Клонирование и экспрессия химически синтезированного гена гормона брадикинина в клетках E. Coli. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Капелинская, Т.В.

• Капелинская, Т.В.
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Капелинская, Т.В.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. МЕТОДЫ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ

1. Плазмидные векторы для клонирования генов •

2. Методы введения чужеродных фрагментов ДНК. в плазмидные векторы

3. Получение специфических молекул ДНК для клонирования

Трансформация E.coii и отбор гибридных клонов

П. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЭУКАРИОТ В КЛЕТКАХ е.coli

1. Возможность функционирования генов эукариот. в прокариотической системе

2. Принципы подхода к получению направленной экспрессии генов эукариот в клетках E.coii

3. Методы изучения экспрессии генов эукариот в бактериальной клетке •.

Ш. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БРАДИКИНИНА И КИНИН-КАЛЛИКРЕИНОВОЙ

СИСТЕМЫ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы.

2. Результаты

I/ Конструирование и характеристика векторной плазмиды для экспрессии гена брадикинина.

2/ Конструирование и характеристика рекомбинантных плазмид, содержащих ген брадикинина.

3/ Экспрессия.гибридного брадикинин-в-галактозидазного гена в клетках E.coii.

3. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.,

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование и экспрессия химически синтезированного гена гормона брадикинина в клетках E. Coli.»

Актуальность проблемы. Бурное развитие методов генной инженерии, позволяющих выделять индивидуальные гены высших организмов, и переносить их в другой организм, открыло, с одной стороны, перспективы создания новой отрасли промышленности - биотехнологии, а с другой стороны, значительно расшибло возможности изучения структуры и функции генома эукариот. Получение бактерий - производителей белков растительного и животного происхождения связано с проблемой экспрессии генов в гетерологичном окружении. Трудности достижения успешной экспрессии генов высших организмов в бактериях заключаются в отличии их структуры от структуры генов прокариот. Одним из возможных путей решения этой проблемы является химический синтез эукариотического гена по известной аминокислотной последовательности с последующим клонированием его в подходящем векторе, обеспечивающем его экспрессию в бактериальных клетках. Этот путь оказался вполне реальным для генов, кодирующих олиго- и полипептиды, например для генов таких важных гормонов как инсулин, соматостатин и некоторых других.

Важно также, что клонирование химически синтезированных генов позволяет легко выделять их в требуемых количествах и использовать в качестве молекулярного зонда при поиске и дальнейшем изучении соответствующих природных генов.

Одной из важных и хорошо изученных биологических систем является кинин-калликреиновая система плазмы крови млекопитающих.В ее состав входит вазоактивный олигопептид брадикинин,обладающий гипотензивным действием на сердечно-сосудистую систему и стимулирующий гладкую мускулатуру. В организме брадикинин образуется в результате специфического протеолитического расщепления его высокомолекулярного предшественника - кининогена. Аминокислотная последовательность брадикинина известна, поэтому химический синтез этого гена с последующим клонированием его в бактериях позволили бы показать возможность создания штамма Е. coii - производителя олигопетида чужеродного происхождения, а также перейти к изучению кинин-калликреиновой системы на генетическом уровне.

Химический синтез гена брадикинина был осуществлен М.Н. Колосовым и его сотрудниками в Институте биоорганической химии АН СССР. /Коробко и др., 1979/.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было получение штамма E.coii - продуцента пептидного гормона человека - брадикинина. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: конструирование вектора для экспресии химически синтезированного гена брадикинина, объединение кодирующих последовательностей гена брадикинина с контрольными элементами lac-оперона E.coii;входящими в состав вектора, выбор штаммов для фе-нотипического тестирования брадикинина в бактериальных экстрактах, а также конструирование плазьшды, содержащей димер гена брадикинина, для выделения из нее ДНК, соответствующей гену брадикинина.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенной работы впервые был клонирован химически синтезированный ген брадикинина и получена его экспрессия в бактериальной клетке. В полученном штамме НВ101/ рьв-55 происходит направленная экспрессия гена гормона брадикинина в виде химерного белка, объединенного с В-галактозидазой. Для обнаружения продукции брадикинина бактериальными клетками разработаны методы радиоиммунологического анализа, применение которых позволило определить, что бради-кинин в бактериях синтезируется в количестве 40000 молекул на клетку. Разработан метод частичной очистки брадикинина из пептидных гидролизатов клеток, включающий хромотографию на колонке

3.

Bio-Rex70 , который позволяет получить 1,5 мг брадикинина из 25 г клеток.

В целом наши эксперименты продемонстрировали возможность конструирования штамма микроорганизма, способного синтезировать полипептид чужеродного происхождения.

Штаммы E.coii, содержащие рекомбинантные плазмиды, могут быть использованы как для препаративного выделения гена брадикинина, так и для выделения продукта его функционирования - гормона брадикинина.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. МЕТОДЫ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ 1.Плазмидиые векторы для клонирования генов

Развитие методов введения чужеродных молекул ДНК в небольшие внехромосомные генетические элементы бактериальной клетки путем рекомбинации in vitro открыло широкие возможности изучения структуры и функционирования генов эукариот.

Клонирование генов представляет собой совокупность методов интеграции индивидуального фрагмента ДНК в плазмидный или фаговый вектор, что обеспечивает репликацию этого фрагмента в бактериальной клетке и, следовательно, стабильное существование в поколениях,

В данном обзоре будут рассмотрены только плазмидные векторы для клонирования генов.

Плазмида является автономной кольцевой внехромосомной молекулой ДНК, которая кодирует множество функций, не являющихся необходимыми для жизнедеятельности хозяйской клетки. Термин "плазмида" впервые был предложен Ледербергом для описания генетических элементов, участвующих ВО ВНехрОМОСОМНОЙ НаСЛедСТВеННОСТИ /Lederberg, 1952/. Впоследствии, при изучении физической природы этих элементов, было показано, что молекулы ДНК, имеющие специфическую плаву, чую плотность в градиенте хлористого цезия, могут переноситься из клетки в клетку в процессе конъюгации, придавая клеткам-хозяевам НОВЫе Генетические СВОЙСТВа / Wohlheiter et al,1964; De Witt, Helinski, 1965/.

Структура молекул плазмидных ДНК была определена путем центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидия / Radioff et ai, 1967/. Было показано, что плазмиды, представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, находящееся в суперекрученном СОСТОЯНИИ / Clewell, Helinski, 1970; Blair et ai, 1972/. На этом физическом свойстве плазмид основывается большинство методов очийси молекул плазмидных ДНК ИЗ клеточных лизатов /Clowes,1972, Helinski and Clewell, 1971/.

Автономность существования плазмид и многие свойства, кодируемые плазмидами, привлекли огромное внимание исследователей в последни 10 лет. К ним легко применимы различные генетические и биохимические методы, поэтому плазмиды широко используются при решении проблем молекулярной биологии и генетики. Плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, используются при клонировании генов как векторы для репликации и отбора чужеродной генетической информации в бактериальных клетках.

Требования, предъявляемые к вектору

Векторы, подходящие для клонирования фрагментов чужеродной ДНК должны отвечать следующим требованиям: а/иметь малый размер; б/иметь, по крайней мере, два маркерных гена /ген устойчивости к антибиотику или ген, придающий ауксотрофность бактерии-хозяину/; в/амплифицирующийся репликон; г/Содержать один участок узнавания для нескольких рестриктаз, которые не должны расщеплять молекулу векторной ДНК в участке начала репликации. Результатом встраивания фрагмента ДНК по участкам узнавания этих рестриктаз должна быть инактивация одного из маркерных генов; д/известная последовательность нуклеотидов; е/свойства, обеспечивающие биологическую безопасность: уменьшение трансмиссибельности в присутствии конъю-гативных плазмид, температуро-чувствительная репликация при температуре тела человека /sutciiffe , 1978/.

Требования, предъявляемые к плазмидным векторам, сложились на основе использования первых плазмид для клонирования генов. С тех пор были сконструированы векторы, обладающие какими-либо преимущественными свойствами и предназначенные для различных целей при клонировании чужеродных генов. Наибольшими преимуществами до настоящего времени обладает сконструированная в лаборатории Бойера в 1977 году плазмида рВЕ322. /.Bolivar et ai, 1977/.

Конструирование векторных плазмид

Все известные к настоящему времени векторные плазмиды представляют собой либо существующие в природе плазмиды, либо сконструированные in vitroH3 фрагментов различных природных плазмид.

Первой плазмидой, использованной в качестве вектора, была плазмида psCIOI /cohen et ai,I973, Cohen, chang, 1973/. Она была получена при изучении двух R-факторов В6 и Е6-6. Плазмида R-6 несет устойчивость к тетрациклину /Тсг/» хлорамфениколу /Стг/, канамицину /КтУ, стрептомицину /strr / и сульфаниламидам /sur/. Она имеет также tra -оперон, определяющий способность этой плазмиды переносить генетический материал при конъюгации клеток, т.е. она относится к группе трансмисоибельных плавмид и имеет молекулярный вес 60 мегадальтон /М<э/. Для конструирования плазмиды psCIOI препараты плазмидной ДНК В-6 были подвергнуты механическому разрушению и смесь фрагментов была использована для траноформа: ции клеток E.coii. в результате была получена плазмида с молекулярным весом 5,8 М^неоущая устойчивость к одному антибиотику тетрациклину и потерявшая свойство трансмиссибельности. Плазмида psCIOI имеет один участок узнавания Е coEI, не затрагивающий ген Тсг.

В дальнейшем была сконструирована серия векторных плазмид на основании плазмиды Col EI. Плазмида Col Ж имеет ряд преимуществ перед J06CIOI. Репликация этой плазмиды находится, в отлиполучены путем механического разрушения молекул ДНК или при расщеплении специфическими эндонуклеазами рестрикции. Клонирование этих фрагментов ДНК называется "шот-ган" экспериментом, а популяция плавмид, содержащих все фрагменты тотальной ДНК, называется банком ИЛИ библиотекой генов /Clarice & Carbon, 1976, Carbon et al,

1976/. Этими авторами дано уравнение, описывающее, какое количество трансформантов необходимойполучить, чтобы в них вошла любая уникальная последовательность данного организма: Р = и cj. = /I - j/^, где Р - вероятность того, что данный ген присутствует в коллекции из й-трансформантов , ^ - часть генома, которую представляет каждый фрагмент, х - длина последовательности, которая должна быть неповреддена, I - длина клонируемых фрагментов. Уравнение предполагает гомогенное распределение размера фрагментов /при механическом разрушении/, каждый трансфорыант

N является гибридным, . а каждая гибридная молекула трансформируется с одинаковой эффективностью. Принимая р = 0,09, I = 10 Md, х I , то п для генов E.coii равно 1440, для генов дрожжей 4.600, для Drosophiia meianogaster 46.000, а для генов человека с

2тЗ.Ю клонов. Из приведенных расчетов видно, что для сложных организмов эукариот такие эксперименты следует проводить с предварительно обогащенными фракциями ДНК. Однако клонирование унин кальных последовательностей генов всших эукариот представляет большие трудности^техники клонирования в векторных плазмидах недостаточно даже для обогащенных последовательностей, поэтому обычно для клонирования генов эукариот применяют фаговые векторы,,обладающие бОЛЬШеЙ емКОСТЬЮ При БКЛЮЧеНИИ ЧужерОДНОЙ ДНК /Blattner et alI977, Baldacci , I979,Kataoka et alf 1979, Robbins et alf 1979, Dugaiczyk et, 1979. / чие от p^JIOIj под слабым контролем хозяина. Количество копий на клетку составляет 24 молекулы, а при амплификации хлорамфенико-лом - 1000-3000 молекул на клетку. Молекулярный вес Col EH равен 4,2 Md / Hershfield et al, 1974, Tanaka, Weisblum, 1975/. Присутствие плазмиды Col EI в клеткахE.coli устанавливается по способности клеток синтезировать колицин EI и по иммунности к нему. Включение чужеродной ДНК по месту, расщепляемому ecori; приводит к инактивации гена синтеза колицина, но не затрагивает области иммунитета к нему /inselburg, 1977, Inselburg, Ware , 1977/.

Путем транслокации ампициллинового транспозона /ТпА/ /Hef-ron , 1975/ из плазмиды EI drd 19 в плазмиду Col EI была получена плазмида rsf 2124, несущая детерминанту устойчивости к Ампициллину / so et aiI975/. В последующем были созданы плазмидные векторы, несущие по две и даже по три детерминанты устойчивости к антибиотикам. На таблице I представлены плазмидные векторы, использующиеся при клонировании генов. Все они имеют ряд преимуществ и недостатков друг перед другом. Более подробное описание конструирования векторных плазмед, дано в опубликованных обзорах / Collins et al, 1977/.

В настоящее время наиболее широко используется плазмида рВК322 / Bolivar et airI977/. Эта плазмида была сконструирована при изучении плазмиды ЕУТЗ, содержащей гены, системы рестрикции-модификации E.coRI. На первом этапе была получена плазмида pMBI / Rodrigues et al, 1976/. После транслокации в нее транспозона ТпА из плазмиды BIdrd 19 была получена плазмида рМВЗ. Серией последующих модификаций и одновременной трансформацией EcoEI фрагментов плазмиды рМВ8 и Е coEI фрагментов pscIOI была получена плазмида рМВ9, несущая устойчивость к тетрациклину. Затем

Таблица № I

Плазмиды, используемые в генетической инженерии у Грнрф Единственные

Плазмида Репликатор f.®®®®* сайты Литература вес маркеры рестриК!газ

I. paCIOI

Строгий кон- 2,5 троль хозяина

ТС

EcoRI,Hindlll Cohen et al BamHI,Sail 1973.

2. Col EI

3. Мини Col EI pvH5I ослабленный 4,2 контроль хозяина, многокопийна

Col EI

Col imm EcoRI,Smal Col prod.

2,1 Col imm EcoRI

Hershfield, 1974.

Hershfield et al,1976,

4. pPsF 2124 Col EI

5. pMB9

Col imm EcoRI,SmaI, Gill & Fal-Colprod. BamHI. cow,1976.

Apr рМВ1-реПЛИ- 3,5 Col innn EcoRI,Hindlll Rodrigues катop,подо- * бный Col EI

6. pBR322 pMBI

7. pBR324 pMBI

8. pBE325 pMBI

Tc BamHI,Sail, et al,1976,

HpaI,SmaI.

2,8 Tcr,Apr EcoRI,BamHI, Bolivar et

HindIII,SalI al,1977

PstI,PvuI,

PvuII,EcoRV.

Col imm EcoRI,Smal, Bolivar et

Apr,Tcr HindIII,SalI al,1977.

5,5

3,7 Cmr,Apr,

Tc R

BamHI.

EcoRI (Cm j)

Bolivar, 1978.

9. pACYCI77 р15А-подоб- 2,4-6 арг,кшг ный Col EI

10. pACYcI84 pi5A 2,65 cmr,Tcr

II. PKBI66 pMBI 1,6 litimm

12. pBR529 pMBI 2,5 APr,cmr r

Tc .

PvuI,PstI Chang,Co

HincII,BamHI hen,1977.

HindIII,SmaI

Xhol,

EcoRI3Cmr) Chang & Cohen,1977. EcoRI,BglII Backman, 1977.

EcoRI(Cmr) Bolivar, 1981. была получена плазмида рВР313 путем гентической транслокации ТпА из pRSF 2124 в рМВ9. Плазмида рВЕ513 имела размер 5,8 Md и несла гены устойчивости -.-'к двум антибиотикам Тс и Ар. Плазмида рВ£322 является производной от рВЕ313 и получена путем, включающим делеции по участкам узнавания psti /рВК318/ и рекомбинацией in vitro pBR3I8, обработанной одновременно Pst I и HPal с pBR320, обработанной одновременно Pst I и Hinc П, в свою очередь полученной из EcoR П фрагментов рВК213.

Плазмида рВ5322 имеет молекулярный вес 2,8 МсЛ, несет две детерминанты устойчивости к антибиотикам Тс и Ар, имеет по одному участку узнавания для девяти рестриктаз: EcoRI, psti, Hindiii, saii,BamHX, Pvuii, Aval, EcoRv,ciai. Эндонуклеаза Pst Г расщепляет pBE322 в области гена Ар r, a Hind Ш ,ват HI и sal I в области гена Тсг. В настоящее время определена полная первичная последовательность нуклеотидов плазмиды рВВ322 / sutciiffe, 1978/.

Свойства векторных плазмид

Все рассмотренные выше плазмиды можно разделить на 2 класса по характеру их репликации. Первая группа включает pSCIOI /cohen et all973/, Rp4 / Jacob, Grinter, 1975/ И pIC30I /Collins et al,

1977/. Эти плазмиды имеют лимитированное число копий на клетку

5 или меньше/ и не амплифицируются при подавлении синтеза белка.

Вторая группа представлена 10-60 копиями на геном и включает

COIEI / Hershfield et al, 1974/, pRSF 2124 /So et al, 1975/, pCII / Covey et al, 1976/, pCM706 И pCMI6 /нашег, Thomas, 1976/, pMB9 /Rodrigues et al, 1976/, pBK3I3, pBK322, PBR324 и pB325 / Bolivar et al, 1977, Bolivar, 1978/. Все плазмиды этой группы имеют репликон CoIEI и способны продолжать репликацию при подавлении синтеза белка /в присутствии хдорамфеникола/ в течение 7-12 часов и давать конечный выход плазмидной ДНК от нескольких сот /большие гибриды/ до 3.000 /исходные плазмиды или небольшие гибриды/ КОПИЙ на геном /ciewell, 1972, Hershfield, 1974/* ЙХ репликация не зависит от гена dnaA и частично не зависит от ДНК полимеравы Ш /ро1С/ / Goebel, 1972, Collins et al, 1973, Stauden-bauer, 1977/. Репликация плазмид этого класса зависит от ДНК-по-лимеразы I /Kingsbury , Helinski, 1973, Grindley,Kelly, 1976/. Репликация из репликона CoIEI также зависит от синтеза РНК, так как блокируется рифампицином даже в присутствии хлорамфеникола / Clewell et al, 1972/.

Другим важным свойством плазмид является несовместимость плазмид с одинаковыми или подобными участками начала репликации. По этому свойству все плазмиды делятся на группы несовместимости / Novick et al, 1976/. Векторные плазмиды, относящиеся ко второй группе и имеющие репликон CoIEI, взаимоисключают друг друга в одном и ТОМ же хозяине. /Cabello et al, 1976/.

При использовании бактериальных мутантов, продуцирующих ми-никлетки, плазмиды могут сегрегировать в них, выполняя роль единственной генетической информации клетки / curtiss, 1969, Fraser and curtiss, 1975/. Используя это важное свойство плазмид, можно анализировать кодируемые плазмидами полипептиды /Kedes et al, 1975, Tait et al, 1976, Miller et al, 1977, Rambach, Hogness, 1977, Seeburg et al, 1978/.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Капелинская, Т.В.

ВЫВОДЫ

I. Сконструирован плазмидный вектор pL-I, включающий контрольные элементы I ас-оперона E.coli и большую часть структурного гена I acz с целью экспрессии чужеродных генов в бактериальных клетках.

2. Проведено клонирование химически синтезированного гена брадикинина в составе векторов pL -I и рВК322. Получена серия рекомбинантных плазмид, содержащих ген брадикинина.

3. Получены пептидные гидролизаты клеток штамма E.coli HBIOI/pL В-55, pL B-II2 и pL -I и с помощью метода радиоиммунного анализа проведено определение содержания в них пептида анти-генноподобного брадикинину. В результате анализа показано, что в клетках штамма HBIOI/pL В-55 синтезируется брадикинин в количестве 40 ООО молекул на клетку.

4. Проведена частичная очистка брадикинина из клеточных ги-ролизатов клеток e.coli и установлено, что брадикинин, синтезируемый бактериями, обладает биологическими свойствами, характерными для гормона млекопитающих - брадикинина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Капелинская, Т.В., 1984 год

1. Городецкий С.И., Капелинская Т.В., Лисенков А.Ф., Слю-саренко А.Г., Дубинин Н.П. 1980: Клонирование и выражение химически синтезированного гена брадикинина в бактериальной клетке. Доклады АН СССР, 250, 208-212.

2. Дзизинский А.А., Гомзаков О.А. 1976: Кинины в физиологии и патологии сердечно-сосудистой системы "Наука". Новосибирск.

3. Дубинин Н.П., Слюсаренко А.Г., Капелинская Т.В., Богу-спаев К.К., Городецкий С.И. 1976: Получение комбинированных молекул ДНК фага лямбда и в. subtiiis методом достройки липких концов. Доклады АН СССР, 230, 729-732.

4. Миллер Ж. 1976: Трансдукция и выделение специализированных трансдуцирующих линий фагов. В кн.: Эксперименты в молекулярной генетике. "Мир", М. стр. 253-280.

5. Пасхина Т.С. Туликова О.М. 1968: Современные методы в биохимии. "Медицина", М., стр. 205.

6. Свердлов Е.Д. Долганов Г.М., Монастырская Г.С., Ходко-ва Е.М., Честухин А.В., Шемякин М.Ф. 1979: Клонирование и экспрессия синтетического гена лейцинэнкефалина в клетках- Биоорг. химия, 5, III2-II25.

7. Тихомирова М.П., Бельков В.В. 1980: Методы введения чужеродной ДНК в клетку и селекция гибридных плазмид. В сб.: Итоги науки и техники. Молекулярная биология, 12, часть П, Ред. Баев А. А.

8. Abelson J. 1979s RNA processing and the interveningw "sequence problem. Ann. Rev. Biochem., 48, I0J5-I069«

9. Alhenc-Gelas P., Marchetti J., Allegrini J., Corvol P., McNard J. 1981: Measurement of urinary kallikrein activity. Species differencies in kinin production. Biochim. Biophis. Acta, 667, 477-488.

10. Ambler R., Scott G.K. 1978: Partial aminoacid sequence of penicillinase coded by E.coii plasmid R6K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3732-3736.

11. Anderson J.N., Schimke R.T. 1976: Partial purification of the ovalbumin gene. Cell, 7, 331-338.

12. Arber W., Linn S. 1969: DNA modification and restriction.- Annu. Rev. Biochem., 38, 467-500.

13. Avery O.T., McLeod O.M., McCarty M. 1944s Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of Pneumococcal types. J. Exp. Med., 79, 137-158.

14. Backman K., Ptashne M. 1978s Maximizing gene expression on a plasmid using recombination in vitro. Cell, 15, 65-71.

15. Baldacci P., Royal A., Cami В., Perrin E., Krust A., Garapin A., Kourilsky P. 1979s Isolation of the-lysozyme gene of the chicken. Nucleic Acid Res., 6, 2667-2681.

16. Baumstark J.S., Bardavill ?/.A., Sbarra A.J,, Haysr N.J. 1964: Purification on pancreatopeptidase E by batch separation on dietyl aminoethyl (DEAE) sephadex. Biochim. Biophys. Acta,77, >76-679.

17. Bernard H.U., Helinski D.R. 1979: Bacterial plasmid cloning vehicles. Genetic Engineering. Principles and methods, 2, ed. by Setlov J.K., Hollaender A.

18. Bertani G., Weigle J.J. 1953: Host controled variation in bacterial viruses. J. of Bacterid., 65, II3-I2I.

19. Bickle Т., Purrota V., Imber R. 1977: A simple general procedure for puriffing restriction endonucleases. Nucleic Acid Res., 4, 2561-2562.

20. Bollum F.J. 1974: Terminal transferase. In: The Enzymes, ed. by Boyer P.D. New York: Academic Press, Vol. X,1.5-171.

21. Boyer H.W., Roulband-Dussoix D. 1969: A complementation analysis of the restriction and modification of DNA in Escherichia coli. J. Molec. Biol., 41, 459-472.

22. Brammar W., Murray N., Winton S. 1974: Restriction of trp bacteriophages by Escherichia coli K. J. Molec. Biol., 90, 633-647.

23. Broome S., Gilbert W. 1978: Immunological screening method to detect specific translation products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2746-2749.

24. Burrell C.J., Mackay P., Greenaway P., HofSchneider P., Murray K. 1979i Expression in E.coii of hepatitis В virus ША sequences cloned in plasmid pBR 322. Nature, 279, 43-47.

25. Busslinder M«, Portmann H., Irminger J., Birnstiel M.L.v 41980: Ubiquitous and gene-specific regulatory 5' sequences in sea urchin histone ША clone coding for histone protein variants. Nucleic Acid Res., 8, 957-977.

26. Cabello P., Timmis K., Cohen S.N. 1976: Replication control in vitro linkage of two distinct replicons, Nature, 259, 285-290.

27. Carbon J., Clarke L., Ilgen C., Ratzkin B. 1976: The construction and use of hybrid plasmid gene banks in E.coii. -In: Tenth Miles Symposium, Cambridge, Mass, June 8-10.

28. Chang A.C.Y., Lausman R.A., Claiton D.A., Cohen S.N. 1975: Studies of mouse mitochondrial DNA in E.coii. Structure and function of the eucariotic-procaryotic chimeric plasmids.112.1. Cell, 6, 251-244.

29. Chang A.,. Nunberg J., Kaufman R., Erlich H., Schimke R., Cohen S. 1978: Phenotypic expression in E.coli of a MA sequences coding for mouse dihydrofolatreductase. Nature, 275, 617-624.

30. Chambon B. 1981: Organization and expression of eucaryo-tic split genes coding for proteins. Annu. Rev. Biochem.,50, 549-385.

31. Charnay P., Lousse A., Fritch A., Perrin D., Tiolais P. 1979s Bacteriophage lambda E. coli K-I2 vector-host system for gene cloning and expression under lactose promoter control. - Mol. Gen. Genet., 170, I7I-I78.

32. Clarke L., Carbon J. 1975: Biochemical construction and selection of hybrid plasmids containing specific segments of the E.coli genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 4561-4565.

33. Clewell D.B. 1972: Nature of Col EI plasmid replication in E.coli in the presence of chloramphenicol. J, Bacterid., 110, 667-676.

34. Clewell D.B., Helinski D.R. 1970: Properties of a super-coiled DNA-protein relaxation complex and strand specifity of the relaxation event. Biochemistry, 9 , 4428-4450.

35. Clewell D.B., Evenchik В., Crauston J.W, 1972: Direct inhibition of Col EI plasmid replication in E.coli by rifampi-cin. Nature, 257, 2951-2955.

36. Clowes R.C. 1972: Molecular structure of bacterial plasmids. Bacteriol. Rev., 56, 561-405.

37. Cohen S.N., Chang A.C.V., Hsu L. 1972: Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of E. coli by R-factor DNA. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69, 2II0-2II4.

38. Cohen S.N., Chang A.C.Y. 1975: Recircularisation and1. ИЗ.autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in E. coli transformants. Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 70, 1293-1297.

39. Cohen S.N., Chang A.C.Y. 1977: Revised interpretation of the origin of the pSG 101 plasmid. J. Bacterid., 132, 734-739.

40. Cohen S.N., Chang А.СЛ., Boyer H.W., Helling R.B. 1973* Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 5240-3244.

41. Collins J., Pritchard R.H. 1973s Relationship between chromosome replication and F'lac episomereplication in E.coli. J. Mol. Biol., 78, 145-155.

42. Collins J. I977:Gene cloning with small plasmids. In: Current Top. Microbiol. Immunol., 78, 121-170.

43. Corden J., Wasylyk В., Buchwalder A., Sassone-Corsi P., Kedinger C., Chambon P. 1980: Promoter sequences of eucaryotic protein-coding genes. Science, 209, I406-1414.

44. Covey C., Richardson D., Carbon J. 1976: A method for the deletion of restriction sites in bacterial plasmid DNA. -Mol, Gen. Genet., 145, 155-158.

45. Crick P.H.C. I979:Split genes and RNA splicing. -Science, 204, 264-271.

46. Curtiss R.III. 1969: Bacterial conjugation. Annu. Rev. Microbiol., 23, 69-136.

47. Curtiss R.III, Inove M., Pereira P., Charles J., Hsu L., Alexander . Rock L. 1977: Construction and use of safer bacterial host strain for recombinant DNA research. In: Molecular cloning of recombinant DNA, ed. by Scott W.A., Werner R.,v. 13, 99-Ю5.

48. Eisen V. 1980: Kinins in physiology and pathology. -Trends in Pharmacol. Sciences, I, 212-215.

49. Emtage J., Tacon W., Catlin G., Jenkins В., Porter A., Carey N. 1980: Influenza antigenic determinants are expressed from haemaglutinin genes cloned in E.coli. Nature, 283,1.1-174,

50. Erdos J. 1976: The kinins. Biochem. Pharmacol., 25, I563-1569.

51. Erlanger B. 1973: Principles and methods for the preparation of drug protein conjugated for immunological studies. Pharmacol. Rev., 25, 271-280.

52. Erlich H., Cohen S.N., McDevitt H.O. 1979: A sensitive radioimmunoassay for detecting products translated from cloned DNA fragments. Cell, 13, 681-689.

53. Davis A.R., Hiti A., Nayall D.P* 1980: Construction and characterisation of a bacterial clone containing the hemagglutinin gene of the WSN strain of influenza virus. Gene, 10, 205-218.

54. Derynck R., Remaunt E., Saman E., Stanssens P., DeClergcq E., Conte J., Fiers W. 1980: Expression of human fibroblast interferon gene in E.coli. Nature, 287, 193-196.

55. De Witt., Helinski D.R. 1965: Characterization of coli-cinogenir factor EI from a non-indured and a mitomycin C-indured Proteus strain. J. Molec. Biol., 13, 692-703.

56. Dubois M.F., Pourcel C., Rousset S., Chany C., Tiollais. 1980: Excretion of hepatitis В surface antigene particles from mouse cells transformed with cloned viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4549-4553.

57. Dugaiczyk A., Doyer H.W., Goodman H. 1975: Ligation of EcoRI endonuclease-generated DNA fragments into linear and circular structures. J. Molec. Biol., 96, I7I-I84,

58. Dugaiczyk A., Woo S., Colbert D., Lai E., Mace M.,

59. O'Malley B.W. 1979: The ovalbumin gene: 'Cloning and molecular organization of the entire natural gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 2253-2257.

60. Fiddes J.C., Goodman H.M. 1979: Isolation cloning and sequence analysis of the cDNA for the -subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

61. Flavell R.A. 1980s The transcription of eucaryotic genes. Nature, 285, 356-357.

62. Fowler A., Zabin I. 1977: The amino acid sequence of -galactosidase of E.coii. Eroc.Natl.Acad.Sci.USA,74,1507-1510.

63. Frser A.O., Curtiss R.III. 1975: Production properties and utility of bacterial minicells. In: Current Topics in Microbiology and Immunology, 69, 1-84,

64. Fraser Т.Н., Bruce B.J. 1978: Chicken ovalbumin is synthesized and secreted by E.coii. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75, 5936-5940.

65. Gannon F., O'Hare K., Perrin F., LePennec J., Benoist C., Cochet M., Breathnch R., Royal A., Garapin A. 1979: Organization and sequences at the 5'end of cloned complete oval-bumine gene. Nature, 278, 428-454.

66. Garapin A., Oolbere-Garapin F.O., Cohen-Solar H., Horodniceae F., Kourilsky P.I98I: Expression of herpes simplex virus type I thymidin kinase gene in E.coii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,, 78, 815-819.

67. Garapin F., Chosterman S,, Horodniceanu F., Kourilsky P., Garapin A.-C. 1979: Cloning of the active thymidin kinase gene of herpes simplex virus type I in E.coii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3755-3759.

68. Goebel W.^1972: Replication of DNA of colicinogenic factoe EI (CoIEl) at restrictive temperature in a DNA replication mutant thermosensitive for DNA-polymerase III. Nature, 237, 192-195.

69. Goeddel D., Yansura D., Caruthers. 1977s Binding of synthetic lactose repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3292-3296.

70. Goeddel D., Orea R., Hirose Т., Kleid D.f Bolivar P., Heineker H., Yansura D., Crea R., Itakura K., Riggs A. 1979(a): Expression in E.coii of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 76, I06-II0.

71. Goeddel D., Heyneker H., Hozumi Т., ArentzemR., Itakura K., Yansura D., Ross M., Miozarri G.t Crea R., Seeburg P. 1979(b): Direct expression in E.coii of a DNA sequence coding for human growth hormone. Nature, 281, 544-548.

72. Goldman M. 1968: Fluorescent antibody methods.Academ. Press, N.Y.-London, 303 Р»

73. Goodfriend Ш., Levine J., Fasman G. 1964: Antibodies to bradykinin and angiotensin. A use of carbodiimides in immunology. Science, 144, 1344-1546.

74. Green P., Heyneker H., Bolivar F., Rodrigues R.,

75. Betlach M., Covarrubias A., Backman K., Russel D., Tait R., Boyer H. 1978: A general method for the purification of restriction enzymes. Nucleic i.cid Res., 5, 2373-2380,

76. Greenwood F.J., Hunter W.M. 1963: The preparation of labelled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochem. J., 89, II4-I2I.

77. Griffin I.H. 1978: Role of surface in surface-depend activation of Hageman factor XII. Proc, Natl. Acad. Sci.USA,75, 1998-2002.

78. Grindley N.D.F., Kelley W.S. 1976: Effects of different alleles of the E.coii K-I2 polA gene on the replication of non-transferring plasmids. Moled. Gen. Genet., 143, 3II-3I8.

79. Grodsky G.M., Forsham P.H. I960: An immunochemical assay of total extractable insulin in man. J. Clin. Invest., 39, 1070-1079.

80. Grossveld G.C., Shewmaker O.K., Jat P., Flavell R.A. 1981: Localization of DNA sequences necessary for transcription of the rabbit -globin gene in vitro. Cell, 25, 215-226.

81. Grunstein N., Hogness D. 1975s Colony hybridization. A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961-3965.

82. Guarente L., Lauer G., Roberts T.M., Pfcashne M. 1980: Improved methods for maximizing expression of a cloned gene. A bacterium that synthesized rabbit -globin. Cell, 20, 543-553.

83. Gubbius E.I., Maurer R.A., Hartley J.L., Donelson J.E. 1979s Construction and analysis of recombinant DNAs containing a structural gene for rat prolactin. Nucleic Acid Res., 6, 915-930.

84. Hammer D., Thomas I. 1976: Molecular cloning of DNAfragments produced by restriction endonucleases Sal I and Bam I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 1537-1541.

85. Han Y., Kato H., Iwanaga S., Komiya 1978: Action of urinary kallekrein, plasmin and other kininogenases on bovine plasma HMWK. J. Biochem., 83, 223-235.

86. Hautala J., Bassett C., Giles N., Kushner S. 1979: Increased expression of eucaryotic genes in E.coli through stabilization of its mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76, 5774-5778.

87. Goodman H.M., Boyer H.W. 1972: DNA nucleotide sequence restricted by the RI endonuclease. Proc.Natl.Acad,Sci.USA, 69, 3448-3452.

88. Heffron P., Kubeus C., Falkow S. 1975: Translocation of a plasmid DNA sequence which mediated ampicillin resistance: molecular nature and specifity of insertion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3623-3627.

89. Helinski' D.R., Olewell D.B. 1971s Circular DNA. Annu. Rev. Biochem., 40, 899-942,

90. Herbert W.I. 1965: Coated charcoal immunoassay of Insulin I. Clinic. Endocrinol, and Metabolism, 25, 1375-1384.

91. Hershfield V., Boyer H.W,, Chow L., Helinski D.R. 1976: Characterization of a Mini-ColEI plasmid. J. Bacteriol., 126, 447-455.

92. Hershfield V., Boyer H.W., Yanofsky C., Zovett M., Melinski D.R. 1974: Plasmid ColEI as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 71, 3455-3459.

93. Meyneker H.L., Shine I., Goodman H.W., Boger H.W., Rosenberg I., Dickerson R.E., Narang S.A., Itakura K., Lin S.-Y., Riggs A.D. 1976: Synthetic lac operator DNA is functional invitro, Nature, 265, 748-752.

94. Horinchi K,, Zinder N.D. 1972: Cleavage of the bacteriophage f DNA by the restriction enzyme of Escherichia coli B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3220-5224.

95. Humpliers P., Cochet M., Krust A., Gerlinger Р», Kou-rilsky P., Chambon P# 1977: Molecular cloning of extensive sequences of the in vitro synthesized chicken ovalbumin structural gene, Nucleic Acid Res., 4, 2589-2406.

96. Inselburg I. 1977: The isolation, mapping and examination of effects of TnA insertions in ColEI plasmids. J. Bacterid., 129, 482-491.

97. Itakura K,, Hirose Т., Crea R., Riggs A.D., Heyneker H., Bolivar F., Boyer H.W. 1977: Expression in Escherichia coli ofa chrmically synthesized gene for the hormone somatostatin. -Science, 198, IO56-IO6I.

98. Itakura E., Katagiri N., Bahl C.P., Wightman R.H., Na-rang S.A. 1975(a): Improved triester approach for the synthesis of pentadecathymidylic acid. Jt of American Chemical Society, 97, 7527-7552.

99. Itakura K., Katagiri N., Narang S.A., Bahl C.P., Marians K.J., Wu R. 1975(b): Chemical synthesis and sequence studies of deoxyribooligonucleotides which constitute the duplex sequence of the lactose operator of E.coli. J, Biol. Chem., 250, 4592-4600.

100. Jacob A.E., Grinter N.J. 1975*. Plasmid RP4 as a vector replicon in genetic engineering* Nature, 256, 504-506.

101. Jacob P., Brenner S., Cuzin P. 1963: On the regulation of DNA replication in bacteria. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol,, 28, 329-348.

102. Jay G., Khoury G., Seth A.K., Jay E. 1981: Construction of general vector for efficient expression of mammalian proteins in bacteria: Use of a synthetic ribosome binding site. Proc. •Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5543-5548.

103. Kamp D,, Kahmann R., Lipzer D., Roberts R.J. 1977: Mapping of restriction sites in the attachment site region of bacteriophage lambda, Molec, Gen. Genet., 154, 231-248.

104. Kaplan A.P., Meier H.L., Mandle R.Jr. 1976: The Hage-man depend pathways of coagulation, fibrinolysis and kinin generation. Seminars in Tromb and Hemostasis, 3, 1-26,

105. Kataoka Т., Xamawaki-Kataoka Y., Xamagishi H., Hon jo T. 1979: Cloning immunoglobulin 2b chain gene of mouse: Characterization and partial sequence determination, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4240-4244.

106. Kato H., Han X.N., Iwanaga S., Suzuki Т., Komiya H. 1980: Bovine plasma HMW and IMW kininogens: Stx-uctural differences between heavy and light chains derived from their kinin-free proteins. J. Biochem., 80, I299-I3H.

107. Kedes L.H., Chang A.C.Y., Houseman D., Cohen S.N. 1975: Isolation of histone genes from unfractionated sea urchin DNA-121.by subculture cloning in E.coii. Nature, 255, 535-538.

108. Kelly T.J., Smith H.O. 1970: A restriction nucleasevfrom Haemophilus influenzae. II. Base sequence of the recognition site. J. Moleс. Biol., 51, 393-409.

109. Kerbirion D., Griffin J.H. 1979: Contact activation of plasma: Structure-activity relationships of human high molecular v/eight kininogen. Advances in Experimental Medicine and Biology, 120 B, 153-162.

110. Kerbirion D.M., Bonna B.N., Griffin J.H. 1980: Immunochemical studies of human high molecular weight kininogen and of its complexes with plasma prekallikrein or kallikrein. J. Biol. Chem., 255, 3952-3958.

111. Khorana H.G. 1975s Bacterial gene for tyrosine transfer RNA. Promoter and terminator sequences and progress in total synthesis. Proc. Int. Symp.Macromol., ed. Mano , Eloisa D, 371-395.

112. Khorana H.G. 1978: Studies on nucleic acids: total synthesis of a biologically functional gene. Bioorg. Chem., 7, 351-393.

113. Kingsbury D.T., Helinski D.R. 1973: Temperature sensitive mutants for replication of plasmids in E.coii. I. Isolation and specificity of host and plasmid mutations. Genetics, 74, 17-31.

114. Kupper H., Keller W., Kurz C., Forss S., Schaller H., Franze R., Strohmaier K., Marquardt 0., Laslavsky V.G., Hof-schneider P.H. 1981: Cloning of cDNA of major antigen of foot and mouth disease virus and expression in E.coii. Nature, 289, 555-559.

115. Last J.A. 1975: Purification and properties of RNA ligase from bacteriophage T4 infected E.coii. Fed.Proc., 34,

116. Lederberg J. 1952: Cell genetics and hereditary symbiosis .-Physiol. Rev., 32, 403-430.

117. Lederberg S., 1957: Supression of the multiplicationof heterologous bacteriophages in lisogenic bacteria. Virology, 3, 496-515.

118. Lederberg E.M., Cohen S.N. 1974: Transformation of Salmonella typhimurium by plasmid DNA. J. Bacterid., 119, Ю72-Ю74.

119. Lehrach Н», Prischauf A., Hanahan D., Wozeney J., Puller P., Boedtker . 1979: Construction and characterizationof pro Collagen complementary deoxyribonucleic acid clones. Biochemistry, 18, 3146-3152.

120. Lobban P.E., Kaizer A.D. 1973s Enzymatic end to end joining of DNA molecules. J. Molec. Biol., 78, 453-471.1.5« Mandel M., Higa A. 1970: Calcium-dependant bacteriophage DNA infection. J. Molec. Biol., 55, 159-162.

121. Martial J.A., Hallewell R.A., Baxter J.D., Goodman H.M. 1979s Human growth hormones Complementary DNA cloning and expression in bacteria, Science, 205, 602-607.

122. Mashford M.L., Roberts M.L. 1972: Determination of blood kinin levels by radioimmunoassay. Biochem. Pharmacol., 21, 2727-2752.

123. Maxam A.M., Gibbert W. 1977s A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564.

124. Mazin A.L., Sulimova G.E., Vanyushin B.F. 1974: Granulated hydroxyapatite preparation and chromatographic properties.- Analyt. Biochem., 61, 62-71.

125. Meagher R.B., Tait R.O., Betlach M., Boyer H.W. 1977: Protein expression in E.coii minicells by recombinant plasmid.- Cell, 10, 521-536.

126. Mercerean-Puijalon 0., Kourilsky P. 1979: Introns in the chicken ovalbumine gene prevent ovalbumin synthesis in E. coli K-I2. Nature, 279, 647-649.

127. Merts J.E., Davis R.W. 1972: Cleavage of DNA by RI restriction endonuclease generates cohesive ends. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3370-3374.

128. Meselson M., Yuan R. 1968: DNA restriction enzyme from Escherichia coli. Nature, 217, III0-III4.

129. Michelson S., Iiorodniceanu F., Kress M., Tardy-Panit

130. M. 1979: Human cytomegalovirus-induced immediate early antigens: analysis in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis afte immunoprecipitation. J. Virology, 32, 259-267.

131. Miller D.L., Andreone T.L., Donelson I.E. 1977: Translation in E.coii mini-cells containing hamster mitochondrial DNA—CoIEI Amp recombinant plasmids. Biochim. Biophys. Acta, 477, 323-333.

132. Mori K., Sakamoto W., Nagasawa S. 1981: Studies on human high molecular weight (HMW) kininogen. III. Cleavage of

133. HMW kininogen by the action of human salinary kallikrein. -J. Biochem., 90, 503-509.

134. Morrow «Т.Е., Cohen S.N., Chang A.C.Y., Boyer H.W., Goodman H.M., Helling R.B. 1974; Replication and transcription of eukaryotic DNA in Escherichia coli. Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 71, 1743-1747.

135. McReynolds L.A., Catterall J.F., O'Malley B.W. 1977: The ovalbumin gene: cloning of a complete ds-c DNA in a bacterial plasmid. Gene, 2, 217-231.

136. McReynolds L., O'Malley B.W., Nisbet A.D., Fothergill J.E., Givol D., Fields S., Robertson M., Brownlee G.C. 1978: Sequence of chicken ovalbumin mRNA. Nature, 273, 723-728.

137. Murray N.E., Brammar W.I., Murray K. 1977: Lamboid phages that simplify the recovery of in vitro recombinants. -Molec. Gen. Genet., 150, 53-61.

138. Murray N.E., Kelley W.S. 1979: Characterization of polA transducing phages; Effective expression of the E.colip&lA gene. Molec. Gen. Genet., 175, 77-87.

139. Nagasawa S., Nakayasu T. 1979: Cleavage of human high molecular weight kininogen by human plasma kallikrein. -Advances in Experiment. Medicine and Biology, 120 B, 163-172.

140. Nagata S., Mantei N., Weismann C. 1981: The structure of one of the eight or more distinct chromosomal genes for human interferon- . Nature, 287, 401-408.

141. Novick R.P., Clowes R.C., Cohen S.N., Curtiss R.III.

142. Datta N., Falkow S. 1976: Uniform nomenclature for bacterial plasmids: a proposal. Bacteriol. Rev., 40, 168-189.

143. O'Farrel P., Polysky В., Gelfand D.H. Regulated expression by readthrough translation from a plasmid-encoded. -ga-lactosidase. J. Bacteriol., 154, 645-654.

144. Oishi M., Irbe R.M. 1977: Circular chromosomes and genetic transformation in Escherichia coli. In: Modern trends in bacterial transformation and transfection. Ed. Portoles A., Lopez P., Espinosa M., 121-154.

145. Osborne T.F., SchellR.E., Burch-Jaffe E., Berget S.J., Berk A.J. 1981: Mapping a eukaryotic promoter: a DNA sequence required for in vivo expression of adenovirus pre-early functions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, I58I-I585.

146. Palmiter R.D., Gagnon J., Walsh K.A. 1978: Ovalbumin: a secreted protein without a transient hydrophobic leader sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 94-98.

147. Pasek H., Goto 0?., Gilbert W., Link В., Schaller H., MacKay P., Leadbetter G., Murray K. 1979: Hepatitis В virus genes and their expression in E.coli. Nature, 282, 575~578.

148. Pribnow D. 1975: Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early promoter. Proc. Natl. Aca&. Sci. USA, 72, 784-788.

149. Pribnow D. 1979: Genetic control signals in DNA. In: Biological Regulation and Development, v. I, 219-278.

150. Rabbits Т.Н. 1976: Bacterial cloning of plasmids car-ring copies of rabbit globin messenger RNA. Nature, 260, 221-225.

151. Radloff R., Bauer W., Vinograd I. 1967: A dye bouyant--density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA: Closed circular DNA in Heha cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57, 1514-1521.

152. Rambach A., Hogness D.S. 1977: Translation of Drosophi-la melanogaster sequences in Escherichia coli. Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5041-5045.

153. Ratzkin В., Carbon J. 1977: Functional expression of cloned yeast DNA in E.coli. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 74, 487-491.

154. Rees L.H., Cook D.H., Kendall I.W., Allen C.F., Kramer R.M., Ratcliffe J.G., Knight R.A, 1971: Radioimmunoassay for rat plasma ACTH. Endocrinology, 89, 254-261.

155. Roberts R.I., Humphreys G.O., Roberts R.I. 1979: Nature of transforming deoxyribonucleic acid in calcium-treated Escherichia coli. J. Bacterid., 138, 1033-Ю35.

156. Rocha e Silva M. 1963: The physiological significance of bradikinin. Ann. New York Acad. Sci., 104, I90-2II.

157. Roskam W.G., Rougeon F. 1979: Molecular cloning and nucleotide sequences of the human growth hormone structural gene. Nucleic Acid Res., 7, 305-320,

158. Rougeon F., Kourilsky P., Mach B. 1975: Insertion of a rabbit -globin gene sequence into an E.coii plasmid. Nucleic Acid Res., 2, 2365-2378.

159. Roughountry R., Jay E., Wu R. 1976: Terminal labelling and addition of homopolymer tracts to duplex DNA fragments by terminal deoxynucleotidyl transferase. Nucleic Acid Res., 3, I0I-II6.

160. Ryan W.S., Ryan I.W., Whitaker C. 1979: How do kinins affect vascular tone? Advances in Experimental Medicine and Biology, 120 A, 375-391.

161. Sadler I.R., Betz I.L., Tecklenburg M., Goeddel D., Yansura D., Caruthers M.H. 1978: Cloning of chemically synthesized lactose operators. II EcoRI-linkered operators. Gene, 3, 211-232.

162. Sancar A., Hack A.M., Rupp V/.D. 1979: Simple method foridentification of plasmid-coded proteins. J. Bacteriol., 692-693.

163. Sanzey В., Mercereau 0., Ternynck Т., Kourilsky P. 1976: Method for identification of recombinants of phage . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 3394-3397.

164. Sassone-Corsi P., Corden I., Kedinger 0., Chambon P. 1981: Promotion of specific in vitro transcription by excised "TATA" box sequences inserted in a foreign nucleotide environment. Nucleic Acid Res., 3941-3958.

165. Scalka A., Shapiro L. 1977: Screening for recombinant DNAs with in situ immunoassays. In: ICN-UCLA. Symposia on Molecular and Cellular Biology, V.8, 75-84.

166. Schaller H., Gray C., Herrmann K. 1975: Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site from the DNA of bacteriophage fd, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 72, 737-741.

167. Seeburg P.H., Shine J., Martial J.A., Baxter J.D., Goodman H.M. 1977(a): Nucleotide sequence and amplification in •bacteria of structural gene for rat growth hormone, Nature,270, 486-494,

168. Seeburg P.H., Shine J,, Martial J.A., Ulrich A,, Baxter J.D., Goodman H.M. 1977(b): Nucleotide sequence of part of the gene for human chorionic somatomammotropin: purification of DNA complementary to predominant mRNA species. Cell, 12, 157-165.

169. Seeburg P.H., Shine J., Martial J.A., Inarie R.D., Morris J.A., Ulrich A., Baxter J.D., Goodman H.M. 1978: Synthesis of growth hormone by bacteria. Nature, 276, 795-798.У

170. Shine J., Dalgaruo L. 1975: The У-terminal sequenceof Escherichia coli I6S ribosomal RNA: complementary to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl, Acad, Sci,1. USA, 71, 1342-1346.

171. Shine J., Fetters I., Lan C.Y., Roberts I.L., Baxter I.D. 1980: Expression of cloned J^-endorphin gene sequences by E.coli. Nature, 285, 456-461.

172. Smith H., Wilcox K. 1970: A restriction enzyme from Haemophilus influenzae. I. Purification and general properties.- J. Molec. Biol., 51, 379-391.

173. Snopek T.I., Sugino A., Agarwal K.L., Cozzarelli N.R. 1976: Catalysis of DNA joining by bacteriophage T4 RNA ligosa.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 68, 417-424.

174. So M., Gill R., Falkow S. 1975: The generation of•pa ColEI-Ap cloning vehicle which allows detection of inserted DNA. Molec. Gen. Genet., 142, 239-249.

175. Sobel M.E., Yamamoto Т., Adams S.L., Dilauro R., Awe-dimento V.E., de Crombruggehe В., Pastan J. 1978: Construction of recombinant bacterial plasmid containing a chick pro- 2 collagen gene sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5846-5850.

176. Spencer I.HJ 1979: Promoters in small bacteriophage genomes. Trends in Biochemical Sciences, 4, 164—168.

177. Staudenbaurer W.L. 1977: Replication of small plasmids in extracts of E.coli. Involvement of the dna В and dna С protein on the replication of early replicative intermediates. -Curr. Top. Microbiol, Immunol., 78, I7I-I85,

178. Steitz I.A. 1979: Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA. In: Biological Regulation and Development, v.I, 349-399.

179. Struhl K., Cameron J.R., Davis R.W. 1976: Functional genetic expression of eukariotic DNA in E.coii, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, I471-1475

180. Struhl K., Davis R.W, 1977: Production of a functional eukaryotic enzyme in E.colis Cloning and expression of the yeast structural gene for imidazoleglycerolphosphate dehydro-tase (his ). Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 74, 5255-5259.

181. Struhl K., Davis R.W., Fink G.R. 1979: Supression of a yeast amber mutation of E.coii. Nature, 279, 78-79.

182. Stuy I.H. 1962; Transformability of Haemophilus influenzae. J. Gen. Microbiol., 29, 537-549.

183. Sutcliffe I.G. 1978: pBR 522 restriction map derived from DNA sequence; accurate DNA size markers up to 4362 nucleotide pairs long. Nucleic Acid Res., 5, 2721-2729.

184. Sutcliffe I.G. 1978: The complete nucleotide sequence of Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symposium, v. 43, 77-90.

185. Tabak H.F., Borst P. 1970: Erroneous transcription of mitochondrial DNA by RNA polymerase from Escherichia coli. -Biochim. Biophys. Acta, 217, 356-364.

186. Taketo A. 1974: Sensitivity of Escherichia coli to viral nucleic acid. VIII. Idiosyncrasy of calcium ion-depend competence for DNA. J. Biochem., 895-904.

187. Talamo R.C., Haber E., Austen K.F. 1968: Antibody to bradykinin: effect of carrier and method of coupling on specificity.;- and affinity. J. Immunology, 101, 333-341.

188. Talmadge K., Kaufman J., Gilbert W. 1980: Bacteria mature preproinsulin to proinsulin. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 77, 3988-3992.

189. Tanaka Т., Weissblum B. I975i Oonstxuction of a colicin EI—R factor composite plasmid in vitro: means for amplification of deoxyribonucleic acid . J. Bacteriol,, 121, 354-362.

190. Ulmann A., Jacob P., Monod J, 1968: On the subunit structure of wild-type versus complemented $>-galactosidase 0f Escherichia coli, J. Molec. Biol., 52, I-I5.

191. Vapnek D., Hautala J.A., Jacobson J.W., Giles N.H., Kushner S,R, 1977: Expression in E.coli K-I2 of the structu ral gene for catabolic dehydroguinase of Neurospora crassa. -Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 74, 5508-3512.

192. Venetianer P., Leder P. I979-: Enzymatic synthesis of solid phasebound DNA sequences corresponding to specific mammalian genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 5892-5896.

193. Villa-Komaroff L., Efstratiadis A., Broome S., Lomedico

194. P., Tizard R., Naber S.P., Chick W.L., Gilbert W. 1978: A bacterial clone synthesizing proinsulin. Proc. Natl, Acad, Sci,1. USA, 75, 3727-372 .

195. Walker G,C,, Uhleribec O.C., Bedows E., Gumport R.I, 1975: T4 induced RNA ligase joins single strauded oligoribo-nucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 122-126.

196. Walz A., Ratzkin В., Carbon J. 1978: Control of expression of a cloned yeast (Saccharomyces cerevisiae) gene (trp 5) by a bacterial insertion elements (IS2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 6172-6176.

197. Wensink P.C,, Finnegan D.I,, Donelson I,, Hogness D.S. 1974: A system for mapping DNA sequences in the chromosomes of Drosophila melanogaster. Cell, 3, 315-325»

198. Wohlheiter I.A., Falkow S., Citarella R.V., Baron L.S. 1964: Characterisation of DNA from a proteus strain harboring an episome. J. Molec. Biol., 9, 576-588,

199. Yalow R.S., Berson S.A. 1971: Radioimmunoassay methods. Application to different peptide hormones. Int. Congr. Clin. Chem., 3, Ю8-125.

200. Yano M., Kato H., Nagasawa S., Suzuki T, An improved method for the purification of kininogen-II from bovine plasma. J. Biochem., 1967, 62, 386-388.

201. Yano M,, Nagawawa S., Suzuki T. Partial purification and some properties of high molecular weight kininogen, bovine--kininogen-I. J. Biochem., 1971, 69, 471-481.