Клонирование гена бета-галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus и характеристика продукта этого гена тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Фокина, Наталия Алексеевна

• Фокина, Наталия Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 1996

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фокина, Наталия Алексеевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ß-Галактозидаза и ее природные источники.

1.2. Промышленное использование ß-галактозидазы.

1.3. Организация генов ß-галактозидаз.

1.4. Клонирование генов ß-галактозидаз бактерий и 12 структура соответствующих ферментов

1.5 Структура ß-галактозидаз

1.6 Регуляция ß-галактозидазного синтеза

1.7. Физико-химические свойства ß-галактозидаз. v 1.8 Субстратная специфичность ß-галактозидазы

1.9 Иммобилизация ß-галактозидаз

ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Химические реагенты и ферменты нуклеотидного обмена

2.3. Бактериальные среды и условия культивирования

2.4. Выделение и анализ плазмидной ДНК

2.5. Выделение хромосомной ДНК Т.ethanollcus

2.6. Конструирование геномной библиотеки.

2.7 Отбор активных клонов на чашках

2.8. Очистка ß-галактозидазы 42 2.8.1. Приготовление клеточных экстрактов

• 2.8.2. Фракционирование сульфатом аммония

2.8.3. Гель-фильтрация

2.8.4. Анион-обменная хроматография

2.9. Электрофорез и изоэлектрофокусирование

2.10. Методы определения активности ß-галактозидазы

2.10.1. Определение активности на хромогенных субстратах

2.10.2. Определение активности на лактозе

2.11. Определение концентрации белка

2.12. Определение термостабильности и pH-стабильности 46 белка

2.13. Иммобилизация галактозидазы

2.14. Определение активности иммобилизованной 47 ß-галактозидазы

2.15. Определение термостабильности и pH-стабильности 48 иммобилизованного белка

2.16. Определение нуклеотидной последовательности 48 гена ß-галактозидазы и компьютерный анализ полученных данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Создание банка генов и отбор активных клонов

3.2 Определение нуклеотидной последовательности 51 гена ß-галактозидазы Т.ethanolicus.

3.3 Выделение и очистка рекомбинантной ß-галактозидазы

3.4 Субстратная специфичность и физико-химические 66 характеристики ß-галактозидазы

3.5 Иммобилизация ß-галактозидазы Т.ethanolicus 74 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 79 ВЫВОДЫ 82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Сокращения используемые в тексте диссертации

Да - дальтон

Ед. - единица активности фермента

ПААГ - полиакриламидный гель

ДТТ - дитиотрейтол т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

БОБ - додецилсульфат натрия

РС буфер - фосфат-цитратный буфер

Среда ЬВ - среда "Ьиг^а-ВегЧгап!"

Субстраты р№ - п-нитрофенил р№Са1 - п-нитрофенил-бета-Д-галактопиранозид оЫРСа1 - о-нитрофенил-бета-Д-галактопиранозид р№Ху1 - п-нитрофенил-бета-Д-ксилозид рЫРС - п-нитрофенил-бета-Д-глюкозид рМр-аСа1 - п-нитрофенил-альфа-Д-галактопиранозид

МШа1 - 4-метил-умбеллиферрил-бета-Д-галактозид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование гена бета-галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus и характеристика продукта этого гена»

Актуальность темы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к ферменту лактазе (0-галактозидаза КФ 3.2.1.23). р-Галактозидаза расщепляет молочный сахар - лактозу - на моносахариды - глюкозу и галактозу. Фермент может быть использован в промышленности для гидролиза лактозы в молоке и молочной сыворотке. Ферментативный гидролиз лактозы в сыворотке позволит создать на его основе безотходную технологию переработки молока и решить проблему охраны окружающей среды, возникающую в связи с загрязнениями, вызываемыми сливом отходов молочной проимышленности. Использование фермента в промышленности позволяет решить важную экономическую задачу получения сахаристых веществ из нетрадиционного сырья. Молочные продукты, где лактоза заменена сбраживаемой смесью моносахаридов - глюкозой и галактозой, находят широкое применение в сельском хозяйстве, медицине, микробиологической промышленности, различных отраслях пищевой промышленности.

Особый интерес представляют р-галактозидазы термофильных бактерий. Они способны продолжительно действовать при при высоких температурах (выше 60°С) и обладают рядом преимуществ по сравнению с р-галактозидазами грибов (температурный оптимум 50°С)' используемых в настоящее время в биотехнологическом производстве. В частности, для них характерны более высокие удельные активности. В связи с высокими температурными оптимумами, гидролиз лактозы возможно проводить при высоких ф температурах. Это препятствует бактериальному заражению при длительном использовании фермента в иммобилизованном состоянии.

Одним из способов получения и изучения темостабильных ферментов, продуцируемых термофильными анаеробными бактериями, является клонирование и экспрессия соответствующих генов в мезофильных микроорганизмах.

Цель и задачи исследования. Целью работы является клонирование гена ß-галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus 39Е (Clostridium thermohydrosulfuricum 39E) в E.coli, исследование его структуры, изучение свойств фермента.

В ходе работы решались следующие задачи:

- создание и анализ банка генов Т.ethanolicus в клетках Е. coli;

- отбор клонов с ß-галактозидазной активностью;

- определение нуклеотидной последовательности клонированного гена ß-галактозидазы;

- выделение и очистка ß-галактозидазы Т.ethanolicus из клеток Е. coli;

- изучение физико-химических свойств термостабильной ß-галактозидазы;

- иммобилизация фермента и характеристика иммобилизованного белка.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Фокина, Наталия Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Из клонотеки Т. еШапоПсиэ 39Е отобран клон, несущий плазмиду риТ50, определяющую синтез термостабильной р-галактозидазы. Определена нуклеотидная последовательность гена 0-галактозидазы Т. еШапоИсиБ. Открытая рамка считывания кодирует белок, состоящий из 744 аминокислот, общей массой 85792 Да.

2. На основании данных субстратной специфичности р-галактозидаза Т. еШапоПсиэ охарактеризована как р-1,4-Б-галактогидролаза (КФ 3.2.1.23).

3. На основании анализа аминокислотной последовательности р-галактозидаза Т. еМгапоИсиэ отнесена к семейству 2 гликозил-гидролаз.

4. Термостабильная р-галактозидаза очищена до гомогенности и определены ее основные биохимические характеристики. В частности показано, что (5-галактозидаза является наиболее термостабильной по сравнению с известными р-галактозидазами.

5. р-Галактозидаза иммобилизована на альдегидном силохроме. Определены основные биохимические характеристики иммобилизованного фермента. Препарат оставался стабильным при 70°С в течении 14 дней. Производительность патрона с иммобилизованной 0-галактозидазой (объем 1 мл) составила 600 мг гидролизованной лактозы в час.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной нами работы из библиотеки генов Thermoanaerobacter ethanolicus 39Е был отобран и охарактеризован клон, продуцирующий фермент гидролиза лактозы - р-галактозидазу. Фермент имел температурный оптимум 75-80°С и рН оптимумы 5.3-6.0. Фермент специфически гидролизовал p-D-галактозидные связи Сахаров.

Был проведен рестриктный анализ клонированого участка ДНК Т.ethanolicus. Получены ряд делеционных производных клонированного фрагмента для секвенирования.

Секвенирован ген, определяющий синтез термостабильной р-галактозидазы, расположенный на плазмиде pUT50. Открытая рамка считывания 722,2 п.н. кодирует белок с молекулярной массой 85323 кДа.

Проведен сравнительный анализ аминокислотной последовательности р-галактозидазы Т.ethanolicus с аминокислотными последовательностями ряда аналогичных ферментов. Наибольшая гомология (45%) была показана с ферментом из родственного микроорганизма Т.thermosulfurogenes. На основании гомологии между (5-галактозидазами из семейства 2 гликозил-гидролаз фермент из Т.ethanolicus отнесен к этому семейству.

Термостабильная 0-галактозидаза из рекомбинантного штамма E.coli TGI, несущего плазмиду PUT50, была очищена до электрофоретической гомогенности. На конечной стадии очистки, после проведения гель-фильтрации и анион-обменной хроматографии, фермент был очищен в 160 раз и был гомогенен по данным электрофореза в ПААГ. Удельная активность очищенной р-галактозидазы при 75° С на р№Са1 и лактозе составила соответственно 800 и 400 ед/мг белка.

Были определены основные биохимические характеристики р-галактозидазы: молекулярная масса 83 кДа; оптимум рН - 5.3-6.0; температурный оптимум 75-80°С; данный фермент стабилен при температуре 70°С в течении 8,5 часа, время полужизни при температуре 75°С составляет 8 часов. На сегодняшний день, это одна из наиболее стабильных из известных р-галактозидаз бактерий.

Нами было показано, что р-галактозидаза действует только на р-Б-галактозидные связи Сахаров. При этом на лактозе ее активность лишь в два раза ниже чем на синтетическом субстрате рЫРСа1. Фермент определен нами как р-Б-галактозид-галактогидролаза (КФ 3.2.1.23).

Галактоза оказывает ингибирующее действие на р-галактозидазу. Глюкоза является активатором фермента. Фермент активировался в присутствии ионов Мп2+. Сульфгидрильные агенты не оказывали влияние на активность р-галактозидазы.

Фермент был иммобилизован на альдегидном силохроме. Активность иммобилизованного фермента составила 1000 ед/г носителя, что значительно превышает активности используемых в настоящее время в промышленности р-галактозидаз дрожжей и грибов.

Были определены биохимические характеристики иммобилизованного фермента. р-Галактозидаза имела максимальную активность при температуре 80°С и рН 6.2-6.6. В результате иммобилизации значительно увеличилась стабильность фермента: он сохранял полностью свою активность в течении 14 дней при температуре 70°С.

Изучена возможность использования иммобилизованной р-галактозидазы для гидролиза раствора лактозы. Показано, что при использовании колонки с иммобилизованным ферментом при 70°С и скорости протока 15 мл\час осуществляется полная конверсия лактозы. Такой "мини-реактор" работал в непрерывном режиме в течении 14 дней без падения скорости конверсии. Производительность такого "мини-реактора" составила 600 мг лактозы в час.

Высокая активность фермента на лактозе, широкий диапазон действия рН, высокий температурный оптимум и стабильность, которые сохраняются при иммобилизации, позволят в перспективе успешно использовать исследованную р-галактозидазу в биотехнологических процессах, связанных с переработкой лактозы в молоке и молочной сыворотке.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фокина, Наталия Алексеевна, 1996 год

1. Захарова И. Я., БугловаТ.Т., Тихомирова А. С. (1988) Ферменты трансформирующие галактозу. Киев. 224с.

2. Виха И. В., Воробьев A.A., Жолудева С. И., Касьянова Т.А., Кудрявцев С.И., (1987) Получение высокоактивного препарата ß-D-галактозидазы. Прикл. Биохим. и Микробиол., 236, 291-298.

3. Кумарев В.П., Райт A.C., Салганик Р.И. (1976) Иммобилизация белков и ферментов на альдегидосилохромах. Биоорганическая химия,2, 700-705.

4. Куликова А. К., Гомартелли М. М., Церетелли А.К., Безбородов A.M., Квеситадзе Г.И., БилайТ.И., (1989), ß-Галактозидаза низших эукариот (грибов и дрожжей)., Прикл. Биохим. и Микробиол., 25, 734-746.

5. Льюин Б., (1987) Гены., Москва., 176-188.

6. Миллер Д., (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Москва., 324-327.

7. Нахапетян Л. А., Мотина Л.И., (1988) Получение глюкозо-галактозных сиропов из молочной сыворотки. Биотехнология, т. 4, 4-21.

8. Самошина Н. М., Лотменцева Е.Ю., Борисова В.Н., (1984) Гидрофобная иммобилизация грибных ß-галактозидаз на неорганическом носителе с карбоксильными группами. Прикладная биохимия и микробиология, 20, 817-821.

9. Самошина Л.М., Лотменцева Е.Ю., Борисова В.Н. и др. (1987) Гидролиз лактозы с помощью грибных иммобилизированных ß-галактозидаз, Биотехнология, 1, 61-65.

10. Самошина Л., Лотменцева Е.Ю., Борисова В.Н., Нахапетян Л.А.,1985) Сравнительное изучение некоторых кинетических параметров грибных (J-галактозидаз., Прикл. Биохимия и Микробиол., 21, 745-751.

11. И. ЦаплинаИ.А., Богданова Т. И., Гвеннер X., Центграф Б., (1992) р-Галактозидаза Thermus ruber., Приклад, биохимия и микробиол., 28, 22-26.

12. AmaritaF., Alcorta F., Duplessix M.L., Cantanbrana Т., Rodriguezfernandez C., (1995) Izolation and properties of free and immobilized fi-galactosidase from the psychrotrophic enterobacterium Buttiauxella agrestis., J. Appl. Bacteriol., 78, 630-635.

13. Akasaki M., Suzuki M., Funakashi J., Yamashina J., (1976) Characterisation of p-galactosidase from a special strain of Aspergillus oryzal. J.Biochem., 80, 1195-1200.

14. Beckwith J.R., Zipser D., (1970) The lactose operon. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

15. Bodalo A., Gomer E., Gomer J., Bastida J., Maximo M., (1991) A comparison of different metods of (5-galactosidaseimmobilization., Process Biochem., 26, 349-353.

16. BrenaB.M., RydenL.G., Porath J., (1994) Immobilization of ß-galactosidase on metal-chelate-substituted gels., Biotechnol. and Appl. Biochem., 19, 217-231.

17. Bronnenmeier K., Staudenbauer W. L., (1990). The molecular biology and genetics of substrate utilization in Clostridia.

18. Browmik T., Marth E.H., (19S0) ß-Galactosidase of Pedicoccus species: induction, purification and parccial characterisation, Appl. Microb. Biotechnol., 33, 317-323.

19. Browmik T., Tarun, Marth E.H., (1989) Simp1 method to detect ß-galactosidase., 1989, Appl. Envirom. Microbiol., 55, 3240-3242.

20. Burchhardt G., Bahl H., (1991) Cloning and analisis of the ß-galactosidase-encoding gene from Clostridium thermosulfurogenes EMI. Gene, 106, 13-19.

21. Buvinger W. E., Riley M., (1985) Nucleotide sequence of Klebsiella pneumoniae lac genes., J. of Bacteriol., 89, 850-857.

22. Choi Y.J., Kim I.H., Lee B.H., Lee J.S., (1995) Purification and characterization of beta-galactosidase from alkalophilic and thermophilis Bacillus sp TA-11., Biothechnol. Appl. Biochem., 22, Part 2, 191-201.

23. Craven G., Steers E., Anfinsen C., (1965) Purification, composition, and molecular weith of the ß-galactosidase of Escherichia coli K-12., J. Biol. Chem., 240, 2468-2477.

24. Crow V., DaveyG., Pearce L., Thomas T., (1983) Plasmid linkage of the D-tagatose-6-phosphate pathway in Streptococcus Lactis: effect on lactose and galactose metabolism., J. of Bacterid., 153, 76-83.

25. Davis S., Stevens H., Riel M., Simons G., Vos W., (1992) Leuconostoc lactis 0-galactosidase is encoded by two overlapping genes., J. of Bacteriol., 174, 4475-4481.

26. De Vos W.M., Gasson M.J., (1989) Structure and expression of the Lactococcus lactis gene for phospho-beta-galactosidase (lacG) in Escherichia coli and L. lactis., J. Gen. Microbiol., 135, ( Pt 7), 1833-1846.

27. Dickson R.C., Dickson L.R., MorkinJ.S., (1979) Purification and properties of inducible B-galactosidase isolated from yeastm

28. Kluyveromyces lactis, J.Bacteriol., 137, 51- 61.

29. Edwards R., Cupples C., Huber R., (1990) Site specific mutants of p-galactosidase show that Tyr-503 is unimportanst in Mg2 + binding but that Glu-461 is very impotant and may be a ligand to Mg2+ ., Biochem. and Biophys. Res. Commun., 171, 33-37.

30. Edwards L. A., TianM.R., Huber R.E., FolwerA.V., (1988) The use of limited proteolysis to probe interdomain and active site regions of (5-galactosidase (E. coli)., J. of Biol. Chem., 263, 1848-1854.

31. Fanning S., Leahy M., Sheehan D., (1994) Nucleotide and deduced amino acid sequences of Rhizobium meliloti 102F34 lacZ gene: comparisonwith prokariotic beta-galactosidases and human beta-glucuronidase., Gene., 141, 91-94.

32. Gebler J.C., Aebersold R., Withers S.G., (1992)

33. J.biol.Chem., 267, 11126-11130.

34. Fowler A., Zabln I., (1978) Amino acid sequence of ß-galactosidase., J. of Biol. Chemistry., 253, 5521-5525.

35. Gekas V., Lopez-Leiva M., (1985) Hydrolysis of lactose: a literature review., Process Biochemistry, 20, 2-11.

36. Goodman R., Pederson D., (1975) ß-Galactosidase from Bacillus stearothermophilus., Can. J. of Microbiol., 22, 817-825.

37. Gilbert H.J., Hall J., (1987) Molecular cloning of Streptococcus bovis lactos catabolic genes., J. of General Microbiology, 133, 2285-2293.

38. Gutshall K.R., TrimburD.E., KasmirJ.J., Brenchley J. E., (1995) Analisis of a novel gene and ß-galactosidase isozyme from a psychrotrophic Arthrobacter isolate., J.Bacteriol., 177,1981-1988.

39. Hamilton I., Lo G., (1978) Co-induction of ß-galactosidase and the lactose-P-enolpyruvate phosphotransferase system in Streptococcus salivarius and Streptococcus mutans., J. of Bacteriol., 136, 900-908.

40. Hancock K.R., Rockman E., Young C., Pearce L., Maddox I., Scott D.B., (1991) Expression and Nucleotid Sequence of the Clostridium acetobutilicum ß-galactosidase gene cloned in Escherichia coli. J. of Bacteriology, 173, 3084-3095.

41. Heller K., Roschenthaler R., (1978) ß-galactosidase galactohydrolase of Streptococcus faecalis and the inhibition of its syntesis by glucose., Canadian J. of Microbiol., 24, 512-519.

42. Henrissat B., Bairoch A., (1993) New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem.J. 293, 781-788.

43. Henrissat B., (1991) A classification of glycosyl hydrolasesft based on amino acid sequence similarities., Biochem. J., 280, 309-316.

44. Henrissat B., (1991) Sequence homology between (5-galactosidase and some (5-glucosidase., Protein sequences Data anal., 4, 61-62.

45. Hengstenberg W., Penberthy W., Hill K., Morse M., (1969) Phosphotransferase system of Staphylococcus aureus: its requirment for the accumulation and metabolism of galactosides., J. of Bacterid., 99, 383-388.

46. Herrchen M., Legler G., (1984) Identification of an essential carboxylate group at the active site of lacZ beta-galactosidase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 138, 527-531.ft

47. Herman R.E., McKay L.L., (1986) Cloning and expression of the J3-galactosidase gene from Streptococcus thermophilus in Escherichia coli., Appl. Environ. Microbiol., 52, 45-50.

48. Hirata H., Negoro S., Okada H., (1984) Molecular basis of isozyme formation of p-galactosidases in Bacillus stearothermophilus: isolation of two p-galactosidase genes, bgaA and bgaB., J. of Bacterid., 160, 9-14.

49. Hirata H., Fukazawa T., Negoro S., Okada H., (1986) Structure of a p-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus., J. of Bacterid., 166, 722-727.

50. Hyun H.H., Zeikus J.G., (1985) Regulation and genetic enchancement of glucoamylase and pullulanase production in Clostridium thermohydrosulfuricum., J. of Bacteriogy, 164, N3,1146-1152.

51. Huber R., Gaunt M., Hurlburt K., (1984) Binding and

52. Reactivity at the "Glucose" site of galactosyl-fJ-galactosidase (E.coli), Archives of Biochem. and Biophys., 234, 151-160.

53. Jacobson R.H., Zhang X-J., DuBose R.F., Matthews B.W., (1994) Three-dimentsional structure of 0-galactosidase from E.coli., Nature, 369,761-766.

54. Kobayashi T., Hirose Y., Ohmiga K., Shimizy S., (1978) Thermostable p-galactosidase from Bacillus acidocaldarius and its immobilization., J. Ferment. Thecnol., 56, 309-314.

55. Kobayashi T., Shiizu T., Hayashi H., (1995) Transcriptional analysis of beta-galactosidase gene (pbg) in Clostridium perfringens., FEMS Microbiol. Lett., 133, 65-69.

56. Kalnins A., Otto K., Ruther U., Muller-Hill B., (1983) Sequence of the lacZ gene of Escherichia coli., EMBO J., 2, 593-597.

57. Laemmli U.K., (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriphage T4., Nature, 227, 680-685.

58. Lee L., Hansen J.B., Yagustyn-Krynicka K., Chassy B.M. (1982) Cloning and expression of the 0-D-Phosphogalactoside Galactogydrolase gene of Lactobacillus casei in Esherichia coli

59. K-12, J. of Bacteriol., 152, N3, 1138-1146.

60. Leon-Morgentaler P., Zwahlen M., Hottinger H., (1991)1.ctose metaoolism in Lactobacillus bulgaricus: analysis of the primary structure and expression of the genes involved., J. of Bacteriology, 173, 1951-1957.

61. LindD.L., Daniel R.M., Cowan D. A., Morgan H.W., (1989) ß-galactosidase from a strain of anaerobic thermophile, Thermoanaerobacter. Enzym.Microb.Technol., 11, 180-186.

62. Little S., Caartwright P., Campblele C., ZPrenneta A., Mc Chesney Y., Mountain A., Robinson M., (1989) Nucleotid sequence of a thermostable beta-galactosidase from Sulfolobus solfataricus., Nucleic Acids Res., 17, 7980.

63. Love D.R., Fisher N. Bergquist., (1988) Sequence of the ß-galactosidase gene from Sulfolobus solfataricus., Mol. Gen. Genet., 213, 84-92.

64. Maeda S., Gasson M.J., (1986) Cloning, expression and location of the Streptococcus lactis gene for ß-D-galactosidase. J. of General. Microbiol., 132, 331-340.

65. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J., (1982) Molecular cloning: a laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

66. Melasniemi H., (1987) Characterization of a-amylase and pullulanase activities of Clostridium thermohydrosulfuricum., Biochem. J., 246, 193-197.

67. Mohamed A., Diwany A., Slem M., Shaker H., (1986) Stadies on ß-galactosidase from Bacillus stearothermophilus NRC 16., Deutche Lebensmittel-Rundschau, 82, 53-56.

68. Ohtsuka K., Tanoh A., Ozawa 0., Kanematsu T., Uchida T., Shinke R., (1990) Purification and Properties of a p-galactosidase with high galactosyl transfer activity from Cryptococcus laurentii Okn-4., J.Ferment, and Bioeng., 70, 301-307.

69. Ovsejevi K., Brena B., Batistaviera F., Carisson J., (1995) Immobilization of p-galactosidase on thiosulfonate-agarose., Enzyme Microb. Technol., 17, 151-156.

70. Pisani F.M., Rella R., Raia C.A., Rosso C., Nucci R., Gambacorta A., De Rosa M., Rossi M., (1990) Thermostable p-galactosidase from the archaebacterium Sulfolobus solfataricus. Purification and properties., J. Biochem., 187, 321-328.

71. Pitcer W.H., Fiord J. R., WeetallH.H., (1976) Metods in Enzymology: Immobilized enzymes., Ed. K. Mosbach N. Y.; Acad. Press, 44, 782-798.

72. Poch 0., Hote H., Dallery V., Debeaux F., Fleer R., Sodoyer R., ( 1992) Seqence of the Kluyveromyces lactis p-galactosidase: comparison with procariotic enzymes and secondary structure analysis., Gene, 118, 55-63.

73. Polard H., Steers E., (1973) Bacillus megaterium KM pgalactosidase: purification by affinity chromatography and characterisation of the active species., , Arch. Biochem. Biophys., 158, 650-661.

74. Rainey F., Ward N., Morgan H., Toalster R., Stackebrandt E., (1993) Phylogenettic Analisis of Anaerobic Thermophilic Bacteria: Aid for THeir Reclassificatien., J. of Bacteriol., 175, 4772-4779.

75. Ramona R.M.V., Dutta S.M., (1981) Purification and properties of p-galactosidase from Streptococcus thermophilus., J. Food Sci., 46, 1419-1421.

76. Ring M., Huber R.E., (1990) Multiple replacements astablish the importance of Tyr-503 in p-galactosidase (Escherichia coli), Arch. Biochem. Biophys., 283, 342-350.

77. Rogalski J., Lobarzewski J., (1995) The purification andftimmobilization of Penicillum Notatum (S-galactosidase., Acta bionechnol., 15, 211-222.

78. Saito T., Honda H., Iijima S., Kobayashi T., (1989) Isoltion of thermostable p-galactosidase gene from a thermophilic anaerobe and its expression in Escherichia coli. Enzyme Microb. Technol.,11, 302-305.

79. Saito T., Suzuki T., LKijima S., Kobayashi T., (1992) J. Ferment. Bioeng., 73, 51-53.

80. Sanger F., Nicken S. and Coulson A. R., (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash), 74, 5463-5467.

81. Sammer, Zdeno, Nurna J., Grones J., (1991) Cloning and expression of the p-D-galactosidase gene from Lactobacilluslactis in Escherichia coli., Biologia, 46, 299-304.

82. Schmidt B.F., Adams R.M., Requadt C., Power S., Mainzer

83. S.,(1989) Expression and nucleotide sequence of the Lactobacillus bulgaricus ß-galactosidase gene cloned in Escherichia coli., J. of Bacteriology, 171, 625-635.

84. Selim M., Badr El-Din S., Elshafei A., Badr El-Din S., (1986) ß-Galactosidase from Bacillus Stearothermophilus NRC-16., Deutche Lebensmittel- Rundschau, 82, 259-261.

85. Smart J., (1991) Transferase reactions of the ß-galactosidase from Streptoioccus thermophilus., Appl. Microbiol. Biotechnol., 34, 495-501.

86. Stokes H., Betts P., Hall, (1985) Sequence of the ebgA gene of Escherichia coli: comparison with the lac Z gene., Molecular biol. and evol., 2, 469-477.

87. Sutcliffe J., (1979) Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quqnt. Biol. 43, 77.

88. Torres M.J., Lee B.H., (1995) Cloning and expresiion of beta-galactosidase from psychotrophic Bacillus subtilis KL88 into Escherichia coli., Biotechnol Lett, 17, 123-128.

89. Torres M.J., Lee B.H., (1995) Expression of0 beta-galactosidase gehe from Lactobacillus sake in Escherichia coli., Biothechnol. Lett., 17, 693-698.

90. Ulrich J.T., Mc Feters G. A., Temple K.L., (1972) Induction and characterisation of ß-galactosidase in an extremal thermophile., J. Bacteriol., 110, 691-698.

91. Uwajima T., Tekeda 0., Yagi H., (1972) Purification, cristalisation and some properties of ß-galactoidas from Saccharomyces fragil is., Arg. Biol. Chem., 36, 570-577.

92. Wan L.G., Vanhuystee R.B., (1994) Novel method to detect beta-galactosidase by a dot-blotting assay on nitrocellulose membrane using 6-bromo-2-naphthyl beta-D-galactopyranoside as substrate., J. Arg. Food Chem., 42, 2499-2501.

93. Widmer F., Leuba J., (1979) ß-Galactosidase from Aspergillus niger. Separation and characterisation of three multipe forms., Eur. J. Biochem., 100, 559-567.

94. Wondolowski M., Woyehic Y., (1974) Characterisation and immobilization of E.coli (ATCC-26) ß-galactosidase., Biothechnol. and Bioeng., 12, 1633-1646.

95. Wongmadden S.T., Landry D., (1995) Purification and characterization of novel glycosidases from the bacterial genus Xanthomonas., Glycobiology, 5, 19-28.

96. Yanisch-Perron C., Viera J., Messing J., (1985) Improved M13 phage closing vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors, Gene, 33, 103-119.

97. Yana ira S., Kobayachi T., Suguri T., Nakakoshi M., Miura S., Ishikawa H., Nakajima I., (1995) Formation ofoligosaccharides from lactose by Bacillus circulans beta-galactosudase., Biosci. Biothecnol. Biochem., 59, 1021-1026.

98. You P.L., Smart J.B., Ennls B.M., (1987) Differential induction of ß-galactosidase and phospho-ß-galactosidase activities in the fermantation of whey permeate by Clostridium acetobutilicum., Appl. Microbiol. Biotechnol., 26, 254-257.

99. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D., (1986) ß-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion market. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81, 414-418.

100. Gallager P.M., D'Amor, Lund S.D., Ganschow R.E., (1988), The complete sequence of murine ß-glucuronidase mRNA and its deduced polipeptide. Genomics 2, 215-219.