пути, и меняется состав белков-регуляторов, благодаря чему IL-2 способен оказывать противоположные эффекты на апоптоз лимфоцитов.

Точные внутриклеточные механизмы двойственности эффектов IL-2 требуют дальнейшего изучения. Это, в свою очередь, позволит понять процессы, лежащие в основе гомеостаза иммунной системы, что даст возможность для разработки новых методов лечения и диагностики заболеваний, связанных с дизрегуляцией апоптоза иммукомпетентных клеток.

Ill

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Сазонова, Елена Викторовна, 2010 год

1. Апоптоз гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах / Е.В. Дмитриева, Е.Ю. Москалёва, Л.В. Сладкова и соавт. // Иммунология. -2002. Т.4, № 2. - С. 235-236.

2. Апоптоз лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови при хронических HBV- и HCV-инфекциях / А.О. Буеверов, Е.В. Дмитриева, Е.Ю. Москалёва и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии — 2000. — № 6. — С. 33-36.

3. Белушкина, Н.Н. Молекулярные основы патологии апоптоза / Н.Н. Белушкина, С.Е. Северин // Архив патологии. — 2001. — № 1. — С. 51-60.

4. Биоэнергетика и смерть / Б.В. Черняк, О.Ю. Плетюшкина, Д.С. Изюмов и др. // Биохимия. 2005. - Т.70, № 2. - С. 294-301.

5. Бойчук, С.В. Fas-рецептор и его роль при атопичекских заболеваниях / С.В. Бойчук, И.Г. Мустафин // Иммунология. 2001. - № 3. - С. 24-29.

6. Бра, М. Митохондрии в программированной гибели клетки: различные механизмы гибели / М. Бра, Б. Квинан, С. А. Сузин // Биохимия. — 2005. -Т. 70, №2.-С. 284-293.

7. Веденов, А.А. Моделирование элементов мышления / А.А. Веденов М.: Наука- 1988.- 108 с.

8. Владимирская, Е.Б. Механизмы апоптотической смерти клетки / Е.Б. Владимирская // Гематология и трансфузиология. — 2002. — Т.47, № 2. — С. 35-40.

9. Влаопулус, С. ЛМК: ключевой модулятор внутрклеточной сигнальной системы / С. Влаопулос, B.C. Зумпурлис // Биохимия. 2004. - Т.69, № 8. -С. 1038-1050.

10. Гольдберг, Е.Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е. Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.П. Шахов. — Томск: Изд-во Том. Ун-та, 1992. -264 с.

11. Дамбаева, С.В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека / С.В. Дамбаева, Д.В. Мазуров, Б.В. Пинегин // Иммунология. — 2001. № 6. - С.58- 61.

12. Дисбаланс иммунорегуляторных Thl- и ТЬ2-цитокинов при персистентных вирусных инфекциях / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий и др. // Медицинская иммунология 2007. -№2. - С. 53-59.

13. Дубиков, А.И. Малые молекулы регуляторы апоптрза клеток синовиальной оболочки у больных ревматоидным артритом / А.И. Дубиков // Научно-практическая ревматология. - 2006. - № 1. - С. 4-8.

14. Жукова, О.Б. Апоптоз и вирусная инфекция / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий. — Изд-во Том. ун-та, 2006. 142 с.

15. Зенков, Н.К. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты / Н.К. Зенков, В.З. Лапкин, Е.Б. Меныцикова М.:Наука, 2001. - 343 с.

16. Иммунология апоптоза и некроза / С.Я. Проскуряков, В.Л. Габай, А.Г. Конопляников и др. // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 12. - С. 1503-1605.

17. Исаева, М.П. Апоптоз как механизм цитопатического действия вируса клещевого энцефалита / М.П. Исаева, Г.Н. Леонова, В.Б. Кожемяко // Вопр. вирусол. 1998. -№ 4. - С. 182-186.

18. Кадагидзе, З.Г. Цитокины / З.Г Кадагидзе // Практическая онкология. -Т.4, № 3. С.131-138.

19. Кашкин, К.П. Иммунологические исследования в клинике инфекционных заболеваний / К.П. Кашкин // Новости прикладной иммунологии и аллергологии. 2004. - № 8. - С. 1-10.

20. Кетлинский, С.А. Роль Т-хелперов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета / С.А. Кетлинский // Иммунология. 2002. — № 2. - С. 77-79.

21. Кремер, Н.Ш. Теория вероятностей и математическая статистика / под ред. Н.Ш. Кремер. М: ЮНИТИ-ДАНА, 2004. - 573 с.

22. Куклина, Е.М. Роль фактора транскрипции NFAT в иммунном ответе / Е.М. Куклина, С.В. Ширшев // Биохимия. 2001. - Т. 66, № 5 - С. 581591.

23. Лебедев, JI.P. Изучение цитокинового профиля при иммунизации геном интерлейкина-2 человека в составе рекомбинантной плазмиды / J1.P. Лебедев, Л.Е. Булычев, И.В. Бабин // Иммунология. 2007. - № 3. — С. 143-147.

24. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика / под ред. Дж. Натвиг и др. М.: Медицина, 1980. - 280 с.

25. Лотце, М.Т. Биологические методы лечения интерлейкином-2: преклинические методы исследования (пер. с англ.) / М.Т. Лотце // Биологические методы лечения онкологических заболеваний, 2-е изд. — Москва, Медицина, 2002. С. 218-246.

26. Маянский, Н.А. Субклеточное перераспределение Вах и его слияние с митохондриями при спонтанном апоптозе нейтрофилов / Н.А. Маянский // Иммунология. 2001. -№ 6. - С. 29-32.

27. Меньшикова, Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и др. -М.:Слово, 2006.-600 с.

28. Механизмы действия онкогенов и опухолевых супрессоров Электронный ресурс. / Российский Онкологический научный центр РАМН. -Электронный журн. Москва: РОНЦ РАМН, - 2006. -Режим доступа к журналу: http://www.rosoncoweb.ru

29. Молекулярные и клеточные основы патогенеза клещевого энцефалита / Р.Ф. Насырова, Н.В. Рязанцева, Н.Г. Жукова и др. // Бюллетень сибирскоймедицины. 2006. - С. 42-51.

30. Мушкамбаров, Н.Н. Молекулярная биология / Н.Н. Мушкамбаров, C.JI. Кузнецов. -М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. -544 с.

31. Носик, Н.Н. Цитокины при вирусных инфекциях / Н.Н. Носик // Вопросы вирусологии. 2000. - № 1. - С. 4-9.

32. Октябрьский, О.Н. Редокс-регуляция клеточных функций / О.Н. Октябрьский, Г.В. Смирнова // Биохимия. — 2007. — Т. 72, вып. 2. С. 158-174.

33. Пирогова, Н.П. Фагоцитарные функции крови у больных острым клещевым энцефалитом / Н.П. Пирогова, В.В. Новицкий // Бюл экспер биол. — 2003. — № 1.-С. 83-85.

34. Попович, A.M. Интелейкин-2: опыт клинического применения в России / A.M. Попович Спб., 2005 - 56 с.

35. Потапнев, М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и еге регуляция цитокинами / М.П. Потапнев // Иммунология. 2002. - № 4. - С. 235-242.

36. Приймяги, JI.C. Иммунорегуляторные ТЫ- и ТЪ2-цитокины при хронических инфекциях, вызванных вирусами гепатитов В и С / JI.C. Приймяги, В.Т. Тефанова // Вопросы вирусологии. 2003. - № 4. - С. 3740.

37. Ратникова, Л.И. Современные представления о патогенезе клещевого энцефалита / Л.И. Ратникова, Л.В. Тер-Багдасарян, И.Л. Миронов // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - № 5. - С. 41-46.

38. Рыжов, С.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов / С.В. Рыжов, В.В. Новиков // Российкий биотерапевтический журнал. 2007. -Т. 1, № 3. - С. 27-33.

39. Сенников, С.В. Альтернативный сплайсинг в формировании структуры системы цитокинов / С.В. Сенников, С.В. Силков В.А. Козлов // Система цитокинов: теоретические и клинические аспекты. — Новосибирск. — 2004. -С.7-23.

40. Симбирцев, А. С. Интерлейкин-2 и рецепторный комплекс интерлейкина-2 в регуляции иммунитета / А. С. Симбирцев // Иммунология. — 1998. — № 6.-С. 3-8.

41. Симбирцев, А.С. Цитокины: классификация и биологические функции / А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. 2004. - Т.З, № 2. - С. 16- 21.

42. Система фактора некроза опухоли а и его рецепторов в иммунопатогенезе персистентных вирусных инфекций / Зима А.П., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. и соавт. // Иммунология. — 2007. — № 6. — С. 357-361.

43. Фильченков, А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций / А.А. Фильченков // Биохимия. 2003. - Т. 68, вып. 4. — С. 453466.

44. Фрейдлин, И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции / И.С. Фрейдлин // Иммунология. 2001. — № 5. — С. 415.ti

45. Фрейдлин, И.С. Регуляторные функции провоспалительных цитокинов и острофазных белков / И.С. Фрейдлин, П.Г. Назаров // Вестник РАМН. -1999.-№5.-С. 28-32.

46. Хаитов, P.M. Физиология иммунной системы / P.M. Хаитов. — М.: ВИНИТИ РАН, 2001. 224 с.

47. Хаитов, P.M. Некоторые избранные проблемы функциональной активности макрофагов / P.M. Хаитов, В.М. Земсков // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 1995. — № 3. — С. 21-32.

48. Хансон, К.П. Программированная клеточная гибель (апоптоз) молекулярные механизмы и роль в биологии и медицине / К.П. Хансон // Биохимия. 1997. - Т. 61, № 7. - С. 402-412.

49. Царегородцева, Т.М. Цитокины в гастроэнтерологии / Т.М. Царегородцева, Т.И. Серова М.: Анахарсис, 2003. — 96 с.

50. Чанакчи, Ч. Активные формы кислорода и воспалительные процессы в зубах человека / Ч. Чанакчи, Я. Чичек, В. Чанакчи // Биохимия. — 2005. — Т. 70, №6.-С. 751-761.

51. Ярилин, А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии // Аткуальные проблемы патофизиологии / Под ред. Б.Б. Мороза. М., 2001. - С.13-56.

52. A human class II МНС-derived peptide antagonizes phosphatiaylinositol 3-kinase to block IL-2 signaling / M.L. Boytim, P. Lilly, K. Drouvalakis et al. // J Clin Invest. 2000. - Vol. 105, № 3. - P. 703-714.

53. A requirement for IL-2/1L-2 receptor signaling in intrathymic negative selection / H. Bassiri, S.R. Carding // J. Immunol. 2001. - Vol. 166, № 10. -P. 5945-5954.

54. Activated АКТ regulates NF-kappaB activation, p53 inhibition and cell survival in HTLV-1-transformed cells / S.J. Jeong, C.A. Pise-Masison, M.F. Radonovich et al. // Oncogene. 2005. - Vol 24, № 44. - P. 6719-1628.v

55. Adrain, C. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas / C. Adrain, SJ. Martin // Trends Biochem. 2001. - № 26. -P. 390.

56. Aggregate formation of hepatitis В virus X protein affects cell cycle and apoptosis / Z.S. Chang, L.B. Zeng, C.S. Chang et al. // World J. Gastroenterol. 2003. -Vol. 9. - P. 1521-1524.

57. Aiolos transcription factor controls cell death in T cells by regulating Bcl-2 expression and its cellular localization / F. Romero, C. Martinez-A, J. Camonis et al. // EMBO J. 1999.Vol. 18, № 12. P. 3419-3430.

58. Alonso, A.S. Tyrosine phosphorylation of VHR phosphatase by ZAP-70 / A.S. Alonso, S. Rahmouni, S. Williams //Nat. Immunol. 2003. - № 4. - P. 44-48.

59. An IL-2-Dependent Switch Between CD95 Signaling Pathways Sensitizes Primary Human T Cells Toward CD95-Mediated Activation-Induced Cell Death / I. Schmitz, A. Krueger, S. Baumann et al. // The Journal of Immunology. 2003. - Vol. 171. - P. 2930-2936.

60. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure / M. Van Engeland, L.J. Nieland, F.C. Ramaekers et al. // Cytometry. 1998. - Vol. 31, № 1. - P. 1-9.

61. Apoptosis regulators / A. Huwiler, B. Boddinghaus, A. Pautz et al // Biochem. Byorhys. Res. Commun. 2001. - Vol. 284, № 2. - P. 404-410.

62. Apoptosis signaling pathways and lymphocyte homeostasis / T. Levade, N. Auge, R.J. Veldman et al. // Circ. Res. 2001. - Vol. 89, № 11. - P. 957-968.

63. Aqueilan, R. Mechanism of action of interleukin-2 (IL-2) Bax, an apoptosis-indusing chimaeric protein targeted against cells expressing the IL-2 receptor / R. Aqueilan, R. Kedar, Ben -Yehudah A. et al. // Biochemistry J. - 2003. -Vol. 370.-P.129-140.

64. Arbuthnot, P. Hepatitis В virus and hepatocellular carcinoma / P. Arburthot, M. Kew // Int. J. Exp.Pathol. -2001. Vol. 82, № 2. -P.77-100.

65. Bcl-2 and Bax regulate the channel activity of the mitochondrial adenine nucleotide translocator / C. Brenner, H. Cadiou, H.L. Vieira et al. // Oncogene. 2000. - Vol. 19. - P. 329-336.

66. Bcl-2 differentially targets K-, N-, and H-Ras to mitochondria in IL-2supplemented or deprived cells: implications in prevention of apoptosis / A. Rebollo, D. Perez-Sala, C. Martinez-A et al. // Oncogene. 1999. - Vol. 18, № 35.-P. 4930-4939.

67. Bcl-2, Bcl-xL sequester BH3 domain-only molecules preventing Bax- and Bak-mediated mitochondrial apoptosis / E.H. Cheng, M.C. Wei, S. Weiler et al. // Mol Cell.-2001.-Vol. 8.-P. 705-711.

68. Bcl-XL is up-regulated by HTLV-I and HTLV-II in vitro and in ex vivo ATLLrsamples / C. Nicot, R. Mahieux, S. Takemoto et al. // Blood. 2000. - № 96. -P. 275-281.

69. Beadling, C. DNA array analysis of interleukin-2-regulated immediate/early genes / C. Beadling, K.A Smith // Med Immunol. 2002. - Vol. 1, № 1. - P.2.

70. Belizario, J.E. A mechanistic view of mitochondrial death decision pores / J.E. Belizario, J. Alves, M. Garay-Malpartida et al. // Bras. J. Med. Biol. Res. — 2007.-Vol. 40, №8.-P. 1011-1024.

71. Bergqvist, A. Transcriptional activation of the interleukin-2 promoter byhepatitis С virus core protein / A Bergqvist, C.M. Rice // J. Virol. 2001. — №75.-P. 772-781.

72. Beyaert, R. Nuclear Factor-kappaB: Regulation and Role in Disease / R. Beyaert -D.: Kluwer Academic Publishers, 2004. 426 p.

73. BH3 Domains of ВНЗ-Only Proteins Differentially Regulate Bax-Mediated Mitochondrial Membrane Permeabilization Both Directly and Indirectly / T. Kuwana, L. Bouchier-Hayes, С J.E.hipuk et al // Mol Cell. 2005. - Vol. 17. -P.525—535.

74. Biochemical Mechanisms of IL-2Regulated Fas-Mediated T Cell Apoptosis / Y. Refaeli, L.V. Parijs, C.A. London et al. // Trends in Immunology. 1998. -Vol. 8, №5. -P. 615-623.

75. Bliss, S.K. Rapid recruitment of neutrophils containing prestored IL-12 during microbial infection / S.K. Bliss, BA. Butcher, E.Y. Denkers / J. Immunol. -2000.-Vol. 165, №8.-P. 4515-4521.

76. Bonizzi, G. The two NF-кВ activation pathways and their role in innate and adaptive immunity / G.Bonizzi, M. Karin // Trends Immunol. — 2004. Vol.25. - P.280-288.

77. Booster effect of interleukin-2 on natural killer 1.1+ cells stimulated by administration of macrophage colony-stimulating factor in mice / ii. Misawa, T Sakurai, M. Yamada et al. // J. Immunother. 2003. - Vol. 26, № 1. - P. 2130.

78. Bromberg, J. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function / J.Bromberg, J.E. Darnell // Oncogene. 2000.- № 19. - P. 2468-2473.

79. Burlacu, A. Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins / A. Burlacu // J. Cell. Mol. Med. 2006. - Vol. 7, № 3. - P. 600-606.

80. Buzek, J. Redox state of tumor suppressor p53 regulates its sequence-specific DNA binding in DNA-damaged cells by cysteine 277 / J. Buzek;* L. Latonen, S. Kurki //Nucleic Acids Research. 2002. - Vol. 30, 11. - P. 2340-2348.

81. CD 95-independent mechanisms of IL-2 deprivationinduced apoptosis in activated human lymphocytes / T. Hieronymus, N. Blank, M. Gruenke et al. // Cell Death and Differentiation. 2000. - № 7. - P. 538-547.

82. Cell cycle arrest rather than apoptosis is associated with measles vims contact-mediated immunosuppression in vitro / J.J. Schnorr, M. Seufert, J. Schlender et al. // Journal of General Virology. 1997. - № 78. - P. 3217-3226.

83. Cell cycle regulation by FasL and Apo2L/TRAIL in human T-cell blasts.1. JL1.plications for autoimmune lymphoproliferative syndromes / A. Bosque, J.I. Aguilo, M. Rey et al. // Journal of Leukocyte Biology. 2008. - № 84. - P. 488-498.

84. Chen, Y. Rhinovirus induces airway epithelial gene expression through dsRNA and interferon-dependent pathways / Y. Chen, E. Hamati, W.M. Lee et al. // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2005. - Vol. 34, № 2. - P. 192-203.

85. CIS associates with the interleukin-2 receptor beta chain and inhibits IL-2-dependent signaling / J.M. Aman, T.S. Migone, M. Zhu et al. // J. BiolChem. -1999, № 274.-P.302-366.

86. CIS, a cytokine inducible SH2 protein, is a target of the JAK-STAT5 pathway and modulates STAT5 activation / A. Matsumoto, M. Masuhara, JC. Mitsui et al. // Blood. 1997. - № 89. - P. 31-48.

87. Combination IL-2 and IL-4 reduces glucocorticoid receptor-binding affinity and T cell response to glucocorticoids / J.C. Kam, S.J. Szefler, W. Surs et al. // J. Immunol. 1993. - Vol. 151, № 7. - P. 3460-3466.

88. Compensatory energetic mechanisms mediating the assembly of signaling complexes between interleukin-2 and its alpha, beta, and gamma(c) receptors / Rickert M., Boulanger M.J., Goriatcheva N. et al. // J. Mol. Biol. 2004. -Vol. 339, №5. -P. 1115-1128.

89. Constitutive activation of STATs upon in vivo human immunodeficiency virus infection / C. Bovolenta, L. Camorali, A.L. Lorini et al. // Blood. 1999. — Vol. 94. - P. 4202-4209.

90. Constitutive STAT3-activation in Sezary syndrome: tyrphostin AG490 inhibits STAT3-activation, interleukin-2 receptor expression and growth of leukemic Sezary cells / K.W. Eriksen, K. Kaltoft, G. Mikkelsen // Leukemia. 2001. -№ 15- P. 787-793.

91. Crystal structure of the IL-2 signaling complex: paradigm for a heterotrimeric cytokine receptor / D.J. Stauber, E.W. Debler, P.A. Horton et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. - Vol. 103, № 8. - P. 2788-2793.

92. Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function / A.M. Thornton, E.E. Donovan, C.A. Piccirillo et al. // J. Immunol. 2004. - №. 172. - P.6519-6523.

93. Cytokine regulation of apoptosis and Bcl-2 expression in lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus / W.B. Graninger, C.W. Steiner, M.T. Graninger et al. // Cell Death and Differentiation. 2000. - Vol. 7, № 10. - P. 966-972.

94. Cytokine response gene 6 induces p21 and regulates both cell growth and arrest / W. Fan, G. Richter, A. Cereseto et al. // Oncogen. 1999. - Vol. 18, № 47.-P. 6573-6582.

95. Cytokine-related Mechanisms of Apoptosis / Lee WoongBee // Cytokine bulletine Электронный ресурс. Электрон, журн. — Режим доступа к журн.: http://www.woongbee.com

96. Danial, N.N. Cell death: critical control points / N.N. Danial, S .J. Kormeyer // Cell. 2004. - № 116. - P. 205-219.

97. Deathassociated protein kinase-related protein 1, a novel serine-threonine kinase involved in apoptosis / B. Inbal, G. Shani, O. Cohen et al. // Mol. Cell. Biol. 2000. - № 20. - 1044-1054.

98. Determination of the in vivo effects of prednisone on Bcl-2 family protein expression in childhood acute lymphoblastic leukemia / F. Casale, R. Addeo, V. D'Angelo // Int. J. Oncol. 2003. - № 22. - P. 123-128.

99. Development and maintenance of T-cell requires post-translational regulation of anti-apoptotic MCL-1 and pro-apoptotic BIM by IL-7 / W. Li, T. Guszczynski, J. Hixon et al. // Cytokine. 2008. - Vol. 43, № 3. - P. 306.

100. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics / A. Letai, M. Bassik, LrWalensky et al. // Cancer Cell. 2002. - Vol. 2. - P. 183-192.

101. Down-regulation of normal human T cell blast activation: roles of AP02L/TRAIL, FasL, and c- FLIP, Bim, or Bcl-x isoform expression / A. Bosque, J. Pardo, M.J. Martinez-Lorenzo // Journal of Leukocyte Biology. -2005.-№77.-P. 568-578.

102. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death / S. Elmore // Toxicol Pathol. 2007. - Vol. 35, № 4. - P. 495-516.

103. Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death / N. Joza, S.A. Susin, E. Daugas et al. // Nature. 2001. - Vol. 410, № 6828.-P. 549-554.

104. Estaquier, J. A role for T-helper type-1 and type-2 cytokines in the regulation of human monocyte apoptosis / J. Estaquier, J.C. Ameisen // Blood. 1997. -Vol. 90, №4.-P. 1618-1625.

105. Existence of escape mutant in HTLV-I tax during the development of adult T-cell leukemia / Y. Furukawa., R. Kubota, M. Тага et al. // Blood. 2001. - № 97.-P. 987-993.

106. Expression of ЬЬсЗ, a pro-apoptotic ВНЗ-only gene, is regulated by diverse cell death and survival signals / J. Han, C. Flemington, A.B. Houghton // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. - № 98. - P. 11318-11323.

107. Flavivirus activates phosphatidylinositol 3-kinase signaling to block caspase-dependent apoptotic cell death at the early stage of virus infection / C.-J. Lee, C.-L. Liao, Y.-L. Lin // Journal of virology. 2005. - Vol. 79. - P. 8388-8399.

108. Fridman, J.S. Control of apoptosis by p53 / J.S. Fridman, S.W. Lowe // Oncogene. 2003. - Vol.22. - P.930-940.

109. Functional cleavage of the common cytokine receptor gamma chain (gammac) by calpain / M. Noguchi, A. Sarin, M.J. Aman et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1997. - № 94. - P. 115-34.

110. Gartel, A.L. Lost in transcription: p21 repression, mechanisms, and consequences. / A.L. Gartel, S.K. Radhakrishnan // Cancer Res. 2005. - Vol. 65, № 10.-P. 3980-3985.

111. Generation of rabbit antibodies against death ligands by cDNA immunization / C. Diestrea, M.J. Martinez-Lorenzob, A. Bosquea et al. // Journal of Immunological Methods. Vol. 317, №. 1. - 2006. - P. 12-20.

112. Genome-wide comparison of human keratinocyte and squamous cell carcinoma responses to UVB irradiation: implications for skin ?nd epithelial cancer / J.E. Dazard, H. Gal, N. Amariglio et al. // Oncogene. 2003. - Vol. 22.-P. 2993-3006.

113. Gesbert, F. Recent advances in the understanding of interleukin-2 signal transduction / F. Gesbert, M. Delespine-Carmagnat, J. Bertoglio // J Clin Immunol. 1998. - № 18. - P. 307-20.

114. Gewies, A. Introduction to Apoptosis. ApoReview / A. Gewies // Электронный ресурс. — Режим доступа: http://www.celldeath.de/encyclo/aporev/apointro.pdf

115. Gilmore, T.D. NF-kB: from basic research to human disease / T.D. Gilmore // Oncogene. 2006. - № 51. - P. 6679-6899.

116. Global analysis of IL-2 target genes: identification of chromosomal clusters of expressed genes / P.E. Kovanen, L. Young, A. Al-Shami et al. // Int. Immunol. -2005.-Vol. 17, № 8.-P. 1009-1021.

117. Glucocorticoid-induced apoptosis and glucocorticoid resistance: molecular mechanisms and clinical relevance / S. Schmidt, J. Rainer, C. Ploner et al. // Cell Death Differ. 2004. - Vol. 11. - P. 45-55.

118. Glucose metabolism in lymphocytes is a regulated process with significant effects on immune cell function and survival / N.J. Maclver, S.R. Jacobs, H.L. Wieman et al. // Journal of Leukocyte Biology. 2008. - № 84. - P. 949-957.

119. Goleva, E. A role for STAT5 in the pathogenesis of IL-2-inducedлglucocorticoid resistance / E. Goleva, К. O. Kisich, D. Y. Leung // J. Immunol. -2003.-Vol. 169, № 10.-P. 5934-5940.

120. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Delays Neutrophil Constitutive Apoptosis Through Phosphoinositide 3-Kinase and Extracellular Signal-Regulated Kinase Pathways / J.B. Klein, M.J. Rane, J.A. Scherzer et al.л

121. The Journal of Immunology. 2000. - № 164. - P. 4286-4291.

122. Green, D.R. Mitochondria and apoptosis / D. R. Green, J. C. Reed // Science. -1998.-Vol. 281.-P. 1309-1312.

123. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism / V. Heiden, M.G., Plas, D.R. Rathmell et al. // Mol. Cell. Biol. 2001. - Vol. 21, № 17. - 5899-5912.

124. Gustafsson, A.B. Bcl-2 family members and apoptosis, taken to heart / A.B. Gustafsson, R.A. Gottlieb // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2007. - Vol. 292, № l.-P. 45-51.

125. Haddad, J.J. Pharmaco-redox regulation of cytokine-related pathways: from receptor signaling to pharmacogenetics / J.J. Haddad // Free Radical Biol. Med. 2002. - Vol.33. - P.907-926.

126. Hay, S. A time to kill: viral manipulation of the cell death program1 / S. Hay, G. Kannourakis // J. General Virology. 2002. - Vol. 83. - P. 1547-1564.

127. Hayden, M.S. Signaling to NF-kB / M.S.Hayden, S.Ghosh // Genes Dev.-2004.-Vol. 18.-P. 2195-2224.

128. HCV core/gClqR interaction arrests T cell cycle progression through stabilization of the cell cycle inhibitor p27Kipl. / Z.Q. Yao. A. Eisen-Vandervelde, S. Ray et al. // Virology. 2003. - № 314. - P. 271-282.

129. Hebenstreit, D. JAK/STAT-dependent gene regulation by cytokines / D. Hebenstreit, J. Horejs-Hoeck, A. Duschl // Drug News Perspect. 2005. - Vol. 18, №4.-P. 243-249.

130. Helper T cell IL-2 production is limited by negative feedback and STAT-dependent cytokine signals / A.V. Villarino, Cristina M. Т., J.S. Stumhofer et al. // J Exp Med. 2007. - Vol. 204, № 1. - P. 65-71.

131. Hepatitis С virus core protein inhibits human T lymphocyte responses by a complement-dependent regulatory pathway / Z.Q. Yao, D.T. iNguyen, A.I. Hiotellis et al. // J. Immunol. 2001. - № 167. - P. 5264-5272.

132. Hepatitis С virus core protein up-regulates anergy-related genes arid a new set of genes, which affects T cell homeostasis / M. Dominguez-Villar, A. Munoz-Suano, B. Anaya-Baz et al. // J. Leukoc. Biol. 2007 - № 82. - P. 1301-1310.

133. HIV-l infection induces a selective reduction in STAT5 protein expression / F. Pericle, L.A. Pinto, S. Hicks et al. // J Immunol. 1998. - № 160,- P. 28-31.

134. HTLV-I Tax induces cellular proteins that activate the kB element in the IL-2 receptor a gene / D.W. Ballardi, E. Bohnlein, J.W. Lowenthal et al. // Science. 1988. - Vol. 241. - P. 1652-1654.

135. Human monocyte-derived dendritic cells differentiated in the presence of IL-2 produce proinflammatory cytokines and prime Thl immune response / N. Sanarico, A. Ciaramella, A. Sacchi et al. // Journal of Leukocyte Biology. — 2006. № 80. - P. 555-562.

136. Human Protein Reference Database / T.S. Prasad, R. Goel, K. Kandasamy et al. // Nucleic Acids Res. 2009. - P. 767-772.

137. Human T cell lymphotropic virus type I Tax activates IL-15Ra gene expression through an NF-kB site / J. M. Mariner, V. Lantz, T. A. Waldmann et al. // J. Immunol. 2001. - № 166. - P. 2602-2609.

138. Identification of genes regulated by dexamethasone in multiple myeloma cells using oligonucleotide arrays / D. Chauhan, D. Auclair, E.K. Robinson et al. // Oncogene. 2002. - № 21. - P. 1346-1358.

139. IEX-1L, an apoptosis inhibitor involved in NF-kB-mediated cell survival / M.X. Wu, Z. Ao, K.V. Prasad et al. // Science. 1998. - № 281. - P. 9981001.

140. IL-2 and related cytokines can promote T cell survival by activating АКТ / E. Kelly, A. Won, Y. Refaeli et al. // J. Immunol. 2002. - Vol. 168, № 2. - P. 597-603.

141. IL-2 signaling in human monocytes involves the phosphorylation and activation of p59hck 1 / M.C. Bosco, R.E. Curiel, A.H. Zea // The Journal of Immunology. 2000. - № 164. - P. 4575-4585.

142. IL-2-induced cellular events / J.A. Gomez, C. Gonzalez, A. Martinez et al. // Crit. Rev. Immunol. 1998.- № 18. - P. 185-220.

143. IL-2-induced signal transduction involves the activation of nuclear NF-kappa В expression / N. Arima, W.A. Kuziel, T.A. Grdina et al. // The Journal of Immunology. 1992. - Vol. 149, № 1. - № 83-91.

144. IL-7 and IL-15 regulate the expression of the bcl-2 and c-myb genes in cutaneous T cell lymphoma (CTCL) cells / J.Z. Qin, C.L. Zhang, J. Kamarashev // Blood. 2001. - № 98. - P. 2778-2783.

145. In the absence of extrinsic signals, nutrient utilization by lymphocytes is insufficient to maintain either cell size or viability / J.C. Rathmell, M.G.a

146. Vander Heiden, M.H. Harris et al. // Mol. Cell. 2000. - № 6. - P. 683-692.

147. In vitro human Th-cell responses to a recombinant hepatitis С virus antigen: failure in IL-2 production despite proliferation / D.D. Eckels, N. Tabatabail, Т.Н. Bian et al. // Hum. Immunol. 1999. - № 60. - P. 187-199.

148. Inactivation of tnf signaling by rationally designed dominant-negative TNF variants / P.M. Steed, M.G. Tansey, J. Zalevsky et al. // Science. — 2003. -Vol. 301, №. 5641.-P. 1895-1898.

149. Induction of apoptosis in mature T cells / T. Ndolo, N.K. Dhillon, H. Ngyen et al. // J. Virol. 2002. - Vol. 76, № 8. - P. 3587-3595.

150. Interaction between complement receptor gClqR and hepatitis С virus core protein inhibits T-lymphocyte proliferation / D.J. Kittlesen, K.A. Chianese-Bullock, Z.Q. Yao et al. // J. Clin. Investig. 2000. - № 106. - P.1239-1249.

151. Interleukin-2 and human monocyte activation / I. Espinoza-Delgado, M.C. Bosco, T. Musso et al.//J. Leukoc. Biol. 1995. - Vol. 57, № 1,-P. 13-19.

152. Interleukin-2 expression in human carcinoma cell lines and its role in cell cycle progression / Т.Е. Reichert, S. Nagashima, Y Kashii et al. // Oncogene. — 2000. -Vol 19, №4.-514-25.

153. Involvement of APO-2 ligand/TRAIL in activation-induced death of Jurkat and human peripheral blood T cells / M.J. Martinez-Lorenzo, M.A. Alava, S. Gamen et al. // Eur. J. Immunol. 1998. - Vol. 8, № 9. - 2714-2725.

154. JAB/SOCS1/SSI-1 is an interleukin-2-induced inhibitor of IL-2 signaling / B. Sporri, P.E. Kovanen, A. Sasaki et al. // Blood. 2001. - Vol. 97, №1. - P. 221-226.

155. Janus kinases and signal transducers and activators of transcription: their rolps in cytokine signaling, development and immunoregulation / R.A.; Ortman, T. Cheng, R. Viskonty et al. // Arthritis Res. 2000. - Vol 2, № 1. - P. 16-32.

156. Jeong, S.Y. The role of mitochondria in apoptosis / S.Y. Jeong, D.W. Seol // BMB Rep. 2008. - Vol. 41,№ l.-P. 11-22.

157. Jerome, K.R. Viral Modulation of T-Cell Receptor Signaling / K.R. Jerome // J. Virol. 2008. - Vol. 2, № 9. - P. 4194-4204.

158. Kinyamu, H.K. Estrogen receptor-dependent proteasomal degradation of the glucocorticoid receptor is coupled to an increase in mdm2 protein expression / H.K. Kinyamu, Т.К. Archer // Mol. Cell. Biol. 2003. - Vol. 23. - P.5867-5881.

159. Kroemer, G. Mitochondrial control of cell death / G. Kroemer, J.C. Reed // Nat. Med. 2000. - Vol. 6.-P. 513-519.

160. Kuhn, D.J. Direct inhibition of interleukin-2 receptor alpha-mediated signaling pathway induces G1 arrest and apoptosis in human head-and-neck cancer cells / D.J. Kuhn, Q.P. Dou // J. Cell Biochem. 2005. - Vol. 95, №„2. - P. 379390.

161. Kyttaris, V. T lymphocytes in systemic lupus erythematosus: an update / V. Kyttaris, G. Tsokos et al. // Curr. Opin. Rheumatol. 2004. - № 16. - P. 548552.

162. Leonard, W.J. Cytokine receptor signaling pathways / W.J. Leonard, J.X. Lin. // J. Allergy Clin. Immunol. 2000. - Vol. 105. - P. 877-888.

163. Leonard, W.J. Cytokines and immunodeficiency diseases / W.J. Leonard // Nat. Rev. Immunol. 2001- №1. - p. 200-208.

164. Leonardo, M.J. Interleukin-2 programs mouse alpha beta T lymphocytes for apoptosis / M.J. Leonardo // Nature. 1991. - Vol. 353, N 6347. - P. 858-861.

165. Lindemann, M.J. Anti-apoptotic signaling by the Interleukin-2 receptor reveals a function for cytoplasmic tyrosine residues within the common yc-receptor / M.J. Lindemann, M. Benczik, S.L. Gaffen // Cancer Research. 2003. - № 63. - P. 9048-9054.

166. Loss of IRF-4-binding protein leads to the spontaneous development of systemic autoimmunity / J.C. Fanzo, I. W. Yang, S. Y. Jang et al. // J Clin Invest. 2006. - Vol. 16, № 3. - P. 703-714.

167. Margolin, K.A. Interleukin-2 in the treatment of renal cancer / K.A. Margolin / Semin Oncol. 2000. - Vol. 27, № 2. - P. 194-203.

168. Marmor, M.D. Role for lipid rafts in regulating interleukin-2 receptor signaling / M.D Marmor, M. Julius // Blood. 2001. - Vol. 98, № 5. - P. 1489-1497.

169. Mathur, S. Narrow-line Seyfert 1 galaxies and the evolution of galaxies and active galaxies / S. Mathur // Monthly Notices of the Royal Astronomical Society. 2000. - Vol. 314, №4.-P. 17-20.

170. Matsuzawa, A. Stress-responsive protein kinases in redox-regulated apoptosis signaling / A. Matsuzawa, H. Ichijo // Antioxid. Redox Signal. 2005. - № 7. -P. 472-481.

171. Mayer, B. Mitochondrial regulation of apoptosis / B. Mayer, R. Oberbauer // News Physiol. Sci. 2003. - Vol. 18. - P. 89-94.

172. McCune, J.M. The dynamics of CD4+ T-cell depletion in HIV disease / J.M. McCune //Nature. 2001. - Vol. 410. - P. 974-979.

173. McFarland, E.D. Izumi К M, Mosialos G. Epstein-Barr virus transformation: involvement of latent membrane protein 1-mediated activation of NF-кВ / E.D. McFarland, K.M. Izumi, G. Mosialos // Oncogene. 1999. - № 18. - P. 69596964.

174. Mechanisms of glucocorticoid-mediated apoptosis in hematological malignancies / S. Greenstein, K. Ghias, N. L. Krett et al. // Clin. Cancer Res. -2002.-Vol. 8, №6.-P. 1681-1694.

175. Microarray analysis uncovers the induction of the pro-apoptotic BH3-only protein Bim in multiple models of glucocorticoid induced apoptosis / Z. Wang, M.H. Malone, H. He // J. Biol. Chem. 2003. - № 278. - P. 2386-1-23867.

176. Mitochondrial involvement in nitric oxide-induced cellular death in cortical neurons in culture / S. Figueroa, M.J. Oset-Gasque , C. Arce et al. // J. Neurosci Res. 2006. - Vol. 5. - P.100-104.

177. Mitochondrial regulation of apoptosis / K. Breitschopf, J. Haendeler, Mai chow P. etal.//Mol. cell. Biol. 2000. - Vol. 20, №5.-P. 1886-1896/

178. Modulation by cytokines of glucocorticoid action / A. Angeli, R. G. Masera, M. L. Sartori et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. - Vol. 876, № 7. - P. 210220.

179. Mogensen, Т.Н. Molecular Pathways in Virus-Induced Cytokine Production / T.N. Mogensen, S.R. Paludan // Microbiol Mol Biol Rev. 2001. - Vol. 65, № l.-P. 131-150.

180. Molecular mechanisms of activated T cell death in vivo / D.A. Hildeman, Y. Zhu, T.C. Mitchell et al. / Curr. Opin. Immunol. 2002. - № 14. - P. 354-359.

181. Molecular signatures induced by interleukin-2 on peripheral blood mononuclear cells and T cell subsets / P. Jin, E. Wang, M. Provenzano et al. ■// Journal of translational medicine. 2006. - № 4. — P. 26.V

182. Moon, J.J. Phosphatidylinositol 3-kinase potentiates, but does not trigger, T cell proliferation mediated by the IL-2 receptor / J.J. Moon, B.H. Nelson // Journal of immunology. 2001. - Vol. 167, № 5. - P. 2714-2723.

183. Moriguchi, M. CXCL12 Signaling Is Independent of Jak2 and Jak3. M. Moriguchi, B.D. Hissong, M. Gadina et al. // J. Biol. Chem. 2005. - № 280. -P. 17408-17414.

184. Muller, N. Role of the cytokine network in CNS and psychiatric disorders / N. Muller // Nervenarzt. 1997. - Vol. 68, № 1. - P. 11-20.

185. Mustelin, T. Protein tyrosine phosphatases and the immune, response / T.Mustelin, T. Vang, N. Bottini // Nat. Rev. Immunol. 2005. - № 5. - P. 4357.

186. Necela, B.M. Mechanisms of glucocorticoid receptor action in noninflammatory and inflammatory cells / B.M. Necela, J.A. Cidlowski // Proc. Am. Thorac. Soc. 2004. - Vol. 1, № 3. - P. 239-246.

187. Nelson, B.H. Biology of the interleukin-2 receptor / B.H. Nelson, D.M. Willerford // Adv. Immunol. 1998. - № 70. - P. 1-81

188. Nelson, B.H. Interleukin-2 signaling and the maintenance of self-tolerance / B.H. Nelson // Current directions in autoimmunity. 2002. - N<j 5. — P. 92112.

189. Newton, R. Molecular mechanisms of glucocorticoid action: what is important? / R. Newton // Thorax. 2005. - Vol. 55, № 7. - P. 603-613.

190. NF-kB anti-apoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAPl and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation / C.Y. Wang, M.W. Mayo, R.G. Korneluk et al. // Science. 1998. -№ 281. - P. 1680-1683.

191. NF-kB induces expression of the Bcl-2 homologue Al/Bfl-1 to preferentially suppress chemotherapy-induced apoptosis / C.Y. Wang, D.C. Guttridge, M.W. Mayo // Mol Cell Biol. 1999. - № 19. - P. 5923-5929.

192. Nieto, M.A. Glucocorticoids activate a suicide program in mature T lymphocytes: protective action of interleukin-2 / M.A. Nieto, A. Lopez-Rivas // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1992. - Vol. 650, № 4. - P. 115-120.v

193. O'Brien, M.A. Apoptosis: A review of pro-apoptotic and anti-apoptotic pathways and dysregulation in disease / M.A. O'Brien, R. Kirby // Journal of Veterinaiy Emergency and Critical Care 2008. - Vol. 18, № 6. - P. 572-585.

194. Orf Virus Encodes a Novel Secreted Protein Inhibitor of Granulocytei.

195. Macrophage Colony-Stimulating Factor and Interleukin-2 / D. Deane, L. Colin, J. Mcinnes et al. // Journal of virology. 2000. - Vol. 74, №. 3. - P. 13131320.

196. O'Shea, J.J. Cytokine Signaling in 2002: New Surprises in the Jak/Stat Pathway / J.J. O'Shea, M. Gadina, R.D. Schreiber // Cell. 2002. - № 109. -P.121-131.

197. Pahl, H.L. Activators and target genes of Rel/NF-B transcription factors / H.L. Pahl// Oncogene. 1999. - Vol. 18. -P.6853-6866.

198. Pardee, A.B. G1 events and regulation of cell proliferation / A.B. Pardee //Science. 2001. - Vol. 246, № 4930.-P. 603-608.

199. Pastori, G.M. Common components, networks, and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of "redox" and abscisic acid-mediated controls / G.M. Pastori, C.H. Foyer // Plant. Physiol. 2002. - № 129. - P. 460-468.

200. Patel, R. JCS3796 p21WAFl is dynamically associated with JNK in human T-lymphocytes during cell cycle progression // R. Patel, B. Bartosch, J.L. Blank // Journal of Cell Science. 1998. - № 111. - P. 2247-2255.

201. Perkins, N.D. Integrating cell-signaling pathways with NF-kB and IKK function / N.D Perkins // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2007. -№ 8. - P. 40-62.

202. Prives, C. The p53 pathway / C. Prives, P.A. Hall // J. Path. 1999. - Vol. 187. - P.112-126.

203. Promotion of neutrophil apoptosis by TNF-alpha / G. Salamone, M. Giordano, A.S. Trevani et al. // J. Immunol. 2001. - № 166. - P. 3476-3483.

204. Protein phosphatase 2A dephosphorylation of phosphoserine 112 plays the gatekeeper role for BAD-mediated apoptosis / C.W. Chiang, C. Kanies, K.W. Kim et al. // Mol Cell Biol. 2003. - Vol. 23. - P. 6350-6362.

205. Proteinphosphatase 1 is a Ras-activated Bad phosphatase that regulates interleukin-2 deprivation-induced apoptosis / V. Ayllon, C. Martinez, A. Garcia et al. // EMBO J. 2000. - № 19 - p. 2237-2246.

206. Qin, J.Z. Constitutive and IL-7 and IL-15 stimulated DNA-binding of STAT factors and novel factors in cutaneous T cell lymphoma (CTCL) Cells / J.Z. Qin, J. Kamarashev, C.L. Zhang // J. Invest Dermatol. 2001. - N2 117. - P. 583-589.

207. Rapecki, S. Inhibition of human T cell activation by novel Src kinase inhibitors is dependent upon the complexity of the signal delivered to the cell / S.

208. Rapecki, R.J. Allen // Pharmacol Exp Ther. 2002. - Vol. 303, № 3. -P.1325-1333.

209. Regulation of the mitochondrial apoptosis-induced channel, MAC, by BCL-2 family proteins / L.M. Dejean, S. Martinez-Caballero, S. Manon et al. // Biochim Biophys Acta. 2006. -№ 1762. - P. 191-201.

210. Resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in lymphoblastic leukemia / R. Kofler, S. Schmidt, A. Kofler et al. // J. Endocrinol. 2003. - Vol. 178, № 1. -P. 29-36.

211. Rhabdomyosarcoma cell lines are resistant to Fas- and highly, sensitive to TRAIL-induced apoptosis / I. Petak., D.M. Tillman, F.G. Harwood et al. // Clin. Cancer Res. 2000. - Vol.6. - P.4432-4441.

212. Rodriguez, R. Chkl and p21 cooperate to prevent apoptosis during DNA replication fork stress / R. Rodriguez, M. Meuth // Mol. Biol. Cell. 2006. -Vol. 17, №1.-P. 402-412.

213. Role of mitochondria in apoptosis / M. Poppe, C. Reimertz, G. Munstermann et al. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2002. - № 44. - P. 325-347.

214. Ruvolo, P.P. Mitochondria, the killer organelles and their weapons / P.P. Ruvolo, F. Gao, W. L. Blalock // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, №15. - P. 11754-11758.

215. Saccani, S. Modulation of NF-kB activity by exchange of dimmers / S. Saccani, S. Pantano, G. Natoli //Mol. Cell. -2003. -№ 11. P. 1563-1574.

216. Scott, M.J. Cell-Mediated Immune Response to Human Papillomavirus Infection M. Scott, M. Nakagawa, A.B. Moscicki // Clinical And Diagnostic Laboratory Immunology. 2001. - Vol. 8, № 2. - P. 209-220.

217. Scott, M.J. Jaks, STATs, Cytokines, and Sepsis / M.J. Scott, C.J. Godshall,о

218. W.G. Cheadle // Clinical And Diagnostic Laboratory Immunology. — 2002. — Vol. 9, №6.-P. 587-889.

219. Selliah, N. Finkel TH. HIV-l NL4-3, but not IIIB, inhibits JAK3/STAT5 activation in CD4 (+) T cells / N. Selliah, Т.Н. Finkel // Virology. 2001. -Vol. 286.-P. 412-421.

220. Sequestration of p561ck by gpl20, a model for TCR desensitization / F. Goldman, J. Crabtree, C. Hollenback et al. // J Immunol. 1997. - Vol. 158. -P. 2017-2024.

221. Shuai, K. Regulation of JAK-STAT signalling in the immune system / K. Shuai, B. Liu // Nat. Rev. Immunol. 2003. - № 3. - P. 900-911.

222. Signaling by IL-2 and related cytokines: JAKs, STATs, and relationship to immunodeficiency / J.A. Johnston, C.M. Bacon, M.C. Riedy et al. // J. Leukoc. Biol. 1996. - Vol. 60, № 4. - P. 441-452.

223. Simmons, A. Nef triggers a transcriptional program in T cells imitating single-signal T cell activation and inducing HIV virulence mediators / A. Simmons, V. Aluvihare, A. McMichael // Immunity 2001. - № 14. - P. 763-777.

224. Singh, V. Regulatory role of pro-Thl and pro-Th2 cytokines in modulating the activity of Thl and Th2 cells when В cell and macrophages are used as antigen presenting cells / V. Singh, J. N Agrewala // BMC Immunol. 2006. - № 7. -P. 17.

225. Smith, K.A. The structure of IL2 bound to the three chains of the IL2 receptor and how signaling occurs / K.A. Smith // Med. Immunol. 2006. - Vol. 5, N 3. -P. 362-367.

226. SOCS-3 is tyrosine phosphorylated in response to interleukin-2 and suppresses STAT5 phosphorylation and lymphocyte proliferation / S.J. Cohney, D. Sanden, N.A. Cacalano et al. // Mol. Cell Biol. 1999. - № 19. - P. 4980.

227. Solomou, E.E. Molecular basis of deficient IL-2 production in T cells from patients with systemic lupus erythematosus / E.E. Solomou, Y.T. Juang, M.F. Gourley et al. // J. Immunol. 2001. - № 166. - P. 4216-4222.

228. Stat5 and Spl regulate transcription of the cyclin D2 gene in response to IL-2 / A. Martino, J.H. Holmes, J.D. Lord // J. Immunol. 2001. - 166. - P. 1723-1729.

229. STATs in oncogenesis / T. Bowman, R.Garcia, J. Turkson et al. // Oncogene. — 2000. № 19. - P. 2474-2488.

230. STRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL / H. Walczak; M.A. Degli-Esposti R. Johnson et al. // The EMBO journal. 1997. - Vol. 16, № 17.-P. 5386-97.

231. Stroud, R.M. In cytokine reference: ligands / R.M. Stroud, S. LaPorte, J.A. Wells//Academic press. 2001. - Vol. l.-P. 21-34.

232. Szabo, C. Poly(ADP-ribose) polymerase activation by reactive nitiogen species — relevance for the pathogenesis of inflammation / C. Szabo // Nitric Oxide. — 2006 -№ 14.-P. 169-179.

233. T cell dysfunction by hepatitis С virus core protein involves PD-l/PDL-1 signaling / Z.Q. Yao, E. King, D. Prayther et al. // Viral Immunol. — 2007. № 20. - P. 276-287.

234. Taha, T.A. A house divided: ceramide, sphingosine, and sphingosine-1-phosphate in programmed cell death / T.A. Taha, T.D. Mullen, L.M. Obeid // Biochim. Biophys. Acta. 2006. - Vol. 1758, № 12. - P. 2027-2036.

235. The Bad guy cooperates with good cop p53: Bad is transcriptionally up-regulated by p53 and forms a Bad/p53 complex at the mitochondria to induce apoptosis / P. Jiang, W. Du, K. Heese et al. // Mol. Cell Biol. 2006. - Vol. 26, №23.-P. 9071-9082.

236. The CD40/CD40 ligand interaction is required for resistance to toxoplasmic encephalitis / G. Reichmann, W. Walker, E.N. Villegas et al // Infect Immun. -2000.-Vol. 68, № 3. P. 1312-1318.

237. The forkhead transcription factor FoxO regulates transcription of p27Kipl and

238. Bim in response to IL-2 / M. Stahl, P.F. Dijkers, G.J. Kops et al. // J. Immunol. -2002.-Vol. 168, № 10.-P. 5024-5031.

239. The PI 3-kinase/Akt signaling pathway delivers an anti-apoptotic signal / S.G. Kennedy, A.J. Wagner, S.D. Conzen et al. // Genes Dev. 1997. - №11. - P. 701-713.

240. The role of interleukin-2 in regulating the sensitivity of natural killer cells for Fas-mediated apoptosis / J. Haux, A. C. Johnsen, B. Steinkjer et al. // Cancer Immunol. Immunother. 1999 - Vol. 48. - P. 139-146.

241. The role of the common cytokine receptor gamma-chain in regulating IL-2-dependent, activation-induced CD8+ T cell death / Z. Dai, A. /.rakelov, M. Wagener et al. // J. Immunol. 1999. - Vol. 163, № 6. - P. 3131-3137.

242. Therapeutic manipulations of peroxynitrite / D. Salvemini, M.P. Jensen D.P. Riley et al. // Drug News and Perspectives 1998. - № 11. - P. 204-214.

243. Thompson, E.B. Stepping stones in the path of glucocorticoid-driven apoptosis of lymphoid cells / E.B. Thompson // Acta Biochim. Biophys. Sin. 2008. -Vol. 40, № 7. - P. 595-600.

244. Thornton, A.M. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production / A.M Thornton, E.M. Shevach // Exp. Med. 1998. - № 188. -P. 287-296.

245. Thornton, S. Heterogeneous effects of IL-2 on collagen-induced arthritis / S. Thornton, G.P. Boivi., K.N. Kim // J Immunol. 2000. - № 65. - P. 557-563.

246. To be, or not to be: NF-kB is the answer role of Rel/NF-kB in the regulation of apoptosis / J. Kucharczak, M.J. Simmons, Y.J. Fan et al. // Oncogene. -2003. - Vol. 22. - P. 8961-8982.

247. TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL / H. Walczak, M.A. Degli-Esposti, R.S. Johnson et al. // The EMBO journal. 1997. Vol. 16, № 17.-P. 5386-5397.

248. Uncoupling IL-2 signals that regulate T cell proliferation, survival, and Fas-mediated activation-induced cell death / L. Van Parijs, Y. Rafaeli, J.D. Lord et al. // Immunity. 1999. - Vol. 11, № 3. - P. 281-288.

249. Unexpected and variable phenotypes in a family with JAK3 deficiency / D.M. Frucht, M. Gadina, G.J. Jagadeesh et al. // Genes and immunity. — 2001. Vol. 2, №8.-P. 422-432.

250. Waldmann, T.A. The interleukin-2 receptor / T. A. Waldmann // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266, № 5. - P. 2681-2684.

251. Waldmann, T.A. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design / T.A. Waldmann // Nature Rev. Immun. 2006. - Vol. 6, № 8. - P. 595-601.

252. Wang, X. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors / X. Wang, M. Rickert, K.C. Garcia // Science. — 2005. Vol. 310, № 5751. - P. 1159-1163.

253. Wigginton, J.M. IFNy and Fas/FasL are required for the antitumor and antiangiogenic effects of IL-12 /pulse IL-2 therapy / J.M Wiggnton, E.Gruys, L. Gelselhart et al. // J. Clin. Inves. 2001. - Vol. 108. - P. 51-62.

254. Yamamoto, Y. Therapeutic potential of inhibition of the NF-kB pathway in the treatment of inflammation and cancer / Y. Yamamoto, R.B. Gaynor // J. Clin Invest. 2001. - Vol. 107, № 2. - P. 135-142.t♦

255. Yusuf, I. Regulation of quiescence in lymphocytes / I. Yusuf, D.A. Fruman // Trends Immunol. 2003. - Vol. 24, № 7. - P. 380-386.